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WO2011027850A1 - ゼラチンを含む骨再生剤 - Google Patents

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Publication number
WO2011027850A1
WO2011027850A1 PCT/JP2010/065108 JP2010065108W WO2011027850A1 WO 2011027850 A1 WO2011027850 A1 WO 2011027850A1 JP 2010065108 W JP2010065108 W JP 2010065108W WO 2011027850 A1 WO2011027850 A1 WO 2011027850A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gelatin
amino acid
bone
acid sequence
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2010/065108
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
崇弘 平塚
章二 大屋
一郎 西村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Priority to CA2773062A priority Critical patent/CA2773062C/en
Priority to US13/394,263 priority patent/US8987204B2/en
Priority to CN201080039114.7A priority patent/CN102625717B/zh
Priority to CN201610111486.5A priority patent/CN105753970B/zh
Priority to EP18162307.5A priority patent/EP3391913B1/en
Priority to EP10813797.7A priority patent/EP2478923B1/en
Priority to JP2011529950A priority patent/JP5642685B2/ja
Publication of WO2011027850A1 publication Critical patent/WO2011027850A1/ja
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Priority to US14/629,135 priority patent/US9968661B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a bone regeneration agent and a bone filling preparation using gelatin.
  • Living tissue is mainly composed of cells and extracellular matrix (polymer structure).
  • the extracellular matrix secreted by the cells provides a functional hydration space and cell scaffold.
  • it has a function as a reservoir for various growth factors secreted by cells, and has a significant influence on the expression and differentiation of cells. In vivo, both interact in a complex manner, affecting various life activities.
  • Bone regeneration in the orthopedic region or dental region is one of the regions that are attracting much attention as an application of regenerative medicine. That is, when the bone disease is a foot or waist, it is impossible to walk, and in the case of dentistry, it is difficult to eat food.
  • typical bone regeneration preparations include Infuse (a combination of BMP-2 and collagen sponge) to treat spinal injury, BioOss (deproteinized bovine ground bone) as a bone filling agent to regenerate alveolar bone, Puros (pulverized human bone), Gem21 (PDGF and ⁇ TCP), Osferion ( ⁇ TCP), and Terplag (US name: FOUNDATION, collagen sponge) are known.
  • Properties required for a bone regeneration treatment preparation include: 1. Strength for maintaining the structure 2. Secure space for bone regeneration. 3. Scaffolds for bone regenerating cells 4. differentiation and proliferation of bone regenerating cells; Degradability associated with bone regeneration is known.
  • the main diseases using the above-mentioned bone regeneration treatment preparation are: Ridge Augmentation, 2. Socket Preservation, 3. Periodontal bone defect regeneration 4. Implantable bone regeneration Sinus Lift is known. While the importance of scaffolding materials that promote bone regeneration in the disease is recognized, the above preparation relies on the bone re-performance of the drug (BMP and PDGF) contained in the preparation, and the function of the material is to secure space in the affected area ( In many cases, inorganic substances are widely used.
  • BMP and PDGF the drug
  • Non-patent Document 1 As a scaffold material (organic substance) for regenerative medicine, collagen or gelatin which is a modified body of collagen is widely used in many cases.
  • a bone regeneration material it is known that highly oriented collagen plays an important role in calcification (Non-patent Document 1), and therefore, a collagen sponge is marketed as a bone regeneration material ( Tel plug (FOUNDATION, Olympus Terumo)).
  • Tel plug As calcification, Olympus Terumo
  • the bone prosthetic material using a collagen sponge only provides a scaffold for tissue formation, and bone is not formed with a collagen sponge alone (Non-patent Document 2).
  • gelatin which is a modified form of collagen, has not been known at all for the bone regeneration effect of gelatin itself according to the knowledge so far. 1.
  • Non-patent Document 3 Gelatin sponge alone inhibits bone regeneration. It is stated that gelatin does not have bone re-performance compared to collagen (Non-patent Document 4). Furthermore, it has been reported that no bone is formed even in ⁇ -TCP, which is an artificial bone component, in the same manner as gelatin sponge obtained by heat-treating collagen (Non-patent Documents 2 and 5). As described above, gelatin widely used as a regenerative medical base material is recognized as being unsuitable as a scaffold material for a bone regeneration treatment agent.
  • the present invention has an object to be solved by providing a bone regenerating agent and a bone filling preparation capable of promoting bone regeneration with the filler carrier itself.
  • gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen, more preferably genetically modified gelatin, has an action of regenerating bone.
  • the present invention has been completed.
  • a bone regenerating agent containing gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen.
  • the gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen is a genetically modified gelatin.
  • gelatin has a repetition of a sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents any one of amino acids) (a plurality of Gly-XY may be the same or different)
  • the molecular weight is 2 KDa or more and 100 KDa or less.
  • gelatin has a repetition of a sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents any one of amino acids) (a plurality of Gly-XY may be the same or different)
  • the molecular weight is 10 KDa or more and 90 KDa or less.
  • gelatin has a repetition of a sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents any one of amino acids) (a plurality of Gly-XY may be the same or different) 2 or more sequences in a molecule.
  • the cell adhesion signal is an amino acid sequence represented by Arg-Gly-Asp.
  • the amino acid sequence of gelatin does not contain serine and threonine.
  • the amino acid sequence of gelatin does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine, and cysteine.
  • the amino acid sequence of gelatin does not include the amino acid sequence represented by Asp-Arg-Gly-Asp.
  • gelatin is Formula: A-[(Gly-XY) n ] m -B (In the formula, A represents an arbitrary amino acid or amino acid sequence, B represents an arbitrary amino acid or amino acid sequence, n Xs independently represent any of the amino acids, and n Ys each independently represent an amino acid. N represents an integer of 3 to 100, and m represents an integer of 2 to 10. Note that n Gly-XY may be the same or different.
  • gelatin is Formula: Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly (In the formula, 63 X's each independently represent any amino acid, and 63 Y's each independently represent any amino acid. The 63 Gly-XYs may be the same or different. Good.) Indicated by
  • gelatin has (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or (2) an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a bone regeneration action .
  • the gelatin is cross-linked.
  • the crosslinking is performed with aldehydes, condensing agents or enzymes.
  • a bone filling preparation comprising the above-described bone regeneration agent of the present invention.
  • a method for inducing bone regeneration comprising administering gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen to a subject in need of bone regeneration.
  • gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen for the production of a bone regeneration agent or a bone filling preparation.
  • the bone regenerative agent of the present invention can exhibit an excellent bone regeneration effect with the support carrier itself without using a physiologically active substance such as platelet-derived growth factor or bone morphogenetic factor.
