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WO2010125176A1 - Polypeptides pour l'evaluation in vitro du potentiel sensibilisant d ' un compose test - Google Patents

Polypeptides pour l'evaluation in vitro du potentiel sensibilisant d ' un compose test Download PDF

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Publication number
WO2010125176A1
WO2010125176A1 PCT/EP2010/055895 EP2010055895W WO2010125176A1 WO 2010125176 A1 WO2010125176 A1 WO 2010125176A1 EP 2010055895 W EP2010055895 W EP 2010055895W WO 2010125176 A1 WO2010125176 A1 WO 2010125176A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
sequence
compound
polypeptide
test compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2010/055895
Other languages
English (en)
Inventor
Hervé GROUX
Jean-Marc Sabatier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IMMUNOSEARCH
Original Assignee
IMMUNOSEARCH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IMMUNOSEARCH filed Critical IMMUNOSEARCH
Priority to EP10715868A priority Critical patent/EP2424983A1/fr
Priority to US13/318,064 priority patent/US8703431B2/en
Priority to JP2012507778A priority patent/JP2012525131A/ja
Priority to CA2760685A priority patent/CA2760685A1/fr
Priority to BRPI1014622-9A priority patent/BRPI1014622A2/pt
Publication of WO2010125176A1 publication Critical patent/WO2010125176A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the present invention relates to novel polypeptides and their use for the in vitro evaluation of the sensitizing potential of a test compound, to a method for in vitro evaluation of the sensitizing potential of a test compound, to an in vitro method for the selection of a compound capable of decreasing sensitization, as well as kits for the implementation of such methods.
  • NGAL neurotrophil gelatinase associated lipocalin
  • SEO et al Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in epidermis skin, J.
  • NGAL was originally identified as a 25kDa protein covalently associated with the 92kDa "neutrophil gelatinase" (or gelatinase B, MMP-9). Crystallographic analysis has shown that the natural ligands of this enzyme are a variety of bacterial ferric siderophores thus acting as a bacteriostatic. In the kidney, this enzyme plays the same role in delivering iron into the cells of the nephron. NGAL is induced by calcium in cultured keratinocytes and its presence in human and murine skin has been confirmed, particularly in the epidermis (in keratinocytes only) and hair follicles, by in situ hybridization.
  • L-PGDS whose role originally described is to isomerize prostaglandin H2 to prostaglandin D2, also functions as a lipophilic protein of the spaces extracellular whose known ligands are bilirubin, retinaldehyde and retinoic acid. Recent studies have shown that L-PGDS is present in Langerhans cells, melanocytes, mast cells, histiocytes and macrophages (but not in keratinocytes) in the rat.
  • the inventors then identified particular sequences of these lipocalins or derived from them, for the development of in vitro evaluation methods of the sensitizing potential of compounds likely to behave as allergens.
  • the present invention relates to an isolated polypeptide comprising a sequence selected from the sequence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives thereof.
  • an isolated polypeptide comprising a sequence chosen from the sequence SEQ ID NO: 1, 2, 3, and 4, still more preferably an isolated polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO : 3, and more preferably an isolated polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 1.
  • ECGX1DELX2EX3 (SEQ ID NO: 3)
  • LYSRSQNPRAEVX1EHFTTFAX2SLGFTEE (SEQ ID NO: 6)
  • X1, X2, X3 and X4 are independently selected from lysine, ornithine, diaminobutyrate or diaminopropionate, preferably lysine.
  • each of the groups X1, X2, X3 and X4 each represents a lysine.
  • X1, X2, X3 and X4 each represent a lysine group, and thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 20: KACAKDELKEK (SEQ ID NO: 20) .
  • said sequence SEQ ID NO: 20 has an amino group (NH 2) at its C-terminal end.
  • sequence SEQ ID NO: 2 X1, X2, X3 and X4 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 21: KEKLEDKACAK (SEQ ID NO: 21)
  • sequence SEQ ID NO: 3 X1, X2 and X3 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 22: ECGKDELKEK (SEQ ID NO: 22)
  • sequence SEQ ID NO: 4 X1, X2 and X3 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 23:
  • sequence SEQ ID NO: 5 X1, X2 and X3 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 24:
  • X1 and X2 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 25:
  • sequence SEQ ID NO: 7 X1, X2, X3 and X4 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 26: LYGRTKELSPELKERFTFAKSLGLK (SEQ ID NO: 26) .
  • X1, X2, X3 and X4 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 27: LYSRTQTLKDELKEKFTTFSKAQGLT (SEQ ID NO: 27) .
  • X1 represents a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 28: RQNQCETK (SEQ ID NO: 28)
  • X1 represents a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 29: TLYGRTKEL (SEQ ID NO: 29)
  • sequence SEQ ID NO: 11 X1 and X2 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 30:
  • sequence SEQ ID NO: 12 X1, X2 and X3 each represent a lysine group, and the sequence thus corresponds to the following sequence SEQ ID NO: 31: KEKFTTFSK (SEQ ID NO: 31)
  • X1 represents a lysine group
  • sequence SEQ ID NO: 32 LYGRTKELS (SEQ ID NO: 32)
  • sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 may have an acetyl group at their N-terminal end.
  • sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 may have an amino group (NH 2) or amide (C0NH 2) at their C-terminus - Terminal.
  • sequences SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 have an amine or amide group at their C-terminal end.
  • Said polypeptide isolated according to the present invention may be in the L form or in the D form.
  • the polypeptides according to the present invention have a length of less than 100 amino acids, preferably less than 80, more preferably less than 50, more preferably less than 40 and most preferably less than 50. any less than 30 amino acids.
  • derivatives is meant a polypeptide having one or more sequence mutations not modifying the activity of said polypeptide, in particular a polypeptide having one or more so-called 'conservative' mutations and mutations not affecting the thiol pKa values. of the cysteine and / or lysine residue and / or having an identity percentage of at least 80% with the complete sequence of the sequence SEQ ID NO: 1 to 13, preferably at least 90%, and still more preferably at least 95%.
  • conservative mutation is meant a mutation selected from substitution of a basic amino acid residue with another basic amino acid residue, an acidic amino acid residue with another amino acid residue. acid, a neutral amino acid residue with another neutral amino acid residue, an aliphatic amino acid residue with another aliphatic or aromatic amino acid residue, an amino acid residue aromatic by another aromatic or aliphatic amino acid residue, an amino acid residue amidated by another amide amino acid residue, an alcoholic amino acid residue by another alcoholic amino acid residue .
  • percent identity between two amino acid sequences, the identical amino acid percentages between the two sequences to be compared, obtained with the best alignment of said sequences, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being randomly distributed in the amino acid sequences.
  • “Better alignment” is the alignment for which the percentage of identity is highest. The sequence comparison between two amino acid sequences is generally performed by comparing these previously aligned sequences according to the best alignment; this comparison is performed on comparison segments in order to identify and compare the similarities of regions.
