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WO2011142019A1 - リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子およびその用途 - Google Patents

リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子およびその用途 Download PDF

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WO2011142019A1
WO2011142019A1 PCT/JP2010/058127 JP2010058127W WO2011142019A1 WO 2011142019 A1 WO2011142019 A1 WO 2011142019A1 JP 2010058127 W JP2010058127 W JP 2010058127W WO 2011142019 A1 WO2011142019 A1 WO 2011142019A1
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WO
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lignan
polynucleotide
protein
amino acid
seq
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PCT/JP2010/058127
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English (en)
French (fr)
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栄一郎 小埜
俊明 梅澤
武文 服部
史朗 鈴木
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Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
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Priority to PCT/JP2010/058127 priority patent/WO2011142019A1/ja
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Priority to EP10851402.7A priority patent/EP2570482B1/en
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
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    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme having lignan methylation activity (activity to transfer a methyl group to lignan), a gene encoding the enzyme, a method for producing methylated lignan using this gene, and the like.
  • Non-patent literature Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2, 371-390
  • sesamin a representative of the furofuran-type lignans of sesame family sesame, is known for its antioxidant properties, lipid metabolism improvement, liver function protection and the like
  • Non-patent Document 1 Nakai, M., et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51, 1666-1670
  • Non-patent document 2 Tsuruoka, T. et al. (2005) Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188.
  • podophyllotoxin an anti-tumor lignan of allyltetralin lactone type contained in the roots of barberry podophyllum (American octopus), has cell division inhibitory activity, and therefore development of anticancer drugs and new anticancer drugs.
  • Non-Patent Document 3 Ayres, DC and Loike, JD (1990) Lignans: Chemical Biological and Clinical Properties. CambridgeUniv. Press, Cambridge, UK). Many lignans are thought to be metabolized into enterolactone having female hormone-like activity in the body after ingestion.
  • Non-patent Document 4 Davin, LB and Lewis, NG (2003 ) Phytochem. Rev. 2, 257-288).
  • Lignan biosynthesis begins mainly with pinoledinol, a furofuran-type lignan that is studied by the oxidative polymerization of coniferyl alcohol, which is a monolignol, which has been studied in forsythia forsythia, barberry podophyllum, and flaxaceae flax.
  • pinoresinol has been shown to be converted to sesamin by the formation of two methylenedioxy rings in pinoresinol by CYP81Q1, a cytochrome P450 enzyme, and its metabolite sesaminol has been shown to be glycosylated.
  • pinoresinol is metabolized to secoisolaricillinol via larisiresinol by pinoresinol / lariciresinol reductase (PLR) (Non-patent Document 4). Secoisolaricillinol is further converted to matheiresinol by secoisolaricillinol dehydrogenase (SIRD).
  • PLR pinoresinol / lariciresinol reductase
  • SIRD secoisolaricillinol dehydrogenase
  • Physiaceae is known to contain lignans having a lactone ring such as yatein and podophyllotoxin in their leaves and roots. Furthermore, label body administration experiments have shown that yatein is biosynthesized via glossy papatin, 5-methylated taprikachin, and 4-methylated taprikachin (Non-patent Document 6).
  • the present invention has been made in view of the above situation, and the following enzyme having lignan methylation activity, polynucleotide encoding the same, vector containing the same, transformant, and using the transformant Methods for producing methylated lignans are provided.
  • polynucleotide according to (1) above which is selected from the group consisting of the following (g) to (h): (g) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has lignan methylation activity A polynucleotide encoding a protein; and (h) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having lignan methylation activity.
  • the polynucleotide according to (1) above which comprises the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide according to (1) above which encodes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide according to any one of (1) to (4) above which is DNA.
  • a protein encoded by the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above (7)
  • a non-human transformant into which the polynucleotide according to any one of (1) to (5) is introduced.
  • a non-human transformant into which the vector according to (7) above is introduced.
  • (10) A method for producing the protein, comprising culturing or growing the transformant according to (8) or (9), and collecting a protein having lignan methylation activity from the transformant. (11) The method according to (10) above, wherein the transformant is sesame, forsythia or flax transformed with the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
  • a method for producing a methylated lignan comprising culturing or growing the transformant according to (8) or (9) above, and collecting the methylated lignan from the transformant.
  • (13) The method according to (12) above, wherein the transformant is sesame, forsythia or flax transformed with the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
  • lignans such as luapricatin can be methylated, which is useful for searching for lignan compounds having a new function.
  • a compound searched using the gene of the present invention or a compound obtained as an intermediate thereof can be a molecule that induces a new flower color in an active pharmaceutical ingredient, a functional food material, or a horticultural plant.
  • methyl lujapricatin obtained in the examples described below is useful as an intermediate of podophyllotoxin known as an anticancer agent. Therefore, the present invention is useful in the pharmaceutical industry, food industry, agriculture and the like.
  • FIG. 1 shows GC-MS charts of standard samples of 5′-methyl tsuaprikatin (upper), 4-methyl tsuaprikachin (middle), and 5-methyl tsuaplicatin (lower), respectively.
  • TIC means Total Ion Chromatogram.
  • FIG. 2 shows MS spectra of standard samples of 5'-methyl tsuaprikatin (upper), 4-methyl tsuaprikachin (middle), and 5-methyl tsuaplicatin (lower), respectively.
  • the 532 ions commonly found in each of them indicate TMS-methylated tsuyapricatin.
  • FIG. 1 shows GC-MS charts of standard samples of 5′-methyl tsuaprikatin (upper), 4-methyl tsuaprikachin (middle), and 5-methyl tsuaplicatin (lower), respectively.
  • the 532 ions commonly found in each of them indicate TMS-methylated tsuyapricatin.
  • FIG. 3 shows zyaprikatin (left type) and 5-position methylated tsuaprikatin (right type) as enzyme reaction substrates.
  • the numbers in the figure indicate the estimated MS spectrum values of the fragment ions generated when each chemical formula is cut at the location indicated by the thick broken line.
  • FIG. 4 shows (A) a standard product of glossy paprikatin, (B) a standard product of 5-methylzaprikatin, (C) a reaction solution of methylzaprikatin and AsOMT116, and (D) boiling with methylzaplicatin.
  • the GC-MS chart of a reaction liquid with AsOMT116 is shown.
  • TIC means Total Ion Chromatogram.
  • FIG. 5 shows (A) the MS spectrum of a standard product of methyl-taprikatin, which is a substrate, (B) the MS spectrum of a standard product of 5-methyltaplicatin, and (C) the reaction between methyl-taprikatin and AsOMT116, respectively.
  • An MS spectrum of the product and (D) a schematic diagram of a lignan methylation reaction catalyzed by AsOMT116 are shown.
  • lignan is a compound in which two molecules of a phenylpropanoid compound having a C 6 C 3 skeleton are polymerized (8,8′-bonded) mainly through these 8-8 ′ positions. Lignans are thought to contribute to biological defense mechanisms in plants (see Phytochemistry Rev. 2, 371-390 (2,003)).
  • Representative lignans include (+)-sesamin, (+)-sesaminol, (+)-pinoresinol, (+)-piperitol and (+)-sesamolinol contained in sesame; forsythia intermedia (+)-Pinoresinol, (-)-Arctigenin and (-)-Materesinol; (-)-Pinoresinol and (-)-Laricilinol contained in Daphne tangutica; Linum usitatissimum (+) ) -Secoisolaricillinol.
  • the molecular structure of these lignans varies (see Wood Research 90, 27-110 (2,003), etc.).
