WO2011037045A1

WO2011037045A1 - 腎細胞癌の判定法

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Publication number: WO2011037045A1
Application number: PCT/JP2010/065842
Authority: WO
Inventors: 西村　紳一郎; 嘉晃三浦; 拓中原; 麻穂天野; 大山　力; 真吾畠山
Original assignee: Hokkaido University NUC; Shionogi and Co Ltd; Hirosaki University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC; Shionogi and Co Ltd; Hirosaki University NUC
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2011-03-31
Anticipated expiration: 2012-03-25
Also published as: EP2482064A1; US20120309022A1; JPWO2011037045A1; EP2482064A4

Abstract

　本発明は、新規な腎細胞癌の診断法を提供する。本発明の方法は、患者の血清を用いてＮ－結合型糖鎖の網羅的解析を行い、検出された糖鎖の発現量を指標とすることにより腎細胞癌の有無または悪性度を評価することができる。

Description

腎細胞癌の判定法

　本発明は、腎細胞癌の判定法に関する。具体的には、腎細胞癌の有無を判定する方法、並びに腎細胞癌の悪性度を判定する方法に関する。

　腎臓癌は、成人における腫瘍の２～３％を占めており、腎臓で見つかる腫瘍のうち、９０～９５％は腎細胞癌である。また、画像診断の技術向上に伴い、比較的早期に偶然見つかるケースも増えてきたものの、巨大になるまで無症状である場合が多く、進行癌として見つかる例も３０％を上まわる。アメリカ合衆国においては、２００６年には３６，０００人が新規に腎臓癌と診断されたが、１３，０００人が死亡している。有効な臓器特異的腫瘍マーカーが未だ見出されていないため、早期発見は困難である。また、腎細胞癌の予後についても、有効な予測マーカーが未だ見出されておらず、手術後の補助療法の必要性や手術適応の決定を困難にしていることが、死亡率を高めている一因にもなっている。

　近年、腎臓癌の診断に関する手段が報告されている。例えば、特開２００８－２０９３６９号公報（特許文献１）には、腎臓癌組織におけるタンパク質の発現を測定することが記載されている。特開２００７－２６７７００号公報（特許文献２）には、腎細胞癌組織において癌抑制遺伝子のメチル化を検出することが記載されている。特開２００４－７７２６８号公報（特許文献３）には、血管新生を抑制するペプチドの癌組織における存在を検出・測定することが記載されている。Tunuguntla, H.S.G.R. et al., The Journal of Urology 179: 2096-2102 (2008)（非特許文献１）には、血清中の糖タンパク質を測定する方法が記載されている。Baldewijins, M.M.L. et al., Biochimicaet Biophysica Acta 1785: 133-155 (2008)（非特許文献２）には、癌遺伝子の検出による遺伝子診断について記載されている。また、特表２００９－５０６３０７号公報（特許文献４）には、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）－７に対する免疫反応レベルまたは抗ＭＭＰ－７抗体レベルを測定することにより腎細胞癌を診断することが記載されている。Sandim V., et al., "Renal Cell Carcinoma and Proteomics", Urologia Internationalis 84:373-377 (2010)（非特許文献３）には、腎細胞癌のプロテオーム解析について解説されており、腎細胞癌の早期発見を可能とするバイオマーカー探索のため、腎細胞癌のプロテオーム解析技術のさらなる開発が必要である旨が記載されている。

特開２００８－２０９３６９号公報特開２００７－２６７７００号公報特開２００４－７７２６８号公報特表２００９－５０６３０７号公報

Tunuguntla, H.S.G.R. et al., The Journal of Urology 179: 2096-2102 (2008) Baldewijins, M.M.L. et al., Biochimicaet Biophysica Acta 1785: 133-155 (2008) Sandim V., et al., "Renal Cell Carcinoma and Proteomics", Urologia Internationalis 84:373-377 (2010)

　上述のとおり、腎臓癌の診断技術に関する報告はされているものの、腎細胞癌を早期に発見・診断できる有効なマーカーは見出されていない。腎細胞癌は、初期には無症状であることが多いため、早期発見が困難な癌の１つである。およそ４０％の患者は、確定診断の時点で進行癌や転移癌に侵されているとの報告もある。これらの患者は、５年生存率が１０％以下と予後が悪く、腎臓癌を特異的に早期に検出できるマーカーが求められている。
　また、癌患者が癌と診断されてからどのくらいの期間元気で生活できるかという予測は、患者のＱＯＬ面からも、有効な治療を進める上でも、非常に重要である。したがって、腎臓癌の悪性度について、特に、進行性の腎細胞癌の診断とその予後の予測を可能にするマーカーも求められている。

