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WO2011078134A1 - ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子及びその用途 - Google Patents

ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子及びその用途 Download PDF

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WO2011078134A1
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amino acid
lipid
malro1
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美佐 落合
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Suntory Holdings Ltd
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    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)

Definitions

  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a novel diacylglycerol acyltransferase and a method for using the same.
  • Triacylglycerol which is a storage lipid, is produced by transferring an acyl group to diacylglycerol.
  • An enzyme that transfers an acyl group to diacylglycerol is called a diacylglycerol acyltransferase (diagylglycerol acyltransferase: DGAT), and is a type of acyl CoA that uses acyl CoA as an acyl donor (acyl donor): diacylglycerol acyltransferase ( Acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (EC: 2.3.1.20) and phospholipids that use phospholipids as acyl donors: diacylglycerol acyltransferase (PDAT) (EC: 2.3.1.158) It has been known.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 The PDAT gene has been cloned from yeast and plants (Patent Document 1, Non-Patent Documents 3 and 4).
  • PDAT derived from Arabidopsis thaliana includes phosphatidic acid, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and the like. It is known that various phospholipids can be used as acyl donors and that C 10 -C 22 acyl groups can be transferred (Non-patent Document 5).
  • DGA1 YOR245C
  • PRO LRO1 YNR008W
  • ARE1 and ARE2 are acyl CoA: sterol acyltransferase genes
  • Non-Patent Document 8 In the lipid-producing bacterium Mortierella alpina (M. alpina), four types of DGAT with acyl CoA as an acyl donor and its genes have been reported so far (two DGAT1 family genes). And two types of DGAT2 family genes) (Patent Documents 2 and 3, Non-Patent Document 8)
  • the present inventors succeeded in cloning a gene encoding a PDAT homologue (MaLRO1) of M. alpina, a lipid-producing bacterium, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following polynucleotide, protein, expression vector, transformant, lipid or fatty acid composition using the transformant, a method for producing a food, etc., and a food produced by such a method. provide.
  • the polynucleotide according to any one of the following groups selected from the group consisting of (a) to (e): (A) a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4; (B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (C) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 100 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added and having diacylglycerol acyltransferase activity A polynucleotide; (D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having diacylglycerol acyltransferase activity; and (e) SEQ ID NO: A polynucleotide that
  • a method for producing a lipid or fatty acid composition comprising collecting the lipid or fatty acid composition from the culture of the transformant according to any one of [8] to [11].
  • the method according to [12] above, wherein the lipid is triacylglycerol.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for transformation of lipid-producing bacteria (for example, M. alpina), yeast, plants and the like. That is, by introducing the polynucleotide of the present invention into an appropriate host cell to produce a transformant and expressing the polynucleotide in the transformant, triacylglycerol containing a high content of DGLA and ARA is obtained. It can be generated efficiently.
  • the transformant thus obtained transformed lipid-producing bacterium, transformed yeast, transformed plant or the like
  • the transformant of the present invention has extremely high production efficiency of lipids and fatty acids. Therefore, this invention can be effectively used for manufacture of the pharmaceutical or health food which requires a large amount of lipid or fatty acid.
  • FIG. 2B is a diagram showing the CDS sequence and deduced amino acid sequence of MaLRO1 following FIG. 2A. It is a figure which shows the alignment of the amino acid sequence of PDAT homologous protein originating in various fungi. Amino acid residues (marked with *) that are important for PDAT activity were conserved across bacterial species. It is a figure which shows the amount of fatty acids in the lipid fraction extracted from the yeast cell. It is a figure which shows the fatty acid composition in the lipid fraction extracted from the yeast cell.
  • the present inventors have succeeded in cloning the full-length cDNA of the PDAT homologue gene (MaLRO1) derived from M. alpina, which is a lipid-producing bacterium, as described in detail in Examples below.
  • the present inventors have also identified the base sequence and the deduced amino acid sequence of MaLRO1 genomic DNA derived from M. alpina.
  • the ORF sequence of MaLRO1, the deduced amino acid sequence of MaLRO1, the CDS sequence of MaLRO1, the cDNA sequence of MaLRO1, and the genomic sequence of MaLRO1 are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • These polynucleotides and enzymes can be obtained by the techniques described in the examples below, known genetic engineering techniques, known synthesis techniques, and the like.
  • the present invention provides a polynucleotide according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (e).
  • A a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • C In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 100 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added and having diacylglycerol acyltransferase activity A polynucleotide;
  • D a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having diacylglycerol acyltransferase activity; and
  • SEQ ID NO: A polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. This refers to a polynucleotide obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using as a probe all or part of a polynucleotide comprising a base sequence to be encoded. Examples of hybridization methods include “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001” and “Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997". Can be used.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • intermediate stringent conditions include, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. or 5 x SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5 ), 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. or 0.2 ° ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency.
  • a probe based on a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 or a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 commercially available reagents (for example, If the probe is labeled with digoxigenin (DIG) using a PCR labeling mix (Roche Diagnostics, etc.), detect hybridization using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics) Can do.
  • DIG digoxigenin
  • the above-described polynucleotide of the present invention can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • Protein of the present invention provides the following proteins.
  • (I) A protein encoded by the polynucleotide of any one of (a) to (e) above.
  • a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • (Iii) A protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted, and / or added, and having diacylglycerol acyltransferase activity.
  • (Iv) A protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having diacylglycerol acyltransferase activity.
  • the protein described in (iii) or (iv) above is typically a naturally occurring variant of the protein of SEQ ID NO: 2, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 “,” Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 “,” Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982) “,” Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 79, 6409 (1982) “,” Gene, 34, 315 (1985) ",” Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ",” Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) "and the like, and those that can be artificially obtained using the site-directed mutagenesis method are also included.
  • a protein having a diacylglycerol acyltransferase activity consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted and / or added”
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 39 1 to 38, 1 to 37, 1 to 36, 1 to 35, 1 to 34, 1 to 33, 1 to 32, 1 to 31, 1 to 30, 1 to 29 Pieces, 1-28 pieces, 1-27 pieces, 1-26 pieces, 1-25 pieces, 1-24 pieces, 1-23 pieces, 1-22 pieces, 1-21 pieces, 1-20 pieces, 1-19 pieces Pieces, 1-18 pieces, 1-17 pieces, 1-16 pieces, 1-15 pieces, 1-14 pieces, 1-13 pieces, 1-12 pieces, 1-11 pieces, 1-10 pieces, 1-9 pieces 1 to several, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4,
  • Such proteins include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 60% or more, 61% or more, 62% or more, 63% or more, 64% or more, 65% or more, 66% or more, 67% or more, 68% 69% or more, 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% More than 94%, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, A protein having an amino acid sequence having 99.7% or more
  • the diacylglycerol acyltransferase activity can be measured according to the method described in Stahl et al., Plant Physiology, 135, 1324-1335 (2004).
  • a method for confirming the diacylglycerol acyltransferase activity there is an experiment using ⁇ dga1 and ⁇ lro1 strains of yeast in which the amount of triacylglycerol produced is significantly reduced.
  • the diacylglycerol acyltransferase activity may be either acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase activity or phospholipid: diacylglycerol acyltransferase activity, preferably phospholipid: diacylglycerol acyl group Transferase activity.
  • deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in the same sequence are at one or more positions in the amino acid sequence. It means that there are deletion, substitution, insertion and / or addition of a plurality of amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • chemical synthesis can be performed using peptide synthesizers such as Advanced Automation Peptide Protein Technologies, Perkin Elmer, Protein Technologies, PerSeptive, Applied Biosystems, and SHIMADZU.
  • the vector of the present invention and a transformant incorporating the vector also provides, in another embodiment, an expression vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • the vector of the present invention is usually (I) a promoter capable of being transcribed in a host cell; (Ii) the polynucleotide according to any one of (a) to (g) bound to the promoter; and (iii) a signal that functions in the host cell with respect to transcription termination and polyadenylation of the RNA molecule.
  • the vector thus constructed is introduced into a host cell. Examples of suitable host cells used in the present invention include lipid producing bacteria, yeast and the like.
  • Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO8571, Mortierella hygrophila IFO5941, Mortierella 266alpina, cc Microorganisms belonging to the subgenus Mortierella such as ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68, Or Mortierella isabellina CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, Mortierella nana I Genus micro-mucor micro such as FO8190, Mortierella ra
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, and the like.
  • yeast diacylglycerol acyltransferase gene used as a host cell
  • yeast when is deleted, it is possible to evaluate only the enzyme activity of the protein. Therefore, in one embodiment of the present invention, yeast as a host cell preferably lacks the DGA1 gene and LRO1 gene.
  • These host cells transformed with the vectors of the present invention have higher amounts of lipids, preferably triacylglycerols (also called “triglycerides”), compared to host cells not transformed with the vectors of the present invention. ), More preferably a triacylglycerol containing arachidonic acid or DGLA, most preferably a triacylglycerol containing arachidonic acid.
  • lipids preferably triacylglycerols (also called “triglycerides”), compared to host cells not transformed with the vectors of the present invention. ), More preferably a triacylglycerol containing arachidonic acid or DGLA, most preferably a triacylglycerol containing arachidonic acid.
  • pDura5 Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004)
  • the vector used for introduction into yeast is not particularly limited as long as it is a vector having an activity of expressing an insert in yeast cells.
  • pYE22m Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995.
  • the vector used for introduction into Mortierella alpina is not particularly limited as long as it is a vector having an activity of expressing an insert in Mortierella alpina cells, but examples thereof include M. alpina expression vector pDuraMCS. It is done.
  • the promoter / terminator for regulating gene expression in the host cell may be any combination as long as it functions in the host cell.
  • the promoter of histon H4.1 gene when used in lipid-producing bacteria, the promoter of histon H4.1 gene, the promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene, and the like can be used.
  • Selectable markers used for transformation include auxotrophic markers (ura5, niaD), drug resistance markers (hygromycine, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc Natl. Acad. Sci.
  • cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (Ashigaki, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; Hussain et al., Gene, 101, 149, respectively) 1991) is available.
