WO2011012119A1

WO2011012119A1 - Verfahren und vorrichtung zur erfassung der bewegung und anlagerung von zellen und partikeln an zell-, gewebe- und implantatschichten bei der simulation von flussbedingungen

Info

Publication number: WO2011012119A1
Application number: PCT/DE2010/000900
Authority: WO
Inventors: Sandy Mosig; Knut Rennert
Original assignee: Universitaetsklinikum Jena
Current assignee: Universitaetsklinikum Jena
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2011-02-03
Anticipated expiration: 2012-01-30
Also published as: DE102009035502A1

Abstract

Aufgabe war es, die Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge von Zellen und Partikeln bei der Simulation von Flussbedingungen genauer und vollständig zu erfassen. Erfindungsgemäß werden die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel in der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4) optisch vollständig überwacht und ausgewertet, transmigrierende Zellen und Partikel zur Kontrolle und Auswertung aufgefangen (7, 8, 9) sowie insbesondere für Langzeituntersuchungen die Kulturbedingungen des Flussmediums für das Durchströmen der Interaktionszone (2, 3, 4), beispielsweise durch Einstellung des pH- Wertes, der Temperatur und der Nährstoffversorgung für die Zellen und Partikel, gesteuert. Die Erfindung wird beispielsweise angewendet zur Testung von Pharmaka, Pathogenen und sonstigen Wirkstoffen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung der Bewegung und Anlagerung von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen zu erfassen. Solche Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge der Zellen und Partikel, insbesondere von Blutzellen, sind bedeutsam für die Untersuchung der Zell- und Gewebephysiologie und von Effekten, welche durch Pharmaka, Pathogene oder sonstige Wirkstoffe hervorgerufen werden und das Verhalten dieser Zellen und Partikel bei ihrem Durchfluss durch den Organismus beeinflussen.

Zur Bestimmung von Haupt- und Nebenwirkungen dieser Pharmaka, verschiedener Pathogene und sonstiger Wirkstoffe auf den besagten

Organismus wird deshalb deren Einfluss auf das Anlagerungs-,

Durchwanderungs- und Differenzierungs-Verhalten, einschließlich sonstiger medizinisch oder biologisch relevanter Verhaltens- und

Reaktionsweisen, von Suspensions- und adhärenten Zellen an Zell- und Gewebeoberflächen unter Flussbedingungen in

Simulationsvorrichtungen außerhalb des Organismus verstärkt untersucht.

Die Simulationsvorrichtungen sollen dabei die im Körper erfolgenden Flussbedingungen möglichst naturgetreu nachbilden können, um

Organismus- und geweberelevante Aussagen treffen zu können. Mit diesen Simulationsverfahren sollen insbesondere Versuche an Tieren substituiert oder zumindest eingeschränkt werden, die zwar lebensnah

Analysen im komplexen System des Organismus unter Berücksichtigung vieler physiologisch relevanter Parameter ermöglichen, die aber ethisch umstritten sind, häufig keine Akzeptanz finden und dadurch immer mehr in Kritik geraten. Darüber hinaus ist bei den Tiermodellen eine Echtzeitbeobachtung des Krankheitsentstehens und des Krankheitsverlaufs nur eingeschränkt möglich. Zudem ist es häufig erforderlich, die behandelten Tiere nach Ablauf des Versuchs zu töten. Dadurch wird auch immer nur eine Momentaufnahme des Krankheitsverlaufs ermöglicht. Aufgrund der individuellen Unterschiede, wie sie auch bei Inzuchttieren auftreten, ist es so gut wie unmöglich, selbst bei einer Vielzahl von Untersuchungen und getöteten Versuchstieren einen repräsentativen Krankheits verlauf zu rekonstruieren. Des Weiteren ist die Übertragbarkeit der beim Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse auf dem Menschen meist fraglich (T. M. Bocan: Animal modeis of atherosclerosis and Interpretation of drug intervention studies, Curr Pharm Des 4, 1998, 37-52; A. C. McMahon, L. Kritharides and H. C. Lowe: Animal modeis of atherosclerosis progression: current concepts, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 5, 2005, 433-440; J. C. Russell and S. Proctor: Small animal modeis of cardio vascular disease: tools for the study of the roles of metabolic Syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc Pathol 15, 2006, 318-330).

Zur Simulation der im Organismus gegebenen Flussbedingungen ist ein Strömungsmodell zur Untersuchung der Anlagerungsprozesse von Zellen bekannt (DE 100 19 833 C2), bei dem ein Endrohr in einem Winkel größer 0° auf eine Interaktionsfläche weist. Durch diese Versuchsanordnung entstehen in diesem Strömungsmodell turbulente Strömungen. Mittels einer Beobachtungseinheit, bestehend aus einem parallel zum Endrohr angebrachten Mikroskop mit Kondensor, werden die Zell-Anlagerungsprozesse im Flussmedium an die Interaktionsfläche beobachtet.

