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WO2010114031A1 - 生物学的試料中の物質を検出する方法 - Google Patents

生物学的試料中の物質を検出する方法 Download PDF

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WO2010114031A1
WO2010114031A1 PCT/JP2010/055887 JP2010055887W WO2010114031A1 WO 2010114031 A1 WO2010114031 A1 WO 2010114031A1 JP 2010055887 W JP2010055887 W JP 2010055887W WO 2010114031 A1 WO2010114031 A1 WO 2010114031A1
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WO
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protein
biotin
binding
binding protein
substance
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PCT/JP2010/055887
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English (en)
French (fr)
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由光 高倉
直美 岡
一博 近藤
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Japan Tobacco Inc
Virus Ikagaku Kenkyusho Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Virus Ikagaku Kenkyusho Inc
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    • G01N2333/36—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for qualitatively and / or quantitatively detecting a substance in a biological sample. According to the method of the present invention, it is possible to detect a substance that is present in a trace amount in a biological sample and is usually difficult to detect.
  • test substance In order to detect a substance in a biological sample, a method using a substance that specifically binds to the substance (test substance) has been widely used. For example, a so-called immunoassay using an antigen-antibody reaction, nucleic acid hybridization using a hydrogen bond between nucleic acid chains, and the like.
  • the test substance if the test substance is an antibody, the antigen is immobilized. Conversely, if the test substance is an antigen, the antibody is immobilized on a carrier such as a microplate, a microbead, or a sensor chip and reacted with the test substance. Then, the presence / absence and extent of the antigen-antibody reaction is detected and measured.
  • Hydrophobic bonds, covalent bonds, etc. are known as general methods for immobilization.
  • “Hydrophobic binding” utilizes the interaction between the hydrophobic surface of the carrier and the hydrophobic portion of a protein that binds specifically to the substance to be detected (hereinafter sometimes referred to as “specific protein”).
  • specific protein a protein that binds specifically to the substance to be detected
  • the binding force is generally weak, and when used for ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) or the like, the protein often leaves the carrier by a washing operation after the binding.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • the “covalent bond” uses an interaction between a functional group (for example, an amino group) in a specific protein and a functional group (for example, a carboxyl group) arranged on the surface of the carrier, and has a strong binding force.
  • a functional group for example, an amino group
  • a functional group for example, a carboxyl group
  • biotin vitamin H
  • avidin is an egg white-derived glycoprotein that binds very strongly to biotin.
  • the interaction between avidin and biotin is one of the strongest non-covalent bonds (Green (1975) Adv Protein Chem 29: 85-133).
  • streptavidin is an avidin-like protein derived from actinomycetes and also binds strongly to biotin.
  • Biotin is a small molecule with a molecular weight of 244, and can be easily bound to various biomolecules such as proteins, nucleic acids, lipids, sugar chains, etc. using commercially available kits.
  • (strept) avidin-biotin has been widely used in the field of molecular biology and biochemistry such as detection of antigens and antibodies due to the strength of its action (Green (1990). ) Methods Enzymol 184: 51-67).
  • (strept) avidin is first bound to a substrate such as a microplate by covalent bond or hydrophobic bond, and then bound to a biotinylated protein. There is a way to fix it.
  • avidin is first bound to a biotin-bound substrate by an avidin-biotin bond, and the desired biotinylated protein is bound to another biotin pocket of the avidin, whereby the substrate-biotin-avidin is bound.
  • a technique of immobilizing in the order of -biotin-desired protein has been reported (JP-A-4-236353).
  • a test substance can be detected using a plate immobilized by such a method.
  • Non-specific binding that causes background signals is reduced in a specific binding assay system using a solid phase in which proteins that specifically bind to test substances such as antigens and antibodies are bound by hydrophobic or covalent bonds.
  • Methods for solving this problem include, for example, a method in which a bacterial component extract is contained in a detection reagent (Japanese Patent Laid-Open No. 59-99257), and the same type of vector used for production of a recombinant protein that specifically binds to a test substance. And a method for adding a culture component of a host cell introduced with a vector not containing a gene encoding the protein to a sample (Japanese Patent Laid-Open No.
  • An object of the present invention is to provide a method for qualitatively and / or quantitatively detecting a substance in a biological sample.
  • the object of the present invention is to provide a method for detecting and measuring a substance present in a trace amount in a biological sample qualitatively and / or quantitatively while suppressing a background signal.
  • the present inventors immobilized a biotinylated protein obtained by binding biotin to a protein that specifically binds to a test substance using a bond between biotin and biotin-binding protein.
  • the present invention has been conceived by devising to reduce the background signal particularly in detecting a substance present in a trace amount in a biological sample. Specifically, when a cell disruption extract and a biotin-binding protein were added to a biological sample, the effect of reducing nonspecific binding was significant. Alternatively, the same effect was obtained by adding a cell disruption extract prepared from cells in which biotin-binding protein was expressed by genetic engineering technology instead of adding biotin-binding protein.
  • the present invention provides a more sensitive detection method that reduces nonspecific binding in a system in which a substance that specifically detects a test substance is immobilized on a carrier using an avidin-biotin bond. It is to provide.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for detecting a substance in a biological sample comprising: 1) Prepare a biotinylated protein in which biotin is bound to a carrier bound to a biotin-binding protein and a protein that specifically binds to the substance to be detected; 2) A biotinylated protein is bound to the carrier prepared in step 1) via a bond between biotin and biotin-binding protein to prepare a carrier to which the biotinylated protein is bound; 3) To the carrier to which the biotinylated protein prepared in step 2) is bound, (A) a biological sample, and (bi) a biotin-binding protein of step 1), a protein that specifically binds to a substance to be detected, and / or a host cell used to express a biotinylated protein Cell disruption extract prepared from the same type of cells, biotin-binding protein, or (b-ii) biotin-binding protein of step 1), protein that specifically binds to the substance to be detected;
  • a kit for detecting a substance in a biological sample A) a carrier in which a biotinylated protein obtained by binding biotin to a protein that specifically binds to a substance to be detected is bound by biotin-biotin-binding protein binding; and Bi) Cell disruption extract prepared from cells of the same type as the host cell used to express the biotin-binding protein of A), the protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or the biotinylated protein Biotin-binding protein, or B-ii) A) biotin-binding protein, protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or host cell used to express biotinylated protein An agent for diluting a biological sample containing a cell disruption extract prepared from a cell in which a biotin-binding protein is expressed by genetic engineering technology in the cell; Including kit.
  • a background signal in detecting a test substance in a biological sample, a background signal can be suppressed and more sensitive detection can be stably performed. According to the method of the present invention, it is possible to detect and measure a substance that is present in a trace amount in a biological sample and is usually difficult to detect or accurately quantify.
  • FIG. 1 shows the expression of a BioEase tag (biotinylated tag) fused SITH-1 protein. Specifically, FIG. 1A shows the result of Western blotting for detection of SITH-1 protein, and FIG. 1B shows the result of activity staining for detection of biotinylated protein.
  • E. coli BL21 (DE3) expressing the BioEase tag-fused SITH-1 protein was sonicated, and the resulting E. coli crude extract fraction was subjected to SDS-PAGE (15% acrylamide gel) to give 20 ⁇ g total protein / lane. And then transferred to a PVDF membrane.
  • FIG. 1A reacted with anti-SITH-1 antibody (diluted 1/1000), reacted with alkaline phosphatase (AP) -labeled anti-rabbit IgG antibody (diluted 1/1000), and then stained with AP.
  • FIG. 1B is a stained image after a streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) (1/1000 dilution) reaction.
  • HRP streptavidin-horseradish peroxidase
  • Control indicates an extract sample derived from Escherichia coli having only an expression vector.
  • the position of the BioEase tag-fused SITH-1 protein is indicated by an arrow.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of various serum dilutions on nonspecific binding. Serum diluted with PBS (white squares (dashed line)), diluted with PBS plus purified tamavidin 2 (TM2), white square (solid lines), diluted with E. coli disruption extract containing only expression vector The asterisk (broken line) is the asterisk (broken line), the asterisk (solid line) is diluted with the E.
  • FIG. 3 is a graph showing the S / N ratio for each dilution ratio of the anti-SITH-1 antibody based on the results shown in FIG.
  • Serum diluted with PBS (white squares (dashed line)), diluted with PBS plus purified tamavidin 2 (TM2), white square (solid lines), diluted with E. coli disruption extract containing only expression vector
  • the asterisk (broken line) is the asterisk (broken line)
  • the asterisk (solid line) is diluted with the E. coli disrupted extract containing only the expression vector
  • the black circle (solid line) is diluted with the E. coli disrupted extract expressing TM2.
  • the detection method of the present invention comprises: 1) Prepare a biotinylated protein in which biotin is bound to a carrier bound to a biotin-binding protein and a protein that specifically binds to the substance to be detected; 2) A biotinylated protein is bound to the carrier prepared in step 1) via a bond between biotin and biotin-binding protein to prepare a carrier to which the biotinylated protein is bound; 3) To the carrier to which the biotinylated protein prepared in step 2) is bound, (A) a biological sample, and (bi) a biotin-binding protein of step 1), a protein that specifically binds to a substance to be detected, and / or a host cell used to express a biotinylated protein Cell disruption extract prepared from the same type of cells, biotin-binding protein, or (b-ii) biotin-binding protein of step 1), protein that specifically binds to the substance to
  • the present invention relates to a method for detecting a substance in a biological sample.
  • the biological sample in the present invention is not particularly limited as long as it can contain a substance to be detected.
  • the body fluids should be diluted as necessary.
  • the dilution rate is usually about 2 to 10,000 times, preferably about 100 to 1000 times, but is not limited thereto.
  • Any buffer may be used as the solution for dilution, but it may contain an appropriate blocking agent.
  • the blocking agent those having a high effect of suppressing non-specific binding are good, and blocking agents well known to those skilled in the art, such as BSA and casein, can be used.
  • test substance of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that is desired to be detected or measured in a biological sample.
  • proteins such as antibodies and antigens and fragments thereof, peptides, nucleic acids, hormones, carbohydrates
  • Preferred examples thereof include glycolipids, bacteria and viruses contained in biological samples.
  • the present invention makes it possible to measure substances in biological samples that have a low concentration and have been difficult to detect or accurately quantify by conventional methods.
  • the test substance is an antibody in serum and the antibody titer is lower (for example, detection is difficult when the serum is diluted 1000-fold, but detection is finally possible when the serum is diluted 100-fold.
  • the antibody titer it is necessary to suppress the dilution rate of serum, and as a result, nonspecific binding derived from serum components also increases.
  • detection and quantification of an antibody are difficult, it can be easily detected or quantified more accurately by the method of the present invention.
  • test substance in the present invention is an antibody
  • Small protein encoded by the intermediate Transform of HHV-6 small protein encoded by HHV-6 latent infection intermediate transcript
  • Antibodies against SITH-1 are included.
  • antibodies against other antigens of herpes virus antibodies against virus-related antigens derived from cytomegalovirus, hepatitis virus, HIV virus, HTLV virus, measles virus, influenza virus, etc. or derived from Helicobacter pylori Antibody against a bacterial-related antigen, or an antibody against a fungus-related antigen.
  • test substance in the present invention is an antigen
  • examples include antigens derived from the above pathogens, cancer antigens, prostate-specific antigens, and the like.
  • SITH-1 based on the description in PCT / JP2008 / 67300 (1) SITH-1 protein and nucleic acid The structure and function of SITH-1 protein and nucleic acid are disclosed in PCT / JP2008 / 67300, the entire contents of which are incorporated herein.
  • SITH-1 is a factor involved in latent infection of herpesvirus, more specifically, a protein specifically expressed during latent infection of herpesvirus.
  • “specifically expressed at the time of latent infection of herpes virus” specifically means that when a herpes virus is latently infected (not proliferatively infected) in a host infected with herpes virus, It means that a gene or gene product derived from a herpes virus is expressed.
  • Examples of the protein and nucleic acid of SITH-1 include (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a nucleic acid encoding this protein.
  • the SITH-1 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is isolated and identified as a protein that is specifically expressed during latent infection with human herpesvirus-6 (HHV-6), as shown in a reference example described later. It has been done.
  • the SITH-1 protein is a protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of 159 amino acids and having a molecular weight of about 17.5 kDa.
  • SITH-1 protein is encoded by the nucleic acid of the SITH-1 gene.
  • the cDNA of this SITH-1 gene has a size of 1795 base pairs (about 1.79 kbp), and the 954th to 956th base sequences are the start codon (Kozak ATG).
  • the base sequence from the 1431st to 1433th is a stop codon (TAA). Therefore, the SITH-1 nucleic acid has a 954 to 1430 base sequence as an open reading frame (ORF) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and this ORF has 477 base pairs (about 0.48 kbp).
  • ORF open reading frame
  • the base sequence representing the ORF region is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is described including the 3 bases of the stop codon.
  • the SITH-1 nucleic acid is always expressed in the cytoplasm of cells latently infected with HHV-6, whereas no expression is observed in proliferatively infected cells.
  • the nucleic acid encoding the SITH-1 protein is encoded by DNA complementary to the HHV-6 latent infection specific gene (H6LT) reported so far, and its expression is intermediate between the latent infection of HHV-6. Strengthen in stages. From these facts, the SITH-1 protein is considered to be a protein that is specifically expressed during latent infection with HHV-6.
  • SITH-1 protein binds to host protein CAML (calcium-modulating cyclophilin ligand, Access #; U18242) to increase the intracellular calcium concentration in glial cells.
  • CAML is a protein that is abundant in the brain and lymphocytes in the host organism and is known to increase intracellular calcium concentration.
  • an increase in intracellular calcium concentration due to the expression of SITH-1 protein leads to activation of general signal transduction in latently infected cells, and is considered to contribute to efficient reactivation of HHV-6. .
  • HHV-6 is known to latently infect glial cells in the brain, and when HHV-6 in the intermediate stage of latent infection or in a highly active latent infection state expresses SITH-1, glial cells It is thought that the calcium concentration inside increases. An increase in intracellular calcium concentration in brain cells is considered to be greatly related to mental disorders such as mood disorders (RIKEN Annual Report 2003).
  • SITH-1 protein retains the activity of binding to CAML, which is a host protein, and has a function of increasing intracellular calcium concentration.
  • mental disorders can be induced by expressing the SITH-1 protein in glial cells in the brain where the protein is most strongly expressed. Therefore, the SITH-1 protein is expressed during the latent infection of herpes virus or at the early stage of reactivation, and is considered to have a function of causing psychiatric disorders in the host.
  • An antibody against SITH-1 can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using SITH-1 protein or a variant thereof, or a partial peptide thereof as an antigen.
  • Known methods include, for example, literature (Harlow et al., “Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988))”, Iwasaki et al., “Monoclonal antibody hybridoma and ELISA 91, Kodansha”. The method of description is mentioned. The antibody thus obtained can be used for detection and measurement of SITH-1 protein.
  • antibody means an immunoglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and Fab fragments thereof, F (ab ′) 2 fragment, Fc fragment), and examples include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Examples include, but are not limited to, chain antibodies, anti-idiotype antibodies, and humanized antibodies.