  • FIG. 1 shows an untreated HE-stained image of a rat calvarial bone defect model.
  • FIG. 2 shows an HE-stained image in which bone is formed in the affected area after genetically modified gelatin powder is implanted in the affected area.
  • FIG. 3 shows an HE-stained image in which porcine-derived gelatin powder is embedded in a defect affected area.
  • FIG. 4 shows an HE-stained image in which collagen powder is embedded in the defect site.
  • FIG. 5 shows an HE-stained image in which bovine cancellous bone (Bio-Oss (trade name), Osteohealth), which is an insoluble substrate, is implanted in the affected area.
  • FIG. 6 shows an electron micrograph of the R-Gel formulation and the interior of the telplug.
  • FIG. 1 shows an untreated HE-stained image of a rat calvarial bone defect model.
  • FIG. 2 shows an HE-stained image in which bone is formed in the affected area after genetically modified ge
  • FIG. 7 shows a rat skull defect model. Left: Macroscopic photograph, Right: ⁇ CT photograph (Micro-CT image: Tissue Eng (2007) 13 (3): 501-12)
  • FIG. 8 shows a method for calculating the bone regeneration rate (analysis from a pathological specimen).
  • FIG. 9 shows the change over time in the bone regeneration rate at the rat skull defect. R-Cel and animal gelatin showed superior bone regeneration rates compared to Bio-Oss Cancellous and Telplug.
  • FIG. 10 shows photographs of pathological specimens (H & E staining) 1 month and 2 months after transplantation into the rat skull. R-Gel (top) and animal gelatin (bottom). In January, the bone regenerates on the surface of R-Gel and animal gelatin.
  • FIG. 11 shows macrophotographs of the extraction site immediately after transplantation and 2 months later in a canine mandibular premolar extraction model.
  • gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen is used as a bone regeneration agent.
  • the bone regenerating agent of the present invention is characterized in that gelatin itself having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen exhibits a bone regenerating action. Therefore, in the bone regenerative agent of the present invention, it is not necessary to contain other substances having a bone regenerating action in addition to gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen. Does not contain other substances having a bone regeneration action other than the gelatin.
  • the bone regeneration agent of the present invention is preferably composed only of gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen.
  • the collagen may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, and type V. More preferred are type I, type II and type III.
  • the collagen origin is preferably human, cow, pig, mouse, rat. More preferably, it is a human.
  • the gelatin as used herein is not particularly limited as long as it has an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen.
  • the gelatin has a GXY portion characteristic of collagen.
  • the GXY portion characteristic of collagen is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins.
  • glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats. Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y contain a large amount of imino acids (proline, oxyproline), and occupy 10% to 45% of the total.
  • the gelatin used in the present invention may be a gelatin derived from a natural animal or a genetically modified gelatin.
  • the origin of gelatin is not particularly limited, and any origin such as fish, cow, pig, goat may be used.
  • gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen is preferably genetically modified gelatin. Since genetically modified gelatin is an artificial gelatin rather than an animal, it is a highly biocompatible bone grafting material that avoids heterogeneous infection.
  • a genetically modified gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen can be used, for example, those described in EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008 / 103041, etc. However, it is not limited to these.
  • Preferred as the genetically modified gelatin used in the present invention is the genetically modified gelatin of the following embodiment.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is excellent in biocompatibility due to the inherent performance of natural gelatin, and is not naturally derived.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is more uniform than natural ones and the sequence is determined, the strength and degradability can be precisely designed with less blur due to cross-linking described later. It is.
  • the molecular weight of the genetically modified gelatin used in the present invention is preferably from 2 to 100 KDa. More preferably, it is 2.5 to 95 KDa. More preferably, it is 5 to KDa. Most preferably, it is 10 KDa or more and 90 KDa or less.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-X-Ys may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the GXY sequence characteristic of collagen is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats. Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y are rich in imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • 80% or more of the sequence, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acids are GXY repeating structures.
  • General gelatin has 1: 1 polar amino acids, both charged and uncharged.
  • the polar amino acid specifically refers to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, arginine, and among these polar uncharged amino acids are cysteine, asparagine, glutamine, serine. , Threonine, tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of all the constituent amino acids.
  • the ratio of the uncharged amino acid in the polar amino acid is 5% or more and less than 20%, preferably less than 10%. Furthermore, it is preferable that any one amino acid among serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine is not included in the sequence, preferably two or more amino acids.
  • the minimum amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, “Pathophysiology”, Vol. 9, No. 7 (1990), page 527, published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the genetically modified gelatin used in the present invention preferably has two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequences, LDV sequences, REDV sequences, YIGSR sequences, PDSGR sequences, RYVVLPR sequences, LGITIPG sequences, RNIAEIIKDI sequences, which are expressed in one-letter amino acid notation in that many types of cells adhere.
  • IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence are preferable, RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence, and HAV sequence, and particularly preferably RGD sequence.
  • RGD sequences an ERGD sequence is preferred.
  • the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 per protein molecule from the viewpoint of cell adhesion and proliferation. Most preferably, it is 12.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%.
  • each stretch of 350 amino acids has at least 1 stretch.
  • it contains two RGD motifs.
  • the ratio of RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, more preferably at least 0.8%, more preferably at least 1.0%, more preferably at least 1.2%. And most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the genetically modified gelatin is preferably at least 4, more preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids. Since the number of RGD motifs is an integer, a gelatin of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences to meet the 0.4% feature.
  • the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 per 250 amino acids. Contains one RGD sequence.
  • the genetically modified gelatin of the present invention it contains at least 4 RGD motifs, preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less. Further, the genetically modified gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention preferably has a repeating structure of A [(Gly-XY) n ] m B.
  • m is preferably 2 to 10, and preferably 3 to 5.
  • n is preferably 3 to 100, more preferably 15 to 70, and most preferably 50 to 65.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, and type V. More preferred are type I, type II and type III.
  • the collagen origin is preferably human, cow, pig, mouse, rat. More preferably, it is a human.
  • the isoelectric point of the genetically modified gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and further preferably 7 to 9.5.
  • the genetically modified gelatin is not deaminated.
  • the genetically modified gelatin does not have procollagen and procollagen.
  • the genetically modified gelatin has no telopeptide.
