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WO2011048566A9 - Moyens pour induire l'apomixie chez les plantes cultivées à reproduction sexuée et utilisation pour la production de plantes totalement ou partiellement apomictiques - Google Patents

Moyens pour induire l'apomixie chez les plantes cultivées à reproduction sexuée et utilisation pour la production de plantes totalement ou partiellement apomictiques Download PDF

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WO2011048566A9
WO2011048566A9 PCT/IB2010/054769 IB2010054769W WO2011048566A9 WO 2011048566 A9 WO2011048566 A9 WO 2011048566A9 IB 2010054769 W IB2010054769 W IB 2010054769W WO 2011048566 A9 WO2011048566 A9 WO 2011048566A9
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WO
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plants
gene
apomictic
partially
maize
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Inventor
Daniel Grimanelli
Olivier Leblanc
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Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
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Priority to MX2012004639A priority patent/MX2012004639A/es
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/829—Female sterility

Definitions

  • the invention relates to means for regulating reproductive development in cultivated plants. More particularly, the subject of the invention is the development of plants that reproduce totally or partially by gametophytic apomixis, that is to say asexually via seeds.
  • Gametophytic apomixis is a form of asexual reproduction by seed. It exists in many angiosperms, and nearly 400 apomictic species have been identified. However, apomictic plants are not found in the main cereals grown (maize, wheat, or rice), but only in wild plants, some forage species, and some fruit species. Apomixis is a genetically controlled mechanism. Apomictic plants develop female gametes without previous meiosis. The gametes thus formed contain a genome identical to that of the somatic tissues from which they are derived. The development of the embryo from these gametes is done without fertilization by a male gamete, ie by parthenogenesis. The genome of the embryo thus formed is therefore strictly identical to that of its parent plant, without paternal contribution. Apomixis is therefore a mode of cloning by seed that ensures the perpetuation of identical genotypes across generations.
  • apomixis in a controlled manner in cultivated species offers many potential applications. These applications concern the propagation of unstable genotypes, the control of pollen contaminations, plant breeding methods, and commercial seed production methods.
  • the invention therefore relates to the use of specific nucleotide sequences whose manipulation allows the development of cultivated plants such as maize, rice and wheat and reproducing totally or partially gametophytic apomixis.
  • the invention aims to use apomixis in a controlled manner in cultivated species with sexual reproduction to develop many applications as will be explained below.
  • the invention thus aims, for the production of partially or totally apomictic plants, the use of a gene from the Argonaute family, a transcript of this gene or its ORF.
  • the invention relates to the use of a gene of the Argonaute family responding to the sequence SEQ ID No. 2 or the transcript of such a gene corresponding to the sequence SEQ ID No. 3, or the ORF of sequence SEQ ID No. 4.
  • the gene defined above is inactivated by mutagenesis.
  • the invention also relates to a method for inducing in cultured species such as maize, rice or wheat an entirely or partially apomictic phenotype, characterized in that it comprises the targeted inactivation, by a transposable element, for example of Mutator type. a gene, a transcript of this gene, or its ORF, as defined above, and the identification of the mutated locus.
  • apomixis in a controlled manner in cultivated species offers many potential applications. They concern the propagation of unstable genotypes, the control of pollen contaminations, methods of plant breeding, and commercial seed production methods.
  • the first application concerns the clonal propagation, by seed, of genetically unstable genotypes. This is the case in particular of all hybrid plants; these plants Hybrids produce by genetic mixing during meiosis and fertilization progenies that are different from each other, and different from their parent plant. This is still the case for cultivated species with unstable ploidy levels in meiosis, such as triploid forms.
  • Apomixis also offers new perspectives in plant breeding. It would make it possible to use as a new variety any genotype selected as interesting, since it is a genetically determined criterion, whatever the genetic structure, since this one, since it is apomictic, becomes genetically stable. It is therefore possible to develop varieties directly from hybrid forms, possibly interspecific ones, by avoiding the stabilization steps currently required, such as the successive stages of self-fertilization, or the production of doubled haploids. This method therefore saves a considerable amount of time, but also opens the door to the introduction of genetic materials that are totally new to selection programs, and in particular to genetic materials that, in sexual plants, induce high sterility. This is the case, for example, with most interspecific crosses. A very important application is the production of hybrid seeds.
  • apomictic plants In the case of apomictic plants, however, one could consider producing the seeds directly from hybrids, thus with much higher yields, using 100% of the available area, without the need to control pollination, and without castration.
  • the interest of using apomixis for seed production is very significant in species such as maize, where hybrid forms are already produced, for reasons of cost reduction, but also in self-pollinated species, such as for example, wheat or rice, where large-scale controlled hybridizations are difficult.
  • the production of some apomictic hybrids would be sufficient to initiate large-scale production of hybrid, genetically stable seeds.
  • Plants or seeds of partially or totally apomictic plants of cultivated species such as maize, rice and wheat, characterized in that they comprise inactivated alleles, of a gene as defined above also fall within the scope of the invention. the invention.
  • the plant seed plants of the invention are advantageously as obtained by inactivation of the gene by mutagenesis or according to the method as defined above, to induce in cultivated plants an entirely or partially apomictic phenotype.
  • FIGS. 1 to 5 represent, respectively,
  • FIGS. 1A to 1C the results relating to the identification of apomeiotic plants in maize by a genetic screen
  • FIG. 2 the results of the cytological analysis of the mutant FNR4
  • FIG. 3 the phylogenetic tree of the multigene family comprising the mutant
  • FIG. 4 the structure of the FNR4 gene and the sites of insertions of the transposable elements in the various available alleles.
  • FIG. 5 the expression profile of FNR4. DEFINITIONS
  • Gametophytic apomixis refers to a form of asexual seed reproduction in which the gametes produced in female gametophytes have not undergone meiotic reduction, and therefore have the same ploidy and genetic makeup as the parent plant. Gametophytic apomixis involves two successive stages: apomeiosis and parthenogenesis.
  • the image is obtained by immunolocalization on the one hand of a specific antibody against beta tubulin, revealed by a secondary antibody coupled to a fluorochrome (visible in green), and by a labeling of DNA with propidium iodide (visible in red).
  • W23 is a wild line.
  • the sequences of 3 mutant alleles, SEQ ID No. 7-9, comprising the Mutator insertion sequence, are given at the end of the description,
  • the apomeiotic phenotype of the mutant FNR4 resulting from the random insertion of a mutator-like transposable element into the genome the known sequence of Mutator elements was used to identify the mutated locus by a conventional co-segregation analysis between the mutant. phenotype and insertion sites of different Mutator elements.
  • a candidate sequence could thus be identified and cloned.
  • the identified locus corresponds well to the one responsible for the apomeiotic phenotype.
  • the comparison of the locus sequence with the public databases makes it possible to associate a biological function with this gene. It appears unambiguously as belonging to a multigene family, comprising about twenty loci, all identified as coding for Argonaute type proteins.
  • the sequences of the gene correspond respectively to the sequences SEQ ID Nos. 2, 3 and 4 and that of the protein corresponding to SEQ ID No. 1.
  • a phylogenetic tree comparing the protein sequence of FNR4 and that of other known Argonauts in maize and Arabidopsis is shown in Figure 3. It includes known members in Arabidopsis (AGOOOX) and maize (AGOIOX). The position in this MEL1 gene tree, another Argonaute gene, described in rice as involved in the regulation of meiosis is also indicated. The phenotype of a mutant mell is very different from fnr4, but it is important to note that it is otherwise a clearly distinct Argonaut.
  • Figure 4 gives the structure of the FNR4 gene and the insertion sites of transposable elements in the different available alleles.
  • the RT-PCR method was used to analyze the expression profile of the gene. The results show that the gene is constitutively expressed in all analyzed tissues (leaves, mature pollen, pre-meiotic eggs, ovules during meiosis, ovules during gametogenesis, mature eggs before fertilization).
  • FIG. 5 A: Expression in maize of the transcripts of the protein. The specificity of the antibody used is validated by the use of mutant lines.
  • the protein detected unlike RNA, is only found in eggs, before and during meiosis. A residual presence is visible in the post-meiosis eggs, but no protein is detected in the other tissues of the plant.
  • the specificity of the antibody for the protein of the FNR4 locus was verified by testing in parallel the presence of the protein on ovules of mutant plants. The signal of the antibody disappears completely in the mutants, indicating excellent specificity. This shows that the mutant plants correspond to a loss of function. Immuno localization techniques were then used to study the localization of the protein at the tissue level. The results, shown in Figure 5B, indicate that the protein is located exclusively in the reproductive cells of the egg. The gene is therefore constitutively expressed in the plant, but regulated post-transcriptionally, the corresponding protein having an exclusive expression profile of the reproductive cells.
  • the expression profile of the gene in hybrid apomictic ecotypes between maize and Tripsacum has also been studied. These apomictic hybrid plants, obtained by crossing sexed maize plants and Apomictic Tripsacum, present the genome of both species in the same cytoplasm. Using primers that can detect both maize and Tripsacum alleles; the expression profile of the gene is verified in the somatic and reproductive tissues of these plants. It is found that the transcripts detected by RT-PCR are absent from the apomictic forms.
  • AAAACAATAAACCATGCATTGTACGGTGACTGCGTCTAGGGAAAATTATACCGC ATGCTAGCAAAACGTCCTCCAGTATTTCATTAGACACATTGGTGTCAACCTAATA TCCTATTTGTTGTCGTTCCAACTAACCCCCTCTTATAGTGCTACAACACTATCATC TATGTGATGGTTTTACTCGTGATACCTCACTTACAGGTGAAAATAAGACCCTC

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Abstract

L'invention vise l'utilisation pour produire des plantes partiellement ou totalement apomictiques d'un gène de la famille Argonaute, d'un transcript de ce gène ou de son ORF. Application pour utiliser de manière contrôlée l'apomixie chez des espèces cultivées à reproduction sexuée.

Description

Moyens pour induire l'apomixie chez les plantes cultivées à reproduction sexuée et utilisation pour la production de plantes totalement ou partiellement apomictiques.
L'invention a pour objet des moyens pour réguler le développement reproducteur chez les plantes cultivées. Plus particulièrement, l'invention a pour objet le développement de plantes se reproduisant totalement ou partiellement par apomixie gamétophytique, c'est-à-dire de manière asexuée par l'intermédiaire de graines.
L'apomixie gamétophytique est une forme de reproduction asexuée par graine. Elle existe chez de nombreuses angiospermes, et près de 400 espèces apomictiques ont été recensées. On ne trouve cependant pas de plantes apomictiques chez les principales céréales cultivées (maïs, blé, ou riz), mais uniquement chez des plantes sauvages, quelque espèces fourragères cultivées, et certaines espèces fruitières. L'apomixie est un mécanisme contrôlé génétiquement. Les plantes apomictiques développent les gamètes femelles sans méiose préalable. Les gamètes ainsi formés contiennent un génome identique à celui des tissus somatiques dont ils sont dérivés. Le développement de l'embryon à partir de ces gamètes se fait sans fécondation par un gamète mâle, c'est à dire par parthénogenèse. Le génome de l'embryon ainsi formé est donc strictement identique à celui de sa plante mère, sans contribution paternelle. L'apomixie est donc un mode de clonage par graine qui assure la perpétuation à l'identique des génotypes au travers des générations.