  • lipid-producing bacteria As a host cell transformation method, a publicly known method can be used.
  • the electroporation method Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000
  • the particle delivery method JP 2005-287403 “Lipid-producing bacteria”.
  • electroporation method spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)), lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, p163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual etc., but not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for producing a lipid or fatty acid composition using the above transformed lipid-producing bacterium or yeast.
  • lipid refers to a simple lipid including a compound (for example, glyceride) in which a fatty acid and an alcohol are ester-bonded or an analog thereof (for example, a cholesterol ester), a portion of the simple lipid, and phosphoric acid.
  • oil and fat refers to an ester (glyceride) of glycerol and a fatty acid.
  • fatty acid means an aliphatic monocarboxylic acid represented by the general formula RCOOH (where R is an alkyl group) (a carboxylic acid having one carboxyl group and having carbon atoms linked in a chain).
  • RCOOH where R is an alkyl group
  • Fatty acids include saturated fatty acids that do not have double bonds in the hydrocarbon chain and unsaturated fatty acids that contain double bonds.
  • the lipid or fatty acid composition of the present invention can be extracted from cells transformed according to the present invention as follows.
  • cultured cells are obtained according to conventional methods such as centrifugation and filtration after completion of the culture.
  • the cells are thoroughly washed and preferably dried. Drying can be performed by freeze drying, air drying, or the like. If necessary, the dried cells are crushed with dynomill or ultrasonic waves, and then extracted with an organic solvent, preferably under a nitrogen stream.
  • organic solvent ether, hexane, methanol, ethanol, chloroform, dichloromethane, petroleum ether, or the like can be used, or by alternately extracting methanol and petroleum ether or using a single solvent of chloroform-methanol-water. Good results can be obtained.
  • Fatty acid-containing lipids can be obtained by distilling off the organic solvent from the extract under reduced pressure.
  • the extracted fatty acid may be methyl esterified by the hydrochloric acid methanol method or the like.
  • the separation of the fatty acid from the lipid containing the fatty acid is performed by concentration and separation by a conventional method (for example, urea addition method, cooling separation method, column chromatography method, etc.) in the state of mixed fatty acid or mixed fatty acid ester. It can be carried out.
  • a conventional method for example, urea addition method, cooling separation method, column chromatography method, etc.
  • the lipid produced by the method of the present invention is preferably a triacylglycerol, more preferably a triacylglycerol containing arachidonic acid or dihomo- ⁇ -linolenic acid, most preferably a triacylglycerol containing arachidonic acid. It is.
  • the fatty acid produced by the method of the present invention is preferably arachidonic acid or dihomo- ⁇ -linolenic acid, most preferably arachidonic acid.
  • the composition of the lipid produced by the method of the present invention and the fatty acid contained in the lipid can be confirmed by the above-described lipid extraction method, fatty acid separation method, or a combination thereof.
  • the lipid or fatty acid composition obtained by the production method of the present invention may be used in accordance with a conventional method, for example, for uses such as production of foods and oils containing fats and oils, industrial raw materials (raw materials such as cosmetics and soaps). it can.
  • the present invention also provides a method for producing foods, cosmetics, medicines, soaps and the like using the transformed lipid-producing bacterium or the transformed yeast of the present invention.
  • This method includes the step of producing lipids or fatty acids using the transformed lipid-producing bacterium or transformed yeast of the present invention.
  • Preparation of foods, cosmetics, medicines, soaps, and the like containing the produced lipids or fatty acids is according to a conventional method.
  • foodstuffs, cosmetics, medicines, soaps and the like produced by the production method of the present invention contain lipids or fatty acids produced using the transformed lipid-producing bacterium or transformed yeast of the present invention.
  • the present invention further provides foods, cosmetics, medicines, soaps and the like produced by such methods.
  • the dosage form of the cosmetic (composition) or pharmaceutical product (composition) of the present invention is not particularly limited, and can be any dosage form such as a solution, paste, gel, solid, or powder.
  • the cosmetic composition or pharmaceutical composition of the present invention includes oil, lotion, cream, emulsion, gel, shampoo, hair rinse, hair conditioner, enamel, foundation, lipstick, funny, pack, ointment, perfume, powder, eau de cologne.
  • skin external preparations such as toothpaste, soap, aerosol, cleansing foam, etc., skin aging prevention improving agent, skin inflammation prevention improving agent, bath preparation, hair nourishing agent, skin beauty liquid, sunscreen agent or trauma, scuffing, It can be used as an agent for improving and preventing rough skin caused by cracks.
  • the cosmetic composition of the present invention may further contain other fats and oils and / or dyes, fragrances, preservatives, surfactants, pigments, antioxidants and the like as necessary. These blending ratios can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose (for example, fats and oils in the composition are 1 to 99.99% by weight, preferably 5 to 99.99% by weight, more preferably 10 to 99.95). % May be contained).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain other pharmaceutically active ingredients (for example, anti-inflammatory ingredients) or auxiliary ingredients (for example, lubricating ingredients, carrier ingredients) as necessary.
  • other commonly used ingredients in cosmetics or topical skin preparations include acne agents, anti-dandruff / itching agents, antiperspirant deodorants, burn agents, anti-ticks / lice agents, keratin softeners, dry skin agents , Antiviral agents, transdermal absorption enhancers and the like.
  • Examples of the food of the present invention include dietary supplements, health foods, functional foods, infant foods, infant formulas, premature infant formulas, and elderly foods.
  • food is a generic term for solids, fluids, liquids, and mixtures thereof that can be consumed.
  • Nutritional supplements refer to foods that are enriched with specific nutritional components. Healthy food means food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements, natural foods, diet foods, and the like.
  • Functional food means food for replenishing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use.
  • Infant food is food that is given to children up to about 6 years of age.
  • the food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food.
  • Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old.
  • Premature infant formula refers to formula that is given to premature infants until they are about 6 months old.
  • Examples of forms of these foods include natural foods such as meat, fish, nuts (treated with oils and fats), foods to which fats and oils are added when cooking Chinese food, ramen, soups, tempura, fries, fried rice, fried rice, Foods using fats and oils as heat medium such as donuts, sugar sugar, butters, margarines, mayonnaise, dressings, chocolates, instant ramen, caramels, biscuits, cookies, cakes, ice creams, etc. or processed foods with added fats during processing Examples include foods that are sprayed or coated with fats and oils during processing finishes such as oysters, hard biscuits and bread rolls. However, it is not limited to foods containing fats and oils.
  • bread, noodles, rice, confectionery (candy, chewing gum, gummi, tablet confectionery, Japanese confectionery), agricultural products such as tofu and processed products thereof, sake, medicinal products Fermented foods such as sake, mirin, vinegar, soy sauce, miso, etc., livestock foods such as yogurt, ham, bacon, sausage, marine foods such as kamaboko, fried tempura, hampen, fruit juice drinks, soft drinks, sports drinks, alcoholic drinks, tea Etc.
  • the food of the present invention is also in the form of a pharmaceutical preparation such as a capsule, or a natural liquid food or semi-digested nutritional food in which the fats and oils of the present invention are blended with proteins, sugars, fats, trace elements, vitamins, emulsifiers, fragrances, etc. , And processed forms such as component nutrient foods, drinks, enteral nutrients, and the like.
  • the diacylglycerol acyltransferase gene of the present invention in a host cell, it is possible to efficiently produce lipids, particularly triacylglycerol. Furthermore, using the expression level of the gene as an index, it can also be used for examination of culture conditions, culture management, etc. for efficient production of lipids, particularly triacylglycerol.
  • Genomic analysis of M. alpina The M. alpina 1S-4 strain was inoculated into 100 ml of GY2: 1 medium (2% glucose, 1% yeast extract pH 6.0) and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 days. Cells were collected by filtration, and genomic DNA was prepared using DNeasy (QIAGEN). The base sequence of the genomic DNA was determined using Roche 454 GS FLX Standard. At that time, the base sequence of the fragment library was determined for 2 runs, and the base sequence of the mate pair library was determined for 3 runs. By assembling the obtained base sequences, 300 Super Contigs were obtained.
  • S. cerevisiae-derived LRO1 (ScLRO1) homologues Using the deduced amino acid sequence (GenBank accession No. P40345) encoded by the S. cerevisiae-derived PDAT gene (ScLRO1) as a query, the genome sequence of M. alpina 1S-4 strain On the other hand, as a result of tblastn search, Super contig containing the sequence shown in SEQ ID NO: 5 was hit. The gene having the base sequence of SEQ ID NO: 5 was designated as MaLRO1, and cDNA was cloned as follows.
  • the amplified DNA fragment of about 0.7 kb was purified and cloned by TOPO-TA cloning kit (Invitrogen).
  • the nucleotide sequence of the insert was confirmed by a DNA sequencer, and the plasmid having the nucleotide sequence of positions 814-1485 of SEQ ID NO: 4 was designated as pCR-MaLRO1-P.
  • PCR was performed using this plasmid as a template and the above primers.
  • ExTaq (Takara Bio) was used for the PCR reaction, but using a PCR labeling mix (Roche Diagnostics) instead of the attached dNTP mix, a probe with digoxigenin (DIG) labeled DNA to be amplified was used. Produced.
  • a cDNA library was screened using the probe.
  • Hybridization conditions are as follows. Buffer: 5 x SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamide; Temperature: 42 ° C (overnight); Washing conditions: 0.2 x SSC, 0.1% SDS solution (65 ° C), 20 minutes x 3 times; Detection was performed using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics). Plasmids were excised from the phage clones obtained by screening by in vivo excitation to obtain each plasmid DNA. Among the plasmids obtained by screening, the plasmid with the longest insert length was designated as plasmid pB-MaLRO1-P1.
  • the sequence of the insert of plasmid pB-MaLRO1-P1 was compared with the genomic sequence.
  • the location indicated by the upward arrow in FIG. 1 is the 5 ′ end of the insert of plasmid pB-MaLRO1-P1.
  • the 5 ′ side of the upward arrow in the genome sequence from the sequence of the insert of MaLRO1-P1 we found that it was 3 times earlier than the stop codon that first appeared on the same frame as that predicted to encode MaLRO1. 'There were two start codons ATG on the side. Therefore, a 5 ′ primer MaLRO1-6F containing a 5 ′ initiation codon was prepared, and MaLRO1-5R was also prepared as a 3 ′ primer.
  • MaLRO1-5R 5'-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • MaLRO1-6F 5'-ATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • PCR was performed with primers MaLRO1-6F and MaLRO1-5R using ExTaq (Takara Bio) using the cDNA prepared from M. alpina 1S-4 as a template.
  • the obtained DNA fragment of about 0.75 kbp was cloned using the TOPO-TA cloning kit, and the base sequence of the insert was determined.
  • the insert contained the 1-762th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 4 had CDS (SEQ ID NO: 3) of the 1-2400th nucleotide sequence and ORF (SEQ ID NO: 1) of the 1-2397th nucleotide sequence.
  • the amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 is shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 2.
  • MaLRO1 genomic sequence (SEQ ID NO: 5) and MaLRO1 cDNA sequence (SEQ ID NO: 4) were compared (FIG. 1). As a result, it was revealed that the genomic sequence of the MaLRO1 gene contains 5 introns and is composed of 6 exons.
  • Bam-MaLRO1-F 5'-GGATCCATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3 '(SEQ ID NO: 10) PCR was performed with primers Bam-MaLRO1-F and MaLRO1-5R using KOD-plus (Toyobo) using cDNA prepared from M. alpina 1S-4 as a template.
  • the obtained DNA fragment of about 0.75 kbp was cloned with a zero brand TOPO-cloning kit (Invitrogen), and the nucleotide sequence was confirmed.
  • a plasmid having an overlapping nucleotide sequence compared to the cDNA sequence of MaLRO1 was designated as pCR-MaLRO1-5 ′.
