WO2011065449A1

WO2011065449A1 - 単糖製造方法

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Publication number: WO2011065449A1
Application number: PCT/JP2010/071066
Authority: WO
Inventors: 和也松本; 雅巳長部; 亮太藤井; 清一渡邉; 絢子遠藤; 桜子木村; 正安楽城; 章中山
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2011-06-03
Anticipated expiration: 2012-05-27
Also published as: JPWO2011065449A1; CA2781090A1; US20120244579A1; JP5431499B2; BR112012012352A2; WO2011065449A9; TW201130981A; CN102666871A; EP2505657A1

Abstract

　リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られた糖化液を得ること、前記糖化液中の糖化酵素を、リグノセルロース原料に吸着させて回収すること、及び、回収された前記糖化酵素を用いて、リグノセルロース原料を糖化すること、を含むリグノセルロース原料から単糖を製造する単糖製造方法。

Description

単糖製造方法

　本発明は、単糖製造方法に関し、特にリグノセルロース原料から単糖を製造する方法に関する。

　近年の環境意識の高まりにより、バイオマスの有効利用に関する検討が盛んに行われている。バイオマス資源中の多糖を分解して得られる糖は、微生物の醗酵基質として用いることにより、乳酸、イソプロパノール、エタノール、アミノ酸等の様々な有用物質生産に利用することができる。

　バイオマス原料としては、リグニンを含むリグノセルロースや、リグノセルロースからリグニンが除去されたセルロース等が一般に使用される。リグノセルロース原料としては、例えば、広葉樹や針葉樹等の木材、麦わらやとうもろこし残渣等の農業残渣などを挙げることができ、一方、リグニンが完全に除去されたセルロースとしては、Ａｖｉｃｅｌ等の試薬としてのセルロースを挙げることができる。またリグニンがある程度除去されたリグノセルロース原料としては、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプ、機械パルプ、ケナフ等の草本由来パルプ；古紙、または紙パルプ工場から回収されるパルプ繊維分を含むペーパースラッジ等を挙げることができる。

　バイオマス資源中の多糖類から醗酵基質となる単糖を作る方法大きく分けて２つの方法がある。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。
　酸糖化法は、酵素糖化法に比べて技術的に完成されているが、デンプン、廃糖蜜などを原料とする方法に比べてまだコストが高く、また、使用した酸の廃棄による環境負荷が問題となっており、実用化の妨げとなっている。

　一方の酵素糖化法では、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素の価格が高いことが実用化の障害となっていることが知られている。
　糖化に用いる酵素のコストを下げる方法として、基質リグノセルロース原料の化学的・物理的な前処理により、後段での酵素の糖化反応効率を向上させ、使用する酵素量を低減する試みがなされている。このような試みとしては、例えば、原料を酸で前処理する方法（特開２００８－５１４２０７号）、ボールミルで粉砕後に酸で蒸煮する前処理方法（特開２００８－２７１９６２号）、叩解処理によりセルロース繊維を解す前処理方法（特開２００９－１７１８８５号）等が挙げられる。これら各種の基質前処理方法によって酵素反応を向上させる効果には限界があり、低コスト化の決め手となるものではない。例えばリグニンが高度に除去されたパルプを叩解処理した場合の酵素反応の向上の効果は１．３倍に止まる（特開２００９－１７１８８５号）。

　この中でも酸を用いた前処理方法は最も応用の報告が多いが、リグノセルロース原料からリグニン成分を除くことを主目的としており、処理後に酸とリグニンを分離する工程が必要となる。リグニンの除去の程度は、糖化酵素の酵素反応性に影響するが、処理後に特に前処理反応物を分離しない場合の酵素反応性、並びに、その酵素反応時の酵素の挙動については報告がない。
　また更なるコスト低減のため、糖化反応後に酵素を回収し再利用する方法も試みられているが、未分解の基質固体残渣への酵素の固着が回収の障害になるとされ、安定的な酵素回収は成功していない。

　例えば、糖化反応後の未分解の基質固体残渣へ酵素が吸着することを利用し、酵素を吸着回収、再利用する方法が知られている（特開昭５９－２１３３９６号、特開昭６２－２０８２８２号、特許第１２９９０６８号、特開昭６３－００７７８１号）。しかしながら特開昭５９－２１３３９６号及び特開昭６２－２０８２８２号には、基質固体残渣に吸着した酵素がそのまま利用可能と記載されており、一方、特許第１２９９０６８号及び特開昭６３－００７７８１号では、酵素の回収再利用に基質固体残渣からの引き剥がし操作を必要とすると記載されている。このように、糖化反応後の基質固体残渣の利用可能性については見解が統一されているとは言い難い。また、基質固体残渣に吸着した酵素をそのまま利用した場合は、回収できた活性量に６７％～９７％とばらつきがあり、１回の回収結果しか示していない（特開昭５９－２１３３９６号）。

　更には通電処理により酵素を残渣から引き剥がし回収する試みもなされている（特開２００８－２０６４８４号）。しかしながら、この方法では、操作は煩雑であり、酵素回収に成功したとしてもコスト面に依然問題が残る。他にも糖化反応液を限外濾過膜にて処理することにより酵素を直接回収する方法も試みられている。古市らは糖化反応液を限外濾過膜にて処理して酵素を回収し、糖液側を更に逆浸透膜で濃縮する方法を提案している（特開昭５８－１９８２９９号）。しかしながら酵素の回収量について記載はなく、連続しての運転成績の記述もない。