L'utilisation de l'apomixie de manière contrôlée chez les espèces cultivées offre de nombreuses applications potentielles. Ces applications concernent la propagation de génotypes instables, le contrôle des contaminations polliniques, les méthodes d'amélioration des plantes, et les méthodes de production commerciale de graines.
Aucune des ces applications n'est envisageable chez les principales espèces cultivées telles le blé, maïs, riz, et autres sur la base des technologies actuelles. On ne connaît en effet pas de formes apomictiques chez ces différentes espèces, et on ne connaît aucun système génétique qui permette d'induire de l'apomixie chez des plantes sexuées.
De nombreux laboratoires se sont attachés, au cours des années passées, à développer des plantes apomictiques, soit en tentant de transférer les déterminants de l'apomixie depuis des plantes sauvages vers des plantes cultivées, soit en induisant par mutagenèse des phénotypes apomictiques chez des plantes sexuées. Aucune de ces deux approches n'a produit de génotype apomictique chez une espèce où ce mode de reproduction n'existait pas antérieurement. Des résultats publiés récemment dans la revue Nature (Ravi, M., Marimuthu, M.P., and Siddiqi, I. (2008). Gamète formation without meiosis in Arabidopsis. Nature 451 : 1121- 1124.), montrent chez Arabidopsis que l'inactivation d'un gène impliqué dans la méiose, appelé DYAD, dont la fonction est de réguler la cohésion des chromatides durant la méiose, permet de produire environ 0,1% de gamètes qui échappent à la méiose. Le reste des gamètes, et donc 99,9% des descendances, sont stériles. Il est même probable que la fréquence de gamètes non-méiotiques ne soit pas significativement différente chez ces plantes mutantes de celle chez des plantes sexuées, et que ces gamètes n'apparaissent en fait à l'observation que parce que la mutation tue par ailleurs tous les gamètes normalement issus de sexualité. Un autre travail récent (Erfurth, I., Jolivet, S., Froger, N., Catrice, O., Novatchkova,
M., and Mercier, R. (2009). Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol. 7: el000124), montre qu'il est possible, chez Arabidopsis, de changer la division méiotique en division mitotique par l'inactivation simultanée de trois gènes impliqués dans la méiose (osdl/Atspol 1- 1/Atrec8). Le triple mutant produit des gamètes diploïdes fonctionnels. Ces gamètes sont cependant fécondés, les descendances ne sont donc pas apomictiques, et on ne sait pas si ce résultat est transposable chez d'autres espèces qu' 'Arabidopsis .
Les travaux des inventeurs dans le domaine ont montré qu'il est possible d'induire un phénotype tout ou partiellement apomictique chez le maïs en manipulant l'expression de gènes particuliers. Les graines produites échappent à la réduction méiotique et sont fertiles. Ces résultats s'appliquent avantageusement aux autres plantes cultivées telles que le riz ou le blé.
L'invention vise donc l'utilisation de séquences de nucléotides spécifiques dont la manipulation permet le développement de plantes cultivées telles que maïs, riz et blé et se reproduisant totalement ou partiellement par apomixie gamétophytique.
Elle a également pour but de fournir une méthode de production de plantes apomictiques. Selon encore un autre aspect, l'invention vise à utiliser de manière contrôlée l'apomixie chez des espèces cultivées à reproduction sexuée pour développer de nombreuses applications comme il sera exposé ci-après. L'invention vise ainsi, pour la production de plantes partiellement ou totalement apomictiques, l'utilisation d'un gène de la famille Argonaute, d'un transcrit de ce gène ou de son ORF.
Il s'agit plus spécialement d'un gène de la famille Argonaute codant pour une protéine de séquence SEQ ID N° 1.
Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un gène de la famille Argonaute répondant à la séquence SEQ ID N°2 ou du transcrit d'un tel gène répondant à la séquence SEQ ID N°3, ou de l'ORF de séquence SEQ ID N°4.
Dans l'utilisation selon l'invention, le gène défini ci-dessus est inactivé par mutagénèse.
Une telle inactivation permet la formation de gamètes d'origine apoméiotique. Les plantes dont la protéine est inactive se reproduisent de manière apoméiotique.
L'invention vise également une méthode pour induire dans les espèces cultivées telles que maïs, riz ou blé un phénotype tout ou partiellement apomictique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inactivation ciblée, par un élément transposable, par exemple de type de Mutator d'un gène, d'un transcrit de ce gène, ou de son ORF, tels que définis ci-dessus, et l'identification du locus muté.
L'utilisation de l'apomixie de manière contrôlée chez les espèces cultivées offre de nombreuses applications potentielles. Elles concernent la propagation de génotypes instables, le contrôle des contaminations polliniques, les méthodes d'amélioration des plantes, et les méthodes de production commerciale de graines.
La première application concerne la propagation clonale, par graine, de génotypes génétiquement instables. C'est le cas en particulier de toutes les plantes hybrides; ces plantes hybrides produisent, par brassage génétique au cours de la méiose et de la fécondation des descendances qui sont différentes entre elles, et différentes de leur plante mère. C'est encore le cas des espèces cultivées présentant des niveaux de ploïdie instables en méiose, comme les formes triploïdes.
Chez certaines espèces cultivées, il faut, pour maintenir un haut niveau de pureté génétique, contrôler rigoureusement la pollinisation, pour éviter une contamination par du pollen issu de champs voisins, plus ou moins éloignés, le pollen pouvant se déplacer sur des distances assez variables, fonctions de l'espèce, des conditions climatiques, ou des vecteurs de dissémination comme les insectes. Dans le cas de plantes apomictiques, cependant, le génome issu des gamètes mâles ne participe pas à la génération suivante. L'utilisation de plantes apomictiques permettrait donc de s'affranchir des risques de contamination. L'apomixie est donc une méthode totalement unique de contrôle de pureté génétique. C'est aussi potentiellement une méthode efficace pour éviter les flux indésirables de transgènes dans le cas de culture d'organismes génétiquement modifiés.
L'apomixie offre aussi de nouvelles perspectives en amélioration des plantes. Elle permettrait en effet d'utiliser comme variété nouvelle tout génotype sélectionné comme intéressant, dès lors qu'il s'agit d'un critère génétiquement déterminé, quelle qu'en soit la structure génétique, puisque celui-ci, dès lors qu'il est apomictique, devient génétiquement stable. On peut donc envisager de développer des variétés directement à partir de formes hybrides, éventuellement interspécifiques, en s 'affranchissant des étapes de stabilisation actuellement nécessaires, comme les étapes d'auto fécondation successives, ou la production d'haploïdes doublés. Cette méthode permet donc un gain de temps considérable, mais ouvre aussi la porte à l'introduction de matériels génétiques totalement nouveaux dans les programmes de sélection, et en particulier de matériels génétiques qui, chez des plantes sexuées, induisent une forte stérilité. C'est le cas par exemple de la plupart des croisements interspécifiques. Une application très importante concerne la production de graines hybrides. Telle qu'elle se pratique aujourd'hui, celle-ci implique l'hybridation contrôlée à large échelle d'écotypes parentaux génétiquement stables. Il s'agit généralement de lignées homozygotes, obtenues par différentes méthodes (production d'haploïdes doublés, auto fécondations...). L'un des deux parents est utilisé comme mâle, l'autre comme femelle. Seules les femelles produisent les graines commerciales. Le rendement des parcelles de production de semences est généralement faible comparativement aux hybrides, pour trois raisons: (1) les lignées mâles sont nécessaires mais utilisent une part importante de l'espace sans produire de graines; (2) les lignées parentales ont généralement un rendement très inférieur aux hybrides du fait de la dépression de consanguinité ; (3) le contrôle des pollinisations implique la castration physique ou génétique des lignées utilisées comme femelle, un processus qui entraîne une perte de rendement importante. Dans le cas de plantes apomictiques, cependant, on pourrait envisager de produire les graines directement à partir d'hybrides, donc avec des rendements très supérieurs, en utilisant 100% de la surface disponible, sans nécessité de contrôler la pollinisation, et sans étape de castration. L'intérêt d'utiliser l'apomixie pour la production de graine est très significatif chez les espèces comme le maïs, ou l'on produit déjà des formes hybrides, pour des raisons de diminution de coûts, mais aussi chez les espèces autogames, comme par exemple le blé ou le riz, où les hybridations contrôlées à large échelle sont difficiles. La production de quelques plantes hybrides apomictiques serait suffisante pour initier la production à large échelle de graines hybrides, génétiquement stables.
Les plantes ou graines de plantes partiellement ou totalement apomictiques d'espèces cultivées telles que le maïs, riz et blé, caractérisées en ce qu'elles comprennent des allèles inactivés, d'un gène tel que défini ci-dessus entrent également dans le champ de l'invention.
Les plantes en graines de plantes de l'invention sont avantageusement telles qu'obtenues par inactivation du gène par mutagénèse ou selon la méthode telle que définie ci-dessus, pour induire dans les cultivées un phénotype tout ou partiellement apomictique.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés à titre illustratif dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 5, qui représentent, respectivement,
- les figures 1A à 1C, les résultats relatifs à l'identification de plantes apoméiotiques chez le maïs par une crible génétique ;
- la figure 2, les résultats de l'analyse cytologique du mutant FNR4 ;
- la figure 3, l'arbre phylogénétique de la famille multigénique comprenant le mutant
FNR4 ;
- la figure 4, la structure du gène FNR4 et les sites d'insertions des éléments transposables dans les différents allèles disponibles ; et
- la figure 5, le profil d'expression de FNR4 . DEFINITIONS
«Apomixie gamétophytique» se réfère à une forme de reproduction asexuée par graines dans laquelle les gamètes produits dans les gamétophytes femelles n'ont pas subi de réduction méiotique, et présentent donc la même ploïdie et la même constitution génétique que la plante mère. L'apomixie gamétophytique implique deux étapes successives: apoméiose et parthénogenèse.
«L' apoméiose» correspond aux mécanismes par lesquels les plantes apomictiques échappent à la méiose. la «parthénogenèse» correspond au développement des embryons sans fécondation et sans contribution génétique paternelle. EXEMPLE 1 : Identification de plantes apoméiotiques par un crible génétique ciblé
Les résultats obtenus sont illustrés dans les figures IA à IC :
Pour identifier des plantes apoméiotiques, une population de mutagénèse basée sur des éléments transposables de type Mutator, dans un fond génétique diploïde a été construite (Figure 1A). Le crible se base sur la réponse de l'albumen à une divergence dans les niveaux de ploïdie respectifs des gamètes mâles et femelles.
Lorsque chez une plante de maïs sauvage, une femelle diploïde est croisée par un mâle tétraploïde, il en résulte un avortement précoce du développement de l'albumen, et donc de la graine.