  • ScDGA1-F1 5'-GAATTCatgtcaggaacattcaatgatata-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • ScDGA1-R1 5'-GTCGACTTACCCAACTATCTTCAATTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • ScLRO1-F1 5'-GAATTCatgggcacactgtttcgaagaaat-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • ScLRO1-R1 5'-GTCGACTTACATTGGGAAGGGCATCTGAGA-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • cerevisiae S288C strain was inoculated into 10 ml YPD (DIFCO) liquid medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. Bacteria were collected by centrifugation, and DNA was extracted using Gentorikun-yeast (Takara Bio). Using this DNA as a template, PCR was performed using ExTaq (Takara Bio) with a combination of primer ScDGA1-F1 and primer ScDGA1-R1, or a combination of primer ScLRO1-F1 and primer ScLRO1-R1.
  • Plasmids having the correct base sequence were designated as plasmid pCR-ScDGA1 and plasmid pCR-ScLRO1, respectively.
  • Plasmid pCR-ScDGA1 was digested with restriction enzymes HpaI and AatI, and a DNA fragment of about 4.5 kbp and plasmid pURA34 (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-120276) were obtained. After digestion with the restriction enzyme HindIII, the DNA fragment of about 1.2 kbp obtained by blunting the ends with the DNA Blunting Kit (Takara Bio) was ligated with Ligation high (Toyobo), and the URA3 gene was inserted in the same direction as the ScDGA1 gene. The resulting plasmid was designated as pCR- ⁇ dga1: URA3-1.
  • Co-transformation was performed by the lithium acetate method using a DNA fragment amplified by PCR with a combination of primers ScLRO1-R1.
  • the transformed strain was SC-Leu, Ura (per liter, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine 0.6 g, aspartic acid 3 g , Glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g, tryptophan 1.2 g) 1.3 g) agar medium Selected on the basis of growing on (2% agar).
  • Ura per liter, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO)
  • DNA was extracted from any two strains using Gen Torkun-yeast (Takara Bio). Using these DNAs as templates, PCR was performed with the following combinations of (1) to (4) primers.
  • the DNA fragment of 1.8 kbp was amplified by the combination of (1) and 3.3 kbp by the combination of (3), but the DNA fragment was amplified by the combination of (2) and (4). There wasn't. This confirmed that these strain
  • the transformed strain was SC-Trp, Leu, Ura (per 1 L, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, amino acid powder (1.25 g adenine sulfate, 0.6 g arginine, aspartic acid 3 g, glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g) 1.3 g) agar medium (2 % Agar) was selected on the basis of growing on the standard.
  • DIFCO Yeast nitrogen base w / o amino acids
  • strain transformed with pYE22m was C / ⁇ DG # 1,2 and the strain transformed with pYE-MaLRO1 was MaLRO1 / ⁇ DG # 1,2.
  • Lyophilized cells were crushed with glass beads, and lipids were extracted with 8 ml of chloroform: methanol 2: 1.
  • Silica gel 60 plates (Merck) and developing solvent hexane: diethyl ether: acetic acid 70: 30: 1 were subjected to thin layer chromatography (TLC) to fractionate lipids.
  • TLC thin layer chromatography
  • Spray 0.015% 80% acetone aqueous solution (primulin solution), visualize the lipid by UV irradiation, mark the triacylglycerol (TG) fraction and phospholipid (PL) fraction with a pencil, and remove the silica gel. Each was scraped and collected in a test tube.
  • Fatty acids were derived into methyl esters by the hydrochloric acid methanol method, and the fatty acids were analyzed by gas chromatography. That is, 1 ml of dichloromethane and 2 ml of 10% hydrochloric acid methanol were added and reacted at 50 ° C. for 3 hours to induce fatty acids into methyl esters. Subsequently, 4 ml of hexane and 1 ml of water were added, and the mixture was vigorously stirred and then centrifuged to separate the upper layer. The solvent was distilled off by speedback, dissolved in acetonitrile and subjected to gas chromatography, and fatty acid analysis was performed.
  • arachidonic acid-producing yeast S. cerevisiae
  • the following plasmids were constructed. First, using cDNA prepared from M. alpina 1S-4 strain as a template, ⁇ 12-f and ⁇ 12-r, ⁇ 6-f and ⁇ 6-r, GLELO-f and GLELO-r or ⁇ 5-f and ⁇ 5-r, PCR using ExTaq with a combination of primers, ⁇ 12 fatty acid desaturase gene of M.
  • alpina 1S-4 strain GenBank accession No.AB020033
  • ⁇ 6 fatty acid desaturase gene GeneBank accession No.AB020032
  • the GLELO fatty acid chain length extension enzyme gene GeneBank accession No. AB193123
  • the ⁇ 5 fatty acid desaturation gene GeneBank accession No. AB188307
  • nucleotide sequence, and clones containing the ⁇ 12 gene, ⁇ 6 gene, GLELO gene, and ⁇ 5 gene nucleotide sequence are plasmid pCR-MA ⁇ 12DS (including the ⁇ 12 gene nucleotide sequence) and pCR-MA ⁇ 6DS (including the ⁇ 6 gene nucleotide sequence), respectively. ), PCR-MAGLELO (including the base sequence of GLELO gene) and pCR-MA ⁇ 5DS (including the base sequence of ⁇ 5 gene).
  • a DNA fragment of about 1.2 kb obtained by digesting plasmid pURA34 (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-120276) with restriction enzyme HindIII was digested with vectors pUC18 with restriction enzymes EcoRI and SphI, and the ends were blunted and self-ligated.
  • the clone obtained by inserting the vector into the HindIII site of the vector and having the EcoRI site side of the vector on the 5 ′ side of URA3 was designated as pUC-URA3.
  • the plasmid pCR-MA ⁇ 12DS was digested with the restriction enzyme HindIII and then blunt-ended, followed by digestion with the restriction enzyme XbaI.
  • the DNA fragment of about 1.2 kb and the vector pESC-URA (STRATAGENE) were used as the restriction enzyme.
  • SacI the blunted end was ligated with a DNA fragment of about 6.6 kbp digested with the restriction enzyme SpeI to obtain plasmid pESC-U- ⁇ 12.
  • the plasmid pCR-MA ⁇ 6DS was digested with the restriction enzyme XbaI and the blunted end was digested with the restriction enzyme HindIII, and the approximately 1.6 kb kbp DNA fragment and the plasmid pESC-U- ⁇ 12 were digested with the restriction enzyme SalI.
  • the blunt end was ligated with a DNA fragment of about 8 kbp digested with restriction enzyme HindIII to obtain plasmid pESC-U- ⁇ 12: ⁇ 6.
  • a fragment of about 4.2 kb obtained by partial digestion with restriction enzyme PvuII was inserted into the SmaI site of pUC-URA3 to obtain plasmid pUC-URA- ⁇ 12: ⁇ 6.
  • the plasmid pCR-MAGLELO was digested with restriction enzymes XbaI and SacI, and a DNA fragment of about 0.95 kbp, and the vector pESC-LEU (STRATAGENE) was digested with restriction enzymes XbaI and SacI, about 7.7 kbp.
  • the plasmid pESC-L-GLELO was obtained.
  • Saccharomyces cerevisiae YPH499 strain (STRATAGENE) was co-transformed with plasmid pUC-URA- ⁇ 12: ⁇ 6 and plasmid pUC-LEU-GLELO: ⁇ 5.
  • the transformant was selected on the basis of growing on SC-Leu, Ura agar medium.
  • one arbitrary strain was designated as ARA3-1 strain.
  • This strain can express ⁇ 12 fatty acid desaturase gene, ⁇ 6 fatty acid desaturase gene, GLELO gene, ⁇ 5 fatty acid desaturase gene from GAL1 / 10 promoter by culturing in a medium containing galactose. it can.
  • the ARA3-1 strain was transformed with plasmids pYE22m and pYE-MaLRO1, respectively.
  • the transformed strain was SC-Trp, Leu, Ura (per 1 L, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, amino acid powder (1.25 g adenine sulfate, 0.6 g arginine, aspartic acid 3 g, glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g) 1.3 g) agar medium (2 % Agar) was selected on the basis of growing on the standard. Of the respective plasmid-introduced strains, any 4 strains were used for the
  • strains were cultured in 10 ⁇ ml of the SC-Trp, Leu, Ura liquid medium at 30 ° C. for 1 day, and 1 ⁇ ml of the strain was SG-Trp, Leu, Ura (with ⁇ -linolenic acid added to 50 ⁇ g / ml).
  • Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, galactose 20 g, amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine 0.6 g, aspartic acid 3 g, glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g mixed) 1.3 g) The liquid medium was cultured at 15 °C for 6 days at 15 °C. The cells were collected, washed with water, and lyophilized.
  • DIFCO amino acid powder
  • Lipid was detected by spraying the primulin solution and irradiating with ultraviolet rays.
  • the TG fraction and the PL fraction were each scraped and collected in a test tube, the fatty acid was derived into a methyl ester by the hydrochloric acid methanol method, and the fatty acid was analyzed by gas chromatography.
  • the composition ratio of polyunsaturated fatty acid (PUFA) in the TG fraction and the PL fraction is shown in FIG.
  • the composition ratio of TG DGLA and arachidonic acid (ARA) increased compared to the control (FIG. 5A).
  • the yeast used in the above examples imparted arachidonic acid-producing ability by introducing genes for M12 alpina-derived ⁇ 12 fatty acid desaturase, ⁇ 6 fatty acid desaturase, GLELO and ⁇ 5 fatty acid desaturase. It can be said that it has the same arachidonic acid production system as M. alpina. In M.
  • GLELO generates DGLA from ⁇ -linolenic acid (GLA) bound to CoA, and then DGLA is incorporated into lipids, followed by ⁇ 5 fatty acid desaturase, mainly the acyl group of phosphatidylcholine.
  • GLA ⁇ -linolenic acid
  • DGLA is incorporated into lipids, followed by ⁇ 5 fatty acid desaturase, mainly the acyl group of phosphatidylcholine.
  • ARA is thought to be generated mainly as an acyl group of phosphatidylcholine.
  • the MaLRO1 gene is considered to encode “phospholipid: diacylglycerol transferase” using phospholipid as a substrate.
  • the ratio of DGLA and ARA did not change between the control and MaLRO1-expressing strains (FIG. 5B).
  • M. alpina expression vector pDuraMCS for expressing a target gene from a histone promoter was used as an M. alpina expression vector.
  • a vector was constructed as follows. About 0.35 kbp DNA fragment obtained by digesting plasmid pCR-MaLRO1-5 'with restriction enzymes BamHI and PstI, and about 2.05 kbp obtained by digesting plasmid pB-MaLRO1-P1 with restriction enzymes PstI and XhoI And the DNA fragment of about 8.3 kbp obtained by digesting M. alpina expression vector pDuraMCS with restriction enzymes BamHI and SalI, and using a Quick ligation Kit (NEW ENGLAND BioLabs). The obtained plasmid was designated as pDuraMCS-MaLRO1.
  • SC agar yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco) 0.5%, ammonium sulfate 0.17%, glucose 2%, adenine 0.002%, tyrosine 0.003%, methionine 0.0001%, arginine 0.0002%, histidine 0.0002%, lysine 0.0004%, tryptophan 0.0004%, threonine 0.0005%, isoleucine 0.0006%, leucine 0.0006%, phenylalanine 0.0006%, agar 2%).
  • LRO1-1 strain was inoculated into 4 ml of GY medium and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 days. The cells were collected by filtration, and RNA was extracted using RNeasy plant kit (QIAGEN). CDNA was synthesized by Superscript First Strand System for RT-PCR (Invitrogen).
  • RT-PCR was performed with the following primer combinations to confirm the expression of the MaLRO1 gene from the introduced construct.
  • Primer PD4P 5'-CGCATCCCGCAAACACACAC-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • Primer MaLRO1-5R 5'-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • PCR was performed with the following primers MaLRO1-1F and MaLRO1-3R, MaLRO1-2F and MaLRO1-4R in combination, and agarose The amplified DNA fragment was confirmed by gel electrophoresis.
  • MaLRO1-1F 5'-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • MaLRO1-3R 5'-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • MaLRO1-2F 5'-GGCGGACCCAACTGGGTGAACGAC-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • MaLRO1-4R 5'-TCACAAGTCGACCTTGGCAGAGTAC-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • the entire amount of the bacterial cells was collected by filtration and freeze-dried.
  • a portion of dried cells (about 10-20 mg) was collected, the fatty acid of the cells was derived into methyl ester by the hydrochloric acid methanol method, extracted with hexane, and hexane distilled off.
  • the ratio of arachidonic acid to the total fatty acid in the microbial cells (“ARA (%)” in Table 1) was analyzed by chromatography.
  • Lipid was detected by spraying the primulin solution and irradiating with ultraviolet rays.
  • Triglyceride (TG) fractions were scraped and collected in a test tube, fatty acids were derived into methyl esters by the hydrochloric acid methanol method, and fatty acid analysis was performed by gas chromatography.
  • triacylglycerol containing a high amount of DGLA and ARA can be efficiently produced.
  • the fatty acids produced in the host cells according to the present invention can be used for the production of foods, cosmetics, medicines, soaps and the like.
  • Sequence number 6 Synthetic DNA Sequence number 7: Synthetic DNA Sequence number 8: Synthetic DNA Sequence number 9: Synthetic DNA Sequence number 10: Synthetic DNA Sequence number 11: Synthetic DNA Sequence number 12: Synthetic DNA Sequence number 13: Synthetic DNA Sequence number 14: Synthetic DNA SEQ ID NO: 15: synthetic DNA Sequence number 16: Synthetic DNA Sequence number 17: Synthetic DNA Sequence number 18: Synthetic DNA Sequence number 19: Synthetic DNA Sequence number 20: Synthetic DNA SEQ ID NO: 21: synthetic DNA Sequence number 22: Synthetic DNA Sequence number 23: Synthetic DNA Sequence number 24: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 24: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 22: Synthetic DNA Sequence number 23: Synthetic DNA Sequence number 24: Synthetic DNA Sequence number 25: Synthetic DNA Sequence number 24:

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Abstract

　本発明は、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素、それをコードするポリヌクレオチド等に関する。本発明は、例えば、配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含有する発現ベクター及び形質転換体、該形質転換体を用いる脂質又は脂肪酸の製造方法、又はそのような製法によって製造された脂質又は脂肪酸を含有する食品等を提供する。

Description

ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子及びその用途
　本発明は、新規なジアシルグリセロールアシル基転移酵素をコードするポリヌクレオチド及びその利用方法に関する。
　貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、ジアシルグリセロールにアシル基が転移されることにより、生成される。ジアシルグリセロールにアシル基を転移する酵素は、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（diacylglycerol acyltransferase: DGAT）と呼ばれ、アシルCoAをアシル供与体(アシルドナー)とするタイプのアシルCoA：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase）（EC：2.3.1.20）と、リン脂質をアシル供与体とするタイプのリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（phospholipids:diacylglycerol acyltransferase：PDAT)（EC:2.3.1.158）が知られている。
　アシルCoAをアシル供与体とするDGATは、一次構造の違いから、DGAT1とDGAT2の2つのファミリーに分類される。(非特許文献1及び2)。また、PDAT遺伝子については、酵母及び植物等からクローン化されており（特許文献1、非特許文献3及び4）、このうち、シロイヌナズナ由来のPDATについては、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等の種々のリン脂質をアシルドナーとすること、また、C10-C22のアシル基を転移できることなどが知られている（非特許文献5）。
　菌類のなかで比較的研究が進んでいる酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、DGATをコードする遺伝子として、DGAT2ファミリーに属するDGA1（YOR245C）（非特許文献6）及びPDATであるLRO1（YNR008W）が知られている。これら2つの遺伝子にコードされる酵素によって、酵母のDGAT活性の大部分が占められるが、これらの遺伝子を同時に破壊してもDGAT活性は完全に喪失するわけではない。この残存DGAT活性については、アシルCoA:ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子であるARE1遺伝子とARE2遺伝子にコードされる酵素のDGAT活性によるものであることが知られている(非特許文献7）。
　脂質生産菌であるモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina: M. alpina）では、これまでに、アシルCoAをアシル供与体とする4種類のDGAT及びその遺伝子が報告されている（2種類のDGAT1ファミリー遺伝子と2種類のDGAT2ファミリー遺伝子）（特許文献2及び3、非特許文献8）
　しかしながら、M. alpinaでは、リン脂質をアシル供与体とするPDATのホモログは知られていない。Δ5脂肪酸不飽和化酵素は、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA）を酸化してアラキドン酸（ARA）の生成を触媒する酵素であるが、M. alpinaにおいては、主に、ホスファチジルコリンのアシル基として存在するDGLAに作用するため、アラキドン酸は、ホスファチジルコリンのアシル基として生成されることが知られている（非特許文献9）。したがって、M. alpinaにおいてアラキドン酸含有トリアシルグリセロールの生成を促進するためには、ホスファチジルコリンなどのリン脂質のアシル基として存在するアラキドン酸から、アラキドン酸含有トリアシルグリセロールを生成する酵素を必要とする。
特表2002-541783 米国特許出願公開第2006／0094086号明細書 米国特許出願公開第2006／0091087号明細書
Proc. Natul. Acad. Sci. USA, 95, 13018-13023, 1998 J.B.C., 276 (42), 38862-38869, 2001 J.B.C., 275 (21), 15609-15612, 2000 Proc. Natl. Acd. Sci. USA,　97（12）, 6487-6492 Plant Physiology, 135, 1324-1335 J. Bacteriol., 184, 519-524, 2002 J.B.C., 277(8), 6478-6482, 2002 2003年農芸化学会大会要旨集 J.B.C., 278(37), 35115-35126, 2003
上記のような状況下で、M. alpinaにアラキドン酸含有トリアシルグリセロールを生成させるために有用な新たな酵素が求められている。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、脂質生産菌であるM. alpinaのPDATのホモログ（MaLRO1）をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のポリヌクレオチド、タンパク質、発現ベクター、形質転換体、該形質転換体を用いる脂質又は脂肪酸組成物及び食品等の製造方法、並びにそのような製法によって製造された食品等を提供する。
　即ち、本発明は、以下のとおりである。
［1］　以下の（a）～（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1～100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［2］　以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の上記［1］に記載のポリヌクレオチド：
（f）配列番号2のアミノ酸配列において1～10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）配列番号2のアミノ酸配列に対して、75％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［3］　配列番号1又は4の塩基配列を含有する、上記［1］に記載のポリヌクレオチド。
［4］　配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、上記［1］に記載のポリヌクレオチド。
［5］　DNAである、上記［1］～［4］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［6］　上記［1］～［5］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
［7］　上記［1］～［5］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
［8］　上記［1］～［5］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
［9］　上記［7］に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
［10］　前記形質転換体が脂質生産菌である、上記［8］又は[9]に記載の形質転換体。
［11］　前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella　alpina）である、上記［10］に記載の形質転換体。
［12］　上記［8］～[11]のいずれかに記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
［13］　前記脂質が、トリアシルグリセロールである、上記［12］に記載の方法。
［14］　前記脂肪酸が、アラキドン酸又はジホモ-γ-リノレン酸である、上記［12］に記載の方法。
［15］　上記［12］に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。
　本発明のポリヌクレオチドは、脂質生産菌（例えば、M. alpina）、酵母、植物等の形質転換に利用することができる。即ち、本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内に導入して、形質転換体を作成し、当該形質転換体内で前記ポリヌクレオチドを発現させることにより、DGLAやARAを高含有するトリアシルグリセロールを効率よく生成することができる。そのようにして得られる形質転換体（形質転換脂質生産菌、形質転換酵母又は形質転換植物等）は脂肪酸組成物、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。
　より具体的には、本発明の形質転換体は、脂質及び脂肪酸の生産効率が極めて高い。したがって、本発明は、大量の脂質又は脂肪酸を必要とする医薬品あるいは健康食品の製造に有効に使用することができる。
MaLRO1のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。 図1Aに続くMaLRO1のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。 MaLRO1のCDS配列と推定アミノ酸配列を示す図である。 図2Aに続くMaLRO1のCDS配列と推定アミノ酸配列を示す図である。 各種菌類に由来するPDATホモログタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。PDAT活性に重要であるとされるアミノ酸残基（＊印）が、菌種を超えて保存されていた。 酵母菌体から抽出した脂質画分中の脂肪酸量を示す図である。 酵母菌体から抽出した脂質画分中の脂肪酸組成を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2009年12月21日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2009-289287号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、脂質生産菌であるM. alpina由来のPDATのホモログの遺伝子（MaLRO1）の全長cDNAのクローニングに初めて成功した。また、本発明者らは、M. alpina由来のMaLRO1のゲノムDNAの塩基配列、及び推定アミノ酸配列も同定した。MaLRO1のORF配列、MaLRO1の推定アミノ酸配列、MaLRO1のCDS配列、MaLRO1のcDNA配列及びMaLRO1のゲノム配列は、それぞれ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号5である。これらのポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
1．本発明のポリヌクレオチド
　まず、本発明は、以下の（a）～（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
（a）配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1～100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell，　Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5 x SSC、1％ SDS、50 mM Tris－HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃又は0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。あるいは、配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1又は4のDNA、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNAと50％以上、51％以上、52％以上、53％以上、54％以上、55％以上、56％以上、57％以上、58％以上、59％以上、60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、blastp、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、blastpを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。