　また特開２００６－８７３１９号には、糖化反応液を限外濾過膜にて処理する場合においても、酵素の未分解残渣への固着が問題になるとし、全基質の９６質量％が滞留時間内に糖化される条件下において、膜処理により酵素を濾別し反応系内に留める連続的な糖化反応方法が開示されている。この場合、装置の構造・操作上、酵素活性の低下等による残渣の増大が反応の不安定性に直結するため、酵素や基質の投入量に大きな制限を設けている。この膜濾過による酵素回収の検討は、既にリグニンが高度に除去されたパルプを基質に用いているが、依然未分解残渣への酵素吸着が最大の問題であり、その低減が必要であるとしている。

　このように、リグノセルロース原料から、セルラーゼやヘミセルラーゼによって高い効率で繊維成分を加水分解して糖類を製造する技術は種々開発されてはいるものの、糖化に要する酵素のコストが高く、経済性がないことが依然として課題となっている。これを解決するために、基質を前処理する方法、また酵素を回収再利用する方法が試みられてきたが、前者は効果が限られること、後者は酵素回収率が低いことにより課題解決には至っていない。酵素回収率が低い問題については、未分解の基質残渣への酵素吸着が原因であるとされてきたが、酵素の性質上、基質への吸着を防ぐことは困難である。

　従って本発明は、酵素の使用量を削減可能にして、簡便且つ低コストにリグノセルロース原料から単糖を製造する方法を提供することを目的とする。

　本発明は以下のとおりである。
　〔１〕　リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られた糖化液を得ること、前記糖化液中の糖化酵素を、リグノセルロース原料に吸着させて回収すること、及び、回収された前記糖化酵素を用いて、リグノセルロース原料を糖化すること、を含むリグノセルロース原料から単糖を製造する単糖製造方法。
　〔２〕　前記リグノセルロース原料が、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプ、機械パルプ、草本由来パルプ、古紙、若しくはペーパースラッジ、またはこれらの混合物である〔１〕記載の製造方法。
　〔３〕　前記リグノセルロース原料が、酸性条件下で加熱処理を行った後に中和する前処理で得られた前処理原料である〔１〕又は〔２〕記載の製造方法。
　〔４〕　前記前処理原料中のヘミセルロース含量が、前処理前の５０質量％以下である〔３〕記載の製造方法。
　〔５〕　前記前処理原料中のフルフラールが、前処理原料の乾燥質量の１質量％以下である〔３〕又は〔４〕記載の製造方法。
　〔６〕前記リグノセルロース原料が、以下の（ａ）～（ｄ）を含む前処理で得られた前処理原料である〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の製造方法：
（ａ）　リグノセルロース原料の固形分濃度が８質量％～３０質量％の原料液を得ること；
（ｂ）　前記原料液を、終濃度０．２質量％～１２質量％の鉱酸により酸性化すること；
（ｃ）　酸性化された原料液を８０℃～１５０℃にて１時間～６時間インキュベートすること；
（ｄ）　前記インキュベート後の原料液を、２０℃～８０℃下でｐＨ３～８に調整すること。
　〔７〕　前記鉱酸が、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸又はこれらの組み合わせである〔６〕記載の製造方法。
　〔８〕前記回収が、以下の（ｅ）～（ｈ）を含む〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の製造方法：
（ｅ）　前記糖化液と、前記糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の４０倍以上の固形分質量のリグノセルロース原料との混合液を得ること；
（ｆ）　２０℃～８０℃にて１分～３時間インキュベートすること；
（ｇ）　前記インキュベート後の混合液を、糖化液と、固形分として酵素が吸着したリグノセルロース原料とに固－液分離すること；
（ｈ）　分離された前記リグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として回収すること。
　〔９〕　前記回収が、以下の（ｉ）～（ｋ）を含む〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の製造方法：
（ｉ）　糖化反応を、前記糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の４０倍以上の固形分質量のリグノセルロース原料が残存する条件で停止させること；
（ｊ）　反応停止後の反応液を、糖化液と、固形分として未反応のリグノセルロース原料とに固－液分離すること；
（ｋ）　分離された前記リグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として回収すること。
　〔１０〕　前記固－液分離の際に液側に分離される酵素活性成分の糖化酵素を追加して、前記再糖化を行うことを含む〔８〕又は〔９〕に記載の製造方法。
　〔１１〕　前記固－液分離の際に液側に分離される酵素活性成分の糖化酵素が、β－グルコシダーゼを含む〔１０〕記載の製造方法。
　〔１２〕　前記液側に分離される酵素活性成分の糖化酵素が、前記固－液分離工程で糖化液側に分離された酵素活性成分を濾別又は樹脂精製により回収したものである〔８〕又は〔９〕に記載の製造方法。
　〔１３〕　前記糖化酵素が、セルラーゼ及びヘミセルラーゼからなる群より選択された少なくとも一方である〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の製造方法。
　〔１４〕前記セルラーゼが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドラターゼ及びβ－グルコシダーゼの各活性を有する酵素混合物である〔１３〕に記載の製造方法。
　〔１５〕　ヘミセルラーゼが、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各活性を有する酵素混合物である〔１３〕又は〔１４〕記載の製造方法。