Das Mikroskop mit Kondensor ist auf eine Fokusebene oberhalb der Interaktionsfläche gerichtet und kann auch nur diese Ebene betrachten. Die Beobachtung ist aber ausschließlich auf diese definierte Ebene beschränkt, so dass die Zellen in ihrer Bewegung nicht kontinuierlich in Echtzeit verfolgt werden ^"können. In der betrachteten Ebene ist es lediglich möglich, die Zellen im Wesentlichen als statische Größe von Einzelmessungen zu erfassen.

Die in der DE 100 19 833 C2 bewusst gewählte Flussrate in der Strömungskammer lässt vorrichtungsbedingt die Einstellung von Strömungs- und Druckverhältnissen nur sehr eingeschränkt zu, insbesondere lassen sich keine laminaren Strömungsverhältnisse an der Interaktionsfläche aufbauen und auswerten. Einzelbeobachtungen von Zellen sind aufgrund der hohen Dynamik der Zellbewegung räumlich nicht auflösbar.

Außerdem bildet diese Vorrichtung ausschließlich die Flussbedingungen der Blutbahn nach und kann damit Zellen beobachten, die sich in dieser simulierten Blutbahn bewegen und ggf. an der Wandung hängen bleiben und anlagern. Zellen hingegen, welche diese Wandung durchwandern und damit unterhalb der Interaktionsfläche zu finden sind, können nicht erfasst und ausgewertet werden und sind damit der Untersuchung nicht zugänglich. Eine solche Aussage ist aber zur Analyse beispielsweise eines Wirkstofftransportes für Pharmaka von großem Interesse.

Darüber hinaus können, insbesondere für Langzeituntersuchungen, wichtige Umfeldparameter, wie Sterilität, pH- Wert etc., um der Physiologie des nachzubildenden Organismus zu entsprechen, nicht gehalten werden. Morphologische Anpassungen von Zellen an die angelegten Flussbedingungen benötigen mehrere Tage. Somit ist eine Berücksichtigung der direkten Auswirkungen des Flusses auf die Morphologie und Physiologie der Zellen nicht gegeben. Des Weiteren bietet die Vorrichtung keine Möglichkeit, mehrschichtige Zellverbände zu untersuchen. Ferner erlaubt die Vorrichtung nicht das mehrmalige Untersuchen von Partikeln und Zellen.

Es ist auch bekannt, Adhäsions- und Migrationsprozesse von T-Zellen unter Flussbedingungen in einem System zu detektieren. (z. B.

G. Cinamon and R. Alon: A real time in vitro assay for studying leukocyte transendothelial migration under physiological flow conditions, J Immunol Methods 273(1-2), 2003, 53-62; T. Schreiber,

V. Shinder et al.: Shear flow-dependent integration of apical and subendothelial chemokines in T-cell transmigration: implications for locomotion and the multistep paradigm, Blood 109(4), 2007, 1381-

1386).

In beiden Einrichtungen werden nach dem gleichen Prinzip

Einzelzellschichten aus Endothelzellen in handelsüblichen Zellkultureinsätzen kultiviert. Vor Versuchsbeginn werden die Endothelzellen mit den zu testenden Substanzen inkubiert, indem diese direkt auf die Zellen gegeben werden. Anschließend werden die Substanzen weggewaschen und der eigentliche Versuch gestartet. Der Fluss des Mediums wird über eine Spritzen-Pumpe erzeugt. Adhäsion und Transmigration werden durch ein im senkrechten Winkel über der Interaktionsfläche angebrachtes Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Endotheliale Zellen benötigen Zeit, sich an Flussbedingungen anzupassen. Unter statischen Bedingungen gewachsene endotheliale Zellen weisen eine andere Physiologie auf als Zellen, die unter dem Einfluss von Strömungsverhältnissen entstehen (z. B. J. T. Butcher, A. M. Penrod, A. J. Garcia and R. M. Nerem: Unique morphology and focal adhesion development of valvulär endothelial cells in static and fluid flow environments, Arterioscler Thromb Vase Biol 24, 2004, 1429- 1434).

Die Vorrichtungen bieten keine Voraussetzung, die Zellen unter Flussbedingungen anzuziehen. Damit ist auch keine Möglichkeit zur längeren Kultivierung von Endothelzellen unter Flussbedingungen gegeben und die Ergebnisse sind nur sehr eingeschränkt mit der in vivo Situation vergleichbar.

Die transmigrierten Zellen werden in einem Behälter aufgefangen. Beim Durchdringen der Interaktionsfläche bleiben jedoch transmigrierte Zelle an deren Unterseite anhaften, die bei der Auswertung unberücksichtigt bleiben. Die Gravitation reicht nicht aus, dass alle transmigrierten Zellen nach unten fallen, um quantitativ vollständig ausgewertet werden zu können. Damit sind Adhäsions- und Migrationsprozesse nur ungenau erfassbar.