  • (+)-Pinoresinol is an early lignan and is classified as a furofuran-type lignan that has been identified in the widest range of plant species.
  • Sesamin one of the sesame lignans, has a variety of bioactive effects and is effective in improving cholesterol metabolism, liver function, and immune function (eg, Sesame Science and Functionality, Mano Namiki Edition: Maruzen Planet) (See 1998).
  • a method for separating and purifying sesamin from sesame seeds or sesame seeds has already been put into practical use (for example, Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2001-139579 and 10-7676, etc.), and promotes alcohol decomposition containing sesamin as a main component.
  • Liver function improving / enhancing agents having an action are commercially available (trade name: Sesamin, distributor: Suntory Ltd.).
  • lignans other than sesamin for example, sesaminol, sesamolin, etc.
  • have also been reported to have a physiologically active action see, for example, Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry, 76: 805-813 (2002).
  • lignan or a derivative thereof is useful as a physiologically active substance having various physiological activities or an intermediate thereof.
  • the present invention provides (a) a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and (b) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA.
  • the polynucleotides targeted in the present invention are not limited to the polynucleotides (a) and (b) above, and other polynucleotides encoding proteins functionally equivalent to the proteins encoded by these polynucleotides. Including polynucleotides.
  • Examples of functionally equivalent proteins include (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and lignan methylated. Examples include proteins having activity.
  • a protein in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 39, 1 to 38, 1 to 37, 1 to 36, 1 to 35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-2 25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1- 15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1- (Several) 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, consisting of an amino acid sequence in which one amino acid residue is deleted, substituted, inserted and / or added, and lignan Examples include proteins having methylation activity.
  • Such a protein includes (d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77 % Or higher, 78% or higher, 79% or higher, 80% or higher, 81% or higher, 82% or higher, 83% or higher, 84% or higher, 85% or higher, 86% or higher, 87% or higher, 88% or higher, 89% or higher 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3 %, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more, and
  • lignan methylation activity means an activity of methylating lignans, that is, an activity of transferring a methyl group to lignans.
  • “Lignan methylation activity” can be measured or confirmed by reacting SAM, the methyl donor, and lignan, the substrate, with lignan methylase and analyzing the reaction product by HPLC or LC-MS analysis. it can. General methods for measuring methylase activity are described in known literature (for example, Toquin, V., et al. (2003) Plan Mol. Biol. 52, 495-509., Gang, D. R., et al. (2002) (Plant Cell 14, 14, 505-519, etc.).
  • the present invention also relates to (e) a polynucleotide encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and has lignan methylation activity And (f) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has lignan methylation activity. It also includes a polynucleotide encoding a protein having the same.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the probe as a probe.
  • a hybridization method for example, a method described in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 can be used.
  • the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions.
  • “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • a polynucleotide having high homology eg, DNA
  • multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
  • Alkphos Direct Labeling Reagents made by Amersham Pharmacia
  • Hybridized polynucleotides can be detected.
  • hybridizable polynucleotides are approximately 70% of the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 when calculated by homology search software such as FASTA and BLAST using the default parameters. Over 71%, Over 72%, Over 73%, Over 74%, Over 75%, Over 76%, Over 77%, Over 78%, Over 79%, Over 80%, Over 81%, Over 82%, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% More than 96%, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, A polynucleotide having 99.9% or more identity can be mentioned.
  • the above-described polynucleotide of the present invention can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • a preferred protein of the present invention is a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having lignan methylation activity.
  • Such a protein has an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has lignan methylation activity. Examples include proteins.
  • Such a protein examples include a protein having the amino acid sequence having the homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having lignan methylation activity.
  • Such proteins are described in “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Current Protocols in Molecular Biology”, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene, 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) ”and the like.
  • deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in one and a plurality of amino acid sequences in the same sequence It means that there are amino acid residue deletion, substitution, insertion and / or addition, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. .
  • the protein of the present invention can catalyze the methylation reaction of the above-mentioned lignan (particularly tsuyapricatin).
  • the present invention provides a vector containing the polynucleotide described above.
  • the vector of the present invention contains the polynucleotide (DNA) described in any of (a) to (i) above.
  • the vector of the present invention usually contains (i) a promoter capable of being transcribed in a host cell; (ii) a polynucleotide according to any one of (a) to (j) linked to the promoter; and (iii) Concerning transcription termination and polyadenylation of RNA molecules, it is constructed to include an expression cassette that contains as a component a signal that functions in the host cell.
  • the vector thus constructed is introduced into a host cell.
  • Examples of the method for producing an expression vector include, but are not limited to, a method using a plasmid, phage, or cosmid.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell can be appropriately selected. That is, if a promoter sequence is appropriately selected according to the type of host cell to ensure expression of the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector. Good.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, promoter, terminator, and / or replication origin, etc.) depending on the type of host to be introduced.
  • Conventional promoters eg, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.
  • yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc.
  • Examples of the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC.
  • animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • markers include auxotrophic markers (ura5, niaD), drug resistance markers (hyromycin, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (in Japanese), Gakuso, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; Hussain et al., Gene, 101, 149, 1991 Is available.
  • the present invention also provides a transformant into which the polynucleotide described in any of (a) to (i) above is introduced.
  • Transformant provides a transformant or a cell into which a polynucleotide encoding a protein having the above lignan methylation activity is introduced.
  • the term “transformant” is used to include not only tissues or organs but also individual organisms.
  • the method for producing a transformant or cell is not particularly limited, and examples thereof include a method for transformation by introducing the above-described recombinant vector into a host.
  • the host cell used here is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used.
  • bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), nematodes (Caenorhabditis elegans), Xenopus laevis (Xenopus, etc.) Can do.
  • yeast budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe
  • nematodes Caenorhabditis elegans
  • Xenopus laevis Xenopus, etc.
  • the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms, plants and animals exemplified in the host cell.
  • the transformant or cell of the present invention is characterized in that the composition of lignan and / or methylated lignan that these transformant or cell naturally has is modified.
  • the transformant or cell of the present invention is preferably a plant or its progeny, or a tissue derived therefrom, and particularly preferably sesame, forsythia or flax. Such a transformant or cell can increase or decrease the content of methylated lignan in an organism producing lignan by using the method for controlling the methylated lignan content of the present invention.
  • the transformant of the present invention can be a plant transformant.
  • the plant transformant of this embodiment is obtained by introducing a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention into a plant so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed. .
  • the recombinant expression vector used for plant transformation is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide of the present invention in the plant.
  • examples of such a vector include a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in a plant cell (eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter), or a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. The vector which has is mentioned.
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant culture cell, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • the plant used for transformation is not particularly limited, and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • transformation methods known to those skilled in the art for example, Agrobacterium method, gene gun, PEG method, electroporation method, etc.
  • Agrobacterium method for example, Agrobacterium method, gene gun, PEG method, electroporation method, etc.
  • a method using Agrobacterium and a method for directly introducing it into plant cells are well known.
  • the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium (for example, Agrobacterium tumefaciens), and this strain is used as a leaf disk method (Hirofumi Uchimiya).
  • the plant genetic manipulation manual (1990), pages 27-31, Kodansha Scientific, Tokyo) can be used to infect sterile cultured leaf pieces to obtain transformed plants.
  • an expression vector is first introduced into Agrobacterium, and then transformed Agrobacterium is transformed into a plant cell or a plant cell by the method described in Plant Molecular Biology Manual (SB Gelvin et al., Academic Press Publishers). It is a method of introducing into plant tissue.
  • plant tissue includes callus obtained by culturing plant cells.