本発明の実施例にかかるリグノセルロース原料の前処理品と前処理未処理品の酵素糖化反応結果を示すグラフである。本発明の実施例にかかるリグノセルロース原料前処理品への吸着により回収した酵素を用いた繰り返し糖化反応の結果を示すグラフである。本発明の実施例にかかる吸着回収酵素を用いた繰り返し糖化反応での触媒原単位低減の結果を示すグラフである。本発明の実施例にかかる未吸着酵素活性分の補充した場合と補充しなかった場合とで、それぞれ繰り返し糖化を行った結果を示すグラフである。本発明の実施例にかかる吸着及び膜回収酵素を用いた繰り返し糖化反応での触媒原単位低減の結果を示すグラフである。

　本発明の単糖製造方法は、リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られた糖化液を得ること、前記糖化液中の糖化酵素を、リグノセルロース原料に吸着させて回収すること（以下、「回収工程」ということがある）及び、回収された前記糖化酵素を用いて、リグノセルロース原料を糖化すること（以下、「再糖化工程」ということがある）、を含むリグノセルロース原料から単糖を製造する単糖製造方法である。

　本発明者らは、糖化酵素の回収率を高めて繰り返し使用することによりコストを下げる方法を検討し、基質又は未分解基質残渣へ吸着した酵素成分は、特別な剥離処理を加えることなくそのまま再使用することができることを見出した。
　本発明によれば、糖化液中の糖化酵素を、リグノセルロース原料に吸着させて回収し、回収された糖化酵素を用いてリグノセルロース原料を糖化して単糖を得るので、糖化酵素を簡便に回収することができると共に糖化酵素の繰り返し使用が可能となる。この結果、糖類を製造する際の酵素の使用量を大幅に減らし、簡便且つ低コストにリグノセルロース原料から単糖を製造することができる。

　本発明において「単糖」とは、１の糖単位で構成される単糖類を主として意味する。なお単糖としては、グルコース又は、リグノセルロース原料から糖化酵素を用いて得られるその他の単糖であれば、特に制限なく本願発明における単糖に包含される。ただし、本発明において、生成された単糖が含まれる糖化液には、２個～１００個程度の複数の糖単位で構成されたオリゴ糖が存在してもよい。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
　また、本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　本発明において、組成物を構成しうる各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　以下、本発明について説明する。

　本発明にかかる単糖製造方法では、リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られた糖化液を用いる。この糖化液は、リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られたものであれば特に制限はないが、好ましくは、糖化酵素を用いてリグノセルロース原料から単糖を生成すること（糖化工程）により得られたものである。本発明では、入手した糖化液を本製造方法に用いてもよく、糖化液を得るための糖化工程を本製造方法の一工程として取り込んでもよい。

　本発明に用いられるリグノセルロース原料は、リグニン含量の低いバイオマス原料であればよい。低いリグニン含量とは、バイオマス原料の平均的なリグニン含量である３０質量％より低い値であり、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下が好適である。リグニン含量の低い原料としては、針葉樹、広葉樹、林地残材、建築廃材、剪定廃棄物、ソーダスト、ケナフ、稲藁、麦わら等の農産破棄物などのリグノセルロース材料から、アルカリ抽出もしくはアルカリ蒸解等の化学パルプ製造法、又はオルガノソルブなどの方法により高度にリグニンを除去した繊維であってセルロース、ヘミセルロースを主成分とする繊維が好ましく、例えば、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプ、機械パルプ、ケナフ等の草本由来パルプ、古紙、もしくはペーパースラッジ（紙パルプ工場から回収されるパルプ繊維分を含む）、またはこれらの混合物がより好ましい。これらの原料であれば、例えば、糖化酵素による確実な糖化処理を行うことができる。特に、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプが使用に好適であり、其々一般のパルプ製造企業から入手することができる。

　本発明の酵素糖化方法で基質とされるリグノセルロース原料は、酸性条件下で加熱処理を行った後に中和する前処理で得られた前処理原料であることが好ましく、リグニン含量の低いリグノセルロース原料の前処理原料であることがより好ましい。リグノセルロース原料を前処理することによって、リグノセルロース原料への酵素吸着を加速することができる。
　酸性条件下で加熱し、その後に中和する前処理により、バイオマス原料中のヘミセルロースが部分的に分解し、キシロース等の単糖に変換される。このリグノセルロース原料からのヘミセルロース成分の減少が、酵素による原料糖化の効率を向上させると共に、その後の酵素の吸着回収率の向上にも寄与する。

　前処理原料としては、ヘミセルロース含量が、前処理前のヘミセルロース含量の５０質量％以下、即ち、前処理の程度としては、ヘミセルロース成分の５０質量％以上が可溶性の単糖又はオリゴ糖まで分解したものであることが好ましく、且つフルフラールの副生をリグノセルロース原料の乾燥質量の１質量％以下に留めるものであることが更に望ましい。ヘミセルロース含量が、前処理前のヘミセルロース含量の５０質量％以下とすることによって、糖化酵素処理効率をより向上させることができる。フルフラールの副生を１質量％以下とすることによって、糖化反応液中の収率に大きな影響を与えずに、後段の酵素反応工程、及び酵素の吸着回収工程での微生物のコンタミネーションを抑制することができる。なおフルフラールは比較的低沸点を有することから、生成単糖液に減圧濃縮処理を加えることにより容易に除去することができる。
　ヘミセルロース含量は、前処理前のヘミセルロース含量の５０質量％以下であれば、ヘミセルロースを限りなく除去する必要はなく、３０質量％以上残っていてよく、４０質量％以上残っていてもよい。