  • the genetically modified gelatin is a substantially pure collagen material prepared with a nucleic acid encoding natural collagen.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; or (2) 80% or more (more preferably 90% or more, most preferably 95% or more) of homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having a bone regeneration action; A genetically modified gelatin having
  • the genetically modified gelatin used in the present invention can be produced by a genetic recombination technique known to those skilled in the art, for example, according to the method described in EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008 / 103041, and the like. Specifically, a gene encoding the amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector, which is then introduced into a suitable host to produce a transformant. To do. By culturing the obtained transformant in an appropriate medium, genetically modified gelatin is produced.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is prepared by recovering the genetically modified gelatin produced from the culture. be able to.
  • the gelatin used in the present invention can be chemically modified depending on the application. Chemical modifications include the introduction of low molecular weight compounds or various polymers (biopolymers (sugars, proteins), synthetic polymers, polyamides) into the carboxyl group or amino group of the side chain of gelatin, and cross-linking between gelatins. Is mentioned. Examples of the introduction of the low molecular weight compound into the gelatin include a carbodiimide-based condensing agent.
  • the crosslinking agent used in the present invention is not particularly limited as long as the present invention can be carried out, and may be a chemical crosslinking agent or an enzyme.
  • the chemical cross-linking agent include formaldehyde, glutaraldehyde, carbodiimide, cyanamide and the like. Preferred are formaldehyde and glutaraldehyde.
  • examples of the crosslinking of gelatin include light irradiation to gelatin into which a photoreactive group has been introduced, or light irradiation in the presence of a photosensitizer.
  • photoreactive group examples include a cinnamyl group, a coumarin group, a dithiocarbamyl group, a xanthene dye, and camphorquinone.
  • glutaraldehyde is most preferred.
  • the enzyme When performing cross-linking with an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a cross-linking action between gelatin chains, but preferably cross-linking can be performed using transglutaminase and laccase, and most preferably transglutaminase.
  • a specific example of a protein that is enzymatically cross-linked with transglutaminase is not particularly limited as long as it has a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be derived from a mammal or may be derived from a microorganism. Specifically, transglutaminase derived from a mammal that has been marketed as an Ajinomoto Co., Ltd.
  • Human-derived blood coagulation factors Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc.
  • Factor XIIIa Haematologic Technologies, Inc.
  • guinea pig liver-derived transglutaminase goat-derived transglutaminase
  • rabbit-derived transglutaminase manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign International, etc. Etc.
  • Gelatin crosslinking has two processes: a process of mixing a gelatin solution and a crosslinking agent and a process of reacting these uniform solutions.
  • the mixing temperature when the gelatin is treated with the crosslinking agent is not particularly limited as long as the solution can be uniformly stirred, but is preferably 0 ° C. to 40 ° C., more preferably 0 ° C. to 30 ° C.
  • the temperature is preferably 3 ° C to 25 ° C, more preferably 3 ° C to 15 ° C, further preferably 3 ° C to 10 ° C, and particularly preferably 3 ° C to 7 ° C.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the crosslinking proceeds, but it is substantially 0 ° C. to 60 ° C., more preferably 0 ° C. to 40 ° C., more preferably in consideration of gelatin modification and decomposition. It is 3 ° C to 25 ° C, more preferably 3 ° C to 15 ° C, still more preferably 3 ° C to 10 ° C, and particularly preferably 3 ° C to 7 ° C.
  • bone regeneration is induced by administering gelatin having an amino acid sequence derived from the above-mentioned partial amino acid sequence of collagen to a subject (for example, a mammal such as a human) who needs bone regeneration. be able to.
  • the bone regeneration agent of the present invention can be used as a bone filling preparation.
  • the bone regenerating agent and bone filling preparation of the present invention can be appropriately determined in dosage, usage, and dosage form according to the purpose of use.
  • the bone regenerating agent of the present invention may be directly administered to a target site in a living body, or distilled water for injection, physiological saline for injection, pH 5-8 buffer (phosphate system, citric acid system). Etc.) may be suspended in a liquid vehicle such as an aqueous solvent and administered by injection, coating, or the like. Further, it may be applied after mixing with an appropriate excipient to form an ointment, gel or cream. That is, the administration form of the bone regenerating agent of the present invention may be oral or parenteral (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, etc.).
  • Examples of the dosage form include orally administered drugs such as tablets, powders, capsules, granules, extracts and syrups, or injections (for example, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections). Etc.) and the like.
  • orally administered drugs such as tablets, powders, capsules, granules, extracts and syrups, or injections (for example, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections). Etc.) and the like.
  • the bone regeneration agent and the bone filling preparation of the present invention can be directly administered to a site where bone is deficient in the living body.
  • the form of the bone regeneration agent of this invention does not have prescription
  • Preparation of the bone regenerative agent and bone filling preparation of the present invention can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical carrier when the pharmaceutical carrier is a liquid, it can be dissolved or dispersed, and when the pharmaceutical carrier is a powder, it can be mixed or adsorbed.
  • pharmaceutically acceptable additives for example, preservatives, stabilizers, antioxidants, excipients, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, coloring agents, fragrances
  • Flavoring agents for example, preservatives, stabilizers, antioxidants, excipients, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, coloring agents, fragrances
  • Flavoring agents for example, preservatives, stabilizers, antioxidants, excipients, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, coloring agents, fragrances
  • Flavoring agents for example, preservatives, stabilizers, antioxidants, excipients, binders, disintegrants
  • the dose of gelatin is not particularly limited, but is, for example, 1 to 100 mg, preferably 1 to 50 mg per 1 cm 2 of the surface area of the organism to be administered.
  • Examples of the target diseases of the bone regenerating agent and bone filling preparation of the present invention include bone defects due to trauma and the like, oral surgical diseases, osteoporosis, arthropathy and the like.
  • CBE3 described below was prepared as a genetically modified gelatin (described in WO2008-103041).
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence. Isoelectric point: 9.34
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) (same as SEQ ID NO: 3 in WO2008 / 103041, except that X at the end is corrected to “P”)
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGAPG
  • CBE3 was used as genetically modified gelatin (hereinafter also referred to as R-Gel) unless otherwise specified.
  • Example 1 (1) Preparation of genetically modified gelatin gel 3% glutaraldehyde was added to a 10% genetically modified gelatin aqueous solution so as to be 1/10 of the total amount. The final concentration of glutaraldehyde is 0.3%. After pouring the mixed liquid obtained by stirring into a silicon frame (length 30 mm x width 30 mm x height 2 mm), left at room temperature for 2 hours, and then left at 4 ° C for 12 hours, A chemically cross-linked gelatin sheet was obtained. This gelatin sheet was immersed in a large excess of glycine aqueous solution for 1 hour to inactivate unreacted glutaraldehyde or aldehyde groups.