Außerdem ermöglicht keine der Vorrichtungen die mehrmalige Untersuchung der Zellen und Partikel in ihrem Fluss durch die Interaktionszone. Auch können Zellen und Partikel in der Interaktionszone nur auf der apikalen Seite vor Versuchsbeginn mit den zu testenden Substanzen inkubiert werden. Bekannt ist weiterhin ein System zur Beobachtung von Adhäsions- und Migrationsprozessen mittels eines Kapillarsystems. Tumorzellen werden in dieses Kapillarsystem eingesetzt und über eine Monozellschicht geleitet. Adhäsionsvorgänge werden dabei ebenfalls aufsichtig durch ein Mikroskop auf der Interaktionsfläche beobachtet. Hierzu wird eine handelsübliche 48-Loch-Zellkultuφlatte genutzt (C. Dong, M. J. Slattery et al.: In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic Protrusion, locomotion, and extravasation, Ann Biomed Eng 30(3), 2002, 344-55).

Auch hier können transmigrierende Zellen nach Adhäsion nicht erfasst und analysiert werden. Außerdem ist die Zelluntersuchung nur auf der besagten Monozellschicht gegeben.

Die Druck- und Strömungsverhältnisse im Kapillarsystem sind nur eingeschränkt beeinflussbar. Auch bei dieser Methode sind keine Langzeituntersuchungen möglich.

In weiteren Publikationen (J. J. Chiu, D. L. Wang et al.: Effects of disturbed flow on endothelial cells, J Biomech Eng 120(1), 1998, 2-8 und J. J. Chiu, C. N. Chen et al.: Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells, J Biomech 36(12), 2003, 1883-95) beschreiben die Autoren ein ähnliches System wie oben von Cinamon und Alon (2003) sowie von Schreiber und Shinder et al. (2007) erwähnt. Das System ist um die Möglichkeit der Detektion von Fluoreszenzen ergänzt. Es besteht aus einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das aufsichtig auf eine Flusskammer, bestehend aus einem Kanal, zeigt. An die Flusskammer ist ein Pumpensystem angeschlossen.

Zusätzlich zu den bereits oben genannten Nachteilen sind keine Möglichkeiten zur Perfusion unterhalb der Interaktionsfläche gegeben. Auch hier ist insbesondere eine längere Kultivierung von Zellen unter Flussbedingungen ausgeschlossen, Möglichkeiten zur Einstellung und Anpassung für Temperatur und pH-Wert bestehen nicht. Transmigrierende Zellen können nicht erfasst werden und sind auch einer späteren Auswertung nicht zugänglich. In der Patentfamilie zu CA 2 503 203 Al wird ein Kammersystem mit mehreren Kammern beschrieben, wobei mindestens die erste Kammer durch einen Kanal mit einer zweiten Kammer verbunden ist. Durch diesen Kanal strömt eine Flüssigkeit über eine Zellschicht aus Endothelzellen. Es existiert eine Beobachtungseinheit zur Detektion von Zelladhäsion und Zellmigration.

Wie auch schon in vorgenannten Systemen beschrieben (vgl. Cinamon und Alon, 2003 sowie Schreiber und Shinder et al., 2007), entziehen sich auch bei dieser Vorrichtung transmigrierende Zellen nach Adhäsion der Beobachtung und der nachfolgenden Auswertung. Es werden auch hier lediglich Monozellschichten zur Untersuchung genutzt. Echtzeitanalysen der Zellbeobachtung sind ebenfalls nicht möglich. Die Einstellung und Anpassung von Temperatur und pH-Wert sind nicht gegeben. Die Zellschicht kann vor Versuchsbeginn nur von der apikalen Seite mit den zu testenden Substanzen inkubiert werden. Es ist keine dynamische Perfusion während des Versuchs möglich.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die bekannten Methoden zur Simulation und Analyse von Bewegungs- und Anlagerungsvorgängen der Zellen und Partikeln an Zell- und Gewebeschichten, die dem lebenden Organismus nahe kommen, unzulänglich sind. Adhäsions- und Migrationsprozesse von Zellen unter Flussbedingungen sind, sofern überhaupt möglich, nur sehr eingeschränkt und mit fehlerbehafteter quantitativer Beurteilung möglich. Langzeituntersuchungen unter den zuvor genannten Bedingungen, die insbesondere für Analysen von Pharmaka und sonstigen Wirkstoffen wichtig sind, bleiben einer solchen Auswertung weitgehend verschlossen bzw. zeigen wenig Relevanz auf die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den lebenden Organismus, so dass trotz aller Simulationsmethoden Tierversuche bei aller ethischer Problematik noch immer eine wichtige Bedeutung, insbesondere für die Biologie, Medizin und Pharmaforschung aufweisen. Die Nachteile der Tierversuche bestehen insbesondere darin, dass die Tiere während oder am Ende der Versuche getötet werden und dass eine reproduzierbare lokale Wirkung von Pathogenen, Pharmaka und anderen Wirkstoffen auf Krankheitsverläufe an definierten Stellen des Körpers selbst bei der Verwendung von Inzuchtstämmen, aufgrund der individuellen Unterschiede der einzelnen verwendeten Tiere, nur sehr schwer reproduzierbar sind. Dies führt zu der Notwendigkeit der Durchführung von einer Vielzahl von Einzelexperimenten, um diesen Nachteil unter Nutzung statistischer Hilfsmittel auszugleichen. Doch selbst die Einzelbeobachtung von fließenden und sich anlagernden Zellen in standardisierbaren Untersuchungsvorrichtungen, wie sie derzeit bekannt ist, bereitet aufgrund der auf eine Ebene determinierten visuellen Beobachtbarkeit und der hohen Dynamik der Zellbewegung größte Schwierigkeiten, so dass die Auswertung im Wesentlichen auf die Erfassung statistischer Größen hinausläuft.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge von Zellen und Partikeln bei der Simulation von Flussbedingungen genauer und vollständig zu erfassen.