  • immunoglobulin IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and Fab fragments thereof, F (ab ′) 2 fragment, Fc fragment
  • antibody recognizing SITH-1 protein is meant to include complete molecules and antibody fragments (eg, Fab and F (ab ′) 2 fragments) that can specifically bind to SITH-1 protein.
  • Fab and F (ab ′) 2 and other fragments of the SITH-1 antibody can be used according to the methods disclosed herein or known methods. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (resulting in Fab fragments) or pepsin (resulting in F (ab ′) 2 fragments).
  • the present invention makes it possible to identify a mood disorder patient or an individual with a potential mood disorder by detecting a SITH-1 antibody in a biological sample.
  • a biotinylated protein-bound carrier in which biotin is bound to a protein that specifically binds to a substance to be detected is a biotinylated protein in which biotin is bound to a protein that specifically binds to a substance to be detected. Utilizes a carrier that is bound by a biotin-biotin binding protein-protein bond.
  • the carrier of the present invention comprises 1) Prepare a biotinylated protein in which biotin is bound to a carrier bound to a biotin-binding protein and a protein that specifically binds to the substance to be detected; 2) The biotinylated protein is bound to the carrier prepared in step 1) via the biotin-biotin-binding protein bond, thereby creating a carrier to which the biotinylated protein is bound. Can be created.
  • Biotin is the generic name for D-[(+)-cis-hexahydro-2-oxo-1H-thieno- (3,4) -imidazole-4-valeric acid]. It is a kind of water-soluble vitamin classified into the vitamin B group and is also called Vitamin B 7 (vitamin B 7 ), or sometimes called vitamin H or coenzyme R. Biotin binds very strongly to avidin, a kind of glycoprotein contained in egg white, and its absorption is inhibited. Therefore, a large amount of raw egg white can cause biotin deficiency.
  • biotin refers to iminobiotin (Hofmann et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4666-4668) and desthiobiotin (Hirsch) in addition to the above biotin. et al. (2002) Anal Biochem 308: 343-357), or biotin analogues such as biocytin and biotin sulfoxide.
  • biotin-avidin biotin-binding protein
  • the present invention includes immobilizing a protein that specifically binds to a substance to be detected on a carrier using the binding between biotin and biotin-binding protein.
  • binding between biotin and biotin-binding protein may be referred to as “avidin-biotin binding”.
  • Biotin-binding proteins include avidin, streptavidin, neutravidin, AVR protein (Biochem. J., (2002), 363: 609-617), bradavidin (J. Biol. Chem., (2005), 280: 13250-13255), Rhizavidin (Biochem. J., (2007), 405: 397-405), tamavidin (WO02 / 072817) and their mutants, etc., bind strongly to biotin. Any protein can be suitably used.
  • the dissociation constant (KD) with biotin is 10 ⁇ 8 M or less, more preferably 10 ⁇ 10 M or less, and further preferably 10 ⁇ 12 M or less.
  • the biotin-binding protein added to the test sample is as described later.
  • biotin-binding protein tamavidin highly expressed in E. coli and mutants thereof can be preferably used.
  • Tamavidin is a biotin-binding protein discovered from the edible mushroom Pleurotus concopiae (WO 02/072817, Takakura et al. (2009) FEBS J 276: 1383-1397).
  • tamavidin variants include high binding ability and low non-specific binding tamavidin (PCT / JP2009 / 64302).
  • “Tamavidin” in the present invention means tamavidin 1 (TM1), tamavidin 2 (TM2), or a variant thereof.
  • the tamavidin of the present invention is typically encoded by a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • the tamavidin of the present invention is a variant of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or a protein encoded by a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • tamavidin 1 may be a protein having biotin binding activity similar to that of tamavidin 1 or 2, or a protein having high binding ability and low non-specific binding activity.
  • tamavidin 1, tamavidin 2, and variants thereof may be collectively referred to simply as tamavidin.
  • a tamavidin 1 or 2 variant is a protein comprising an amino acid sequence comprising a deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7, Alternatively, it may be a protein having biotin binding activity similar to 2.
  • the substitution may be a conservative substitution, which is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics.
  • Non-limiting examples of conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues such as Ile, Val, Leu or Ala mutual substitutions, Lys and Arg, Glu and Asp, Gln and Asn mutual substitutions. Substitution between polar residues such as substitution is included.
  • Mutants due to amino acid deletion, substitution, insertion and / or addition may be performed on, for example, site-directed mutagenesis (eg, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20), which is a well-known technique, on DNA encoding a wild-type protein. , P. 6487-6500, 1982, the entire contents of which are incorporated herein by reference).
  • site-directed mutagenesis eg, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20
  • one or more amino acids means amino acids that can be deleted, substituted, inserted and / or added by site-directed mutagenesis.
  • “one or more amino acids” may mean one or several amino acids depending on the case. Without limitation, “one or more amino acids” means 50 or less, preferably 40 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 8 or less, 5 or less, 3 or less, Means within amino acids.
  • the tamavidin 1 or 2 variant further comprises at least 60% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7, preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, A protein comprising an amino acid sequence having 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, and more preferably 99.3% or more, comprising tamavidin 1 or 2 It may be a protein having the same biotin binding activity, or a protein having a high binding ability and a low non-specific binding activity.
  • The% identity between two amino acid sequences may be determined by visual inspection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity of two protein sequences can be determined by Needleman, S .; B. And Wunsch, C.I. D. (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) and determined by comparing sequence information using the GAP computer program available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). May be.
  • Preferred default parameters for the GAP program include: (1) Henikoff, S .; And Henikoff, J.H. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992), scoring matrix, blossum 62; (2) gap weight of 12, (3) gap length weight of 4; And (4) no penalty for end gaps.
  • the percent identity can be determined by comparison with sequence information using, for example, the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997).
  • the program can be used on the Internet from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) or the DNA Data Bank of Japan (DDBJ) website.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • Various conditions (parameters) for identity search by the BLAST program are described in detail on the same site, and some settings can be changed as appropriate, but the search is usually performed using default values.
  • the percent identity between two amino acid sequences can be determined by genetic information processing software GENETYX Ver. It may be determined using a program such as 7 (manufactured by Genetics) or the FASTA algorithm. At that time, the default value may be used for the search.
  • the percent identity between two nucleic acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation, or more preferably, this comparison is made by comparing the sequence information using a computer program.
  • a typical preferred computer program is the Wisconsin package, version 10.0 program “GAP” from the Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wis.) (Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res. , 12: 387).
  • GAP Genetics Computer Group
  • two amino acid sequences can be compared, and a nucleic acid sequence and an amino acid sequence can be compared.
  • biotin-binding protein that binds to a carrier is used to create a carrier to which a biotinylated protein is bound through a bond between biotin and a biotin-binding protein. Therefore, the tamavidin 1 or 2 mutant is not significantly reduced in biotin-binding activity as compared to the case where a biotinylated protein is formed using these wild-types. Is preferred.
  • the mutant of tamavidin 1 is not modified in N14, S18, Y34, S36, S78, W82, W98, W110, and D118 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Y34 in the notation means the 34th tyrosine residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the mutant of tamavidin 2 does not modify four tryptophan residues (W69, W80, W96, W108) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • modification to an amino acid having similar properties or structure for example, phenylalanine (F) is preferable.
  • the amino acid residues (N14, S18, Y34, S36, S76, T78, D116) considered to directly interact with biotin are not modified.
  • glutamine (Q) or aspartic acid (D ) Preferably to aspartic acid, in the case of aspartic acid (D40) to asparagine (N), in the case of serine (S18, S36, S76), to threonine (T) or tyrosine (Y), preferably threonine
  • tyrosine (Y34) serine (S), threonine (T) or phenylalanine (F), preferably to phenylalanine, and in the case of threonine (T78), to serine (S) or tyrosine (Y)
  • serine in the case of aspartic acid (D116), glutamic acid (E) or aspa Gin to (N)
  • preferable tamavidin variants include the following. (PCT / JP2009 / 64302).
  • a protein showing biotin-binding activity comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or an amino acid sequence having one to several amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence
  • Group 1 Arginine residue at position 104 of SEQ ID NO: 7; 2) 141st lysine residue of SEQ ID NO: 7; 3) the 26th lysine residue of SEQ ID NO: 7; and 4) one or more residues selected from the 73rd lysine residue of SEQ ID NO: 7 are substituted with an acidic amino acid residue or a neutral amino acid residue
  • a modified biotin-binding protein in which the 104th arginine residue is substituted with a glutamic acid residue and the 141st lysine residue is substituted with a glutamic acid residue.
  • Biotin-binding protein-bound carrier The material constituting the solid carrier is cellulose, Teflon (registered trademark), nitrocellulose, agarose, highly crosslinked spherical agarose, dextran, chitosan, polystyrene, polyacrylamide, polyester, polycarbonate, polyamide, polypropylene , Nylon, polyvinylidene difluoride, latex, polystyrene latex, silica, glass, glass fiber, gold, platinum, silver, copper, iron, stainless steel, ferrite, silicon wafer, polyethylene, polyethyleneimine, polylactic acid, resin, many Including but not limited to sugars, proteins (such as albumin), carbon or combinations thereof. Further, those having a certain strength, a stable composition, and little nonspecific binding are preferable.
  • the shape of the solid support includes, but is not limited to, beads, magnetic beads, thin films, microtubes, filters, plates, microplates, carbon nanotubes, sensor chips, and the like.
  • Flat solid carriers such as thin films and plates may be provided with pits, grooves, filter bottoms, etc., as is known in the art.
  • the beads can have a sphere diameter ranging from about 25 nm to about 1 mm. In preferred embodiments, the beads have a diameter in the range of about 50 nm to about 10 ⁇ m. The size of the beads can be selected depending on the particular application.
  • the beads as described above can be preferably used.
  • the biotin-binding protein may be directly bound to the carrier, or a carrier on which the biotin-binding protein is immobilized in advance may be purchased. Alternatively, it may be bound to a biotinylated carrier via a biotin-biotin-binding protein-protein bond.
  • a biotin-binding protein As a method for directly binding a biotin-binding protein, there is a method using a hydrophobic bond or a covalent bond.
  • a biotin-binding protein may be directly bound and immobilized on a microplate such as NEW ELISA Plate Kit (Sumitomo Bakelite) according to the instructions attached to the kit.
  • Avidin and streptavidin are commercially available from, for example, SIGMA.
  • the biotin-binding protein solution is, for example, a microplate or the like (for example, but not limited to, Nunc-Immuno? Plate (Nunc), SpectraPlate-96 HB (Perkin Elmer), or Reacti -Direct contact with the support surface of Bind (trademark) 96-Well Plates Corner Notch (PIERCE), etc., and binding by interaction between the hydrophobic part of the biotin-binding protein and the hydrophobic part of the support by placing it for a certain period of time , Immobilize.
  • a microplate or the like for example, but not limited to, Nunc-Immuno? Plate (Nunc), SpectraPlate-96 HB (Perkin Elmer), or Reacti -Direct contact with the support surface of Bind (trademark) 96-Well Plates Corner Notch (PIERCE), etc.
  • a functional group is arranged on the surface of the carrier, and this is bonded to the functional group in the biotin-binding protein.
  • various carriers having various functional groups arranged on the surface are commercially available and can be preferably used.
  • a microplate on which functional groups are arranged on the surface as a maleic anhydride plate, for example, Reacti-Bind (trademark), Maleic Anhydride Activated Polyplate 96-Well Plates (PIERCE), As an active amino group plate, for example, Immobilizer?
  • -Amino Modules / Plates or as a carboxyl group plate, for example, an ELISA plate MS-8896F (96 well, C type, flat bottom, carbo) (Sumitomo Bakelite).
  • the microbeads having functional groups arranged on the surface include Sepharose (trademark) (GE Healthcare Bioscience) as a highly crosslinked agarose bead, and Dynabeads (trademark) (Dynal) as a magnetic bead. However, it is not limited to these.
  • the biotin-binding protein and the solid support may be linked according to the instructions attached to the support.
  • the carboxyl group of a solid support whose surface is modified so that the carboxyl group is exposed and the amino group of a biotin-binding protein can be converted into the crosslinking reagent 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
  • EDC crosslinking reagent 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • a biotin-binding protein and a solid support can be linked by a coupling reaction in the presence.
  • a biotin-binding protein is mixed with a solid support whose surface is active esterified with N-hydroxysuccinide (NHS) in a buffer solution of pH 6.5 to 9 containing no primary amino group, and the carboxyl group on the surface of the solid support is mixed.
  • the amino group of the biotin-binding protein can be linked.
  • the crosslinking reagent BS3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate
  • DSS disuccinimidyl suberate
  • the amino group on the surface of the solid support and the amino group of the biotin-binding protein or the crosslinking reagent SPDP Using (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate) or GMBS (N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide) to bind the amino group on the surface of the solid support and the thiol group of the biotin-binding protein.
  • SPDP Using (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate) or GMBS (N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide) to bind the amino group on the surface of the solid support and the thiol group of the biotin-binding protein.
  • the biotin-binding protein can be biotinylated on the carrier and bound via an avidin-biotin bond. That is, by utilizing the fact that most of biotin-binding proteins are tetramers, biotin-binding protein is bound to a biotin-bonded carrier, and then biotinylated protein is further bound.
  • Examples of a method for binding biotin to a carrier include a method using a biotinylation reagent.
  • the biotinylation reagent include PZERCE (linker length in parentheses, reactive group) EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-Biotin (13.5 ⁇ , primary amine), EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-LC-Biotin (22.4 ⁇ , primary amine), EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin (30.5 ⁇ , primary amine), EZ-Link (registered trademark) PFP- Biotin (9.6 ⁇ , amine), EZ-Link (registered trademark) Maleimide-PEO 2 -Biotin (29.1 ⁇ , thiol group), EZ-Link (registered trademark) Biotin-PEO 2 Amine (20.4 ⁇ , carboxyl group) ), EZ-Link (registered trademark) Biotin-PE
  • biotin can be bound to a desired carrier such as a microplate, microbeads, or sensor chip using a known method.
  • a desired carrier such as a microplate, microbeads, or sensor chip using a known method.
  • carriers having various functional groups such as amino group, carboxyl group, thiol group, tosyl group, epoxy group, maleimide group, activated ester (for example, magnetic beads, sepharose beads, agarose beads, latex beads, microtiter plates, etc.)
  • a method of using is a method of using.
  • a biotinylation reagent containing NHS ester when used, it should be dissolved in an organic solvent such as DMSO (demethylsulfoxide) or a phosphate buffer of pH 7-9 and added to an immobilization carrier having an amino group.
  • an organic solvent such as DMSO (demethylsulfoxide) or a phosphate buffer of pH 7-9
  • Biotin can be bound by
  • a biotinylation reagent containing an amino group is used, the carboxyl group of the immobilization carrier is converted into an activated ester using a carbodiimide such as EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride).
  • biotinylation reagent dissolved in a buffer solution at around pH 5 may be added to bind biotin.
  • the biotinylated immobilization carrier is preferably blocked with BSA or the like after inactivating unreacted functional groups.
  • biotinylated commercially available carrier can be used.