　近年、腎細胞癌においても癌特異的に発現されているタンパク質をターゲットとした診断方法の研究が盛んであるが、遺伝子レベルでの解析に止まり、進展していないものも多い。遺伝子レベルでの解析を直接、臨床に応用するには、コストや時間などの面で多くの問題が残されている。また、癌細胞特異的に発現されているタンパク質を直接検出する場合でも、偽陽性や偽陰性がみられたり、検出感度が不十分であったりなど、改善されるべき点は多い。さらに、通常行われているＭＲＩやＣＴ、血管造影などの検査は、高価な装置を必要とし、かつ、多人数を一度に検査できないので、一次スクリーニングとしての使用は不可能である。

　本発明者らは、血清Ｎ－結合型糖鎖の網羅的解析を行い、腎細胞癌の存在あるいは悪性度と相関するバイオマーカーとして有用な糖鎖構造を見出した。即ち、本発明者らは、被験者の血液（血清）における特定の糖鎖の存在量、または、特定の複数の糖鎖の存在量を、本願発明者により既に開発された定量的な高速網羅的糖鎖エンリッチ技術（グライコブロッティング法）〔西村等(Nishimura S.-I., Niikura K., Kurogochi M., Matsushita T., Fumoto M., Hinou H., Kamitani R., Nakagawa H., Deguchi K., Miura N., Monde K., Kondo H.)「ハイスループット・プロテイングライコミクス：化学選択的グライコブロッティングとマルディトフ／トフ質量分析との併用」"High-Throughput Protein Glycomics: Combined Use of Chemoselective Glycoblotting and MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry", Angew. Chem. Int. Ed., 44, 91-96 (2005)〕を用いて測定することにより、腎細胞癌の存在あるいは悪性度を十分な特異性と感度でもって判定することができることを見出し、上記課題を解決した。

