WO2011067373A1

WO2011067373A1 - Methode de detection d'une polyglobulie chez un chien

Info

Publication number: WO2011067373A1
Application number: PCT/EP2010/068820
Authority: WO
Inventors: Bruno Cassinat; Stéphanie BEURLET; Christine Chomienne
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2011-06-09
Anticipated expiration: 2012-06-04

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de diagnostic de polyglobulie primaire chez le chien par détection de mutations dans le gène JAK2.

Description

METHODE DE DETECTION D'UNE POLYGLOBULIE CHEZ UN CHIEN

L'invention se rapporte à une méthode de détection d'une polyglobulie primitive chez un mammifère canin.

Les polyglobulies sont des pathologies caractérisées par une augmentation de la masse des globules rouges, menant à une hausse des paramètres de la lignée rouge dans le sang circulant : hématocrite, taux d'hémoglobine et concentration en globules rouges. Ceci peut mener à des problèmes cardio- vasculaires, ainsi qu'à des thromboses.

Face à un sujet présentant une augmentation de ces paramètres sanguins, il convient de poser le diagnostic le plus précis possible, afin d'adapter la prise en charge et de diminuer le risque de complications.

La polyglobulie primitive (aussi appelée polyglobulie vraie, polyglobulie de Vaquez (PV) chez l'homme, ou polycythemia vera) est due à une prolifération des cellules précurseurs de la lignée hématopoïétique. Il s'agit donc d'un syndrome myéloprolifératif, qui peut être traité par une chimiothérapie de fond avec un antimétabolite myélotoxique qui diminue notamment la synthèse des globules rouges (en particulier l'hydroxyurée).

Récemment, la présence d'une mutation acquise récurrente dans le gène

JAK2 a été trouvée dans 90% des patients atteints de PV (la moitié des autres cas avérés de PV chez l'homme présentent une autre mutation dans le même gène JAK2).

Cette mutation (V617F) modifie le nucléotide 617, localisé dans le domaine pseudokinase de JAK2, menant à la substitution d'une valine par une phénylalanine, ce qui déclenche l'activation constitutive de la kinase responsable de la polyglobulie. La détection de la mutation est devenue un outil majeur de diagnostic chez l'homme.

La polyglobulie primitive (PP) est une maladie rare chez les chiens, et probablement sous-estimée, les symptômes étant non spécifiques et pouvant être attribués à d'autres maladies (tels que la faiblesse, polyuro-polydipsie, des signes neurologiques liés à l'hypoglycémie ou d'hyperviscosité), et de la non-existence à ce jour, d'un test de diagnostic. Le diagnostic chez le chien est effectué par élimination (d'autres causes de l'augmentation de la lignée érythrocytaire peuvent être éliminées), en utilisant également ponction ou biopsie de moelle osseuse (ces deux méthodes étant toutefois particulièrement invasives, coûteuses et complexes à mettre en œuvre).

Il existe donc un besoin de définir un nouveau test de diagnostic de la polyglobulie primitive chez le chien (et, d'une façon générale, chez le mammifère canin), qui soit plus simple, plus rapide et plus discriminant que les méthodes utilisées à ce jour.

L'invention se rapporte ainsi à une méthode de diagnostic d'une polyglobulie primitive (syndrome prolifératif des précurseurs de la lignée érythrocytaire) chez le mammifère canin, dans lequel on recherche des mutations dans la séquence du gène JAK2 de ce mammifère.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : analyse de la séquence de l'exon 14 de JAK2 dans l'ADN extrait à partir d'ADN du sang périphérique. A: séquence de type sauvage provenant de cellules sanguines d'un chien contrôle. B: séquence mutée obtenue à partir de cellules sanguines du chien n° 1. Les flèches indiquent les 3 positions de variation qui montent l'existence d'une hétérogénéité de séquence dans les cellules sanguines.

C: séquence de type sauvage détecté dans un frottis buccal du chien n° 1 (ADN de lignée germinale). D: séquences d'acides aminés des protéines JAK2 humaine et canine de type sauvage ou mutant. Les séquences indiquées sur A, B, C sont les séquences complémentaires de la séquence SEQ ID N° 2.