  • a binary vector such as pBI121 or pPZP202 can be used.
  • an electroporation method and a gene gun method are known.
  • a plant body, a plant organ, and a plant tissue itself may be used as they are, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used.
  • the sample thus prepared can be processed using a gene transfer apparatus (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)).
  • the treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
  • the cell or plant tissue into which the gene has been introduced is first selected for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant body by a conventional method.
  • Regeneration of a plant body from a transformed cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
  • transformation is performed by introducing a recombinant vector into the cultured cells using a gene gun, electroporation method, or the like. Callus, shoots, hairy roots, etc. obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used at a suitable concentration using conventionally known plant tissue culture methods. It can be regenerated into plants by administration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.).
  • plant hormones auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.
  • Whether or not a gene has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing a DNA-specific primer.
  • the present invention also includes a plant into which the polynucleotide of the present invention has been introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or a tissue derived therefrom.
  • transformant plants of the present invention include sesame, rice, tobacco, barley, wheat, rapeseed, potato, tomato, poplar, banana, eucalyptus, sweet potato, tides, alfalfa, lupine, corn, cauliflower, rose, chrysanthemum, Carnation, Qualcomm, Cyclamen, Orchid, Eustoma, Freesia, Gerbera, Gladiolus, Gypsophila, Kalanchoe, Lily, Pelargonium, Geranium, Petunia, Torenia, Tulip, Forsythia, Arabidopsis, Ama, Shark and Miyakogusa .
  • sesame can be used to make the transformant of the present invention.
  • a method for producing a sesame transformant for example, T. et al. Asamizu: Transformation of ssame plants using MAT vector system: introduction of fat acid acid genes. Known methods such as those described in Sesame Newsletter 16: 22-25 (2002) may be mentioned.
  • methylated lignans for example, methyl tsuyaprikatin
  • methylated lignans are produced in a low-cost and environmentally-friendly production process in order to produce methylated lignans in the sesame. be able to.
  • tobacco can be suitably used as the transformant of the present invention.
  • Tobacco is a typical plant that can be easily transformed together with petunia and the like, and can be regenerated from one cell (protoplast) from which the cell wall has been removed to one individual plant. Since one regenerated plant does not fall into a chimera unlike one plant derived from multiple cells, a transformant can be produced efficiently.
  • a preferable method for the transformation of tobacco is the leaf disk method. This method is a method that is easy to operate and can obtain a number of independent transformants from one leaf section. The method of transformation is described in, for example, “Guideline for Neoplastic Chemistry Experiment 3 Separation / Analysis of Nucleic Acids and Genetic Experiment Chemistry Dojin 1996”.
  • lignan methylase By using the transformed tobacco thus obtained, lignan methylase can be produced by a production process that is low in cost and low in the environment.
  • rice can also be suitably used as the transformant of the present invention. If transformed rice is used, lignan methylase can be produced in the rice by a production process with low cost and low environmental burden.
  • the transformant of the present invention can produce the methylated lignan by introducing the polynucleotide, regardless of the species, as long as it is an organism containing lignan (especially tsuyapricatin).
  • a transformant introduced with a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding the protein of the present invention it is possible to catalyze a reaction for methylating lignans present in living organisms such as plants, so that the cost is low. Large-scale preparation of methylated lignans is possible with a production process with low environmental impact.
  • the present invention can provide an inexpensive food or industrial product by preparing a large amount of methylated lignan.
  • the protein which catalyzes a lignan methylation reaction can be provided on the conditions of low cost and low environmental load.
  • the cells according to the invention can be various bacterial hosts.
  • the cell according to the present embodiment is obtained by introducing a recombinant vector containing the polynucleotide according to the present invention into the cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed.
  • the cell of the present invention can produce the methylated lignan by introducing the polynucleotide, regardless of the species, as long as it is an organism containing lignan (particularly tsuyapricatin).
  • the lignan methylation reaction can be catalyzed in the cell, so that the cost is low and the environment is low.
  • the production process enables large-scale preparation of methylated lignans.
  • the present invention can provide an inexpensive food or industrial product by preparing a large amount of methylated lignan. If the cell which concerns on this invention is used, the protein which catalyzes a lignan methylation reaction can be provided on the conditions of low cost and low load to an environment.
  • the present invention provides a method for producing the protein of the present invention using the transformant described above.
  • the protein of the present invention can be obtained by separating and purifying the protein of the present invention from the culture of the transformant.
  • the culture means any of a culture solution, cultured cells or cultured cells, or disrupted cultured cells or cultured cells. Separation and purification of the protein of the present invention can be carried out according to a usual method.
  • the protein of the present invention when the protein of the present invention is accumulated in cultured cells or cultured cells, after culturing, the cells or cells are disrupted by usual methods (for example, ultrasound, lysozyme, freeze-thawing, etc.)
  • a crude extract of the protein of the present invention can be obtained by an ordinary method (for example, centrifugation, filtration, etc.).
  • the protein of the present invention is accumulated in the culture solution, the cells or cells and the culture supernatant are separated from each other by the usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.) after completion of the culture.
  • a culture supernatant containing the protein can be obtained. .
  • Purification of the protein of the present invention contained in the thus obtained extract or culture supernatant can be performed according to a usual separation / purification method.
  • Separation / purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in appropriate combination. be able to.
  • the present invention provides a method for producing methylated lignan using an organism or cell that expresses the protein of the present invention.
  • the organism may be a natural unmodified organism or a transformant using a recombinant expression system.
  • the methylated lignan production method of the present invention can efficiently produce lignans (particularly, luapricatin).
  • the method for producing a methylated lignan of the present invention produces a methylated lignan using an organism or tissue thereof transformed with a polynucleotide encoding the protein of the present invention.
  • the organism is the above-mentioned transformant plant or bacterium, and particularly preferably Escherichia coli, sesame, forsythia or flax.
  • the method for producing methylated lignan of the present invention includes a step of introducing a polynucleotide encoding the protein of the present invention into the organism.
  • the various gene introduction methods described above may be used as the step of introducing the polynucleotide into the organism.
  • the composition of the organism differs between the methylated lignan produced before transformation and the methylated lignan produced after transformation. Specifically, the content of lignans and methylated lignans obtained from the organisms increases.
  • the method for producing methylated lignan according to this embodiment further includes a step of extracting methylated lignan from the organism.
  • the present invention provides foodstuffs and industrial products produced using the methylated lignans obtained by the above-described method for producing methylated lignans.
  • the food described in this section is produced using the methylated lignan extracted from the above-described transformed plant even if it is the seed, fruit, cuttings, tuber, and / or tuberous root of the above-mentioned transformed plant. Or a processed food (eg, sesame, forsythia or flax, or a processed food thereof).
  • the food or industrial product according to the present invention can contain a desired amount of lignan (particularly glossy pikatin).
  • the methylated lignan extract extracted from the transformed plant of the present invention having an increased methylated lignan content as described above is provided as a food having a high methylated lignan content.
  • the extracted methylated lignans not only the extracted methylated lignans but also the seeds, fruits, cut ears, tubers, and / or tuberous roots of the transformed plants are also provided as foods rich in methylated lignans.
  • the target for modifying the methylated lignan composition is not particularly limited, and can be any organism other than plants, such as animals, bacteria, or yeasts.
  • the proteins or polynucleotides of the present invention can be used in industrial products (eg industrial products such as films, biodegradable plastics, functional fibers, lubricants, or detergents). ) Can be used as a raw material.