　本前処理においては、まずリグノセルロース原料は、固形分濃度が８質量％～３０質量％となるように水にて希釈されて、原料液を得る。リグノセルロース原料は溶解度が極めて低いため、固形分懸濁液として調製される。前処理に用いる鉱酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。これらの鉱酸であれば、例えば前処理効率を良好なものにすることができる。中でも工業利用には安価な硫酸が好適である。

　本前処理は、鉱酸を原料液に終濃度０．２質量％～１２質量％で加えて酸性化すること及び、酸性化された原料液を８０℃～１５０℃にて１時間～６時間インキュベートすることを含む。更に望ましくは、リグノセルロース原料の固形分濃度を８質量％～２０質量％、鉱酸を終濃度０．２質量％～５質量％添加し、９０℃～１５０℃にて１時間～４時間インキュベートすることが好適である。前処理反応に用いる反応容器には特に限定は無いが、耐酸性を有する加熱圧力容器、又は、耐酸性を有する容器をオートクレーブのような加熱圧力装置に入れて処理する形態が考えられる。

　インキュベート後の原料液を、２０℃～８０℃下でｐＨ３～８、好ましくはｐＨ４～７に調整し、リグノセルロース原料前処理品（前処理原料）とする。ｐＨ調整用のアルカリ試薬には特に限定は無く、ＮａＯＨやＫＯＨ、アンモニア等を用いることができる。前処理後のリグノセルロース原料も依然溶解度は低く、固形分懸濁液として回収される。

　本発明における糖化酵素とは、リグノセルロース原料を単糖単位に分解する酵素を意味し、リグノセルロース原料を単糖にまで分解するものであればよく、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであればよい。
　セルラーゼは、セルロースをグルコースに分解するものであればよく、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドラターゼ及びβ－グルコシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
　同じくヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース等の単糖に分解するものであればよく、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
　本発明において「酵素活性成分」とは、酵素混合物とした場合にはこれらの糖化酵素のそれぞれを意味し、単独の糖化酵素を用いた場合には、用いられる糖化酵素そのものを意味する。

　これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼの起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等のヘミセルラーゼを用いることができる。あえて例示するならば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｉｒｐｅｘ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属などの各種の起源のものおよび／または遺伝子組み換えにより製造したものを単独若しくは二種以上を混合して用いることも出来る。また、酵素源としては、一般に市販されているセルラーゼ製剤や上記菌の培養物やその濾過液を直接使用することも出来る。なお、その中でも、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（トリコデルマ）属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（アクレモニウム）属由来のセルラーゼなどのようなセルロース分解力の強力なセルラーゼが好ましい。

　市販のセルラーゼ及びヘミセルラーゼとしては、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１０００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１５００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＸＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＸＹ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ　ＣＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ　ＨＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓（株）製）、メイセラーゼ（明治製菓（株）製）、セルラーゼアマノＡ（天野エンザイム（株）製）、セルラーゼアマノＴ（天野エンザイム（株）製）、セルラーゼダイワ（大和化成（株）製）、セルライザー（ナガセ生化学工業（株）製）、ドリセラーゼ（協和発酵（株）製）、セルラーゼオノズカ（ヤクルト薬品工業（株）製）、セルロシン（阪急バイオインダストリー（株）製）等を用いることが出来る。また市販のβ-グルコシダーゼとしては、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＢＧ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）等を用いることができる。

　本発明の糖化反応は、リグノセルロース原料に酵素を加え、攪拌しながら反応を進行させることにより行われる。糖化反応に用いる反応容器には特に限定は無いが、装入したリグノセルロース原料、酵素類が十分混和されるように攪拌でき、また使用する酵素の最適温度に保てるように温度調節機能を有することが好ましい。反応温度は例えば、トリコデルマ属に代表されるカビ起源の市販酵素の場合、４０℃から５５℃が好適である。糖化反応槽中の液のｐＨは使用する酵素の最適ｐＨに保つことが好ましく、例えば、トリコデルマ属起源の市販の酵素の場合、ｐＨ４から７の間が好ましい。
　反応に仕込む、基質としてのリグノセルロース原料及び酵素の濃度は、特に限定されるものではない。リグノセルロース原料前処理品の移液、装入等の操作には、８質量％～３０質量％の固形分濃度であることが好ましい。また使用する酵素は、その活性に応じて基質を効率よく分解するに十分な量を投入すればよい。酵素の量は、酵素の種類等によって適宜調整が可能である。

　本発明の回収工程は以下のように行うものであることが好ましい。即ち、前記糖化液と、リグノセルロース原料との混合液を得ること；所定時間インキュベートすること；前記インキュベート後の混合液を、糖化液と、固形分として酵素が吸着したリグノセルロース原料とに固－液分離すること；分離された前記リグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として回収することを含むことが好ましい。この回収によれば、酵素活性成分の全蛋白質質量の７０質量％以上を固形成分に吸着回収することができる。