  • the percentage identity between two amino acid sequences is determined by comparing these two sequences. optimally aligned, the amino acid sequences may include additions or deletions relative to the reference sequence to achieve optimal alignment between the two sequences. The percent identity is calculated by determining the number of identical positions between the two sequences, and dividing that number by the total number of positions compared, and multiplying that number by one hundred.
  • said isolated polypeptide consists of a sequence chosen from the sequence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives of these, preferably in a sequence selected from the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and derivatives thereof, preferably in a sequence chosen from the sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, even more preferably in the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the isolated polypeptide consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, and still more preferably in the sequence SEQ ID NO: 20, is particularly preferred because its synthesis and purification are easy, it has excellent solubility and is easy to handle because it is not very electrostatic. it is only very slightly dimerized, which facilitates its use in the methods according to the present invention, and finally it makes it possible to detect the allergens fixed on said sequence in a single reaction step.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide as defined above.
  • the nucleotide sequence according to the present invention may be in the form of RNA or DNA, preferably in the form of DNA.
  • Said DNA may be in double-stranded or single-stranded form.
  • the present invention relates to a method for in vitro evaluation of the sensitizing potential of a test compound, comprising the steps of: a) contacting a test compound with an isolated polypeptide comprising a selected sequence among SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 and 17 and derivatives thereof; b) measuring the possible binding of said test compound with said polypeptide.
  • the evaluation method may also be performed ex vivo.
  • sequence SEQ ID NO: 14 represents the polypeptide sequence of human lipocalin 2:
  • sequence SEQ ID NO: 15 represents the polypeptide sequence of mouse lipocalin 2:
  • sequence SEQ ID NO: 16 represents the polypeptide sequence of human prostaglandin D synthase:
  • sequence SEQ ID NO: 17 represents the polypeptide sequence of mouse prostaglandin D synthase: MAALRMLWMGLVLLGLLGFPQTPAQGHDTVQPNFQQDKFLGRWYSAGLASNSS WFREKKAVLYMCKTVVAPSTEGGLNLTSTFLRKNQCETKIMVLQPAGAPGHYTY SSPHSGSIHSVSVVEANYDEYALLFSRGTKGPGQDFRMATLYSRTQTLKDELKEKF TTFSKAQGLTEEDIVFLPQPDKCIQE (SEQ ID NO: 17)
  • one or more of the lysine residues of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 may be replaced by ornithine, diaminobutyrate or diaminopropionate.
  • the isolated polypeptide comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives thereof.
  • the measurement of the possible binding obtained in step b) may optionally be compared with a negative control carried out in the absence of the test compound or in the presence of a compound known as non-sensitizing, such as for example chlorobenzene (Cbz) or lactic acid (LA), or to a positive control carried out with a known ligand of said polypeptide.
  • a compound known as non-sensitizing such as for example chlorobenzene (Cbz) or lactic acid (LA)
  • said method according to the present invention may further comprise a step c) of determining the sensitizing potential of a test compound. The higher the binding percentage, the greater the sensitizing potential.
  • Said bond may for example be a covalent bond, hydrogen, saline, electrostatic, Van der Waals, a radical attack ...
  • said bond is a covalent bond.
  • the measurement of the bond can be carried out by any measurement technique of a bond well known to those skilled in the art.
  • a labeling which may be of antigenic, fluorescent, enzymatic or radioactive type, a separation by liquid chromatography (HPLC), the use of surface plasmon resonance technique, etc.
  • the polypeptide is linked to an antigenic marker and the measurement of the binding of said test compound with said polypeptide is carried out by means of a detectable antibody directed against said antigenic marker.
  • This antigenic marker can be any type of marker known to those skilled in the art and can be chosen in particular from a polyhistidine amino acid sequence (polyHis), a cMyc element, Flag or an isolated sequence of haemagglutinin or the V5 protein.
  • the polyHis sequence preferably contains from 4 to 6 Histidine residues.
  • the antigenic marker is a polyhistidine amino acid sequence (polyHis).
  • the antibodies used to detect this antigenic marker may be polyclonal or monoclonal. They can be produced by conventional techniques known to those skilled in the art. These may be commercial antibodies. Among these, mention may be made of the penta-His HRP conjugate antibody (QIAGEN), the anti-6x His rabbit antibody Abcam 9108, the HRP-labeled horseradish-6x His rabbit antibody (horseradish peroxidase), and Abcam. 1187, mouse antibody -anti-5x His Qiagen 34698, mouse antibody -anti-poly-His Sigma H-1029.
  • Antibodies can be coupled to detectable markers known to those skilled in the art, such as enzymes (eg HRP horseradish peroxidase), radioactive labels, fluorescers, magnetic particles, and the like.
  • enzymes eg HRP horseradish peroxidase
  • radioactive labels eg HRP horseradish peroxidase
  • fluorescers eg. fluorescers, magnetic particles, and the like.
  • the antibody is coupled to HRP (HorseRadish Peroxidase).
  • the immunodetection can be carried out by any suitable technique, for example a Western Blot, Dot Blot, etc.
  • the polypeptide is linked to a fluorescent label and the measurement of the binding of said test compound with said polypeptide is carried out by fluorometry.
  • the fluorescent labeling may be direct or indirect, the fluorophore being attached directly to the polypeptide or via another marker.
  • the fluorescent label may be, for example, fluorescein, RPE (R-Phycoerythrin), GFP (Green Fluorescent Protein), APC (AlloPhycoCyanin), cyanines or Europium.
  • polypeptide is linked to an enzyme label and the measurement of the binding of said test compound with said polypeptide is by fluorometry, luminescence or colorimetry, depending on the substrate used in the enzymatic reaction.
  • the measurement of the binding of said test compound with said polypeptide can in particular be carried out using a colorimetric substrate (p-Nitrophenyl Phosphate or pNPP), fluorescent (Fluorescein Diphosphate or FDP) or luminescent (Lumi-Phos TM), the measured the interaction is then carried out respectively by spectrophotometry at 405 nm, by fluorimetry (exitation: 485 nm, emission: 535 nm) or by luminescence.
  • a colorimetric substrate p-Nitrophenyl Phosphate or pNPP
  • fluorescent Fluorescein Diphosphate or FDP
  • luminescent Li-Phos TM
  • the polypeptide may be attached to a support.
  • the support preferentially used for the implementation of the method according to the present invention is a plate, a ball or a chip.
  • polypeptides used in the method according to the present invention may be prepared by any technique known to those skilled in the art, in particular by artificial synthesis and more particularly by solid phase synthesis.
  • test compound may be a compound of varied nature, structure and origin, including a biological compound, a chemical compound, synthetic compound, etc.
  • the test compound can be any product that is in an isolated form or in admixture with other products.