  • Example 1 Gene cloning Unless otherwise described in detail, molecular biological techniques used in this example were in accordance with the method described in Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
  • screening by plaque hybridization was performed using a mixture of the fragments amplified by the four OMT gene-specific primer sets shown in Table 1 as a screening probe. It was.
  • the probe was labeled by PCR using a non-radioisotope DIG-nucleic acid detection system (Roche Diagnostics) according to the conditions recommended by the manufacturer.
  • cDNA of safflower family safflower was used as a template (Set 1 Forward: SEQ ID NO: 3; Set 1 Reverse: SEQ ID NO: 4; Set 2 Forward: SEQ ID NO: 5; Set 2 Reverse: SEQ ID NO: 6).
  • the obtained cDNA sequence was subjected to homology analysis with the Blastx program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) to obtain a shark methylase-like gene (AsOMT).
  • AsOMT116 The AsOMT clone 116 shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 (hereinafter referred to as AsOMT116) showed low homology (approximately 51%) with Rosa enenensis phloroglucinol O-methyltransferase (accession number BAD18975) by Blastx analysis, but with clear function Since it could not be estimated, it was expressed in E. coli and functional analysis was performed.
  • AsOMT116 Single-character code of amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) MSKQDQDATEFTRVLQVSGGIILGMVLKAAVEFNLFEIMANAAAVDGASPFGDDAKKLSSDDIVAHLPTQNPAATAMLERILRFLSAHSFLTRTVVAGEGGQEQSLYGLESICKNYIPDQDGVSFAPLLVMLHDKVIIDSLLCLKDALLEGGIPFNKAHDGMDAFEYPAIDSRFNDVFNQAMYNHTTLIMKKILEVYAGFEELTEIVDVGGGTGATLAKIMSKYPHIRGINFDLPHVIKNAPPLAGVEHVGGDMFESVPKGEVIFMKWILHDWSDGHCLKLLQNCCNSLPESGKVIIVESIVPENTNTGSSSELSNVMSNDMVMLAVNPGGKERSIKEFEALAKESGFATVELICSVAIYSVLEFHKKV
  • Example 2 Construction of expression vector RT-PCR method using full length ORF of AsOMT116 and primers (Table 2: Upper: SEQ ID NO: 11; Lower: SEQ ID: 12) added with the following restriction enzyme sites Amplified by
  • Shark cDNA was obtained by reverse transcription reaction using 1 ⁇ g of the above-mentioned Shark total RNA as a template.
  • SuperScript TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (GIBCO BRL) was used, and the synthesis conditions followed those recommended by the manufacturer.
  • PCR reaction solution (50 ⁇ l) consists of 1 ⁇ l of shark cDNA, 1 ⁇ ExTaq® buffer (TaKaRa® Bio), 0.2 mM dNTP, primer (Table 3) 0.4 pmol / ⁇ l each, ExTaq® polymerase 2.5 U. This PCR reaction solution was reacted at 94 ° C. for 3 minutes, and then subjected to 30 cycles of reaction at 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes.
  • This PCR product was subcloned into pBluescript SK + vector (Stratagene). Using a DNA sequencer model 3100 (Applied Biosystems), it was confirmed that there was no mutation due to PCR in the inserted fragment by a primer walking method using a synthetic oligonucleotide primer.
  • an AsOMT116 fragment of about 1.1 kb was excised. This fragment was ligated to the NheI and XhoI sites of pET23a (Novagen), an E. coli expression vector, to obtain an E. coli expression vector for this enzyme gene. It was designed to express a fusion protein of AsOMT116 and His tag that has an open reading frame of His tag and AsOMT116 gene downstream of this vector XhoI site.
  • Example 3 Analysis of enzyme function
  • the AsOMT116 E. coli expression plasmid obtained above was used to transform E. coli BL21 (DE3) strain according to a conventional method.
  • the obtained transformant is inoculated into 4 ml of LB medium (10 g / l typtone pepton, 5 g / l yeast extract, 1 g / l NaCl) containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and overnight at 37 ° C. Cultured with shaking.
  • the cultured transformants are collected by centrifugation (5,000 ⁇ g, 10 min), and disruption buffer [20 M HEPES buffer (pH 7.5), 14 mM ⁇ -mercaptoethanol] is added at 1 ml per gram of cells.
  • the transformant was suspended. Subsequently, this suspension was sonicated (15 ⁇ sec ⁇ 8 times) and centrifuged (15,000 ⁇ g, 15 ⁇ min). The obtained supernatant (soluble fraction) was recovered as a crude enzyme solution and used for enzyme analysis.
  • the enzyme reaction conditions are as follows. Prepare 50 ⁇ l of a reaction solution (0.04 mM S-adenosylmethionine, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 mM MgCl 2 , 0.01 mM substrate (tsuyapricatin), approximately 3 mg crude enzyme), and react at 30 ° C. for 1 hour. It was.
  • the enzyme reaction solution was extracted with ethyl acetate, dried, dissolved in 10 ⁇ l of N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide to form trimethylsilyl (TMS), and GC-MS analysis was performed under the following conditions.
  • Analytical instrument Shimadzu GCMS-QP2010 Plus mass spectrometer system Mode: electron impact Column: 10m Shimadzu CPB10-M25 Carrier gas: Helium injection temperature: 250 ° C Column temperature: 160 ° C-250 ° C, speed 20 ° C / min
  • the preparation used was the one prepared in the previous literature (Sakakibara, aN., Et al (2003) Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485). Under these conditions, the standard products 5'-methyl-taprikatin, 5-position methyl-taprikatin and 4-position methyl-taprikatin were eluted at retention times of about 20.1 minutes, 20.3 minutes, and 18.3 minutes, respectively (FIG. 1). Although the retention times of 5'-methyl-taprikatin and 5-position methyl-taprikatin are similar, it was confirmed that both of these can be distinguished from the MS fragment pattern (Fig. 2).
  • the 239 fragment ions found in the 5th position methyl-taprikatin are not found in the 5'-position methyl-taprikatin, but conversely, the 297 fragment ions found in the 5th-position methyl-taprikatin are in the 5th position. It is not observed in methyl luapricatin (FIG. 2). All monomethylated tsuaprikatin had 532 parent ions with TMS hydroxyl groups. Their structures were deduced from the 239 fragment ions found in the above-mentioned 5-methylated tsuaplicatin and the 297 fragment ions found in tsuyapricatin and 5 'position tsuaplicatin (FIG. 3).
  • AsOMT116 is a novel methylating enzyme that specifically methylates 5-position of tsuyapricatin derived from shark.
  • lignans such as luapricatin can be methylated, which is useful for searching for lignan compounds having a new function.
  • a compound searched using the gene of the present invention or a compound obtained as an intermediate thereof can be a molecule that induces a new flower color in an active pharmaceutical ingredient, a functional food material, or a horticultural plant.
  • methyl lujapricatin obtained in the examples described below is useful as an intermediate of podophyllotoxin known as an anticancer agent. Therefore, the present invention is useful in the pharmaceutical industry, food industry, agriculture and the like.