　本発明は、
（１）患者における腎細胞癌の有無を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した血清サンプルから全Ｎ－結合型糖鎖を回収する工程；
ｂ）該Ｎ－結合型糖鎖の定量的プロファイルを取得する工程；
ｃ）検出されたある１つの糖鎖の発現量、検出されたある１つの糖鎖と検出された別のもう１つの糖鎖との発現量比、または検出された糖鎖の発現量の総和を算出する工程；および
ｄ）該発現量、該発現量比または該発現量の総和を指標として腎細胞癌の有無を判定する工程
を含む方法；
（２）前記ｃ）の工程における糖鎖が、ＲＣ１、ＲＣ５、ＲＣ１５、ＲＣ１９、ＲＣ２２、ＲＣ２３、ＲＣ２５、ＲＣ３２、ＲＣ３３、ＲＣ４７および４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖からなる群から選択される、（１）記載の方法；
（３）前記ｃ）の工程において、ＲＣ３３の発現量またはＲＣ１９の発現量を算出する、（１）記載の方法；
（４）前記ｃ）の工程において、ＲＣ３３とＲＣ１５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１５）、ＲＣ３３とＲＣ１の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１）、ＲＣ４７とＲＣ１５の発現量比（ＲＣ４７／ＲＣ１５）、ＲＣ３３とＲＣ２２の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２２）、ＲＣ１９とＲＣ１５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ１５）、ＲＣ１９とＲＣ３２の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ３２）、ＲＣ１とＲＣ１９の発現量比（ＲＣ１／ＲＣ１９）、ＲＣ３３とＲＣ５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ５）、ＲＣ２３とＲＣ５の発現量比（ＲＣ２３／ＲＣ５）またはＲＣ３３とＲＣ２５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２５）を算出する、（１）記載の方法；
（５）前記ｃ）の工程において、４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和を算出する、（１）記載の方法；
（６）患者における腎細胞癌の悪性度を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した血清サンプルから全Ｎ－結合型糖鎖を回収する工程；
ｂ）該Ｎ－結合型糖鎖の定量的プロファイルを取得する工程；
ｃ）検出されたある１つの糖鎖と別のもう１つの糖鎖との発現量比を算出する工程；および
ｄ）該発現量比を指標として腎細胞癌の悪性度を判定する工程
を含む方法；
（７）前記ｃ）の工程における糖鎖が、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ５、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ１９、ＲＣ２９、ＲＣ３１およびＲＣ４０からなる群から選択される、（６）記載の方法；
（８）腎細胞癌の悪性度を、該腎細胞癌が進行性であるか否かについて判定する、（６）または（７）に記載の方法；
（９）前記ｃ）の工程において、ＲＣ３１とＲＣ２９の発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）、ＲＣ９とＲＣ６の発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）またはＲＣ４とＲＣ６の発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）を算出する、（８）記載の方法；
（１０）腎細胞癌の悪性度を、該腎細胞癌の予後について判定する、（６）または（７）に記載の方法；
（１１）前記ｃ）の工程において、ＲＣ３とＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）、ＲＣ７とＲＣ８の発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）、ＲＣ２とＲＣ８の発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）、ＲＣ１７とＲＣ１８の発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）、ＲＣ１２とＲＣ１３の発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）、ＲＣ３とＲＣ８の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）、ＲＣ５とＲＣ２９の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）、ＲＣ５とＲＣ４０の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）またはＲＣ１９とＲＣ５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）を算出する、（１０）記載の方法；
（１２）腎細胞癌の診断マーカーとしての、ＲＣ１、ＲＣ５、ＲＣ１５、ＲＣ１９、ＲＣ２２、ＲＣ２３、ＲＣ２５、ＲＣ３２、ＲＣ３３、ＲＣ４７からなる群から選択される糖鎖または４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の使用；
（１３）選択される糖鎖がＲＣ３３またはＲＣ１９である、（１２）記載の使用；
（１４）選択される糖鎖がＲＣ３３とＲＣ１５、ＲＣ３３とＲＣ１、ＲＣ４７とＲＣ１５、ＲＣ３３とＲＣ２２、ＲＣ１９とＲＣ１５、ＲＣ１９とＲＣ３２、ＲＣ１とＲＣ１９、ＲＣ３３とＲＣ５、ＲＣ２３とＲＣ５またはＲＣ３３とＲＣ２５の組合せである、（１２）記載の使用；
（１５）選択される糖鎖が４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖である、（１２）記載の使用；
（１６）進行性腎細胞癌の診断マーカーとしての、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ２９およびＲＣ３１からなる群から選択される糖鎖の使用；
（１７）選択される糖鎖が、ＲＣ３１とＲＣ２９、ＲＣ９とＲＣ６、またはＲＣ４とＲＣ６の組合せである、（１６）記載の使用；
（１８）腎細胞癌の予後予測マーカーとしての、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ５、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ１９、ＲＣ２９、ＲＣ３１およびＲＣ４０からなる群から選択される糖鎖の使用；および
（１９）選択される糖鎖が、ＲＣ３とＲＣ６、ＲＣ７とＲＣ８、ＲＣ２とＲＣ８、ＲＣ１７とＲＣ１８、ＲＣ１２とＲＣ１３、ＲＣ３とＲＣ８、ＲＣ５とＲＣ２９、ＲＣ５とＲＣ４０またはＲＣ１９とＲＣ５の組合せである、（１８）記載の使用
を提供する。

　本発明によれば、腎細胞癌の有無または悪性度を、従来法を上回る感度ならびに特異性で識別することができる。さらに、本発明では、患者から採取した血液試料を用いて糖鎖解析を行うため、患者への負担が極めて少ない。そして、本発明の方法では、一回の測定で得られた解析結果から、判定に用いる糖鎖を適宜選択することで複数の判定を行うことできるため、いくつも検査を行う必要がない。また、本発明では多人数を一度で検査でき、また、遺伝子診断などと比較して低価格で行うことが可能である。