  • the test compound can be defined in terms of structure and / or composition or be defined functionally.
  • the test compound may, for example, be an isolated and structurally defined product, an isolated product of indefinite structure, a mixture of known and characterized products or a composition comprising one or more products.
  • One or more compounds can thus be tested, in admixture or separately.
  • compositions may be, for example, samples of a cosmetic or dermatological product.
  • the test compound may be of natural or synthetic origin.
  • the present invention is particularly suitable for the identification of a large number of compounds. This simple and efficient screening can be accomplished in a very short time.
  • the described methods can be partially automated, thus enabling efficient and simultaneous screening of various and diverse compounds, either as a mixture or in separate form.
  • the method according to the invention is carried out in HTS (High Throughput Screening) or in MTS (Medium Throughput Screening).
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids, and the terms “polypeptide”, “peptide” and “protein” may be used interchangeably.
  • sensitizing potential means the risk for the test compound of causing an immunological reaction when it is brought into contact with a mammal, preferably a human.
  • the sensitizing potential can be considered as the risk of developing an allergy in contact with the test compound.
  • said test compound is capable of being applied to the skin.
  • the sensitizing potential corresponds to the risk of developing a skin allergy.
  • said test compound is capable of entering into the composition of a dermatological or cosmetic composition.
  • the method according to the present invention makes it possible to evaluate whether the test compound is likely to cause a contact allergy or atopic dermatitis.
  • the method according to the present invention is carried out in a buffer solution having a pH of between 7.3 and 9.3, more preferably between 7.8 and 8.8, and particularly preferably the buffer solution having a pH of 8.3.
  • the method according to the present invention is carried out at a temperature of between 20 ° C. and 40 ° C., more preferably between 25 ° C. and 35 ° C., more preferably between 28 ° C. and 32 ° C., and most preferably at 30 ° C.
  • the method according to the present invention is carried out in the dark.
  • the concentration of polypeptide used for carrying out the method according to the present invention is between 0.2 and 1.5 mM, more preferably between 0.4 and 1.2 mM, more preferably 1 mM.
  • the concentration of the test compound for carrying out the process according to the present invention is between 1 and 10 mM, more preferably between 3 and 7 mM, more preferably between 4 and 6 mM and preferably between any of 5mM.
  • the test compound can be contacted with several isolated polypeptides having different sequences.
  • the evaluation method according to the present invention may be a competition test, in which the test compound competes with a compound identified as a sensitizer. Said compound identified as sensitizer may be brought into contact with said polypeptide isolated prior to step a), or simultaneously with step a). Such an embodiment makes it possible to compare the sensitizing potential of a test compound with that of a compound identified as a sensitizer.
  • the present invention relates to an in vitro method for selecting a compound capable of decreasing sensitization, comprising the steps of: a) contacting a compound identified as a sensitizer with a polypeptide isolated compound comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 and 17 and derivatives thereof and a candidate compound to decrease sensitization; b) measuring the possible binding of the compound identified as sensitizing with said polypeptide.
  • Said method for the selection of a compound capable of reducing the sensitization can be carried out under the same conditions as those described above for the in vitro evaluation method of the sensitizing potential of a test compound.
  • compound capable of decreasing sensitization means a compound capable of reducing the sensitizing potential of a compound identified as a sensitizer.
  • compound capable of decreasing sensitization means a compound which reduces the risk of causing an immunological reaction in the presence of a compound identified as a sensitizer.
  • desensitizing compound may also be used to define the "compound capable of decreasing sensitization”.
  • a compound is capable of reducing the sensitization if it makes it possible to reduce the sensitizing potential of a compound identified as sensitizer by at least 10%, preferably by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and preferably 100% relative to the sensitizing potential observed in the absence of said desensitizing compound.
  • the term "compound identified as sensitizer” means a compound that can be identified by the method of the present invention, ie, in other words, a compound identified as having an allergenic potential.
  • the compound that can be identified by means of the method according to the invention can be a compound of varied nature, structure and origin, in particular a biological compound, a chemical compound, synthetic compound, etc.
  • the compound identified as sensitizer is selected from diphenylcyclopropenone (DPCP), lauryl gallate (LG), 3-3-dimethylaminopropylamine
  • 3-DMAPA cinnamic aldehyde (CA), citral (Cal), 1,4-hydroquinone (HQ), glutaraldehyde (GA), 1,2-benzisothiazolin-3-one (Ben), phenylacetaldehyde (PA) and lilial (Li), preferably from diphenylcyclopropenone, lauryl gallate, 1,4-hydroquinone and glutaraldehyde, and particularly preferably diphenylcyclopropenone.
  • Diphenylcyclopropenone is an extremely strong sensitizer; lauryl gallate, 1,4-hydroquinone and glutaraldehyde are strong sensitizers; 3-3-dimethylaminopropylamine, cinnamaldehyde, citral, 1,2-benzisothiazolin-3-one and phenylacetaldehyde are moderate sensitizers, and the ilium is a weak sensitizer.
  • the candidate compound for decreasing sensitization may be any product which is in isolated form or in admixture with other products.
  • the candidate compound for decreasing sensitization can be defined in terms of structure and / or composition or be functionally defined.
  • the candidate compound for decreasing sensitization can, for example, be an isolated and structurally defined product, an isolated product of indefinite structure, a mixture of known and characterized products or a composition. comprising one or more products. One or more compounds can thus be tested, in admixture or separately.
  • the test compound may be of natural or synthetic origin.
  • the ability of a candidate compound to decrease or inhibit binding can be evaluated by comparing the binding capacity of a polypeptide comprising at least one sequence selected from SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 and 17 and derivatives thereof, with a compound identified as sensitizing in the presence of said candidate compound, to the binding capacity of said polypeptide with said compound identified as a sensitizer in the absence of said candidate compound.
  • a decrease or inhibition of the binding capacity is observed in the presence of said candidate compound, it can be concluded that said candidate compound is a compound capable of reducing the sensitization.
  • said candidate compound is suitable for use on the skin and can be used in a cosmetic or dermatological composition.
  • Step a) may be carried out: i) by first contacting the compound identified as sensitizer and isolated polypeptide as defined above, optionally followed by a first measurement of the binding of the compound identified as sensitizing with said isolated polypeptide, then contacted with the candidate compound to decrease the sensitization with the compound identified as a sensitizer bound to the isolated polypeptide; ii) by contacting the compound identified as a sensitizer with the candidate compound beforehand to reduce the sensitization and then bringing the isolated polypeptide as defined above into contact with the compound identified as sensitizing agent and the candidate compound for reducing the sensitization; or iii) by simultaneously bringing into contact the compound identified as sensitizing agent, the candidate compound to reduce the sensitization and the isolated polypeptide as defined above.
  • the isolated polypeptide comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives thereof.