  • Reacti-Bind (trademark) Biotin Coated Polystyrene Plates (manufactured by PIERCE) can be used as the biotinylated microplate, but is not limited thereto.
  • biotinylated microbeads include, for example, BioMag Biotin (manufactured by Polysciences) as magnetic beads, and Nanomag (registered trademark) -D biotin, nanomag (registered trademark) -silica manufactured by Corefront Co., Ltd. as nanomagnetic beads.
  • Biotin is a polystyrene microbead
  • Beadlyte registered trademark
  • Biotin Beads Upstate
  • Sigma Biotin Agarose
  • 2-iminobiotin-Agarose is a highly crosslinked agarose
  • Biotin-Sepharose Technology can be used, but is not limited thereto.
  • the length of the linker connecting the carrier and biotin is preferably at least longer than 5 mm, more preferably 13.5 mm or longer.
  • a carrier having a biotin-binding protein bound thereto By bringing a biotin-binding protein into contact with such a biotinylated carrier, a carrier having a biotin-binding protein bound thereto can be produced.
  • Biotinylated protein In the present invention, biotin is bound to a protein that specifically binds to a test substance, a biotinylated protein is prepared, and this is bound to a carrier using a biotin-biotin-binding protein-binding bond. It's okay.
  • the biotinylated protein production method is not particularly limited, but a biotin labeling kit (for example, but not limited to, EZ-Link? NHS-Lc-Biotin PIERCE) or Biotin Labeling Kit- NH2 (DOJINDO MOLECULAR TECHNOLOGIES INC.) Or the like may be used to bind biotin to a protein that specifically binds to the test substance.
  • a protein gene that specifically binds to a test substance is fused with a DNA encoding a peptide containing a biotinylated sequence, and a vector that expresses the fusion gene is constructed.
  • a fusion protein with a biotinylated sequence in any host As a biotinylated protein (Schwarz et al., (1988). J. Biol. Chem. 263: 9640-9645.).
  • a vector include, but are not limited to, a vector containing an Invitrogen BioEase TM tag (Example 1 in this specification).
  • Invitrogen BioEase TM tag Example 1 in this specification.
  • pcDNA TM 6 vectors for mammalian cell expression there are pET104 vectors for E. coli expression, and pMT / BioEase vectors for Drosophila expression.
  • biotinylation reagent examples include PZERCE (linker length in parentheses, reactive group) EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-Biotin (13.5 ⁇ , primary amine), EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-LC-Biotin (22.4 ⁇ , primary amine), EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin (30.5 ⁇ , primary amine), EZ-Link (registered trademark) PFP- Biotin (9.6 ⁇ , amine), EZ-Link (registered trademark) Maleimide-PEO 2 -Biotin (29.1 ⁇ , thiol group), EZ-Link (registered trademark) Biotin-PEO
  • biotin can be bound to a desired protein using a known method.
  • biotinylation reagent containing NHS ester when a biotinylation reagent containing NHS ester is used, biotin is bound by dissolving in an organic solvent such as DMSO (demethylsulfoxide) or a pH 7-9 phosphate buffer and adding it to the desired protein. Can do.
  • an organic solvent such as DMSO (demethylsulfoxide) or a pH 7-9 phosphate buffer
  • DMSO demethylsulfoxide
  • pH 7-9 phosphate buffer a pH 7-9 phosphate buffer
  • a carboxyl group of a desired protein is converted into an activated ester using a carbodiimide such as EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbohydride hydrochloride).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbohydride hydrochloride
  • a protein that specifically binds to a test substance in advance, Purification may be performed from the organism from which the protein is originally derived, or may be purified after the gene encoding the protein is incorporated into an expression vector and expressed in a desired host cell through genetic engineering. Good.
  • Host cells include mammalian cells (eg, but not limited to cells derived from primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats, Chinese hamsters, and dogs), insect cells (using baculoviruses) Expression system, Drosophila system, etc.), yeast, Escherichia coli, plant, Bacillus subtilis and the like.
  • Escherichia coli can be mentioned.
  • HEK293, HeLa, HepG2, 293T for humans CHO, NIH3T3, PC12 for rodents, COS-1, COS-7, MDCK, Vero for insects, and insect cells for other mammals.
  • Established cultured cell lines such as Sf9 and S2 can be preferably used.
  • the protein can be expressed using a cell-free expression system using a wheat germ extract or an insect cell extract.
  • the expression vector can be appropriately selected by those skilled in the art as appropriate for the host cell to be used.
  • Purification of the expressed protein can use methods well known to those skilled in the art. Ordinary ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography and the like may be used in combination, but a purification tag sequence may be used.
  • a protein that specifically binds to the test substance as a fusion protein with glutathione-S-transferase, maltose binding protein, cellulose binding protein, chitin binding protein, thioredoxin binding protein, etc. It may be expressed in a host and purified using the affinity for glutathione, maltose, cellulose, chitin, thioredoxin (for example, using a glutathione-immobilized column).
  • a protease recognition site is introduced into a fusion site with a protein that specifically binds to a test substance in advance, it can be removed by treating the tag sequence with the protease after purification.
  • the protease those known to those skilled in the art such as enterokinase and Factor Xa may be used.
  • HisTag or Strep (II) -Tag it is also possible to use HisTag or Strep (II) -Tag to purify using a column in which ionized nickel and StrepTactin are immobilized.
  • a plurality of tags may be fused to a protein that specifically binds to the test substance, and purification methods may be combined.
  • HisTag and a biotinylated sequence such as BioEASE (trademark) (Invitrogen) are fused to the end of a protein that specifically binds to a test substance, and expressed as a recombinant protein in a host, followed by purification with a nickel column. And may be further purified with a low affinity avidin or low affinity streptavidin (eg, SA mutein, Roche) column.
  • biotinylated protein and a carrier to which a biotin-binding protein is bound are prepared and brought into contact with each other to bind the protein to the carrier via an avidin-biotin bond. Can be made.
  • a crude cell disruption extract containing biotinylated protein is prepared at a total protein concentration of 0.1 mg / ml to 5 mg / ml, preferably 0.2 mg / ml to 2 mg / ml. This is contacted with a carrier to which a biotin-binding protein is bound at 10 ° C. to 40 ° C., preferably 20 ° C. to 30 ° C., for 5 minutes to 2 hours, preferably 30 minutes to 1 hour. By this operation, the biotinylated protein is immobilized on a carrier to which a biotin-binding protein is bound.
  • the excess crude cell disruption extract is washed in a buffer solution such as PBS or TBS containing 0.05% to 1%, preferably 0.1% to 0.3% surfactant such as Tween20. It is preferable to do.
  • a buffer solution such as PBS or TBS containing 0.05% to 1%, preferably 0.1% to 0.3% surfactant such as Tween20. It is preferable to do.
  • the biotinylated protein is bound by contacting the cell disruption crude extract in this manner, the purification and the immobilization are actually performed at the same time. Therefore, in this case, a separate purification work is unnecessary.
  • purified biotinylated protein at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml to 5 ⁇ g / ml may be contacted with a carrier to which a biotin-binding protein is bound.
  • step 3 Addition of biological sample to carrier bound to biotinylated protein
  • the carrier bound to biotinylated protein prepared in step 2) (A) a biological sample, and (b) the same species as the host cell used to express the biotin-binding protein of step 1), the protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or the biotinylated protein.
  • step 3 the carrier bound to biotinylated protein prepared in step 2) (A) a biological sample, and (b) the same species as the host cell used to express the biotin-binding protein of step 1), the protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or the biotinylated protein.
  • a cell disruption extract prepared from the cells prepared from the cells.
  • a method of adding a culture component of a host cell introduced with a vector that is the same type as a vector used for production of a recombinant protein that specifically binds to a test substance and does not contain a gene encoding the protein to the sample JP-A-8-43392
  • a water extract from a cell that is the same type as a cell that has produced a recombinant protein that specifically binds to a test substance and does not contain the protein and then its water-soluble fraction
  • a method of adding a minute to a sample Japanese Patent Laid-Open No. 2004-301646) is known.
  • the present inventors have come up with a method for obtaining a more remarkable effect in a system in which a detection protein is bound to a carrier using a bond between biotin and biotin-binding protein. Specifically, it has been found that it is preferable that both the cell disruption extract and the biotin-binding protein are present simultaneously when the test sample is brought into contact with the carrier.
  • the cells from which the cell disruption extract is derived are not particularly limited, such as E. coli cells, yeast cells, mammalian cells, insect cells, plant cells and the like. However, it is preferably a cell of the same type as the host cell used to express the biotin-binding protein, the protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or the biotinylated protein.
  • a biotin-binding protein a protein that specifically binds to a substance to be detected, and / or a biotinylated protein is prepared in E. coli, it is desirable to prepare a cell disruption extract from E. coli.
  • a biotin-binding protein a protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or a biotinylated protein is expressed in a cell-free system
  • the used cell disruption extract is used as it is or in a desired buffer. It can be used suspended in a liquid.
  • two or more types of cell disruption extracts May be used.
  • biotin-binding proteins and / or proteins that specifically bind to substances to be detected are not expressed by genetic engineering techniques, but are originally extracted and purified from cells containing these proteins. May be.
  • tamavidin when used as the biotin-binding protein, a cell disruption extract of basidiomycete Pleurotus concopiae cells can be used.
  • the cell extract of the present invention also includes a cell disruption extract that inherently contains a biotin-binding protein and / or a protein that specifically binds to the substance to be detected.
  • the cells for preparing the cell disruption extract may contain any vector, preferably an empty vector.
  • An empty vector includes a biotin-binding protein, a protein that specifically binds to a test substance, and / or a gene that is the same type as the vector used to express the biotinylated protein and encodes these proteins. There is no vector.
  • any vector may be used which further contains any nucleic acid in these empty vectors.
  • the vector used when the biotin-binding protein, the protein that specifically binds to the test substance, and / or the biotinylated protein is expressed may be an unrelated vector.
  • the cell disruption extract is not particularly limited as long as it is a cell-derived component, and for example, a protein component, a carbohydrate component, a lipid component, or a mixed component thereof can be used.
  • a soluble extract of cells can be used.
  • the method for preparing the cell disruption extract is not particularly limited, and various methods can be used. Usually, cells cultured in an appropriate medium are disrupted or solubilized by physical means such as ultrasonic waves, chemical means using a surfactant, enzyme treatment, etc., and dissolved by operations such as centrifugation or filtration. It can be prepared as an ingredient. In order to extend the shelf life, the liquid clarified by centrifugation or filtration is subjected to heat treatment such as addition of a protease inhibitor or autoclaving to suppress or deactivate various cell-derived enzymes. It is preferable to make it.
  • the concentration at which the cell disruption extract is added may vary depending on the strength of the non-specific reaction that occurs, and a concentration sufficient to absorb the non-specific reaction can be set as appropriate.
  • E. coli a vector may be included, and the vector encodes a biotin-binding protein.
  • the absorbance at OD600 reaches 0.1 to 2, preferably 0.25 to 1, more preferably 0.4 to 0.6.
  • the shaking culture is carried out at a temperature between 37 ° C. and 37 ° C. for 2 to 24 hours, preferably 4 to 16 hours.
  • the cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in a desired buffer solution, disrupted, the disrupted solution is centrifuged, and the supernatant is recovered as an E. coli crude extract.
  • a crude cell disruption extract When a crude cell disruption extract is mixed with a biological sample, the sample is not limited, but 0.05 mg in a desired buffer solution (may contain BSA, casein, a commercially available blocking agent, etc.).
  • Cell disrupted crude extract prepared to a total protein concentration of 0.5 mg / ml to 5 mg / ml, preferably 0.5 mg / ml to 5 mg / ml, and mixed at 10 ° C. to 30 ° C., preferably 20 ° C. to 30 ° C. The reaction is carried out for 1 minute to 4 hours, preferably 10 minutes to 1 hour.
  • the biological sample is serum or the like, the serum is usually diluted 10 to 10,000 times, preferably 100 to 1000 times, more preferably 100 to 500 times with a cell disruption extract.
  • a background signal can be finally suppressed by adding a biotin-binding protein to a biological sample.
  • Such a biotin-binding protein may be the same as or different from the biotin-binding protein bound to the above-described carrier. Moreover, it may be a wild type or a mutant, and the biotin binding ability may be the same, higher or lower than that of the wild type.
  • a powder of biotin-binding protein (either naturally derived or genetically expressed) may be added directly, or it may be added after dissolving in an appropriate solution. .
  • the mixture of the sample and the cell disruption extract may be treated with a carrier on which the biotin-binding protein is immobilized (for example, passed through a column) (step b-). i).
  • the concentration of the biotin-binding protein is 1 ⁇ g / ml to 500 ⁇ g / ml, preferably 10 ⁇ g / ml to the final concentration. Add at 100 ⁇ g / ml.
  • concentration of the biotin-binding protein when the biotin-binding protein is expressed in the cells by genetic engineering is not limited to this, but may be the same concentration.
  • biotin-binding protein obtained by introducing a gene encoding a biotin-binding protein into a host cell, expressing it, and disrupting the host cell (step b-ii).
  • the biotin-binding protein may be expressed in a desired host by a method well known to those skilled in the art, but the desired protein and / or the desired biotinylated protein that specifically binds to the test substance is genetically engineered. When it is expressed in the same species as that host.
  • a gene encoding a biotin-binding protein is incorporated into an expression vector, which is introduced into E. coli, and E. coli is cultured while inducing protein expression.
  • the induction conditions such as the expression vector, host E. coli strain, medium component, IPTG concentration and culture temperature may be appropriately selected from conditions suitable for the expression of the biotin-binding protein.
  • Addition of a biological sample and a cell disruption extract to an added carrier such as a biological sample to the carrier can be performed by any method.
  • the biological sample must contact the cell disruption extract at the same time or before the biological sample contacts the carrier. That is, it is sufficient that the biological sample and the cell disruption extract are in sufficient contact, and the component derived from the cell disruption extract does not necessarily need to be finally added to the carrier together with the biological sample.
  • a carrier in which a cell disruption extract component is bound may be prepared and a biological sample may be processed there.
  • the biological sample can be passed through a cell disruption extract component column.
  • the biological sample and the cell disruption extract are mixed with the carrier at 10 ° C. to 30 ° C., preferably at 20 ° C. to 30 ° C., for 10 minutes to 4 hours.
  • the reaction is preferably performed for 30 minutes to 2 hours.
  • test substance that specifically binds to a biotinylated protein is detected in step 4).
  • the method for detecting the test substance can be appropriately selected by those skilled in the art based on the properties of the desired protein.
  • Preferable examples include immunoassay methods such as enzyme-linked immunosorbent assay methods (including ELISA and sandwich ELISA methods) and radioimmunoassay methods (RIA), nucleic acid hybridization assays, surface plasmon resonance methods, and the like.
  • immunoassay methods such as enzyme-linked immunosorbent assay methods (including ELISA and sandwich ELISA methods) and radioimmunoassay methods (RIA), nucleic acid hybridization assays, surface plasmon resonance methods, and the like.
  • the antigen is immobilized, the antibody present in the test sample is reacted with the antigen, and detected by a method well known to those skilled in the art.