Einerseits sollen die Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge unter Bedingungen simuliert und ausgewertet werden können, die dem Druck- und Strömungsverhalten im nachzubildenden Organismus bzw. körpereigenen Gefäß auch für Langzeituntersuchungen wesentlich näher kommen. Andererseits soll dabei ebenfalls das Adhäsions- und Migrationsverhalten der Zellen und Partikel möglichst vollständig und mit hoher Auswertegenauigkeit erfasst werden können.

Mit der Erfindung wird die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel, einschließlich deren Migration durch die Zell-, Gewebe- und

Implantatschicht, in der gesamten zumindest einen Interaktionszone (und nicht nur durch Blick von oben) optisch erfasst und ausgewertet. Die

Erfassung erfolgt vorzugsweise durch mehrere

Beobachtungsstrahlengänge, beispielsweise durch zwei Stereomikroskopie-Systeme, räumlich visuell, so dass die

Interaktionszone in einem Bereich nicht nur oberhalb, sondern auch innerhalb und ggf. unterhalb derselben visuell räumlich aufgelöst und vollständig überwacht wird. Mit dieser Überwachung kann auch gleichzeitig eine spektroskopische Erfassung der Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel, einschließlich der Interaktionszone mit ihren Zell-, Gewebe- und Implantatschichten selbst, verbunden sein, indem an wenigstens einen der besagten Beobachtungsstrahlengänge eine Spektroskopieeinheit gekoppelt ist.

Durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht dieser zumindest einen Interaktionszone transmigrierende Zellen und Partikel, welche auf diese Weise optisch verfolgt und dabei gegebenenfalls spektrometrisch analysiert werden können, werden in wenigstens einer Perfusionskammer unterhalb der Interaktionszone aufgefangen und sind somit einer weiteren Auswertung zufuhrbar. Insbesondere für Langzeituntersuchungen werden die Flussbedingungen des Flussmediums für das Durchströmen der Interaktionszone, beispielsweise durch Einstellung des pH- Wertes, der Temperatur, der Sauerstoffsättigung und der NährstoffVersorgung für die Zellen und Partikel, speziell eingestellt, beispielsweise durch eine dosierbare Regelung.

Mit der hier beschriebenen Erfindung wird die Möglichkeit geschaffen, Bewegungs-, Adhäsions- und Transmigrationsprozesse von Zellen unter Flussbedingungen, wie sie z. B. in Blut- und Lymphgefäßen eines lebenden Organismus vorliegen, nahezu naturgetreu nachzubilden, diese Vorgänge räumlich als auch zeitlich aufzulösen und gewünschte Zielzellen nach der Untersuchung vital zu isolieren und somit diese Zellen/Partikel für anschließende Untersuchungen nutzbar zu machen. Weiterhin können Zellen/Partikel unter naturnahen Bedingungen kontakt- und markierungsfrei spektrometrisch analysiert werden. Die Erfindung integriert Komponenten der Zell- und Gewebekultur und der optischen Bildaufhahme- und -Verarbeitung und ist daher vielseitig einsetzbar.