Les résultats obtenus sont illustrés dans la Figure 1B. Lorsque les gamètes sont au même niveau de ploïdie (haploïdes tous les deux, ou diploïdes tous les deux), la graine se développe normalement. Dans ce crible, une plante tétraploïde a été utilisée comme mâle, et 15000 plantes mutagénisées comme femelles. La recherche à porté sur les plantes qui, du fait de l'absence de réduction méiotique induite par mutation, produisent des gamètes eux-mêmes diploïdes, et donc en équilibre avec la contribution génomique des gamètes mâles diploïdes produits par le pollinisateur. Dans ce crible, la très grande majorité des plantes présentaient la réponse attendue, c'est à dire d' avortement du développement de la graine. Dans le cas du mutant fnr4 (Female Non Réduction 4), cependant, le croisement avec un testeur tétraploïde conduit à la formation de graines normalement développées. En analysant ces graines normalement développées, par une analyse classique de cytométrie de flux (Figure 1C), on vérifie que l'embryon de ces graines présente un génome tétraploïde, donc issu de la fusion de deux gamètes diploïdes. Les plantes mutantes produisent donc bien des gamètes apoméiotiques. L'analyse cytologique du mutant fhr4, rapportée sur la Figure 2, indique que l'échec de la méiose résulte d'un défaut de condensation des chromosomes au cours de la méiose et la désorganisation qui en résulte du réseau de micrdtubules constituant le fuseau méiotique. L'image est obtenue par immunolocalisation d'une part d'un anticorps spécifique contre la tubuline beta, révélée par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (visible en vert), et par un marquage de l'ADN au iodure de propidium (visible en rouge). W23 est une lignée sauvage. Les séquences de 3 allèles mutants, SEQ ID N° 7 - 9, comprenant la séquence d'insertion Mutator, sont données en fin de description,
EXEMPLE 2 : Identification de la fonction altérée chez les plantes mutantes
Le phénotype apoméiotique du mutant FNR4 découlant de l'insertion aléatoire d'un élément transposable de type Mutator dans le génome, la séquence, connue, des éléments Mutator a été utilisée pour identifier le locus muté par une classique analyse de co-ségrégation entre le phénotype et les sites d'insertion des différents éléments Mutator.
Une séquence candidate a ainsi pu être identifiée et clonée. L'analyse de trois mutations indépendantes dans le même gène, toutes issues d'insertions d'éléments transposables, montre un phénotype identique. Le locus identifié correspond donc bien à celui responsable du phénotype apoméiotique. La comparaison de la séquence du locus aux bases de données publiques permet d'associer une fonction biologique à ce gène. Il apparaît sans ambiguïté comme appartenant à une famille multigénique, comprenant une vingtaine de loci, tous identifiés comme codant pour des protéines de type Argonaute. Les séquences du gène (génomique, transcrit et cadre de lecture) correspondent respectivement aux séquences SEQ ID N° 2, 3 et 4 et celle de la protéine correspondante à SEQ ID N°l .
Un arbre phylogénétique comparant la séquence protéique de FNR4 et celle des autres Argonautes connus chez le maïs et chez Arabidopsis est présentée Figure 3. Elle inclue les membres connus chez Arabidopsis (AGOOOX) et le maïs (AGOIOX). La position dans cet arbre du gène MEL1, un autre gène Argonaute, décrit chez le riz comme impliqué dans la régulation de la méiose est également indiquée. Le phénotype d'un mutant mell est très différent de fnr4, mais il est important de noter que c'est par ailleurs un Argonaute clairement distinct.
La Figure 4 donne la structure du gène FNR4 et les sites d'insertions des éléments transposables dans les différents allèles disponibles.
EXEMPLE 3 : Profil d'expression du gène et de la protéine chez les formes sauvages, les mutants apoméiotiques, et les plantes apomictiques.
La méthode de RT-PCR a été utilisée pour analyser le profil d'expression du gène. Les résultats montrent que le gène est exprimé de manière constitutive dans tous les tissus analysés (feuilles, pollen mature, ovules pré-méio tiques, ovules au cours de la méiose, ovules au cours de la gamétogenèse, ovules matures avant fécondation).
En utilisant des peptides de synthèse dessinés sur la base de la séquence de la protéine, des anticorps spécifiques de séquences SEQ IDN°5 et SEQ ID N°6 permettant de visualiser par Western Blot la présence de la protéine sur des extraits échantillonnés à différentes étapes de développement ont été générés. La détection de l'anticorps par immuno-détection, est illustrée Figure 5, A : Expression chez le maïs des transcrits de la protéine. La spécificité de l'anticorps utilisé est validée par l'utilisation de lignées mutantes. B : localisation tissulaire de la protéine, limitée à la partie basale du sac embryonnaire mature ; détection par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (en vert). ADN révélé en bleu. L'examen de la Figure 5 A montre une bande de taille attendue sur la base de la séquence protéique, environ lOOkD. La protéine détectée, contrairement à l'ARN, ne se retrouve que dans les ovules, avant et pendant la méiose. Une présence résiduelle est visible dans les ovules post-méiose, mais aucune protéine n'est détectée dans les autres tissus de la plante. La spécificité de l'anticorps pour la protéine du locus FNR4 a été vérifiée en testant en parallèle la présence de la protéine sur des ovules de plantes mutantes. Le signal de l'anticorps disparaît totalement chez les mutants, ce qui indique une excellente spécificité. Cela montre par ailleurs que les plantes mutantes correspondent bien à une perte de fonction. Des techniques d'immuno localisation ont ensuite été utilisées pour étudier la localisation de la protéine au niveau tissulaire. Les résultats, illustrés Figure 5B, indiquent que la protéine est localisée exclusivement dans les cellules reproductrices de l'ovule. Le gène est donc exprimé de manière constitutive dans la plante, mais régulé post-transcriptionellement, la protéine correspondante présentant un profil d'expression exclusif des cellules reproductrices.