  • SEQ ID NO: 1 AsOMT116 cDNA
  • SEQ ID NO: 2 AsOMT116 amino acid sequence

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Abstract

　本発明は、リグナンにメチル基を転移する活性（リグナンメチル化活性）を有する酵素（例えば、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその変異体）、それをコードする遺伝子（例えば、配列番号：１の塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその変異体）、この遺伝子を用いてメチル化リグナンを製造する方法などを提供する。

Description

リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子およびその用途
　本発明は、リグナンメチル化活性（リグナンにメチル基を転移する活性）を有する酵素、それをコードする遺伝子、この遺伝子を用いてメチル化リグナンを製造する方法などに関する。
　植物二次代謝産物の一種であるリグナンは植物界に幅広く分布しており(非特許文献：Umezawa, T.(2003) Phytochem. Rev. 2, 371-390)、それらのうち有用な生物活性を有するものは医薬品や健康食品として利用されている。例えばゴマ科ゴマのフロフラン型リグナンの代表であるセサミンは、抗酸化性、脂質代謝改善や肝機能保護などの機能性が知られており市販されている（非特許文献１： Nakai, M., et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51, 1666-1670； 非特許文献２：Tsuruoka, T. et al. (2005) Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188）。
　一方、メギ科ポドフィラム（アメリカハッカクレン）の根に含まれるアリルテトラリンラクトン型の抗腫瘍性リグナンであるポドフィロトキシンは細胞分裂阻害活性を有するため制がん剤および新しい制がん剤の開発に利用されている(非特許文献３：Ayres, D. C. and Loike, J. D. (1990) Lignans: Chemical Biological and Clinical Properties. CambridgeUniv. Press, Cambridge, U.K.)。また、多くのリグナンは摂取後体内において女性ホルモン様活性を有するエンテロラクトンに代謝されると考えられている。
　このようにリグナン類の有用性が明らかになりつつあるのに対して、その生合成経路における触媒酵素遺伝子についての情報は限られている(非特許文献４：Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2, 257-288)。
　リグナン生合成は主に、モクセイ科レンギョウ、メギ化ポドフィラム、およびアマ科アマで研究がされており、モノリグノールの一種であるコニフェリルアルコールの酸化的重合によって与えられるフロフラン型リグナンのピノレジノールから始まる。ゴマにおいて、ピノレジノールはチトクロームP450酵素であるCYP81Q1によってピノレジノールに二つのメチレンジオキシ環が形成されてセサミンに変換され、さらにその代謝物であるセサミノールが配糖体化されることが示されている（非特許文献５：Noguchi, A., et al (2008) Plant J. 54, 415-427）。
　ラクトン環を有するリグナン生合成経路では、ピノレジノールはピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素(PLR)によってラリシレジノールを経てセコイソラリシレジノールに代謝される(非特許文献４)。セコイソラリシレジノールはさらにセコイソラリシレジノール脱水素酵素(SIRD)によってマタイレジノールへと変換される。
　マタイレジノール以降のラクトン環を有するリグナン代謝経路についてはポドフィロトキシン配糖体に至るまでに複数の酵素反応を経る必要があるが、いくつか酵素活性が報告されているだけで実行酵素の単離に至っていない(非特許文献６： Sakakibara, N., et al (2003) Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485）。
　セリ科シャクはその葉や根において、ヤテインやポドフィロトキシンなどのラクトン環を有するリグナンを含有していることが知られている。さらにラベル体投与実験によって、ヤテインはツヤプリカチン、５位メチル化ツヤプリカチン、４,５位メチル化ツヤプリカチンを経て生合成されることが示されている（非特許文献６）。
J. Agri. Food Chem. 51, 1666-1670 (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188 (2005) Lignans: Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge,  U.K. (1990) Phytochem. Rev. 2, 257-288 (2003) Plant J. 54, 415-427 (2008) Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485 (2003)
　このような状況の下、リグナン生合成に関与する新たな酵素およびそれをコードする遺伝子を同定することが求められていた。
　本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、下記に示す、リグナンメチル化活性を有する酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター、形質転換体、この形質転換体を用いてメチル化リグナンを製造する方法などを提供する。
（１）以下の(a)～(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
　(a)配列番号：１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
　(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、１～５０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１a）以下の(e)～(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
　(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（２）以下の(g)～(h)からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
　(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１～１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（２a）以下に示す上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
　　(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　（３）配列番号：１の塩基配列を含有する、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
　（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
　（５）ＤＮＡである、上記（１）～（４）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
　（６）上記（１）～（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
　（７）上記（１）～（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
　（８）上記（１）～（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
　（９）上記（７に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
　（１０）上記（８）又は（９）に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からリグナンメチル化活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
　（１１）上記形質転換体が上記（１）～（５）のいずれか項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである上記（１０）に記載の方法。
　（１２）上記（８）又は（９）に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からメチル化リグナンを採取するメチル化リグナンの製造方法。
　（１３）上記形質転換体が上記（１）～（５）のいずれか項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである上記（１２）に記載の方法。
　本発明によれば、ツヤプリカチンなどのリグナンをメチル化できるので、新たな機能を有するリグナン化合物の探索に有用である。本発明の遺伝子を用いて探索される化合物あるいはそれを中間体として得られる化合物は、医薬の有効成分、機能性食品素材、園芸植物において新しい花色を導く分子となり得る。例えば、後述の実施例において得られたメチルツヤプリカチンは、抗癌剤として知られているポドフィロトキシンの中間体として有用である。したがって、本発明は、医薬品産業、食品産業、農業などにおいて有用である。
図１は、それぞれ、5’－メチルツヤプリカチン（上段）、4－メチルツヤプリカチン（中段）、5－メチルツヤプリカチン(下段)の標準サンプルのＧＣ-ＭＳチャートを示す。TICはTotal Ion Chromatogramを意味する。 図２は、それぞれ、5’－メチルツヤプリカチン（上段）、4－メチルツヤプリカチン（中段）、5-メチルツヤプリカチン(下段)の標準サンプルのＭＳスペクトルを示す。それぞれに共通して見られる532のイオンはＴＭＳ化されたメチル化ツヤプリカチンを示す。 図３は、酵素反応基質のツヤプリカチン（左式）及び5位メチル化ツヤプリカチン（右式）を示す。図中の数字は、それぞれの化学式が太い折れ線で示す箇所で切断されたときに生じるフラグメントイオンの推定MSスペクトルの値を示す。 図４は、それぞれ、（Ａ）ツヤプリカチン標準品、（Ｂ）5－メチルツヤプリカチンの標準品、（Ｃ）メチルツヤプリカチンとAsOMT116との反応液、（Ｄ）メチルツヤプリカチンと煮沸したAsOMT116との反応液のＧＣ-ＭＳチャートを示す。TICはTotal Ion Chromatogramを意味する。 図５は、それぞれ、（Ａ）基質であるメチルツヤプリカチン標準品のＭＳスペクトル、（Ｂ）5－メチルツヤプリカチンの標準品のMSスペクトル、（Ｃ）メチルツヤプリカチンとAsOMT116との反応生成物のMSスペクトル、及び（Ｄ）AsOMT116 が触媒するリグナンメチル化反応の模式図を示す。
　本明細書中、「リグナン」は、Ｃ6Ｃ3骨格を有するフェニルプロパノイド化合物２分子が、主としてこれらの８－８’位を介して重合（８，８’－結合）した化合物である。リグナンは、植物における生体防御機構に寄与していると考えられている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖ． ２， ３７１－３９０ （２，００３）参照）。