  • the present invention also relates to a kit for the implementation of an in vitro evaluation method of the sensitizing potential of a test compound according to the present invention, comprising at least one isolated polypeptide comprising a sequence chosen from SEQ sequences. ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 and 17 and derivatives thereof.
  • said isolated polypeptide comprises a sequence selected from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives thereof, preferentially among the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, and even more preferably among the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
  • the present invention also relates to a kit for implementing a method for selecting compounds capable of reducing the sensitization according to the present invention, said kit comprising at least one polypeptide comprising a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 and 17 and derivatives thereof, and at least a compound identified as sensitizer.
  • the compound identified as a sensitizer is chosen from diphenylcyclopropenone, lauryl gallate, 3-3-dimethylaminopropylamine, cinnamaldehyde, citral, 1,4-hydroquinone, glutaraldehyde, 1,2-benzisothiazolinol 3- one, phenylacetaldehyde and lilial, preferably from diphenylcyclopropenone, lauryl gallate, 1,4-hydroquinone and glutaraldehyde, and particularly preferably is diphenylcyclopropenone.
  • said isolated polypeptide comprises a sequence selected from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives thereof, preferentially among the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, and even more preferably among the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
  • the present invention relates to the use of a polypeptide comprising a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 and 17 and derivatives thereof for the in vitro evaluation of the sensitizing potential of a test compound.
  • said isolated polypeptide comprises a sequence selected from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 and derivatives thereof, preferentially among the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, and even more preferably among the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
  • test with 0.5 mM of polypeptide and 5 mM of test compound was carried out under the following conditions:
  • X1, X2, X3 and X4 are independently selected from lysine, ornithine, diaminobutyrate or diaminopropionate, and at least one of Xl, X2, X3 and X4 is not lysine.
  • a high percentage of lauryl gallate binding which has a strong sensitizing power is observed for the 3 sequences studied, a high percentage of cinnamaldehyde aldehyde binding, which has a moderate sensitizing power, for the sequence SEQ ID NO: 7 and moderate for the sequences SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 18.
  • test with 0.5 mM of polypeptide of sequence SEQ ID NO: 29 and 5 mM of test compound was carried out according to the same protocol as that described for Example 1.
  • sequence SEQ ID NO: 19 which is not a lipocalin derivative, served as a positive control. This sequence corresponds to the following sequence:
  • AC-RFAACAA-NH 2 (SEQ ID NO: 19)
  • the buffer used was 10mM TRIS-HCl at pH8.3.
  • fixation indicates that a fixation exists, but that it is not quantifiable.
  • n / a non-determinable fixation at an identical retention time.
  • X1, X2, X3 and X4 are independently selected from lysine, ornithine, diaminobutyrate or diaminopropionate, and at least one of Xl, X2, X3 and X4 is no lysine.
  • the buffer used was TRIS-HCl. 10OmM.
  • X1, X2, X3 and X4 are independently selected from lysine, ornithine, diaminobutyrate or diaminopropionate, and at least one of Xl, X2, X3 and X4 is not lysine.
  • the signal was disturbed, preventing measurements greater than 82-83% fixation. These values therefore represent a minimum.

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux polypeptides et à leur utilisation pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, une méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, ainsi que des trousses pour la mise en oeuvre de telles méthodes.

Description

POLYPEPTIDES POUR L ' EVALUATION IN VITRO DU POTENTIEL SENSIBILISANT D ' UN COMPOSE TEST
La présente invention se rapporte à de nouveaux polypeptides et à leur utilisation pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, à une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, à une méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, ainsi qu'à des trousses pour la mise en œuvre de telles méthodes.
Les industries de la parfumerie et de la cosmétique se doivent de rester compétitives et performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec comme contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son environnement attachées à leur utilisation. Or l'allergie de contact est l'un des risques majeurs associés à l'utilisation d'un parfum ou d'un produit cosmétique.
L'allergie cutanée de contact (ou dermatite atopique) est un problème de santé publique majeur chez l'homme. Elle représente une manifestation immunotoxique environnementale sérieuse, contraignante, dont il est important d'anticiper les effets lorsque l'on met sur le marché des produits susceptibles de la provoquer. La sensibilisation cutanée et, par conséquent la manifestation allergique associée, est le résultat dans un premier temps de l'interaction d'une molécule allergénique avec des cellules spécialisées de l'épiderme, les cellules présentatrices de l'antigène (cellules de Langerhans, cellules dendritiques) puis dans un second temps de leurs présentations par ces cellules à des lymphocytes effecteurs T CD4+ et CD8+. Ce sont ces derniers qui sont à la base de la réaction allergique et inflammatoire. Néanmoins, les allergènes, en particulier ceux qui peuvent être présents dans un parfum ou un produit cosmétique, sont des petites molécules qui ne peuvent pas être reconnues directement. Leur reconnaissance nécessite leur association préalable avec des protéines du soi. Ainsi, c'est le complexe hétérodimérique néoformé dans la peau qui sera ultérieurement présenté aux cellules T dans les ganglions proximaux. Par conséquent, la faculté d'une molécule chimique (composé de parfum ou ingrédient cosmétique) à s'associer à une protéine de l'utilisateur de ce parfum est un préalable obligatoire à l'induction de la réaction pathologique consécutive. Jusqu'à présent, des animaux étaient utilisés pour identifier les molécules sensibilisantes au niveau cutané et le LLNA (local lymph node assay) basé sur la prolifération induite des lymphocytes ganglionnaires après contact avec le sensibilisant a été développé. Ce test a été adopté comme « Testing guideline 429 » par l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) et est considéré encore à ce jour comme le test de référence pour la détermination d'un agent chimique sensibilisant. Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de méthodes n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des méthodes alternatives permettant de déterminer si une composition parfumante nouvelle est susceptible de représenter un danger pour l'homme par ses propriétés sensibilisantes.
De manière surprenante, les Inventeurs ont montré que des séquences de deux enzymes de la famille des lipocalines, présentes dans la peau et présentant des séquences homologues importantes, permettaient de cribler in vitro des composés susceptibles de se comporter comme des allergènes. Ces enzymes sont la « neutrophil gelatinase associated lipocalin » (NGAL, également appelée lipocaline 2) (SEO et al, Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in skin epidermis, J. Invest. Dermatol., 126, 510-412 ; 2006), et la « prostaglandine D synthase » (L-PGDS) (TAKEDA et al, Lipocalin-type prostaglandin D synthase as a melanocyte marker regulated by MTIF, BBRC, 339, 1098-1106 ; 2006).