Untersuchungen an Zellen des Blutes und der Blutgefäße werden häufig unter statischen Bedingungen durchgeführt. Dies entspricht jedoch nicht der Situation in einem lebenden Organismus, in dem diese Zellen verschiedenen Flussbedingungen ausgesetzt sind. Die Zellen adaptieren sich an den Fluss und weisen unter fließenden Bedingungen abweichende zellphysiologische Eigenschaften gegenüber statischen Bedingungen auf. Untersuchungen von an den Fluss adaptierten Zellen geben somit genauere Auskunft über das Verhalten und die Eigenschaften von Zellen in und am Blutgefäß in vivo. Die Erfindung erlaubt Untersuchungen dieser Art unter verschiedenen Typen von Strömungsbedingungen (turbulent, laminar, pulsierend) und erlaubt darüber hinaus die Regulation wichtiger physiologischer Parameter wie hydrostatischer Druck, Flussgeschwindigkeiten, Zell/Partikel- konzentration im Flussmedium, pH- Wert und Sauerstoffsättigung. Es ist möglich, ganze Gewebeschichten entweder in der Zellkultur vorzuzüchten und in die Erfindung zu integrieren oder das Zusammenwachsen des Gewebes schon unter Flussbedingungen im System durchzuführen. Dazu gestattet die Erfindung eine individuelle Anpassung von physiologischen bzw. auch pathologischen Flussbedingungen für die zu untersuchenden Zellen über gewünschte Zeiträume. So erlaubt dieses System zum einen, die frei regelbare Zugabe verschiedener Substanzen nicht nur von der apikalen sondern auch von der basolateralen Seite der Zell-/Gewebe- bzw. Implantatschicht. Dies ist von Bedeutung, da z. B. subzellulär gelegene bioaktive Stoffe, wie beispielsweise modifizierte LDL, einen starken Einfluss auf die Interaktion von Leukozyten mit dem gesamten Gewebeverband haben. Zudem ist mit dieser Erfindung die Untersuchung der Effekte verschiedener Pharmaka, biologisch wirksamer Moleküle, chemischer Noxen und mikrobiologischer Organismen, wie Bakterien, Parasiten und Pilzen, nicht nur auf die Interaktion von Zellen im Flussmedium mit den apikal gelegenen Zellen der Gefaßwand beschränkt, sondern erlaubt ebenso eine Untersuchung der die Gefäßwand transmigrierenden und/oder im Gewebe differenzierenden Zellen. Mittels der in der Erfindung integrierten Perfusionskammern und den darin enthaltenen Zellfallen, ist es möglich, vollständig migrierte Zellen vital aufzufangen und anschließenden analytischen und/oder funktionellen Untersuchungen zugänglich zu machen. Weiterhin verfugt die Erfindung über eine frei regelbare Kontrolle der Umweltparameter pH- Wert, Temperatur, Sauerstoffmenge und Nährstoffzugabe, womit physiologische Bedingungen eingestellt werden können bzw. durch die einstellbaren Umweltparameter bedingte pathologische Ereignisse, wie Alkalose, Azidose, Nährstoffrestriktion, Hypoxie standardisiert und nah an der in vivo-Situation analysiert werden können. Krankheiten, wie Krebs und Sepsis, deren Ausbreitung durch den Blutfluss erfolgen, können mit dieser Erfindung sehr viel genauer, gründlicher und umfassender als mit bisherigen in vitro Methoden untersucht werden. Durch die Erfindung ist es möglich, die Metastasierung von Tumorzellen kosteneffizient, standardisiert und ohne Einsatz von Tiermodellen nachzustellen. Hierbei können physiologische Bedingungen simuliert werden, um ein umfassendes Bild über die Ausbreitung von Tumorzellen in vivo zu erhalten. Es ist möglich durch den Einsatz verschiedener Gewebeverbände, verschiedene Gewebebereiche des Körpers nachzuahmen und somit die Metastasierung von bestimmten Tumoren in definierten Geweben zu simulieren. Zudem ist es möglich, die Untersuchungen über lange Zeiträume durchzuführen und mit ein- oder mehrmaligem Mediumumlauf innerhalb des Systems zu arbeiten. Hierdurch wird die Möglichkeit geschaffen langfristig ablaufende pathophysiologische Vorgänge, wie beispielweise das Entstehen atherosklerotischer Läsionen, in Echtzeit zu erfassen. Ferner ist es möglich die Wirkung von pharmakologisch wirksamen Substanzen, Partikel oder Zellen beim Ablauf pathophysiologischer Vorgänge in Echtzeit zu dokumentieren. Hierdurch können Untersuchungen zur Entwicklung von Interventionstherapien effektiver ausgestaltet werden, da Wirkstoffkonzentrationen dynamisch verändert werden können und die Auswirkung auf pathophysiologische Vorgänge direkt beobachtet werden können. Diese Möglichkeiten eröffnen beispielsweise bei der Untersuchung von atherosklerotischen Läsionen, damit verbundenen inflammatorischen Reaktionen und der Wirkung pharmakologisch wirksamer Substanzen neue Möglichkeiten, da Zellen humanen Ursprungs eingesetzt werden können und auf die Nutzung von Tiermodellen verzichtet werden kann. Hierdurch können für die Krankheitsentstehung beim Menschen relevante Vorgänge besser untersucht werden. Die Vorzüge der Erfindung kommen in ähnlicher Weise auch bei der Untersuchung anderer krankheitsrelevanter Vorgänge (z. B. bei Sepsis, Krebs, Autoimmunkrankheiten usw.) am und im Gewebe zu tragen. Zu den Vorteilen der Erfindung zählt weiterhin die Möglichkeit, die Adhäsion und Transmigration von Zellen sowohl aufsichtig als auch seitlich auf und im Gewebe zu erfassen. Um dies zu erreichen, kommen Stereomikroskope zum Einsatz, die in der Lage sind, auch Fluoreszenzsignale zu detektieren. Durch den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die im langwelligen Infrarotbereich emittieren, ist es möglich, Zellbewegungen auch innerhalb von Geweben zu erfassen. Durch das Einbringen von horizontalen transparenten Zwischenschichten in zu untersuchende Gewebe ist es weiterhin möglich, auch Zellbewegungen im Graufeld mittels Phasenkontrast zu erfassen. Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Kammerkörpers als Ausfuhrungsbeispiel in unterschiedlichen Ansichten näher erläutert werden.