　この工程でのリグノセルロース原料は、酵素の基質としてよりも酵素の吸着剤として作用する。酵素の吸着量を十分に確保し、且つ固－液分離での糖液部分の割合を減らさない（＝容積効率の維持）ためには、好ましくは、糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の４０倍以上、好ましくは２００倍以上の固形分質量のリグノセルロース原料を使用し、また糖化酵素が安定性を保てる温度、例えば２０℃～８０℃にて１分～３時間インキュベートする。これにより、可溶化形態の糖化酵素を固形分としてのリグノセルロース原料に効率的に吸着させることができる。

　また吸着に用いるリグノセルロース原料を新たに糖化反応終了液に投入する方法の他に、糖化反応を途中で停止させ、未分解の基質残渣に糖化酵素を吸着させてもよい。即ち、糖化反応を、所定量のリグノセルロース原料が残存する条件で停止させること；反応停止後の反応液を、糖化液と、固形分としての未反応のリグノセルロース原料とに固－液分離すること；分離された前記リグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として回収することを含む回収工程としてもよい。これにより、糖化工程に連続して吸着を行い、より短時間で酵素を回収することができる。
　なお、回収工程は、前処理原料を用いて糖化酵素を吸着させる方が、より短時間で効果的に回収することができる。前処理を行っていない未処理のリグノセルロース原料を用いる場合には、好ましくは６０分～１２０分とすることが好ましく、一方、前処理原料を用いる場合には、１分～１２０分とすることが好ましい。

　反応の停止は、可溶性の分解生成単糖及びオリゴ糖類の蓄積量から逆算した反応容器内の基質残渣の量が、反応容器内の糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の２００倍以下の固形分質量である時点で反応を停止することが好ましく、４０倍以上の固形分質量である時点で反応を停止することが更に好ましい。基質残渣の量が、反応容器内の糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の２００倍以下の固形分質量の時点で反応を停止することによって、糖化工程として充分に単糖を生成することができ、４０倍以上の固形分質量とすることにより吸着用として充分量の基質量を確保することができる。これにより、酵素蛋白質に対する基質残渣の質量比が十分となって、７０質量％以上の酵素蛋白質を吸着することができる。
　なお、反応容器内の基質残渣量は、混合液中の単糖又はオリゴ糖のそれぞれの量又はこれらの合計量を高速液体クロマトグラフィーなどの公知の分析器で測定すること等により確認すればよい。

　リグノセルロース原料に吸着させた酵素は、前記処理後の液を遠心、又は粗濾過する等操作により糖化液と固形分としてのリグノセルロース原料とに分離し、固形分側を分取することにより回収する。この酵素の吸着したリグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として次バッチの糖化反応に供すればよい。
　糖化液と基質固形物の分離に適用される遠心又は粗濾過の条件は、当業界において通常用いられている方法をそのまま適用すればよく、例えば遠心の場合５００×ｇ～１００００×ｇとすればよく、粗濾過の場合には、ステンレス、セラミック、樹脂製のフィルターで、目開きサイズが０．１μｍ～２ｍｍのものを用いて濾過すればよい。

　一方、固－液分離工程の上清糖化液側に分離した酵素活性成分については、回収して再糖化に用いることが好ましい。上記の回収方法で未吸着の酵素成分を回収追加することにより、本発明では、再度の酵素糖化反応を更に安定して行うことができる。
　液側に分離された酵素成分は、上清糖化液より膜を用いて濾別回収する、または、蛋白質精製用樹脂カラムにて精製回収し、上述の固形分に吸着回収された酵素成分と合わせて次バッチの糖化反応工程に供してもよい。或いはそのような糖化液からの酵素回収を行わず、別途新しい酵素成分を相当活性量追加することにより、前バッチの糖化反応工程と同一の活性量で糖化反応を継続させることもできる。

　上記固－液分離工程で上清糖化液側に分離される酵素成分には、主にβ-グルコシダーゼと、一部のエンドグルカナーゼが含まれることが見出された。従って、β－グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ又はこれらの組み合わせを追加の糖化酵素として用いることが、糖化効率の観点から好ましい。

　回収後の糖化工程では、上述した回収工程により回収された糖化酵素を用いて、リグノセルロース原料を糖化する（本明細書では、「再糖化」ということがある）。
　好ましくは、上記の固－液分離工程で回収された液側分離された酵素を追加する。これにより、繰り返し再糖化を行っても単糖蓄積率を維持することができる。

　リグノセルロース原料に吸着させて回収された糖化酵素と、液側分離された酵素（これらを合わせて、回収酵素混合物という）を用いて再糖化を行うには、基質固形物への吸着にて回収した酵素成分として、糖化液側に分離された活性量に相当する新しい酵素活性成分を追加した酵素混合物を用いることが好ましい。これにより再糖化に用いる酵素活性量を、より精密に制御・規定することができる。

　また、基質固形物への吸着にて回収した酵素成分に、固－液分離工程で糖化液側に分離された酵素活性成分を濾別又は樹脂精製により回収した酵素活性成分を追加した酵素混合物とすることも好ましい。これにより酵素追加の必要が無くなり、酵素の使用量を大幅に低減させることができる。なお、分離された酵素活性成分を濾別又は樹脂精製する方法としては、酵素活性成分を回収可能な膜装置又は樹脂カラムを使用すればよく、例えば、旭化成社製「マイクローザペンシル型モジュールＡＣＰ－００１３Ｄ」等を挙げることができる。