NGAL a été identifiée à l'origine comme une protéine de 25kDa associée de manière covalente avec la « neutrophil gelatinase » de 92kDa (ou gelatinase B, MMP-9). L'analyse crystallographique a montré que les ligands naturels de cette enzyme sont une variété de sidérophores ferriques bactériens agissant ainsi comme un bactériostatique. Dans le rein, cette enzyme joue le même rôle en délivrant le fer dans les cellules du néphron. NGAL est induit par le calcium dans les kératinocytes en culture et sa présence dans la peau humaine et murine a été confirmée, particulièrement au niveau de l'épiderme (dans les kératinocytes exclusivement) et des follicules pileux, par hybridation in situ.
L-PGDS dont le rôle initialement décrit est d'isomériser la prostaglandine H2 en prostaglandine D2, fonctionne également comme une protéine lipophile des espaces extracellulaires dont les ligands connus sont la bilirubine, le rétinaldéhyde et l'acide rétinoïque. Des études récentes ont montré que L-PGDS est présente dans les cellules de Langerhans, les mélanocytes, les mastocytes, les histiocytes et les macrophages (mais pas dans les kératinocytes) chez le rat.
Les Inventeurs ont alors identifié des séquences particulières de ces lipocalines ou dérivées de celles-ci, pour la mise au point de méthodes d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant de composés susceptibles de se comporter comme des allergènes.
Ainsi, la présente invention se rapporte à un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés celles-ci, de préférence à un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, et 4, encore plus préférentiellement un polypeptide isolé comprenant la séquence SEQ ID NO :1 ou la séquence SEQ ID NO :3, et encore préférentiellement un polypeptide isolé comprenant la séquence SEQ ID NO :1.
Lesdites séquences sont listées ci-dessous :
Xl ACAX2DELX3EX4 (SEQ ID NO : 1)
X1EX2LEDX3ACAX4 (SEQ ID NO :2)
ECGX1DELX2EX3 (SEQ ID NO :3)
X1EX2LEDX3GCE (SEQ ID NO :4), LYGRTX1ELTSELX2ENFIRFSX3SLGLPEN (SEQ ID NO :5)
LYSRSQNPRAEVX1EHFTTFAX2SLGFTEE (SEQ ID NO :6)
LYGRTX1ELSPELX2ERFTFAX3SLGLX4 (SEQ ID NO :7)
LYSRTQTLX1DELX2EX3FTTFSX4AQGLT (SEQ ID NO :8)
RQNQCETXl (SEQ ID NO :9) TLYGRTX1EL (SEQ ID NO :10)
XlERFTRF AX2 (SEQ ID NO : 11)
X1EX2FTTFSX3 (SEQ ID NO : 12)
LYGRTX1ELS (SEQ ID NO :13)
où Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, de préférence la lysine. Avantageusement, chacun des groupes Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine. Ainsi, avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :1, Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun un groupement lysine, et correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 20 suivante : KACAKDELKEK (SEQ ID NO :20). Préférentiellement, ladite séquence SEQ ID NO:20 présente un groupement aminé (NH2) à son extrémité C-Terminale.
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :2, Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 21 suivante : KEKLEDKACAK (SEQ ID NO :21)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :3, Xl, X2 et X3 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 22 suivante : ECGKDELKEK (SEQ ID NO :22) Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :4, Xl, X2 et X3 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 23 suivante :
KEKLEDKGCE (SEQ ID NO :23)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :5, Xl, X2 et X3 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 24 suivante :
LYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPEN (SEQ ID NO :24)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :6, Xl et X2 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 25 suivante :
LYSRSQNPRAEVKEHFTTFAKSLGFTEE (SEQ ID NO :25)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :7, Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 26 suivante : LYGRTKELSPELKERFTFAKSLGLK (SEQ ID NO :26).
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 27 suivante : LYSRTQTLKDELKEKFTTFSKAQGLT (SEQ ID NO :27).
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :9, Xl représente un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 28 suivante : RQNQCETK (SEQ ID NO :28) Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :10, Xl représente un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 29 suivante : TLYGRTKEL (SEQ ID NO :29)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO : 11 , Xl et X2 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 30 suivante :
KERFTRFAK (SEQ ID NO :30)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :12, Xl, X2 et X3 représentent chacun un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 31 suivante : KEKFTTFSK (SEQ ID NO :31)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :13, Xl représente un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 32 suivante : LYGRTKELS (SEQ ID NO :32)
Avantageusement, les séquences SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 peuvent présenter un groupement acétyl à leur extrémité N-Terminale.
Avantageusement, les séquences SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 peuvent présenter un groupement aminé (NH2) ou amide (C0NH2) à leur extrémité C- Terminale. De préférence, les séquences SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 3, présentent un groupement aminé ou amide à leur extrémité C-Terminale.
Ledit polypeptide isolé selon la présente invention peut être sous la forme L ou sous la forme D.
De préférence, les polypeptides selon la présente invention ont une longueur inférieure à 100 acides aminés, de manière préférée inférieure à 80, de manière encore préférée inférieure à 50, de manière encore préférée inférieure à 40 et de manière préférée entre toute inférieure à 30 acides aminés.
On entend par « dérivés », un polypeptide présentant une ou plusieurs mutations de séquence ne modifiant pas l'activité dudit polypeptide, notamment un polypeptide présentant une ou plusieurs mutations dites 'conservatives' et les mutations n'affectant pas les valeurs de pKa du thiol du résidu de cystéine et/ou de lysine et/ou ayant un pourcentage d'identité d'au moins 80% avec la séquence complète de la séquence SEQ ID NO :1 à 13, de préférence au moins 90%, et encore préférentiellement d'au moins 95%.
On entend par « mutation conservative », une mutation choisie parmi la substitution d'un résidu d'acide aminé basique par un autre résidu d'acide aminé basique, d'un résidu d'acide aminé acide par un autre résidu d'acide aminé acide, d'un résidu d'acide aminé neutre par un autre résidu d'acide aminé neutre, d'un résidu d'acide aminé aliphatique par un autre résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique, d'un résidu d'acide aminé aromatique par un autre résidu d'acide aminé aromatique ou aliphatique, d'un résidu d'acide aminé amidé par un autre résidu d'acide aminé amidé, d'un résidu d'acide aminé alcoolique par un autre résidu d'acide aminé alcoolique.
On entend par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés, les pourcentages d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenus avec le meilleur alignement desdites séquences, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant aléatoirement réparties dans les séquences d'acides aminés. On entend par « meilleur alignement », l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité est le plus élevé. La comparaison de séquence entre deux séquences d'acides aminés est en général réalisée en comparant ces séquences préalablement alignées selon le meilleur alignement ; cette comparaison est réalisée sur des segments de comparaison afin d'identifier et comparer les similarités de régions. Le meilleur alignement de séquences peut être réalisé, outre manuellement, par l'utilisation de l'algorithme d'homologie global développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), l'algorithme d'homologie local développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol, vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode des similarités développée par PEARSON et LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des logiciels utilisant de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA dans le "Wisconsin Genetics software Package », Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d'alignements multiples MUSCLE (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Afin d'obtenir le meilleur alignement local, il peut être préférable d'utiliser le logiciel BLAST, avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés est déterminée en comparant ces deux séquences alignées de façon optimales, les séquences d'acides aminés pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence afin d'obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, et en divisant ce nombre par le nombre total de positions comparées, et en multipliant ce nombre par cent.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide isolé consiste en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de celles-ci, de manière préférée en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO : 4, et des dérivés de celles-ci, de préférence en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3, encore plus préférentiellement en la séquence SEQ ID NO : 1.
