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WO2010106293A1 - Analogues de la temporine-sha et leurs utilisations - Google Patents

Analogues de la temporine-sha et leurs utilisations Download PDF

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WO2010106293A1
WO2010106293A1 PCT/FR2010/050487 FR2010050487W WO2010106293A1 WO 2010106293 A1 WO2010106293 A1 WO 2010106293A1 FR 2010050487 W FR2010050487 W FR 2010050487W WO 2010106293 A1 WO2010106293 A1 WO 2010106293A1
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WO
WIPO (PCT)
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peptide
leishmania
nucleic acid
peptide according
temporin
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2010/050487
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English (en)
Inventor
Ali Ladram
Denis Sereno
Feten Abassi
Bruno Oury
Mohamed Amiche
Pierre Nicolas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Pierre et Marie Curie
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Pierre et Marie Curie
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
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Publication date
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Priority to BRPI1009585A priority patent/BRPI1009585A2/pt
Priority to JP2012500299A priority patent/JP5713211B2/ja
Priority to EP10716554A priority patent/EP2408806A1/fr
Priority to US13/257,018 priority patent/US9522942B2/en
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    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
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    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance

Definitions

  • the present invention relates to novel antimicrobial peptides, pharmaceutical compositions comprising these peptides and their uses, especially as a drug or disinfectant.
  • the present invention further relates to a transgenic plant expressing these novel peptides.
  • antimicrobial peptides have emerged as very promising for designing new therapeutic agents.
  • Cationic antimicrobial peptides are considered to be one of the key components of the innate immune system that provides the first line of defense for multicellular organisms against pathogens.
  • the interest of these peptides comes on the one hand from their very broad spectrum of activity allowing in particular their use in the treatment of infections by multi-resistant strains.
  • their mode of action is based on rapid permeabilization or fragmentation of the membranes of microorganisms and is therefore unlikely to generate the appearance of resistance mechanisms.
  • Antimicrobial peptides have been identified in plants, insects, amphibians or mammals.
  • the skin of amphibians is an important source of antimicrobial peptides and each frog species has its own peptide repertoire that is usually 10 to 15 PAM.
  • the frogs of the Ranidae family are very numerous and this family currently comprises 16 genera and 338 species. These frogs synthesize and secrete a remarkable diversity of MAP that has been classified into 13 families (Conlon et al, 2008 and 2009).
  • One of these families, the temporins includes small size (generally between 10 and 14 residues) whose sequences are very variable depending on the species. More than 60 members belonging to the temporine family have been identified.
  • the temporins In contrast to the other 12 families of Ranidae peptides, the temporins lack the Rana box motif, a heptapeptide motif cyclized by a C-terminal disulfide bridge (Mangoni, 2006). In addition, most temporins contain a single basic residue which gives them a net charge of +2 at physiological pH.
  • Temporines are generally particularly active against gram-positive bacteria and yeasts, but they also possess antifungal properties (Rollins-Smith et al, 2003) and for some antiviral properties (Chinchar et al, 2004).
  • Leishmaniasis is an extremely widespread disease in the world, mainly in India, South America, Africa and around the Mediterranean. Several million people are infected each year with this parasite. Depending on the species of Leishmania, leishmaniasis can be cutaneous, muco-cutaneous or visceral affections. For example, the visceral form, the most serious and potentially fatal in the absence of treatment, is due to two species of Leishmania: Leishmania infantum and Leishmania donovani.
  • Leishmania present two successive morphological stages: the promastigote stage (free form in the digestive tract of the insect vector, the sandfly) and the amastigote stage (intracellular form infecting mononuclear phagocytes of the mammalian host).
  • the first-line treatment for leishmaniases is the use of antimony derivatives, such as meglumine antimoniate (Glucantime ® ) or sodium stibogluconate (Pentostam ® ).
  • antimony derivatives such as meglumine antimoniate (Glucantime ® ) or sodium stibogluconate (Pentostam ® ).
  • Glucantime ® meglumine antimoniate
  • Pentostam ® sodium stibogluconate
  • antimony derivatives such as meglumine antimoniate (Glucantime ® ) or sodium stibogluconate (Pentostam ® ).
  • Glucantime ® meglumine antimoniate
  • Pentostam ® sodium stibogluconate
  • the object of the present invention is to provide novel antimicrobial peptides, temporin-SHa analogs and having increased antimicrobial activity, especially with respect to bacteria and the parasite Leishmania.
  • these new peptides also have decreased hemolytic activity relative to the temporin-SHa.
  • the present invention firstly relates to a peptide of 13 to 100 amino acids in size, having an antimicrobial activity and comprising the sequence FLX 1 -X 2 -IVX 3 -MLX 4 -KLF, where X 1 is amino acid selected from the group consisting of S, R, H and K, and X 2 , X 3 and X 4 , the same or different, are amino acids selected from the group consisting of G, R, H and K, and wherein, when X is S, at least one of X 2 , X 3 and X 4 residues is selected from the group consisting of R, H and K, and the functional derivatives and pharmaceutically acceptable salts of said peptide.
  • X 1 is an amino acid selected from the group consisting of R, H and K, and X 2 , X 3 and X 4 are G.
  • X 1 is K, and X 2 , X 3 and X 4 are G .
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a peptide according to the invention.
  • the present invention further relates to an expression cassette comprising a nucleic acid according to the invention.
  • the present invention also relates to an expression vector comprising a nucleic acid encoding a peptide according to the invention.
  • the present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid, a cassette or an expression vector according to the invention.
  • the present invention also relates to an antibody specifically binding to a peptide according to the invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to the invention, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
  • the present invention also relates to a peptide according to the invention as a medicament.
  • the medicament is for treating an infection with a bacterium, a virus, a fungus or a parasite.
  • the parasite belongs to the genus Leishmania.
  • the present invention relates to the use of a peptide according to the invention as a disinfectant, preservative or pesticide.
  • the present invention relates to a medical device or an implant comprising a body having at least one surface covered or including a peptide according to the invention.
  • the present invention relates to a transgenic plant comprising a nucleic acid, a cassette or an expression vector according to the invention, and capable of expressing or expressing a peptide according to the invention.
  • FIG. 1 shows a Schiffer-Edmunson projection of the ⁇ -helix of temporin-SHa.
  • Residues 4, 11, 7, 3 and 10 constitute the polar face of the helix.
  • the residues 8, 1, 12, 5, 9, 2, 13 and 6 constitute the apolar face of the helix.
  • FIG. 2 presents a graph showing the activity of the temporin-SHa (B) and the [K 3 ] temporin-SHa (*) analog on the axenic amastigotes (A) and promastigotes (B) of Leishmania infantum.
  • the percentage of growth of the amastigotes and promastigotes is represented as a function of the peptide concentration.
  • Figure 3 shows a graph showing the cytotoxic activity of temporin-SHa (m) and the [K 3 ] temporin-SHa (*) analog on monocytes. The percentage of monocyte growth is shown as a function of peptide concentration.
  • temporin-SHa formerly called temporin-lSa
  • This temporin is obtained by the post-translational processing of a precursor of 50 residues (entry number in the GenBank database: CAO77282).
  • This precursor has a highly conserved N-terminal domain containing the signal peptide and a region rich in acid residues, as well as a hypervariable C-terminal domain containing the progenitor sequence of the temporin-SHa.
  • the mature form of temporin is obtained after i) proteolytic cleavage at the KR doublet that precedes the progenitor sequence, ii) removal of the C-terminal K residue from the progenitor sequence by a carboxypeptidase and iii) residue amidation C-terminal of temporin thanks to the C-terminal residue G of the progenitor sequence which serves as donor of the amide function (substrate peptidyl-glycine ⁇ -amidating monooxygenase).
  • the mature protein is a peptide of 13 amino acid residues length and having the following sequence FLSGIVGMLGKLF (SEQ ID No.1).
  • the temporins are not structured in aqueous solution but are structured in ⁇ -helix in membrano -mimetic environments.
  • This peptide has antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, yeast and parasite Leishmania infantum (Abbassi et al., 2008).
  • the antiparasitic action of temporin-SHa is exerted on the promastigote forms as well as on the axenic amastigote forms of the parasite with respectively IC 50 of 18.1 ⁇ M and 22.8 ⁇ M.
  • the antimicrobial activity of antimicrobial peptides (MAP), as well as their cytolytic activities towards mammalian cells reflect a subtle equilibrium between several parameters, such as net charge, hydrophobicity and helicity.
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide polypeptide or protein
  • C cysteine
  • D aspartic acid
  • E glutamic acid
  • F phenylalanine
  • G glycine
  • H histidine
  • I isoleucine
  • K lysine
  • L leucine
  • M methionine
  • N asparagine
  • P proline
  • Q glutamine
  • R arginine
  • S serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • microbe or "microbial” as used herein refers to bacteria, fungi, yeasts, viruses and / or parasites.
  • microbial infection refers to an infection caused by bacteria, fungi, yeasts, viruses and / or parasites.
  • IC50 or “inhibitory concentration 50” is the concentration of a compound required to reduce the in vitro growth of a population of microorganisms by 50%.
  • MIC or “minimum inhibitory concentration” corresponds to the minimum concentration of compound which makes it possible to totally inhibit microbial growth, after 18 hours of incubation, generally at 37 ° C., in the presence of said compound.
  • CMB or “minimum bactericidal concentration” is the minimum concentration of compound that can destroy 99.9% of microorganisms after 18 to 24 hours of contact with said compound.
  • lethal concentration 50 refers to the concentration of compound causing the death of 50% of a population cellular.
  • LC50 is a quantitative indicator of the toxicity of a compound. LC50 is used in this document to evaluate the haemolytic activity of PAM and in this case corresponds to the peptide concentration inducing haemolysis of 50% of red blood cells.
  • the present invention relates first of all to a temporin-SHa analog peptide in which one or more amino acids of the polar face of the ⁇ -helix are substituted with basic amino acids.
  • the amino acids constituting the polar face of this helix are the residues 4, 11, 7, 3 and 10 of the temporin-SHa , especially as presented in SEQ ID No.1.
  • the present invention thus relates to a temporin-SHa analog peptide having antimicrobial activity and comprising the sequence FL-Xi-X 2 -IVX 3 -ML-X4-KLF (SEQ ID No.18), where X1 is an amino acid selected from the group consisting of S, R, H and K, and X 2 , X 3 and X 4 , which are the same or different, are amino acids selected from the group consisting of G, R, H and K, and wherein when Xi is S at least one of the residues X 2 , X 3 and X 4 is selected from the group consisting of R, H and K.
  • the peptide of the present invention comprises a sequence selected from the group consisting of
  • FL-Xi-GIVGMLGKLF SEQ ID No. 2
  • FLSX 2 -IVGMLGKLF SEQ ID No.3
  • FLSGIVX 3 -MLGKLF SEQ ID No.4
  • FLSGIVGMLX 4 -KLF SEQ ID No.5
  • FL-Xi-X 2 -IVGMLGKLF SEQ ID NO: 6
  • FL-Xi -GI-VX 3 -MLGKLF (SEQ ID No. 7); FL-Xi -GI-VGMLX 4 -KLF (SEQ ID No.8); FLSX 2 -IVX 3 -MLGKLF (SEQ ID No.9); FLSX 2 -IVGMLX 4 -KLF (SEQ ID No.10); FLSGIVX 3 -MLX 4 -KLF (SEQ ID No.11);
  • FL-Xi-X 2 -IVX 3 -MLGKLF SEQ ID No. 12
  • FL-Xi-X 2 -IVGMLX 4 -KLF SEQ ID No.13
  • FL-Xi-GIVX 3 -MLX 4 -KLF SEQ ID No. 14
  • FLSX 2 -IVX 3 -MLX 4 -KLF SEQ ID No.15
  • FL-Xi-X 2 -IVX 3 -MLX 4 -KLF SEQ ID No.16
  • X 1 , X 2 , X 3 and / or X 4 are basic amino acids selected from the group consisting of R , H and K.