Le profil d'expression du gène dans des écotypes apomictiques hybrides entre maïs et Tripsacum a également été étudié. Ces plantes hybrides apomictiques, obtenues en croisant des plantes de maïs sexuées et des Tripsacum apomictiques, présentent le génome des deux espèces dans un même cytoplasme. En utilisant des amorces capables de détecter à la fois les allèles de maïs et de Tripsacum; on vérifie le profil d'expression du gène dans les tissus somatiques et reproducteurs de ces plantes. On constate que les transcrits détectés par RT- PCR sont absents des formes apomictiques.
SEQ ID No 7 (1/5)
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GTCGGAGCAGTGAGTGGGAGTAGTTCAGGGACTGGGAGAGGAGAGGAAGCAG GACCTGGGAGACCTCGCCTCGTCCGTCCTCCTGCCTACTTCCTTGCTTTTGGTA AGTGAAAGTGATTGAAGTGGAGATGCCTCCAATCTGCAGTGCTGTTTCACGCGT AAACCCTGGCCCCCTCGCCGCTGGAAGCCCCATTGTTCCTCTTTCATTTCTTAC CGCTGATGCAGCTTATGGTTTCCTAGGGTTTTCGAGATATTTGGTTTCTTGCATC CAGAGGACGAAGAGCTTTCATAGGGTTTTCGAGACATTGTCCTCACAATCGCAT CCATTCTGCAGTGCTGTTTCACGCGTAAACCCTAGCCCCTCGTCGCTGGAAGCC CACATGGTTCCTCTTTCATTTCTTACCGCTGATGCAGCTTATGGGTTCCTAGGGT TTTCGAGACATTTGGCTTCTTGCATCCAGAGGACGAAGAGCTTTCCTAGGGTTTT CGAGACATTGTCCTCACAATCGCAGATTTGGTTCGAGACATTTGTTTNNNNNNN NNNCGTCCCGCGCTTGAGTCCTTGTGATCTGCACAGCATGATGCTGCCACCAAA TGCATGCAGTTAGACAAGCTTAATGTTGCATCTGATAAGACTGTACAACAGATTC GTGTGCCAAATGTGTCCTTGCTACTCAAGGAGGTCATATGGAACAAGTAAAACG AAATTTCTGCATCAGCAATCAGGCACAAGACTG AATGACGTGGTTAGTGCCAAT GAGGTGGGGACTTGGGAATGGAATTAGAGTTATAGCTATTCCTATAATTCATCTC ACTACAGAGGCTCTCCATCCTACTAGGACTGTACAACAGATTCGTGTGCCAAAT GTGTCCTTGCTACTCAAGGAGGTCATATGGAACAAGTAAAACAAAATTTCTGCAT CAGCAATCAGGCACAAGACTGAATGACGTGGTTAGTGCCAATGAGGTGGGAAC TTGGGAATGGAATTAGAGTTATAGCTATTCTATAGCTATTCCTATAATTCATCTCA CTACAGAGGCTCTCCATCCTACTAGAATTTAATCTGATAAAGTAGGCAGAAACAT GGAACTTATAATGTCGAAGATTGCATGTATAGAATCTAAGTAACGGAAAGATTCA ACTTTGTGATTATATGCTGCTGTTACATGGTATTGGTAAAACATTCTTTCAAGTGC TCATTGTCTTCCCTTGCAACCAATTCATTGTTGTCCTTGTTTCCTTGCAGGTAGG TGCTGCTTGTTTTATCTTGAAATGGGCTCTCATGATGGCGAGGATGAAGAGTTG CCACCCCCCCCTCCGGTGCCACCAGATGTGATTCCCATTAAAGCTGAAGATGCT GTGGGTGAATCACCAGCAAACCATATATTAAAGCCAAAGAGATTACTGATGGAC AGGCCTGGTATAGGAAGAAAAGGGCAGCCGACCCAGCTCTATTCAAATCACTTT AAAGTCGCTGTGAAGAGTACAGAAGACGTCTTCTTTCACTACTATGTATGTCTGC TGACTGAGTTCATGATCCTTTGTTCAAAATATGTCATTGTCTGTCCCTTGTTTATA ACTAATCTTTGGCTGATGTGATATTGTTATTTTATTTGACTAGGTAAACCTGAAGT ATGAGGATGATCGACCCGTTGATGGTAAAGGGATCGGCAGAAAGGTGATTGATA AACTGCAGCAGACATATCGTGCAGAGCTTTCTAACAAGGACTTTGTATATGATG GAGAAAAGAGCCTGTTTACAGTTGGTGGTCTTCCACAAAAAAAGAATGAGTTCA CCGTTGTCTTGGAGGACGTATCTACTGGAAAGTTAGTTTTAGTCTTTGATCTGCT TTCTTGTTGTTTATGCTTACCCAGAATCAGTAATTGCCATG I I I I I I GTTTGTGGT TGTAGGACTGCTGCCAATGGGAGCCCTGGAGGTAATGACAGTCCTGGAGGTGG TGATAGGAAGAGAGTGAGGAGGCCATACCAGACGAAAACTTTCAAAGTGGAGAT AAATTTTGCAGCAGAGGTTCCTATGAGTGCTATTGGTCAAGTCATTAGAGGCGA AGAATCTGAGAACTCCCTGGAGGCGCTTCGTGTTCTTGATATCATACTGAGGCA GCATTCCGCAGAACAGTATGTAGCTATGCATCTTGATGGATGATTATAGGTAGAT TTGAGGATCTTCTGCAGTTACGACATGACAA I I I I I CTCAATACTTGCAGAGGCT GCCTTTTGGTTAAGCAATCA I I I I I CTACAACAACCCTTCATGCTTTGTTGACTTG GGTGGTGGTGTGATGGGTTGTCGTGGATTTCATTCAAGCTTCCGTGGCACACAG AGTGGACTTTCCCTCAATGTTGGTGCGTGTTCGTCCTGTATGGCTGTATTGGTG CCATGTAACTGCATTGTCTATTCTATAATCTTACATCTTTCATGATCATGATAGCC I I I I I I I I I GAAATCCACAGATGTCTCAACAACAATGATCGTGAAACCTGGCCCT GTTATTGATTTTCTTCTTTCTAACCAGAATGTTAATGATCCTAGCAGAATTGATTG GCAAAAGGTAAATGCCATCTTTGGATGAAACTTCTCGAATAACCATGCTAGTGCA TTGAAATATCTATTTTGATAGAATGATAACACAATTTTGGGGTGTGCATATTCAAT SEQ ID No 7 (3/5)
ACAGGCCAAGCGTGCTCTCAAGGGCTTGAGGATTAGAACCACTCCTGCAAATTC AGAATTCAAGATTTTTGGTCTCAGCGAGAGGATCTGCAAAGAACAAACGTGTGG ACATGTTTTCTTACCGCTCTGTTTATTGTCATGCMGCTTTACTTTACA I I I I I AAA AAATTGTACCCTAGTGTGTTAAGCTTGTTTCAGAAGAATTTTATTTAACAAATATT GCCT7TATTGATTTTGTTCTGATTCCAATGCCAAGCTTGCTTGATGGTGATATCT GTGTGCTTAATTGCTTTCTCATTGACATATGCAATTAGGTTTCCGCTGAGGCAGA GAAATGGTAGCAACGGAGATTGTGATACCATTGAAATAACTGTCTATGACTACTA TGCAAAGAAAGGAATCGATCTAAAGTATTCTGGTGATTTCCCCTGTATAAATACA GGG AAGGCAAAGCGCCCAACATATTTTCCAATCG AGGTTTGTTTCAGTTTTGTTA GTTACATCCTGTCAAATCTCTGTTTATTAAATATATCTTGCATCTCATATTCGATG GGCAGGCTTGGTGGGGCTGTCTCACTGAGTCACTAGGTCGTGGGTTCAAAGCA GCCTCTCCACATTTGTGGGGGGGGGAAGGCTTGCTTCGGTTTATCCCTTCCTTA GACCCTAGGTCTGCCCC I 1 I I I I I GCATCTCA I I I I I I I GTATTGTGTTTCTAGCT ATGCTCGCTTGTTCCGCTTCAAAGATACACCAAAGCTTTGTCTACGCTACAAAGG TCATCCCTTGTGGAGAAGTCTAGACAGAAGCCTGAAGAAAGGATGACCGTTCTA AATGATGTGAGCTGTTACCTTGATTTTAGCATGCTGCGACCATTCATAACTGCAT GGGATTTATTTCTACGACTGAATTAATCAACAGCTTATGATTACCCTAAATGCTA GGCACTGCAACGCAGTAACTACGATTCTGACCCCATGTTGATGTGCNNNNNNNN NNAGGTTGAGGGCATGTGGTGTTTCAGTTGCTCCAAAATTTACCCAAGTTGAAG GAAGGATCCTTCAAGCCCCAAAGGTNNNNNNNNNNGCTTGNNAGAGAATCCTA GGGTGTTTGGATGGAATTCTAGGATTTAAAGA I I I I I I I CCTATCCTGATTGTTAA TATCTCTATGGATCCAAACGCTCCCTTAGTTGTTTTCTCTCTAAATGTTGTACCAA GTCATTATCTCAGTAAAATGCATCTGACTAAATCTAATATCTTGTAGCTGAAAGC CGGCAATGGTGATGATATCTTTTCACGAAATGGACGGTGGAATTTCACTAATAG GGTCAGCAGCTCAACATGTTTC I M i l I AACCTTC I I I I I 1 1 CTTTATTAGGAAGG A l I I I I CTGATGTTTATTTGCCAATACTTTGCCCCTTTCAGAAGTTTTATGAAACC TGCTCTGTGAATAAGTGGGCGGTCGTTAATTTCTCTGCACGTTGTGATGTTCGG AATCTTATCCGTGACCTGATGAGGAATGCATCTGCAAAGGGAATTGTATGGTTTA GCTTTTCACATATCTTCTATTGTAGCAGTTTTCTGCTGCTGACGTTTTCTTCTGGC AGCAAATGGAGGAACCTTTTGATGTGTTTGAAGAGAGTCCCTCTATGAGGCGTG CACCTGTGTCAAGAAGGGTGGATGATATGTTTGGGCAGATAAAATCAAAACTTC CTGGAGCTCCTAGGTTCCTCTTGTGCCTTCTCCCTGAGAGGAAAAATTGTGAAA TCTATGG7TGGTTTA I I I I I I GTTACCACTCCACATAAATATCTCACATCTTGCAA TAATTATACC I I I I I GGTTTCAACCAGGTCCTTGGAAGAGAAAGTGCCTGGCCGA GTTTGGTATTGTCACACAGTGTCTAGCTCCATTAAGAGTCAATGATCCGTACCTG CTTAATTTGCTGATGAAGATCAATGCAAAGGTTTGGGACATGATTTTATCTTTCTT TTGCACTGTATTGTTCCCTGGTTCATGATTATATTATCCTCTTTCCTCTG I I I I I A ACTAGCTTGGTGGTCTGAACTCGTTGCTGCAAGTTGAAGCATCTTCGTCAATAC CACATGTGTCGCAAGTACCCACCATCATCTTAGGTATGGATGTTTCACATGGTCA TCCAGGACAAGATAGACCTTCGGTTGCAGCGGTAAGATGGGTGTACCTTTACTT GTACAATTCTTCTGCCCACATGGAATCTGAGTGGTTTTGTAAAATATGTGAAATG GATGTCTGTTAATCTGATGTAAACCATACCTTTCTTCTTTGTTTAGGTGGTTAGTT CTCGTCAATGGCCTCTTATCTCTAGATATAGAGCATCAGTGCACACCCAATCTGC CAGACTAGAAATGATGTCCTCGTTGTTTAAGCCGCGGGGTACTGATGATGATGG CCTCATCCGGTAAGAGATATCTTCTTAGTATGTTGATGTATGGTAAGCGTGATGA CTTTTGGATGCTAAGTTTATCTTCGTATTTGGGACTTCCAGGGAATCACTGATCG ACTTCTACACTAGCTCTGGAAAGCGAAAACCAGAACACATAATTATTTTCAGGTC TGAAGCTTTGGGGTTÂTTGTTAGCTTGTATCACTAAATC r I I I I GTAGAAACAAAT TC I I I I I I I I G I I I I I GTTTTGAGAAGTATGTATGGTACATTCTTTGCTGGGATGG SEQ ID No 7 (4/5)
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69
15
SEQ ID No 8 (1/5)