  • a human antibody bound to the antigen is detected using an anti-human antibody.
  • this anti-human antibody is labeled with fluorescence, enzyme, or radioisotope, and finally the amount of antibody is indirectly measured by measuring the amount of fluorescence, enzyme activity, or radioactivity, Quantify.
  • the substance to be measured is an antigen
  • an antibody against a certain part (epitope) of the antigen is immobilized, reacted with an antigen present in a test sample, and then reacted with an antibody against another epitope of the antigen.
  • the secondary antibody against this different epitope is labeled as described above, the amount of antigen can be indirectly measured.
  • a nucleic acid hybridization assay a nucleic acid of several tens to several hundreds or several thousand bases having a sequence region complementary to the nucleic acid to be measured is immobilized on a solid phase using a biotin-biotin-binding protein-protein bond. .
  • a test sample containing a nucleic acid previously labeled with fluorescence or a radioisotope is reacted therewith, and the amount of fluorescence or the amount of radioactivity is measured.
  • the labeling may be performed by a method well known to those skilled in the art, or commercially available fluorescent or enzyme-labeled anti-human antibodies may be used.
  • the fluorescent label for example, a label with fluorescein and rhodamine, or a label with a fluorescent protein such as GFP can be considered.
  • the enzyme label peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, glucose oxidase and the like can be used, but are not limited thereto. Substrates for measurement with these enzymes are commercially available.
  • a substrate for TBA or chemiluminescence can be used.
  • the radioisotope include iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), and phosphoric acid ( 32 P) in the case of nucleic acids.
  • the amount of antigen or antibody present in a biological sample can be determined, for example, using a linear regression computer algorithm, using standard preparations (e.g. It can be simply calculated by comparison with the amount present in the patient's standard sample.
  • assay methods for detecting antigens and antibodies are described, for example, for ELISA, in Iacobelli et al., Breast Cancer Research and Treatment 11: 19-30 (1988).
  • the substance to be detected in a biological sample for example, when there are few antibodies (when the antibody titer is low) or when there is a lot of nonspecific binding to the biological sample itself such as serum, The influence of background signal due to non-specific binding is increased. Therefore, the substance to be detected can be measured more accurately by appropriately subtracting the background signal from the measured value.
  • the background to be subtracted can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the experimental system.
  • a “human / monkey anti-type I and type II collagen IgG antibody measurement kit” manufactured by Chondrex
  • this kit calculation is performed by subtracting the background value (measured value using only the secondary antibody without adding serum) from the sample measurement value.
  • biotinylation was performed as described in Example 2 to subtract the background due to such non-specific reaction. From the measured value of the carrier in which the SITH-1 antigen (protein that specifically binds to the substance to be detected) is immobilized via tamavidin, the biotinylated SITH-1 antigen is not immobilized (however, tamavidin is not immobilized on the carrier).
  • SITH-1 antigen protein that specifically binds to the substance to be detected
  • the SITH-1 antigen Similar to the group in which the SITH-1 antigen is immobilized, a blocking operation with BSA or the like is performed, and serum containing an anti-SITH-1 antibody (a substance to be detected in a biological sample) (biological It is also effective to subtract the measured value in the section where the biological sample is added.
  • the organism from which the sample is derived for example, human in the case of SITH-1 does not have any protein (but is not limited to, but when the organism is a mammal, for example, GFP (green It can be obtained more accurately by subtracting the measured value of the section in which the solid phase is immobilized.
  • the immobilization method is not particularly limited, but it is preferable to biotinylate the protein and immobilize it on a carrier on which the biotin-binding protein is immobilized by binding between biotin and biotin-binding protein.
  • the calculation method as described above can be appropriately designed and selected by those skilled in the art based on the properties of the biological sample and the characteristics of the antibody used.
  • the detection method of the present invention is preferably capable of specifically detecting an antibody having a low antibody titer in serum.
  • the present invention also provides an agent for diluting a biological sample for use in a system for detecting a substance in a biological sample.
  • the diluent of the present invention is 1) Cell disruption extract and biotin-binding protein, or 2) Cell disruption extract prepared from cells expressing biotin-binding protein by genetic engineering technology.
  • This diluent is a biotinylated protein that binds biotin to a protein that specifically binds to the substance to be detected in a system that detects the substance in the biological sample.
  • the composition of the diluent of the present invention is selected according to the production process of the protein bound to the carrier, that is, the biotin-binding protein, the protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or the biotinylated protein. It is preferable to do.
  • a host cell used to express a biotin-binding protein, a protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or a biotinylated protein It is preferable to use the same type of cells.
  • the diluent of the present invention may include 1) a cell disruption extract and a biotin-binding protein. This can be used in the embodiment of step 3) (bi) in the method for detecting a substance in a biological sample of the present invention.
  • a cell disruption extract prepared from cells in which a biotin-binding protein is expressed by genetic engineering technology may be included. This can be used in the embodiment of step 3) (b-ii).
  • the “agent for diluting a biological sample” may be the cell disruption extract (and biotin-binding protein) itself, or an agent for further diluting the cell disruption extract together with the biological sample.
  • a suitable buffer solution or a solvent such as a commercially available cell diluent or serum diluent may be contained.
  • kits for detecting a substance in a biological sample.
  • the kit of the present invention comprises A) a carrier in which a biotinylated protein obtained by binding biotin to a protein that specifically binds to a substance to be detected is bound by biotin-biotin-binding protein binding; and Bi) Cell disruption extract prepared from cells of the same type as the host cell used to express the biotin-binding protein of A), the protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or the biotinylated protein Biotin-binding protein, or B-ii) A) biotin-binding protein, protein that specifically binds to the substance to be detected, and / or host cell used to express biotinylated protein An agent for diluting a biological sample containing a cell disruption extract prepared from a cell in which a biotin-binding protein is expressed by genetic engineering technology in the cell; including.
  • the “agent for diluting a biological sample” may be the cell disruption extract (and biotin-binding protein) itself, or an agent for further diluting the cell disruption extract together with the biological sample.
  • a suitable buffer solution or a solvent such as a commercially available cell diluent or serum diluent may be contained.
  • a fusion protein of SITH-1 protein derived from human herpesvirus 6 (HHV-6) and a biotinylated sequence (BioEase tag from Invitrogen) was expressed in E. coli and obtained therefrom.
  • the Escherichia coli crude extract was directly reacted with a tamavidin 2 (hereinafter referred to as “TM2”)-immobilized microplate, and the fusion protein was bound to the microplate through a tamavidin-biotin bond.
  • TM2 tamavidin 2
  • the thus obtained SITH-1 protein-binding plate contains human serum diluted with an E. coli crude extract (including rabbit anti-SITH-1 antibody. Commercial human serum does not contain anti-SITH-1 antibody.
  • E. coli crude extract including rabbit anti-SITH-1 antibody.
  • Commercial human serum does not contain anti-SITH-1 antibody.
  • BioEase Tag A gene encoding a fusion protein in which a BioEase tag was arranged at the N-terminal side of the SITH-1 protein was designed.
  • This BioEase tag is a peptide tag including a sequence that is biotinylated by a biotinylated enzyme in a living body (in this case, E. coli).
  • the amino acid sequence of the BioEase-SITH-1 fusion protein is shown in SEQ ID NO: 8, and the encoded nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9.
  • a primer for amplifying the SITH-1 gene was designed. That is, a primer (SITH1NtermGW-F) consisting of a DNA sequence encoding the N-terminal part of SITH-1 protein and a primer (SITH1CtermGW-R) consisting of a DNA sequence encoding the C-terminal part of SITH-1 protein in the reverse direction Designed.
  • PCR reaction conditions were as follows: 500 ng of template DNA, 2 ⁇ l of 10 (ExTaq buffer (TaKaRa)), 1.6 ⁇ l of 2.5 mM dNTP, 20 ⁇ moles of each primer, 0.1 ⁇ l of 5 U / ⁇ l ExTaq in 20 ⁇ l of reaction solution Then, using GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER), 96 ° C for 3 minutes once, 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes 20 times, 72 ° C for 6 minutes once As a result, a 477 bp PCR product was obtained.
  • the plasmid in which the SITH-1 gene was incorporated was used as an entry clone, and recombination reaction was performed with Gateway System using pET104.1 destination vector (manufactured by Invitrogen) which is a BioEase tag fusion protein expression vector.
  • the recombinant product was transformed into E. coli TB1, plasmid DNA was extracted, and this plasmid was further transformed into E. coli BL21 (DE3).
  • E. coli colony was amplified by PCR using SITH1NtermGW-F and SITH1CtermGW-R to confirm the presence or absence of the inserted gene.
  • BioEase tag fusion vector BioEase-SITH1 / pET104.1 for expression of SITH-1 protein was completed.
  • the cells were suspended in 3 ml of 0.1 M HEPES / KOH (pH 7.4) and then crushed by ultrasonic waves. The disrupted solution was centrifuged (15,000 rpm), and the supernatant was used as an E. coli crude extract.
  • the protein contained in the crude extract was fractionated by SDS-PAGE and subjected to Western blotting.
  • Rabbit anti-SITH-1 antibody unpublished
  • alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG antibody BIO RAD
  • Results are shown in FIG. 1A.
  • a band of about 30 kDa that was not present in the control was detected from BioEase tag-fused SITH-1-expressing E. coli. This size almost coincided with the molecular weight of 28.6 kDa of BioEase tag fusion SITH-1.
  • E. coli BL21 introduced with pTrc99A or TM2 / pTrc99A was prepared in the presence of IPTG, and then a crude E. coli extract was prepared for use in subsequent ELISA experiments. did.
  • Example 2 Detection of Anti-SITH-1 Antibody in Human Serum by ELISA Purified TM2 was immobilized on a microplate using a New ELISA plate kit (Sumitomo Bakelite). The immobilization method followed the instructions attached to the kit.
  • the crude extract of E. coli expressing the BioEase tag-fused SITH-1 protein obtained in Example 1 was prepared with 0.1 M HEPES / KOH (pH 7.4) so that the total protein concentration was 2 mg / ml, and then fixed to TM2. 100 ⁇ l was added to an activated plate (Sumitomo Bakelite, New ELISA). The plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and BioEase tag-fused SITH-1 protein was bound to the TM2-immobilized plate by tamavidin-biotin binding.
  • each well of the plate was washed 3 times with TBS buffer (TBST) containing 0.1% Tween 20, and 250 ⁇ l of 5 ⁇ g / ml BSA / TBST solution was added to each well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking. Went. Thereafter, each well was washed 3 times with TBST.
  • TBS buffer TBST
  • human serum Human Serum pool, manufactured by Cosmo-Bio
  • PBS or 1 mg total soluble protein / ml pTrc99A-introduced Escherichia coli crude extract prepared in Example 1 (1-4), or 1 mg total soluble.
  • rabbit anti-SITH-1 antibody was 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1/8000 in volume ratio. It was added after serial dilution.
  • the above antibody dilution ratio can be regarded as the same level as when the depression patient serum is diluted approximately 10 to 80 times. Furthermore, in order to confirm the effect of TM2 in the Escherichia coli crude extract used for dilution of serum, a solution obtained by adding purified TM2 to PBS or the pTrc99A-introduced Escherichia coli crude extract to a final concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the rabbit anti-SITH-1 antibody was added in a volume ratio of 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1 / 100 ⁇ l each was added to a plate on which BioEase tag fusion SITH-1 was immobilized, and the mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the blocking operation was performed on a TM2 fixed plate to which nothing was bound, and then PBS solution, pTrc99A-introduced or TM2 / pTrc99A-introduced Escherichia coli crude extract (1 mg total soluble protein / ml) was used.
  • the results are shown in FIGS.
  • the anti-SITH-1 antibody contained in the serum had a lot of non-specific binding when the serum was diluted with PBS, and a high amount of luminescence was detected even when the anti-SITH-1 antibody was not added. In addition, this non-specific binding was not improved even in the presence of 50 ⁇ g / ml TM2.
  • the S / N ratio was particularly high in the group where 50 ⁇ g / ml TM2 was added to the pTrc99A-introduced Escherichia coli crude extract and in the group where the TM2 / pTrc99A-introduced Escherichia coli crude extract was added.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of SITH-1.
  • SEQ ID NO: 2 Base sequence of SITH-1 ORF.
  • SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence of SITH-1 cDNA.
  • SEQ ID NO: 4 Base sequence of tamavidin 1.
  • SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of tamavidin 1.
  • SEQ ID NO: 6 Base sequence of tamavidin 2.
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of tamavidin 2.