Figure 2 : prolifération des cellules BaF3 transfectées par des constructions exprimant la protéine JAK2, en présence (gauche) ou en absence (droite) d'Interleukine 3. Mutant 1 représente la construction JAK2 canine présentant la mutation V617F. Mutant 2 représente la construction JAK2 canine présentant les mutations V617F/C618L. WT représente les contrôles (construction JAK2 canine sans mutation) Les résultats de 3 expériences indépendantes sont présentés. Figure 3 : Analyse par Western blot de la phosphorylation de STAT5 (sur la Tyr694) dans des extraits cellulaires totaux de cellules BaF3 transfectées avec des constructions exprimant la JAK2 canine. Les cellules ont été placées pendant 12 heures dans du DMEM contenant 1 % de FBS en présence ou en absence d'IL3.

La présente demande permet de fournir une méthode de diagnostic d'une polyglobulie primitive chez un canidé, et notamment un chien, qui soit rapide, et permette d'éviter le prélèvement de moelle osseuse. Cette méthode est basée sur la détection de mutations acquises dans le gène JAK2 du canidé. Ce gène présente une forte homologie avec le gène JAK2 humain, et notamment dans le domaine pseudokinase (Zhao et al, J Biol Chem. 2005 Jun 17;280(24):22788-92, voir notamment la figure 1.C).

L'invention se rapporte ainsi à une méthode de diagnostic in vitro d'une polyglobulie chez un canidé, caractérisée en ce qu'elle comporte l'étape de détection de la présence d'une leucine en position 618 de la séquence de la protéine JAK2 dudit canidé, représentée par SEQ ID N° 1.

Dans un mode de réalisation, la méthode comprend également l'étape de détection de la présence d'une phénylalanine en position 617 de SEQ ID N° 1.

Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend uniquement l'étape de détection de la présence d'une phénylalanine en position 617 de SEQ ID N° 1 .

Cette méthode est particulièrement adaptée chez le chien, SEQ ID N° 1 représentant la séquence protéique de la protéine JAK2 chez le chien.

Dans un mode de réalisation préféré, cette méthode est réalisée sur un échantillon sanguin qui a été prélevé sur le canidé.

Dans un mode de réalisation préféré, le canidé présente une élévation chronique de l'hématocrite.

Dans un mode de réalisation préféré, le canidé ne présente pas d'élévation de son niveau d'EPO (érythropoïétine) circulante.

Il est entendu que la séquence SEQ ID N° 1 représente un allèle particulier du gène JAK2 chez le chien. D'autres canidés peuvent présenter des allèles différents. Ainsi, il est possible que la séquence du gène JAK2 d'un canidé autre que le chien (ou d'un chien particulier) puisse différer de la séquence SEQ ID N° 1 par quelques nucléotides (présence de variations naturelles entre allèles ou entre séquences d'animaux de phylogénie proche).

En conséquence, la présence d'une leucine en position 618 et/ou d'une phénylalanine en position 617 (ou à l'équivalent de ces positions, déterminées en fonction de la localisation du domaine pseudokinase dans la séquence considérée, et notamment si l'on prend une isoforme de JAK3 en considération) de la séquence de la protéine JAK2 dudit canidé est indicatrice d'une polyglobulie primitive.

On peut détecter les mutations sur la protéine via des anticorps reconnaissant spécifiquement ces mutations, ou une chromatographie d'affinité.

Les anticorps spécifiques des mutations peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec une protéine mutante, et tri des anticorps du sérum obtenu (suppression des anticorps réagissant de façon croisée avec la protéine non-mutée).

Il est toutefois plus aisé de détecter les mutations dans la protéine en recherchant les mutations existant au niveau génétique.

Ainsi, dans un cas particulier, la mutation F617 (resp. L618) est due à la présence d'un codon TTC en position 1849 (resp. d'un codon CTT en position 1852) de SEQ ID N° 2.

Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend une étape d'amplification de l'ADN présent dans un échantillon qui a été prélevé du canidé.

Ainsi que mentionné plus haut, les mutations recherchées étant acquises, il est préférable que l'échantillon soit un échantillon sanguin. Il peut toutefois aussi s'agir d'un échantillon de moelle osseuse. Cet échantillon doit contenir des cellules permettant une extraction et analyse de l'ADN du canidé.