TACACAAGAGGAGCGAAGCAAGTTTCATCCAACAGGCTTCATCACGGTGAAACG GGTATACAACGTGGCTTCGGTATAACTCAAAGGAAGTATAACGAAGCACACTTC ATCAAGCAGGCTTCGTCATAACGAAACAATGAGATGCAAGGAGAAGGTGTTACT CAAGTTATTAAATACAACTGACGACATTGCCCTTATGACATATTGTAAACTCTGTA TGTAATTATTGAGGGTATAAATGTAATAGCGTACGAACCCTTGCGATTGTCTATA AATAGATGAACATTACCCCGTACTATTCACGTTGGATTGTAATCGCTCTCGCGTC AACACCTTCAAACAAGCCGAAGATATCACTGCAATATAAATTTTGATAATGTTTAT ATATTTATCATGGAATAAATATATGACTGGATATCACACTCATGTATTTAAATCCT TATTGATATAAATG ATG AGG ATGTGTTATTCACG ACCTTTGTCTG AAG ATTATTAT ATCCGAAAGGAGATA I I I I I I CGAAGGACGAATGTTCTTAACATTTAATAACTGT GTTACCTTGTTCTTGAACATGTGACAAACATTAGGTTTTGAGTATTTCAATTAATA GTGAAATTAAATTAAATTTTAGTTGTCCAAAATGACAGACTTCGATATTTGTTATA ATTGTTGAGTTAAATTTTAACAGCATCCATAAACAAGTAAACAACGACTATGTGT GCACCAGTGTCTCCTGTATCAACGGGGTGGTCCGTCTGGAGGAGGTACCGAGA GATAAGTGCTATTATGGACGAAGAGGGAAGGGGATTCGACGAAATGGAGGCGT TGGCGTTGGCTTCTGTGTTTTGGAGACGCACGCGACAGCCAAACTCCAAAACG GATACGAGACAGCTCTTGGGGCTGCGTAAACAGGTATTAGTTTTCTGTCCCCGT TTACCGTTCCCGTGCGCAGACGCCGTCACGCGTACTCTTCTTGTCTCCGTCGCC GCGCTCTACGGCGGTGCTGGCGTCCGTGCTGTACTCCGCGCCGGCAGAGGCC GCGCGCGCGTCGCCCGCGGACGGCGCCACGCCGCTCCACCTCGCCGCGGCC GTGCACATCCTCCTCGCCGCGGGCGCGTCCGTGGACGCGCGCGCCTTCTCGG GCCTCCGCGCCGGGGACCTCCTCCTCCCGCGCGCCAACGAGGCCGCCGCCGC CGCAGACCGGGCGCTCCGCGTGCTCCTGAAGTTCCCCGCGGCGTCACTGTCG TCCTCGCCCAAGAAGTCCGCCTCGCCGCCGCCGGCCCCGGAGGCGAGGAAGG AGTACCCGCCCGACCTGACGCTGCCGGACCTCAAGAGCGGGCTGTTCAGCACC GACGAGCAACGGACGCACCTTACAGCTGTCCTAGCACTAATTACTCCTAAATTC ATCATACACCAAAGTTTCAATTAGTAAAAGGTTTTGGTATTATTTTCTTTACAAGA CTAAAAGCATCCACTCGTATTTGCCATGGAAATATTGCCAAAATGGTTACCGAAG AACCAATGAAAAATGGCGGTATCCGTCCACCTGTAACTTGTCCAAGGCTCTTCC AGCAGAGTAGTGCCGCCATGACGATTGACAGAGACACGAGACGAAACAAGCAG AAGGTCCCCGCGGCGTCACTGTCGTCCTCGCCCAAGAAGTCCGCCTCGCCGCC GCCGGCCCCGGAGGCGAGGAAGGAGTACCCGCCCGACCTGACGCTGCCGGA CCTCAAGAGCGGGCTGTTCAGCACCGACGAGTTCCGCATGTACAGCTTCAAGG TGAAGCCCTGCTCCCGCACCTACTCGCACAACTGGACCGAGTGCCCTTCGTGC ACCCGGGCGAGAACGCGCGGCGCCGTGACCCGCGCGTACTCCTACAGCTGCG TGCCCTGCCCCGAGTTCCGCAAGGGCCGGCGCTGCCGCAAGGGCGACGGCTG CGAGTACGCGCACGACGTCTTCGAGTGCTGGCTCCACCCCGGCGCAGTACCG GACGCGCCTCTGCAAGGACGAGGTGGGCTGCGCGCGCCGCATCTGCTTCTTC GCGCACAAGCGCGAGGAGCTCCGCGCCGTCAACCCCTCCGCGGTGTTCGTCG GCATGCAGATGCAGCCCACCGTGTCGCCGCCGCCGCCCAACGGCCTCGGCGA CATGCTCAGCCCGGCGGCCTGGCCCTCCTCCCCCGCGAGCAGGCTCAATAAG GCCGCGCTCGGCGGCCGGGACCTGGACCAGTACCAGCACATGTTGTTCGACAA GGTGTCGTCGCCGAGGGCCAGTTGGAGACAAGAAGAGTACGCGTGACGGAGA TGCGACGGAGAAAAAGGGTACGCGTGACGGCGTCTGCACACGGGAACGGTAA ACGGGGACAAGAAACTAATACCTGTTTACGCAGCCCCAAGTGCTGTCTCGTATC CGTTTTGGAGTTTGGCTGTCGCGTGCGTCTCCAAAACAGAGAAGCCAACGCCAA CGCCTCCATTTCGTCGAATCCCCTTCCCTCTTCGTCCATAATGGCAATTATCTCC TCGTGTTCGGTCCCGCCGTTCGAGAGACGAGCTACGCATTTAAGCCGGGGAGG SEQ ID No 8 (2/5)
TCGGAGCAGTGAGTGGGAGTAGTTCAGGGACTGGGAGAGGAGAGGAAGCAGG ACCTGGGAGACCTCGCCTCGTCCGTCCTCCTGCCTACTTCCTTGCTTTTGGTAA GTGAAAGTGATTGAAGTGGAGATGCCTCCAATCTGCAGTGCTGTTTCACGCGTA AACCCTGGCCCCCTCGCCGCTGGAAGCCCCATTGTTCCTCTTTCATTTCTTACC GCTGATGCAGCTTATGGTTTCCTAGGGTTTTCGAGATATTTGGTTTCTTGCATCC AGAGGACGAAGAGCTTTCATAGGGTTTTCGAGACATTGTCCTCACAATCGCATC CATTCTGCAGTGCTGTTTCACGCGTAAACCCTAGCCCCTCGTCGCTGGAAGCCC ACATGGTTCCTCTTTCATTTCTTACCGCTGATGCAGCTTATGGGTTCCTAGGGTT TTCGAGACATTTGGCTTCTTGCATCCAGAGGACGAAGAGCTTTCCTAGGGTTTT CG AG AC ATTGTCCTCAC AATCGCAG ATTTG GTTCG AG ACATTTGTTTN N N N N N N NNNCGTCCCGCGCTTGAGTCCTTGTGATCTGCACAGCATGATGCTGCCACCAAA TGCATGCAGTTAGACAAGCTTAATGTTGCATCTGATAAGACTGTACAACAGATTC GTGTGCCAAATGTGTCCTTGCTACTCAAGGAGGTCATATGGAACAAGTAAAACG AAATTTCTGCATCAGCAATCAGGCACAAGACTGAATGACGTGGTTAGTGCCAAT GAGGTGGGGACTTGGGAATGGAATTAGAGTTATAGCTATTCCTATAATTCATCTC ACTACAGAGGCTCTCCATCCTACTAGGACTGTACAACAGATTCGTGTGCCAAAT GTGTCCTTGCTACTCAAGGAGGTCATATGGAACAAGTAAAACAAAATTTCTGCAT CAGCAATCAGGCACAAGACTGAATGACGTGGTTAGTGCCAATGAGGTGGGAAC TTGGGAATGGAATTAGAGTTATAGCTATTCTATAGCTATTCCTATAATTCATCTCA CTACAGAGGCTCTCCATCCTACTAGAATTTAATCTGATAAAGTAGGCAGAAACAT GGAACTTATAATGTCGAAGATTGCATGTATAGAATCTAAGTAACGGAAAGATTCA ACTTTGTGATTATATGCTGCTGTTACATGGTATTGGTAAAACATTCTTTCAAGTGC TCATTGTCTTCCCTTGCAACCAATTCATTGTTGTCCTTGTTTCCTTGCAGGTAGG TGCTGCTTGTTTTATCTTGAAATGGGCTCTCATGATGGCGAGGATGAAGAGTTG CCACCCCCCCCTCCGGTGCCACCAGATGTGATTCCCATTAAAGCTGAAGATGCT GTGGGTGAATCACCAGCAAACCATATATTAAAGCCAAAGAGATTACTGATGGAC AGGCCTGGTATAGGAAGAAAAGGGCAGCCGACCCAGCTCTATTCAAATCACTTT AAAGTCGCTGTGAAGAGTACAGAAGACGTCTTCTTTCACTACTATGTATGTCTGC TGACTGAGTTCATGATCCTTTGTTCAAAATATGTCATTGTCTGTCCCTTGTTTATA ACTAATCTTTGGCTGATGTGATATTGTTATTTTATTTGACTAGGTAAACCTGAAGT ATGAGGATGATCGACCCGTTGATGGTAAAGGGATCGGCAGAAAGGTGATTGATA AACTGCAGCAGACATATCGTGCAGAGCTTTCTAACAAGGACTTTGTATATGATG GAGAAAAGAGCCTGTTTACAGTTGGTGGTCTTCCACAAAAAAAGAATGAGTTCA CCGTTGTCTTGGAGGACGTATCTACTGGAAAGTTAGTTTTAGTCTTTGATCTGCT TTCTTGTTGTTTATGCTTACCCAGAATCAGTAATTGCCATG I I I I I I GTTTGTGGT TGTAGGACTGCTGCCAATGGGAGCCCTGGAGGTAATGACAGTCCTGGAGGTGG TGATAGGAAGAGAGTGAGGAGGCCATACCAGACGAAAACTTTCAAAGTGGAGAT AAATTTTGCAGCAGAGGTTCCTATGAGTGCTATTGGTCAAGTCATTAGAGGCGA AGAATCTGAGAACTCCCTGGAGGCGCTTCGTGTTCTTGATATCATACTGAGGCA GCATTCCGCAGAACAGTATGTAGCTATGCATCTTGATGGATGATTATAGGTAGAT TTGAGGATCTTCTGCAGTTACGACATGACAA I I I I I CTCAATACTTGCAGAGGCT GCCTTTTGGTTAAGCAATCA I I I I I CTACAACAACCCTTCATGCTTTGTTGACTTG GGTGGTGGTGTGATGGGTTGTCGTGGATTTCATTCAAGCTTCCGTGGCACACAG AGTGGACTTTCCCTCAATGTTGGTGCGTGTTCGTCCTGTATGGCTGTATTGGTG CCATGTAACTGCATTGTCTATTCTATAATCTTACATCTTTCATGATCATGATAGCC I I I I I I I I I GAAATCCACAGATGTCTCAACAACAATGATCGTGAAACCTGGCCCT GTTATTGATTTTCTTCTTTCTAACCAGAATGTTAATGATCCTAGCAGAATTGATTG GCAAAAGGTAAATGCCATCTTTGGATGAAACTTCTCGAATAACCATGCTAGTGCA TTGAAATATCTATTTTGATAGAATGATAACACAATTTTGGGGTGTGCATATTCAAT SEQ ID No 8 (3/5)
ACAGGCCAAGCGTGCTCTCAAGGGCTTGAGGATTAGAACCACTCCTGCAAATTC AGAATTCAAGATTTTTGGTCTCAGCGAGAGGATCTGCAAAGAACAAACGTGTGG ACATGTTTTCTTACCGCTCTGTTTATTGTCATGCAAGCTTTACTTTACA I I I I I AAA AAATTGTACCCTAGTGTGTTAAGCTTGTTTCAGAAGAATTTTATTTAACAAATATT GCCTTTATTGATTTTGTTCTGATTCCAATGCCAAGCTTGCTTGATGGTGATATCT GTGTGCTTAATTGCTTTCTCATTGACATATGCAATTAGGTTTCCGCTGAGGCAGA GAAATGGTAGCAACGGAGATTGTGATACCATTGAAATAACTGTCTATGACTACTA TGCAAAGAAAGGAATCGATCTAAAGTATTCTGGTGATTTCCCCTGTATAAATACA GGGAAGGC AGCGCCCAACATATTTTCCAATCGAGGTTTGTTTCAGTTTTGTTA GTTACATCCTGTCAAATCTCTGTTTATTAAATATATCTTGCATCTCATATTCGATG GGCAGGCTTGGTGGGGCTGTCTCACTGAGTCACTAGGTCGTGGGTTCAAAGCA GCCTCTCCACATTTGTGGGGGGGGGAAGGCTTGCTTCGGTTTATCCCTTCCTTA GACCCTAGGTCTGCCCC I I I I I I I GCATCTCA I I I I I I I GTATTGTGTTTCTAGCT ATGCTCGCTTGTTCCGCTTCAAAG ATACACCAAAGCTTTGTCTACGCTACAAAGG TCATCCCTTGTGGAGAAGTCTAGACAGAAGCCTGAAGAAAGGATGACCGTTCTA AATGATGTGAGCTGTTACCTTGATTTTAGCATGCTGCGACCATTCATAACTGCAT GGGATTTATTTCTACGACTGAATTAATCAACAGCTTATGATTACCCTAAATGCTA