腎細胞患者の血清より得られたＮ－結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを示す。上段：進行癌（死亡例）、中段：進行癌（生存例）、下段：限局癌。上段：腎細胞癌患者（限局癌および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ３と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ３と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（限局癌および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ７と糖鎖ＲＣ８の発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ７と糖鎖ＲＣ８の発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（限局癌および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ２と糖鎖ＲＣ８の発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ２と糖鎖ＲＣ８の発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ１７と糖鎖ＲＣ１８の発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ１７と糖鎖ＲＣ１８の発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ１２と糖鎖ＲＣ１３の発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ１２と糖鎖ＲＣ１３の発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（限局癌および進行癌（生存例））の血清における糖鎖ＲＣ３１と糖鎖ＲＣ２９の発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３１と糖鎖ＲＣ２９の発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（限局癌および進行癌（生存例））の血清における糖鎖ＲＣ９と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ９と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（限局癌および進行癌（生存例））の血清における糖鎖ＲＣ４と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ４と糖鎖ＲＣ６の発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ１５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１５）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ１５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ３３の発現量の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３３の発現量のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ１の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ１の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ４７と糖鎖ＲＣ１５の発現量比（ＲＣ４７／ＲＣ１５）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ４７と糖鎖ＲＣ１５の発現量比（ＲＣ４７／ＲＣ１５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ２２の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２２）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ２２の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２２）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ１９と糖鎖ＲＣ１５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ１５）の分布を示す箱ひげ図。下段：ＲＣ１９と糖鎖ＲＣ１５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ１５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ１９の発現量の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ１９の発現量のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ１９と糖鎖ＲＣ３２の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ３２）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ１９と糖鎖ＲＣ３２の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ３２）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ１と糖鎖ＲＣ１９の発現量比（ＲＣ１／ＲＣ１９）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ１と糖鎖ＲＣ１９の発現量比（ＲＣ１／ＲＣ１９）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ５）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和の分布を示す箱ひげ図。下段：４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ２３と糖鎖ＲＣ５の発現量比（ＲＣ２３／ＲＣ５）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ２３と糖鎖ＲＣ５の発現量比（ＲＣ２３／ＲＣ５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：健常者および腎細胞癌患者の血清における糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ２５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２５）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３３と糖鎖ＲＣ２５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ３と糖鎖ＲＣ８の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ３と糖鎖ＲＣ８の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ５と糖鎖ＲＣ２９の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ５と糖鎖ＲＣ２９の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ５と糖鎖ＲＣ４０の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ５と糖鎖ＲＣ４０の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。上段：腎細胞癌患者（進行癌（生存例）および進行癌（死亡例））の血清における糖鎖ＲＣ１９と糖鎖ＲＣ５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）の分布を示す箱ひげ図。下段：糖鎖ＲＣ１９と糖鎖ＲＣ５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）のＲＯＣ曲線（縦軸はtrue positive rate（真陽性率）を示し、横軸はfalse positive rate（偽陽性率）を示す。）。

　本発明によれば、被験者から採取した血清から、グライコブロッティング(Glycoblotting)法により血中の全Ｎ－結合型糖鎖を回収し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより定量的プロファイルを取得する。このとき、内部標準として既知量のオリゴ糖を添加しておけば、そのスペクトル上の面積より、検出された血中のＮ－結合型糖鎖の存在量（本明細書中、発現量ともいう）を容易に算出できる。糖鎖の具体的な解析方法は、上述の西村等（Angew. Chem. Int. Ed., 44, 91-96 (2005)）の記載および三浦等(Miura Y., Hato M., Shinohara Y., Kuramoto H., Furukawa J.-I., Kurogochi M., Shimaoka H., Tada M., Nakanishi K., Ozaki M., Todo S., and Nishimura S.-I.)の文献[“BlotGlycoABC^TM, an Integrated Glycoblotting Technique for Rapid and Large Scale Clinical Glycomics” Molecular & Cellular Proteomics 7:370-377 (2008)]、古川等(Furukawa J.-I., Shinohara Y., Kuramoto H., Miura Y., Shimaoka H., Kurogochi M., Nakano M., Nishimura S.-I.)らの記載[“Comprehensive Approach to Structural and Functional Glycomics Based on Chemoselective Glycoblotting and Sequential Tag Conversion”]、WO2009/044900の記載に基づいて行うことができる。

　次いで、検出されたある１つの糖鎖の発現量、検出されたある１つの糖鎖と検出された別のもう１つの糖鎖との発現量比、または検出された糖鎖の発現量の総和を算出し、それら発現量、発現量比または発現量の総和を指標として、患者における腎細胞癌の有無あるいは腎細胞癌の悪性度を判定することができる。

　本発明の方法において検出され用いられるＮ－結合型糖鎖は、例えば表１に示すとおりであるが、これに限定されない。

（表中、Manはマンノース、GlcNAcはＮ－アセチルグルコサミン、Hexはヘキソース、dHexはデオキシヘキソース、HexNAcはＮ－アセチルヘキソサミン、NeuAcはＮ－アセチルノイラミン酸を表す。）