La méthode peut ainsi comprendre une étape d'hybridation de l'ADN du canidé avec une sonde spécifique de l'une ou l'autre mutation.

Cette sonde peut notamment être fixée à un support solide.

Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend une étape de séquençage d'une partie de SEQ ID N° 2 contenant les nucléotides 1849 à 1854 de SEQ ID N° 2.

On peut effectuer une amplification avec un seul couple d'amorces, ou effectuer deux séries de PCR, la seconde amplification étant réalisée avec des amorces situées à l'intérieur du premier fragment amplifié.

On utilise de préférence une ADN polymérase à haute ou très haute fidélité. En effet, comme on recherche la présence spécifique de nucléotides définis, il est important que la polymérase n'induise pas de mutations dans le fragment amplifié. De telles enzymes sont disponibles commercialement. On peut ainsi citer les enzymes Phusion™ DNA Polymerases (Finnzymes Oy, Espoo, Finlande) présentant un taux d'erreur de l'ordre de 4,4 x 10^"7.

Lors de la mise en œuvre de la réaction d'amplification, on peut choisir de n'amplifier que le gène JAK2 (ou une partie de ce gène), en utilisant un coupe d'amorces approprié, ou d'amplifier, dans la même réaction, différents gènes potentiellement présents dans l'échantillon (notamment d'autres gènes de susceptibilité à d'autres pathologies), en utilisant une pluralité d'amorces différentes. On introduit ainsi dans le tube de réaction plusieurs couples d'amorces, chacun étant spécifique d'un gène que l'on souhaite amplifier.

La détection des nucléotides polymorphes dans le gène JAK2 s'effectue de toute manière connue dans l'art. L'homme du métier connaît en effet de multiples protocoles appropriés qui peuvent être identifiés sur des moteurs de recherche sur Internet. On peut notamment citer www.ipbs.fr/formation/biotech/mutations.pdf.

On peut ainsi séquencer le fragment d'ADN, en particulier par la méthode de séquençage de Sanger en utilisant uniquement trois désoxynucléotides et un didésoxynucléotide et une amorce (notamment une amorce telle que mentionnée ci-dessus). Les produits de séquence sont ensuite séparés sur gel de polyacrylamide et la présence de la mutation est confirmée par observation de la taille des produits.

On peut aussi faire une réaction d'extension d'amorce. Dans ce cas, l'amorce utilisée est définie de telle sorte que le premier nucléotide à incorporer après cette amorce corresponde au nucléotide polymorphe.

On peut également détecter les mutations par la technique HRM (High

Resolution Melt), ou tout autre méthode de séquençage.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite étape de détection comprend une étape d'hybridation de l'ADN (préférentiellement amplifié) avec une sonde spécifique de l'une ou l'autre mutation, ou des deux mutations. L'hybridation de deux chaînes d'ADN est due à l'appariement de bases complémentaires A-T et G- C et est diminuée lors de mésappariement. La Tm d'un oligonucléotide de 10 à 20 bases sera donc abaissé s'il y a un mésappariement. Pour calculer le Tm d'un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante : Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C), dans laquelle A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l'oligonucléotide. On peut ainsi utiliser la méthode « dot blot », en fixant un oligonucléotide sonde porteur de la mutation sur une membrane de nitrocellulose, et en appliquant l'ADN présent dans l'échantillon (ou l'ADN amplifié) dans des conditions permettant l'hybridation spécifique du polymorphisme (la TM est calculée selon la composition de l'oligonucléotide sonde choisi.

Dans ce cas, la sonde est fixée à un support solide.

Dans un mode de réalisation particulier, l'hybridation est réalisée sur une puce à ADN. Un premier spot contient un oligonucléotide présentant le polymorphisme du gène JAK2 au codon positionné à 1849 de SEQ ID N° 2, un deuxième spot contient un oligonucléotide présentant le polymorphisme du gène JAK2 au codon positionné à 1852 de SEQ ID N° 2, et un troisième spot contient un oligonucléotide d'un gène JAK2 non-porteur de mutation. On amplifie et on marque l'ADN avec un fluorophore. Il est ensuite hybridé sur les oligonucléotides fixés à la puce. On observe une fluorescence s'il y a hybridation.