G GC ACTGC AACGC AGTAACTACG ATTCTG ACCCC ATGTTG ATGTGCN N N N N N N N NNAGGTTGAGGGCATGTGGTGTTTCAGTTGCTCCAAAATTTACCCAAGTTGAAG GAAGGATCCTTCAAGCCCCAAAGGTNNNNNNNNNNGCTTGNNAGAGAATCCTA GGGTGTTTGGATGGAATTCTAGGATTTAAAGA I I I I I I I CCTATCCTGATTGTTAA TATCTCTATGGATCCAAACGCTCCCTTAGTTGTTTTCTCTCTAAATGTTGTACCAA GTCATTATCTCAGTAAAATGCATCTGACTAAATCTAATATCTTGTAGCTGAAAGC CGGCAATGGTGATGATATCTTTTCACGAAATGGACGGTGGAATTTCACTAATAG GGTCAGCAGCTCAACATGTTTC I I I I ! I AACCTTC I I I I I I I CTTTATTAGGAAGG A l I I I I CTGATGTTTATTTGCCAATACTTTGCCCCTTTCAGAAGTTTTATGAAACC TGCTCTGTGAATAAGTGGGCGGTCGTTAATTTCTCTGCACGTTGTGATGTTCGG AATCTTATCCGTGACCTGATGAGGAATGCATCTGCAAAGGGAATTGTATGGTTTA GCTTTTCACATATCTTCTATTGTAGCAGTTTTCTGCTGCTGACGTTTTCTTCTGGC AGCAAATGGAGGAACCTTTTGATGTGTTTGAAGAGAGTCCCTCTATGAGGCGTG CACCTGTGTCAAGAAGGGTGGATGATATGTTTGGGCAGATAAAATCAAAACTTC CTGGAGCTCCTAGGTTCCTCTTGTGCCTTCTCCCTGAGAGGAAAAATTGTGAAA TCTATGGTTGGTTTA I I I I I I GTTACCACTCCACATAAATATCTCACATCTTGCAA TAATTATACC I I I I I GGTTTCAACCAGGTCCTTGGAAGAGAAAGTGCCTGGCCGA GTTTGGTATTGTCACACAGTGTCTAGCTCCATTAAGAGTCAATGATCCGTACCTG CTTAATTTGCTGATGAAGATCAATGCAAAGGTTTGGGACATGATTTTATCTTTCTT TTGCACTGTATTGTTCCCTGGTTCATGATTATATTATCCTCTTTCCTCTG I I I I I A ACTAGCTTGGTGGTCTGAACTCGTTGCTGCAAGTTGAAGCATCTTCGTCAATAC CACATGTGTCGCAAGTACCCACCATCATCTTAGGTATGGATGTTTCACATGGTCA TCCAGGACAAGATAGACCTTCGGTTGCAGCGGTAAGATGGGTGTACCTTTACTT GTACAATTCTTCTGCCCACATGGAATCTGAGTGGTTTTGTAAAATATGTGAAATG GATGTCTGTTAATCTGATGTAAACCATACCTT CTTCTTTGTTTAGGTGGTTAGTT CTCGTCAATGGCCTCTTATCTCTAGATATAGAGCATCAGTGCACACCCAATCTGC CAGACTAGAAATGATGTCCTCGTTGTTTAAGCCGCGGGGTACTGATGATGATGG CCTCATCCGGTAAGAGATATCTTCTTAGTATGTTGATGTATGGTAAGCGTGATGA CTTTTGGATGCTAAGTTTATCTTCGTATTTGGGACTTCCAGGGAATCACTGATCG ACTTCTACACTAGCTCTGGAAAGCGAAAACCAGAACACATAATTATTTTCAGGTC TGAAGCTTTGGGGTTATTGTTAGCTTGTATCACTAAATC I I I I I GTAGAAACAAAT TC I I I I I I I I G I I I I I GTTTTGAGAAGTATGTATGGTACATTCTTTGCTGGGATGG T/IB2010/054769
18
SEQ ID No 8 (4/5)
ATTATTGATACTTTCTTAGCCGCCGTGGCGTAAATGTAACCATTTGCTGGGTTTT AGGGATGGAGTCAGTGAAAGTCAGTTTACCCAGGTCATCAACATTGAGCTGGAT CAGATCATCGAGGTAATACATTTGTTTGATTCGTCCTTTGCACATTTGCTTGCTTA GTTCAGGAACGAATTGCAAGGTAACACATCCTTGTAATTAATGCAGGCATGTAA GTTTCTGGATGAGAAGTGGTCACCCAAGTTCACTGTGATTGTTGCTCAAAAGAA CCACCACACCAAGTTCTTTCAGACGGCATCACCAGACAATGTTCTTCCTGGTAAT ATGTTTATTTTTGTCATACTAAAGGGAGTGTGGTGAGATGCGGTGACAATAATAA ATGTGTTTGTTTGTTACGCAGGAACTGTGGTGGATAGTAAAGTTTGCCATCCTAA GAACTTCGACTTCTACATGTGTGCACATGCTGGGATGATTGTGAGTTGATCTCA GAATTGAGCAAAAAGATGCTGCTGTCTTGTTCTTGTCTCTGAATCCTAGATGGTT CTTCGTCTCAGGGAACAACAAGGCCGACCCACTATCATGTTCTGCACGACGAGA TAGGTTTCAGTGCCGACGAGATGCAGGAGTTTGTTCATTCGCTCTCTTACGTGT AAGTAGTAGTAGTAAAATGCTGTTTTGGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTGTGC TTACGCTGCGTGTCCTGCTGTGCAGGTACCAG AGGAGCACGACAGCCATCTCA GTGGGTAGGCCGCTTGAATCTAAAGCCATCTTGTGCAGCACAGGGACAGCAGG TTGA I I I I I I I CTAGTGTCTG I I I I I GTGTTTGCAGTTGCTCCAGTGTGCTACGCC CACCTCGCTGCAGCCCAGGTGAGCACGTTCCTGAGATTGGAGGAGATGTCAGA CGCGTCCTCCAGCCAGGGAGGAGGGCATACCTCGGCTGGCAGTGCTCCTGTG CCGGAGCTGCCTCGCCTGCATGACAAAGTCAGGAGCTCCATGTTCTTCTGCTAG CTGATGTGCGTGCGCATCAGGATCGAGCTCCATGTTTTGTGTTAGTAAGGCCTA GTTAGTAAGGCTGTAGAAAGAATGTTTAATGTTTGCATGCTAAAGTCCAAACAAT CAAAACCACTACTATATCTACCAGAGCACTGATCGATCAAACAACAAGAGTCAG CATCAATCAATCAAAACCACCACTATTCTATCTACCGATCAATCTACTCTATACCT GAAGCACTCACTCGCTCGCAAACAACCAAGGGATCATGGATCCTTGAGTAGCTC CATTGTCCAGTCCCTGACCTTGACGAAGCATTTCATGGACAGCCTCTCGTACGC CATCTCGTACATCCGGAGGTTCATGTAGGCGAAGCTCAAGTAGGTGGCGATGC ACTCTTGGTGCCTGTGGTACAGCGCCGGGATGGTCAGAGCGGCCACCACACTT GCGTAGCAGGCGGTCGGGAAATCTGTAACGCTGCCGACGATGGACACGCTCCA CAGGCAGAGGAAGGCTCTGTAGAAGAGCAGCGAGTCCCTGCCCAGAGCGATGT CCCGGAAAGCGTCCGAGGCGGCGTCCAGAGCAGAGCGCAGCAGCGCCGCCG CCTCGTCCACGGCCTGCTGCGGAACGCGCAGCTCCGGGACGGGAGGCTGCGG CCTGTTCAGGAGGCGCGCCGCTTTGGCCCACAGGAAGAGCACGGTGAGGAGC AGGAGCAGCACGTTGGAGGCGAGGGACACCAAGGTGTAGCCGCCGTACAAGA GCAGCCAGGAGGAGACGGTGCCCGCCAGCAGGCAGGCGCTCACGTCGGCGC GGCCCCGGCGCCACAGCAGCACGTCCCAGACTGCTGCAGCAATCCGATCCGAT TCCGATCCAGATATATTAGTTAGTAGATCCAATCTCGAGCGGCCAATCCGTAATA ATAATTGGCTGAGAGAAAAGGTGGGAGAGAGTACCGAATCCTCCGACGGCACA TGTCCCGGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCAACACCAACACCAGCATCCACCACC ATCGTCGTAGTTAATACTAAGGGAAGGGAACTAGAGAAGGAAGGGAGGGGCCG ATGCAACGGAAGAAATGGATGGAATTCGACCAACAGCTAGCTAGAGCGAAGCA GAACCCAATCCCAATCAAAACCCGAGAACGAACCTGCTTTTACTTTCCCAACCA GACGGTGGCTGGCTTGGAATCCCACTATCCCTCATTCCCTCTACCAACAGGGCA CCGGCCTGGCCTCCCTCCCCAATCATCCAACCACCACC I I I I I I I I I CTTCCTTT TGCTGTGTTTTCTTACAAACTTAAATCTACTCGAATATTGATTCAAGATATTATGG AGAGTAATTGAATATTTCGATGAATCACGTCATGTATATATTTCTTAATTACAAAC TTCTATCACTATCAAATAAAGTAAACATAATGCTATTTGCAATAATATATACTATGT AAACATGACTAAATCAAAATAAATGTTTAATTTAATAGTTACCAAGTTTGCAAGAA AACATTTCCTTCCAAAGCACATATCATGATGCTGGCAATTTAGTTTTATCAGCTAT AATAATATCATTGACAACACATTTTGTAAGTCCACATTCTAAATAAATTCTGTACA SEQ ID No 8 (5/5)
TTATAACTAAAACATTATATCATATCAGCATAAAAAATAAATTAAGTATTCTATGTT TCTATAAAACAATAAACCATGCATTGTACGGTGACTGCGTCTAGGGAAAATTATA CCGCATGCTAGCAAAACGTCCTCCAGTATTTCATTAGACACATTGGTGTCAACCT AATATCCTATTTGTTGTCGTTCCAACTAACCCCCTCTTATAGTGCTACAACACTAT CATCTATGTGTGATGGTTTTACTCGTGATACCTCACTTACAGGTGAAAATAAGAC CCTCAAAAAGGAGGCGAATGAGCTCATTCACGTCTTAATTAAAGCCTACAGTAG TGAGGCTCACTTGCTTAAATGCTTGGATAGTCAAAGATTCTAGGTATTAGACTAA GTAACTATTCTGTTTTGCTACAAATGTATTAGACTAATGCTGAAGGGCAAATGCC GAAGGTAGGTTTCGACCAGGGCGCGCACCAAGACTTTGGTGATCATTGTGAAC ATGCTTCGGACGAAGCTAATTCCGAAGGTCCTATGGGCGACGACAAACTAAG
SEQ ID No 9 (1/5)
TACACAAGAGGAGCGAAGCAAGTTTCATCCAACAGGCTTCATCACGGTGAAACG GGTATACAACGTGGCTTCGGTATAACTCAAAGGAAGTATAACGAAGCACACTTC ATCAAGCAGGCTTCGTCATAACGAAACAATGAGATGCAAGGAGAAGGTGTTACT CAAGTTATTAAATACAACTGACGACATTGCCCTTATGACATATTGTAAACTCTGTA TGTAATTATTGAGGGTATAAATGTAATAGCGTACGAACCCTTGCGATTGTCTATA AATAGATGAACATTACCCCGTACTATTCACGTTGGATTGTAATCGCTCTCGCGTC AACACCTTCAAACAAGCCGAAGATATCACTGCAATATAAATTTTGATAATGTTTAT ATATTTATCATGGAATAAATATATGACTGGATATCACACTCATGTATTTAAATCCT TATTGATATAAATG ATG AGG ATGTGTTATTCACG ACCTTTGTCTGAAGATTATTAT ATCCGAAAGGAGATA I I I I I I CGAAGGACGAATGTTCTTAACATTTAATAACTGT GTTACCTTGTTCTTGAACATGTGACAAACATTAGGTTTTGAGTATTTCAATTAATA GTGAAATTAAATTAAATTTTAGTTGTCCAAAATGACAGACTTCGATATTTGTTATA ATTGTTGAGTTAAATTTTAACAGCATCCATAAACAAGTAAACAACGACTATGTGT GCACCAGTGTCTCCTGTATCAACGGGGTGGTCCGTCTGGAGGAGGTACCGAGG TCCCGCCGTTCGAGAGACGAGCTACGCATTTAAGCCGGGGAGGTCGGAGCAGT GAGTGGGAGTAGTTCAGGGACTGGGAGAGGAGAGGAAGCAGGACCTGGGAGA CCTCGCCTCGTCCGTCCTCCTGCCTACTTCCTTGCTTTTGGTAAGTGAAAGTGA