　代表的なリグナンとしては、ゴマに含まれる（+）－セサミン、（+）－セサミノール、（＋）－ピノレジノール、（+）－ピペリトールおよび（+）－セサモリノール；レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に含まれる（＋）－ピノレジノール、（－）－アルクチゲニンおよび（－）－マタイレジノール；ソシマ（Ｄａｐｈｎｅ　ｔａｎｇｕｔｉｃａ）に含まれる（－）－ピノレジノールおよび（－）－ラリシレジノール；アマ（Ｌｉｎｕｍ　ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に含まれる（＋）－セコイソラリシレジノールなどが挙げられる。これらのリグナンの分子構造は多様である（Ｗｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０， ２７－１１０ （２，００３）等参照）。（+）－ピノレジノールは初期リグナンであり、最も幅広い植物種で同定されているフロフラン型のリグナン類に分類される。ゴマリグナンの１つであるセサミンは、多彩な生理活性作用を有しており、コレステロール代謝、肝機能および免疫機能の改善に有効である（例えば、ゴマその科学と機能性、並木満夫編：丸善プラネット社（1998）参照）。セサミンをゴマ種子またはゴマの絞り粕から分離精製する方法がすでに実用化されており（例えば、特開２００１－１３９５７９公報、特開平１０－７６７６号公報等）、セサミンを主成分とするアルコール分解促進作用を有する肝機能改善／増強剤が市販されている（商品名：セサミン、発売元：サントリー株式会社）。またセサミン以外の他のリグナン（例えば、セサミノール、セサモリンなど）もまた生理活性作用を有することが報告されている（例えば、日本農芸化学会誌、７６：８０５－８１３（２００２）参照）。このように、リグナン又はその誘導体は、種々の生理活性を有する生理活性物質あるいはその中間体として有用である。
　以下に、本発明のリグナンにメチル基を転移する酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター、形質転換体などを詳細に説明する。
１．本発明のポリヌクレオチド
　まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記(a)及び(b)のポリヌクレオチドに限定されるものではなく、これらのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。
　このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１～50個、１～40個、１～39個、１～38個、１～37個、１～36個、１～35個、１～34個、１～33個、１～32個、１～31個、１～30個、１～29個、１～28個、１～27個、１～26個、１～25個、１～24個、１～23個、１～22個、１～21個、１～20個、１～19個、１～18個、１～17個、１～16個、１～15個、１～14個、１～13個、１～12個、１～11個、１～10個、１～9個、１～8個、１～7個、１～6個（1～数個）、１～5個、１～4個、１～3個、１～2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　本明細書中、「リグナンメチル化活性」は、リグナンをメチル化する活性、すなわち、リグナンにメチル基を転移する活性を意味する。「リグナンメチル化活性」は、メチル基供与体であるSAMと基質であるリグナンとをリグナンメチル化酵素と反応させ、その反応生成物をHPLCまたはLC-MS分析することで測定又は確認することができる。一般的なメチル化酵素活性測定法は公知文献に記載されている（例えば、Toquin, V., et al. (2003) Plant Mol. Biol. 52, 495-509.,Gang, D. R., et al. (2002) Plant Cell 14, 505-519など参照)。
　また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含する。
　ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
　これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad．Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
２．本発明のタンパク質　本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)～(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質である。
　このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質が挙げられる。
　このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；　C群：アスパラギン、グルタミン；　D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；　E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；　F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；　G群：フェニルアラニン、チロシン。
　また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
　本発明のタンパク質は、上記したリグナン（特に、ツヤプリカチン）のメチル化反応を触媒することができる。
３．ベクター及びこれを導入した形質転換体　次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)～(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。
　本発明のベクターは、通常、（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；（ｉｉ）該プロモーターに結合した、上記（ａ）～（ｊ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
　本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
　発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８１，　３３７　１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，　ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，　生化学，　６４，　６６０，　１９９２；　Ｈｕｓｓａｉｎ　ｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　ｇｅｎｅ，　１０１，　１４９，　１９９１）などが利用可能である。
　また、本発明は、上記（ａ）～（i）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。
　３．形質転換体
　本発明は、上述したリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。本明細書中、用語「形質転換体」は、組織または器官だけでなく、生物個体を含む意味で用いられている。
　形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
　本発明の形質転換体または細胞は、これらの形質転換体または細胞が天然に有するリグナンおよび／またはメチル化リグナンの組成が改変されていることを特徴とする。本発明の形質転換体または細胞は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、ゴマ、レンギョウまたはアマであることが特に好ましい。このような形質転換体または細胞は、本発明のメチル化リグナン含有量を制御する方法を用いることによって、リグナンを産生する生物中のメチル化リグナンの含有量を増加または減少させることができる。
　本発明の形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態の植物形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように植物中に導入することによって取得される。　　　　
　組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
　本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
　植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７～３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
　また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ－１０００（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０～２０００ｐｓｉ程度の圧力、４～１２ｃｍ程度の距離で行う。
　遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。　植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
　遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。
　本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
　また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明の形質転換体植物としては、例えば、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ、アマ、シャクおよびミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。
　好ましい実施形態において、ゴマを使用して、本発明の形質転換体を作製することができる。ゴマの形質転換体の作製方法としては、例えば、Ｔ．Ａｓａｍｉｚｕ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｓａｍｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ＭＡＴ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ　ｇｅｎｅｓ．Ｓｅｓａｍｅ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　１６：２２～２５（２００２）に記載されるような公知の方法が挙げられる。
　このようにして得た形質転換ゴマを用いれば、当該ゴマ内でメチル化リグナンを生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでメチル化リグナン（例えば、メチルツヤプリカチン）を生産することができる。
　他の好ましい実施形態において、本発明の形質転換体として、タバコを好適に用いることができる。タバコは、ペチュニアなどとともに、形質転換が容易な代表的植物であり、細胞壁を取り除いた細胞の１個（プロトプラスト）から、植物１個体への再生が可能である。この再生された植物１個体は、多細胞に由来する１個体とは異なりキメラ状に陥らないため、形質転換体の作製を効率よく行うことができる。
　タバコの形質転換に好ましい方法としては、リーフディスク法が挙げられる。この方法は、操作が容易であり、かつ１枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換体を得ることができる方法である。形質転換の方法はたとえば「新生物化学実験の手引き３　核酸の分離・分析と遺伝子実験法　化学同人　１９９６年」に記載されている。
　このようにして得た形質転換タバコを用いれば、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