　各酵素の活性回収値は通常用いられる方法をそのまま使用して得ることができる。例えば、β－グルコシダーゼ活性値は、基質セロビオースの分解速度をＨＰＬＣにて定量することで決定した値とすればよい。また、エンドグルカナーゼ活性値は、基質Ａｚｏ―ＣＭ―Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅの分解活性を５９０ｎｍの吸光度変化を測定して決定した値とすればよい。これら活性値を最初に投入した酵素濃度に相当する酵素標準液と比較し、酵素活性回収率を算定することができる。

　この回収酵素混合物に更に基質としてのリグノセルロース原料又はその前処理品を追加し、最初の糖化反応条件と一致するように水にて濃度を調整の上、ｐＨ温度を制御し攪拌しながら再糖化反応を行う。
　以上の一連の酵素糖化、酵素回収、再糖化は、繰り返し実施することができ、酵素の活性が維持される期間内において触媒コストを低減し続けることが可能になる。

　以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。また特に断らない限り、「％」は質量％を意味する。
［実施例１］　リグノセルロース原料の前処理
　リグノセルロース含有物として広葉樹クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を用意した（以降、「リグノセルロース原料」、「パルプ」、及び、「ＬＢＫＰ」の各文言は、同一のものを意味し、互いに交換可能に用いられる）。ガラスビーカーにＬＢＫＰを取り固形分濃度１０％［ｗ／ｗ］となるように水で希釈し、続いて硫酸を終質量濃度０．５％で添加した。ＬＢＫＰ－硫酸溶液の入ったビーカーを、オートクレーブにて１３０℃、４時間加熱した。冷却後、ＮａＯＨ、及び、クエン酸緩衝液（終濃度２０ｍＭ）にてｐＨ５．０に調整し、リグノセルロース原料前処理品とした。このリグノセルロース原料前処理品を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、ヘミセルロース成分の８８％が可溶性のキシロースに分解され、フルフラールの生成量は原料の乾燥質量の０．５％に止まることを確認した。
〈分析条件〉
分析機器：　日本分光ＨＰＬＣ
カラム　：　ＵＬＴＲＯＮ　ＰＳ－８０Ｈ　
（３００×８　ｍｍ；　信和化工株式会社製）
分析温度：５０℃
移動相　：　過塩素酸水溶液　ｐＨ２．１

［実施例２］　リグノセルロース原料への酵素の吸着試験
　リグノセルロース原料、及びリグノセルロース原料前処理品に対する酵素の吸着性を其々調べた。酵素としてエンドグルカナーゼ、セロビオヒドラターゼ、β-グルコシダーゼ、及び、ヘミセルラーゼを含む市販のセルラーゼ水溶液（商品名：Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１０００、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）を用いた。用いたセルラーゼ水溶液の蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した結果は２．５質量％であった。

　フラスコを用い、２０ｍＭのクエン酸緩衝液中に、セルラーゼ水溶液とリグノセルロース原料前処理品を、蛋白質質量：リグノセルロース原料前処理品固形分質量比が、１：１３、１：４０、１：６７、１：１２０、1：２００となるように加えた。フラスコを４５℃にて緩やかに攪拌し、１分後に吸着試験液を回収、７０００×ｇで遠心した上清を取得した。遠心上清中の蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定し、吸着処理を加えていないセルラーゼ水溶液の蛋白質濃度と比較した。
　同じく２０ｍＭのクエン酸緩衝液中に、セルラーゼ水溶液とＬＢＫＰ（未処理品）を、蛋白質質量：ＬＢＫＰ固形分質量比が、１：１３、１：４０、１：６７、１：１２０、1：２００となるように加えた。フラスコを４５℃にて緩やかに攪拌し、１分後に吸着試験液を回収、７０００×ｇで遠心した上清を取得した。遠心上清中の蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定し、吸着処理を加えていないセルラーゼ水溶液の蛋白質濃度と比較した。
　以上の検討での酵素活性成分全蛋白質量のリグノセルロース原料、及びリグノセルロース原料前処理品を用いた吸着回収率を表１に示す。

［実施例３］　リグノセルロース原料、及びその前処理品の酵素糖化
　セパラブルフラスコに、固形分濃度１０質量％のパルプ未処理品、２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を装入し、セルラーゼ水溶液（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１０００）を終体積濃度２％（終蛋白質濃度０．０５質量％）にて添加した後、４５℃にて緩やかに攪拌して糖化反応を行った。

　同様にセパラブルフラスコに固形分濃度１０質量％のリグノセルロース原料前処理品（ｐＨ５．０）を装入し、セルラーゼ水溶液を終体積濃度２％にて添加した後、４５℃にて緩やかに攪拌して糖化反応を行った。一定時間毎に反応液をサンプリングし、生成単糖量（グルコース、及び、キシロースの合計）を実施例１と同様にＨＰＬＣにて分析した結果を図１及び表２に示す。なお図１において破線は未処理品の酵素糖化反応の結果を示し、実線は前処理品の酵素糖化反応の結果を示す。
　表２及び図１に示されるように、パルプ未処理品を用いた酵素糖化反応結果と比較し、リグノセルロース原料前処理品を用いた結果では顕著に反応速度が向上していた。