2．本発明のタンパク質
　本発明は、次に示すタンパク質を提供する。
（i）上記（a）～（e）のいずれかのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（ii）配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（iii）配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
（iv）配列番号2のアミノ酸配列に対して60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
　上記（iii）又は（iv）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号2のタンパク質の変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc.  Acids.  Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　本明細書中、「配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、例えば、1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。　なお、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性は、Stahl et al., Plant Physiology, 135,1324-1335（2004）に記載の方法に従って測定することができる。
　また、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を確認する方法としては、トリアシルグリセロールの生成量が著しく低下した酵母のΔdga1、Δlro1株を用いた実験が挙げられる。当該酵素をコードするポリヌクレオチドをΔdga1、Δlro1株中で発現させた場合に、トリアシルグリセロール生成量が増加すれば、そのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質又はペプチドはジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するということができる。本発明者らは、実施例において、薄層クロマトグラフィーを用いて、脂質をトリアシルグリセロール（TG）画分とリン脂質（PL）画分に分画し、トリアシルグリセロールの生成量の増大を確認しているが、リン脂質の生成量には変化が認められなかった（図4）。
　本発明において、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性は、アシルCoA：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性又はリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性のいずれでもよいが、好ましくは、リン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性である。
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2－アミノブタン酸、メチオニン、o－メチルセリン、t－ブチルグリシン、t－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2－アミノアジピン酸、2－アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4－ジアミノブタン酸、2，3－ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3－ヒドロキシプロリン、4－ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
　また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
3．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換体
　本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
　本発明のベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、上記（a）～（g）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
　このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例としては、脂質生産菌、酵母等が挙げられる。
　脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265（1992）に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus　Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella　isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等を挙げることができる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
　また、酵母の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces　cerevisiae）NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が挙げられる。
　なお、酵母内に本発明のベクターを導入して、該ベクターがコードするタンパク質のジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を調べる場合、宿主細胞として用いる酵母のジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子（DGA1及びLRO1）が欠損していると、該タンパク質の酵素活性のみを評価することが可能になる。従って、本発明の一態様においては、宿主細胞としての酵母は、DGA1遺伝子及びLRO1遺伝子が欠損していることが好ましい。
　本発明のベクターで形質転換されたこれらの宿主細胞は、本発明のベクターで形質転換されていない宿主細胞に比べて、より多くの量の脂質、好ましくは、トリアシルグリセロール（「トリグリセリド」とも呼ばれる）、より好ましくは、アラキドン酸又はDGLAを含有するトリアシルグリセロール、最も好ましくは、アラキドン酸を含有するトリアシルグリセロールを生産する。
　脂質生産菌に導入する際に用いるベクターとしては、例えば、pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))が利用可能であるが、これに限定されない。
　酵母に導入する際に用いるベクターとしては、酵母細胞内でインサートを発現する活性を有するベクターであれば特に限定されないが、例としては、pYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）が挙げられる。モルティエレラ・アルピナに導入する際に用いるベクターとしては、モルティエレラ・アルピナ細胞内でインサートを発現する活性を有するベクターであれば特に限定されないが、例としては、M. alpina発現用ベクターpDuraMCSが挙げられる。
　宿主細胞中での遺伝子発現を調節するためのプロモーター/ターミネーターとしては、宿主細胞中で機能する限り、任意の組み合わせでよい。例えば、脂質生産菌で利用する場合はhiston H4.1遺伝子のプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等を利用可能である。
　形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD）、薬剤耐性マーカー（hygromycine、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992； Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）等が利用可能である。
　宿主細胞の形質転換方法としては、一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、脂質生産菌の場合、エレクトロポレーション法（Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000）やパーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）が利用できる。また、酵母の場合は、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929（1978））、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, 153, p163（1983））、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 （1978）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等に記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。
　その他、一般的なクローニング技術に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
4．本発明の脂質又は脂肪酸組成物の製造方法
　本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換脂質生産菌又は酵母を用いる脂質又は脂肪酸組成物の製造方法を提供する。
　本明細書中、「脂質」とは、脂肪酸とアルコールとがエステル結合した化合物（例えば、グリセリド）又はその類似体（例えば、コレステロールエステル）等を含む単純脂質、単純脂質の一部にさらにリン酸、アミノ酸、糖等が結合した複合脂質、及び脂質の加水分解物で水に溶けない誘導脂質をいうものとする。
　本明細書中、「油脂」とは、グリセロールと脂肪酸のエステル（グリセリド）のことをいう。
　本明細書中、「脂肪酸」とは、一般式RCOOH（Rはアルキル基）で表される脂肪族モノカルボン酸（カルボキシル基を一個有し、炭素原子が鎖状に連結したカルボン酸）のことをいう。脂肪酸には、炭化水素鎖中に二重結合を有さない飽和脂肪酸と、二重結合を含む不飽和脂肪酸とが含まれる。
　本発明の脂質又は脂肪酸組成物は、本発明に従って形質転換した細胞から以下のようにして抽出することができる。生物（例えば、脂質生産菌又は酵母）の形質転換株について、培養終了後、遠心分離法、ろ過等の常法に従って培養細胞を得る。細胞を十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥細胞を、必要に応じて、ダイノミルや超音波等により破砕した後、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又はメタノール及び石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム－メタノール－水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。抽出した脂肪酸は、塩酸メタノール法等によってメチルエステル化してもよい。
　さらに、上記脂肪酸を含有する脂質からの脂肪酸の分離は、混合脂肪酸又は混合脂肪酸エステルの状態で、常法（例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法等）により濃縮分離することにより行うことができる。
　本発明の方法により製造される脂質は、好ましくは、トリアシルグリセロール、より好ましくは、アラキドン酸又はジホモ-γ-リノレン酸を含有するトリアシルグリセロール、最も好ましくは、アラキドン酸を含有するトリアシルグリセロールである。
　また、本発明の方法により製造される脂肪酸は、好ましくは、アラキドン酸又はジホモ-γ-リノレン酸、最も好ましくは、アラキドン酸である。なお、本発明の方法により生成される脂質及び該脂質に含まれる脂肪酸の組成は、上記の脂質の抽出方法、脂肪酸の分離方法又はそれらの組合せによって確認することができる。
　本発明の製造方法によって得られた脂質又は脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
　本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換脂質生産菌又は形質転換酵母を用いる食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造方法を提供する。この方法は、本発明の形質転換脂質生産菌又は形質転換酵母を用いて脂質又は脂肪酸を生成する工程を包含する。生成された脂質又は脂肪酸を含有する食品、化粧料、医薬、石鹸等の調製は、常法による。このように、本発明の製造方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等は、本発明の形質転換脂質生産菌又は形質転換酵母を用いて生成された脂質又は脂肪酸を含有する。本発明はさらに、そのような方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等を提供する。
　本発明の化粧品（組成物）又は医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の化粧料組成物又は医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、香水、パウダー、オーデコロン、歯磨、石鹸、エアロゾル、クレンジングフォーム等の化粧料若しくは皮膚外用薬の他、皮膚老化防止改善剤、皮膚炎症防止改善剤、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤あるいは、外傷、あかぎれ、ひびわれ等による肌荒れの防止改善剤等に用いることができる。
　本発明の化粧料組成物は、必要に応じてさらに、その他の油脂、及び／又は色素、香料、防腐剤、界面活性剤、顔料、酸化防止剤等を適宜配合することができる。これらの配合比率は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る（例えば、油脂は、組成物中に、1～99.99重量％、好ましくは、5～99.99重量％、より好ましくは、10～99.95重量％含有され得る）。また、本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいても良い。例えば、化粧料あるいは皮膚外用薬におけるその他の常用成分としては、にきび用薬剤、ふけ・かゆみ防止剤、制汗防臭剤、熱傷用薬剤、抗ダニ・シラミ剤、角質軟化剤、乾皮症用薬剤、抗ウイルス剤、経皮吸収促進剤等が挙げられる。
　本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
　栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約1歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
　これらの食品の形態の例としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）、中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品、天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品、おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等を挙げることができる。しかしながら、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等であってもよい。
　本発明の食品はまた、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の油脂が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態であってもよい。
　以上に記載するように、本発明のジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子を宿主細胞内で発現させることにより、効率的に脂質、特に、トリアシルグリセロールを生成させることが可能である。
　さらに、当該遺伝子の発現量を指標にして、脂質、特に、トリアシルグリセロール生産を効率よく行うための培養条件の検討、培養管理、等にも利用できる。
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。
M. alpinaのゲノム解析
　M. alpina 1S-4株を100 mlのGY2：1培地（2％グルコース、1％酵母エキス　pH6.0）に植菌し、28℃で2日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy (QIAGEN)を用いてゲノムDNAを調製した。
　上記ゲノムDNAの塩基配列を、 Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を2ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を3ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、300個のSuper Contigが得られた。
S. cerevisiae　由来LRO1（ScLRO1）ホモログの探索
　S. cerevisiae由来のPDAT遺伝子（ScLRO1）がコードする推定アミノ酸配列（GenBank accession No. P40345）をクエリーとして、M. alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、tblastn検索を行った結果、配列番号5に示す配列を含むSuper contigがヒットした。配列番号5の塩基配列を有する遺伝子をMaLRO1とし、以下のようにしてcDNAをクローン化した。
cDNAライブラリーの作製
　M. alpina 1S-4株を100 mlの培地（1.8％グルコース、1％酵母エキス、pH6.0）に植菌し、3日間28℃で前培養した。10 L培養槽（Able Co.，東京）に5 Lの培地（1.8％グルコース、1％大豆粉、0.1％オリーブ油、0.01％アデカノール、0.3％KH2PO4、0.1％ Na2SO4、0.05％ CaCl2・2H2O、0.05％ MgCl2・6H2O、pH6.0）を入れ、前培養物を全量植菌し、300 rpm、1 vvm、26℃の条件で8日間通気攪拌培養した。培養1、2、及び3日目に各々2％、2％、及び1.5％相当のグルコースを添加した。培養1、2、3、6、及び8日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアニジン／CsCl法でtotal RNAを調製した。Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、total RNAからpoly（A）＋RNAの精製を行った。各ステージのcDNAライブラリーを、ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (STRATAGENE)を用いて作製した。
cDNAクローニング
　MaLRO1のcDNAをクローニングするために、配列番号5をもとに、以下のプライマーを作製した。
MaLRO1-1F: 5’-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3’（配列番号6）
MaLRO1-3R: 5’-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3’（配列番号7）
 
　上記で作製したcDNAライブラリーを鋳型として、プライマーMaLRO1-1FとプライマーMaLRO1-3R、ExTaq (タカラバイオ)を用いて、以下のサイクルでPCR増幅を行った。
［94℃　2分］x 1サイクル、
［94℃　1分、55℃　1分、72℃　1分］x 30サイクル
［72℃　10分］x 1サイクル
　増幅された約0.7 kbのDNA断片を精製し、TOPO-TAクローニングキット（インビトロジェン）により、クローン化した。
　インサートの塩基配列をDNAシーケンサーにより確認し、配列番号4の814-1485番目の塩基配列を持つプラスミドをpCR-MaLRO1-Pとした。次に、このプラスミドを鋳型として、上記プライマーを用いてPCRを行った。PCR反応には、ExTaq（タカラバイオ）を用いたが、添付のdNTPミックスの代わりにPCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いて、増幅されるDNAをジゴキシゲニン（DIG）ラベルしたプローブを作製した。
　上記プローブを用いて、cDNAライブラリーをスクリーニングした。
ハイブリダイゼーションの条件は、以下のとおりである。
バッファー：5 x SSC、1％ SDS、50 mM Tris-HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド；
温度：42℃（一晩）；
洗浄条件：0.2 x SSC、0.1％ SDS溶液中（65℃）で、20分間×3回；
　検出は、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンにより、プラスミドを切り出し、各プラスミドDNAを得た。スクリーニングして得られたプラスミドのうちインサート長の最も長いものをプラスミドpB-MaLRO1-P1とした。
　プラスミドpB-MaLRO1-P1のインサートの配列とゲノム配列を比較した。図1の上向き矢印で示したところがプラスミドpB-MaLRO1-P1のインサートの5´末端であった。ゲノム配列で上向き矢印の5´側の配列をMaLRO1-P1のインサートの配列からさかのぼって解析してみたところ、MaLRO1をコードすると推定されるフレームと同じフレーム上に最初に出現したストップコドンよりも3’側に開始コドンATGが2つ存在していた。そこで、5’側の開始コドンを含む5’プライマーMaLRO1-6Fを作製し、さらに、3’プライマーとしてMaLRO1-5Rも作製した。
MaLRO1-5R：5’-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3’（配列番号8）
MaLRO1-6F：5’-ATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3’（配列番号9）
　M. alpina　1S-4株から調製したcDNAを鋳型として、ExTaq(タカラバイオ)を用いてプライマーMaLRO1-6FとMaLRO1-5R によりPCRを行った。得られた約0.75 kbpのDNA断片をTOPO-TAクローニングキットを使ってクローン化し、インサートの塩基配列を決定した。インサートは配列番号4の1-762番目の塩基配列を含んでいた。すなわち、配列番号4の1番目の開始コドンATGは、転写されていることが示唆された。こうして得られた塩基配列とプラスミドpB-MaLRO1-P1のインサートの塩基配列を連結すると配列番号4の塩基配列となり、これがMaLRO1のcDNAの塩基配列であると考えられた。
配列解析
　配列番号4の配列は、1-2400番目の塩基配列のCDS（配列番号3）、1-2397番目の塩基配列のORF（配列番号1）を有していた。配列番号1から導かれるアミノ酸配列を図2および配列番号2に示した。MaLRO1のゲノム配列（配列番号5）とMaLRO1のcDNA配列（配列番号4）を比較した（図1）。その結果、MaLRO1遺伝子のゲノム配列は、5つのイントロンを含み、6つのエキソンから構成されることが明らかになった。
　配列番号2に示したMaLRO1のアミノ酸配列をGenBankに登録されているアミノ酸配列に対して、blastp検索した結果、菌類由来のLRO1ホモログと一定の相同性を示した。最も相同性が高かったのは、担子菌であるUstilago maydis由来の機能未知の推定タンパク質（EAK81307）であり、同一性は35.7％であった。また、MaLRO1は、Yarrowia lipolytica由来のLRO1 (XP_504038)と31.7％、S.cerevisiae由来のLRO1と28.9％の相同性を示した。配列番号2と上述の菌類由来のLRO1ホモログのアミノ酸配列を比較した（図3）。活性中心を構成すると考えられている3つのアミノ酸残基が、いずれのホモログにおいても保存されていた。
発現ベクターの構築
　M. alpina由来LRO1遺伝子を酵母S.cerevisiaeで高発現させるための構成を有する発現ベクターを構築した。
　最初に、プライマーBam-MaLRO1-Fを作製した。
Bam-MaLRO1-F:5’-GGATCCATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3’（配列番号10）
　M. alpina 1S-4株から調製したcDNAを鋳型として、KOD-plus(東洋紡)を用いてプライマーBam-MaLRO1-FとMaLRO1-5R によりPCRを行った。得られた約0.75kbpのDNA断片をゼロ　ブラントTOPO-クローニングキット（インビトロジェン）でクローン化し、塩基配列を確認した。MaLRO1のcDNA配列と比較して重複する塩基配列部分を有するプラスミドをpCR-MaLRO1-5’とした。このプラスミドpCR-MaLRO1-5’を制限酵素BamHIとPstIで消化して得られた約0.35 kbpのDNA断片と、プラスミドpB-MaLRO1-P1を制限酵素PstIとXhoIで消化して得られた約2.05 kbpのDNA断片と、酵母発現用ベクターpYE22mを制限酵素BamHIとSalIで消化して得られた約8.3 kbpのDNA断片とを、Quick ligation Kit (NEW ENGLAND BioLabs)を用いて連結させ、得られたプラスミドをpYEMaLRO1とした。
酵母S.cerevisiae Δdga1、Δlro1株での発現
（1）酵母S.cerevisiae Δdga1、Δlro1株の作製
（1-1）S.cerevisiae由来DGA1遺伝子とLRO1遺伝子のクローン化
　S.cerevisiae由来のDGA1遺伝子（YOR245C、以下、ScDGA1と記載する）とLRO1遺伝子（YNR008W、以下、ScLRO1と記載する）の全長をクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
ScDGA1-F1: 5’-GAATTCatgtcaggaacattcaatgatata-3’（配列番号11）
ScDGA1-R1: 5’-GTCGACTTACCCAACTATCTTCAATTCTGC-3’（配列番号12）
ScLRO1-F1: 5’-GAATTCatgggcacactgtttcgaagaaat-3’（配列番号13）
ScLRO1-R1: 5’-GTCGACTTACATTGGGAAGGGCATCTGAGA-3’（配列番号14）
 