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of BioEase-SITH-1 fusion protein
  • SEQ ID NO: 9 Base sequence encoding BioEase-SITH-1 fusion protein
  • SEQ ID NO: 10 Primer for PCR SITH1NtermGW-F
  • SEQ ID NO: 11 Primer for PCR SITH1NtermGW-R

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Abstract

　本発明は、生物学的試料中の物質を検出する方法、当該方法に使用する担体、及びキットに関する。　本発明の方法は、　１）　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し；　２）　工程１）で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し；　３）　工程２）で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、　（ａ）　生物学的試料、及び　（ｂ－ｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質等を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは　（ｂ－ｉｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質等を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液 を混合して添加する；そして、　４）　ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する ことを含む。

Description

生物学的試料中の物質を検出する方法
　本発明は、生物学的試料中の物質を定性的、及び／又は、定量的に検出する方法に関する。本発明の方法により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常は検出が困難な物質の検出も可能である。
　生物学的試料中の物質を検出するために、当該物質（被検物質）に対し特異的に結合する物質を利用する方法が、従来より広く用いられている。例えば抗原抗体反応を利用するいわゆるイムノアッセイや、核酸の鎖同士の水素結合を利用する核酸ハイブリダイゼーション等である。例えばイムノアッセイの場合、被検物質が抗体であれば抗原を、逆に被検物質が抗原であれば、抗体をマイクロプレートや微小ビーズ、あるいはセンサーチップなどの担体に固定化し、被検物質と反応させた後、抗原抗体反応の有無や程度を検出・測定する。
　固定化の汎用的な方法として、疎水結合、共有結合などが知られている。「疎水結合」は、担体の疎水性表面と、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質（以下、「特異的タンパク質」と呼称する場合がある）の疎水性部分との相互作用を利用して、担体と特異的タンパク質とを結合させるものであり、特別な試薬を必要としない点で簡便である。しかしながら、概して結合力は弱く、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）等に用いる場合、結合後の洗浄操作等で、タンパク質が担体から離れてしまうことが多い。また、疎水結合により特異的タンパク質と担体を結合させた場合、そのタンパク質の多くが、その機能を完全に、あるいは部分的に失ってしまう場合がある。「共有結合」は、特異的タンパク質中の官能基（例えばアミノ基）と担体表面に配置された官能基（例えばカルボキシル基）との相互作用を利用するものであり、結合力は強い。しかし、共有結合により特異的タンパク質と担体とを結合させた場合、疎水結合の場合と同様に、結合させたタンパク質においてしばしば、その機能を完全に、あるいは部分的に失ってしまう場合がある。
　疎水結合や共有結合の他にも、複数のヒスチジンをタンパク質の末端に融合させ、このヒスチジンタグをもつ融合タンパク質を、表面にニッケルが配置された、例えばプロテインチップ等の基板などに結合させる方法が知られている。しかしながら、ヒスチジンタグとニッケルイオンの相互作用はあまり強くなく、さらにニッケルイオンには、様々な生体分子との非特異的な結合が知られている。
　あるいはまた、アビジンやストレプトアビジンのビオチン（ビタミンＨ）結合性を利用して、タンパク質を担体に結合させる方法が考案されている。アビジンは、卵白由来の糖タンパク質でビオチンに極めて強く結合する。アビジンとビオチンの相互作用は最も強い非共有結合の一つである（Ｇｒｅｅｎ　（１９７５）　Ａｄｖ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ　２９：　８５－１３３）。一方、ストレプトアビジンは放線菌由来のアビジン様タンパク質で、やはりビオチンと強く結合する。ビオチンは分子量２４４の低分子であり、様々な生体分子、例えばタンパク質や核酸、脂質、あるいは糖鎖などに、市販のキット等を用いて容易に結合させることができ、さらにビオチン化された分子の性質を変化させることが少ない。これまでに（ストレプト）アビジン－ビオチンの相互作用は、その作用力の強さから、例えば、抗原や抗体の検出など分子生物学や生化学の分野で、広範に用いられている（Ｇｒｅｅｎ　（１９９０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１８４：　５１－６７）。アビジンやストレプトアビジンを利用して、タンパク質を担体に結合させる場合、まず（ストレプト）アビジンを共有結合や疎水結合によりマイクロプレートなどのような基板に結合し、さらにビオチン化したタンパク質と結合させることにより固定化させる方法がある。あるいはまた、ビオチンを結合させた基板に、まずアビジンを、アビジン－ビオチン結合によって結合させ、ここへビオチン化した所望のタンパク質を、アビジンの別のビオチンポケットに結合させることで、基板－ビオチン－アビジン－ビオチン－所望のタンパク質という順序で固定させる技術が報告されている（特開平４－２３６３５３）。このような方法で固定化したプレートを用いて被検物質を検出することができる。
　一般に、抗原や抗体といった被検物質に特異的に結合するタンパク質を疎水結合又は共有結合により結合させた固相を用いた特異的結合アッセイ系において、バックグラウンドシグナルの原因となる非特異結合を低減させることは、重要な課題である。この課題を解決する方法として、例えば、細菌成分抽出液を検出用試薬に含有させる方法（特開昭５９－９９２５７）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法（特開平８－４３３９２）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの水抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法（特開２００４－３０１６４６）などが提案されている。これらの方法により、非特異結合の抑制には一定の効果が見られている。
　また、アビジン－ビオチン結合を利用したアッセイにおいても、被検物質に特異的にタンパク質を疎水結合、共有結合等により結合させた固相を用いたアッセイと同様に、バックグラウンドシグナルへの対処が大きな問題である。これに対し、上述の非特異抑制方法に加え、不活性化した（ストレプト）アビジンを結合させた固相に試料を接触させた後に、活性（ストレプト）アビジンを結合させた固相に接触させる方法（特開平８－１１４５９０）、アビジン結合固相にビオチン化物質を結合させた後に、ポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体を接触させる方法（特開平１１－２１１７２７）やビオチン含有溶液を接触させる方法（特開２００２－４８７９４）などが提案されている。しかしながら、実用上の効果は十分とは言えなかった。
特開昭５９－９９２５７ 特開平８－４３３９２ 特開２００４－３０１６４６ 特開平４－２３６３５３ 特開平８－１１４５９０ 特開平１１－２１１７２７ 特開２００２－４８７９４
Ｇｒｅｅｎ　（１９７５）　Ａｄｖ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ　２９：　８５－１３３ Ｇｒｅｅｎ　（１９９０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１８４：　５１－６７
　本発明は、生物学的試料中の物質を定性的、及び／又は、定量的に検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明は特に、生物学的試料中に微量に存在する物質を、バックグラウンドシグナルを抑えつつ、定性的、及び／又は、定量的に検出・測定する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究に努めた結果、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を用いて、被検物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を担体に固定化した系において、特に生物学的試料中に微量に存在する物質の検出にあたり、バックグラウンドシグナルを低下する工夫を行って、本発明を想到した。具体的には、生物学的試料に細胞破砕抽出液及びビオチン結合性タンパク質を添加した場合において、非特異結合を下げる効果が顕著であった。あるいは、ビオチン結合性タンパク質を添加する代わりに、遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を添加しても同様の効果が得られた。
　本発明は、以上の知見に基づき、アビジン－ビオチン結合を用いて、被検物質を特異的に検出する物質を担体に固定化した系において、非特異結合を減少させたより感度の高い検出方法を提供するものである。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
　生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
　１）　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し；
　２）　ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し；
　３）　工程２）で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、
　（ａ）　生物学的試料、及び
　（ｂ－ｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
　（ｂ－ｉｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
　４）　ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。
［態様２］
　態様１の工程３（ｂ－ｉ）において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、態様１に記載の方法。
［態様３］
　ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、態様１又は２のいずれか１項に記載の方法。
［態様４］
　生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳からなる群から選択される、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
　生物学的試料を希釈するための剤であって、
　１）　細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
　２）　遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む剤。
［態様６］
　生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
　Ａ）　検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体；並びに、
　Ｂ－ｉ）　Ａ）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
　Ｂ－ｉｉ）　Ａ）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤；
を含むキット。
　本発明の方法により、生物学的試料中の被検物質の検出において、バックグラウンドシグナルを抑え、より高感度な検出を安定的に行うことができる。本発明の方法により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常は検出や正確な定量が困難な物質の検出・測定も可能になる。
図１はＢｉｏＥａｓｅタグ（ビオチン化タグ）融合ＳＩＴＨ－１タンパク質の発現を示す。具体的には、図１ＡはＳＩＴＨ－１タンパク質検出のためのウェスタンブロッティングの結果、図１Ｂはビオチン化タンパク質検出のための活性染色の結果である。
　ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質を発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を超音波破砕し、得られた大腸菌粗抽出液画分を、２０μｇ総タンパク質／レーンとなるようＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１５％　アクリルアミドゲル）で展開し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。
　具体的には、図１Ａが抗ＳＩＴＨ－１抗体（１／１０００希釈）を反応後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（１／１０００希釈）を反応させ、その後ＡＰによる染色を行った。図１Ｂは、ストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１／１０００希釈）反応後の染色像である。図１Ａ、図１ＢともにＣｏｎｔｒｏｌは発現ベクターのみをもつ大腸菌由来の抽出サンプルを示す。ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質の位置を矢印で示した。
　図１ＢのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ染色では、太いバンドが２本検出された。下方のバンドは、図１Ａの抗ＳＩＴＨ－１抗体で検出されないことから、ＳＩＴＨ－１部位の一部が分解されたＢｉｏＥａｓｅタグ付きタンパク質であると考えられた。
図２は、各種の血清希釈液の非特異結合へ及ぼす効果を表すグラフである。血清を、ＰＢＳで希釈した区を白四角（破線）、ＰＢＳに精製タマビジン２（ＴＭ２）を加えた液で希釈した区を白四角（実線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液で希釈した区をアスタリスク（破線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液に精製ＴＭ２を加えた液で希釈した区をアスタリスク（実線）、ＴＭ２を発現させた大腸菌破砕抽出液で希釈した区を黒丸（実線）で示した。各グラフの縦軸（ルミネッセンス）は抗ＳＩＴＨ－１抗体の検出量を示し、横軸は段階希釈した抗ＳＩＴＨ－１抗体の希釈割合を示す。 図３は、図２に示した結果から、抗ＳＩＴＨ－１抗体の希釈割合それぞれに関して、Ｓ／Ｎ比を求めたグラフである。
　血清を、ＰＢＳで希釈した区を白四角（破線）、ＰＢＳに精製タマビジン２（ＴＭ２）を加えた液で希釈した区を白四角（実線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液で希釈した区をアスタリスク（破線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液に精製ＴＭ２を加えた液で希釈した区をアスタリスク（実線）、ＴＭ２を発現させた大腸菌破砕抽出液で希釈した区を黒丸（実線）で示した。
　Ｉ．生物学的試料中の物質を検出する方法
　本発明の検出方法は、
　１）　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し；
　２）　ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し；
　３）　工程２）で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、
　（ａ）　生物学的試料、及び
　（ｂ－ｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
　（ｂ－ｉｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
　４）　ビオチン化タンパク質と特異的に結合した被検物質を検出する
ことを含む。
　１．生物学的試料中の検出物質
　本発明は、生物学的試料中の物質を検出する方法に関する。
　本発明における生物学的試料としては、検出対象となる物質が含まれうるものであれば特段限定されない。生物から採取された細胞、組織又はその破片等を含む試料、例えば体液、さらに好ましくは、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水及び母乳などである。
　これらの体液は、必要に応じ希釈して用いる。希釈率は通常２倍ないし１００００倍程度、好ましくは１００倍ないし１０００倍程度であるが、これに限定されない。希釈するための溶液は任意の緩衝液が使用されうるが、適当なブロッキング剤を含んでも良い。ブロッキング剤としては、非特異的な結合を抑制する効果が高いものが良く、ＢＳＡやカゼイン等、当業者に周知のブロッキング剤を使用することができる。
　本発明の被検物質としては、生物学的試料中の検出又は測定が望まれる物質であれば特段の制限はないが、抗体や抗原などのタンパク質やその断片、ペプチド、核酸、ホルモン、糖質、糖脂質、あるいは生物学的試料中に含まれる細菌やウイルスなどを好ましく挙げることができる。
　本発明は生物学的試料中、濃度が低く従来の方法では検出や正確な定量が困難であった物質の測定も可能となる。例えば、被検物質が血清中の抗体であって、さらにその抗体価が低い場合（例えば、血清を１０００倍希釈した場合には検出が難しいが、１００倍希釈した場合に、ようやく検出が可能となるような低い抗体価の場合）には、血清の希釈率を抑制することが必要となり、その結果、血清中成分に由来する非特異的な結合も増加してしまうため、既存の方法では当該抗体の検出や定量は困難であるが、本発明の方法によって容易に検出、あるいはより正確に定量することが可能となる。
　限定されるわけではないが、本発明における被検物質が抗体の場合、例えば、Ｓｍａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｏｆ　ＨＨＶ－６　（ＨＨＶ－６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質）（ＳＩＴＨ－１）に対する抗体が含まれる。その他にも、ヘルペスウイルスの上記以外の抗原に対する抗体、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、ＨＴＬＶウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルスなどに由来するウイルス関連抗原に対する抗体、あるいはヘリコバクター・ピロリ菌などに由来する細菌関連抗原に対する抗体、あるいは菌類関連抗原に対する抗体などが挙げられる。
　また、限定されるわけではないが、本発明における被検物質が抗原の場合、上記病原体由来の抗原や、癌抗原、前立腺特異抗原等が挙げられる。
　　ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００の記載内容に基づくＳＩＴＨ－１
　　　（１）ＳＩＴＨ－１タンパク質、核酸
　ＳＩＴＨ－１タンパク質、核酸の構造及び機能は、ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００に開示されており、その全内容が本明細書中に援用される。
　ＳＩＴＨ－１は、ヘルペスウイルスの潜伏感染に関与する因子、より詳細にはヘルペスウイルスの潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質である。ここで「ヘルペスウイルスの潜伏感染時に特異的に発現する」とは、ヘルペスウイルスが感染している宿主において、ヘルペスウイルスが潜伏感染している（増殖感染していない）際に、特異的に、ヘルペスウイルス由来の遺伝子又は遺伝子産物が発現することをいう。
　ＳＩＴＨ－１のタンパク質及び核酸としては、例えば、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及びこのタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＳＩＴＨ－１タンパク質は、後述する参考例に示すように、ヒトヘルペスウイルス－６（ＨＨＶ－６）の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質として単離・同定されたものである。ＳＩＴＨ－１タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、１５９アミノ酸からなる、分子量約１７．５ｋＤａのタンパク質である。
　ＳＩＴＨ－１タンパク質は、ＳＩＴＨ－１遺伝子の核酸によってコードされている。このＳＩＴＨ－１遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号３に示すように、１７９５塩基対（約１．７９ｋｂｐ）のサイズを有しており、９５４番目から９５６番目の塩基配列が開始コドン（Ｋｏｚａｋ　ＡＴＧ）であり、１４３１番目から１４３３番目の塩基配列が終止コドン（ＴＡＡ）である。したがって、上記ＳＩＴＨ－１核酸は、配列番号３に示す塩基配列のうち、９５４番目から１４３０番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、このＯＲＦは、４７７塩基対（約０．４８ｋｂｐ）のサイズを有している。ＳＩＴＨ－１のｃＤＮＡのうち、ＯＲＦ領域を表す塩基配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２に示す塩基配列は、ストップコドンの３塩基を含んで記載している。
　ＳＩＴＨ－１核酸は、ＨＨＶ－６が潜伏感染している細胞の細胞質において常に発現している一方、増殖感染細胞では発現が認められない。ＳＩＴＨ－１タンパク質をコードする核酸は、これまでに報告したＨＨＶ－６潜伏感染特異的遺伝子（Ｈ６ＬＴ）と相補鎖の関係にあるＤＮＡにコードされ、その発現は、ＨＨＶ－６の潜伏感染の中間段階において増強する。これらの事実から、ＳＩＴＨ－１タンパク質は、ＨＨＶ－６の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質であると考えられる。
　ＳＩＴＨ－１タンパク質は、宿主タンパク質であるＣＡＭＬ（ｃａｌｃｉｕｍ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ　ｌｉｇａｎｄ、Ａｃｃｅｓｉｏｎ　＃；　Ｕ１８２４２）と結合し、グリア細胞内カルシウム濃度を上昇させる。ＣＡＭＬは宿主生体内において、脳とリンパ球に多く存在し、細胞内のカルシウム濃度を上昇させることが知られているタンパク質である。また、ＳＩＴＨ－１タンパク質の発現による細胞内カルシウム濃度の上昇は、潜伏感染細胞内の全般的なシグナル伝達の活性化をもたらし、ＨＨＶ－６の効率的な再活性化に寄与するものと考えられる。
　ＨＨＶ－６は脳内のグリア細胞で潜伏感染することが知られており、潜伏感染時や活性の高い潜伏感染状態である中間段階にあるＨＨＶ－６がＳＩＴＨ－１を発現させると、グリア細胞内のカルシウム濃度が上昇するものと考えられる。脳の細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇は、気分障害などの精神障害と大いに関係するものと考えられている（理研年報２００３）。
　ＳＩＴＨ－１タンパク質は、宿主のタンパク質であるＣＡＭＬと結合する活性を保持し、細胞内カルシウム濃度を上昇させる機能を有するものである。また、ＳＩＴＨ－１タンパク質を、このタンパク質が最も強く発現すると考えられる脳内のグリア細胞で発現させることにより、精神障害を誘導できる。それゆえ、ＳＩＴＨ－１タンパク質は、ヘルペスウイルスの潜伏感染時又は再活性化初期に発現し、宿主に精神障害を生じさせる機能を有すると考えられる。
　　　（２）ＳＩＴＨ－１に対する抗体
　ＳＩＴＨ－１に対する抗体は、ＳＩＴＨ－１タンパク質又はその変異体、あるいはそれらの部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８））」、岩崎らの「単クローン抗体　ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、ＳＩＴＨ－１タンパク質の検出・測定などに利用できる。