［実施例４］　酵素の回収（１）
　実施例３のリグノセルロース原料前処理品の酵素糖化液から、以下の方法で酵素を回収した。
　酵素糖化液（９６時間反応液）に、終固形分濃度２質量％（酵素蛋白質量の４０倍質量）になるようにリグノセルロース原料前処理品を添加し、４５℃、１時間、緩やかに攪拌した。この吸着処理液を回収し、７０００×ｇで遠心した沈殿物を回収した。
　一方の遠心上清中の蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定し、沈殿物側に酵素蛋白質の８１質量％が吸着回収されたものと見なした。また上清中のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、並びに、セロビオース等基質の分解を実施例１と同様のＨＰＬＣを用いた活性分析より、未回収の主要酵素成分はβ-グルコシダーゼであり、元のセルラーゼ水溶液に含まれるβ-グルコシダーゼ活性の５８％が上清側に流失していることを確認した。上清側の単糖液量は１反応当りの生成単糖として、図３の触媒原単位計算に用いた。

［実施例５］　回収した酵素を用いた前処理リグノセルロース調製品の糖化（１）
　実施例４にて回収した沈殿物、すなわち、酵素の吸着したリグノセルロース原料前処理固形物を用いた再糖化反応を行った。
　セパラブルフラスコに、上記の酵素の吸着したリグノセルロース原料前処理固形物（実測固形分濃度２０質量％）、及び、リグノセルロース原料前処理品を装入し、両試料を合わせたリグノセルロース原料前処理品の終固形分濃度が１０質量％になるように、２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。この溶液に、市販のβ-グルコシダーゼ水溶液（商品名：Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）を終体積濃度０．０８％（＝実施例４で上清側に流失した活性分）添加し、４５℃にて緩やかに攪拌して再糖化反応を行った。
　実施例３、４、５の一連の酵素糖化、酵素回収、再糖化を４回繰り返し行った反応結果を表３及び図２に示す。なお、図２において黒菱形は初発反応、白四角は１回目の再糖化反応、黒三角は２回目の再糖化反応、白丸は３回目の再糖化反応、白三角は４回目の再糖化反応の、それぞれの結果を示す。その場合の触媒原単位（＝〔使用セルラーゼ水溶液質量＋β-グルコシダーゼ水溶液質量〕／〔生成単糖質量〕）の低減の推移を図３に示す。
　図２及び図３、並びに表３に示されるように、本実施例の方法では、酵素回収、再糖化を行っても、初発反応とほぼ同様に糖化を行うことができ、糖化効率を損なうことなく糖化酵素をリサイクルできることがわかった。

［実施例６］　β-グルコシダーゼ未添加での再糖化
　実施例５での回収した酵素を用いた前処理リグノセルロース調製品の糖化実験を、市販のβ-グルコシダーゼ水溶液の添加無しで、即ち吸着回収した酵素のみで実施した。
フラスコに、上記の酵素の吸着したリグノセルロース原料前処理固形物（実測固形分濃度２０質量％）、及び、リグノセルロース原料前処理品を装入し、両試料を合わせたリグノセルロース原料前処理品の終固形分濃度が１０質量％になるように、２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。その後、４５℃にて緩やかに攪拌して再糖化反応を行い、９６時間反応後の生成単糖量をＨＰＬＣにて分析した。

　実施例３、実施例４、実施例６の一連の酵素糖化、酵素回収、β-グルコシダーゼ未添加での再糖化を４回繰り返し行った場合の、其々の９６時間培養後の生成単糖量の推移を図４に示す。なお、図４において破線はβ－グルコシダーゼ未添加の結果を示し、実線は添加した場合（実施例５）の結果を示す。各実験は３回行い、その平均値とエラーバーも示す。実施例５のβ-グルコシダーゼを追加しての再糖化を繰り返した場合の結果（図４、実線グラフ）と比較すると、β-グルコシダーゼを添加しない場合、β-グルコシダーゼの遠心上清側への流失によりリサイクル回数を重ねるに従い単糖生成量が減少していることが分かる。

［実施例７］　酵素の回収（２）
　実施例３と同様にリグノセルロース原料前処理品の酵素糖化を行い、ＨＰＬＣを用いた分析に基づいて、生成単糖濃度が８０質量％に達する前に反応を停止した（推定残余基質固形分濃度２％以上＝酵素蛋白質質量の４０倍質量）。この酵素糖化液を７０００×ｇで遠心し、沈殿物を回収した。
　一方の遠心上清中の蛋白質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定し、沈殿物側に酵素蛋白質の７４質量％が吸着回収されたものと見なした。更に遠心上清中に流失した酵素を回収するため、遠心上清液を市販のＵＦ膜（商品名：マイクローザペンシル型モジュールＡＣＰ－００１３Ｄ、旭化成ケミカルズ株式会社製）にて処理し、液中の８３質量％の酵素蛋白質を回収した。これら操作の合計により、初発の酵素蛋白質投入量の９６質量％が回収されたものと見なした。ＵＦ膜にて濾別した単糖液量は１反応当りの生成単糖として、図５の触媒原単位計算に用いた。