Le polypeptide isolé consistant en la séquence SEQ ID NO :1, et encore préférentiellement en la séquence SEQ ID NO :20, est particulièrement préféré car sa synthèse et sa purification sont aisées, il présente une excellente solubilité et est facile à manipuler car peu électrostatique, il n'est que très faiblement dimérisé ce qui facilite son utilisation dans les méthodes selon la présente invention, et enfin il permet de détecter les allergènes fixés sur ladite séquence en une seule étape réactionnelle.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une séquence nucléotidique comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci- dessus.
La séquence nucléotidique selon la présente invention peut être sous forme d'ARN ou d'ADN, de préférence sous forme d'ADN.
Ledit ADN peut être sous forme double brin ou simple brin. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci; b) mesure de la liaison éventuelle dudit composé test avec ledit polypeptide.
Bien entendu, la méthode d'évaluation pourra également être réalisée ex vivo.
La séquence SEQ ID NO :14 représente la séquence polypeptidique de la lipocaline 2 humaine :
MPLGLLWLGLALLGALHAQAQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVV GLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQP GEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELT SELKENFIRFSKYLGLPENHIVFPVPIDQCIDG (SEQ ID NO : 14)
La séquence SEQ ID NO :15 représente la séquence polypeptidique de la lipocaline 2 de souris :
MALSVMCLGLALLGVLQSQAQDSTQNLIPAPSLLTVPLQPDFRSDQFRGR WYVVGLAGNAVQKKTEGSFTMYSTIYELQENNSYNVTSILVRDQDQGCRYWIRT FVPSSRAGQFTLGNMHRYPQVQSYNVQVATTDYNQFAMVFFRKTSENKQYFKITL YGRTKELSPELKERFTRFAKSLGLKDDNIIFSVPTDQCIDN (SEQ ID NO :15)
La séquence SEQ ID NO :16 représente la séquence polypeptidique de la prostaglandine D synthase humaine :
MATHHTLWMGLALLGVLGDLQAAPEAQVSVQPNFQQDKFLGRWFSAGLASNSS
WLREKKAALSMCKSVVAPATDGGLNLTSTFLRKNQCETRTMLLQPAGSLGSYSY
RSPHWGSTYSVSVVETDYDQYALLYSQGSKGPGEDFRMATLYSRTQTPRAELKEK
FTAFCKAQGFTEDTIVFLPQTDKCMTEQ (SEQ ID NO :16)
La séquence SEQ ID NO :17 représente la séquence polypeptidique de la prostaglandine D synthase de souris : MAALRMLWMGLVLLGLLGFPQTPAQGHDTVQPNFQQDKFLGRWYSAGLASNSS WFREKKAVLYMCKTVVAPSTEGGLNLTSTFLRKNQCETKIMVLQPAGAPGHYTY SSPHSGSIHSVSVVEANYDEYALLFSRGTKGPGQDFRMATLYSRTQTLKDELKEKF TTFSKAQGLTEEDIVFLPQPDKCIQE (SEQ ID NO :17)
Avantageusement, un ou plusieurs des résidus lysine des séquences SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 peuvent être remplacés par l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate.
De préférence, le polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de celles-ci.
La mesure de la liaison éventuelle obtenue à l'étape b) peut éventuellement être comparée à un contrôle négatif réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non sensibilisant, comme par exemple le chlorobenzène (Cbz) ou l'acide lactique (LA), ou à un contrôle positif réalisé avec un ligand connu dudit polypeptide. Ainsi, ladite méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination du potentiel sensibilisant d'un composé test. Plus le pourcentage de liaison sera important, plus le potentiel sensibilisant sera important.
Ladite liaison peut par exemple être une liaison covalente, hydrogène, saline, électrostatique, de Van der Waals, une attaque radicalaire... De préférence, ladite liaison est une liaison covalente.
La mesure de la liaison peut être réalisée par toute technique de mesure d'une liaison bien connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer la mesure d'une liaison à l'aide d'un marquage, qui peut être de type antigénique, fluorescent, enzymatique, radioactif, une séparation par chromatographie en phase liquide (HPLC), l'utilisation de la technique de résonance plasmonique de surface, etc...
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur antigénique et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée par le biais d'un anticorps détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique. Ce marqueur antigénique peut être tout type de marqueur connu de l'homme du métier et peut être notamment choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou d'une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la protéine V5. La séquence polyHis contient de préférence de 4 à 6 résidus Histidine. Préférentiellement, le marqueur antigénique est une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis).
Les anticorps utilisés pour détecter ce marqueur antigénique peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Ils peuvent être produits par des techniques conventionnelles connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'anticorps commerciaux. Parmi ceux-ci, on peut citer l'anticorps penta-His HRP conjugate (QIAGEN), l'anticorps de lapin anti-6x His Abcam 9108, l'anticorps de lapin -6x His marqué à la HRP (peroxidase de raifort) Abcam 1187, l'anticorps de souris -anti- 5x His Qiagen 34698, l'anticorps de souris -anti-poly-His Sigma H- 1029.
Les anticorps peuvent être couplés à des marqueurs détectables, connus de l'homme du métier, tels que des enzymes (par exemple la peroxidase de raifort HRP), des marqueurs radioactifs, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc. Préférentiellement, l'anticorps est couplé à la HRP (HorseRadish Peroxydase).
L'immunodétection peut être réalisée par n'importe quelle technique adaptée, par exemple un Western Blot, Dot Blot, etc...
Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur fluorescent et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée par fluorométrie. Le marquage fluorescent peut être direct ou indirect, le fluorophore étant fixé directement sur le polypeptide ou par l'intermédiaire d'un autre marqueur. Le marqueur fluorescent peut être par exemple la fluorescéine, la RPE (R-Phycoerythrin), la GFP (Green Fluorescent Protein), l'APC (AlloPhycoCyanin), les cyanines ou l'Europium.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur enzymatique et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique.
La mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide peut notamment être effectuée à l'aide d'un substrat colorimétrique (p-Nitrophenyl Phosphate ou pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-Phos™), la mesure de l'interaction étant alors effectuée respectivement par spectrophotomètrie à 405 nm, par fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence.