  • the freeze-dried recombinant gelatin gel was powdered by a pulverizer New Power Mill (Osaka Chemical Co., LTD.). Prior to use in the following animal experimental samples, the powder was sterilized with ethylene oxide gas.
  • Experimental level group group 1 deficient only group 2: genetically modified gelatin gel (about 10 mg)
  • Group 3 Pig-derived gelatin (high-grade gelatin TYPE: APAT, Nippi Co., Ltd.) (about 10 mg)
  • Group 4 Collagen (Telplug (trade name) ground product, Olympus Terumo Biomaterials Co., Ltd.) (about 10 mg)
  • Group 5 Bovine cancellous bone (Bio-Oss (trade name), Osteohealth) (approximately 20 mg)
  • the blood was lethal under anesthesia with pentobarbital and the head was removed. Histological observation of the parietal bone including the implantation site was performed by HE staining.
  • Example 2 Preparation of genetically modified gelatin (R-Gel), animal gelatin preparation
  • An aqueous solution containing R-Gel or animal gelatin (APAT, Nippi Gelatin, concentration: 7.5%), and glutaraldehyde (GA, 0.3%) (PH 6) was vigorously stirred, and the solution was stirred for 3 minutes while entraining bubbles.
  • the resulting solution into which the infinite number of bubbles was introduced was allowed to stand at 4 ° C. overnight to obtain a gel-like solid containing a large number of bubbles.
  • the obtained gel was washed twice with 0.1 M glycine aqueous solution to inactivate unreacted glycine and then washed four times with water.
  • the gel washed with water was freeze-dried to obtain sponge-like R-Gel and gelatin gel.
  • the sponge was pulverized by a mill to obtain a sponge-like granule having a granule size of about several hundred ⁇ m.
  • FIG. 6 When the internal structure of the granules and the tell plug was observed with a scanning electron microscope, it had a similar porous structure (FIG. 6).
  • Example 3 Preparation of a rat skull defect model
  • a rat skull defect model used as a bone regeneration ability evaluation system was used (Tissue Eng (2007) 13 (3) : 501-12).
  • the skull follows the same bone formation process (intramembrane ossification) as the alveolar bone, and is generally used for evaluation of dental bone filling agents.
  • the section was sliced with hematoxylin-eosin (H & E) and a specimen was prepared by thinning a block in which the head was fixed in formalin and decalcified and embedded in paraffin.
  • the pathological specimen was observed with an optical microscope, and the ratio of new bone to the defect was defined as the bone regeneration rate (FIG. 8).
  • the bone regeneration ability of the preparation was evaluated based on the bone regeneration rate.
  • the affected part of each rat was slightly depressed, and most of the defective part was covered with soft soft tissue, and the white and hard part seen as some new bone (regenerated bone) around the cut part. Admitted.
  • the specimen was observed with an optical microscope, about 30% of the defect was covered with a thin granulation tissue one month after the operation, and bone regeneration was observed in about 10% of the defect from the existing bone.
  • the bone regeneration rate increased with time, but after 3 months, the bone regeneration rate was about 30%. It can be said that the bone regeneration amount coincided with literature data (March bone regeneration rate: about 30%) Tissue Eng (2007) 13 (3): 501-12), and the model system could be constructed.
  • Example 4 Evaluation of Bone Regeneration Rate in Rat Skull Deficit Portion
  • the rat skull defect portion prepared in Example 3 was subjected to R-Gel preparation, animal gelatin preparation, Terprag (Olympus Terumo), Bio-Oss Cancellous (0.25-1 mm, Osteohealth).
  • Collagen film BioGide, Osteohealth
  • a group in which nothing was applied to the affected area was defined as Control.
  • the bone regeneration rate was similar to that of Control, and remained at 30% after 3 months.
  • telplug which is a collagen sponge
  • R-Gel and animal gelatin bone regeneration was the same as that of Terplug until one month after transplantation, but after that, bone regeneration surpassed that of Terplug, and about 90% (1.5 times that of Telplug) after 3 months of transplantation.
  • the affected part of bone regeneration was repaired with the regenerated bone. It can be said that R-Gel and animal gelatin sponge-like granules have superior bone regeneration ability compared to telplug.
  • Example 5 Analysis of pathological specimens of animal gelatin and R-Gel
  • gelatin gelatin
  • R-Gel genetically modified gelatin
  • Example 6 Preparation of a dog Socket Preservation model A model was prepared in accordance with a previous report (Araujo M et al. Int. J. Periodontics Restorative Dent. 28, 123-135, 2008.). Under anesthesia, the oral cavity of the beagle dog was disinfected with isodine solution, and then the central part of the second (P2) and third premolars (P3) of both lower jaws were opened with a fissure bar. After incising the periodontal ligament around the distal teeth with a scalpel, the distal teeth were extracted using extraction forceps and an elevator.
  • the extraction site (extraction fossa) was stopped by filling a cotton ball soaked with a 10-fold diluted solution of adrenaline injection (bosmin, 1 mg / mL, Daiichi Sankyo Co., Ltd.). The remaining proximal dental pulp was removed with a reamer, filled with a gutter percha, and the dental pulp cavity was sealed with a root canal sealer.
  • Example 7 Evaluation of effectiveness in canine model Tooth extraction site prepared in Example 6 was treated with BioOss Cancellous (0.25-1 mm, Osteo Health), Terplug (Olympus Terumo), R-Gel, and animal gelatin. The bone was filled to the top. A collagen film (Biogide, Osteo Health) was placed between the filling excluding the tell plug and the gingiva. Control did not install packing and membranes.