  • X 1 , X 2 , X 3 and / or X 4 are K.
  • Xi is K in SEQ ID Nos. 2 to 16.
  • the peptide has a size of between 13 and 100 amino acids, preferably between 13 and 30, 35, 40, 45 or 50 amino acids. According to another embodiment, the peptide has a size of between 13 and 15, 20 or 25 amino acids. According to a particular embodiment, the peptide has a size of 13 amino acids.
  • the peptide according to the invention may be a precursor of a mature antimicrobial peptide. This precursor then undergoes post-translational modifications making it possible to obtain the mature form of the PAM. It can thus comprise a translocation signal sequence and recognition and / or cleavage sites allowing it to undergo these post-translational modifications.
  • the peptide is a precursor of a mature antimicrobial peptide and comprises the sequence FLGT-1-NLSLCEQERDADEEERRDEPN-ESNVEVEKRFL-Xi-X 2 -I-VX 3 -MLX 4 -KLFGK (SEQ ID No.17 ), where X 1 is an amino acid selected from the group consisting of S, R, H and K, and X 2 , X 3 and X 4 , which are identical or different, are amino acids selected from the group consisting of G, R, H and K, and where when X is S at least one of the residues X 2 , X 3 and X 4 is selected from the group consisting of R, H and K.
  • the amino acids constituting the peptide according to the invention may be of L or D configuration, preferably of L configuration.
  • the peptide according to the invention may have a post-translational modification and / or a chemical modification, in particular a glycosylation, an amidation , acylation, acetylation or methylation.
  • protecting groups may be added at the C- and / or N-terminus.
  • the protecting group at the N-terminus may be acylation or acetylation and the protecting group at the C-terminus may be amidation or esterification.
  • the action of proteases can also be counteracted by the use of amino acids of configuration D, the cyclization of peptide by formation of disulfide bridges, lactam rings or bonds between the N- and C-termini.
  • the peptide according to the invention has an amidation of its C-terminal end.
  • the peptide according to the invention may comprise one or more amino acids which are rare amino acids, in particular hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methylsilyl, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine, aminobutyric acid; or synthetic amino acids including ornithine, norleucine, norvaline and cyclohexyl-alanine.
  • amino acids which are rare amino acids in particular hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methylsilyl, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, pyroglutamine, aminobutyric acid; or synthetic amino acids including ornithine
  • the invention also covers the functional derivatives of a peptide according to the invention as described above.
  • the term "functional derivative” as used herein refers to peptides having substantially the same amino acid sequence, substantially the same helical structure, and substantially the same antimicrobial activity. These functional derivatives can be, for example, retro peptides, retro-inverso peptides, peptides having conservative substitutions and peptides whose side chain of one or more of the amino acids is substituted by groups which do not modify the antimicrobial activity of the peptide of the invention.
  • the term “conservative substitution” as used herein refers to a substitution of one amino acid residue for another that has similar chemical or physical properties (size, charge, or polarity).
  • isoleucine, leucine, alanine, valine, phenylalanine, proline and glycine may be conservatively substituted, as may lysine, histidine and arginine or serine, tyrosine and threonine or cysteine and methionine or asparagine, glutamine and tryptophan or aspartic acid and glutamic acid.
  • the term "functional derivative” also refers to a peptide according to the invention whose sequence is shortened by 1, 2, 3 or 4 amino acids at its C-terminal and / or N-terminal end.
  • the invention also covers the pharmaceutically acceptable salts of a peptide according to the invention.
  • the pharmaceutically acceptable salts may be, for example, salts with pharmaceutically acceptable mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; salts with pharmaceutically acceptable organic acids such as acetic acid, citric acid, maleic acid, malic acid, succinic acid, ascorbic acid and tartaric acid; salts with pharmaceutically acceptable inorganic bases such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium salts; or salts with organic bases which have salifiable nitrogen, commonly used in the pharmaceutical art.
  • the methods for preparing these salts are well known to those skilled in the art.
  • the peptide according to the invention can be obtained by conventional chemical synthesis (in the solid phase or in liquid homogeneous phase) or by enzymatic synthesis (Kullman et al., 1987). It can also be obtained by culturing a host cell, as described hereinafter, comprising a transgene encoding the peptide and expressing said peptide, and extracting said peptide from these host cells or from the culture medium. wherein the peptide has been secreted.
  • the peptide according to the invention is endowed with antimicrobial activity.
  • this activity is greater than that of temporin-SHa with respect to at least one bacterial, viral, fungal or parasitic strain.
  • the peptide according to the invention has an antimicrobial activity superior to temporin-SHa with respect to bacteria and more particularly with respect to Gram-negative bacteria such as Escherichia coli or Pseudomonas aeruginosa.
  • the peptide according to the invention has a MIC against Pseudomonas aeruginosa of less than 10 ⁇ M.
  • the peptide according to the invention has an antimicrobial activity superior to temporin-SHa with respect to parasites, especially with regard to the parasites Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis, Leishmania major , Leishmania mexicana, Leishmania panamensis, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis and / or Leishmania peruviana, particularly Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica and / or Leishmania braziliensis, and most preferably vis-à-vis the parasite Leishmania infantum.
  • the peptide according to the invention has an IC50 of less than 15 ⁇ M vis-à-vis the promastigote form of the parasite Leishmania infantum. According to a preferred embodiment, the peptide according to the invention has a lower hemolytic activity than that of temporin-SHa. According to a particular embodiment, the peptide according to the invention has an ⁇ -CL50 for erythrocytes greater than 30 ⁇ M.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding a peptide according to the invention.
  • nucleic acid means any molecule based on DNA or RNA. It may be synthetic or semi-synthetic molecules, recombinant, possibly amplified or cloned in vectors, chemically modified, comprising non-natural bases or modified nucleotides comprising for example a modified bond, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar.
  • the nucleic acid according to the invention may be in the form of DNA and / or RNA, single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid is an isolated DNA molecule, synthesized by recombinant techniques well known to those skilled in the art.
  • nucleic acid according to the invention can be deduced from the sequence of the peptide according to the invention and the use of the codons can be adapted according to the host cell in which the nucleic acid is to be transcribed. These steps can be performed according to methods well known to those skilled in the art and some of which are described in the reference manual Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention further relates to an expression cassette comprising a nucleic acid according to the invention operably linked to the sequences necessary for its expression.
  • the nucleic acid may be under the control of a promoter allowing its expression in a host cell.
  • an expression cassette consists of or comprises a promoter for initiating transcription, a nucleic acid according to the invention, and a transcription terminator.
  • expression cassette refers to a nucleic acid construct comprising a coding region and a regulatory region, operably linked.
  • operably linked indicates that the elements are combined in such a way that the expression of the coding sequence (the gene of interest) and / or targeting of the encoded peptide are under control of the transcriptional promoter and / or the transit peptide.
  • the promoter sequence is placed upstream of the gene of interest, at a distance thereof compatible with the control of the expression.
  • the sequence of the transit peptide is generally fused upstream of the sequence of the gene of interest, and in phase with it, and downstream of any promoter. Spacer sequences may be present between the regulatory elements and the gene, as long as they do not prevent expression and / or targeting.
  • said expression cassette comprises at least one enhancer activator sequence operably linked to the promoter.
  • the present invention further relates to an expression vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the invention.
  • This expression vector can be used to transform a host cell and allow the expression of the nucleic acid according to the invention in said cell.
  • the vector may be a DNA or an RNA, circular or not, single- or double-stranded. It is advantageously chosen from a plasmid, a phage, a phagemid, a virus, a cosmid and an artificial chromosome.
  • the expression vector comprises regulatory elements allowing the expression of the nucleic acid according to the invention.
  • These elements may comprise, for example, transcription promoters, transcription activators, terminator sequences, initiation and termination codons.
  • the methods for selecting these elements based on the host cell in which expression is desired are well known to those skilled in the art.
  • the vector may further comprise elements allowing its selection in the host cell, such as, for example, an antibiotic resistance gene or a selection gene ensuring the complementation of the respective gene deleted in the genome of the host cell.
  • elements allowing its selection in the host cell, such as, for example, an antibiotic resistance gene or a selection gene ensuring the complementation of the respective gene deleted in the genome of the host cell.
  • the expression vector is preferably a plant vector.
  • plant vectors are described in the literature, among which mention may in particular be made of A. tumefaciens T-DNA plasmids pBIN19 (Bevan, 1984), pPZ100 (Hajdukewicz et al., 1994), the pCAMBIA series (R. Jefferson, CAMBIA, Australia).
  • Vectors of the invention may further comprise an origin of replication and / or a selection gene and / or a plant recombination sequence.
  • the vectors can be constructed by conventional molecular biology techniques well known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention to transform or transfect a cell.
  • the host cell may be transiently / stably transfected / transfected and the nucleic acid, cassette or vector may be contained in the cell as an episome or chromosomal form.
  • the present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid, a cassette or an expression vector according to the invention.
  • the host cell is a microorganism, preferably a bacterium or a yeast.
  • the host cell is an animal cell, for example a mammalian cell such as COS or CHO cells (US 4,889,803; US 5,047,335).
  • the cell is non-human and non-embryonic.
  • the host cell is a plant cell.
  • plant cell refers to any cell derived from a plant and capable of constituting undifferentiated tissues such as calli, and differentiated tissues such as embryos, plant parts, plant tissues and the like. plants or seeds.
  • the present invention also relates to a method for producing an antimicrobial peptide according to the invention comprising the transformation or transfection of a cell with a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the peptide produced by said cell.
  • Methods for producing recombinant peptides are well known to those skilled in the art. For example, there may be mentioned the specific modes described in WO 01/70968 for production in a human immortalized cell line, WO 2005/123928 for production in a plant and US 2005-229261 for production in the milk of an animal transgenic.
  • the present invention also relates to a method for producing an antimicrobial peptide according to the invention comprising the insertion of a nucleic acid, a cassette or an expression vector according to the invention into an expression system in vitro also called acellular and the harvest of the peptide produced by said system.
  • an expression system in vitro also called acellular and the harvest of the peptide produced by said system.
  • Many in vitro or acellular expression systems are commercially available and the use of these systems is well known to those skilled in the art.
  • the present invention further relates to a peptide according to the invention as a medicament, in particular as a medicament for the treatment of a microbial infection, namely an infection with a bacterium, a virus, a fungus or a parasite. It also relates to a nucleic acid, a cassette or a vector according to the invention as a medicament.
  • the drug may be for pharmaceutical or veterinary use.
  • the infection is an infection with a parasite, preferably of the genus Leishmania.
  • Infection with a parasite may be cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis or visceral leishmaniasis.
  • the parasite may be selected from the group consisting of Leishmania aethiopica, Leishmania amazonensis, Leishmania arabica, Leishmania aristedes, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania colombiensis, Leishmania deanei, Leishmania donovani, Leishmania enriettii, Leishmania equatorensis, Leishmania forattinii, Leishmania garnhami, Leishmania gerbili, Leishmania guyanensis, Leishmania herreri, Leishmania hertigi, Leishmania lainsoni, Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania naiffi, Leishmania panamensis, Leishmania peruviana, Leishmania pifanoi, Leishmania shawi, Leishmania turanica, Leishmania tropica and Leishmania venezuelensis.
  • the parasite is selected from the group consisting of Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis, Leishmania panamensis and Leishmania peruviana.