　さらに、本発明の方法において検出され用いられるＮ－結合型糖鎖には、４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖も含まれる。「４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖」の「４分岐構造」とは、糖鎖のコア構造のうちα１→６結合したマンノースから、さらにβ１→６及びβ１→２結合したＮ-アセチルグルコサミンにより糖鎖が２つに分岐し、且つ、コア構造のうちα１→３結合したマンノースからは、β１→４及びβ１→２結合したＮ-アセチルグルコサミンにより糖鎖が２つに分岐した構造を意味する。また、「３分岐でバイセクティング構造」とは、上記４つの分岐鎖のうちの１つの分岐鎖が欠落し、且つ、糖鎖の主鎖の末端にβ１→４結合したGlcNAc（即ちバイセクティングGlcNAc）が存在する構造を有する糖鎖を意味する。例えば、以下の構造を有する糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
４分岐構造を有する糖鎖の例

３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の例

　本発明において、上記のグライコブロッティング法で検出された糖鎖の発現量、検出されたある１つの糖鎖と検出された別のもう１つの糖鎖との発現量比、または検出された糖鎖の発現量の総和が、腎細胞癌の有無と相関することが見出された。例えば、上に例示した糖鎖のうち、ＲＣ１、ＲＣ５、ＲＣ１５、ＲＣ１９、ＲＣ２２、ＲＣ２３、ＲＣ２５、ＲＣ３２、ＲＣ３３、ＲＣ４７、４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖は、腎細胞癌の存在と相関することが見出された。

　具体的には、腎細胞癌では、ＲＣ３３およびＲＣ１９の発現量が増大することが見出された。
　また、腎細胞癌では、以下に示す糖鎖の発現量比：
ＲＣ３３およびＲＣ１５（ＲＣ３３／ＲＣ１５）、
ＲＣ３３およびＲＣ１（ＲＣ３３／ＲＣ１）、
ＲＣ４７およびＲＣ１５（ＲＣ４７／ＲＣ１５）、
ＲＣ３３およびＲＣ２２（ＲＣ３３／ＲＣ２２）、
ＲＣ１９およびＲＣ１５（ＲＣ１９／ＲＣ１５）、
ＲＣ１９およびＲＣ３２（ＲＣ１９／ＲＣ３２）、
ＲＣ３３およびＲＣ５（ＲＣ３３／ＲＣ５）、
ＲＣ２３およびＲＣ５（ＲＣ２３／ＲＣ５）および
ＲＣ３３およびＲＣ２５（ＲＣ３３／ＲＣ２５）
は増大し、
ＲＣ１およびＲＣ１９（ＲＣ１／ＲＣ１９）、
は減少することが見出された。
　さらに、腎細胞癌では、４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和が増大することが見出された。

　さらに本発明において、上記のグライコブロッティング法で検出されたある１つの糖鎖と検出された別のもう１つの糖鎖との発現量比が、腎細胞癌の悪性度と相関することが見出された。例えば、上に例示した糖鎖のうち、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ５、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ１９、ＲＣ２９、ＲＣ３１およびＲＣ４０は、腎細胞癌の悪性度と相関することが見出された。

　具体的には、進行性の腎細胞癌では、以下に示す糖鎖の発現量比：
ＲＣ９とＲＣ６の発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）および
ＲＣ４とＲＣ６の発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）
は増大し、
ＲＣ３１とＲＣ２９の発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）
は減少することが見出された。

　さらに、予後不良の進行性腎細胞癌では、
ＲＣ３とＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）、
ＲＣ７とＲＣ８の発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）、
ＲＣ２とＲＣ８の発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）、
ＲＣ１２とＲＣ１３の発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）、
ＲＣ３とＲＣ８の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）および
ＲＣ１９とＲＣ５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）
は増大し、
ＲＣ１７とＲＣ１８の発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）
ＲＣ５とＲＣ２９の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）および
ＲＣ５とＲＣ４０の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）
は減少することが見出された。