TTGAAGTGGAGATGCCTCCAATCTGCAGTGCTGTTTCACGCGTAAACCCTGGCC CCCTCGCCGCTGGAAGCCCCATTGTTCCTCTTTCATTTCTTACCGCTGATGCAG CTTATGGTTTCCTAGGGTTTTCGAGATATTTGGTTTCTTGCATCCAGAGGACGAA GAGCTTTCATAGGGTTTTCGAGACATTGTCCTCACAATCGCATCCATTCTGCAGT GCTGTTTCACGCGTAAACCCTAGCCCCTCGTCGCTGGAAGCCCACATGGTTCCT CTTTCATTTCTTACCGCTGATGCAGCTTATGGGTTCCTAGGGTTTTCGAGACATT TGGCTTCTTGCATCCAGAGGACGAAGAGCTTTCCTAGGGTTTTCGAGACATTGT CCTCACAATCGCAGATTTGGTTCGAGACATTTGTTTGAGATAAGTGCTATTATGG ACGAAGAGGGAAGGGGATTCGACGAAATGGAGGCGTTGGCGTTGGCTTCTGTG TTTTGGAGACGCACGCGACAGCCAAACTCCAAAACGGATACGAGACAGCTCTTG GGGCTGCGTAAACAGGTATTAGTTTTCTGTCCCCGTTTACCGTTCCCGTGCGCA GACGCCGTCACGCGTACTCTTCTTGTCTCCGTCGCCGCGCTCTACGGCGGTGC TGGCGTCCGTGCTGTACTCCGCGCCGGCAGAGGCCGCGCGCGCGTCGCCCGC GGACGGCGCCACGCCGCTCCACCTCGCCGCGGCCGTGCACATCCTCCTCGCC GCGGGCGCGTCCGTGGACGCGCGCGCCTTCTCGGGCCTCCGCGCCGGGGAC CTCCTCCTCCCGCGCGCCAACGAGGCCGCCGCCGCCGCAGACCGGGCGCTCC GCGTGCTCCTGAAGTTCCCCGCGGCGTCACTGTCGTCCTCGCCCAAGAAGTCC GCCTCGCCGCCGCCGGCCCCGGAGGCGAGGAAGGAGTACCCGCCCGACCTG ACGCTGCCGGACCTCAAGAGCGGGCTGTTCAGCACCGACGAGCAACGGACGC ACCTTACAGCTGTCCTAGCACTAATTACTCCTAAATTCATCATACACCAAAGTTTC AATTAGTAAAAGGTTTTGGTATTATTTTCTTTACAAGACTAAAAGCATCCACTCGT ATTTGCCATGGAAATATTGCCAAAATGGTTACCGAAGAACCAATGAAAAATGGC GGTATCCGTCCACCTGTAACTTGTCCAAGGCTCTTCCAGCAGAGTAGTGCCGCC ATGACGATTGACAGAGACACGAGACGAAACAAGCAGAAGGTCCCCGCGGCGTC ACTGTCGTCCTCGCCCAAGAAGTCCGCCTCGCCGCCGCCGGCCCCGGAGGCG AGGAAGGAGTACCCGCCCGACCTGACGCTGCCGGACCTCAAGAGCGGGCTGT TCAGCACCGACGAGTTCCGCATGTACAGCTTCAAGGTGAAGCCCTGCTCCCGC ACCTACTCGCACAACTGGACCGAGTGCCCTTCGTGCACCCGGGCGAGAACGCG CGGCGCCGTGACCCGCGCGTACTCCTACAGCTGCGTGCCCTGCCCCGAGTTC CGCAAGGGCCGGCGCTGCCGCAAGGGCGACGGCTGCGAGTACGCGCACGAC GTCTTCGAGTGCTGGCTCCACCCCGGCGCAGTACCGGACGCGCCTCTGCAAG GACGAGGTGGGCTGCGCGCGCCGCATCTGCTTCTTCGCGCACAAGCGCGAGG SEQ ID No 9 (2/5)
AGCTCCGCGCCGTCAACCCCTCCGCGGTGTTCGTCGGCATGCAGATGCAGCCC ACCGTGTCGCCGCCGCCGCCCAACGGCCTCGGCGACATGCTCAGCCCGGCGG CCTGGCCCTCCTCCCCCGCGAGCAGGCTCAATAAGGCCGCGCTCGGCGGCCG GGACCTGGACCAGTACCAGCACATGTTGTTCGACAAGGTGTCGTCGCCGAGGG CCAGTTGGAGACAAGAAGAGTACGCGTGACGGAGATGCGACGGAGAAAAAGG GTACGCGTGACGGCGTCTGCACACGGGAACGGTAAACGGGGACAAGAAACTAA TACCTGTTTACGCAGCCCCAAGTGCTGTCTCGTATCCGTTTTGGAGTTTGGCTG TCGCGTGCGTCTCCAAAACAGAGAAGCCAACGCCAACGCCTCCATTTCGTCGAA TCCCCTTCCCTCTTCGTCCATAATGGCAATTATCTCCTCGTGTTCNCGTCCCGC GCTTGAGTCCTTGTGATCTGCACAGCATGATGCTGCCACCAAATGCATGCAGTT AGACAAGCTTAATGTTGCATCTGATAAGACTGTACAACAGATTCGTGTGCCAAAT GTGTCCTTGCTACTCAAGGAGGTCATATGGAACAAGTAAAACGAAATTTCTGCAT CAGCAATCAGG CACAAGACTG AATGACGTGGTTAGTGCCAATG AG GTG GG G AC TTGGGAATGGAATTAGAGTTATAGCTATTCCTATAATTCATCTCACTACAGAGGC TCTCCATCCTACTAGGACTGTACAACAGATTCGTGTGCCAAATGTGTCCTTGCTA CTCAAGGAGGTCATATGGAACAAGTAAAACAAAATTTCTGCATCAGCAATCAGG CACAAGACTGAATGACGTGGTTAGTGCCAATGAGGTGGGAACTTGGGAATGGA ATTAG AGTTATAGCTATTCTATAG CTATTCCTATA ATTCATCTC ACTAC AG AG GCT CTCCATCCTACTAGAATTTAATCTGATAAAGTAGGCAGAAACATGGAACTTATAA TGTCGAAGATTGCATGTATAGAATCTAAGTAACGGAAAGATTCAACTTTGTGATT ATATGCTGCTGTTACATGGTATTGGTAAAACATTCTTTCAAGTGCTCATTGTCTTC CCTTGCAACCAATTCATTGTTGTCCTTGTTTCCTTGCAGGTAGGTGCTGCTTGTT TTATCTTGAAATGGGCTCTCATGATGGCGAGGATGAAGAGTTGCCACCCCCCCC TCCGGTGCCACCAGATGTGATTCCCATTAAAGCTGAAGATGCTGTGGGTGAATC ACCAGCAAACCATATATTAAAGCCAAAGAGATTACTGATGGACAGGCCTGGTAT AGGAAGAAAAGGGCAGCCGACCCAGCTCTATTCAAATCACTTTAAAGTCGCTGT GAAGAGTACAGAAGACGTCTTCTTTCACTACTATGTATGTCTGCTGACTGAGTTC ATGATCCTTTGTTCAAAATATGTCATTGTCTGTCCCTTGTTTATAACTAATCTTTG GCTGATGTGATATTGTTATTTTATTTGACTAGGTAAACCTGAAGTATGAGGATGA TCGACCCGTTGATGGTAAAGGGATCGGCAGAAAGGTGATTGATAAACTGCAGCA GACATATCGTGCAGAGCTTTCTAACAAGGACTTTGTATATGATGGAGAAAAGAG CCTGTTTACAGTTGGTGGTCTTCCACAAAAAAAGAATGAGTTCACCGTTGTCTTG GAGGACGTATCTACTGGAAAGTTAGTTTTAGTCTTTGATCTGCTTTCTTGTTGTTT ATGCTTACCCAGAATCAGTAATTGCCATG I I I I I I GTTTGTGGTTGTAGGACTGC TGCCAATGGGAGCCCTGGAGGTAATGACAGTCCTGGAGGTGGTGATAGGAAGA GAGTGAGGAGGCCATACCAGACGAAAACTTTCAAAGTGGAGATAAATTTTGCAG CAGAGGTTCCTATGAGTGCTATTGGTCAAGTCATTAGAGGCGAAGAATCTGAGA ACTCCCTGGAGGCGCTTCGTGTTCTTGATATCATACTGAGGCAGCATTCCGCAG AACAGTATGTAGCTATGCATCTTGATGGATGATTATAGGTAGATTTGAGGATCTT CTGCAGTTACGACATGACAA I I I I I CTCAATACTTGCAGAGGCTGCCTTTTGGTT AAGCAATCA I I I I I CTACAACAACCCTTCATGCTTTGTTGACTTGGGTGGTGGTG TGATGGGTTGTCGTGGATTTCATTCAAGCTTCCGTGGCACACAGAGTGGACTTT CCCTCAATGTTGGTGCGTGTTCGTCCTGTATGGCTGTATTGGTGCCATGTAACT GCATTGTCTATTCTATAATCTTACATCTTTCATGATCATGATAGCC I I I I I I I I I GA AATCCACAGATGTCTCAACAACAATGATCGTGAAACCTGGCCCTGTTATTGATTT TCTTCTTTCTAACCAGAATGTTAATGATCCTAGCAGAATTGATTGGCAAAAGGTA AATGCCATCTTTGGATGAAACTTCTCGAATAACCATGCTAGTGCATTGAAATATC TATTTTGATAGAATGATAACACAATTTTGGGGTGTGCATATTCAATACAGGCCAA GCGTGCTCTCAAGGGCTTGAGGATTAGAACCACTCCTGCAAATTCAGAATTCAA T/IB2010/054769
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SEQ ID No 9 (3/5)
GATTTTTGGTCTCAGCGAGAGGATCTGCAAAGAACAAACGTGTGGACATGTTTT CTTACCGCTCTGTTTATTGTCATGCAAGCTTTACTTTACA I I I I I AAAAAATTGTA CCCTAGTGTGTTAAGCTTGTTTCAGAAGAATTTTATTTAACAAATATTGCCTTTAT TGATTTTGTTCTGATTCCAATGCCAAGCTTGCTTGATGGTGATATCTGTGTGCTT AATTGCTTTCTCATTGACATATGCAATTAGGTTTCCGCTGAGGCAGAGAAATGGT AGCAACGGAGATTGTGATACCATTGAAATAACTGTCTATGACTACTATGCAAAGA AAGGAATCGATCTAAAGTATTCTGGTGATTTCCCCTGTATAAATACAGGGAAGGC AAAGCGCCCAACATATTTTCCAATCGAGGTTTGTTTCAGTTTTGTTAGTTACATC CTGTCAAATCTCTGTTTATTAAATATATCTTGCATCTCATATTCG ATGGGCAGGCT TGGTGGGGCTGTCTCACTGAGTCACTAGGTCGTGGGTTCAAAGCAGCCTCTCC ACATTTGTGGGGGGGGGAAGGCTTGCTTCGGTTTATCCCTTCCTTAGACCCTAG GTCTGCCCC I I I I I I I GCATCTCA I I I I I I I GTATTGTGTTTCTAGCTATGCTCGC TTGTTCCGCTTCAAAGATACACCAAAGCTTTGTCTACGCTACAAAGGTCATCCCT TGTGGAG AAGTCTAGACAGAAGCCTGAAGAAAGGATGACCGTTCTAAATGATGT GAGCTGTTACCTTGATTTTAGCATGCTGCGACCATTCATAACTGCATGGGATTTA TTTCTACGACTGAATTAATCAACAGCTTATGATTACCCTAAATGCTAGGCACTGC AACGCAGTAACTACGATTCTGACCCCATGTTGATGTGCNNNNNNNNNNAGGTTG AGGGCATGTGGTGTTTCAGTTGCTCCAAAATTTACCCAAGTTGAAGGAAGGATC CTTCAAGCCCCAAAGGTNNNNNNNNNNGCTTGNNAGAGAATCCTAGGGTGTTT GGATGGAATTCTAGGATTTAAAGA I I I I I I I CCTATCCTGATTGTTAATATCTCTA TGGATCCAAACGCTCCCTTAGTTGTTTTCTCTCTAAATGTTGTACCAAGTCATTAT CTCAGTAAAATGCATCTGACTAAATCTAATATCTTGTAGCTGAAAGCCGGCAATG GTGATGATATCTTTTCACGAAATGGACGGTGGAATTTCACTAATAGGGTCAGCA GCTCAACATGTTTC I I I I I I AACCTTC I I I I M I CTTTATTAGGAAGGA I I I I I CTG ATGTTTATTTGCCAATACTTTGCCCCTTTCAGAAGTTTTATGAAACCTGCTCTGTG AATAAGTGGGCGGTCGTTAATTTCTCTGCACGTTGTGATGTTCGGAATCTTATCC GTGACCTGATGAGGAATGCATCTGCAAAGGGAATTGTATGGTTTAGCTTTTCAC ATATCTTCTATTGTAGCAGTTTTCTGCTGCTGACGTTTTCTTCTGGCAGCAAATG GAGGAACCTTTTGATGTGTTTGAAGAGAGTCCCTCTATGAGGCGTGCACCTGTG TCAAGAAGGGTGGATGATATGTTTGGGCAGATAAAATCAAAACTTCCTGGAGCT CCTAGGTTCCTCTTGTGCCTTCTCCCTGAGAGGAAAAATTGTGAAATCTATGGTT GGTTTA I I I I I I GTTACCACTCCACATAAATATCTCACATCTTGCAATAATTATAC