  • the parasite is selected from the group consisting of Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica and Leishmania braziliensis.
  • the infection is an infection with the parasite Leishmania infantum.
  • the infection can also be an infection with a parasite of the genus
  • the parasite may be selected from the group consisting of Trypanosoma avium, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma congolense,
  • Trypanosoma equinum Trypanosoma equiperdum
  • Trypanosoma evansi Trypanosoma lewisi
  • Trypanosoma melophagium Trypanosoma percae
  • the parasite is selected from the group consisting of Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi and
  • the present invention relates to a peptide according to the invention as an antimicrobial agent.
  • the present invention also relates to a nucleic acid, a cassette or a vector according to the invention as an antimicrobial agent.
  • the present invention relates to a peptide according to the invention as a stimulating agent of the immune system, in particular during a microbial infection.
  • the present invention also relates to a nucleic acid, a cassette or a vector according to the invention as a stimulating agent of the immune system.
  • the peptide according to the invention has chemotactic properties. The peptide induces the recruitment of immune cells to the place of infection and increases the efficacy of the immune response to infections.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising at least one peptide according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid, cassette or vector according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
  • the pharmaceutically acceptable excipients and carriers that can be used in the composition according to the present invention are well known to those skilled in the art (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 th edition, AR Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be suitable for oral, sublingual, cutaneous, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, intraocular or intra-auricular administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is suitable for dermal, oral, intramuscular, intravenous, transdermal or subcutaneous administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is suitable for topical administration.
  • composition according to the invention may be in the form of tablets, capsules, capsules, granulates, suspensions, emulsions, solutions, gels, pastes, ointments, creams, plasters, potions, suppositories, enemas, injectables, implants, patches, sprays or aerosols.
  • the composition according to the invention comprises from 1 to
  • composition according to the invention comprises from 50 to 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000 or 1500 mg of peptide according to the invention.
  • composition according to the invention may furthermore comprise additional active substances, such as other antimicrobial agents, in particular antimicrobial peptides or antibiotics.
  • additional active substances such as other antimicrobial agents, in particular antimicrobial peptides or antibiotics.
  • the composition may also comprise substances capable of potentiating the activity of the peptide according to the invention.
  • the present invention relates to the use of a peptide according to the invention for the preparation of a medicament for the treatment of a microbial infection.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid, a cassette or a vector according to the invention for the preparation of a medicament for the treatment of a microbial infection.
  • the present invention relates to a peptide according to the invention for use in the treatment of a microbial infection.
  • the present invention also relates to a nucleic acid, a cassette or a vector according to the invention for use in the treatment of a microbial infection.
  • the treatment can be curative or preventive.
  • the subject to be treated is an animal, preferably a mammal. According to a particular embodiment, the subject to be treated is a human.
  • the present invention also relates to a method of treating a microbial infection comprising administering a therapeutically effective dose of a peptide, nucleic acid, cassette or vector of the invention.
  • terapéuticaally effective dose refers to the amount of peptide, nucleic acid, cassette or vector according to the invention required to observe antimicrobial activity on the bacterium, virus, fungus or the parasite responsible for the infection.
  • the amount of peptide, nucleic acid, cassette or vector according to the invention to be administered as well as the duration of the treatment are evaluated by those skilled in the art according to the physiological state of the subject to be treated, the pathogen and the antimicrobial activity of the peptide vis-à-vis said pathogen.
  • the microbial infection to be treated is a leishmaniasis.
  • An effective dose of peptide according to the present invention may include, but is not limited to, about 1 to 40 mg / kg body weight.
  • the frequency of administration may be for example every 4 to 24 hours, preferably every
  • the duration of the treatment may be, for example, from 1 to 30 days, preferably from 10 to 20 days, and most preferably from 5 to 10 days.
  • the present invention also relates to the use of the peptide according to the invention as a preservative, disinfectant or pesticide.
  • the food products can be treated with a peptide according to the invention in order to eliminate or prevent the risk of infection by micro-organisms and thus improve their preservation.
  • the peptide is used in this case as a preservative.
  • the peptide according to the invention can be used as a pesticide.
  • the peptide is then used to prevent or treat plant infections by phytopathogens.
  • the peptide according to the invention can also be used as a disinfectant.
  • the term "disinfectant" refers to an antimicrobial activity of the peptide on a surface (eg, walls, doors, medical equipment), a liquid (eg, water) or a gas (eg, anesthetic gas) . Biofilms are responsible for nearly 60% of nososomial infections.
  • the peptide according to the invention is used for the elimination of bacterial biofilms. According to a preferred embodiment, the peptide according to the invention is especially used for the disinfection of surgical or prosthetic equipment.
  • the present invention also relates to a medical device or implant comprising a body having at least one surface covered or including a peptide according to the invention.
  • the surface may be covered with a peptide at a density of 0.4 to 300 mg / cm 2 .
  • the peptide may be combined with another active molecule, preferably an antibiotic.
  • the implant can be a vascular implant.
  • the present invention also relates to a method for preparing a medical device or implant comprising applying a peptide layer according to the invention, or putting it in contact with it, on at least one surface of the device. or implant.
  • This type of medical device or implant and its uses and methods of preparation are described for example in the patent application WO 2005/006938.
  • the present invention relates to a food composition comprising at least one peptide according to the invention.
  • the present invention also relates to an agrochemical composition comprising at least one peptide according to the invention.
  • the present invention relates to a transgenic plant comprising a nucleic acid, a cassette or an expression vector according to the invention, capable of expressing or expressing a peptide according to the invention.
  • the introduction of the nucleic acids, cassettes or expression vectors of the invention into a cell or plant tissue, including a seed or plant can be carried out by any technique known to those skilled in the art.
  • Plant transgenesis techniques are well known in the art, and include for example the use of the bacterium Agrobacterium tumefaciens (Hooykaa and Schilperoort, 1992), electroporation, conjugative transfer, biolistic techniques (Russel et al., 1992). ) or microinjection into plant embryos or protoplasts.
  • Other plant transgenesis techniques are well known, or other protocols embodying the above techniques are described in the prior art (Siemens and Schieder, 1996) and can be applied to the present invention.
  • the transgenic plant according to the invention can in particular be obtained according to the method described in the patent application WO 00/055337.
  • the transgenic plant may belong to any plant species. It can be monocotyledonous or dicotyledonous. More particularly, the transgenic plant of the invention is a crop plant intended or not for animal or human food or on which the sandflies, the insect vectors of Leishmania, come to feed such as corn, wheat, rapeseed , soy, alfalfa, flax, rice, sugar cane, beet, tobacco, cotton, sunflower, tomato, cabbage, carrot, potato, or fruit trees such as lemon, apple, apricot, peach or hazel, or plants identified to date as sources of sweet meal for sandflies such as Ricinus communis, Capparis spinosa, Solanum jasminoides, Solanum luteum or Bougainvillea glabra.
  • the expression of the peptide according to the invention allows the transgenic plant to have increased resistance to pathogens, and more particularly to phytopathogens.
  • the use of such a transgenic plant can significantly reduce the spraying or application of pesticides on crops, and thus limit the adverse effects of these products on the environment.
  • the transgenic plant expresses a peptide according to the invention which is administered to an animal, including sandflies or a by ingestion of said plant or its juices.
  • the peptide does not necessarily have an effect on the phytopathogens but has an antimicrobial activity vis-à-vis one or more pathogens of the animal including leishmanias present in the digestive tract of sandflies vectors of leishmaniasis humans and animals or the human to whom it is administered.
  • transgenic plants on which the sandflies take their sweet meal deliver directly into the digestive tract of the insect vector, an antimicrobial peptide of the invention that directly kills the parasite that may be present in the insect vector or by blocking its development by killing bacteria of the intestinal flora of the insect vector, necessary for differentiation and parasitic multiplication.
  • Transgenic plants are an effective means of indirectly controlling the transmission of leishmaniasis.
  • the present invention relates to an antibody specific for the peptide according to the invention.
  • antibody refers in particular to polyclonal or monoclonal antibodies, fragments thereof (e.g., F (ab) '2, F (ab)) fragments, single antibodies, -chain or minibody or any polypeptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the peptide according to the invention, in particular the CDRs (regions determining the complementarity).
  • chimeric, humanized or human antibodies may be mentioned.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas according to methods well known to those skilled in the art. The different techniques for preparing the antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to the use of an antibody according to the invention for detecting a peptide according to the invention. It also relates to the use of an antibody according to the invention for carrying out quantitative measurements of a peptide according to the invention, in particular by immunological assays. These measurements can in particular make it possible to evaluate the expression of the peptide according to the invention in a host cell or a transgenic plant according to the invention. All references cited in this specification are incorporated by reference in this application. Other features and advantages of the invention will appear better on reading the following examples given for illustrative and non-limiting. EXAMPLES
  • Vanhoye et al. Vanhoye et al. (Vanhoye et al, 2004), and using amino acids protected by
  • Escherichia coli ATCC 25922 and ATCC 352148
  • Staphylococcus aureus ATCC 25923
  • Enterococcus faecalis ATCC 29212
  • Bacillus megaterium and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
  • a standard inoculum of 10 5 to 10 6 bacteria / mL (exponential growth phase) was prepared.
  • an isolated colony on an LB agar previously seeded with one of the strains was cultured in 10 ml of LB medium.
  • the cultures in a liquid medium were then incubated for 2 to 3 hours with stirring at 37 ° C. so that the bacteria were in an exponential growth phase.
  • Each bacterial suspension was diluted in LB medium to obtain an OD at 630 nm of 0.01 which corresponds to a concentration of 10 5 -10 6 cfu / ml (cfu: colony forming unit).
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of each peptide was determined by a growth inhibition test in a liquid medium.
  • MIC is defined as the lowest concentration of peptide capable of inhibiting the growth of the bacterial strain tested after incubation for 18 h at 37 ° C.
  • the test was performed in a sterile microtiter plate containing 96 wells. A range of increasing concentrations of each peptide (1 to 400 ⁇ M) was previously prepared in sterile milliQ water containing 5% dimethyl sulfoxide (DMSO). DMSO facilitates the solubilization of peptides and shows no antimicrobial activity at the concentration used.
  • 50 ⁇ l of peptide were incubated with 50 ⁇ l of bacterial suspension (10 5 -10 6 cfu / ml). The microplate was then incubated at 37 ° C for 18 h with shaking. Bacterial growth was determined by measuring OD at 630 nm (turbidity) using a plate reader. The tests were performed in triplets for each peptide concentration.
  • the negative growth inhibition control was obtained by replacing the solution containing the peptide with 50 ⁇ l of sterile milliQ water containing 5% DMSO.
  • the positive control allowing to completely inhibit the growth of bacterial strains was obtained by replacing the solution containing the peptide with 50 ⁇ l of formaldehyde at 0.7%.
  • yeast strains Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans (ATCC 90028), Candida parapsilosis (ATCC 22019). These strains were previously grown on YPD agar for at least 48 hours. Yeast suspensions were then prepared exactly as for bacteria, and adjusted to 10 5 to 10 6 cfu / ml in liquid YPD medium. The antifungal test corresponds to the growth inhibition test in a liquid medium used for the bacteria (cf above) in which the LB medium has been replaced by a YPD culture medium. The fungal strains were incubated at 30 ° C.
  • the haemolytic activity of antimicrobial peptides was demonstrated using human red blood cells from healthy donors. Haemolysis of globules red results in the release of hemoglobin in the reaction medium whose concentration is determined spectrophotometrically at 450 nm.