　このように、上記のグライコブロッティング法により血清中のＮ－結合型糖鎖の網羅的解析を行い、検出された糖鎖の発現量または発現量比をマーカーとして用いることで、腎細胞癌の有無や悪性度を判定することができる（後記実施例参照）。
　中でも、ＲＣ３３およびＲＣ１９の発現量、発現量比ＲＣ３３／ＲＣ１５、ＲＣ３３／ＲＣ１、ＲＣ４７／ＲＣ１５、ＲＣ３３／ＲＣ２２、ＲＣ１９／ＲＣ１５、ＲＣ１９／ＲＣ３２、ＲＣ３３／ＲＣ５、ＲＣ２３／ＲＣ５、ＲＣ３３／ＲＣ２５、ＲＣ１／ＲＣ１９、および４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和は、健常者と腎細胞患者との間で有意差がみられ、腎細胞癌の存在を診断するためのマーカーとして有用である。
　また、発現量比ＲＣ３１／ＲＣ２９、ＲＣ９／ＲＣ６およびＲＣ４／ＲＣ６は、限局癌と進行癌との間で有意差がみられ、進行癌を診断するためのマーカーとして有用である。さらに、発現量比ＲＣ３／ＲＣ６、ＲＣ７／ＲＣ８、ＲＣ２／ＲＣ８、ＲＣ１７／ＲＣ１８、ＲＣ１２／ＲＣ１３、ＲＣ３／ＲＣ８、ＲＣ５／ＲＣ２９、ＲＣ５／ＲＣ４０、ＲＣ１９／ＲＣ５は、腎細胞癌の生存例と死亡例との間で有意差がみられ、死亡する可能性のある腎細胞癌を見出す予後マーカーとして有用である。
　さらに、複数の糖鎖発現量比の変動を組み合わせることにより、診断効率をさらに上げることも可能である。

　以下に実施例を記載して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

　腎細胞癌患者計３１名（限局癌１７例、進行癌（生存例）６例、進行癌（死亡例）８例）の血清を用い、西村等の方法（前掲）により、Ｎ－結合型糖鎖の網羅的解析を行った。定量的プロファイルは、血清中のＮ－結合型糖鎖の捕捉・精製後、MALDI-TOF MSにより取得した。腎細胞癌患者のＮ－結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを図１に示す。各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した。
　検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３の発現量とＲＣ６の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）を算出したところ、進行癌（死亡例）において、有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝１．０００）（図２、図３）。つまり、発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）は、腎細胞癌の悪化に伴い増加する値であり、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ７の発現量とＲＣ８の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）を算出したところ、限局癌と比較して、進行癌（死亡例）において、有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝１．０００）（図４）。つまり、発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ２の発現量とＲＣ８の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）を算出したところ、限局癌と比較して、進行癌（死亡例）において、有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝１．０００）（図５）。つまり、発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１７の発現量とＲＣ１８の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）を算出した。進行癌（生存例）と比較した場合、進行癌（死亡例）において、有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９４３）（図６）。つまり、発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１２の発現量とＲＣ１３の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）を算出した。進行癌（生存例）と比較した場合、進行癌（死亡例）において、有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９３８）（図７）。つまり、発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３１の発現量とＲＣ２９の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）を算出した。限局癌と比較した場合、進行癌（生存例）において、有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９２０）（図８）。つまり、発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）は、限局癌と進行癌とを判別可能な診断マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ９の発現量とＲＣ６の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）を算出した。限局癌と比較した場合、進行癌（生存例）において、有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９１１）（図９）。つまり、発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）は、限局癌と進行癌とを判別可能な診断マーカーとして用いることができる。

　実施例１で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ４の発現量とＲＣ６の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）を算出した。限局癌と比較した場合、進行癌（生存例）において、有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８９３）（図１０）。つまり、発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）は、限局癌と進行癌とを判別可能な診断マーカーとして用いることができる。