　別の好ましい実施形態において、本発明の形質転換体として、イネを好適に用いることもできる。形質転換イネを用いれば、当該イネ内で低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
　本発明の形質転換体は、リグナン（特に、ツヤプリカチン）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチル化リグナンを生産することができる。
　本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された形質転換体を用いれば、植物などの生物に内在するリグナンをメチル化する反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、メチル化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
　本発明の形質転換体を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するタンパク質を低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
　一実施形態において、本発明に係る細胞は、種々の細菌宿主であり得る。本実施形態に係る細胞は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように細胞中に導入することによって取得される。
　当業者は、本明細書中の記載に従えば、リグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されれば、細菌から高等植物までの広範な生物にリグナンメチル化能を付与することができるということを容易に理解する。
　本発明の細胞は、リグナン（特に、ツヤプリカチン）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチル化リグナンを生産することができる。
　本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された細胞を用いれば、当該細胞内でリグナンメチル化反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。さらに本発明は、メチル化リグナンを大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
　本発明に係る細胞を用いれば、リグナンメチル化反応を触媒するタンパク質を低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
４．本発明のタンパク質の製造方法
　本発明は、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる本発明のタンパク質の製造方法を提供する。具体的には、上記形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を分離・精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
　例えば、本発明のタンパク質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。　　　　
　このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
　５．メチル化リグナンの製造方法
　本発明は、本発明のタンパク質を発現する生物体または細胞を用いてメチル化リグナンを生産する方法を提供する。上記生物体は、天然の未改変生物体であっても組換え発現系を用いた形質転換体であってもよい。本発明のメチル化リグナン製造方法は、リグナン（特に、ツヤプリカチン）を効率よく製造することができる。
　一実施形態において、本発明のメチル化リグナン製造方法は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用いてメチル化リグナンを製造する。好ましくは、上記生物体は、上述した形質転換体植物または細菌であり、特に好ましくは、大腸菌、ゴマ、レンギョウまたはアマである。
　本発明のメチル化リグナン製造方法は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。本実施形態において、上記生物体は形質転換される前に産生したメチル化リグナンと形質転換後に産生するメチル化リグナンとの間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびメチル化リグナンは、その含有率が増加する。本実施形態に係るメチル化リグナン製造方法は、さらに上記生物体からメチル化リグナンを抽出する工程を含む。
　６．食品および工業製品
　本発明は、上述のメチル化リグナン製造方法により得られたメチル化リグナンを用いて製造される食品および工業製品を提供する。本項で記載する食品は、上述した形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根であっても、上述した形質転換植物体から抽出されたメチル化リグナンを用いて製造された食品（例えば、ゴマ、レンギョウまたはアマ、あるいはこれらの加工食品）であってもよい。本発明に係る食品または工業製品は、所望する量のリグナン（特に、ツヤプリカチン）を含有することができる。
　例えば、上述のようにメチル化リグナンの含量が増加した本発明の形質転換植物から抽出されたメチル化リグナン抽出液は、メチル化リグナンの含量が高い食品として提供される。また、抽出したメチル化リグナンに限らず、上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等もまた、メチル化リグナンを多く含む食品として提供される。メチル化リグナン組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、または酵母等のあらゆる生物を対象とすることが可能である。
　また、リグナンおよびメチル化リグナンの独特な物性に基づいて、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、工業製品（例えば、フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品）の原料に利用され得る。
　本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
[実施例１]：遺伝子クローニング　本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning(Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)に記載の方法に従った。
　セリ科シャク（Anthrissus sylvestris）の若い葉と根からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総ＲＮＡを抽出し、引き続き、オリゴテックス－dT mRNA精製キット(TaKaRa Bio)によりPolyA(+)RNAを得た。このポリA(+)RNA 4μgを用いて、ラムダZAPIIdirectional cDNAライブラリー合成キット(Stratagen社)を用いて、同社の推奨する方法によりcDNAライブラリーを作製した。
　上記cDNAライブラリーを含むファージ約30万pfuを用いて、表1に記載の４種のOMT遺伝子特異的プライマーセットで増幅される断片を混合したものをスクリーニングプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。プローブはノンラジオアイソトープDIG－核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社、）を用いて、製造者が推奨する条件に従いPCRによりラベルした。この際、ＯＭＴプライマーセット1および2に関してはキク科ベニバナのｃＤＮAを鋳型として用いた（Set 1 Forward:配列番号：３；Set 1 Reverse：配列番号：４；Set 2 Forward:配列番号：５；Set 2 Reverse：配列番号：６）。また、ＯＭＴプライマーセット3および4に関してはヤナギ科ポプラのｃＤＮAを鋳型として用いた（Set 3 Forward:配列番号：７；Set 3 Reverse：配列番号：８；Set 4 Forward:配列番号：９；Set 4 Reverse：配列番号：１０）。鋳型ｃＤＮＡを1μl、1x Taq buffer (TakaRa Bio)、 0.2mM dNTPs、表１に示す遺伝子特異的プライマー各0.2 pmol/μl、rTaq polymerase 1.25 Uを含むPCR反応液を使用した。このPCR反応液を、94℃で5分反応させた後、94℃1分、52℃1分、72℃2分の反応を30サイクル行い、最後に72℃で5分間処理した。このPCR産物からMini Quick Spinカラム(Roche)でプライマーおよび未反応のdNTPを除去し、これをプローブとして用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
　ライブラリーのスクリーニングならびに陽性クローンの検出はノンラジオアイソトープDIG－核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。ハイブリダイゼーション反応を30％ホルムアミドを含む5xSSC中、37℃で一晩行い、メンブレンの洗浄を4x SSC、1%SDSを用いて55℃で20分間行った。約40万プラークをスクリーニングして得た陽性クローンから、DNA Sequencer model 3100 (Applied Biosystems) を用いて合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によってcDNA配列を得た。得られたcDNA配列をBlastxプログラム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によってホモロジー解析することでシャクメチル化酵素様遺伝子(AsOMT)を得た。
　配列番号1および2に示されるAsOMTクローン116（以下AsOMT116）はBlastx解析によってRosa chinensisのphloroglucinol O-methyltransferase (アクセッション番号BAD18975)と低い相同性（約51%）を示したが、明確な機能が推定できなかったため、大腸菌で発現させて機能解析を行った。
AsOMT116 cDNA配列（配列番号：1）
ATGTCTAAACAAGATCAAGATGCCACTGAATTCACAAGGGTGCTGCAGGTAAGTGGTGGCATAATTCTTGGAATGGTATTGAAAGCTGCTGTTGAGTTTAATCTTTTCGAGATCATGGCCAATGCTGCTGCTGTTGATGGAGCTTCTCCTTTCGGAGATGATGCTAAGAAGTTGTCTAGTGATGATATTGTAGCTCATCTTCCCACACAAAATCCTGCAGCTACTGCAATGCTGGAGCGAATTCTTCGGTTTCTGTCTGCTCATTCCTTTCTTACCAGGACCGTAGTAGCTGGAGAAGGTGGCCAGGAACAGAGTTTGTATGGTCTAGAAAGTATTTGCAAGAATTACATTCCTGATCAAGATGGTGTTTCATTTGCTCCTTTATTGGTTATGCTTCATGACAAAGTTATCATCGATTCTTTGTTGTGCTTGAAAGATGCACTTCTTGAGGGAGGTATTCCGTTTAACAAGGCTCATGATGGCATGGATGCATTTGAATACCCTGCAATAGACAGCAGATTCAATGACGTTTTCAATCAAGCAATGTACAACCACACCACTTTAATCATGAAGAAGATTCTAGAAGTTTACGCTGGATTCGAAGAACTCACAGAGATTGTAGATGTTGGTGGTGGAACCGGGGCAACACTAGCCAAAATCATGTCCAAATATCCTCATATCAGGGGAATCAACTTCGATTTGCCTCATGTCATCAAGAACGCCCCTCCTTTAGCTGGTGTGGAGCATGTGGGAGGAGATATGTTTGAAAGTGTCCCGAAAGGAGAGGTCATCTTCATGAAGTGGATACTTCATGATTGGAGCGATGGACACTGCTTAAAGCTTTTGCAGAATTGCTGCAACTCCCTTCCAGAATCTGGCAAGGTGATAATTGTAGAATCAATAGTGCCAGAGAATACGAACACAGGTTCTTCATCGGAATTAAGCAATGTCATGAGCAATGATATGGTAATGCTGGCAGTAAATCCGGGAGGAAAGGAGAGGAGTATCAAAGAATTTGAGGCATTGGCAAAAGAATCTGGATTCGCCACCGTAGAACTCATATGCAGCGTCGCTATATATAGTGTTCTAGAATTTCATAAGAAAGTG