  • Red blood cells were separated from plasma and white blood cells by centrifugation of human blood (900 g, 10 min). The pellet containing the red blood cells was washed 3 times with PBS buffer, pH 7.4. After counting with a cell of
  • the test was carried out as follows: 100 .mu.l of the different concentrations of peptide were added to 100 .mu.l of the suspension of red blood cells. After 1 h of incubation at 37 ° C, followed by centrifugation (12000g, 15 sec), the absorbance of the supernatant was measured at 450 nm.
  • the negative control for this test (0% hemolysis) contained 100 ⁇ l of PBS buffer in place of the solution containing the peptide and the positive control (100% hemolysis) contained 100 ⁇ l of 0.1% Triton on the place of the same solution.
  • the LC50 value obtained results from the average of three experiments performed in triplets and corresponds to the peptide concentration inducing 50% hemolysis.
  • the antiparasitic activity of the peptides was evaluated on both forms of the parasite Leishmania infantum, the promastigote form and the amastigote form.
  • the anti-Leishmania activity tests were carried out with an ⁇ NEO- ⁇ LUC line of Leishmania infantum. This line was obtained by transforming the Leishmania infantum strain MHOM / MA / 67 / ITMAP-263 with the pGM ⁇ NEO- ⁇ LUC vector containing the luciferase reporter gene (LUC) and the neomycin resistance gene (NEO) such as as described in Roy et al. (2000). It is maintained in culture in its two forms, promastigotes and amastigotes.
  • LOC luciferase reporter gene
  • NEO neomycin resistance gene
  • Promastigotes of Leishmania infantum were maintained at 26 ° C by one to two weekly passages depending on the number of parasites in the inoculum, in SDM 79 medium, supplemented with 10% to 20% of decomplemented fetal calf serum and 5% mg / mL of pork and in the presence of 100 U / mL of penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin (Brun & Shonenberger, 1979). From an inoculum of 10 5 cells / ml in log phase growth, the promastigotes reached a cell density of 2 to 3 ⁇ 10 8 parasites / mL in stationary phase, after 7 days of culture in culture flasks. 25 cm 2 . Cell densities were determined by flow cytometry counting in the presence of propidium iodide on a Facscan counter (Excalibur, Becton-Dickinson, Ivry, France).
  • the axenic amastigotes were obtained by differentiation of the promastigotes at 37 ° C ⁇ 0, PC (saturation in H 2 O, 5% CO 2 ), in culture in MAA medium, supplemented with 20% of decomplemented fetal calf serum and 12.5 mg / mL of pork hemoin, in the presence of 100 LVmL of penicillin and 100 ⁇ g / mL of streptomycin (Sereno and Lemesre, 1997). From an inoculum of 5 ⁇ 10 5 cells / ml in log phase growth, the amastigotes reached a cell density of 2 to 3 ⁇ 10 8 parasites / mL in stationary phase, after 7 days of culture in flasks of culture of 25 cm 2 .
  • axenic amastigotes Microscopic observation of axenic amastigotes shows homogeneous forms (round to ovoid) without apparent flagellum and immobile.
  • the axenic amastigotes of various Leishmania species exhibit the same ultrastructural, biological, biochemical, and immunological properties as intracellular amastigotes. Cell densities were also determined by flow cytometry counting according to the same procedure and the same parameters used for promastigotes.
  • the suspension of axenic amastigotes is distributed in a culture microplate in a volume of 80 ⁇ l per well (ie 10 5 parasites / well) into which 20 ⁇ l of each peptide solution (60 to 0.94) are added.
  • ⁇ M final ie a final parasite density of 10 6 parasites / mL.
  • the plate is then incubated at 37 ° C for 72 h.
  • the peptide solution was replaced with 20 ⁇ L of MAA / 20 medium.
  • the positive control was performed with 20 ⁇ L of the solution containing the highest concentration of peptide.
  • the experiments are performed in triplets for each peptide concentration.
  • lysis buffer (Steady GLO, Promega) were added to each well. After incubation for 5 min at room temperature, cell lysis was checked under a microscope. The emitted luminescence was measured by a luminescence reader (Victor,
  • amastigote tests 80 ⁇ l of promastigote suspension (10 5 parasites / well) were mixed with 20 ⁇ l of peptide solution (60 to 0.94 ⁇ M final) in each well of a microtiter plate. Negative and positive controls were performed according to the same protocol as for anti-Leishmania activity tests on amastigotes. The experiments are performed in triplets for each peptide concentration. After 72 hours of incubation at 26 ° C., 50 ⁇ L per well of Steady lysis buffer
  • GIo Promega
  • the cytotoxic activity of the antimicrobial peptides was determined against a THP-I human monocyte line.
  • the cells were maintained in culture in RPMI medium (10% FCS, 100 LVmL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin) until an exponential phase of growth. After counting on a Thoma cell, the cell density was adjusted to 6.25 ⁇ 10 5 cells / ml in RPMI 1640 medium. Five-fold concentrated peptide solutions were prepared in RPMI medium (300 to 4.7 ⁇ M).
  • the monocytes are distributed in a volume of 80 ⁇ l of cell suspension per well (ie 5 ⁇ 10 4 monocytes / well or 5 ⁇ 10 5 cells / final ml) and mixed with 20 ⁇ l of peptide solution (60 to 0.94 ⁇ M final). Negative and positive controls were performed according to the same protocol as for anti-Leishmania activity tests. The experiments are performed in triplets for each peptide concentration. The cells are incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 72 hours.
  • MTT or 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • succinate-tetrazolium reductase which is present in the mitochondrial respiratory chain of metabolically active cells. This formazan blue is detectable by spectrophotometry (570 nm).
  • the plates are then incubated for 4 h at 37 ° C.
  • the enzymatic reaction is stopped by the addition of 100 ⁇ l of a 50% isopropanol / 10% SDS mixture and the microplates are then incubated at room temperature for 30 min, with stirring.
  • OD at 570 nm from each well was then measured (Victor reader, PerkinElmer) to determine IC50.
  • the anti-Leishmania activity of the two temporins was evaluated on the parasite Leishmania infantum, which is mainly responsible for human visceral leishmaniasis in the Mediterranean basin and in Latin America.
  • Culture of the promastigote and axenic amastigote forms of Leishmania infantum (MHOM / MA / 67 / ITMAP-236) expressing the luciferase gene were used.
  • the evaluation of the metabolic activity of parasites is based on the oxidation of luciferin by luciferase in the presence of ATP. This process results in the emission of photons which is proportional to the concentration of the non-ionic parasites.
  • Cirioni O Giacometti A, Ghiselli R, Dell Acqua G, Gov Y, Kamysz W,

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux peptides antimicrobiens, des compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides et leurs utilisations, notamment en tant que médicaments antimicrobiens, désinfectants, pesticides ou conservateurs. La présente invention concerne également une plante transgénique exprimant ces nouveaux peptides.

Description

Analogues de la temporine-SHa et leurs utilisations
La présente invention se rapporte à de nouveaux peptides antimicrobiens, aux compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides et à leurs utilisations, notamment en tant que médicament ou désinfectant. La présente invention se rapporte en outre à une plante transgénique exprimant ces nouveaux peptides.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
L'évolution et la progression de la résistance bactérienne aux antibiotiques apparaît aujourd'hui comme un problème majeur de santé publique, notamment en milieu hospitalier avec l'apparition de souches multi-résistantes. D'importants efforts de recherche ont permis de développer de nouveaux antibiotiques efficaces sur ces souches résistantes. Néanmoins, à force d'utilisation, des mécanismes de résistance vis-à-vis de ces molécules apparaissent et diminuent leur efficacité.
Face à ce phénomène, les peptides antimicrobiens (PAM) sont apparus comme très prometteurs pour concevoir de nouveaux agents thérapeutiques. Les peptides antimicrobiens cationiques sont considérés comme l'un des éléments clefs du système immunitaire inné qui assure la première ligne de défense des organismes multicellulaires contre les pathogènes. L'intérêt de ces peptides vient d'une part de leur très large spectre d'activité permettant notamment leur utilisation dans le cadre de traitement d'infections par des souches multi-résistantes. D'autre part, leur mode d'action repose sur une perméabilisation ou une fragmentation rapide des membranes des microorganismes et est donc peu susceptible de générer l'apparition de mécanismes de résistance.
Des peptides antimicrobiens ont été identifiés aussi bien chez les plantes, les insectes, les batraciens ou les mammifères. La peau des batraciens est une source importante de peptides antimicrobiens et chaque espèce de grenouille dispose de son propre répertoire peptidique constitué généralement de 10 à 15 PAM.
Les grenouilles de la famille des Ranidae sont très nombreuses et cette famille comporte à l'heure actuelle 16 genres et 338 espèces. Ces grenouilles synthétisent et sécrètent une remarquable diversité de PAM qui ont été classés en 13 familles (Conlon et al, 2008 et 2009). L'une de ces familles, les temporines, comprend des PAM de petite taille (généralement entre 10 et 14 résidus) dont les séquences sont très variables suivant les espèces. Plus de 60 membres appartenant à la famille des temporines ont été identifiés. Ces temporines ont été isolées à partir de plusieurs espèces de Rana comme par exemple, Rana temporaria (Simmaco et al, 1996), Rana esculenta (Simmaco et al, 1990), Rana japonica (Isaacson et al, 2002), Rana ornativentris (Kim et al, 2001) et Pelophylax (Rana) saharica (Abbassi et al, 2008).
Contrairement aux 12 autres familles de peptides de Ranidae, les temporines sont dépourvues, du motif «Rana box», un motif heptapeptidique cyclisé par un pont disulfure en C-terminal (Mangoni, 2006). De plus, la plupart des temporines contiennent un seul résidu basique qui leur confère une charge nette de +2 à pH physiologique.
Les temporines sont en général particulièrement actives contre les bactéries Gram-positif et les levures mais elles possèdent également des propriétés antifongiques (Rollins-Smith et al, 2003) et pour certaines des propriétés antivirales (Chinchar et al, 2004).
Des études récentes menées sur les temporines A, B (Mangoni et al, 2006) et SHa (Abbassi et al, 2008), ont indiqué que ces peptides possèdent une action antiparasitaire sur des protozoaires du genre Leishmania, agents responsables des leishmanioses. En dehors de ces temporines, très peu de PAM possèdent une activité antiparasitaire : les dermaseptines et le polypeptide YY (également isolés de la peau de grenouille) ; l'indolicidine (isolée de granules de neutrophiles bovins) ; la gomésine (isolée de l'araignée Acanthoscurήa gomesiana) ; les hybrides cécropine-mélittine (obtenus à partir de molécules d'insectes).
Les leishmanioses sont des affections extrêmement répandues dans le monde, essentiellement en Inde, en Amérique du sud, en Afrique et sur le pourtour méditerranéen. Plusieurs millions de personnes sont infectées chaque année par ce parasite. Selon l'espèce de Leishmania, les leishmanioses peuvent être des affections cutanées, muco-cutanées ou viscérales. Par exemple, la forme viscérale, la plus grave et potentiellement mortelle en absence de traitement, est due à deux espèces de Leishmania : Leishmania infantum et Leishmania donovani. Les Leishmania présentent au cours de leur cycle de développement deux stades morphologiques successifs : le stade promastigote (forme libre dans le tube digestif de l'insecte vecteur, le phlébotome) et le stade amastigote (forme intracellulaire infectant les phagocytes mononuclés de l'hôte mammifère).
Le traitement de première intention des leishmanioses consiste en l'utilisation des dérivés de l'antimoine, tels que l'antimoniate de méglumine (Glucantime®) ou le stibogluconate de sodium (Pentostam®). Cependant, l'efficacité de l'antimoine diminue avec l'émergence d'une importante résistance pouvant aller jusqu'à 60% selon la localisation géographique. Malgré la disponibilité de médicaments alternatifs comme l'amphotéricine B (Ambisome®) ou la miltéfosine (Impavido®), il y a un réel besoin de trouver de nouvelles molécules permettant de lutter contre cette maladie.