　腎細胞癌患者（６５名：３０歳代～９０歳代）の血清と、健常者（８５名：４０歳代～７０歳代）の血清を用い、実施例１と同様に解析を行った。
　検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３３の発現量とＲＣ１５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１５）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９３６）（図１１）。つまり、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１５）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３３の発現量のみに着目したところ、健常者と比較して、腎細胞癌においては、有意に発現量が高かった（ＡＵＣ＝０．９１９）（図１２）。つまり、ＲＣ３３の発現量は、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３３の発現量とＲＣ１の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９０５）（図１３）。つまり、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ４７の発現量とＲＣ１５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ４７／ＲＣ１５）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９０１）（図１４）。つまり、発現量比（ＲＣ４７／ＲＣ１５）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３３の発現量とＲＣ２２の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２２）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８９７）（図１５）。つまり、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２２）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１９の発現量とＲＣ１５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ１５）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８８７）（図１６）。つまり、発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ１５）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１９の発現量のみに着目したところ、健常者と比較して、腎細胞癌においては、有意に発現量が高かった（ＡＵＣ＝０．８８６）（図１７）。つまり、ＲＣ１９の発現量は、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１９の発現量とＲＣ３２の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ３２）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８８４）（図１８）。つまり、発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ３２）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１の発現量とＲＣ１９の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ１／ＲＣ１９）を算出したところ、腎細胞癌において有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８８１）（図１９）。つまり、発現量比（ＲＣ１／ＲＣ１９）は、腎細胞癌患者において特異的に減少する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３３の発現量とＲＣ５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ５）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８８０）（図２０）。つまり、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ５）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、４分岐または３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量に着目し、その総和を算出したところ、健常者と比較して、腎細胞癌においては、有意に数値が大きかった（ＡＵＣ＝０．８７９）（図２１）。つまり、４分岐または３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和は、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ２３の発現量とＲＣ５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ２３／ＲＣ５）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８７７）（図２２）。つまり、発現量比（ＲＣ２３／ＲＣ５）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　実施例９で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３３の発現量とＲＣ２５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２５）を算出したところ、腎細胞癌において有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．８７６）（図２３）。つまり、発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２５）は、腎細胞癌患者において特異的に増加する値であり、腎細胞癌を見出す診断マーカーとして用いることができる。

　腎臓癌患者計６５名（限局癌４０例、進行癌（生存例）１４例、進行癌（死亡例）１１例）の血清を用い実施例１と同様に解析を行った。検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ３の発現量とＲＣ８の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）を算出したところ、進行癌（死亡例）において、有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９７１）（図２４）。つまり、発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例２２で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ５の発現量とＲＣ２９の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）を算出したところ、進行癌（死亡例）において、有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９６１）（図２５）。つまり、発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例２２で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ５の発現量とＲＣ４０の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）を算出したところ、進行癌（死亡例）において、有意に低い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９５８）（図２６）。つまり、発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　実施例２２で検出された糖鎖のうち、糖鎖ＲＣ１９の発現量とＲＣ５の発現量に着目し、発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）を算出したところ、進行癌（死亡例）において、有意に高い値が得られた（ＡＵＣ＝０．９５０）（図２７）。つまり、発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）は、死亡する可能性のある進行癌を見出す予後マーカーとして用いることができる。

　本発明の方法は、腎細胞癌の診断および予後の予測に用いることができる。特に、本発明の方法は、多人数を一度に検査することができるので、腎細胞癌の一次スクリーニングに有用である。