［実施例８］　回収した酵素を用いた前処理リグノセルロース調製品の糖化（２）
　実施例７にて回収した、リグノセルロース原料前処理固形物に吸着した酵素成分、並びに、遠心上清液よりＵＦ膜にて濾別した酵素成分を用いた再糖化反応を行った。
　セパラブルフラスコに、上記酵素が吸着したリグノセルロース原料前処理固形物（実測固形分濃度２０％）と、ＵＦ膜にて濾別した酵素液と、リグノセルロース原料前処理品とを装入し、試料を合わせたリグノセルロース原料前処理品の終固形分濃度が１０質量％になるように、２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈した。その後、４５℃にて緩やかに攪拌して再糖化反応を行った。
　実施例７、８の一連の酵素糖化、酵素回収、再糖化を４回繰り返し行った試行での触媒原単位（＝〔使用セルラーゼ水溶液質量＋β-グルコシダーゼ水溶液質量〕／〔生成単糖質量〕）の推移を表４及び図５に示す。

　表４及び図５に示されるように、酵素添加することにより糖化を繰り返しても糖化効率が低下することがなく、糖化酵素をコスト面及び処理効率面の双方において効果的に利用できることがわかった。

　従って本発明によれば、酵素の使用量を削減可能にして、簡便且つ低コストにリグノセルロース原料から単糖を製造することができる。

　２００９年１１月２７日に出願された日本国特許出願第２００９－２７０８３９号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims

　リグノセルロース原料及び糖化酵素から得られた糖化液を得ること、
　前記糖化液中の糖化酵素を、リグノセルロース原料に吸着させて回収すること、及び
　回収された前記糖化酵素を用いて、リグノセルロース原料を糖化すること、
　を含むリグノセルロース原料から単糖を製造する単糖製造方法。
　前記リグノセルロース原料が、広葉樹クラフトパルプ、針葉樹クラフトパルプ、機械パルプ、草本由来パルプ、古紙、若しくはペーパースラッジ、またはこれらの混合物である請求項１記載の製造方法。
　前記リグノセルロース原料が、酸性条件下で加熱処理を行った後に中和する前処理で得られた前処理原料である請求項１又は請求項２記載の製造方法。
　前記前処理原料中のヘミセルロース含量が、前処理前の５０質量％以下である請求項３記載の製造方法。
　前記前処理原料中のフルフラールが、前処理原料の乾燥質量の１質量％以下である請求項３又は請求項４記載の製造方法。
　前記リグノセルロース原料が、以下の（ａ）～（ｄ）を含む前処理で得られた前処理原料である請求項１～請求項５のいずれか１項記載の製造方法：
　（ａ）　リグノセルロース原料の固形分濃度が８質量％～３０質量％である原料液を得ること；
　（ｂ）　前記原料液を、終濃度０．２質量％～１２質量％の鉱酸により酸性化すること；
　（ｃ）　酸性化された原料液を８０℃～１５０℃にて１時間～６時間インキュベートすること；
　（ｄ）　前記インキュベート後の原料液を、２０℃～８０℃下でｐＨ３～８に調整すること。
　前記鉱酸が、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸又はこれらの組み合わせである請求項６記載の製造方法。
　前記回収が、以下の（ｅ）～（ｈ）を含む請求項１～請求項７のいずれか１項記載の製造方法：
（ｅ）　前記糖化液と、前記糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の４０倍以上の固形分質量のリグノセルロース原料との混合液を得ること；
（ｆ）　２０℃～８０℃にて１分～３時間インキュベートすること；
（ｇ）　前記インキュベート後の混合液を、糖化液と、固形分として酵素が吸着したリグノセルロース原料とに固－液分離すること；
（ｈ）　分離された前記リグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として回収すること。
　前記回収が、以下の（ｉ）～（ｋ）を含む請求項１～請求項７のいずれか１項記載の製造方法：
（ｉ）　糖化反応を、前記糖化酵素の酵素活性成分の全蛋白質質量の４０倍以上の固形分質量のリグノセルロース原料が残存する条件で停止させること；
（ｊ）　反応停止後の反応液を、糖化液と、固形分として未反応のリグノセルロース原料とに固－液分離すること；
（ｋ）　分離された前記リグノセルロース原料を、酵素－基質複合体として回収すること。
　前記固－液分離の際に液側に分離される酵素活性成分の糖化酵素を追加して、前記糖化を行うことを含む請求項８又は請求項９に記載の製造方法。
　前記固－液分離の際に液側に分離される酵素活性成分の糖化酵素が、β－グルコシダーゼを含む請求項１０記載の製造方法。
　前記液側に分離される酵素活性成分の糖化酵素が、前記固－液分離で糖化液側に分離された酵素活性成分を濾別又は樹脂精製により回収したものである請求項８又は請求項９記載の製造方法。
　前記糖化酵素が、セルラーゼ及びヘミセルラーゼからなる群より選択された少なくとも一方である請求項１～請求項１２のいずれか１項記載の製造方法。
　前記セルラーゼが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドラターゼ及びβ－グルコシダーゼの各活性を有する酵素混合物である請求項１３に記載の製造方法。
　前記ヘミセルラーゼが、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各活性を有する酵素混合物である請求項１３又は請求項１４記載の製造方法。