RESUME DE L'INVENTION
L'objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux peptides antimicrobiens, analogues de la temporine-SHa et présentant une activité antimicrobienne accrue, notamment vis-à-vis des bactéries et du parasite Leishmania.
De préférence, ces nouveaux peptides ont également une activité hémolytique diminuée par rapport à la temporine-SHa.
La présente invention concerne tout d'abord un peptide d'une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la séquence F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F, où Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où, lorsque Xi est S, au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et les dérivés fonctionnels et les sels pharmaceutiquement acceptables dudit peptide. De préférence, Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et X2, X3 et X4 sont G. De préférence, Xi est K, et X2, X3 et X4 sont G.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention.
La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention. La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention. Dans un autre aspect, la présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention.
La présente invention concerne également un anticorps se liant spécifiquement à un peptide selon l'invention.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide selon l'invention, et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également un peptide selon l'invention, en tant que médicament. De préférence, le médicament est destiné au traitement d'une infection par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite. De préférence, le parasite appartient au genre Leishmania.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention en tant que désinfectant, conservateur ou pesticide. Dans un autre aspect, la présente invention concerne un appareillage médical ou un implant comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou incluant un peptide selon l'invention.
Dans un dernier aspect, la présente invention concerne une plante transgénique comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention, et susceptible d'exprimer ou exprimant un peptide selon l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente une projection de Schiffer-Edmunson de l'hélice α de la temporine-SHa. Les résidus 4, 11, 7, 3 et 10 constituent la face polaire de l'hélice. Les résidus 8, 1, 12, 5, 9, 2, 13 et 6 constituent la face apolaire de l'hélice. La figure 2 présente un graphe représentant l'activité de la temporine-SHa ( B ) et de l'analogue [K3]temporine-SHa (*) sur les amastigotes axéniques (A) et les promastigotes (B) de Leishmania infantum. Le pourcentage de croissance des amastigotes et des promastigotes est représenté en fonction de la concentration en peptide. La figure 3 présente un graphe représentant l'activité cytotoxique de la temporine-SHa (m) et de l'analogue [K3]temporine-SHa (*) sur les monocytes. Le pourcentage de croissance des monocytes est représenté en fonction de la concentration en peptide.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La temporine-SHa, anciennement appelée temporine-lSa, a été isolée à partir de la peau de la grenouille nord-africaine Pelophylax saharica (Abbassi et al, 2008). Cette temporine est obtenue par la maturation post-traductionnelle d'un précurseur de 50 résidus (numéro d'entrée dans la base de données GenBank : CAO77282). Ce précurseur présente un domaine N-terminal très conservé contenant le peptide signal et une région riche en résidus acides, ainsi qu'un domaine C-terminal hypervariable contenant la séquence progénitrice de la temporine-SHa. In vivo, la forme mature de la temporine est obtenue après i) clivage protéolytique au niveau du doublet KR qui précède la séquence progénitrice, ii) élimination du résidu K en C-terminal de la séquence progénitrice par une carboxypeptidase et iii) amidation du résidu C-terminal de la temporine grâce au résidu G en C-terminal de la séquence progénitrice qui sert de donneur de la fonction amide (substrat de la peptidyl-glycine α-amidating monooxygenase). La protéine mature est un peptide d'une longueur de 13 résidus d'acide aminé et présentant la séquence suivante F-L-S-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.1). Les temporines ne sont pas structurées en solution aqueuse mais se structurent en hélice α dans des environnements membrano -mimétiques. Ce peptide possède une activité antimicrobienne vis-à-vis des bactéries Gram- positif et Gram-négatif, des levures et du parasite Leishmania infantum (Abbassi et al. , 2008). L'action antiparasitaire de la temporine-SHa s'exerce aussi bien sur les formes promastigotes que sur les formes amastigotes axéniques du parasite avec respectivement une CI50 de 18,1 μM et de 22,8 μM. L'activité antimicrobienne des peptides antimicrobiens (PAM), ainsi que leurs activités cytolytiques vis-à-vis des cellules de mammifères, sont le reflet d'un subtil équilibre entre plusieurs paramètres, comme la charge nette, l'hydrophobie, l'hélicité et l'amphipathie (Giangaspero et al., 2001 ; Yeaman et al., 2003 ; Dennison et al., 2005). Ces paramètres sont très étroitement liés et la simple substitution d'un résidu d'acide aminé peut induire la modification simultanée de plusieurs propriétés physicochimiques du peptide. Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la substitution d'un ou plusieurs acides aminés de la face polaire de l'hélice α de la temporine-SHa par un acide aminé basique permettait d'obtenir un analogue de cette temporine présentant une activité antimicrobienne accrue ainsi qu'une toxicité diminuée.
Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », « polypeptide » ou « protéine » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d'acide aminé constituant cette chaîne. Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I : isoleucine; K : lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P : proline ; Q : glutamine ; R : arginine ; S : serine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y : tyrosine.
Le terme « microbe » ou « microbien » tel qu'utilisé dans ce document se réfère à des bactéries, des champignons, des levures, des virus et/ou des parasites.
Le terme « infection microbienne » tel qu'utilisé dans ce document se réfère à une infection causée par des bactéries, des champignons, des levures, des virus et/ou des parasites.
Le terme « activité antimicrobienne » tel qu'utilisé dans ce document se réfère à une activité antibactérienne, antivirale, antifongique et/ou antiparasitaire. Cette activité peut être évaluée au travers de la mesure de différents paramètres tels que la CI50, la CMI ou encore la CMB. La « CI50 » ou « concentration inhibitrice 50 » correspond à la concentration nécessaire d'un composé pour réduire de 50% la croissance in vitro d'une population de microorganismes. La « CMI » ou « concentration minimale inhibitrice » correspond à la concentration minimale de composé permettant d'inhiber totalement la croissance microbienne, après 18 heures d'incubation, en général à 37°C, en présence dudit composé. La « CMB » ou « concentration minimale bactéricide » est la concentration minimale de composé permettant de détruire 99,9% des microorganismes après 18 à 24 heures de contact avec ledit composé.
Le terme « concentration létale 50 » ou « CL50 » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à la concentration de composé causant la mort de 50 % d'une population cellulaire. La CL50 est un indicateur quantitatif de la toxicité d'un composé. La CL50 est notamment utilisée dans ce document pour évaluer l'activité hémolytique des PAM et correspond dans ce cas à la concentration de peptide induisant l'hémolyse de 50% des globules rouges.
La présente invention concerne tout d'abord un peptide analogue de la temporine-SHa dans lequel un ou plusieurs acides aminés de la face polaire de l'hélice α sont substitués par des acides aminés basiques. Selon la projection de Schiffer- Edmunson de l'hélice α de la temporine-SHa représentée sur la figure 1, les acides aminés constituant la face polaire de cette hélice sont les résidus 4, 11, 7, 3 et 10 de la temporine-SHa, notamment telle que présentée dans la SEQ ID No.1.
La présente invention concerne donc un peptide analogue de la temporine-SHa, doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la séquence F-L-Xi-X2-I-V-X3-M-L- X4-K-L-F (SEQ ID No.18), où Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où lorsque Xi est S au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K.
Selon un mode de réalisation, le peptide de la présente invention comprend une séquence sélectionnée parmi le groupe consistant en
F-L-Xi-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.2) ; F-L-S-X2-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.3); F-L-S-G-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.4); F-L-S-G-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.5); F-L-Xi-X2-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID N0.6);
F-L-Xi -G-I- V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.7); F-L-Xi -G-I- V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.8); F-L-S-X2-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.9); F-L-S-X2-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.10); F-L-S-G-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.11);
F-L-Xi-X2-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.12); F-L-Xi-X2-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.13); F-L-Xi-G-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.14); F-L-S-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.15); et F-L-Xi-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.16), dans lesquels X1, X2, X3 et/ou X4 sont des acides aminé basiques sélectionnés dans le groupe constitué de R, H et K. De préférence, X1, X2, X3 et/ou X4 sont K. Dans un mode de réalisation particulier, Xi est K dans les SEQ ID Nos.2 à 16.
Selon un mode de réalisation, le peptide a une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, de préférence entre 13 et 30, 35, 40, 45 ou 50 acides aminés. Selon un autre mode de réalisation, le peptide a une taille comprise entre 13 et 15, 20 ou 25 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide a une taille de 13 acides aminés.
Le peptide selon l'invention peut être un précurseur d'un peptide antimicrobien mature. Ce précurseur subit alors des modifications post-traductionnelles permettant d'obtenir la forme mature du PAM. Il peut ainsi comprendre une séquence signal de translocation et des sites de reconnaissance et/ou de clivage lui permettant de subir ces modifications post-traductionnelles. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide est un précurseur d'un peptide antimicrobien mature et comprend la séquence F-L-G-T- 1-N-L-S-L-C-E-Q-E-R-D-A-D-E-E-E-R-R-D-E-P-N-E-S-N-V-E-V-E-K-R-F-L-Xi-X2- 1-V-X3-M-L-X4-K-L-F-G-K (SEQ ID No.17), où Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où lorsque Xi est S au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K.
Les acides aminés constituant le peptide selon l'invention peuvent être de configuration L ou D, de préférence de configuration L. Le peptide selon l'invention peut présenter une modification post-traductionnelle et/ou une modification chimique en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation ou une méthylation.
Afin d'augmenter la biodisponibilité du peptide en améliorant sa résistance aux peptidases, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C- et/ou N- terminale. Par exemple, le groupement protecteur à l'extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l'extrémité C-terminale peut être une amidation ou une estérifîcation. L'action des protéases peut également être contrecarrée par l'utilisation d'acides aminés de configuration D, la cyclisation du peptide par formation de ponts disulfures, d'anneaux lactames ou de liaisons entre les extrémités N- et C-terminales. Le peptide de l'invention peut également comprendre des liaisons pseudo-peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques « classiques » CONH et conférant une résistance accrue aux peptidases, telles que CHOH-CH2, NHCO, CH2-O, CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S. De préférence, le peptide selon l'invention présente une amidation de son extrémité C-terminale.
Le peptide selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs acides aminés qui sont des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N- éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique ; ou des acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine.
L'invention couvre également les dérivés fonctionnels d'un peptide selon l'invention tel que décrit ci-dessus. Le terme « dérivé fonctionnel » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à des peptides ayant substantiellement la même séquence d'acides aminés, substantiellement la même structure hélicoïdale et substantiellement la même activité antimicrobienne. Ces dérivés fonctionnels peuvent être, par exemple, des rétro peptides, des rétro-inverso peptides, des peptides présentant des substitutions conservatives et les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité antimicrobienne du peptide de l'invention. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). A titre d'exemple, l'isoleucine, la leucine, l'alanine, la valine, la phénylalanine, la proline et la glycine peuvent être substitués mutuellement de façon conservative, de même que la lysine, l'histidine et l'arginine ou la serine, la tyrosine et la thréonine ou la cystéine et la méthionine ou l'asparagine, la glutamine et le tryptophane ou l'acide aspartique et l'acide glutamique. Le terme de « dérivé fonctionnel » se réfère également à un peptide selon l'invention dont la séquence est raccourcie de 1, 2, 3 ou 4 acides aminés en son extrémité C-terminale et/ou N-terminale.
L'invention couvre également les sels pharmaceutiquement acceptables d'un peptide selon l'invention. Les sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ; les sels avec des acides organiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales pharmaceutiquement acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifîable, couramment utilisés dans la technique pharmaceutique. Les méthodes de préparation de ces sels sont bien connues de l'homme du métier.