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Abstract

　本発明の目的は、補填材担体自体で骨再生を促進できる骨再生剤及び骨補填製剤を提供することである。本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを含む骨再生剤が提供される。

Description

ゼラチンを含む骨再生剤
　本発明は、ゼラチンを用いた骨再生剤及び骨補填製剤に関する。
　生体組織は主に細胞と細胞外マトリックス（高分子構造体）から構成されている。細胞により分泌される細胞外マトリックスは細胞の機能する水和空間や細胞の足場を提供する。また、細胞が分泌する種々の成長因子の貯蔵庫としての機能を持ち、細胞の機能発現や分化に重大な影響を与えている。生体内では両者が複雑に相互作用を及ぼすことで、種々の生命活動に影響を与えている。
　近年、重篤な疾患の治療に人工臓器、遺伝子治療および再生医療を用いる高度先端医療が臨床現場で目覚しい成果を挙げており、世の中の注目を集めている。中でも組織再生に主要な役割を担う細胞・成長因子・細胞外マトリックスの主要３要素を用いて損なわれた組織や臓器を再生する再生医療が次世代の治療法として注目を集めている。事実、培養皮膚や角膜では、再生医療が実現されている。
　整形外科領域または歯科領域の骨再生は、再生医療の適用として非常に注目を集めている領域の一つである。すなわち、骨疾患が足や腰の場合は歩行不能、歯科の場合は食事摂取が困難となることから、骨疾患は著しいQOLの低下を引き起こす。現在、骨再生治療製剤として代表的なものとして、脊椎損傷を治療するInfuse（BMP-2とコラーゲンスポンジの組み合わせ）、歯槽骨を再生する骨補填剤としてBioOss（脱タンパク化したウシ粉砕骨）、Puros（ヒト骨粉砕物）、Gem21（PDGFとβTCP）、Osferion(βTCP)、テルプラグ（米国名：FOUNDATION、コラーゲンスポンジ）が知られている。骨再生治療製剤に必要な性質として、１．構造維持の為の強度、２．骨再生のためのスペース確保、３．骨再生する細胞の足場、４．骨再生する細胞の分化と増殖、５．骨再生に伴う分解性が知られている。
　歯科領域において、上述の骨再生治療製剤を用いる主な疾患は、１．Ridge Augmentation、２．Socket Preservation、３．Periodontal bone defect regeneration、４．Implantable bone regeneration、５．Sinus  Liftが知られている。該疾患における骨再生を促す足場材料の重要性が認識されながらも、上記製剤は製剤に含まれる薬剤（BMPやPDGF）自身の骨再性能に頼っており、材料の機能は患部のスペース確保（強度）との認識が強く、多くのケースでは無機物が広く使用されている。
　一般に再生医療の足場材料（有機物）としては、コラーゲンやコラーゲンの変性体であるゼラチンが多くの場合で広く使用されている。骨再生材料としては、高次に配向したコラーゲンが石灰化に重要な役割を果たしていることが知られていることから（非特許文献１）、コラーゲン製スポンジが骨再生材として上市されている（テルプラグ（FOUNDATION，オリンパステルモ社））。しかしながら、コラーゲンスポンジを用いる骨補填材は、組織形成の足場を提供するだけであり、コラーゲンスポンジ単独では骨は形成されない（非特許文献２）。また、コラーゲンの変性体であるゼラチンは、これまでの知見によれば、ゼラチン自体の骨再生効果は全く知られておらず、１．ゼラチンスポンジ単独では骨再生を阻害する（非特許文献３）、２．ゼラチンはコラーゲンに比べて骨再性能を有さない（非特許文献４）と述べてられている。さらに、コラーゲンを熱処理したゼラチンスポンジと同様に、人工の骨成分であるβ－TCPにおいても骨が形成されないことが報告されている（非特許文献２及び５）。上記の通り、再生医療基材として広く使用されているゼラチンは、骨再生治療剤の足場材料としては適さないと認識されている。なお、単体では骨が再生されない補填材の場合、生理活性物質である血小板由来増殖因子（PDGF：platelet-derived growth factor）や骨形成因子（BMP：Bone morphogenetic protein）を含浸させる方法が研究されている（特許文献１）が、このような生理活性物質の精製タンパク質は高価であるため、一般に普及するには至っていない。
　一方、ゼラチンをはじめとする生体高分子はこれまで広く医療材料として用いられている。近年の遺伝子工学手法の進歩により、大腸菌や酵母に遺伝子を導入することによるタンパク質の合成が行われている。該手法により、種々の遺伝子組み換えコラーゲン様タンパク質が合成（例えば特許文献２及び３）されており天然のゼラチンと比較して、非感染性には優れ、均一であり、配列が決定されているので強度、分解性を精密に設計することが可能であるなどの優位点を有するとされる。しかし、これまで提案されている遺伝子組み換えゼラチンの用途としては、天然ゼラチンの代替の域を超えるものではなく、当然ながら骨再生剤としての用途も知られていなかった。
特開２００４－２０３８２９号公報 米国特許６９９２１７２号 ＷＯ２００８/１０３０４１号公報
田畑他　Biomaterials 19 807-815 1998. Biomaterials 26:2501-2507, 2005 田畑他、Journal of Neurosurgery 91 851-856, 1999 石井他、歯科医展望、97（３）、665-677,2001 J Neurosurg 91:851-856, 1999
　本発明は、補填材担体自体で骨再生を促進できる骨再生剤及び骨補填製剤を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチン、さらに好ましくは遺伝子組み換えゼラチンが、骨を再生する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを含む骨再生剤が提供される。
　好ましくは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンが、遺伝子組み換えゼラチンである。
　好ましくは、ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である。
　好ましくは、ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が10 KDa以上90 KDa以下である。
　好ましくは、ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む。
　好ましくは、細胞接着シグナルがArg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列である。
　好ましくは、ゼラチンのアミノ酸配列が、セリン及びスレオニンを含まない。
　好ましくは、ゼラチンのアミノ酸配列が、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない。
　好ましくは、ゼラチンのアミノ酸配列が、Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない。
　好ましくは、ゼラチンが、
式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
　好ましくは、ゼラチンが、
式：Gly-Ala-Pro-［（Gly－Ｘ－Ｙ）63］3－Gly
（式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される。
　好ましくは、ゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、骨再生作用を有するアミノ酸配列を有する。
　好ましくは、ゼラチンが架橋されている。
　好ましくは、架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される。
　本発明によればさらに、上記した本発明の骨再生剤を含む、骨補填製剤が提供される。
　本発明によればさらに、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを、骨再生を必要とする対象者に投与することを含む、骨再生を誘導する方法が提供される。
　本発明によればさらに、骨再生剤又は骨補填製剤の製造のための、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンの使用が提供される。
　本発明の骨再生剤は、血小板由来増殖因子又は骨形成因子などの生理活性物質を使用することなく、補填材担体自体で優れた骨再生効果を示すことができる。