C l I I I I GGTTTCAACCAGGTCCTTGGAAGAGAAAGTGCCTGGCCGAGTTTGGTA TTGTCACACAGTGTCTAGCTCCATTAAGAGTCAATGATCCGTACCTGCTTAATTT GCTGATGAAGATCAATGCAAAGGTTTGGGACATGATTTTATCTTTCTTTTGCACT GTATTGTTCCCTGGTTCATGATTATATTATCCTCTTTCCTCTG I I I I I AACTAGCT TGGTGGTCTGAACTCGTTGCTGCAAGTTGAAGCATCTTCGTCAATACCACATGT GTCGCAAGTACCCACCATCATCTTAGGTATGGATGTTTCACATGGTCATCCAGG ACAAGATAGACCTTCGGTTGCAGCGGTAAGATGGGTGTACCTTTACTTGTACAA TTCTTCTGCCCACATGGAATCTGAGTGGTTTTGTAAAATATGTGAAATGGATGTC TGTTAATCTGATGTAAACCATACCTTTCTTCTTTGTTTAGGTGGTTAGTTCTCGTC AATGGCCTCTTATCTCTAGATATAGAGCATCAGTGCACACCCAATCTGCCAGACT AGAAATGATGTCCTCGTTGTTTAAGCCGCGGGGTACTGATGATGATGGCCTCAT CCGGTAAGAGATATCTTCTTAGTATGTTGATGTATGGTAAGCGTGATGACTTTTG GATGCTAAGTTTATCTTCGTATTTGGGACTTCCAGGGAATCACTGATCGACTTCT ACACTAGCTCTGGAAAGCGAAAACCAGAACACATAATTATTTTCAGGTCTGAAGC TTTGGGGTTATTGTTAGCTTGTATCACTAAATC I I I I I GTAGAAACAAATTC I I I I I TTTG I I I I I GTTTTGAGAAGTATGTATGGTACATTCTTTGCTGGGATGGATTATTG ATACTTTCTTAGCCGCCGTGGCGTAAATGTAACCATTTGCTGGGTTTTAGGGAT SEQ ID No 9 (4/5)
GGAGTCAGTGAAAGTCAGTTTACCCAGGTCATCAACATTGAGCTGGATCAGATC ATCGAGGTAATACATTTGTTTGATTCGTCCTTTGCACATTTGCTTGCTTAGTTCAG GAACGAATTGCAAGGTAACACATCCTTGTAATTAATGCAGGCATGTAAGTTTCTG GATGAGAAGTGGTCACCCAAGTTCACTGTGATTGTTGCTCAAAAGAACCACCAC ACCAAGTTCTTTCAGACGGCATCACCAGACAATGTTCTTCCTGGTAATATGTTTA TTTTTGTCATACTAAAGGGAGTGTGGTGAGATGCGGTGACAATAATAAATGTGTT TGTTTGTTACGCAGGAACTGTGGTGGATAGTAAAGTTTGCCATCCTAAGAACTTC GACTTCTACATGTGTGCACATGCTGGGATGATTGTGAGTTGATCTCAGAATTGA GCAAAAAG ATGCTGCTGTCTTGTTCTTGTCTCTGAATCCTAGATGGTTCTTCGTC TCAGGGAACAACAAGGCCGACCCACTATCATGTTCTGCACGACGAGATAGGTTT CAGTGCCGACGAGATGCAGGAGTTTGTTCATTCGCTCTCTTACGTGTAAGTAGT AGTAGTAAAATGCTGTTTTGGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTGTGCTTACGCT GCGTGTCCTGCTGTGCAGGTACCAGAGGAGCACGACAGCCATCTCAGTGGGTA GGCCGCTTGAATCTAAAGCCATCTTGTGCAGCACAGGG ACAGCAGGTTG ATTTT TTTCTAGTGTCTG I I I I I GTGTTTGCAGTTGCTCCAGTGTGCTACGCCCACCTCG CTGCAGCCCAGGTGAGCACGTTCCTGAGATTGGAGGAGATGTCAGACGCGTCC TCCAGCCAGGGAGGAGGGCATACCTCGGCTGGCAGTGCTCCTGTGCCGGAGC TGCCTCGCCTGCATGACAAAGTCAGGAGCTCCATGTTCTTCTGCTAGCTGATGT GCGTGCGCATCAGGATCGAGCTCCATGTTTTGTGTTAGTAAGGCCTAGTTAGTA AGGCTGTAGAAAGAATGTTTAATGTTTGCATGCTAAAGTCCAAACAATCAAAACC ACTACTATATCTACCAGAGCACTGATCGATCAAACAACAAGAGTCAGCATCAATC AATCAAAACCACCACTATTCTATCTACCGATCAATCTACTCTATACCTGAAGCAC TCACTCGCTCGCAAACAACCAAGGGATCATGGATCCTTGAGTAGCTCCATTGTC CAGTCCCTGACCTTGACGAAGCATTTCATGGACAGCCTCTCGTACGCCATCTCG TACATCCGGAGGTTCATGTAGGCGAAGCTCAAGTAGGTGGCGATGCACTCTTG GTGCCTGTGGTACAGCGCCGGGATGGTCAGAGCGGCCACCACACTTGCGTAG CAGGCGGTCGGGAAATGTGTAACGCTGCCGACGATGGACACGCTCCACAGGCA GAGGAAGGCTCTGTAGAAGAGCAGCGAGTCCCTGCCCAGAGCGATGTCCCGG AAAGCGTCCGAGGCGGCGTCCAGAGCAGAGCGCAGCAGCGCCGCCGCCTCGT CCACGGCCTGCTGCGGAACGCGCAGCTCCGGGACGGGAGGCTGCGGCCTGTT CAGGAGGCGCGCCGCTTTGGCCCACAGGAAGAGCACGGTGAGGAGCAGGAGC AGCACGTTGGAGGCGAGGGACACCAAGGTGTAGCCGCCGTACAAGAGCAGCC AGGAGGAGACGGTGCCCGCCAGCAGGCAGGCGCTCACGTCGGCGCGGCCCC GGCGCCACAGCAGCACGTCCCAGACTGCTGCAGCAATCCGATCCGATTCCGAT CCAGATATATTAGTTAGTAGATCCAATCTCGAGCGGCCAATCCGTAATAATAATT GGCTGAGAGAAAAGGTGGGAGAGAGTACCGAATCCTCCGACGGCACATGTCCC GGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCAACACCAACACCAGCATCCACCACCATCGTC GTAGTTAATACTAAGGGAAGGGAACTAGAGAAGGAAGGGAGGGGCCGATGCAA CGGAAGAAATGGATGGAATTCGACCAACAGCTAGCTAGAGCGAAGCAGAACCC AATCCCAATCAAAACCCGAGAACGAACCTGCTTTTACTTTCCCAACCAGACGGT GGCTGGCTTGGAATCCCACTATCCCTCATTCCCTCTACCAACAGGGCACCGGC CTGGCCTCCCTCCCCAATCATCCAACCACCACC ! I I I I I I I I CTTCCTTTTGCTG TGTTTTCTTACAAACTTAAATCTACTCGAATATTGATTCAAGATATTATGGAGAGT AATTGAATATTTCGATGAATCACGTCATGTATATATTTCTTAATTACAAACTTCTAT CACTATCAAATAAAGTAAACATAATGCTATTTGCAATAATATATACTATGTAAACA TGACTAAATCAAAATAAATGTTTAATTTAATAGTTACCAAGTTTGCAAGAAAACAT TTCCTTCCAAAGCACATATCATGATGCTGGCAATTTAGTTTTATCAGCTATAATAA TATCATTGACAACACATTTTGTAAGTCCACATTCTAAATAAATTCTGTACATTATA ACTAAAACATTATATCATATCAGCATAAAAAATAAATTAAGTATTCTATGTTTCTAT SEQ ID No 9 (5/5)
AAAACAATAAACCATGCATTGTACGGTGACTGCGTCTAGGGAAAATTATACCGC ATGCTAGCAAAACGTCCTCCAGTATTTCATTAGACACATTGGTGTCAACCTAATA TCCTATTTGTTGTCGTTCCAACTAACCCCCTCTTATAGTGCTACAACACTATCATC TATGTGTGATGGTTTTACTCGTGATACCTCACTTACAGGTGAAAATAAGACCCTC AAAAAGGAGGCGAATGAGCTCATTCACGTCTTAATTAAAGCCTACAGTAGTGAG GCTCACTTGCTTAAATGCTTGGATAGTCAAAGATTCTAGGTATTAGACTAAGTAA CTATTCTGTTTTGCTACAAATGTATTAGACTAATGCTGAAGGGCAAATGCCGAAG GTAGGTTTCGACCAGGGCGCGCACCAAGACTTTGGTGATCATTGTGAACATGCT TCGGACGAAGCTAATTCCGAAGGTCCTATGGGCGACGACAAACTAAG

Claims

REVENDICATIONS
1 - Utilisation pour produire des plantes partiellement ou totalement apomictiques d'un gène de la famille Argonaute, d'un transcrit de ce gène ou de son ORF. 2 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le gène de la famille
Argonaute code pour une protéine de séquence SEQ ID N° 1.
3- Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le gène de la famille Argonaute répond à la séquence SEQ ID N°2.
4 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit transcrit répond à la séquence SEQ ID N°3.
5 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit ORF répond à la séquence SEQ ID N°4.
6 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le gène est inactivé par mutagénèse. 7 - Méthode pour induire dans les espèces cultivées telles que maïs, riz ou blé un phénotype tout ou partiellement apomictique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inactivation ciblée, par un élément transposable, par exemple de type de Mutator, d'un gène tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, d'un transcrit de ce gène selon la revendication 1 ou 4, ou de son ORF selon la revendication 1 ou 5, et l'identification du locus muté.
8 - Application de la méthode selon la revendication 7, pour la propagation de génotypes instables, le contrôle de contaminations polliniques, l'amélioration des plantes et la production commerciale de graines.
9 - Plantes ou graines de plantes totalement ou partiellement apomictiques d'espèces cultivées telles que maïs, riz ou blé, caractérisées en ce qu'elles comprennent des allèles inactivés d'un gène tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4. 10 - Plantes ou graines de plantes totalement ou partiellement apomictiques d'espèces cultivées telles que maïs, riz ou blé obtenues selon la revendication 6 ou 7.
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