Le peptide selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide) ou par synthèse enzymatique (Kullman et al., 1987). Il peut également être obtenu par la méthode consistant à cultiver une cellule hôte, telle que décrite ci-après, comprenant un transgène codant pour le peptide et exprimant ledit peptide, et à extraire ledit peptide à partir de ces cellules hôtes ou du milieu de culture dans lequel le peptide a été sécrété. Le peptide selon l'invention est doté d'une activité antimicrobienne.
Avantageusement, cette activité est supérieure à celle de la temporine-SHa vis-à-vis d'au moins une souche bactérienne, virale, fongique ou parasitaire. Selon un mode de réalisation, le peptide selon l'invention a une activité antimicrobienne supérieure à la temporine-SHa vis-à-vis des bactéries et plus particulièrement vis-à-vis des bactéries Gram-négatif telles qu'Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CMI vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa inférieure à 10 μM. Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention a une activité antimicrobienne supérieure à la temporine-SHa vis-à-vis des parasites, notamment vis-à-vis des parasites Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania panamensis, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis et/ou Leishmania peruviana, plus particulièrement vis-à-vis des parasites Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica et/ou Leishmania braziliensis, et de manière tout particulièrement préférée vis-à-vis du parasite Leishmania infantum. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CI50 inférieure à 15 μM vis-à-vis de la forme promastigote du parasite Leishmania infantum. Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention a une activité hémolytique inférieure à celle de la temporine-SHa. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CL50 vis-à-vis des érythrocytes supérieure à 30 μM.
La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention.
Au sens de l'invention, on entend par « acide nucléique » toute molécule à base d'ADN ou d'ARN. Il peut s'agir de molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs, modifiées chimiquement, comprenant des bases non-naturelles ou des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié.
L'acide nucléique selon l'invention peut être sous la forme d'ADN et/ou d'ARN, simple brin ou double brin. Selon un mode de réalisation préférée, l'acide nucléique est une molécule d'ADN isolée, synthétisée par des techniques recombinantes bien connues de l'homme du métier.
L'acide nucléique selon l'invention peut être déduit de la séquence du peptide selon l'invention et l'usage des codons peut être adapté selon la cellule hôte dans laquelle l'acide nucléique doit être transcrit. Ces étapes peuvent être réalisées selon des méthodes bien connues de l'homme du métier et dont certaines sont décrites dans le manuel de référence Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001).
La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention lié de manière opérationnelle aux séquences nécessaires à son expression. Notamment, l'acide nucléique peut être sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans une cellule hôte. De manière générale, une cassette d'expression est constituée de ou comprend un promoteur permettant d'initier la transcription, un acide nucléique selon l'invention, et un terminateur de transcription. Le terme « cassette d'expression » désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de manière opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante (le gène d'intérêt) et/ou le ciblage du peptide codé soient sous contrôle du promoteur transcriptionnel et/ou du peptide de transit. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec le contrôle de l'expression. De même, la séquence du peptide de transit est généralement fusionnée en amont de la séquence du gène d'intérêt, et en phase avec celui-ci, et en aval de tout promoteur. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les éléments régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression et/ou le ciblage. Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d'expression comprend au moins une séquence activatrice « enhancer » liée de manière opérationnelle au promoteur.
La présente invention concerne en outre un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon l'invention. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l'expression de l'acide nucléique selon l'invention dans ladite cellule. Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double- brin. Il est avantageusement choisi parmi un plasmide, un phage, un phagemide, un virus, un cosmide et un chromosome artificiel.
Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs permettant l'expression de l'acide nucléique selon l'invention. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle l'expression est souhaitée, sont bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans la cellule hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome de la cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Lorsque la cellule hôte à transformer est une cellule végétale, le vecteur d'expression est de préférence un vecteur de plante. Des exemples de vecteurs de plantes sont décrits dans la littérature, parmi lesquels on peut citer notamment les plasmides T-DNA de A. tumefaciens pBIN19 (Bevan, 1984), pPZPlOO (Hajdukewicz et al., 1994), la série pCAMBIA (R. Jefferson, CAMBIA, Australie). Les vecteurs de l'invention peuvent comprendre, en outre, une origine de réplication et/ou un gène de sélection et/ou une séquence de recombinaison végétale.
Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur d'expression selon l'invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et l'acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique.
La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte est un microorganisme, de préférence une bactérie ou une levure. Selon un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule animale, par exemple une cellule de mammifère telle que les cellules COS ou CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire.
Selon encore un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule végétale. Le terme « cellule végétale » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, et des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plante, des plantes ou des semences.
La présente invention concerne également une méthode de production d'un peptide antimicrobien selon l'invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du peptide produit par ladite cellule. Les méthodes de production de peptides recombinants sont bien connues de l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans WO 01/70968 pour une production dans une lignée cellulaire immortalisée humaine, WO 2005/123928 pour une production dans une plante et US 2005-229261 pour une production dans le lait d'un animal transgénique. La présente invention concerne également une méthode de production d'un peptide antimicrobien selon l'invention comprenant l'insertion d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur d'expression selon l'invention dans un système d'expression in vitro également appelé acellulaire et la récolte du peptide produit par ledit système. De nombreux systèmes d'expression in vitro ou acellulaires sont disponibles dans le commerce et l'utilisation de ces systèmes est bien connue de l'homme du métier.
La présente invention concerne en outre un peptide selon l'invention en tant que médicament, en particulier en tant que médicament destiné au traitement d'une infection microbienne, à savoir une infection par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite. Elle concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention en tant que médicament. Le médicament peut être destiné à un usage pharmaceutique ou vétérinaire.
Selon un mode de réalisation particulier, l'infection est une infection par un parasite, de préférence du genre Leishmania. L'infection par un parasite peut être une leishmaniose cutanée, une leishmaniose muco-cutanée ou une leishmaniose viscérale. Le parasite peut être choisi parmi le groupe constitué de Leishmania aethiopica, Leishmania amazonensis, Leishmania arabica, Leishmania aristedes, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania colombiensis, Leishmania deanei, Leishmania donovani, Leishmania enriettii, Leishmania equatorensis, Leishmania forattinii, Leishmania garnhami, Leishmania gerbili, Leishmania guyanensis, Leishmania herreri, Leishmania hertigi, Leishmania lainsoni, Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania naiffi, Leishmania panamensis, Leishmania peruviana, Leishmania pifanoi, Leishmania shawi, Leishmania turanica, Leishmania tropica et Leishmania venezuelensis. De préférence, le parasite est choisi parmi le groupe constitué de Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis, Leishmania panamensis et Leishmania peruviana. De manière particulièrement préférée, le parasite est choisi parmi le groupe constitué de Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica et Leishmania braziliensis. De manière tout particulièrement préférée, l'infection est une infection par le parasite Leishmania infantum.
L'infection peut également être une infection par un parasite du genre
Trypanosoma. Le parasite peut être choisi parmi le groupe constitué de Trypanosoma avium, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma congolense,
Trypanosoma equinum, Trypanosoma equiperdum, Trypanosoma evansi, Trypanosoma lewisi, Trypanosoma melophagium, Trypanosoma percae, Trypanosoma rangeli,
Trypanosoma rotatorium, Trypanosoma simiae, Trypanosoma suis, Trypanosoma theileri, Trypanosoma triglae et Trypanosoma vivax. De préférence, le parasite est choisi parmi le groupe constitué de Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi et
Trypanosoma congolense.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention en tant qu'agent antimicrobien. La présente invention concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention en tant qu'agent antimicrobien.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention en tant qu'agent stimulateur du système immunitaire, notamment lors d'une infection microbienne. La présente invention concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention en tant qu'agent stimulateur du système immunitaire. Selon un mode particulier de l'invention, le peptide selon l'invention possède des propriétés chimiotactiques. Le peptide induit le recrutement de cellules immunitaires sur le lieu de l'infection et augmente l'efficacité de la réponse immunitaire aux infections.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide selon l'invention et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique, cassette ou vecteur selon l'invention et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Les excipients et supports pharmaceutiquement acceptables susceptibles d'être utilisés dans la composition selon la présente invention sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th édition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of
Pharmaceutical Excipients, 3rd édition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press[2000]) et comprennent notamment les solutions physiologiques salées et les tampons phosphates.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être appropriée pour une administration orale, sublinguale, cutanée, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire ou intra- auriculaire. De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention est appropriée pour une administration cutanée, orale, intramusculaire, intraveineuse, transdermique ou sous-cutanée. Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention est appropriée pour une administration topique. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme de comprimés, capsules, gélules, granulats, suspensions, émulsions, solutions, gels, pâtes, onguents, crèmes, emplâtres, potions, suppositoires, lavements, injectables, implants, patches, sprays ou aérosols. Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend de 1 à
2000 mg de peptide selon l'invention. De préférence, la composition selon l'invention comprend de 50 à 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000 ou 1500 mg de peptide selon l'invention.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre des substances actives additionnelles, telles que d'autres agents antimicrobiens, notamment des peptides antimicrobiens ou des antibiotiques. La composition peut également comprendre en outre des substances susceptibles de potentialiser l'activité du peptide selon l'invention.
La présente invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une infection microbienne. La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une infection microbienne. La présente invention concerne un peptide selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une infection microbienne. La présente invention concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une infection microbienne. Le traitement peut être curatif ou préventif.
Le sujet à traiter est un animal, de préférence un mammifère. Selon un mode de réalisation particulier, le sujet à traiter est un humain.
La présente invention concerne également une méthode de traitement d'une infection microbienne comprenant l'administration d'une dose thérapeutiquement efficace d'un peptide, d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur selon l'invention.
Le terme « dose thérapeutiquement efficace » tel qu'utilisé ici se réfère à la quantité de peptide, d'acide nucléique, de cassette ou de vecteur selon l'invention nécessaire pour observer une activité antimicrobienne sur la bactérie, le virus, le champignon ou le parasite responsable de l'infection. La quantité de peptide, d'acide nucléique, de cassette ou de vecteur selon l'invention à administrer ainsi que la durée du traitement sont évalués par l'homme du métier selon l'état physiologique du sujet à traiter, l'agent pathogène et l'activité antimicrobienne du peptide vis-à-vis dudit agent pathogène.
Dans un mode de réalisation particulier, l'infection microbienne à traiter est une leishmaniose.
Une dose efficace de peptide selon la présente invention peut comprendre, sans y être limitée, entre environ 1 et 40 mg/kg de poids corporel. La fréquence d'administration peut être par exemple toutes les 4 à 24 heures, de préférence toutes les
8 à 12 heures. La durée du traitement peut être par exemple de 1 à 30 jours, de préférence de 10 à 20 jours, et de manière tout particulièrement préférée de 5 à 10 jours.
La présente invention concerne également l'utilisation du peptide selon l'invention en tant que conservateur, désinfectant ou pesticide.
Les produits alimentaires peuvent être traités par un peptide selon l'invention afin d'éliminer ou de prévenir le risque d'infection par des micro -organismes et ainsi améliorer leur conservation. Le peptide est utilisé dans ce cas comme conservateur. Le peptide selon l'invention peut être utilisé en tant que pesticide. Le peptide est alors utilisé afin de prévenir ou de traiter les infections des plantes par des phytopathogènes. Le peptide selon l'invention peut également être utilisé en tant que désinfectant. Le terme « désinfectant » se réfère à une activité antimicrobienne du peptide sur une surface (par exemple, murs, portes, matériel médical), un liquide (par exemple, de l'eau) ou un gaz (par exemple, un gaz anesthésiant). Les biofîlms sont responsables de près de 60% des infections nososomiales. Ils sont essentiellement dus à la colonisation microbienne de bio matériaux implantés. L'éradication d'un biofilm bactérien est un problème clinique majeur étant donné que l'antibio thérapie habituellement active sur les bactéries à l'état planctonique, se révèle souvent bien moins efficace sur des structures organisées en biofilm. L'effet des peptides antimicrobiens sur ce type de bio film a été démontré dans de précédentes études réalisées sur la temporine-A (Cirioni et al., 2003).