AsOMT116 アミノ酸配列（配列番号：2）の一文字表記
MSKQDQDATEFTRVLQVSGGIILGMVLKAAVEFNLFEIMANAAAVDGASPFGDDAKKLSSDDIVAHLPTQNPAATAMLERILRFLSAHSFLTRTVVAGEGGQEQSLYGLESICKNYIPDQDGVSFAPLLVMLHDKVIIDSLLCLKDALLEGGIPFNKAHDGMDAFEYPAIDSRFNDVFNQAMYNHTTLIMKKILEVYAGFEELTEIVDVGGGTGATLAKIMSKYPHIRGINFDLPHVIKNAPPLAGVEHVGGDMFESVPKGEVIFMKWILHDWSDGHCLKLLQNCCNSLPESGKVIIVESIVPENTNTGSSSELSNVMSNDMVMLAVNPGGKERSIKEFEALAKESGFATVELICSVAIYSVLEFHKKV
[実施例２］：発現ベクター構築
　AsOMT116の完全長ORFを、下記の制限酵素サイトを付加したプライマー（表２：上段：配列番号：１１；下段：配列番号：１２）を用いてRT-PCR法によって増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　シャクcDNAは前述のシャク総RNA 1μgを鋳型として逆転写反応することにより得た。cDNA合成はSuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL）を利用し、合成条件は製造業者が推奨する条件に倣った。
　PCR反応液(50μl)は、シャクcDNA 1μl、1×ExTaq buffer(TaKaRa Bio)、0.2mM dNTP、プライマー(表3)各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5Uからなる。このPCR反応液を、94℃で3分間反応させた後、94℃で１分間、50℃で1分間、72℃で2分間の反応を30サイクル行った。PCR産物を1％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、AsOMT116の完全長ORFから推定された約1.1ｋｂのサイズの増幅産物が得られたことを確認した。
　このPCR産物をpBluescript SK+ベクター（Stratagene）にサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100 (Applied Biosystems) を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって挿入断片内ＰＣＲによる変異がないことを確認した。
　プライマーに付加したNheIおよびXhoIの制限酵素部位を利用して約1.1ｋｂのAsOMT116断片を切り出した。この断片を、大腸菌発現ベクターであるpET23a(Novagen社)のNheIおよびXhoIサイトへ連結し、本酵素遺伝子の大腸菌発現ベクターを得た。本ベクターXhoIサイト下流にあるHisタグとAsOMT116遺伝子のオープンリーディングフレームを有する、AsOMT116とHisタグの融合タンパク質が発現するよう設計した。
［実施例３］：酵素機能解析
　本酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られたAsOMT116大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を、50 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（10 g/l typtone pepton，5 g/l  yeast extract，1 g/l NaCl）4 mlに接種し、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度（OD600）がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5 mMのIPTGを添加し、18℃で20 hr振盪培養した。
　以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（5,000×g，10 min）にて集菌し、破砕バッファー［20 mM HEPESバッファー（pH 7.5）， 14 mM β-メルカプトエタノール］を細胞１gあたり1 ml添加し、形質転換体を懸濁した。続いてこの懸濁液を超音波破砕して（15 sec×8回）、遠心分離（15,000×g，15 min）した。得られた上清（可溶性画分）を粗酵素液として回収し、酵素解析に用いた。
　酵素反応条件は以下の通りである。反応液（0.04 mM Ｓ－アデノシルメチオニン、50 mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)、2mM MgCl2、0.01mM 基質（ツヤプリカチン）、約3mg粗酵素）50μlを調製し、30℃、１時間反応させた。
　酵素反応液は酢酸エチル抽出を行い、乾燥後、10μlのＮ，Ｏ－ビス(トリメチルシリル)アセトアミドに溶解させることでトリメチルシリル(TMS)化させ、下記条件でGC-MS分析を行った。
分析機器：島津 GCMS-QP2010 Plus mass spectrometer system 
モード：electron impact
カラム： 10m Shimadzu CPB10-M25
キャリアーガス： ヘリウム
インジェクション温度：250℃
カラム温度：160℃～250℃、速度20℃/分
　標品は前述の先行文献（Sakakibara, N., et al (2003) Org. Biomol. Chem. 1, 2474-2485）で調製したものを使用した。本条件で標準品の5’位メチルツヤプリカチン、5位メチルツヤプリカチンおよび4位メチルツヤプリカチンはそれぞれ保持時間約20.1分、20.3分、および18.3分に溶出された(図１)。5’位メチルツヤプリカチンと5位メチルツヤプリカチンの保持時間は近似しているが、これら両者はMSフラグメントパターンから区別できることを確認した（図２）。たとえば、5位メチルツヤプリカチンで見られる239のフラグメントイオンは5’位メチルツヤプリカチンには認められないが、逆に、5’位メチルツヤプリカチンに見られる297のフラグメントイオンは5位メチルツヤプリカチンには認められない（図２）。すべてのモノメチル化ツヤプリカチンには、水酸基がTMS化された532の親イオンが認められた。上記の5位メチル化ツヤプリカチンで見られる239のフラグメントイオン、およびツヤプリカチンと5’位ツヤプリカチンにおいて見られる297のフラグメントイオンから、それらの構造を推定した（図３）。
　上記のGC-MS分析条件で、AsOMT116の酵素反応液をGC-MS分析に供したところ、保持時間約20.3分に新たな生成物が検出された（図４A及びC）。このGC保持時間20.3分のピークは、煮沸処理したAsOMT116では得られなかった（図４D）。したがって、20.3分のピークがAsOMT116の反応生成物であることを確認した。
　このGC保持時間20.3分のピーク生成物についての質量分析（MS）の結果から、239のフラグメントイオンなど、5位メチル化ツヤプリカチンと共通する質量分析パターンが検出された（図５B及びC）。したがって、このAsOMT116の酵素反応液中の新たな生成物は5位メチル化ツヤプリカチンであることが判明した（図５）。また、反応基質であるツヤプリカチンにおいて、親イオン590は認められるが、図５B及びCで検出された239のイオンは認められなかった（図５A）。一方、5位メチル化ツヤプリカチン又は反応生物において、239のフラグメントイオンの出現に伴い、反応基質であるツヤプリカチンで検出された297のイオンは消失した（図５B及びC）。すなわち、この239のフラグメントイオンがAsOMT116によってメチル化を受けた部分を含むフラグメントであることが示された。したがって、GC-MS分析によって、5位メチル化ツヤプリカチンがAsOMT116の反応生成物であることを確認した。
　以上の結果から、AsOMT116はシャク由来のツヤプリカチンの5位を特異的にメチル化する新規メチル化酵素であることが示された。
　本発明によれば、ツヤプリカチンなどのリグナンをメチル化できるので、新たな機能を有するリグナン化合物の探索に有用である。本発明の遺伝子を用いて探索される化合物あるいはそれを中間体として得られる化合物は、医薬の有効成分、機能性食品素材、園芸植物において新しい花色を導く分子となり得る。例えば、後述の実施例において得られたメチルツヤプリカチンは、抗癌剤として知られているポドフィロトキシンの中間体として有用である。したがって、本発明は、医薬品産業、食品産業、農業などにおいて有用である。
配列番号：１：AsOMT116 cDNA配列
配列番号：２：AsOMT116のアミノ酸配列

Claims (13)

  1. 　以下の(a)～(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    　(a)配列番号：１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
    　(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、１～５０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　以下の(g)～(h)からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
    　(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、１～１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつリグナンメチル化活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  3. 　配列番号：１の塩基配列を含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　ＤＮＡである、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
  9. 　請求項７に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
  10. 　請求項８又は９に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からリグナンメチル化活性を有するタンパク質を採取する該タンパク質の製造方法。
  11. 　上記形質転換体が請求項1～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項８又は９に記載の形質転換体を培養し又は生育させ、当該形質転換体からメチル化リグナンを採取するメチル化リグナンの製造方法。
  13. 　上記形質転換体が請求項1～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたゴマ、レンギョウまたはアマである請求項１２に記載の方法。
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