On peut aussi détecter la présence des deux nucléotides mentionnés plus haut par d'autres méthodes. Après amplification, on peut mélanger le produit d'amplification avec de l'ADN ne comprenant pas les mutations et hybrider ces deux oligonucléotides. Les mésappariements sont alors détectés par coupure enzymatique (notamment en utilisation de Ce/I) ou chimique. Cette méthode de détection est bien connue et des enzymes appropriées sont notamment décrites dans EP 964929.

Exemple

Matériels et méthodes

Des échantillons de sang ont été prélevés sur cinq chiens suspectés de présenter une PP.

Ces animaux présentaient : élévation chronique de l'hématocrite, faible dosage d'EPO (si disponible), radiographie thoracique et une échographie abdominale pour éliminer les maladies chroniques ou néoplasiques qui peuvent être une cause de polyglobulie.

Extraction de l'ADN

L'ADN génomique a été extrait à partir de 200 μΙ de sang total en utilisant le kit Qiagen Qiamp DNA Blood Mini Kit selon les instructions du fabricant. La quantité et qualité des échantillons d'ADN ont été évaluées avec un spectrophotomètre Nanodrop. PCR et séquençage

Des amorces spécifiques canines ont été conçues sur la base du génome canin publié (NC_006583 Canis lupus familiaris, base de données NCBI).

Les amorces ont été conçues dans les régions introniques qui encadrent l'exon 14 (codant pour le domaine pseudo-kinase de JAK2 où la mutation de l'homme se trouve principalement).

La réaction de PCR a été réalisée en utilisant le kit de Ready Mix (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK). Chaque 50 μΙ contenait 4 μΙ de l'ADN extrait, 25 μΙ de Ready Mix solution, 1 μΙ de l'amorce inverse (5' GTTTG G G C ATTTTAAC ATATAG C ATATT3 ' , SEQ ID N° 3) et 1 μΙ de l'amorce sens (5'ATGCATTTCTCTTACAGCAGACAGTATC3\ SEQ ID N° 4).

Les conditions pour l'amplification étaient : dénaturation initiale à 95 ° C pendant 5 min, suivie de 30 cycles de (95 ° C pendant 40s, 62 ° C pendant 45s et 72 ° C pendant 1 ,5 min), avec une étape d'élongation finale de 72 ° C pendant 3 min. Les produits de PCR ont été purifiés en utilisant le kit de purification QIAgen conformément aux instructions du fabricant et séquencés.

Sous-clonage du produit PCR

En cas de besoin des produits de PCR ont été sous-clonés dans le plasmide pCR2.1 -TOPO (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) et amplifiés dans des cellules compétentes « One Shot chemically compétent E. coli », en utilisant le kit de clonage TOPO (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) et suivant les instructions du fabricant. Après une nuit de culture dans un milieu LB contenant 50 μg / ml d'ampicilline, l'ADN plasmidique a été isolé à l'aide du kit QIAgen Miniprep, en suivant les instructions du fabricant.

Clonage de l'ADNc JAK2 canin

Afin d'exprimer la protéine JAK2 dans les cellules BaF3, l'ADNC complet a été synthétisé par GeneCust (Luxembourg) sur la base du génome canin publié et cloné dans pCDNA3 (Invitrogen Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni).

Une mutagenèse dirigée a permis de préparer deux mutants :

Dans le mutant 1 , un changement de base unique a été introduit pour générer un mutant V617F

Dans le mutant 2, 2 mutations ont été introduites pour générer le mutant

V617F/C618L BaF3 cellules en culture et transfection

Les cellules BaF3/EpoR sont un sous-clone de la lignée cellulaire BaF3, dépendante à l'Interleukine 3 (IL3) et qui exprime le récepteur de l'érythropoïétine.

Les cellules ont été maintenues dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et de NL3.

La transfection des cellules BaF3/EpoR avec les plasmides portant l'ADNc de type sauvage et les constructions mutantes a été réalisée par nucléofection en utilisant le kit Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V (Lonza, France).

48 heures après transfection, les cellules ont été cultivées dans le milieu standard additionné de IL3 et de la généticine pendant 4 semaines pour établir des lignées stables.