図１は、ラット頭蓋冠骨欠損モデルの未処置のHE染色像を示す。 図２は、遺伝子組み換えゼラチンパウダーを欠損患部に埋入後、患部に骨形成されたHE染色像を示す。 図３は、ブタ由来ゼラチンパウダーを欠損患部に埋入したHE染色像を示す。 図４は、コラーゲンパウダーを欠損患部に埋入したHE染色像を示す。 図５は、不溶性基質であるウシ海綿骨（Bio-Oss（商品名）、Osteohealth）を欠損患部に埋入したHE染色像を示す。 図６は、R-Gel製剤およびテルプラグ内部の電子顕微鏡写真を示す。 図７は、ラット頭蓋骨欠損モデルを示す。左：肉眼写真、右：μCT写真（Micro-CT image: Tissue Eng (2007) 13(3):501-12） 図８は、骨再生率の算出方法（病理標本より解析）を示す。 図９は、ラット頭蓋骨欠損部での骨再生率の経時変化を示す。R-Celおよび動物ゼラチンはBio-Oss Cancellousおよびテルプラグと比べて優れた骨再生率を示した。 図１０は、ラット頭蓋骨への移植1月および2月後の病理標本写真（H&E染色）を示す。R-Gel（上）および動物ゼラチン（下）。移植1月では、R-Gelおよび動物ゼラチン表面で骨再生する。移植2月後では、R-Gel周囲では細胞によりR-Gelが分解した部位にて骨再生し、空隙の少ない骨を再生した。一方、動物ゼラチン周囲では、細胞により動物ゼラチンが分解した部位に繊維性の軟組織を認め、再生骨中に瘢痕様の繊維性組織を多く含んだ。 図１１は、イヌ下顎小臼歯抜歯モデルにおいて、移植直後および2ヵ月後の抜歯部位の肉眼写真を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明では、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを骨再生剤として使用する。なお、本発明の骨再生剤においては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチン自体が骨再生作用を発揮することを特徴とするものである。従って、本発明の骨再生剤においては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチン以外には、骨再生作用を有する他の物質を含む必要がなく、本発明の骨再生剤は好ましくは、上記ゼラチン以外の、骨再生作用を有する他の物質を含まないものである。即ち、本発明の骨再生剤は、好ましくは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンのみからなるものである。コラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
　本明細書でいうゼラチンとは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されない。好ましくは、ゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGXY部分を有する。コラーゲンに特徴的なGXY部分とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。X及びYであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占める。
　本発明で用いるゼラチンは、天然の動物に由来するゼラチンでもよいし、遺伝子組み換えゼラチンでもよい。天然の動物に由来するゼラチンを用いる場合、ゼラチンの由来は特に限定されず、魚、牛、豚、山羊など、いかなる由来でもかまわない。
　上記の中でも、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンは、遺伝子組み換えゼラチンであることが好ましい。なお、遺伝子組み換えゼラチンは、動物由来ではなく人工的なゼラチンであるため、異種感染を回避した生体適合性の高い骨補填材である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを用いることができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとして好ましいものは、以下の態様の遺伝子組み換えゼラチンである。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは天然のゼラチン本来の性能から、生体適合性に優れ、且つ天然由来ではないことでＢＳＥなどの懸念がなく、非感染性に優れている。また、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは天然のものに比して均一であり、配列が決定されているので、強度、分解性においても後述の架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンの分子量は2 KDa以上100 KDa以下であることが好ましい。より好ましくは2.5 KDa以上95KDa以下である。より好ましくは5 KDa以上90 KDa以下である。最も好ましくは、10 KDa以上90KDa以下である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、好ましくはコラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する。ここで、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシン、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧＸＹ配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ，Ｙであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくはその配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造であることが好ましい。
　一般的なゼラチンは極性アミノ酸のうち、電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを指す。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ該極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、システインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置として、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましく、遺伝子組み換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。遺伝子組み換えゼラチン内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明の遺伝子組み換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明の遺伝子組み換えゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　また、遺伝子組み換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、Ａ［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ ）n］mＢの繰り返し構造を有することが好ましい。ｍとして好ましくは２～１０、好ましくは３～５である。ｎは３～１００が好ましく、１５～７０がさらに好ましく、５０～６５が最も好ましい。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンの等電点は、好ましくは5～10であり、より好ましくは6～10であり、さらに好ましくは7～9.5である。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはプロコラーゲンおよびプロコラーゲンを有さない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の相同性を有し、骨再生作用を有するアミノ酸配列；
を有する遺伝子組換えゼラチンである。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組み換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンを調製することができる。
　本発明で用いるゼラチンは用途に応じて、化学的に修飾することができる。化学的な修飾としては、ゼラチンの側鎖のカルボキシル基やアミノ基への低分子化合物あるいは各種高分子（生体高分子（糖、タンパク質）、合成高分子、ポリアミド）の導入や、ゼラチン間の架橋が挙げられる。該ゼラチンへの低分子化合物の導入としては、例えばカルボジイミド系の縮合剤が挙げられる。