　酵母S.cerevisiae S288C株を10 ml　YPD（DIFCO）液体培地に1白金耳植菌し、30℃で1日間振とう培養した。遠心分離により集菌し、Genとるくん‐酵母用（タカラバイオ）を用いてDNAを抽出した。
　このDNAを鋳型として、プライマーScDGA1-F1とプライマーScDGA1-R1の組み合わせ、あるいはプライマーScLRO1-F1とプライマーScLRO1-R1の組み合わせで、ExTaq（タカラバイオ）を用いてPCRを行った。それぞれの組み合わせで得られた約1.3 kbpのDNA断片と約2 kbpのDNA断片をTA-cloning Kit（インビトロジェン）を用いてクローン化し、塩基配列を確認した。正しい塩基配列を有するプラスミドをそれぞれプラスミドpCR-ScDGA1とプラスミドpCR-ScLRO1とした。
(1-2)プラスミドpCR-Δdga1:URA3-1の構築
　プラスミドpCR-ScDGA1を制限酵素HpaIとAatIで消化して得られた約4.5 kbpのDNA断片と、プラスミドpURA34 (特開2001-120276)を制限酵素HindIIIで消化したあと、DNA Blunting Kit(タカラバイオ)により末端を平滑化して得られた約1.2 kbpのDNA断片をLigation high(東洋紡)により連結し、URA3遺伝子がScDGA1遺伝子と同じ向きに挿入されたプラスミドをpCR-Δdga1:URA3-1とした。
（1-3）プラスミドpUC-Δlro1:LEU2-1の構築
　プラスミドpCR-ScLRO1を制限酵素EcoRIとSalIで消化して得られた約2 kbpのDNA断片と、pUC18を同じ制限酵素で消化したものとをLigation high (東洋紡)により連結し、プラスミドpUC-ScLRO1を得た。このプラスミドを制限酵素XbaIとApaIで消化したあと、DNA Blunting Kit (タカラバイオ)により末端を平滑化して得られた約3.8 kbpのDNA断片と、プラスミドYEp13 （GenBank accession No.U03498）を制限酵素SalIとXhoIで消化したあとDNA Blunting Kit(タカラバイオ)により末端を平滑化して得られた約2.2 kbpのDNA断片とをLigation high(東洋紡)により連結し、LEU2遺伝子がScLRO1遺伝子と同じ向きに挿入されたプラスミドをpUC-Δlro1:LEU2-1とした。
（1-4）形質転換株の取得
　S.cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63　his3-Δ200 leu2-Δ1 a）（STARATAGENE）をホストとして以下のように形質転換株を作製した。すなわち、プラスミドpCR-Δdga1:URA3-1を鋳型としてプライマーScDGA1-F1とプライマーScDGA1-R1の組み合わせでPCRにより増幅したDNA断片と、プラスミドpUC-Δlro1:LEU2-1を鋳型として、プライマーScLRO1-F1とプライマーScLRO1-R1の組み合わせでPCRにより増幅したDNA断片を用いて、酢酸リチウム法によりco-transformationした。形質転換株は、SC-Leu,Ura（1 Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7 g、グルコース20 g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25 g、アルギニン0.6 g、アスパラギン酸3 g、グルタミン酸3 g、ヒスチジン0.6 g、リジン0.9 g、メチオニン0.6 g、フェニルアラニン1.5 g、セリン11.25 g、チロシン0.9 g、バリン4.5 g、スレオニン6 g、トリプトファン1.2 gを混合したもの）1.3 g）寒天培地（2％アガー）上で生育することを基準に選抜した。得られた形質転換株のうち、任意の2株の菌体より、Genとるくん‐酵母用（タカラバイオ）を用いてDNAを抽出した。これらのDNAを鋳型として、以下の(1)～(4)プライマーの組み合わせでPCRを行った。
(1) ScDGA1-F1とScDGA1-R1
(2) ScDGA1-F1とScDGA1-R2
(3) ScLRO1-F1とScLRO1-R1
(4) ScLRO1-F1とScLRO1-R2
ScDGA1-R2：5’-GACCAGTGTCATCAGAGAAATAGG-3’ （配列番号15）
ScLRO1-R2：5’-GAGCTGGAACTGCCTTTGGAGC-3’ （配列番号16）
　その結果、いずれの株においても、(1)の組み合わせで1.8 kbp、(3)の組み合わせで3.3kbpのDNA断片が増幅されたが、(2)や(4)の組み合わせではDNA断片が増幅されなかった。このことから、これらの株はΔdga1、Δlro1株であることが確認できた。このうち任意の1株を以下の形質転換のホストとして用いた。
（2）酵母S.cerevisiae Δdga1、Δlro1株への遺伝子導入と解析
（2-1）形質転換株の取得
　Δdga1、Δlro1株をホストとして、プラスミドpYE22m、pYE-MaLRO1でそれぞれ酢酸リチウム法により形質転換した。形質転換株は、SC-Trp,Leu,Ura（1 Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7 g、グルコース20 g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25 g、アルギニン0.6 g、アスパラギン酸3 g、グルタミン酸3 g、ヒスチジン0.6 g、リジン0.9 g、メチオニン0.6 g、フェニルアラニン1.5 g、セリン11.25 g、チロシン0.9 g、バリン4.5 g、スレオニン6 gを混合したもの）1.3 g）寒天培地（2％アガー）上で生育することを基準に選抜した。それぞれのプラスミド導入株の中から、任意の2株を以下の培養実験に使用した。すなわち、pYE22mで形質転換した株はC/ΔDG＃1、2とし、pYE-MaLRO1で形質転換した株はMaLRO1/ΔDG＃1、2とした。
（2-2）形質転換株の培養
　C/ΔDG＃1、2 、MaLRO1/ΔDG＃1、2の4株をそれぞれ、SC-Trp,Leu,Ura液体培地10 mlに1白金耳植菌し、30℃で終夜振とう培養した。得られた培養液1 mlを、YPDA（酵母エキス1％、ペプトン2％、グルコース2％、1-adenine hemisulfate salt 0.0075%）液体培地10 mlに植菌し、30℃で24時間振とう培養した。遠心分離により菌体を集菌し、水洗後、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体をガラスビーズで破砕し、8 mlのクロロホルム：メタノール2：1で、脂質を抽出した。シリカゲル60　プレート（メルク）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸70：30：1の条件で薄層クロマトグラフィー(TLC)を行い、脂質を分画した。0.015％プリムリン、80％アセトン水溶液（プリムリン溶液）を噴霧し、UV照射により脂質を可視化して、トリアシルグリセロール（TG）画分およびリン脂質（PL）画分に鉛筆でしるしをつけ、シリカゲルをそれぞれかきとって試験管に集めた。塩酸メタノール法により、脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸分析した。すなわち、ジクロロメタン　1 ml、10％塩酸メタノール　2 mlを加え、50℃で3時間反応させ、脂肪酸をメチルエステルに誘導した。つづいて、ヘキサン4 ml、水1 mlを添加し、激しく撹拌した後、遠心分離し、上層を分取した。スピードバックで溶媒を留去し、アセトニトリルに溶解してガスクロマトグラフィーに供し、脂肪酸分析を行った。なお、上記メチル化反応の際、トリコサン酸を内部標準として加え、脂肪酸量を定量した。結果を図4に示す。
　M. alpina由来のPDATホモログであるMaLRO1を発現させたMaLRO1/ΔDG＃1、2株では、コントロールであるC/ΔDG＃1、2株に比べて、TG量が、約10倍になっており、MaLRO1はTG合成活性を有することが示唆された。
アラキドン酸生産酵母での発現
（1）アラキドン酸酵母の育種
　アラキドン酸生産酵母（S. cerevisiae）を育種するために、以下のプラスミドを構築した。
　まず、M. alpina 1S-4株から調製したcDNAを鋳型として、Δ12-fとΔ12-r、Δ6-fとΔ6-r、GLELO-fとGLELO-r又はΔ5-fとΔ5-rといった、プライマーの組み合わせでExTaqを用いてPCRを行い、M. alpina 1S-4株のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(GenBank accession No.AB020033)、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(GenBank accession No.AB020032)、GLELO脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子(GenBank accession No.AB193123)及びΔ5脂肪酸不飽和化遺伝子(GenBank accession No.AB188307)を増幅した。
Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg（配列番号17）
Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC（配列番号18）
Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag（配列番号19）
Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG（配列番号20）
GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc（配列番号21）
GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC（配列番号22）
Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc（配列番号23）
Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC（配列番号24）
　これらをTOPO-TA-cloning Kitによりクローン化した。塩基配列を確認し、Δ12遺伝子、Δ6遺伝子、GLELO遺伝子及びΔ5遺伝子の塩基配列を含むクローンをそれぞれプラスミドpCR-MAΔ12DS（Δ12遺伝子の塩基配列を含む）、pCR-MAΔ6DS（Δ6遺伝子の塩基配列を含む）、pCR-MAGLELO（GLELO遺伝子の塩基配列を含む）、pCR-MAΔ5DS（Δ5遺伝子の塩基配列を含む）とした。
　一方、プラスミドpURA34（特開2001-120276）を制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.2 kbのDNA断片を、ベクターpUC18を制限酵素EcoRIとSphIで消化したあと末端を平滑化し、セルフライゲーションして得られたベクターのHindIIIサイトに挿入し、ベクターのEcoRIサイト側がURA3の5’側であるクローンをpUC-URA3とした。また、YEp13を制限酵素SalIとXhoIで消化して得られた約2.2kbのDNA断片をベクターpUC18のSalIサイトに挿入し、ベクターのEcoRI側がLUE2の5’側であるクローンをpUC-LEU2とした。
　次に、プラスミドpCR-MAΔ12DSを制限酵素HindIIIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素XbaIで消化して得られた約1.2 kbpのDNA断片と、ベクターpESC-URA（STRATAGENE）を制限酵素SacIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素SpeIで消化した約6.6 kbpのDNA断片を連結し、プラスミドpESC-U-Δ12を得た。プラスミドpCR-MAΔ6DSを制限酵素XbaIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.6 kbpのDNA断片と、プラスミドpESC-U-Δ12を制限酵素SalIで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化した約8 kbpのDNA断片と連結し、プラスミドpESC-U-Δ12:Δ6を得た。これを制限酵素PvuIIで部分消化して得られた約4.2kbの断片をpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、プラスミドpUC-URA-Δ12:Δ6を得た。
　また、プラスミドpCR-MAGLELOを制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約0.95 kbpのDNA断片と、ベクターpESC-LEU（STRATAGENE）を制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約7.7 kbpのDNA断片と連結し、プラスミドpESC-L-GLELOを得た。プラスミドpCR-MAΔ5DSを制限酵素XbaIで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.3 kbpのDNA断片とプラスミドpESC-L-GLELOを制限酵素ApaIで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約8.7 kbpのDNA断片を連結して、プラスミドpESC-L-GLELO:Δ5を得た。これを制限酵素PvuIIで消化して得られた約3.2 kbp断片をpUC-LEU2のSmaIサイトに挿入し、プラスミドpUC-LEU-GLELO:Δ5を得た。Saccharomyces cerevisiae YPH499株（STRATAGENE）をプラスミドpUC-URA-Δ12:Δ6とプラスミドpUC-LEU-GLELO:Δ5でco-transformationした。形質転換株は、SC-Leu,Ura寒天培地上で生育することを基準に選抜した。こうして得られた株のうち、任意の一株をARA3-1株とした。この株は、ガラクトースを含む培地で培養することにより、GAL1/10プロモーターからΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、GLELO遺伝子、Δ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させることができる。
（2）アラキドン酸生産酵母への形質転換と解析
　ARA3-1株をプラスミドpYE22m、pYE-MaLRO1でそれぞれ形質転換した。形質転換株は、SC-Trp,Leu,Ura（1 Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7 g、グルコース20 g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25 g、アルギニン0.6 g、アスパラギン酸3 g、グルタミン酸3 g、ヒスチジン0.6 g、リジン0.9 g、メチオニン0.6 g、フェニルアラニン1.5 g、セリン11.25 g、チロシン0.9 g、バリン4.5 g、スレオニン6 gを混合したもの）1.3 g）寒天培地（2％アガー）上で生育することを基準に選抜した。それぞれのプラスミド導入株の中から、任意の4株を以下の培養実験に使用した。
　これらの株を上記SC-Trp,Leu,Ura液体培地10 mlで30℃、1日間培養し、そのうち1 mlを、50μg/mlになるようγリノレン酸を添加したSG-Trp,Leu,Ura（1 Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7 g、ガラクトース20 g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25 g、アルギニン0.6 g、アスパラギン酸3 g、グルタミン酸3 g、ヒスチジン0.6 g、リジン0.9 g、メチオニン0.6 g、フェニルアラニン1.5 g、セリン11.25 g、チロシン0.9 g、バリン4.5 g、スレオニン6 gを混合したもの）1.3 g）液体培地10 mlに、2本で15℃、6日間培養した。集菌し、水洗した後、凍結乾燥した。乾燥菌体にクロロホルム：メタノール　2：1を4 ml添加し、70℃で1時間保持したあと、遠心分離して上清を回収した。さらに、残った菌体にクロロホルム：メタノール　2：1を4　ml添加し、遠心分離した上清を先に回収した上清と合わせて回収した。スピードバックを使って、溶媒を留去し、残渣を少量のクロロホルムに溶かした。シリカゲル60　プレート（メルク）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸70：30：1の条件でTLCを行い、脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧し、紫外線を照射することにより脂質を検出した。TG画分とPL画分をそれぞれかきとって試験管に集め、塩酸メタノール法により脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。
　TG画分とPL画分の多価不飽和脂肪酸（PUFA）の組成比をそれぞれ図5に示した。MaLRO1発現株では、TGのDGLAやアラキドン酸（ARA）の組成比がコントロールに比べて上昇していた（図5A）。上記実施例で用いた酵母は、M. alpina由来のΔ12脂肪酸不飽和化酵素、Δ6脂肪酸不飽和化酵素、GLELO及びΔ5脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子を導入することによってアラキドン酸生産能を付与したものであり、M. alpinaと同様のアラキドン酸生成系を有するといえる。M. alpinaにおいては、GLELOが、CoAに結合したγリノレン酸（GLA)からDGLAを生成し、その後、DGLAは脂質に取り込まれ、続いてΔ5脂肪酸不飽和化酵素が、主にホスファチジルコリンのアシル基として存在するDGLAに作用し、ARAを生成する。よって、上記実施例で用いた酵母の細胞内においても、M. alpinaと同様に、DGLAはCoAに結合した状態や他の脂質中に存在するほか、ホスファチジルコリンのアシル基としても存在すると考えられる。また、ARAは主にホスファチジルコリンのアシル基として生成すると考えられる。従って、MaLRO1遺伝子は、リン脂質を基質とする、「リン脂質：ジアシルグリセロール基転移酵素」をコードしているものと考えられる。
　一方、リン脂質の脂肪酸組成比を見ると、DGLAやARAの比率はコントロールとMaLRO1発現株とで変わらなかった（図5B）。
 これらのことから、MaLRO1は、DGLAやARAに対する特異性が高く、MaLRO1を用いることで、DGLAやARAを高含有するTGを効率よく生成することができる可能性が示唆された。
M.alpina発現用ベクターの構築
　M. alpina発現用ベクターとして、ヒストンプロモーターから目的遺伝子を発現させるpDuraMCSを用いた。
　MaLRO1遺伝子をM. alpinaで発現させるために、以下のようにベクターを構築した。プラスミドpCR-MaLRO1-5’を制限酵素BamHIとPstIで消化して得られた約0.35 kbpのDNA断片と、プラスミドpB-MaLRO1-P1を制限酵素PstIとXhoIで消化して得られた約2.05 kbpのDNA断片と、M. alpina発現用ベクターpDuraMCSを制限酵素BamHIとSalIで消化して得られた約8.3 kbpのDNA断片とを、Quick ligation Kit (NEW ENGLAND BioLabs)を用いて連結させ、得られたプラスミドをpDuraMCS-MaLRO1とした。
M. alpina形質転換株の取得
　このプラスミドを用いて、M. alpina 1S-4株より国際公開公報WO 2005019437に記載の「脂質生産菌の育種方法」にしたがって誘導したウラシル要求性株Δura－3を宿主としてパーティクルデリバリー法で形質転換を行った。形質転換株の選択には、SC寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）0.5％、硫酸アンモニウム0.17％、グルコース2％、アデニン0.002％、チロシン0.003％、メチオニン0.0001％、アルギニン0.0002％、ヒスチジン0.0002％、リジン0.0004％、トリプトファン0.0004％、スレオニン0.0005％、イソロイシン0.0006％、ロイシン0.0006％、フェニルアラニン0.0006％、寒天2％）を用いた。
形質転換M. alpinaの評価
　得られた形質転換13株を、GY培地（グルコース2％、酵母エキス1％）10 mlに植菌し、28℃、300 rpmで10日間培養し、アラキドン酸の生産性の高い株を選抜し、LRO1-1株とした。
　LRO1-1株を、GY培地4 mlに植菌し、28℃で2日間振とう培養を行った。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてRNAを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステム for RT-PCR（インビトロジェン）によりcDNAを合成した。導入したコンストラクトからのMaLRO1遺伝子の発現を確認するため、以下のプライマーの組み合わせでRT-PCRを行い、導入したコンストラクトからのMaLRO1遺伝子の発現を確認した。
 