Western Blot

10⁷ cellules ont été lavées dans du PBS froid ont été lysées avec 1 ml de tampon 2X NuPage LDS Sample Buffer (280mm TrisBase, 4% LDS, 20% glycérol, 1 mM EDTA, 0,44 mM SERVA Blue G250, 0,35 mM de phénol rouge, pH 8,5) additionné de 2X NuPage Reducing Agent (100 mM DTT) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Les protéines ont été séparées sur gel d'électrophorèse 12% SDS- polyacrylamide (SDS-PAGE), et transférées sur des membranes de PVDF (Immobilon-P Transfert membranes, Millipore).

Les anticorps utilisés sont des anticorps anti-phospho STAT5 Tyr694 et anti-STAT5 de Cell Signaling Technologies.

Résultats

Le séquençage direct de l'exon 14 de JAK2 a été effectuée à partir de l'ensemble des échantillons d'ADN de sang prélevés dans 5 différents chiens tels que décrits ci-dessus.

4 chiens présentaient une séquence de type sauvage par rapport à la séquence d'un contrôle en bonne santé, et identique à la séquence publiée issue de NC_006583 (AD Ne représenté par SEQ ID N° 2). (figure 1A),

Un animal présentait une séquence mutée dans l'exon 14 (figure 1 B) (hétérogénéité des séquences présentes dans les cellules sanguines).

Trois bases ont été modifiées en positions 1849 (G→ T), 1852 (T→ C) et

1853 (G→T) (figure 1 B). Il s'agit de mutations acquises, car le séquençage de l'ADN obtenu à partir de la lignée germinale (frottis buccal) a montré la séquence de type sauvage seulement (figure 1 C), ce qui exclue la possibilité de mutations héréditaires.

Afin d'élucider si les 3 mutations se rapportaient à trois mutations sur trois allèles différents ou à un mutant hébergeant les 3 mutations sur un seul allèle, des produits de PCR ont été sous-clonés et séquencés.

Alors que 12 clones montraient la séquence de type sauvage, 3 clones contenaient la séquence mutante avec trois mutations ponctuelles. On n'a observé aucun clone avec uniquement une ou deux mutations.

Ces résultats indiquent que les trois mutations sont simultanément présentes dans un allèle du gène JAK2. On estime que la fréquence des allèles mutés dans l'échantillon est de 20 % pour cet animal.

L'analyse de la séquence protéique correspondante a montré que 2 acides aminés ont été modifiés : la valine en position 617 a été remplacée par une phénylalanine et la cystéine en position 618 a été remplacée par une leucine (figure 1 D). Ainsi, la mutation V617F est identique à la mutation JAK2 principale trouvée chez l'homme et associée à la polyglobulie de Vaquez.

L'expression de la séquence mutante dans BaF3 confère l'indépendance à NL3 Les mutations acquises dans les cellules cancéreuses conduisent souvent à une activation constitutive des voies de signalisation impliquées dans la croissance cellulaire.

La mutation JAK2 V617F détecté chez des patients humains atteints de PV est responsable de la croissance des progéniteurs érythrocytaires de façon indépendante des cytokines.

Pour tester si la mutation JAK2 identifiée chez le chien possède le même effet, les cellules BaF3 contenant le récepteur de ΙΈΡΟ (BaF3 Epo-R) ont été transfectées avec des plasmides exprimant soit l'ADNc sauvage (WT), soit un

ADNc mutant.

En l'absence d'IL3, seuls les clones portant un gène JAK2 mutant sont capables de croître (figure 2), sans qu'il ne soit possible d'observer une différence significative entre le clone portant une mutation simple et celui qui porte une mutation triple.

Ainsi, la mutation de JAK2 chez le chien induit un avantage de croissance dans les cellules hématopoïétiques. La protéine JAK2 mutée active STAT5

On a déterminé si l'expression de la protéine JAK2 mutante pourrait activer la signalisation intracellulaire de façon constitutive.

L'une des voies les plus importantes activée en aval de JAK2 est la phosphorylation de STAT5.

Les cellules BaF3 transfectées ont été incubées en présence ou en absence d'IL3, et l'analyse des protéines extraites a révélé une augmentation du niveau de STAT5 phosphorylée dans des cellules exprimant la protéine JAK2 mutée.

Ainsi, le double mutant JAK2 V617F/C618L (mutant 2) a été capable d'induire la phosphorylation de STAT5 en l'absence de cytokines (Figure 3).