Selon un mode de réalisation, le peptide selon l'invention est utilisé pour l'élimination de biofîlms bactériens. Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention est notamment utilisé pour la désinfection du matériel chirurgical ou prothétique.
La présente invention concerne également un appareillage médical ou implant comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou incluant un peptide selon l'invention. Notamment, la surface peut être couverte d'un peptide à une densité de 0,4 à 300 mg/cm2. Le peptide peut être combiné à une autre molécule active, de préférence un antibiotique. L'implant peut être un implant vasculaire.
La présente invention concerne également une méthode de préparation d'un appareil médical ou implant comprenant l'application d'une couche de peptide selon l'invention, ou la mise en contact avec celui-ci, sur au moins une surface de l'appareil ou implant. Ce type d'appareil médical ou implant ainsi que ses utilisations et méthodes de préparation sont par exemple décrite dans la demande de brevet WO 2005/006938.
La présente invention concerne une composition alimentaire comprenant au moins un peptide selon l'invention.
La présente invention concerne également une composition agrochimique comprenant au moins un peptide selon l'invention. La présente invention concerne une plante transgénique comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention, et susceptible d'exprimer ou exprimant un peptide selon l'invention.
L'introduction des acides nucléiques, des cassettes ou des vecteurs d'expression de l'invention dans une cellule ou un tissu végétal, y compris une graine ou plante, peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Les techniques de transgenèse végétale sont bien connues dans le domaine, et comprennent par exemple l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens (Hooykaa and Schilperoort, 1992), l'électroporation, le transfert conjugatif, des techniques biolistiques (Russel et al., 1992) ou la micro injection dans des embryons ou protoplastes végétaux. D'autres techniques de transgenèse végétale sont bien connues, ou d'autres protocoles mettant en œuvre les techniques ci-dessus sont décrits dans l'art antérieur (Siemens and Schieder, 1996) et peuvent être appliqués à la présente invention. La plante transgénique selon l'invention peut notamment être obtenue selon la méthode décrite dans la demande de brevet WO 00/055337.
La plante transgénique peut appartenir à toute espèce végétale. Elle peut être monocotylédone ou dicotylédone. Plus particulièrement, la plante transgénique de l'invention est une plante de culture destinée ou non à l'alimentation animale ou humaine ou sur laquelle les phlébotomes, les insectes vecteurs des leishmanies, viennent se nourrir tels que le maïs, le blé, le colza, le soja, la luzerne, le lin, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, le tournesol, la tomate, le chou, la carotte, la pomme de terre, ou des arbres fruitiers tels que le citronnier, le pommier, l'abricotier, le pêcher ou le noisetier, ou les plantes identifiées, à ce jour, comme sources de repas sucré pour les phlébotomes tels Ricinus communis, Capparis spinosa, Solanum jasminoides, Solanum luteum ou Bougainvillea glabra.
Selon un mode de réalisation, l'expression du peptide selon l'invention permet à la plante transgénique de présenter une résistance accrue aux pathogènes, et plus particulièrement aux phytopathogènes. L'utilisation d'une telle plante transgénique permet de réduire de manière considérable la pulvérisation ou l'application de pesticides sur les cultures, et ainsi de limiter les effets néfastes de ces produits sur 1 ' environnement.
Selon un autre mode de réalisation, la plante transgénique exprime un peptide selon l'invention qui est administré à un animal y compris les phlébotomes ou un humain par ingestion de ladite plante ou de ses sucs. Dans ce cas, le peptide n'a pas nécessairement un effet sur les phytopathogènes mais présente une activité antimicrobienne vis-à-vis d'un ou plusieurs pathogènes de l'animal y compris les leishmanies présentes dans le tractus digestif des phlébotomes vecteurs des leishmanioses humaines et animales ou l'humain auquel il est administré. Les plantes transgéniques sur lesquelles les phlébotomes prennent leur repas sucré, délivrent directement dans le tractus digestif de l'insecte vecteur, un peptide antimicrobien de l'invention qui tue directement le parasite éventuellement présent chez l'insecte vecteur ou en bloquant son développement en tuant les bactéries de la flore intestinale de l'insecte vecteur, nécessaires à la différenciation et à la multiplication parasitaire. Les plantes transgéniques constituent de fait un moyen efficace de contrôle indirect de la transmission des leishmanioses.
La présente invention concerne un anticorps spécifique du peptide selon l'invention. Le terme « anticorps » tel qu'utilisé dans la présente invention se réfère notamment à des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des fragments de ceux-ci (par exemple les fragments F (ab) '2, F (ab)), des anticorps simple-chaîne ou minibody ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le peptide selon l'invention, notamment les CDR (régions déterminant la complémentarité). On peut citer par exemple les anticorps chimériques, humanisés ou humains. Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Les différentes techniques de préparation des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour détecter un peptide selon l'invention. Elle concerne également l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour effectuer des mesures quantitatives d'un peptide selon l'invention, notamment par des dosages immunologiques. Ces mesures peuvent notamment permettre d'évaluer l'expression du peptide selon l'invention dans une cellule hôte ou une plante transgénique selon l'invention. Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES
Matériel et méthodes
Synthèse peptidique en phase solide
La synthèse peptidique en phase solide a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur de peptides automatique (Applied Biosystems 433A) selon le protocole décrit dans
Vanhoye et al. (Vanhoye et al, 2004), et en utilisant des acides aminés protégés par
Fmoc (Novabiochem, Suisse) et une résine Rink amide MBHA (Senn Chemicals,
Suisse).
La purification des peptides synthétisés a été réalisée par RP-HPLC sur une colonne semipréparative Cl 8 (Waters RCM compact preparative cartridge module, 300
Â, 25 x 100 mm), en utilisant un gradient 0-60% acétonitrile (1%/min) à un débit de 8 ml/min. L'homogénéité et l'identité des peptides synthétiques ont été évaluées par RP-
HPLC analytique (colonne Symmetry C 18, 5 μm, 4,6 x 250 mm, Waters - débit : 0,75 ml/min) et spectrométrie de masse MALDI-TOF (Voyager DE-PRO, Applied Biosystems).
Tests d'activité antibactérienne
Les souches suivantes ont été utilisées pour les tests antibactériens : Escherichia coli (ATCC 25922 et ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Bacillus megaterium et Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
Pour chaque souche, un inoculum standard de 105 à 106 bactéries/mL (phase exponentielle de croissance) a été préparé. Pour cela, une colonie isolée sur une gélose LB préalablement ensemencée par une des souches, a été mise en culture dans 10 mL de milieu LB. Les cultures en milieu liquide ont ensuite été incubées pendant 2 à 3 h sous agitation à 37°C pour que les bactéries soient en phase exponentielle de croissance. Chaque suspension bactérienne a été diluée dans du milieu LB de manière à obtenir une DO à 630 nm de 0,01 qui correspond à une concentration de 105-106 cfu/mL (cfu : unité formant une colonie). La concentration minimale inhibitrice (CMI) de chaque peptide a été déterminée par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. La CMI est définie comme étant la plus faible concentration de peptide capable d'inhiber la croissance de la souche bactérienne testée, après une incubation de 18 h à 37°C. Le test a été effectué dans une plaque de microtitration stérile contenant 96 puits. Une gamme de concentrations croissantes de chaque peptide (l à 400 μM) a été préalablement préparée dans de l'eau milliQ stérile contenant 5% de diméthyl sulfoxide (DMSO). Le DMSO facilite la solubilisation des peptides et ne présente aucune activité antimicrobienne à la concentration utilisée. Dans chaque puits, 50 μL de peptide ont été incubés avec 50 μL de suspension bactérienne (105-106 cfu/mL). La microplaque a ensuite été incubée à 37°C pendant 18 h, sous agitation. La croissance bactérienne a été déterminée par mesure de la DO à 630 nm (turbidité) à l'aide d'un lecteur de plaques. Les tests ont été réalisés en triplets pour chaque concentration de peptide.
Le témoin négatif d'inhibition de croissance a été obtenu en remplaçant la solution contenant le peptide par 50 μL d'eau milliQ stérile contenant 5% de DMSO. Le témoin positif permettant d'inhiber totalement la croissance des souches bactériennes a été obtenu en remplaçant la solution contenant le peptide par 50 μL de formaldéhyde à 0,7%.
Tests d'activité antifongique
Les trois souches de levures suivantes ont été utilisées : Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans (ATCC 90028), Candida parapsilosis (ATCC 22019). Ces souches ont été préalablement cultivées sur gélose YPD pendant 48 h minimum. Des suspensions de levures ont ensuite été préparées, exactement comme pour les bactéries, et ajustées à 105-106 cfu/mL dans du milieu YPD liquide. Le test antifongique correspond au test d'inhibition de croissance en milieu liquide utilisé pour les bactéries (cf ci-dessus) dans lequel le milieu LB a été remplacé par un milieu de culture YPD. Les souches fongiques ont été incubées à 300C.
Tests hémolvtiques
L'activité hémolytique des peptides antimicrobiens a été mise en évidence en utilisant des globules rouges humains de donneurs sains. L'hémolyse des globules rouges se traduit par la libération d'hémoglobine dans le milieu réactionnel dont la concentration est déterminée par spectrophotométrie à 450 nm.
Les globules rouges ont été séparés du plasma et des globules blancs par centrifugation du sang humain (900 g, 10 min). Le culot contenant les globules rouges a été lavé 3 fois avec du tampon PBS, pH 7,4. Après comptage à l'aide d'une cellule de
Malassez, une solution mère de 2.107 hématies/mL a été préparée dans le même tampon, ainsi qu'une gamme de concentrations des peptides à tester (1 à 200 μM).
Le test a été effectué de la manière suivante : 100 μL des différentes concentrations de peptide ont été ajoutés à 100 μL de la suspension de globules rouges. Après 1 h d'incubation à 37°C, puis centrifugation (12 000g, 15 sec), l'absorbance du surnageant a été mesurée à 450 nm. Le témoin négatif pour ce test (0% d'hémolyse) contenait 100 μL de tampon PBS à la place de la solution contenant le peptide et le témoin positif (100% d'hémolyse) contenait 100 μL de Triton 0,1% à la place de la même solution. La valeur LC50 obtenue résulte de la moyenne de trois expériences réalisées en triplets et correspond à la concentration de peptide induisant 50% d'hémolyse.
Tests d'activité anti-Leishmania
L'activité antiparasitaire des peptides a été évaluée sur les deux formes du parasite Leishmania infantum, la forme promastigote et la forme amastigote. Les tests d'activité anti-Leishmania ont été réalisés avec une lignée αNEO-αLUC de Leishmania infantum. Cette lignée a été obtenue en transformant la souche MHOM/MA/67/ITMAP-263 de Leishmania infantum avec le vecteur pGM αNEO- αLUC contenant le gène rapporteur de la luciférase (LUC) et le gène de résistance à la néomycine (NEO) tel que décrit dans Roy et al. (2000). Elle est maintenue en culture sous ses deux formes, promastigotes et amastigotes.