Es zeigen:

Fig. 1 : Kammerkörper mit drei unterhalb der Interaktionszone

angeordneten Perfusionskammern in geschnittener

schematischer Seitenansicht

Fig. 2: frontale Ansicht des Kammerkörpers mit angedeutetem aufsichtigem Objektiv- und Tubussystem

Fig. 3: seitliche Ansicht des Kammerkörpers in der Längsachse mit angedeuteten aufsichtigen und seitlichen Objektiv- und

Tubussystemen inklusive Fluoreszenzeinheit

Fig. 4: seitliche Ansicht des Kammerkörpers in der Längsachse mit angedeuteten aufsichtigen Objektiv- und Tubussystemen und seitliche angeordnetem Ramanmikroskop und Laser Fig. 5: schematische Darstellung der Flüssigkeitsumläufe

Fig. 1 zeigt einen Kammerkörper 1 mit drei Interaktionszonen 2, 3, 4, bestehend jeweils aus einer dem menschlichen Körper nachgebildeten Zell-, Gewebe- und Implantatschicht. Der Kammerkörper 1 weist einen Zufluss 5 auf, über welchen ein Flussmedium 6 mit den zu untersuchenden Zellen und Partikel (angedeutet durch Pfeildarstellung) in den Kammerkörper 1 eingeleitet wird, so dass die Zellen und Partikel des einströmenden Flussmediums 6 nacheinander die Interaktionszonen 2, 3, 4, unter welchen drei Perfusionskammern 7, 8, 9 angeordnet sind, durchströmen und mit der jeweiligen Zell-, Gewebe- und Implantatschicht in Kontakt treten. Nach Durchströmen des Kammerkörpers 1 mit den Interaktionszonen 2, 3, 4 tritt das Flussmedium über einen Abfluss 10 wieder aus. Der Kammerkörper wird über ein integriertes Heiz-/Kühlwasserkanalsystem 11 temperiert.

Die Interaktion der Zellen und Partikel des Flussmediums mit den Interaktionszonen 2, 3, 4 kann durch ein seitlich bzw. aufsichtig angeordnetes Mikroskopsystem 12 beobachtet werden (vgl. Fig. 2). Als Mikroskopsystem 12 können in an sich bekannter Weise sowohl Stereomikroskopsysteme als auch konfokale Laserscanning Mikroskope oder andere Mikroskop- und Spektroskopiesysteme zum Einsatz kommen. Die Beobachtung der Interaktionszonen 2, 3, 4 durch das Mikroskopsystem 12 erfolgt durch im Kammerkörper 1 vorgesehenen und den Interaktionszonen 2, 3, 4 zugeordnete austauschbare Glas- oder Quarzeinsätze 13, 14, 15. Zur vollständigen Beobachtung der Gesamtheit aller Interaktionszonen 2, 3, 4 ist das Mikroskopsystem 12 über (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellte Mittel, beispielsweise an sich bekannte schienenartige Führungselemente zur transversalen Positionsveränderung und ebenfalls an sich bekannte Schwenk- bzw. Rotationselemente zur Veränderung der Winkellage, über die Seite des Kammerkörpers 1 mit den Glas- oder Quarzeinsätzen 13, 14, 15 verfahrbar. Durch das Mikroskopsystem 12 kann die Adhäsion, Migration und Differenzierung der Zellen und Partikel des Flussmediums sowie der Zell-, Gewebe- und Implantatschichten der Interaktionszonen 2, 3, 4 in Echtzeit beobachtet und ausgewertet werden.

In Fig. 3 sind zwei Mikroskopsysteme 12 dargestellt, welche die Interaktionszonen 2, 3, 4 des Kammerkörpers 1 sowohl aufsichtig und als auch seitlich (Beobachtungsstrahlengang 36) beobachten. Die beiden aus Übersichtsgründen getrennt dargestellten Mikroskopsysteme 12 können beispielsweise durch separate und vorzugsweise in rechtwinkliger Lage zueinander angeordnete Mikroskopsysteme oder auch durch ein einziges Mikroskopsystem mit entsprechenden Beobachtungsstrahlengängen (mit aufsichtigem Strahlengang 37 und seitlichem Strahlengang 36 an den Kammerkörpers 1 angreifend) realisiert werden.

Zur Auswertung und Dokumentation der durch die getrennt dargestellten Mikroskopsysteme 12 detektierten Signale, sind die beiden Mikroskopsysteme 12 jeweils über einen Kameraport 16 bzw. 17 mit einem Computersystem 18 gekoppelt (vgl. Fig. 3).