Le polypeptide peut être fixé sur un support. Le support préférentiellement utilisé pour la mise en œuvre de la méthode selon la présente invention est une plaque, une bille ou une puce.
Les polypeptides utilisés dans la méthode selon la présente invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par synthèse artificielle et plus particulièrement par synthèse en phase solide.
Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.
Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.
De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un produit cosmétique ou dermatologique. Le composé test peut être d'origine naturelle ou synthétique. La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. Préférentiellement, la méthode selon l'invention est réalisée en HTS (High Throughput Screening) ou en MTS (Médium Throughput Screening).
Au sens de la présente invention, on entend par « polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes « polypeptide », « peptide » et « protéine » peuvent être indifféremment utilisés.
On entend par « potentiel sensibilisant », le risque pour le composé test de provoquer une réaction immunologique lors de sa mise en contact avec un mammifère, de préférence un humain. Ainsi, le potentiel sensibilisant peut être considéré comme le risque de développer une allergie au contact du composé test.
De préférence, ledit composé test est apte à être appliqué sur la peau. Ainsi, le potentiel sensibilisant correspond au risque de développer une allergie cutanée. De préférence, ledit composé test est apte à entrer dans la composition d'une composition dermatologique ou cosmétique.
De préférence, la méthode selon la présente invention permet d'évaluer si le composé test est susceptible de provoquer une allergie de contact ou dermatite atopique.
De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée dans une solution tampon ayant un pH compris entre 7.3 et 9.3, de manière encore préférée entre 7.8 et 8.8, et de manière particulièrement préférée la solution tampon ayant un pH de 8.3.
De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée à une température comprise entre 200C et 400C, de manière encore préférée entre 25°C et 35°C, de manière encore préférée entre 28°C et 32°C, et de manière préférée entre toute à 300C.
De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée dans l'obscurité.
De préférence, la concentration de polypeptide utilisée pour la mise en œuvre du procédé selon la présente invention est comprise entre 0.2 et 1.5 mM, de manière encore préférée entre 0.4 et 1.2 mM, de manière encore préférée de 1 mM.
De préférence, la concentration du composé test pour la mise en œuvre du procédé selon la présente invention est comprise entre 1 et 10 mM, de manière encore préférée entre 3 et 7 mM, de manière encore préférée entre 4 et 6 mM et de manière préférée entre toute de 5mM. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, le composé test peut être mis au contact de plusieurs polypeptides isolés présentant des séquences différentes.
Dans mode de réalisation particulier, la méthode d'évaluation selon la présente invention peut être un test de compétition, dans laquelle le composé test entre en compétition avec un composé identifié comme sensibilisant. Ledit composé identifié comme sensibilisant pourra être mis en contact avec ledit polypeptide isolé préalablement à l'étape a), ou simultanément à l'étape a). Un tel mode de réalisation permet de comparer le potentiel sensibilisant d'un composé test à celui d'un composé identifié comme sensibilisant.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, comprenant les étapes de : a) mise en contact d'un composé identifié comme sensibilisant, d'un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, et d'un composé candidat pour diminuer la sensibilisation; b) mesure de la liaison éventuelle du composé identifié comme sensibilisant avec ledit polypeptide.
Ladite méthode pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation peut être réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment pour la méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.
On entend par « composé apte à diminuer la sensibilisation », un composé capable de réduire le potentiel sensibilisant d'un composé identifié comme sensibilisant. En d'autres termes, on entend par « composé apte à diminuer la sensibilisation », un composé diminuant le risque de provoquer une réaction immunologique en présence d'un composé identifié comme sensibilisant. On pourra également employé le terme « composé désensibilisant » pour définir le « composé apte à diminuer la sensibilisation ». De préférence, on conclura qu'un composé est apte à diminuer la sensibilisation s'il permet de réduire le potentiel sensibilisant d'un composé identifié comme sensibilisant d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, et de manière préférée 100% par rapport au potentiel sensibilisant observé en l'absence dudit composé désensibilisant.
On entend notamment par « composé identifié comme sensibilisant », un composé susceptible d'être identifié par la méthode de la présente invention, soit, en d'autres termes, un composé identifié comme présentant un potentiel allergène. Le composé susceptible d'être identifié à l'aide de la méthode selon l'invention peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.
De préférence, le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la diphénylcyclopropénone (DPCP), le lauryl gallate (LG), la 3-3-dimethylaminopropylamine
(3-DMAPA), l'aldéhyde cinnamique (CA), le citral (Cal), la 1 ,4-hydroquinone (HQ), le glutaraldéhyde (GA), la l,2-benzisothiazolin-3-one (Ben), la phénylacetaldéhyde (PA) et le lilial (Li), préferentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1,4- hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée est la diphénylcyclopropénone.
La diphénylcyclopropénone est un sensibilisant extrêmement fort ; le lauryl gallate, la 1 ,4- hydroquinone et le glutaraldéhyde sont des sensibilisants forts ; la 3-3- dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la l,2-benzisothiazolin-3-one et la phénylacetaldéhyde sont des sensibilisants modérés, et le lilial est un sensibilisant faible.
Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.
Le composé test peut être d'origine naturelle ou synthétique.
La capacité d'un composé candidat à diminuer ou à inhiber la liaison, peut être évaluée en comparant la capacité de liaison d'un polypeptide comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, avec un composé identifié comme sensibilisant en présence dudit composé candidat, à la capacité de liaison dudit polypeptide avec ledit composé identifié comme sensibilisant en l'absence dudit composé candidat. Ainsi, si une diminution ou une inhibition de la capacité de liaison est observée en présence dudit composé candidat, on pourra en conclure que ledit composé candidat est un composé apte à diminuer la sensibilisation.
De préférence, ledit composé candidat est apte à être utilisé sur la peau et peut être utilisé dans une composition cosmétique ou dermatologique.
L'étape a) peut être réalisée : i) par mise en contact préalable du composé identifié comme sensibilisant et du polypeptide isolé tel que défini précédemment, suivi optionnellement d'une première mesure de la liaison du composé identifié comme sensibilisant avec ledit polypeptide isolé, puis mise en contact avec le composé candidat pour diminuer la sensibilisation avec le composé identifié comme sensibilisant lié au polypeptide isolé ; ii) par mise en contact préalable du composé identifié comme sensibilisant et du composé candidat pour diminuer la sensibilisation puis mise en contact du polypeptide isolé tel que défini précédemment avec le composé identifié comme sensibilisant et le composé candidat pour diminuer la sensibilisation ; ou iii) par mise en contact simultanée du composé identifié comme sensibilisant, du composé candidat pour diminuer la sensibilisation et du polypeptide isolé tel que défini précédemment. De préférence, le polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de celles-ci.
La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en œuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test selon la présente invention, comprenant au moins un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci.
De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de celles-ci, préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.
Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet une trousse pour la mise en œuvre d'une méthode de la sélection de composés aptes à diminuer la sensibilisation selon la présente invention, ladite trousse comprenant au moins un polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, et au moins un composé identifié comme sensibilisant.
De préférence, le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 3-3-dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la 1 ,4-hydroquinone, le glutaraldéhyde, la l,2-Benzisothiazolin-3- one, la phénylacetaldéhyde et le lilial, préférentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1 ,4-hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée est la diphénylcyclopropénone.
De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de celles-ci, préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.
De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de celles-ci, préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.
Exemples
Exemple 1
Un test avec 0.5mM de polypeptide et 5 mM de composé test a été réalisé dans les conditions suivantes :
Le mélange réactionnel contenant 40 μL de solution peptidique (solution mère à 1.25mM dans un tampon acétate d'ammonium à 10OmM à pH 10,2 et le polypeptide de séquence SEQ ID NO :18, SEQ ID NO : 7 dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, ou SEQ ID NO : 8 dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine), 35 μL de solution tampon acétate d'ammonium à 10OmM, à pH 10,2, 20 μL d'acétonitrile et 5 μL de solution à tester (solution mère à 10OmM dans de l'acétonitrile ou un mélange 50% acétonitrile 50% DMSO) a été préparé puis mis sous agitation. La séquence SEQ ID NO :18, qui n'est pas un dérivé de lipocalines, a servi de contrôle positif. Cette séquence correspond à la séquence suivante :
AC-RFAAKAA-NH2 (SEQ ID NO : 18)
Le mélange réactionnel a ensuite été mis à incuber à 300C pendant 4h et dans l'obscurité. Une analyse par HPLC a ensuite été réalisée à un gradient de 10% à 45% de tampon B (acétonitrile + 0.08% de acide trifluoroacetique (TFA)) en 20 min (tampon A : eau + 0.1% de TFA), débit 1 ml/min. La détection a été réalisée sous UV à 230 nm. Le contrôle sans allergène est constitué de 40μL de solution tampon. Les réactifs de synthèse (Fmoc-acides aminés, résine de synthèse) ont été obtenus chez
IRIS BIOTECH (Allemagne), les solvants organiques ont été obtenus chez
SDS/CARLO ERBA (France) et l'acétonitrile a été obtenu chez FISHER BIOBLOCK
(France).
Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
Tableau 1
Figure imgf000019_0001
Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO :7 et dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un parmi Xl, X2, X3 et X4 n'est pas de la lysine.
On observe un pourcentage élevé de fixation du lauryl gallate qui possède un pouvoir sensibilisant fort pour les 3 séquences étudiées, un pourcentage élevé de fixation de l'aldéhyde cinnamique, qui possède un pouvoir sensibilisant modéré, pour la séquence SEQ ID NO : 7 et modéré pour les séquences SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 18.
Exemple 2
Un test avec 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 29 et 5 mM de composé test a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1.
La séquence SEQ ID NO :19, qui n'est pas un dérivé de lipocalines, a servi de contrôle positif. Cette séquence correspond à la séquence suivante :
AC-RFAACAA-NH2 (SEQ ID NO : 19) Le tampon utilisé était le TRIS-HCl à 10OmM à pH8.3.
Tableau 2
Figure imgf000020_0001
Exemple 3
Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 8, dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et 5 mM de composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1. Le tampon utilisé était le TRIS-HCl à 10OmM à pH8.3, pH 9.2 et pH8.8.
Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3
Figure imgf000020_0002
Le terme « fixation » indique qu'une fixation existe, mais que celle-ci n'est pas quantifiable. n/a : fixation non déterminable à un temps de rétention identique.
On observe que de meilleurs résultats sont obtenus à un pH de 8.3. Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un parmi Xl, X2, X3 et X4 n'est pas de la lysine.
Exemple 4
Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 8, dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et 5 mM de composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1. Le tampon utilisé était le TRIS-HCl à 10OmM. Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4
Figure imgf000021_0001
Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un parmi Xl, X2, X3 et X4 n'est pas de la lysine.
Exemple 5
Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptides de séquences SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO :1, dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et présentant un groupement NH2 à son extrémité C-Terminale et SEQ ID NO : 8 dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et 5 mM de composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1. Le tampon utilisé était le TRIS-HCl à 10OmM.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 5
Figure imgf000022_0001
Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO :1 ou dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un parmi Xl, X2, X3 et X4 n'est pas de la lysine. A noter dans le cas des tests de SEQ ID NO : 1 , le signal a été perturbé, empêchant des mesures supérieures à 82-83% de fixation. Ces valeurs représentent par conséquent un minima.
Lors d'une série de mesure réalisée avec la séquence SEQ ID NO : 1, le lauryl gallate et le phénylacetaldéhyde ont très fortement précipités, expliquant ainsi les résultats moyens obtenus.
Une coélution du polypeptide avec les allergènes Cinnamic aldéhyde et 1,2- Benzisothiazolin-3-one a été observée.
Les résultats montrent que le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1 permet d'obtenir des résultats similaires à l'emploi des 2 polypeptides de séquence SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 8, tout en présentant les avantages suivants : peptide court, 11 résidus, synthèse et purification sans difficultés faible dimérisation
- excellente solubilité, aisé à manipuler (peu électrostatique) - test et conditions uniques permet de détecter à la fois les allergènes fixés par la cystéine et ceux fixés par la lysine.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 et des dérivés de celles-ci ; b) mesure de la liaison éventuelle dudit composé test avec ledit polypeptide.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ledit composé test est apte à être appliqué sur la peau.
3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle ledit composé test est apte à entrer dans la composition d'une composition dermatologique ou cosmétique.
4. Méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, comprenant les étapes de : a) mise en contact d'un composé identifié comme sensibilisant, d'un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17, et des dérivés de celles-ci, et d'un composé candidat pour diminuer la sensibilisation; b) mesure de la liaison éventuelle du composé identifié comme sensibilisant avec ledit polypeptide.
5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 3-3-Dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la 1 ,4-hydroquinone, le glutaraldéhyde, la l,2-Benzisothiazolin-3-one, la phénylacetaldéhyde et le lilial.
6. Polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13, et des dérivés de celles-ci.
7. Polypeptide isolé selon la revendication 6, dans lequel ladite séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 présente un groupement acétyl à son extrémité N-Terminale.
8. Polypeptide isolé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel ladite séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 présente un groupement aminé ou amide à son extrémité C-Terminale.
9. Acide nucléique comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.
10. Utilisation d'un polypeptide isolé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.
11. Trousse pour la mise en œuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ladite trousse comprenant au moins un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci.
12. Trousse pour la mise en œuvre d'une méthode de la sélection de composés aptes à diminuer la sensibilisation selon la revendication 4 ou 5, ladite trousse comprenant au moins un polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, et au moins un composé identifié comme sensibilisant.
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