　本発明で用いる架橋剤は本発明を実施可能である限りは特に限定はなく、化学架橋剤でも酵素でもよい。化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミドなどが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドである。さらに、ゼラチンの架橋としては、光反応性基を導入したゼラチンへの光照射、あるいは光増感剤の存在化での光照射によるものが挙げられる。光反応性基としては、例えば、シンナミル基、クマリン基、ジチオカルバミル基、キサンテン色素、カンファキノンが挙げられる。上記の架橋剤のうち、もっとも好ましくはグルタルアルデヒドである。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、ゼラチン鎖間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　ゼラチンの架橋には、ゼラチンの溶液と架橋剤を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
　本発明においてゼラチンを架橋剤で処理する際の混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃～４０℃であり、より好ましくは０℃～３０℃であり、より好ましくは３℃～２５℃であり、より好ましくは３℃～１５℃であり、さらに好ましくは３℃～１０℃であり、特に好ましくは３℃～７℃である。
　ゼラチンと架橋剤を攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、ゼラチンの変性や分解を考慮すると実質的には０℃～６０℃であり、より好ましくは０℃～４０℃であり、より好ましくは３℃～２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃～１０℃であり、特に好ましくは３℃～７℃である。
　本発明においては、上記したコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを、骨再生を必要とする対象者（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによって、骨再生を誘導することができる。
　本発明の骨再生剤は、骨補填製剤として使用することができる。
　本発明の骨再生剤及び骨補填製剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の骨再生剤は、生体内の目的部位に直接投与してもよいし、あるいは注射用蒸留水、注射用生理食塩水、ｐＨ５～８の緩衝液（リン酸系、クエン酸系等）等の水性溶媒等の液状賦形剤に懸濁して、例えば注射、塗布等により投与してもよい。また、適当な賦形剤と混合し、軟膏状、ゲル状、クリーム状等にしてから塗布してもよい。即ち、本発明の骨再生剤の投与形態は、経口でもよいし、非経口（例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与等）でもよい。
　剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤（例えば静脈内注射剤、筋肉内注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤等）等の非経口投与剤を挙げることができる。
　好ましくは、本発明の骨再生剤及び骨補填製剤は、生体中の骨が欠損した部位へ直接投与することができる。このように局所的に投与する場合、本発明の骨再生剤の形態は特に規定はないが、例えばスポンジ、フィルム、不織布、ファイバー（チューブ）、粒子、メッシュなどが挙げられる。
　本発明の骨再生剤及び骨補填製剤の製剤化は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、製剤用担体が液体の場合は、溶解又は分散させ、また、製剤用担体が粉末の場合は、混合又は吸着させることができる。さらに必要に応じて、薬学的に許容される添加物（例えば、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、塑性剤、界面活性剤又は無痛化剤等）を含有させることもできる。
　ゼラチンの投与量は、特に限定されないが、例えば、投与される生体の表面積１ｃｍ2当たり１～１００ｍｇであり、好ましくは１～５０ｍｇである。
　本発明の骨再生剤及び骨補填製剤の対象疾患としては例えば、外傷などによる骨欠損、口腔外科疾患、骨粗鬆症、関節症などが挙げられる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　遺伝子組み換えゼラチンとして以下記載のCBE3を用意した（ＷＯ2008-103041に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：51.6kD
構造： Gly-Ala-Pro[(Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ)63]3Gly
アミノ酸数：571個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧｌｙ－Ｘ－Ｙ の繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：9.34
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（WO2008／103041号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
　以下の実施例では、特に断りのない限り、上記CBE3を遺伝子組み換えゼラチン（以下、R-Gelとも称する）として用いた。
実施例１：
（１）遺伝子組み換えゼラチンゲルの作製
　１０％遺伝子組み換えゼラチン水溶液へ全体量の1/10になるように３％グルタルアルデヒドを加えた。グルタルアルデヒドの最終濃度は０．３％である。攪拌して得られた混合液をシリコン製枠（縦30mm×横30mm×高さ2mm）に流し込んだ後、室温で2時間静置し、つづいて4℃にて12時間静置することによって、化学的に架橋したゼラチンシートを得た。このゼラチンシートを大過剰のグリシン水溶液で1時間浸漬し、未反応のグルタルアルデヒドあるいはアルデヒド基を不活性化した。続いて、蒸留水にて2回洗浄した後に凍結乾燥することによって架橋リコンビナントゼラチンゲルを得た。凍結乾燥したリコンビナントゼラチンゲルを粉砕機New Power Mill（Osaka Chemical Co., LTD.）によってパウダーを得た。以下の動物実験サンプルに用いる前に、該パウダーをエチレンオキシドガスを用いて滅菌した。
（２）ラット頭頂骨欠損部における骨再生誘導試験
　実験動物としては、10匹のＳＤラット（雄、10-12週齢、0.3-0.5kg）を用いた。ペントバルビタール（ネンブタール（登録商標）、大日本住友製薬）0.8ml/kgを腹腔内に投与することにより麻酔した。ラットの頭頂骨を露出し、直径5 mmの円形の骨欠損部を作製した。滅菌した遺伝子組み換えゼラチンゲル約10mgを作製した骨欠損部へ充填した後、皮膚を縫合した。
実験水準グループ
グループ１：欠損のみ
グループ２：遺伝子組み換えゼラチンゲル（約10 mg）
グループ３：ブタ由来ゼラチン（ハイグレードゼラチン TYPE:APAT、株式会社ニッピ）（約10 mg）
グループ４：コラーゲン（テルプラグ（商品名）粉砕物、オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）（約10 mg）
グループ５：ウシ海綿骨（Bio-Oss（商品名）、Osteohealth）（約20 mg）
　手術後4週目にペントバルビタール麻酔下で放血致死させて頭部を摘出した。埋入部を含む頭頂骨をHE染色にて組織学的観察をおこなった。
（４）結果
　グループ１から５の観察結果を図１から５に示す。ブタ由来ゼラチン及び遺伝子組み換えゼラチンを用いた場合には、有意に骨形成の誘導が認められた（図２、図３）。コラーゲンや不溶性基質単独では、骨形成は促進されない（図４及び図５）。ところが、本発明のRGDモチーフを大量に含む遺伝子組み換えゼラチンを用いることにより、これまでの担体では不可能であったような骨補填材単独でもラット頭頂骨欠損部において骨形成が認められた（図２）。このことにより、副作用が考えられるBMPのような生理活性物質を用いなくても、効果的に骨形成が可能であることが示された。
実施例２：遺伝子組み換えゼラチン（R-Gel）、動物ゼラチン製剤の作製
　R-Gelまたは動物ゼラチン(APAT、ニッピゼラチン社製、濃度：7.5％)、およびグルタルアルデヒド（GA、0.3％）を含む水溶液（ｐH６）を激しく攪拌し、気泡を巻き込みながら溶液を3分間攪拌した。得られた無数の気泡が導入された溶液を４℃にて終夜静置させることで、多数の気泡を含むゲル状の固体を得た。得られたゲルを0.1Ｍグリシン水溶液にて2回洗浄し、未反応のグリシンを失活させた後、水にて4回洗浄した。該水にて洗浄されたゲルを凍結乾燥し、スポンジ状のR-Gelおよびゼラチンゲルを得た。該スポンジをミルにて粉砕し、数百μｍ程度の顆粒サイズのスポンジ状顆粒を得た。該顆粒およびテルプラグの内部構造を走査型電子顕微鏡にて観察すると、同様の多孔質構造を有した（図６）。