Für die Detektion von Fluoreszenzsignalen an Zellen und Partikeln des Flussmediums und/oder an den besagten Zell-, Gewebe- und Implantatschichten der Interaktionszonen 2, 3, 4 und/oder der Perfusionskammern 7, 8, 9 werden diese Bereiche durch eine geeignete und Fluoreszenzfarbstoffe anregende Lichtquelle 19 bestrahlt.

Zur Detektion von metabolischen Vorgängen an Zellen und Partikeln des Flussmediums und/oder an den besagten Zell-, Gewebe- und Implantatschichten der Interaktionszonen 2, 3, 4 und/oder der Perfusionskammern 7, 8, 9 können ferner Spektroskopiemessungen durchgeführt werden. Hierfür erfolgt die optische Anregung durch einen Laser 20 (vgl. Fig. 4).

Die Messung der Spektren erfolgt durch einen Detektor 21, der beispielsweise in Form eines an sich bekannten Ramanmikroskops in das System integriert werden kann. Der Detektor 21 ist zur Signaldigitalisierung an ein Wandlersystem 22 gekoppelt, der ebenfalls mit dem Computersystem 18 zur Datenauswertung in Verbindung steht. Zum Einbringen von Zellen oder Partikeln in das Flussmedium dient ein Zellreservoir 23, das an ein beheiz-/ kühlbares Mediumreservoir 24 gekoppelt ist (vgl. schematische Darstellung Fig. 5). Eine Steuerung von pH- Wert und pO₂-Wert kann durch Begasungsanlagen erfolgen, die im Mediumreservoir 24 oder auch im Zellreservoir 23 integriert sein können (aus Übersichtsgründen nicht explizit in der Zeichnung dargestellt). Eine Zugabe von Substanzen in das Flussmedium kann durch ein Substanzapplikationsventil 25 erfolgen. Das Zellreservoir 23, das Mediumreservoir 24 und das Substanzapplikationsventil 25 sind in einen Mediumkreislauf 26 eingebunden. Fig. 5 zeigt diesen Mediumkreis- lauf 26, in welchem auch eine Sensorkammer 27 mit Sensorelementen zur Erfassung der Zellkulturparameter, wie pH- Werte, Temperatur und NährstoffVersorgung, für die im Flussmedium 5 vorhandenen Zellen und Partikel angeordnet ist. Auf diese Weise werden die besagten Zellkulturparameter im Mediumkreislauf 26 kontrolliert und können beispielsweise, wie vorgenannt, über die erwähnten Begasungsanlagen des Mediumreservoirs 24 oder des Zellreservoir 23 anwendungsspezifisch gesteuert werden.

Die Temperierung des Kammerkörpers 1 erfolgt über einen Heizungs- /Kühlungskreislauf28. An welchen ein temperierbares Heizwasserreservoir 29 angeschlossen ist, das den Heizungs- /Kühlungskreislauf 28 speist.

Unterhalb des Kammerkörpers 1 sind an demselben (entsprechend den drei besagten Interaktionszonen) drei Perfusionskammern 30, 31, 32 angeordnet (vgl. auch Perfusionskammern 7, 8, 9 in Fig. 1) angebracht, an die jeweils ein Vorratsbehälter 33, 34, 35 für zusätzlich in den Mediumkreislauf 26 einzubringende Testubstanzen und sonstige Applikationen angeschlossen ist.

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen

1 Kammerkörper

2, 3, 4 Interaktionszone

5 Zufluss

6 einströmendes Flussmedium

7, 8, 9 Perfusionskammer

10 Abfluss

11 Heiz-/Kühlwasserkanalsystem

12 Mikroskopsystem

13, 14, 15 - Glas- oder Quarzeinsatz im Kammerkörper 1

16, 17 Kameraport

18 Computersystem

19 Lichtquelle

20 Laser

21 Detektor

22 Wandlersystem

23 Zellreservoir

24 Mediumreservoir

25 Substanzapplikationsventil

26 Mediumkreislauf

27 Sensorkammer

28 Heizungs-/Kühlungskreislauf

29 Heizwasserreservoir

30, 31, 32 - Perfusionskammer

33, 34, 35 - Vorratsbehälter

36, 37 Beobachtungsstrahlengang

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Erfassung der Bewegung und Anlagerung von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen, bei dem die Zellen und Partikel in einem Flussmedium durch zumindest eine Interaktionszone im

Bereich der ggf. durch Trägermaterialien stabilisierten Zell-, Gewebe- und Implantatschicht geleitet werden sowie die Bewegungs- und Anlagerungsprozesse in laminaren, turbulenten und pulsierenden Strömungen visuell durch Aufsicht auf die zumindest eine Interaktionszone erfasst werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel, einschließlich deren Migration durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht, in der gesamten zumindest einen Interaktionszone optisch erfasst und ausgewertet werden, dass durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht transmigrierende

Zellen und Partikel in wenigstens einer Perfusionskammer vorzugsweise unterhalb der zumindest einen Interaktionszone aufgefangen werden und dass die Flussbedingungen des Flussmediums außerhalb und innerhalb der zumindest einen Interaktionszone, insbesondere für Langzeituntersuchungen, durch