Culture des parasites :
Les promastigotes de Leishmania infantum ont été maintenus à 26°C par un à deux passages hebdomadaires selon le nombre de parasites dans l'inoculum, dans du milieu SDM 79, supplémenté avec 10% à 20% de sérum de veau fœtal décomplémenté et de 5 mg/mL d'hêmine de porc et en présence de 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (Brun & Shonenberger, 1979). À partir d'un inoculum de 105 cellules/mL en phase de croissance logarithmique, les promastigotes ont atteint une densité cellulaire de 2 à 3χ108 parasites/mL en phase stationnaire, après 7 jours de culture dans des flacons de culture de 25 cm2. Les densités cellulaires ont été déterminées par comptage en cytométrie de flux, en présence d'iodure de propidium sur un compteur Facscan (Excalibur, Becton-Dickinson, Ivry, France).
Les amastigotes axéniques ont été obtenus par différenciation des promastigotes à 37°C ± 0,PC (saturation en H2O, 5% CO2), en culture dans le milieu MAA, supplémenté avec 20% de sérum de veau fœtal décomplémenté et de 12,5 mg/mL d'hêmine de porc, en présence de 100 LVmL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (Sereno et Lemesre, 1997). À partir d'un inoculum de 5χ105 cellules/mL en phase de croissance logarithmique, les amastigotes ont atteint une densité cellulaire de 2 à 3χ108 parasites/mL en phase stationnaire, après 7 jours de culture dans des flacons de culture de 25 cm2. L'observation microscopique des amastigotes axéniques montre des formes homogènes (rondes à ovoïdes) sans flagelle apparent et immobiles. Les amastigotes axéniques des diverses espèces de Leishmania présentent les mêmes propriétés ultrastructurales, biologiques, biochimiques et immuno logiques que les amastigotes intracellulaires. Les densités cellulaires ont aussi été déterminées par comptage en cytométrie de flux selon la même procédure et les mêmes paramètres utilisés pour les promastigotes.
Tests d'activité anti-Leishmania sur les amastigotes axéniques :
Une suspension d' amastigotes axéniques de la lignée de Leishmania infantum transfectée par la cassette αNEO-αLUC en phase exponentielle de croissance et avec un pourcentage de viabilité supérieur à 90%, a été ajustée à une densité de 1,25x106 parasites/mL dans du milieu MAA/20. Des solutions de peptides antimicrobiens cinq fois concentrées ont également été préparées dans ce milieu (300 à 4,7 μM).
Pour le test, la suspension d' amastigotes axéniques est répartie dans une microplaque de culture sous un volume de 80 μL par puits (soit 105 parasites/puits) dans lesquels sont ajoutés 20 μL de chaque solution de peptide (60 à 0,94 μM final) (soit une densité parasitaire finale de 106 parasites/mL). La plaque est ensuite incubée à 37° C pendant 72 h. Pour le contrôle négatif, la solution de peptide a été remplacée par 20 μL de milieu MAA/20. Le contrôle positif a été réalisé avec 20 μL de la solution contenant la plus forte concentration de peptide. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide. Après 72 heures, 50 μL de tampon de lyse (Steady GLO, Promega) ont été ajoutés dans chaque puits. Après incubation durant 5 min à température ambiante, la lyse cellulaire a été vérifiée au microscope. La luminescence émise a été mesurée par un lecteur de luminescence (Victor,
PerkinElmer). Elle est proportionnelle au nombre de parasites vivants dans le milieu. Le pourcentage de croissance a été calculé selon la formule suivante : % croissance = [(L moy - bdf)Peptide x 100] / (L moy - bdf)contrôie avec L moy : Luminescence moyenne et bdf : bruit de fond. La concentration inhibant de 50% la croissance des amastigotes (CI50) a été déterminée.
Tests d'activité anti-Leishmania sur les promastigotes :
Comme pour les tests sur amastigotes, 80 μL de suspension de promastigotes (105 parasites/puits) ont été mélangés à 20 μL de solution de peptide (60 à 0,94 μM final) dans chaque puits d'une plaque de microtitration. Les contrôles négatifs et positifs ont été réalisés selon le même protocole que pour les tests d'activité anti-Leishmania sur les amastigotes. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide. Après 72 heures d'incubation à 26°C, 50 μL par puits de tampon de lyse Steady
GIo (Promega) ont été ajoutés et, après incubation durant 5 min à température ambiante, la lyse cellulaire a été vérifiée au microscope. La luminescence émise a été mesurée et le pourcentage de croissance a été calculé selon la méthode décrite ci-dessus. La concentration inhibant de 50% la croissance des promastigotes (CI50) a été déterminée.
Tests de cytotoxicité sur les monocytes :
L'activité cytotoxique des peptides antimicrobiens a été déterminée vis-à-vis d'une lignée de monocytes humains THP-I. Les cellules ont été maintenues en culture dans du milieu RPMI (10% SVF, 100 LVmL pénicilline, 100 μg/mL streptomycine) jusqu'à obtenir une phase exponentielle de croissance. Après comptage sur cellule de Thoma, la densité cellulaire a été ajustée à 6,25x105 cellules/mL dans du milieu RPMI 1640. Des solutions peptidiques 5 fois concentrées ont été préparées dans du milieu RPMI (300 à 4,7 μM). Les monocytes sont répartis sous un volume de 80 μL de suspension cellulaire par puits (soit 5xlO4 monocytes/puits ou 5xlO5 cellules/mL final) et mélangés à 20 μL de solution de peptide (60 à 0,94 μM final). Les contrôles négatifs et positifs ont été réalisés selon le même protocole que pour les tests d'activité anti-Leishmania. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide. Les cellules sont incubées à 37°C, sous 5% de CO2, pendant 72h.
Après 72 heures, le nombre de cellules THP-I viables a été indirectement évalué par le test MTT (Mosmann, 1983). Le MTT (ou 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényl-tétrazolium bromide), de couleur jaune, est réduit en bleu formazan sous l'action de la succinate-tétrazolium réductase qui est présente dans la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules métaboliquement actives. Ce bleu formazan est détectable par spectrophotométrie (570 nm).
Une solution de MTT dissous dans le tampon PBS (pH 7,4) à la concentration de 10 mg/mL, filtrée sur 0,45 μm, est ainsi répartie à raison de 10 μL par puits. Les plaques sont ensuite incubées pendant 4 h à 37°C. La réaction enzymatique est stoppée par l'addition de 100 μL d'un mélange isopropanol 50% / SDS 10% et les microplaques sont ensuite incubées à température ambiante durant 30 min, sous agitation. La DO à 570 nm de chaque puits a ensuite été mesurée (lecteur Victor, PerkinElmer) afin de déterminer la CI50.
Résultats
Activités antibactérienne, antifongique et hémolvtique de la temporine-SHa et de l'analogue [K3 Jtemporine-SHa
L'activité antimicrobienne de la temporine-SHa (SEQ ID No.1) et de l'analogue [K Jtemporine-SHa (SEQ ID No.19) a été évaluée sur différentes souches bactériennes de référence Gram-positif et Gram-négatif, ainsi que sur des souches fongiques.
L'activité hémolytique de ces deux peptides a également été évaluée. Les valeurs des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations létales 50 (CL50) sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Activités antimicrobiennes et hémolytiques de la temporine-SHa et de l'analogue [K3]temporine-SHa
Figure imgf000028_0001
Ces résultats démontrent que l'activité antimicrobienne de l'analogue [K3]temporine-SHa est remarquablement plus importante que celle de la temporine- SHa, notamment à l' encontre des souches Gram-négatif (CMI de 3 μM pour toutes les souches testées) et des levures.
A noter que l'activité antibactérienne de l'analogue [K ]temporine-SHa est 10 fois plus importante à l' encontre de Pseudomonas aeruginosa que celle de la temporine- SHa. Ce résultat est particulièrement intéressant étant donné que cette souche est résistante à la plupart des temporines.
De plus, l'augmentation du pouvoir antimicrobien de l'analogue [K3]temporine- SHa s'accompagne d'une diminution d'un facteur 2 de l'activité hémolytique par rapport à celle de la temporine-SHa. Activité anti-Leishmania de la temporine-SHa et de l'analogue [K Jtemporine-SHa
L'activité anti-Leishmania des deux temporines a été évaluée sur le parasite Leishmania infantum, agent responsable essentiellement de la leishmaniose viscérale humaine dans le pourtour du bassin méditerranéen et en Amérique latine. Des cultures des formes promastigotes et amastigotes axéniques de Leishmania infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-236) exprimant le gène de la luciférase ont été utilisées. L'évaluation de l'activité métabolique des parasites est basée sur l'oxydation de la luciférine par la luciférase en présence d'ATP. Ce processus aboutit à l'émission de photons qui est proportionnelle à la concentration des parasites non Iy ses. Les résultats de ces tests anti-Leishmania ont démontré que la temporine-SHa et l'analogue [K Jtemporine-SHa sont actifs contre les deux formes du parasite Leishmania infantum (Figure 2 A et B). Cependant, l'analogue [K3]temporine-SHa présente une meilleure activité antiparasitaire vis-à-vis des promastigotes par rapport à la temporine-SHa. L'analogue [K3]temporine-SHa agit sur la forme promastigote du parasite avec une CI50 de l'ordre de 10 μM, alors que la temporine-SHa a une CI50 de l'ordre de 20 μM (figure 2 B).
Les effets cytotoxiques de la temporine-SHa et de l'analogue [K Jtemporine-SHa ont été évalués sur la lignée de monocytes humains THP-I. Les monocytes représentent la forme non différenciée des macrophages qui sont les cellules hôtes des parasites
Leishmania. Les résultats obtenus (Figure 3) démontrent que la temporine-SHa et l'analogue [K3]temporine-SHa ne sont pas cytotoxiques aux doses antimicrobiennes.
Conclusion
La substitution de la serine sur la face polaire de l'hélice α de la temporine-SHa par une lysine a permis de générer un analogue [K3]temporine-SHa présentant une activité antimicrobienne plus importante que celle de la temporine-SHa, notamment à l'encontre des souches Gram-négatif et des levures. Cet analogue présente en outre une meilleure activité antiparasitaire vis-à-vis du parasite Leishmania infantum, notamment vis-à-vis des promastigotes. De plus, il a été démontré que cette augmentation du pouvoir antimicrobien s'accompagne d'une diminution d'un facteur 2 de l'activité hémolytique et que cet analogue n'était pas cytotoxique vis-à-vis des monocytes, cellules cibles du parasite de l'hôte vertébré, aux doses antimicrobiennes.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide d'une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la séquence F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F, où Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où lorsque Xi est S au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et dérivés fonctionnels et sels pharmaceutiquement acceptables dudit peptide.
2. Peptide selon la revendication 1, dans lequel Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K et X2, X3 et X4 sont G.
3. Peptide selon la revendication 2, dans lequel Xi est K.
4. Acide nucléique codant pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 4.
6. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou une cassette d'expression selon la revendication 5.
7. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 4, une cassette d'expression selon la revendication 5 ou un vecteur d'expression selon la revendication
6.
8. Composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
9. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 en tant que médicament.
10. Peptide selon la revendication 9, dans lequel le médicament est destiné au traitement d'une infection par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite.
11. Peptide selon la revendication 10, dans lequel le parasite appartient au genre Leishmania.
12. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, acide nucléique selon la revendication 4, cassette d'expression selon la revendication 5 ou vecteur selon la revendication 6 pour une utilisation dans le traitement d'une infection microbienne.
13. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 en tant que désinfectant, conservateur ou pesticide.
14. Appareillage médical ou implant comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou incluant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
15. Plante transgénique comprenant un acide nucléique selon la revendication 4, une cassette d'expression selon la revendication 5 ou un vecteur d'expression selon la revendication 6 et susceptible d'exprimer ou exprimant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
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