プライマーPD4P: 5’-CGCATCCCGCAAACACACAC-3’　　（配列番号25）
プライマーMaLRO1-5R：5’-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3’　（配列番号8）
 
　内在性のMaLRO1遺伝子と導入コンストラクトのMaLRO1遺伝子をあわせたMaLRO1遺伝子の発現を確認するため、以下のプライマーMaLRO1-1FとMaLRO1-3R、MaLRO1-2FとMaLRO1-4Rの組み合わせで、PCRを行い、アガロースゲル電気泳動により増幅されたDNA断片を確認した。PCRのサイクルを20サイクルにしたところ、LRO1-1株で増幅されたDNA断片のバンドの濃さが明らかにコントロール株のものより濃かった。このことより、LRO1-1株ではコントロール株と比べてMaLRO1遺伝子の発現量が増加していることが確認された。
 
MaLRO1-1F：　5’-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3’　（配列番号6）
MaLRO1-3R：　5’-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3’　（配列番号7）
 
MaLRO1-2F：　5’-GGCGGACCCAACTGGGTGAACGAC-3’　　（配列番号26）
MaLRO1-4R：　5’-TCACAAGTCGACCTTGGCAGAGTAC-3’ 　　（配列番号27）
 
脂肪酸分析
　形質転換株であるLRO1-1株と、M. alpina　1S-4株（コントロール）をGY培地4 mlに植菌し（n=3）、28℃、125 rpmで振とう培養した。培養9日目に菌体の全量を濾過により回収し、凍結乾燥した。乾燥菌体の一部（約10-20 mg程度）を分取し、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去したものを、ガスクロマトグラフィーにより菌体内総脂肪酸に占めるアラキドン酸の比率（表1中の「ARA(%)」）について分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　表1に示したとおり、MaLRO1遺伝子を高発現させたM. alpinaでは、総脂肪酸中のアラキドン酸比率が増加していた。
　また、乾燥菌体の一部（約10-20 mg程度）に、クロロホルム：メタノール　2：1を4 ml添加し、70℃で1時間保持したあと、遠心分離して上清を回収した。さらに、残った菌体にクロロホルム：メタノール2：1を4 ml添加し、遠心分離した上清を先に回収した上清と合わせて回収した。スピードバックを使って、溶媒を留去し、残渣を少量のクロロホルムに溶かした。シリカゲル60　プレート（メルク）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸70：30：1の条件でTLCを行い、脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧し、紫外線を照射することにより脂質を検出した。
　トリグリセリド（TG）画分をかきとって試験管に集め、塩酸メタノール法により脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表2に示したとおり、MaLRO1遺伝子を高発現させたM. alpinaでは、トリグリセリド中のアラキドン酸比率が増加していた。
　本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、DGLAやARAを高含有するトリアシルグリセロールを効率よく生成させることができる。本発明によって宿主細胞内で生成される脂肪酸は、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。
　配列番号6：合成DNA
　配列番号7：合成DNA
　配列番号8：合成DNA
　配列番号9：合成DNA
　配列番号10：合成DNA
　配列番号11：合成DNA
　配列番号12：合成DNA
　配列番号13：合成DNA
　配列番号14：合成DNA
　配列番号15：合成DNA
　配列番号16：合成DNA
　配列番号17：合成DNA
　配列番号18：合成DNA
　配列番号19：合成DNA
　配列番号20：合成DNA
　配列番号21：合成DNA
　配列番号22：合成DNA
　配列番号23：合成DNA
　配列番号24：合成DNA
　配列番号25：合成DNA
　配列番号24：合成DNA
　配列番号25：合成DNA