Einstellung der Zellkulturparameter, wie pH- Werte, Temperatur und NährstoffVersorgung für die Zellen und Partikel, gesteuert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel in getrennten und von mehreren Seiten auf den Bereich der zumindest einen Interaktionszone gerichteten Beobachtungsstrahlengängen erfasst wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Erfassung der Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel durch wenigstens einen Beobachtungsstrahlengang erfolgt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussbedingungen sowie die Umweltbedingungen, wie Einstellung des pH-Wertes, Sauerstoffsättigung, der Temperatur und der Nährstoffversorgung für die Zellen und Partikel, einstellbar geregelt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem die zumindest eine Interaktionszone durchströmenden Flussmedium Wirksubstanzen und/oder biologisch wirksame Partikel, insbesondere mikrobiologischen Ursprungs, wie Bakterien, Sporen,

Pilze und Parasiten, in abgetöteter und/oder vitaler Form, und/oder biologisch nicht wirksame Partikel, wie Mikrobeads, zugegeben werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht transmigrierenden sowie in der wenigstens einen Perfusionskammer aufgefangenen Zellen und Partikel einer separaten zusätzlichen Analyse unterzogen werden.

7. Vorrichtung zur Erfassung der Bewegung und Anlagerung von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen, bei dem die Zellen und Partikel in einem Flussmedium durch zumindest eine Interaktionszone im Bereich der ggf. durch Trägermaterialien stabilisierten Zell-, Gewebe- und Implantatschicht geleitet werden sowie die Bewegungs- und Anlagerungsprozesse in laminaren, turbulenten und pulsierenden Strömungen visuell durch Aufsicht auf die zumindest eine Interaktionszone erfasst werden, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikroskopieeinrichtung (12) mit mindestens einem Beobachtungsstrahlengang (36, 37) zur optischen Erfassung der Zellen und Partikel nicht nur oberhalb, sondern auch innerhalb und außerhalb, vorzugsweise unterhalb, der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4), einschließlich der Erfassung der Migration der Zellen und Partikel durch deren Zell-, Gewebe- und Implantatschicht, vorgesehen ist, dass in und/oder an der Vorrichtung Sensor- und Steuerungselemente (28) angeordnet sind, durch die insbesondere für Langzeituntersuchungen die Zellkulturparameter zumindest eines Medienkreislaufs (26) der Vorrichtung, beispielsweise pH-Wert, Sauerstoffsättigung,

Temperatur und NährstoffVersorgung der Zellen und Partikel, gesteuert und einstellbar geregelt werden können, und dass vorzugsweise unterhalb der zumindest einen

Interaktionszone (2, 3, 4) wenigstens eine Perfusions- kammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) zur Einbringung von Testsubstanzen in die zumindest eine Interaktionszone (2, 3, 4) sowie zur Anreicherung von durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht transmigrierenden Zellen und Partikeln vorgesehen ist.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroskopieeinrichtung (12) zusätzlich zu dem aufsichtig auf die zumindest eine Interaktionszone gerichteten Beobachtungsstrahlengang einen im Wesentlichen seitlich auf dieselbe Interaktionszone gerichteten Beobachtungsstrahlengang (36) aufweist.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Mikroskopieeinrichtung (12) eine Spektroskopieeinheit (20, 21) zur Erfassung und Auswertung der Zellen und Partikel, einschließlich der Analyse der zumindest einen

Interaktionszone (2, 3, 4) selbst, vorgesehen ist.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der wenigstens einen Perfusionskammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) Mittel, beispielsweise Strömungskanäle, zum Erzeugen einer

Medienverwirbelung vorgesehen sind, so dass sich transmigrierende Zellen und Partikel des Flussmediums (6) von der Unterseite der durchdrungenen Zell-, Gewebe- und Implantatschichten lösen und in der wenigstens einen Perfusionskammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) aufgefangen werden.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der wenigstens einen Perfusionskammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) Mittel, beispielsweise ein oder mehrere Zellsiebe, zum Auffangen der transmigrierenden Zellen und Partikel vorgesehen sind.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4) durch eine oder mehrere für die Beobachtungsstrahlengänge optisch durchlässige Trägerschichten, beispielsweise bakterielle Nanocellulose, stabilisiert ist.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4) aus mehreren Einzelzellschichten besteht, die jeweils sandwichartig durch eine für die Beobachtungsstrahlengänge (36, 37) optisch durchlässige Trägerschicht, beispielsweise bakterielle Nanocellulose, getrennt sind.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass insbesondere für langfristige Wirkstofftestungen

Reservoirs (23, 24) für Zellen, Partikel und erforderliche Nährmedien vorgesehen sind.

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen innerhalb des

Kammerkörpers (1) vorgesehen sind, beispielsweise eine Lichtquelle, über welche Anregungslicht mittels Lichtleitkabel seitlich an den Kammerkörper (1) herangeführt ist.