　以下の有効性評価には、該スポンジ状顆粒のエチレンオキシド滅菌物を使用した。該GAにて架橋したR-Gelおよび動物ゼラチンをラットまたはイヌに移植し、それぞれの有効性を評価した。
実施例３：ラット頭蓋骨欠損モデルの作製
　R- Gel の骨再生能を評価するために、骨再生能評価系として用いられているラット頭蓋骨欠損モデルを用いた（Tissue Eng (2007) 13(3):501-12）。頭蓋骨は歯槽骨と同様の骨形成過程(膜内骨化)を辿り、一般的に歯科骨補填剤の評価に用いられている。
　Sprague－Dawleyラット（SDラット、雄、10-12週齢）を麻酔し、右側頭頂骨にドリル（Osada Success 40, 長田電気工業）にて円形の欠損部（径 = 5 mm）を作成した（図７）。骨再生に影響する欠損部の骨片や血液を生理食塩水にて洗浄、除去した後、患部皮膚を縫合した。所定期間後（3週，1,2,3月）ラットを開腹・放血させラットをサクリファイした。欠損させた患部の肉眼観察を実施した後、該頭部をホルマリン固定・脱灰してパラフィンに包埋したブロックを薄切した切片をヘマトキシリン－エオシン(H＆E）染色し標本を作製した。病理標本を光学顕微鏡により観察し、欠損部に対する新生骨の割合を骨再生率、とした（図８）。ここで、骨再生率により製剤の骨再生能を評価した。
　欠損させた患部を観察すると、いずれのラットも患部は若干窪み、欠損部の殆どが柔らかい軟組織で覆われており、切断部周辺に若干の新生骨（再生骨）と見られる白色で堅い部分を認めた。該標本を光学顕微鏡にて観察すると、手術1月後には欠損部の３割程度の部分を薄い肉芽組織で覆われ、既存骨から欠損部分の1割程度に骨再生を認めた。骨再生率は時間に従って増加したが、3月後でも再生骨率は約3割であった。該骨再生量が文献データ（3月骨再生率：約３割）Tissue Eng (2007) 13(3):501-12）と一致し、モデル系が構築できたと言える。
実施例４：ラット頭蓋骨欠損部での骨再生率評価
　実施例３にて作製したラット頭蓋骨欠損部分にR-Gel製剤、動物ゼラチン製剤、テルプラグ（オリンパステルモ社）、Bio-Oss Cancellous (0.25-1 mm, Osteohealth社)を移植した。顆粒剤型であるR-Gel、動物ゼラチンおよびBio-Oss Cancellous 上部にコラーゲン製膜（BioGide、Osteohealth社）を設置し、顆粒が患部から飛散しないようにした。また、患部に何も適用しない群をControlとした。
　Bio-Oss Cancellousを適用した患部では骨再生率はControlと同程度で3ヵ月後に30％に留まった。また、コラーゲンスポンジであるテルプラグの場合、経時的に骨再生し、3ヵ月後に約60％の患部が再生骨にて修復された（図９）。一方、R-Gelおよび動物ゼラチンの場合、移植１ヶ月まではテルプラグと同等の骨再生であったが、その後テルプラグを上回る骨再生を示し、移植3ヵ月後には約90％（テルプラグの1.5倍の骨再生）の患部が再生骨にて修復された。テルプラグに比べ、R-Gelおよび動物ゼラチンスポンジ状顆粒は優れた骨再生能を有すると言える。
実施例５：動物ゼラチンとR-Gelの病理標本解析
　動物ゼラチン（ゼラチン）と遺伝子組み換えゼラチン（R-Gel）による骨再生をより詳細に解析するため、それぞれの基材周囲および再生骨の組織の形態を解析した（図１０）。移植1ヶ月後、R-Gel、ゼラチン両基材の表面に多数の骨芽細胞が存在し、新生骨を認め両者の組織像に大きな違いを認めなかった。
　移植２ヵ月後、R-Gelと新生骨の間隙に多数の骨芽細胞と該細胞によるR-Gelの分解、および欠陥の少ない新生骨の形成を認めた。一方、動物ゼラチンと新生骨界面には多数の線維芽細胞と繊維性の軟組織の形成、および多数の瘢痕様の繊維性組織を含む新生骨を認めた。すなわち、R-Gelは動物ゼラチンに比べて密な骨を再生した。
実施例６：イヌSocket Preservation モデルの作製
　モデルの作製は既報（Araujo M et al. Int. J. Periodontics Restorative Dent. 28, 123-135, 2008.）に従って実施した。麻酔下、ビーグル犬の口腔内をイソジン液にて消毒した後、両下顎の第2（P2）および第3小臼歯（P3）の中央部を裂溝バーにより切開した。遠位部の歯周辺の歯周靭帯をメスにて切開した後、遠位部の歯を抜歯鉗子、エレベーターを用いて抜歯した。抜歯部位（抜歯窩）にアドレナリン注射液（ボスミン・注1mg/mL、第一三共株式会社）の10倍希釈液を浸した綿球を詰めることで止血した。残存している近位部の歯の歯髄をリーマーにて除去した後、ガッターパーチャを充填し、歯根管シーラーにて歯髄腔をシールした。
実施例７：イヌモデルでの有効性の評価
　実施例６にて作製した抜歯部位にBioOss Cancellous（0.25-1 mm,オステオヘルス社）、テルプラグ（オリンパステルモ社）、R-Gel、および動物ゼラチンを歯槽骨頂まで充填した。該テルプラグを除く充填物と歯肉の間にコラーゲン製膜（Biogide、オステオヘルス社）を設置した。Controlは充填物および膜を設置しなかった。
　2ヵ月後に抜歯部位の歯肉の厚さを調べると（図１１）、未処置のControlでは歯肉の厚さが減少した。BioOss Cancellousを移植した部位は歯肉の厚さが維持された。テルプラグを移植した部位は若干の歯肉の厚さの減少を認めた。これに対し、R-Gelを移植した部位ではBioOssと同等の歯肉の維持を認めた。即ち、R-Gelはテルプラグ以上の有効性を示した。

Claims (15)

  1. コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを含む骨再生剤。
  2. コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンが、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１に記載の骨再生剤。
  3. ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である、請求項１又は２に記載の骨再生剤。
  4. ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が10 KDa以上90 KDa以下である、請求項１から３の何れかに記載の骨再生剤。
  5. ゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、請求項１から４の何れかに記載の骨再生剤。
  6. 細胞接着シグナルがArg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列である、請求項５に記載の骨再生剤。
  7. ゼラチンのアミノ酸配列が、セリン及びスレオニンを含まない、請求項１から６の何れかに記載の骨再生剤。
  8. ゼラチンのアミノ酸配列が、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない、請求項１から７の何れかに記載の骨再生剤。
  9. ゼラチンのアミノ酸配列が、Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない、請求項１から８の何れかに記載の骨再生剤。
  10. ゼラチンが、
    式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
    （式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される、請求項１から９の何れかに記載の骨再生剤。
  11. ゼラチンが、
    式：Gly-Ala-Pro-［（Gly－Ｘ－Ｙ）63］3－Gly
    （式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
    で示される、請求項１から１０の何れかに記載の骨再生剤。
  12. ゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、骨再生作用を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から１１の何れかに記載の骨再生剤。
  13. ゼラチンが架橋されている、請求項１から１２の何れかに記載の骨再生剤。
  14. 架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される、請求項１３に記載の骨再生剤。
  15. 請求項１から１４の何れかに記載の骨再生剤を含む、骨補填製剤。
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