　用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体及びヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　用語「ＳＩＴＨ－１タンパク質を認識する抗体」は、ＳＩＴＨ－１タンパク質に特異的に結合し得る完全な分子及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2並びにＳＩＴＨ－１抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法、又は公知の方法に従って使用され得る。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。
　気分障害患者、又は、気分障害の可能性のある個体は、ＳＩＴＨ－１タンパク質の発現量が増加しており、その結果ＳＩＴＨ－１抗体価も上昇していると考えられる。本発明は、一態様において、生物学的試料中のＳＩＴＨ－１抗体を検出することにより、気分障害患者又は気分障害の可能性のある個体を同定することを可能にする。
　２．検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させた、ビオチン化タンパク質が結合した担体
　本発明は、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させた、ビオチン化タンパク質が、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体を利用する。
　本発明の担体は、
　１）　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し；
　２）　ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成する、
ことによって作成することができる。
　「ビオチン」とは、Ｄ－［（＋）－ｃｉｓ－ヘキサヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－チエノ－（３，４）－イミダゾール－４－吉草酸］の一般名称である。ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ7（ビタミンＢ7）とも呼ばれ、あるいは、ビタミンＨ、補酵素Ｒとも言われることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合し、その吸収が阻害される。そのため、生卵白の大量摂取によってビオチン欠乏症を生じることがある。
　本明細書中において「ビオチン」とは、上記ビオチンの他、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｏｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７：４６６６－４６６８）や、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｉｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　３０８：　３４３－３５７）、あるいはビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）やＢｉｏｔｉｎ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ等のビオチン類縁体も含む。
　ビオチン－アビジン（ビオチン結合性タンパク質）複合体を用いたシステムは、生化学、分子生物学、組織免疫学やＤＮＡ分析、あるいは臨床検査などの分野で広く利用されている。
　本発明は、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質の間の結合を利用して、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質を担体に固定することを含む。本発明において、「ビオチン－ビオチン結合性タンパク質の間の結合」を「アビジン－ビオチン結合」と呼称する場合がある。
　　ビオチン結合性タンパク質
　ビオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，（２００２），　３６３：　６０９－６１７）、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，（２００５），　２８０：　１３２５０－１３２５５）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　（２００７），４０５：３９７－４０５）、タマビジン（ＷＯ０２／０７２８１７）やこれらの変異体等、ビオチンと強く結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。好ましくは、ビオチンとの解離定数（ＫＤ）が１０-8Ｍ以下、さらに好ましくは１０-10Ｍ以下、さらに好ましくは１０-12Ｍ以下である。但し、被検試料に添加するビオチン結合性タンパク質については、後述のとおりである。
　ビオチン結合性タンパク質として、特に、大腸菌で高発現するタマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見されたビオチン結合性タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７、Ｔａｋａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．　（２００９）　ＦＥＢＳ　Ｊ　２７６：　１３８３－１３９７）。タマビジンの変異体としては、例えば、高結合能・低非特異結合タマビジン（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／６４３０２）等が挙げられる。
　本発明における「タマビジン」は、タマビジン１（ＴＭ１）、タマビジン２（ＴＭ２）、又はそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のタマビジンは典型的には、配列番号５若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号４若しくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、本発明のタマビジンは、配列番号５若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号４若しくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、及びそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶことがある。
　タマビジン１又は２の変異体は、配列番号５又は７のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
　アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．１０，　Ｎｏ．　２０，　ｐ．６４８７－６５００，　１９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。限定されるわけではないが、「１または複数のアミノ酸」とは、５０個以内、好ましくは、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１０個以内、８個以内、５個以内、３個以内のアミノ酸を意味する。
　タマビジン１又は２の変異体はさらに、配列番号５又は７のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
　２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，　Ｓ．　Ｂ．　及びＷｕｎｓｃｈ，　Ｃ．　Ｄ．　（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　４８：　４４３－４５３，　１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，　Ｓ．　及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，　Ｊ．　Ｇ．　（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８９：　１０９１５－１０９１９，　１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
　当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　２５，　ｐ．３３８９－３４０２，　１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
　２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、又はより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９８４，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２：　３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。
　なお、担体に結合する「ビオチン結合性タンパク質」は、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成するために利用されるものである。よって、限定されるわけではないが、上記タマビジン１又は２の変異体は、これらの野生型を利用してビオチン化タンパク質を形成した場合と比較して、ビオチン結合活性が大きく減少していないことが好ましい。
　よって、非限定的に、タマビジン１の変異体は、配列番号５のアミノ酸配列において、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７８、Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０、Ｄ１１８が改変されないことが好ましい。なお表記の、例えばＹ３４は、配列番号５のアミノ酸配列の第３４番目のチロシン残基を意味する。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７８）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、トリプトファン(Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０)の場合は、フェニルアラニン（Ｆ）へ、アスパラギン酸（Ｄ１１８）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
　また、タマビジン２の変異体は、配列番号７のアミノ酸配列において、４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）が改変されないことが好ましい。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸、例えばフェニルアラニン（Ｆ）への改変が好ましい。また、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
　本発明において、好ましいタマビジン改変体には以下のものが含まれる。（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／６４３０２）。
　配列番号７に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
　１）配列番号７の１０４番目のアルギニン残基；
　２）配列番号７の１４１番目のリジン残基；
　３）配列番号７の２６番目のリジン残基；及び
　４）配列番号７の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
　より好ましくは、配列番号７において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ－Ｋ１４１Ｅ）；
　配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ－Ｒ１０４Ｅ）；
　配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ－Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
　配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ－Ｒ１０４Ｅ－Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
　　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体
　固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン（登録商標）、ニトロセルロース、アガロース、高架橋球形アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、ポリスチレンラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
　固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
　発明の一態様において、ビーズは、約２５ｎｍ～約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ～約１０μｍの範囲の直径を有する。ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
　限定されるものではないが、例えば、高い検出感度が望まれる場合においては、検出すべき物質とこれに特異的に結合する物質との接触頻度や洗浄操作の容易性といった観点から、固体担体として上記のようなビーズを好ましく使用することができる。
　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体を作製する方法として、ビオチン結合性タンパク質を、担体に直接結合させても良く、あるいはビオチン結合性タンパク質が予め固定化された担体を購入しても良い。あるいはまたビオチン化した担体に、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合を介して結合させてもよい。
　ビオチン結合性タンパク質を直接結合させる方法としては、疎水結合や共有結合を用いる方法などがある。あるいはＮＥＷ　ＥＬＩＳＡ　Ｐｌａｔｅキット（住友ベークライト社）のようなマイクロプレートに、キット添付の説明書きに従ってビオチン結合性タンパク質を直接結合、固定化させても良い。なお、アビジンやストレプトアビジンは例えばＳＩＧＭＡ社等から市販されている。
　疎水結合を利用する場合、担体の疎水性表面と、ビオチン結合性タンパク質の疎水性部分との相互作用を利用して結合させる。具体的には、ビオチン結合性タンパク質溶液を例えば、マイクロプレート等（例えばこれらに限定されるわけではないが、Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ？　Ｐｌａｔｅ　（Ｎｕｎｃ社）、ＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ－９６　ＨＢ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）、あるいはＲｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ（商標）　９６－Ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅｓ　Ｃｏｒｎｅｒ　Ｎｏｔｃｈ　（ＰＩＥＲＣＥ社）等）の担体表面に直接接触させ、一定時間置くことでビオチン結合性タンパク質の疎水性部分と担体の疎水性部分との相互作用により結合、固定化させる。
　一方、共有結合の場合は、担体の表面に官能基を配置させ、これとビオチン結合性タンパク質中の官能基とを結合させる。このような結合のために、様々な官能基が表面に配置された各種担体が市販されており、好ましく用いることができる。例えばこれらに限定されるわけではないが、官能基が表面に配置されたマイクロプレートとしては、無水マレイン酸プレートとして例えばＲｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ（商標）　Ｍａｌｅｉｃ　Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　９６－Ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）が、活性型アミノ基プレートとして例えばＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ？　－Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｕｌｅｓ／Ｐｌａｔｅｓ　（Ｎｕｎｃ社）が、あるいはカルボキシル基プレートとして例えばＥＬＩＳＡ用プレートＭＳ－８７９６Ｆ（９６ウェル・Ｃタイプ・平底・カルボ）（住友ベークライト社）が挙げられる。また、官能基が表面に配置されたマイクロビーズとしては、高架橋アガロースビーズとして例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス社）が、磁性ビーズとして例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｄｙｎａｌ社）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ビオチン結合性タンパク質と固体担体の連結は、担体に添付された説明書に従えばよい。
　具体的には、これに限定されるわけではないが、以下のような、当業者に公知のタンパク質と固体担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、表面をカルボキシル基が露出するよう修飾された固体担体のカルボキシル基とビオチン結合性タンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、ビオチン結合性タンパク質と固体担体を連結することができる。あるいは、表面がＮ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）により活性エステル化された固体担体にビオチン結合性タンパク質を一級アミノ基を含まないｐＨ６．５～９の緩衝液中で混和し、固体担体表面のカルボキシル基とビオチン結合性タンパク質のアミノ基を結びつけることができる。あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、固体担体表面のアミノ基とビオチン結合性タンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル　３－［２－ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ－（４－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、固体担体表面のアミノ基とビオチン結合性タンパク質のチオール基を結びつけることができる。
　ビオチン結合性タンパク質を固定化した担体としては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ？　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｐｌａｔｅｓ　（ＰＩＥＲＣＥ社）、Ｎｕｎｃ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃｏａｔｅｄ　９６　Ｍｉｃｒｏ　Ｗｅｌｌ？　Ｐｌａｔｅｓ　（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ社）等のマイクロプレート類、あるいはＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　（Ｄｙｎａｌ社）、ＭａｇｎａＢｉｎｄ？　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｂｅａｄｓ　（ＰＩＥＲＣＥ社）等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
　また、ビオチン結合性タンパク質は、上述のように、担体をビオチン化し、アビジン－ビオチン結合を介して結合することもできる。即ち、ビオチン結合性タンパク質の多くが四量体であることを利用し、ビオチンが結合した担体にビオチン結合性タンパク質を結合させ、その後、さらにビオチン化したタンパク質を結合する方法である。
　ビオチンを担体に結合させる方法として、例えばビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）　ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　ＰＦＰ－Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＯ2－Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＯ2　Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＯ3－ＬＣ　Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－ＬＣ－Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　ＮＨＳ－Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
　上記ビオチン化試薬を用いて、マイクロプレート、微小ビーズ、あるいはセンサーチップなど所望の担体に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、トシル基、エポキシ基、マレイミド基、活性化エステルなど種々の官能基を持つ担体（例えば磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートなど）を用いる方法がある。この場合例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ｄｅｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）のような有機溶媒か、ｐＨ７－９のリン酸緩衝液で溶解し、アミノ基を持つ固定化担体に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）のようなカルボジイミドを用いて固定化担体のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。なお、ビオチン化した固定化担体は、好ましくは未反応の官能基を不活性化した後、ＢＳＡなどでブロッキングする。
　また、ビオチン化された市販担体を利用することもできる。ビオチン化されたマイクロプレートとしては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ（商標）　Ｂｉｏｔｉｎ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を利用できるが、これに限定されるものではない。ビオチン化された微小ビーズとしては、例えば、磁性ビーズとして、ＢｉｏＭａｇ　Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が、ナノ磁性ビーズとして、コアフロント社製のｎａｎｏｍａｇ（登録商標）－Ｄ　ｂｉｏｔｉｎ、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）－ｓｉｌｉｃａ　ｂｉｏｔｉｎが、ポリスチレン製マイクロビーズとして、Ｂｅａｄｌｙｔｅ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ　Ｂｅａｄｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）が、アガロースとしてＳｉｇｍａ社製の、Ｂｉｏｔｉｎ　Ａｇａｒｏｓｅ、２－ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ－Ａｇａｒｏｓｅが、高架橋アガロースとして、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（バイオリサーチテクノロジー社製）を利用できるが、これらに限定されるものではない。
　担体とビオチンと繋ぐリンカーの長さは、少なくとも５Åより長いことが好ましく、より好ましくは１３．５Å以上である。
　このようなビオチン化担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させることにより、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体を作製することができる。
　　ビオチン化タンパク質
　本発明においては、被検物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させ、ビオチン化タンパク質を作製して、これをビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して担体に結合させてよい。