Claims (15)

  1. 以下の（a）～（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
    （a）配列番号1又は4の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
    （b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （c）配列番号2のアミノ酸配列において、1～100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    （e）配列番号1又は4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の請求項1に記載のポリヌクレオチド：
    （f）配列番号2のアミノ酸配列において1～10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    （g）配列番号2のアミノ酸配列に対して、75％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつジアシルグリセロールアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  3. 　配列番号1又は4の塩基配列を含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　DNAである、請求項1～4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. 　請求項1～5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
  7. 　請求項1～5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  8. 　請求項1～5のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
  9. 　請求項7に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
  10. 　前記形質転換体が脂質生産菌である、請求項8又は9に記載の形質転換体。
  11. 　前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella　alpina）である、請求項10に記載の形質転換体。
  12. 　請求項8～11のいずれかに記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
  13. 　前記脂質が、トリアシルグリセロールである、請求項12に記載の方法。
  14. 　前記脂肪酸が、アラキドン酸又はジホモ-γ-リノレン酸である、請求項12に記載の方法。
  15. 　請求項12に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。 
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KR1020127012909A KR101438981B1 (ko) 2009-12-21 2010-12-20 디아실글리세롤아실기 전이 효소 유전자 및 그 용도
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CA2783543A CA2783543C (en) 2009-12-21 2010-12-20 Diacylglycerol acyltransferase genes and use thereof
EP10839364.6A EP2518147B1 (en) 2009-12-21 2010-12-20 Diacylglycerole acyltransferase gene, and use thereof
CN201080057882.5A CN102844431B (zh) 2009-12-21 2010-12-20 二酰甘油酰基转移酶基因及其用途
BR112012015410A BR112012015410A2 (pt) 2009-12-21 2010-12-20 genes diacilglicerol aciltransferase e uso dos mesmos.

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103717736A (zh) * 2011-08-04 2014-04-09 三得利控股株式会社 具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2787603C (en) 2010-02-03 2017-05-30 Suntory Holdings Limited Glycerol-3-phosphate acyltransferase homologue and use thereof
US10307167B2 (en) 2012-12-14 2019-06-04 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10314594B2 (en) 2012-12-14 2019-06-11 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10813630B2 (en) 2011-08-09 2020-10-27 Corquest Medical, Inc. Closure system for atrial wall
US20140142689A1 (en) 2012-11-21 2014-05-22 Didier De Canniere Device and method of treating heart valve malfunction
US9566443B2 (en) 2013-11-26 2017-02-14 Corquest Medical, Inc. System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation
KR101582294B1 (ko) 2014-02-28 2016-01-06 엠플레어 주식회사 사용자 나레이션 기반의 e-book 대여 서비스 시스템
US10842626B2 (en) 2014-12-09 2020-11-24 Didier De Canniere Intracardiac device to correct mitral regurgitation
RU2662972C1 (ru) * 2018-04-26 2018-07-31 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1
KR20200015261A (ko) 2018-08-03 2020-02-12 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 스트리밍 서비스 시스템
KR20200015255A (ko) 2018-08-03 2020-02-12 엠플레어 주식회사 스트리밍 북 플레이어
KR20200109884A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스 시스템의 콘텐츠 카드 등록방법
KR20200109892A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스를 위한 컴퓨터 프로그램이 기록된 기록매체
KR20200109889A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스를 위한 컴퓨터 프로그램
KR20200109902A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 콘텐츠 카드 등록 프로그램이 기록된 기록매체
KR20200109881A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스 방법
KR20200109876A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스 시스템 및 콘텐츠 카드 등록방법
KR20200109896A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 기록매체
KR20200109878A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스 시스템
KR20200109882A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스 시스템의 콘텐츠 카드 등록방법
KR20200109880A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 온라인 콘텐츠 서비스 시스템
KR20200109893A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 컴퓨터 프로그램
KR20200109901A (ko) 2019-03-15 2020-09-23 엠플레어 주식회사 콘텐츠 카드 등록 방법을 실행시키기 위한 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램
CN109837256B (zh) * 2019-03-21 2020-12-01 江南大学 一种二酰甘油酰基转移酶1及其在生产甘油三酯中的应用
CA3210860A1 (en) * 2021-03-03 2022-09-09 Anna EL TAHCHY Production of phospholipids in microbes and uses thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001120276A (ja) 1999-10-26 2001-05-08 Suntory Ltd 酵母の育種方法
JP2002541783A (ja) 1999-04-01 2002-12-10 ビーエーエスエフ プランド サイエンス ゲーエムベーハー トリアシルグリセロール生成の生合成経路における新規クラスの酵素および該酵素をコードする組換えｄｎａ分子
WO2005019437A1 (ja) 2003-08-22 2005-03-03 Suntory Limited 脂質生産菌の育種方法
JP2005287403A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Suntory Ltd 脂質生産菌の育種方法およびその利用
US20060094086A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Yadav Narendra S Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US20060091087A1 (en) 2004-10-15 2006-05-04 Patrick Belanger Footwear rack
JP2009289287A (ja) 2009-09-09 2009-12-10 Hitachi Ltd 指認証装置

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69941390D1 (de) 1998-07-02 2009-10-22 Calgene Llc Diacylglyzerin-acyltransferase proteine
IL147942A0 (en) * 2002-01-31 2002-08-14 Enzymotec Ltd Method of fractionation of phytosterol esters in oil and products obtained thereby
US7198937B2 (en) * 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
EP3581178B1 (en) * 2005-02-14 2023-08-30 Suntory Holdings Limited Composition containing dihomo-(gamma)-linolenic acid (dgla) as active ingredient
CA2688293A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Childrens's Medical Center Corporation Dietary formulations and methods for treatment of inflammation and other disorders
AU2008255877B2 (en) 2007-05-25 2013-10-31 Suntory Holdings Limited Novel lysophosphatidic acid acyltransferase genes
JP5451387B2 (ja) * 2007-06-18 2014-03-26 サントリーホールディングス株式会社 グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ｇｐａｔ）ホモログとその利用
BRPI0813547A2 (pt) 2007-07-23 2014-12-30 Suntory Holdings Ltd Composições de ácido graxo tendo uma nova taxa de ácido graxo
UA108834C2 (ru) * 2008-05-23 2015-06-25 Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані трансгенные семена сои, имеющие повышенное общее содержание жирных кислот
CN102388137B (zh) 2009-03-26 2014-04-09 三得利控股株式会社 新型溶血磷脂酰基转移酶

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002541783A (ja) 1999-04-01 2002-12-10 ビーエーエスエフ プランド サイエンス ゲーエムベーハー トリアシルグリセロール生成の生合成経路における新規クラスの酵素および該酵素をコードする組換えｄｎａ分子
JP2001120276A (ja) 1999-10-26 2001-05-08 Suntory Ltd 酵母の育種方法
WO2005019437A1 (ja) 2003-08-22 2005-03-03 Suntory Limited 脂質生産菌の育種方法
JP2005287403A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Suntory Ltd 脂質生産菌の育種方法およびその利用
US20060091087A1 (en) 2004-10-15 2006-05-04 Patrick Belanger Footwear rack
US20060094086A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Yadav Narendra S Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
JP2009289287A (ja) 2009-09-09 2009-12-10 Hitachi Ltd 指認証装置

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Course Manual", 2000, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, article "Methods in yeast genetics"
"Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual", COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ALTSCHUL S. F. ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403
APPL. MICROBIOL. BIOTECLMOL., vol. 65, 2004, pages 419 - 425
AUSUBEL: "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. 59, 1995, pages 1221 - 1228
GENE, vol. 34, 1985, pages 315
HUSSAIN ET AL., GENE, vol. 101, 1991, pages 149
J. BACTERIOL., vol. 184, 2002, pages 519 - 524
J. BACTERIOLOGY, vol. 153, 1983, pages L63
J.B.C., vol. 275, no. 21, 2000, pages 15609 - 15612
J.B.C., vol. 276, no. 42, 2001, pages 38862 - 38869
J.B.C., vol. 277, no. 8, 2002, pages 6478 - 6482
J.B.C., vol. 278, no. 37, 2003, pages 35115 - 35126
JUNJI INOKOSHI ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 64, 1992, pages 660
KARLIN; ALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
MACKENZIE D. A. ET AL., APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 66, 2000, pages 4655 - 4661
MARIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 337
MISA OCHIAI ET AL.: "Mortierella alpina Yurai Diacylglycerol Acyl-ki Ten'i Koso Idenshi no Cloning to Shokubutsu deno Hatsugen", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY 2003 NENDO (HEISEI 15 NEND) TAIKAI KOEN YOSHISHU, vol. 24, no. 2A07, 5 March 2003 (2003-03-05), pages 19, XP008158090 *
MYCOTAXON, vol. XLIV, no. 2, 1992, pages 257 - 265
NUC. ACIDS. RES., vol. 10, 1982, pages 6487
NUC. ACIDS. RES., vol. 13, 1985, pages 4431
PLANT PHYSIOLOGY, vol. 135, pages 1324 - 1335
PROC. NAIL ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 1929
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages L929
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 79, 1982, pages 6409
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 488
PROC. NATL. ACD. SCI. USA, vol. 97, no. 12, pages 6487 - 6492
PROC. NATUL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, 1998, pages 13018 - 13023
SAMBROOK; RUSSEL: "Molecular Cloning; A Laboratory Manual", vol. 3, 2001, COLD SPRING HARBOR, LABORATORY PRESS
SAMBROOK; RUSSELL: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", vol. 3, 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2518147A4
SORGER, D. ET AL.: "Triacylglycerol biosynthesis in yeast.", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 61, no. 4, 2003, pages 289 - 99, XP008158508 *
STAHL ET AL., PLANT PHYSIOLOGY, vol. 135, 2004, pages 1324 - 1335
STAHL, U. ET AL.: "Cloning and Functional Characterization of a Phospholipid: Diacylglycerol Acyltransferase from Arabidopsis", PLANT PHYSIOL., vol. 135, no. 3, 2004, pages 1324 - 1335, XP008158148 *
YASUSHI KAMISAKA: "Cell Biological Studies on Intracellular Trafficking of Lipids. Biosynthesis of Triacylglycerol and Related Intracellular Lipid Transport in Fungi and Yeasts", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 44, no. 8, 1999, pages 1207 - 1212, XP008158536 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103717736A (zh) * 2011-08-04 2014-04-09 三得利控股株式会社 具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途
US8980591B2 (en) 2011-08-04 2015-03-17 Suntory Holdings Limited Protein having activity to promote fatty acid chain elongation, gene encoding same and use thereof
CN103717736B (zh) * 2011-08-04 2015-11-25 三得利控股株式会社 具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途

Also Published As

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CN102844431B (zh) 2014-10-08

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