Claims

　患者における腎細胞癌の有無を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した血清サンプルから全Ｎ－結合型糖鎖を回収する工程；
ｂ）該Ｎ－結合型糖鎖の定量的プロファイルを取得する工程；
ｃ）検出されたある１つの糖鎖の発現量、検出されたある１つの糖鎖と検出された別のもう１つの糖鎖との発現量比、または検出された糖鎖の発現量の総和を算出する工程；および
ｄ）該発現量、該発現量比または該発現量の総和を指標として腎細胞癌の有無を判定する工程
を含む方法。
　前記ｃ）の工程における糖鎖が、ＲＣ１、ＲＣ５、ＲＣ１５、ＲＣ１９、ＲＣ２２、ＲＣ２３、ＲＣ２５、ＲＣ３２、ＲＣ３３、ＲＣ４７および４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
　前記ｃ）の工程において、ＲＣ３３の発現量またはＲＣ１９の発現量を算出する、請求項１記載の方法。
　前記ｃ）の工程において、ＲＣ３３とＲＣ１５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１５）、ＲＣ３３とＲＣ１の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ１）、ＲＣ４７とＲＣ１５の発現量比（ＲＣ４７／ＲＣ１５）、ＲＣ３３とＲＣ２２の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２２）、ＲＣ１９とＲＣ１５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ１５）、ＲＣ１９とＲＣ３２の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ３２）、ＲＣ１とＲＣ１９の発現量比（ＲＣ１／ＲＣ１９）、ＲＣ３３とＲＣ５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ５）、ＲＣ２３とＲＣ５の発現量比（ＲＣ２３／ＲＣ５）またはＲＣ３３とＲＣ２５の発現量比（ＲＣ３３／ＲＣ２５）を算出する、請求項１記載の方法。
　前記ｃ）の工程において、４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の発現量の総和を算出する、請求項１記載の方法。
　患者における腎細胞癌の悪性度を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した血清サンプルから全Ｎ－結合型糖鎖を回収する工程；
ｂ）該Ｎ－結合型糖鎖の定量的プロファイルを取得する工程；
ｃ）検出されたある１つの糖鎖と別のもう１つの糖鎖との発現量比を算出する工程；および
ｄ）該発現量比を指標として腎細胞癌の悪性度を判定する工程
を含む方法。
　前記ｃ）の工程における糖鎖が、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ５、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ１９、ＲＣ２９、ＲＣ３１およびＲＣ４０からなる群から選択される、請求項６記載の方法。
　腎細胞癌の悪性度を、該腎細胞癌が進行性であるか否かについて判定する、請求項６または７に記載の方法。
　前記ｃ）の工程において、ＲＣ３１とＲＣ２９の発現量比（ＲＣ３１／ＲＣ２９）、ＲＣ９とＲＣ６の発現量比（ＲＣ９／ＲＣ６）またはＲＣ４とＲＣ６の発現量比（ＲＣ４／ＲＣ６）を算出する、請求項８記載の方法。
　腎細胞癌の悪性度を、該腎細胞癌の予後について判定する、請求項６または７に記載の方法。
　前記ｃ）の工程において、ＲＣ３とＲＣ６の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ６）、ＲＣ７とＲＣ８の発現量比（ＲＣ７／ＲＣ８）、ＲＣ２とＲＣ８の発現量比（ＲＣ２／ＲＣ８）、ＲＣ１７とＲＣ１８の発現量比（ＲＣ１７／ＲＣ１８）、ＲＣ１２とＲＣ１３の発現量比（ＲＣ１２／ＲＣ１３）、ＲＣ３とＲＣ８の発現量比（ＲＣ３／ＲＣ８）、ＲＣ５とＲＣ２９の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ２９）、ＲＣ５とＲＣ４０の発現量比（ＲＣ５／ＲＣ４０）またはＲＣ１９とＲＣ５の発現量比（ＲＣ１９／ＲＣ５）を算出する、請求項１０記載の方法。
　腎細胞癌の診断マーカーとしての、ＲＣ１、ＲＣ５、ＲＣ１５、ＲＣ１９、ＲＣ２２、ＲＣ２３、ＲＣ２５、ＲＣ３２、ＲＣ３３、ＲＣ４７からなる群から選択される糖鎖または４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖の使用。
　選択される糖鎖がＲＣ３３またはＲＣ１９である、請求項１２記載の使用。
　選択される糖鎖がＲＣ３３とＲＣ１５、ＲＣ３３とＲＣ１、ＲＣ４７とＲＣ１５、ＲＣ３３とＲＣ２２、ＲＣ１９とＲＣ１５、ＲＣ１９とＲＣ３２、ＲＣ１とＲＣ１９、ＲＣ３３とＲＣ５、ＲＣ２３とＲＣ５またはＲＣ３３とＲＣ２５の組合せである、請求項１２記載の使用。
　選択される糖鎖が４分岐構造若しくは３分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖である、請求項１２記載の使用。
　進行性腎細胞癌の診断マーカーとしての、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ２９およびＲＣ３１からなる群から選択される糖鎖の使用。
　選択される糖鎖が、ＲＣ３１とＲＣ２９、ＲＣ９とＲＣ６、またはＲＣ４とＲＣ６の組合せである、請求項１６記載の使用。
　腎細胞癌の予後予測マーカーとしての、ＲＣ２、ＲＣ３、ＲＣ４、ＲＣ５、ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９、ＲＣ１２、ＲＣ１３、ＲＣ１７、ＲＣ１８、ＲＣ１９、ＲＣ２９、ＲＣ３１およびＲＣ４０からなる群から選択される糖鎖の使用。
　選択される糖鎖が、ＲＣ３とＲＣ６、ＲＣ７とＲＣ８、ＲＣ２とＲＣ８、ＲＣ１７とＲＣ１８、ＲＣ１２とＲＣ１３、ＲＣ３とＲＣ８、ＲＣ５とＲＣ２９、ＲＣ５とＲＣ４０またはＲＣ１９とＲＣ５の組合せである、請求項１８記載の使用。