　ビオチン化タンパク質の作製方法としては、特に限定するものではないが、ビオチン標識キット（例えばこれらに限定されるわけではないが、ＥＺ－Ｌｉｎｋ？　ＮＨＳ－Ｌｃ－Ｂｉｏｔｉｎ　ＰＩＥＲＣＥ社）や、Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２　（ＤＯＪＩＮＤＯ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ　ＩＮＣ．社）など）を用いて被検物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させてもよい。あるいは被検物質と特異的に結合するタンパク質の遺伝子を、ビオチン化配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと融合し、この融合遺伝子を発現するベクターを構築、任意の宿主においてビオチン化配列との融合タンパク質として発現させることにより、ビオチン化タンパク質を作製してもよい（Ｓｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８８）．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３：９６４０－９６４５．）。このようなベクターとしてこれに限定されるわけではないが、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅ（商標）タグが含まれるベクターが挙げられる（本明細書の実施例１）。このうち哺乳類細胞発現用には、ｐｃＤＮＡ（商標）　６ベクターが、大腸菌発現用にはｐＥＴ１０４ベクターが、あるいはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現用にはｐＭＴ／ＢｉｏＥａｓｅベクターがある。
　さらには、上述の担体をビオチン化する際に用いた方法と同様の方法を、所望のタンパク質のビオチン化にあたっても、好ましく利用することができる。すなわち、ビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）　ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　ＰＦＰ－Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＯ2－Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＯ2　Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＯ3－ＬＣ　Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　Ｂｉｏｔｉｎ－ＬＣ－Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）　ＮＨＳ－Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
　このようなビオチン化試薬を用いて、所望のタンパク質に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。
　例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ｄｅｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）のような有機溶媒か、ｐＨ７－９のリン酸緩衝液で溶解し、所望のタンパク質に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）のようなカルボジイミドを用いて、所望のタンパク質のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。
　なお、このようにビオチン化試薬を用いてビオチン化タンパク質を作製する場合は、予め被検物質と特異的に結合するタンパク質を精製しておくことが好ましい。精製は、当該タンパク質が元来由来する生物から行っても良く、あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに組み込んで、所望の宿主細胞で遺伝子工学的に発現させてから、精製してもよい。宿主細胞としては哺乳類細胞（例えば、非限定的に、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、チャイニーズハムスター等の齧歯類、あるいはイヌなどに由来する細胞）、昆虫細胞（バキュロウイルスを利用した発現系やＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの系など）、酵母、大腸菌、植物、枯草菌などを挙げることができる。好ましくは大腸菌を挙げることができる。また、例えば、ヒトであればＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、２９３Ｔ、齧歯類であればＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、その他哺乳類であればＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、昆虫細胞であればＳｆ９、Ｓ２などの確立された培養細胞系を、好ましく利用することもできる。あるいはまた、小麦胚芽抽出液や昆虫細胞抽出液などを利用した無細胞発現系を用いてタンパク質を発現させることもできる。
　発現ベクターに関しては、用いる宿主細胞に適したものを、当業者は適宜選択することができる。
　発現させたタンパク質の精製は当業者に周知の方法を使用できる。通常のイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせて用いてもよいが、精製用のタグ配列を用いてもよい。この場合、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、チオレドキシン結合タンパク質等との融合タンパク質として被検物質と特異的に結合するタンパク質を大腸菌や哺乳類などの任意の宿主で発現させ、各々グルタチオン、マルトース、セルロース、キチン、チオレドキシンとの親和性を利用して（例えばグルタチオン固定化カラムを用いて）精製しても良い。また予め被検物質と特異的に結合するタンパク質との融合部位にプロテアーゼの認識部位を導入しておけば、精製後にタグ配列を当該プロテアーゼで処理することにより、除去することもできる。プロテアーゼとしては、例えばエンテロキナーゼやＦａｃｔｏｒ　Ｘａなど当業者に周知のものでよい。この他、ＨｉｓＴａｇやＳｔｒｅｐ（ＩＩ）－Ｔａｇを用いて、各々イオン化したニッケル、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎが固定化したカラムを用いて精製してもよい。さらに精製度を上げるために、複数のタグを被検物質と特異的に結合するタンパク質に融合させ、精製法を組み合わせてもよい。例えば、被検物質と特異的に結合するタンパク質の末端にＨｉｓＴａｇとＢｉｏＥＡＳＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等のビオチン化配列を融合させ、宿主で組換えタンパク質として発現させた後、ニッケルカラムで精製を行い、さらに低親和性アビジンや低親和性ストレプトアビジン（例えばＳＡムテイン、Ｒｏｃｈｅ社）カラムで精製してもよい。
　　ビオチン化タンパク質の担体への結合
　本発明においては、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と、ビオチン化タンパク質を準備し、両者を接触させることにより、アビジン－ビオチン結合を介して担体にタンパク質を結合させることができる。
　限定されるわけではないが、ビオチン化タンパク質を含む細胞破砕粗抽出液を、０．１ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌないし２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度で準備する。これを、１０℃ないし４０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、５分ないし２時間、好ましくは３０分ないし１時間、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と接触させる。この操作により、ビオチン化タンパク質は、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体に固定化される。さらにその後、０．０５％ないし１％、好ましくは０．１％ないし０．３％のＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を含むＰＢＳあるいはＴＢＳなどの緩衝液中で、余分な細胞破砕粗抽出物を洗浄することが好ましい。
なお、このように細胞破砕粗抽出液を接触させることにより、ビオチン化タンパク質を結合させる場合、事実上、精製と固定化を同時に行ったことになる。従って、この場合、別途の精製作業は不要である。
　あるいはまた、０．１μｇ／ｍｌないし５μｇ／ｍｌの濃度の精製したビオチン化タンパク質を、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と接触させてもよい。
　３．ビオチン化タンパク質が結合した担体への生物学的試料の添加
　本発明の方法は、工程３）において、工程２）で作成した、ビオチン化タンパク質が結合した担体に、
　（ａ）　生物学的試料、及び
　（ｂ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する
ことを含む。
　　細菌破砕抽出液の添加
　一般に、担体を利用した検出方法において、バックグラウンドシグナルの原因となる非特異結合を低減させるため、細菌破砕抽出液を検出用試薬に含有させる方法（特開昭５９－９９２５７）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法（特開平８－４３３９２）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの水抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法（特開２００４－３０１６４６）などが知られている。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を用いて検出用タンパク質を担体に結合した系において、より顕著な効果を得る方法を想到した。具体的には、被検試料を担体に接触させる際に、細胞破砕抽出液、並びにビオチン結合性タンパク質の両方を同時に存在させると好ましいことを見いだした。
　細胞破砕抽出液が由来する細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など、特段の制限はない。しかし、ビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞であることが好ましい。例えば、ビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を大腸菌で調製した場合、細胞破砕抽出液も大腸菌から調製することが望ましい。また、無細胞系により、ビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させた場合は、使用した細胞破砕抽出液をそのまま、あるいは所望の緩衝液に懸濁して、使用することができる。ビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞の組み合わせに応じて、２種類ないしそれ以上の種類の細胞破砕抽出液を用いてもよい。
　また、ビオチン結合性タンパク質及び／又は検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質は、遺伝子工学技術により発現させたものではなく、本来的にこれらのタンパク質を有する細胞から抽出・精製したものであってもよい。例えば、ビオチン結合性タンパク質としてタマビジンを用いる場合、担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）細胞の細胞破砕抽出液を利用することもできる。このように、ビオチン結合性タンパク質及び／又は検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質を本来的に含んでいる細胞の破砕抽出液も、本発明の細胞抽出液に含まれる。
　また、細胞破砕抽出液を調製するための細胞は、任意のベクター、好ましくは空ベクターを含んでもよい。空ベクターとは、ビオチン結合性タンパク質、被検物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はそのビオチン化タンパク質を発現させた時に用いたベクターと同種で、かつこれらのタンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターである。また、例えば、これらの空ベクターにさらに任意の核酸を含む、任意のベクターであってもよい。あるいは、ビオチン結合性タンパク質、被検物質と特異的に結合するタンパク質及び／又はビオチン化タンパク質を発現させた時に用いたベクターとは、無関係の任意のベクターであってもよい。
　また、細胞の破砕抽出液としては、細胞に由来する成分であれば特に制限されず、例えば、そのタンパク質成分、糖質成分、脂質成分又はその混合成分を使用することができる。好ましくは、細胞の可溶性抽出物を使用することができる。
　細胞の破砕抽出液の調製方法としては、特に制限されず、各種の方法を使用することができる。通常、適切な培地で培養した細胞を、超音波などの物理的手段あるいは界面活性剤などを用いた化学的手段あるいは酵素処理等で破砕若しくは可溶化し、遠心分離又は濾過等の操作により、可溶性成分として調製することができる。また、保存寿命をのばすためには、遠心分離又は濾過等により清澄にした液に、例えばプロテアーゼインヒビターの添加、又はオートクレーブ処理等の加熱処理を施して、細胞由来の各種酵素等を抑制又は失活させることが好ましい。細胞の破砕抽出液を加える濃度は、生じる非特異反応の強さに応じて変えてもよく、該非特異反応を吸収するに充分な濃度を適宜設定することができる。
　細胞破砕抽出液を調製する具体的な方法の例としては、これに限定されるわけではないが、例えば大腸菌細胞の場合、大腸菌（ベクターを含んでもよく、またベクターにはビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を含んでも良い）を、抗生物質を含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．１ないし２、好ましくは０．２５ないし１、さらに好ましくは０．４ないし０．６に達するまで、１５℃ないし３７℃、好ましくは２５℃ないし３７℃で振とう培養した後、０．０１ｍＭないし５ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭないし１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに１５℃ないし３７℃、好ましくは２５℃ないし３７℃で、２時間ないし２４時間、好ましくは４時間ないし１６時間振とう培養を行う。培養液から遠心にて菌体を回収し、菌体を所望の緩衝液中に懸濁後、破砕し、破砕液を遠心し、その上清を大腸菌粗抽出液として回収すればよい。
　生物学的試料に、細胞破砕粗抽出液を混合する場合、限定されるわけではないが、試料に、所望の緩衝液（ＢＳＡやカゼイン、市販のブロッキング剤などを含んでも良い）で０．０５ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度に調製した細胞破砕粗抽出液を混合し、１０℃ないし３０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、１分ないし４時間、好ましくは１０分ないし１時間反応させる。なお、生物学的試料が血清等の場合、通常血清を細胞破砕抽出液で１０倍から１００００倍、好ましくは１００倍から１０００倍、より好ましくは１００倍から５００倍に希釈して用いる。
　　ビオチン結合性タンパク質の添加
　本発明の方法において、生物学的試料にビオチン結合性タンパク質を添加することにより、最終的にバックグラウンドシグナルを抑制することができる。
　このようなビオチン結合性タンパク質は、上述の担体に結合させるビオチン結合性タンパク質と、同じであっても異なっていてもよい。また、野生型であっても変異体であってもよく、ビオチン結合能は野生型と比較して、同等であっても、高くてもよく、低くてもよい。また、添加の態様として、ビオチン結合性タンパク質（天然由来でも、遺伝子工学的に発現させたものでもよい）の粉末を直接添加してもよく、適当な液に溶解してから添加してもよい。また例えば、ビオチン結合性タンパク質を試料に直接添加するのではなく、試料と細胞破砕抽出液の混合物をビオチン結合性タンパク質を固定した担体で処理する（例えばカラムに通す）態様でもよい（工程ｂ－ｉ）。
　ビオチン結合性タンパク質を細胞破砕粗抽出液に添加する場合、これに限定されるわけではないが、ビオチン結合性タンパク質の濃度は最終濃度で、１μｇ／ｍｌないし５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌで添加する。当該細胞中でビオチン結合性タンパク質を遺伝子工学的に発現させる場合の、ビオチン結合性タンパク質の濃度に関しても、これに限定されるわけではないが、同様の濃度であっても良い。
　あるいは、ビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し発現させ、当該宿主細胞を破砕して得られたビオチン結合性タンパク質を含む細胞抽出液として使用してもよい（工程ｂ－ｉｉ）。この場合、ビオチン結合性タンパク質は所望の宿主で、当業者に周知の方法で発現されば良いが、被検物質と特異的に結合する所望のタンパク質及び／又は所望のビオチン化タンパク質を遺伝子工学的に発現させた場合は、その宿主と同種のものが好ましい。
　宿主が大腸菌の場合、ビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入し、タンパク質発現を誘導しつつ、大腸菌の培養を行なう。発現ベクターや宿主大腸菌株、培地成分、ＩＰＴＧ濃度や培養温度などの誘導条件は、ビオチン結合性タンパク質の発現に適した条件を適宜選択すればよい。
　　担体への生物学的試料等の添加
　担体への生物学的試料、及び、細胞破砕抽出液の添加は任意の方法で行うことができる。ただし、生物学的試料が担体と接触するよりも同時、あるいはそれよりも前に、生物学的試料が細胞破砕抽出液と接触しなければならない。すなわち、生物学的試料と細胞破砕抽出液が十分に接触すればよく、細胞破砕抽出液由来の成分は必ずしも最終的に生物学的試料とともに担体に添加される必要はない。例えば、細胞破砕抽出液成分を結合した担体を作成し、そこへ生物学的試料を処理したものを使用してもよい。具体的には、生物学的試料を、細胞破砕抽出液成分カラムに通す、などの態様が挙げられる。
　なお、添加後は、特に限定されるわけではないが、生物学的試料及び細胞破砕抽出液を、担体と、１０℃ないし３０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、１０分ないし４時間、好ましくは３０分ないし２時間反応させる。
　４．被検物質の検出方法
　本発明の検出方法は、工程４）において、ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する。
　被検物質を検出する方法は、所望のタンパク質の性質に基づき、当業者が適切に選択できる。好ましいものとして、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を含む）や放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）などのイムノアッセイ法、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、表面プラズモン共鳴法などのようなアッセイ法が挙げられる。アビジン－ビオチン結合を用いて固相化された、被検物質と特異的に結合・相互作用する物質に対し、被検試料を反応させた後、当該被検物質を検出する。
　イムノアッセイにおいて、例えば測定すべき物質が抗体の場合、抗原を固定化し、被検試料中に存在する抗体を抗原と反応させ、当業者に周知の方法で検出される。例えば被検試料がヒト由来の場合、抗原に結合したヒト抗体を、抗ヒト抗体を用いて検出する。この際、この抗ヒト抗体は、蛍光や酵素、あるいは放射性同位元素で標識しておき、最終的に蛍光量や酵素活性、あるいは放射性量を測定することで、間接的に抗体の量を測定、定量する。また測定すべき物質が抗原の場合、その抗原のある部分（エピトープ）に対する抗体を固定化し、被検試料中に存在する抗原と反応させた後、さらにその抗原の別のエピトープに対する抗体を反応させる。この別のエピトープに対する二次抗体を上記のように標識しておけば、間接的に抗原の量を測定することができる。あるいはまた、核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、測定すべき核酸と相補的な配列領域を有する数十から数百、あるいは数千塩基の核酸をビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合を用いて固相化しておく。ここへ予め蛍光や放射性同位元素で標識した核酸を含む被検試料を反応させ、蛍光量や放射性量を測定する。
　上記標識は当業者に周知の方法で行えばよく、また市販の、蛍光や酵素標識された抗ヒト抗体等を用いてもよい。蛍光標識としては例えばフルオレセイン及びローダミンなどによる標識や、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質による標識も考えられる。酵素標識としてはペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ、あるいはルシフェラーゼやグルコースオキシダーゼ等が利用され得るがこれらに限定されない。これらの酵素による測定のための基質は市販されており、例えばペルオキシダーゼの場合、ＴＢＡやケミルミネッセンス用の基質を用いることが出来る。また、放射性同位元素として例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、及びトリチウム（3Ｈ）、核酸の場合はリン（32Ｐ）などが挙げられる。
　生物学的試料（サンプル）中に存在する抗原や抗体の量は、例えば、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物（例えば臨床検体の場合、健常者の標準試料若しくは典型的な患者の標準試料）中に存在する量との比較によって簡易に算出され得る。抗原や抗体を検出するためのこのようなアッセイ法は、例えば、ＥＬＩＳＡについて、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　１１：　１９－３０　（１９８８）　に記載されている。
　あるいは、例えば、生物学的試料中の検出すべき物質、例えば、抗体が少ない場合（抗体価が低い場合）や、血清などの生物学的試料そのものに非特異的な結合が多い場合には、非特異結合によるバックグラウンドシグナルの影響が大きくなる。そのため、測定値よりバックグラウンドシグナルを適切に差し引くことで、検出したい物質をより正確に測定することが可能になる。差し引くバックグラウンドは実験系に応じて当業者が適切に判断しうる。
　例えば、このような態様の例として、血清中に存在するコラーゲンに対する抗体を検出する「ヒト／サル抗Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンＩｇＧ抗体測定キット」（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製）がある。このキットではサンプル測定値からバックグラウンドの値（血清は加えず二次抗体のみによる測定値）を差し引いて算出する。
　また、血清のように、生物学的試料そのものに非特異的な結合が多い場合には、そのような非特異反応によるバックグラウンドを差し引くために、実施例２に記載したように、ビオチン化したＳＩＴＨ－１抗原（検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質）を、タマビジンを介して固定化した担体における測定値から、ビオチン化ＳＩＴＨ－１抗原を固定化していない区（ただし担体にタマビジンは固定化されており、ＳＩＴＨ－１抗原を固定化した区と同様に、ＢＳＡなどによるブロッキング操作は行われ、かつ抗ＳＩＴＨ－１抗体（生物学的試料中の検出したい物質）を含む血清（生物学的試料）を添加した区）の測定値を差し引く態様も有効である。
また、好ましくは、試料が由来する生物（例えば、ＳＩＴＨ－１の場合はヒト）が抗体を有しない任意のタンパク質（制限されるものではないが、上記生物が哺乳類の場合は、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などを挙げることができる）を固相化した区の測定値を差し引くことで、より正確に求めることが出来る。固定化の方法としては、特に限定はされないが、当該タンパク質をビオチン化し、ビオチン結合性タンパク質が固定化された担体に、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合により固定化することが好ましい。