Une phosphorylation constitutive a également été observée avec la protéine présentant une mutation V617F (mutant 1 ), même si le signal est apparu plus faible par rapport au mutant 2 (Figure 3).

Ces résultats confirment que la protéine JAK2 canine mutée présente une activité kinase constitutive conduisant à l'activation constitutive des voies de signalisation intracellulaire responsables de la polyglobulie primitive.

Discussion

Ces résultats montrent l'existence de mutations acquises dans le gène

JAK2 canin, dans un animal sur cinq suspectés de polyglobulie primitive.

Ces trois mutations entraînent les substitutions V617F et C618L dans le domaine JH2 pseudo-kinase impliqué dans l'auto-inhibition de l'activité kinase.

Chez l'homme la présence de doubles mutants en position 617 et 618 (V617F-C618R) a été trouvée chez 3 patients. Cependant, la présence de 2 acides aminés mutés est extrêmement rare chez l'homme et les conséquences fonctionnelles d'un double mutant par rapport à un seul mutant n'ont pas été élucidées.

Dans le cas présent, il peut s'agir du fait que les mutations doubles sont plus fréquentes chez le chien que chez l'homme, ou que le hasard a permis l'identification d'un mutant très rare.

La présence d'une mutation simple V617F ou des deux mutations V617F/C618L ne semble pas apporter de différence en termes de signalisation cellulaire (STAT5 est constitutivement phosphorylée dans des cellules BaF3 transfectées le mutant simple ou double). Cette activation constitutive des mutants JAK2 mène par ailleurs à l'indépendance des cellules transfectées BaF3 vis-à-vis de I IL3.

Seul un chien sur les cinq chiens étudiés était porteur d'une mutation dans la région analogue à la région JAK2 mutée chez les humains.

La PP est mal caractérisée chez les chiens, notamment en raison de la difficulté à poser un diagnostic définitif et aussi parce que la maladie ne peut être que légèrement symptomatique pendant des mois ou années d'évolution.

On peut considérer qu'une autre région du gène JAK2 pourrait être mutée dans les 4 chiens trouvés négatifs, ainsi qu'il a été rapporté chez l'homme pour l'exon 12 du gène JAK2. En effet, ces mutations rares sont souvent rapportées chez des patients présentant seulement une polyglobulie (c'est-à-dire des numérations plaquettaire et de globules blancs normales) qui est la situation de tous les chiens testés dans cette étude.

Enfin, on a signalé la présence de mutations acquises supplémentaires, chez l'homme, dans les gènes TET2 et ASXL1.

La question de l'apparition de mutations supplémentaires dans les gènes canins devrait être d'intérêt.

En effet, les résultats rapportés ici montrent que des mutations similaires sont trouvées dans le gène JAK2 chez l'homme et chez les chiens, en présence de polyglobulie primitive. Ceci suggère un niveau élevé de similitude dans la régulation de l'érythropoïèse entre les humains et les animaux.

Ainsi, les chiens présentant une polyglobulie et une mutation dans le gène JAK2, telle que rapportée ici, pourraient être utilisés en tant que nouveau modèle animal pour étudier l'impact des mutations dans le développement des syndromes myéloprolifératifs, mais aussi pour tester l'efficacité de nouveaux médicaments.

Claims

Revendications

1 . Méthode de diagnostic in vitro d'une polyglobulie chez un canidé, caractérisée en ce qu'elle comporte l'étape de détection de la présence d'une phénylalanine en position 617 de SEQ ID N° 1 (F617) et/ou d'une leucine en position 618 (L618) de la séquence de la protéine JAK2 dudit canidé, représentée par SEQ ID N° 1 .

2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend également l'étape de détection de la présence d'une F617 et d'une L618 dans SEQ ID N° 1.

3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit canidé est un chien.

4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la présence de la F617 est due à la présence d'un codon TTC en position 1849 et la présence de la L618 est due à la présence d'un codon et CTT en position 1852 de SEQ ID N° 2.

5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'amplification de l'ADN présent dans ledit échantillon.

6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'hybridation de l'ADN avec une sonde spécifique de l'une ou l'autre mutation.

7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite sonde est fixée à un support solide.

8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de séquençage d'une partie de SEQ ID N° 2 contenant les nucléotides 1849 à 1854 de SEQ ID N° 2.