以上のような算出方法は、生物学的試料の性質や使用する抗体の特徴などを踏まえ、当業者が適切に設計、選択することができる。
　本発明の検出方法は、好ましくは血清中の抗体価の低い抗体を特異的に検出することが可能である。
　ＩＩ．生物学的試料の希釈剤
　本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出する系に用いる、生物学的試料を希釈するための剤を提供する。
　本発明の希釈剤は、
　１）　細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
　２）　遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む。
　この希釈剤は、生物学的試料中の物質を検出する系において、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している担体に、生物学的試料を添加する前に、生物学的試料を希釈するための剤である。本発明の希釈剤は、担体に結合しているタンパク質、即ち、ビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質、の製造過程によって、その組成を選択することが好ましい。
　具体的には、生物学的試料中の物質を検出する系において、ビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞を利用することが好ましい。
　本発明の希釈剤は、１）細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質を含むものであってもよい。これは、本発明の生物学的試料中の物質を検出する方法において、工程３）（ｂ－ｉ）の態様に使用することができる。あるいは、２）遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含むものであってもよい。これは、工程３）（ｂ－ｉｉ）の態様に使用することができる。
　「生物学的試料を希釈するための剤」は、細胞破砕抽出液（及びビオチン結合性タンパク質）そのものであってよく、あるいは、細胞破砕抽出液を生物学的試料とともにさらに希釈する剤であって、適当な緩衝液や市販の細胞希釈液あるいは血清希釈液などの溶剤を含んでもよい。
　ＩＩＩ．キット
　本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、
　Ａ）　検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体；並びに、
　Ｂ－ｉ）　Ａ）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
　Ｂ－ｉｉ）　Ａ）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤；
を含む。
　「生物学的試料を希釈するための剤」は、細胞破砕抽出液（及びビオチン結合性タンパク質）そのものであってよく、あるいは、細胞破砕抽出液を生物学的試料とともにさらに希釈する剤であって、適当な緩衝液や市販の細胞希釈液あるいは血清希釈液などの溶剤を含んでもよい。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　本明細書中の実施例では、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）由来のＳＩＴＨ－１タンパク質とビオチン化配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅタグ）との融合タンパク質を大腸菌で発現させ、そこから得られた大腸菌粗抽出液を直接タマビジン２（以下、「ＴＭ２」と記載する）固定化マイクロプレートに反応させ、融合タンパク質をタマビジンービオチン結合によりマイクロプレートに結合させた。
　こうして得られたＳＩＴＨ－１タンパク質結合プレートに、大腸菌粗抽出液で希釈したヒト血清（ウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体を含む。市販のヒト血清には抗ＳＩＴＨ－１抗体が含まれないので、本試験では市販のヒト血清にウサギの抗ＳＩＴＨ－１抗体（抗血清）を段階希釈して加えたものを検体として用いた。）を反応させ、ヒト血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ－１抗体価を測定した。
　実施例１　ＳＩＴＨ－１とビオチン化配列（ＢｉｏＥａｓｅタグ）との融合タンパク質発現用ベクターの構築
　ＳＩＴＨ－１タンパク質のＮ末側に、ＢｉｏＥａｓｅタグが配置された融合タンパク質をコードする遺伝子を設計した。このＢｉｏＥａｓｅタグは生体内（この場合大腸菌）において生体中のビオチン化酵素によってビオチン化される配列を含むペプチドタグである。ＢｉｏＥａｓｅ－ＳＩＴＨ－１融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に、コードする塩基配列を配列番号９に示す。
　１－１．プライマーの設計
　ＢｉｏＥａｓｅ－ＳＩＴＨ－１融合遺伝子構築のために、まず、ＳＩＴＨ－１遺伝子を増幅させるためのプライマーを設計した。即ち、ＳＩＴＨ－１タンパク質のＮ末端部位をコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ－Ｆ）と、ＳＩＴＨ－１タンパク質のＣ末端部位を逆向きにコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１ＣｔｅｒｍＧＷ－Ｒ）を設計した。
　ＳＩＴＨ－１とＢｉｏＥａｓｅタグとの融合遺伝子構築用プライマーを表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（配列番号１０－１１）
　１－２．ＰＣＲ
　ＳＩＴＨ－１遺伝子（ＯＲＦ）（配列番号２）にＦＬＡＧタグをつけた発現ベクター（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００）のＤＮＡを鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ－ＦとＳＩＴＨ１ＣｔｅｒｍＧＷ－Ｒを用いてＳＩＴＨ－１部位の増幅を行った。ＰＣＲ反応条件は、２０μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０(ＥｘＴａｑ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を２μｌ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰを１．６μｌ、プライマーを各２０ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μｌ　ＥｘＴａｑを０．１μｌ添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ）を用いて９６℃３分を１回、９５℃で１分，６０℃で１分，７２℃で２分を２０回、７２℃６分を１回行った。その結果、４７７ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
　１－３．クローニング
　ＰＣＲによって得られたＳＩＴＨ－１遺伝子を、ベクターｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書に従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの存在が確認されたプラスミドに関してＭ１３プライマー（ＴａＫａＲａ社）と、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）を用いて塩基配列を決定し、設計した遺伝子の配列と比較して、変異がないことを確認した。
　ＳＩＴＨ－１遺伝子が組み込まれたプラスミドをエントリークローンとし、Ｇａｔｅｗａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを用いてＢｉｏＥａｓｅタグ融合タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ１０４．１デスティネーションベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と組換え反応を行った。組換え産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、プラスミドＤＮＡを抽出し、このプラスミドをさらに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。得られた大腸菌コロニーを鋳型に、ＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ－ＦとＳＩＴＨ１ＣｔｅｒｍＧＷ－Ｒを用いてＰＣＲによる挿入遺伝子部位の増幅を行い、挿入遺伝子の有無を確認した。
　以上の方法で、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質発現用のベクターＢｉｏＥａｓｅ－ＳＩＴＨ１／ｐＥＴ１０４．１を完成させた。
　１－４．大腸菌発現
　ＢｉｏＥａｓｅ－ＳＩＴＨ１／ｐＥＴ１０４．１を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、又は対照としてｐＴｒｃ９９Ａのみを導入した大腸菌ＢＬ２１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３０℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養した。培養液５０ｍｌから遠心にて菌体を回収した。菌体は０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）３ｍｌ中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。
　ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質の発現を確認するため、粗抽出液中に含まれるタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画し、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングによるＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１の検出にはウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体（未発表）とアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いた。
　結果を図１Ａに示す。ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１発現大腸菌からは、対照には存在しない約３０ｋＤａのバンドが検出された。このサイズはＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１の分子量２８．６ｋＤａとほぼ一致した。
　さらに抗ＳＩＴＨ－１抗体の代わりに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて、シグナルを検出した。結果を図１Ｂに示す。対照にはシグナルが殆ど検出されなかった一方で、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１を発現させた大腸菌粗抽出液からは、ストレプトアビジンと反応する（従ってビオチン化されていると考えられる）タンパク質に由来する太いバンドが２本検出された。しかもそのうち上のバンドは先のウェスタンブロッティングの際に検出されたバンドとほぼ同じサイズであった。以上のことから、ビオチン化ＳＩＴＨ－１の発現に成功したことが示された。
　なお、上記に加え、後のＥＬＩＳＡ実験に用いるため、ｐＴｒｃ９９ＡやＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ（ＷＯ　０２／０７２８１７）を導入した大腸菌ＢＬ２１に関しても上記と同様に、ＩＰＴＧ存在下で培養後、大腸菌粗抽出液を調製した。
　実施例２　ＥＬＩＳＡによるヒト血清中抗ＳＩＴＨ－１抗体の検出
　精製ＴＭ２をＮｅｗ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅキット（住友ベークライト）を用いてマイクロプレートに固定化した。固定化方法はキット添付の説明書に従った。
　実施例１で得られたＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質を発現した大腸菌粗抽出液を全タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ　（ｐＨ７．４）で調製後、ＴＭ２固定化プレート（住友ベークライト、Ｎｅｗ　ＥＬＩＳＡ）に１００μｌ添加した。室温で１時間静置し、タマビジン－ビオチン結合によりＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質をＴＭ２固定化プレートに結合した。その後、プレートの各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、５μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ／ＴＢＳＴ　溶液を各ウェルに２５０μｌ添加し、室温で１時間静置し、ブロッキングを行った。その後、各ウェルはＴＢＳＴで３回洗浄した。
　次に、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　ｐｏｏｌ，Ｃｏｓｍｏ－Ｂｉｏ社製）をＰＢＳ、又は実施例１の（１－４）で調製した１ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌのｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液、又は１ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌのＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液で１００倍希釈した溶液に、ウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体を体積比で１／５００、１／１０００、１／２０００、１／４０００、１／８０００となるように段階希釈して加えた。この（抗ＳＩＴＨ－１抗体を含む）希釈したヒト血清を、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質をビオチン-タマビジン２結合を用いて固定化したプレートに、１００μｌずつ添加し、１時間室温で反応させた。
ウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体（抗血清）の血清中抗体価は、典型的なうつ病（気分障害）患者の血清中抗ＳＩＴＨ－１抗体価に比べ、およそ５０倍程度高いと推定される。従って市販（健常者）ヒト血清に体積比で１／５０量のウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体（抗血清）を混ぜると、典型的なうつ病患者血清の擬似検体となると考えられる。よって、上記の抗体希釈率は、うつ病患者血清をおよそ１０倍から８０倍希釈して用いる場合と同程度とみなすことができる。
さらに、血清の希釈に用いた大腸菌粗抽出液中におけるＴＭ２の効果を確認するために、ＰＢＳ若しくは上記ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液に、最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように、精製ＴＭ２を加えた溶液を調製し、これを用いてヒト血清を１００倍希釈した溶液に、上記と同様、ウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体を体積比で１／５００、１／１０００、１／２０００、１／４０００、１／８０００となるように段階希釈して加え、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１を固定化したプレートに１００μｌずつ添加し、１時間室温で反応させた。また対照として、何も結合させていないＴＭ２固定化プレートに上記ブロッキング操作を行った後、上記と同様にＰＢＳ溶液や、ｐＴｒｃ９９Ａ導入あるいはＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（１ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌ）、さらに精製ＴＭ２を加えたＰＢＳや、精製ＴＭ２を加えたｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液で、１００倍希釈したヒト血清に、段階的に希釈したウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体を加えたものを１００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。
　上記のように各種の希釈液で希釈したヒト血清に、ウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体を段階希釈して加えたものを、担体に固定化したＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１タンパク質と反応させた後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＳＩＴＨ－１に結合したウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体、ならびに各ウェル中で非特異的に結合していると考えられる血清中のヒトＩｇＧを、それぞれ検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ならびにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれＴＢＳＴで５０００倍希釈した混合溶液を１００μｌずつ添加し、１時間室温で静置した。その後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を検出した。活性は各ウェルに、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｐｉｃｏ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ）を１００μｌずつ添加し、５分間室温で静置した後発光量をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）によって測定した。なお、データ値としては、ウサギ抗ＳＩＴＨ－１抗体の各濃度区それぞれにおいて、対照区（ＴＭ２プレートにＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１を固定していないが、ＢＳＡによりブロッキング操作は行なわれ、かつ各濃度の抗ＳＩＴＨ－１抗体を含むヒト血清を処理した区）の各発光量の測定も併せて行い、その対照区の値を、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１を固定化した区の発光量の値から差し引いた。これを血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ－１抗体の検出量とした。さらに、各血清希釈液の効果の比較を行うために、Ｓ／Ｎ比を以下に示す式によって算出した。
　Ｓ／Ｎ比＝抗ＳＩＴＨ－１抗体を各濃度で加えた区の抗ＳＩＴＨ－１抗体検出量／抗ＳＩＴＨ－１抗体を加えない区の抗ＳＩＴＨ－１抗体検出量
　従って、Ｓ／Ｎ比が大きいほど検出感度が高いことを示している。
　結果を図２、図３に示す。血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ－１抗体は、血清をＰＢＳで希釈した区では、非特異結合が多く、抗ＳＩＴＨ－１抗体を添加していない区でも高い発光量が検出された。また、この非特異結合は５０μｇ／ｍｌ　ＴＭ２存在下でも改善されなかった。一方、血清をｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液やＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液、あるいはｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液に５０μｇ／ｍｌ　ＴＭ２を添加したもので希釈した区においては、ＳＩＴＨ－１抗体を加えない区におけるルミネッセンス値が相当低く、非特異結合が劇的に減少していた（図２）。
　また図３に示したように、Ｓ／Ｎ比に関しては特にｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液に５０μｇ／ｍｌ　ＴＭ２を添加した区とＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区において高かった。
　以上のことから、ＴＭ２プレートにＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ－１を固定化したプレートを用いた測定系において、ＴＭ２含有大腸菌粗抽出液でヒト血清を希釈することで、ヒト血清由来の非特異結合を減少させ、極めて低い濃度の抗ＳＩＴＨ－１抗体も感度良く定量的に検出できることが示された。
　配列番号１：ＳＩＴＨ－１のアミノ酸配列。
　配列番号２：ＳＩＴＨ－１　ＯＲＦの塩基配列。
　配列番号３：ＳＩＴＨ―１　ｃＤＮＡの塩基配列。
　配列番号４：タマビジン１の塩基配列。
　配列番号５：タマビジン１のアミノ酸配列。
　配列番号６：タマビジン２の塩基配列。
　配列番号７：タマビジン２のアミノ酸配列。
　配列番号８：ＢｉｏＥａｓｅ－ＳＩＴＨ－１融合タンパク質のアミノ酸配列
　配列番号９：ＢｉｏＥａｓｅ－ＳＩＴＨ－１融合タンパク質をコードする塩基配列
　配列番号１０：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ－Ｆ
　配列番号１１：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ－Ｒ

Claims (6)

  1. 　生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
    　１）　ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し；
    　２）　ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し；
    　３）　工程２）で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、
    　（ａ）　生物学的試料、及び
    　（ｂ－ｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
    　（ｂ－ｉｉ）　工程１）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
    を混合して添加する；そして、
    　４）　ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する
    ことを含む、前記方法。
  2. 　請求項１の工程３（ｂ－ｉ）において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、請求項１に記載の方法。
  3. 　ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 　生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳からなる群から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　生物学的試料を希釈するための剤であって、
    　１）　細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
    　２）　遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
    を含む剤。
  6. 　生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
    　Ａ）　検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン－ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体；並びに、
    　Ｂ－ｉ）　Ａ）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
    　Ｂ－ｉｉ）　Ａ）のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び／又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤；
    を含むキット。
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