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WO2010106285A1 - Procedes de mesure de la quantite intracellulaire de molecules d'interet intrinsequement fluorescentes par cytometrie en flux et leurs applications - Google Patents

Procedes de mesure de la quantite intracellulaire de molecules d'interet intrinsequement fluorescentes par cytometrie en flux et leurs applications Download PDF

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WO2010106285A1
WO2010106285A1 PCT/FR2010/050474 FR2010050474W WO2010106285A1 WO 2010106285 A1 WO2010106285 A1 WO 2010106285A1 FR 2010050474 W FR2010050474 W FR 2010050474W WO 2010106285 A1 WO2010106285 A1 WO 2010106285A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
molecule
interest
cells
intracellular
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2010/050474
Other languages
English (en)
Inventor
Mahchid Bamdad
Marc Berger
Céline BOURGNE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHU DE CLERMONT-FERRAND
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Clermont Auvergne
Original Assignee
CHU DE CLERMONT-FERRAND
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Clermont Auvergne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHU DE CLERMONT-FERRAND, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Clermont Auvergne filed Critical CHU DE CLERMONT-FERRAND
Publication of WO2010106285A1 publication Critical patent/WO2010106285A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
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    • G01N15/1012—Calibrating particle analysers; References therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the invention relates to methods for measuring the intracellular quantity of intrinsically fluorescent molecules of interest by flow cytometry and their applications.
  • Intracellular quantification of molecules of interest in living cells is a major issue. Indeed, in all fields of science, the ability to measure the exact amount of a molecule directly in a living cell, leads to many applications, particularly in the field of medicine, since such a measurement closely reflects the actual in vivo / in situ state of the cell, no deterioration of the biological material having been made.
  • the inventors thus had the merit of inventing a method for measuring the intracellular quantity of intrinsically fluorescent molecules of interest in the cells of a sample using a flow cytometer. Indeed, while flow cytometry previously only allowed the detection of fluorescent molecules (see in particular US 2009/004213, WO 2007/010014, WO2007 / 022588, EP0617287, and Ferrandiz et al., DNA repair, vol. 8, no.3, p.390-399), the inventors have developed a technique for quantifying fluorescent molecules, and this directly in living cells, without denaturation or pretreatment.
  • the invention relates firstly to a method for measuring the intracellular quantity of a molecule of intrinsically fluorescent interest by flow cytometry using a correlation line between the fluorescence intensity. and the intracellular concentration of said molecule of interest. Secondly, the invention relates to a method for establishing said correlation curve between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of the molecule of interest.
  • a first subject of the invention therefore relates to a method for measuring the intracellular quantity of a molecule of intrinsically fluorescent interest in cells, comprising the steps of: measuring the fluorescence of the cells whose intracellular quantity is to be known in said molecule of interest using a flow cytometer parameterized with the emission and absorption spectra of said molecule of interest, this fluorescence value being plotted on a correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of said molecule of interest, and read the intracellular quantity of the molecule of interest.
  • a second subject of the invention relates to a method for establishing a correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration for a molecule of intrinsically fluorescent interest, comprising the following steps:
  • step (2) parameterize a flow cytometer with the emission and absorption spectra obtained in step (1) so as to be able to specifically detect said molecule of interest
  • step (3) establishing a correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of said molecule of interest in a cellular model.
  • step (3) comprises the following sub-steps:
  • step (2) (a) measuring the natural fluorescence of said cell model using a parameterized cytometer as described in step (2),
  • step (2) measuring the fluorescence intensity of the cells of the cellular model for each concentration of said molecule of interest using a cytometer parameterized as described in step (2), subtracting at this fluorescence intensity the fluorescence intensity related to the natural fluorescence of said cellular model as measured in (a), the residual fluorescence intensity then being proportional to the quantity of said molecule of interest having actually penetrated into the cell,
  • a particular embodiment of the invention relates to a method for measuring the intracellular quantity of a molecule of inherently fluorescent interest in cells, comprising the following steps:
  • step (1) determine the fluorescence emission and absorption spectra of said molecule of interest, (2) parameterize a flow cytometer with the emission and absorption spectra obtained in step (1) so as to to be able to specifically detect said molecule of interest,
  • step (B) measuring the fluorescence of the cells whose intracellular quantity is desired to be known to said molecule of interest by means of a flow cytometer parameterized as described in step (2), to report this fluorescence value in a straight line correlation obtained as described in step (A), and read the intracellular quantity molecule of interest, the steps (A) and (B) being capable of being implemented by different operators and / or separately in the weather.
  • step (A) (3) comprises the following substeps:
  • step (2) (a) measuring the natural fluorescence of said cell model using a parameterized cytometer as described in step (2), (b) contacting the cell model with different concentrations of said molecule of interest,
  • step (2) measuring the fluorescence intensity associated with each concentration of said molecule of interest using a parameterized cytometer as described in step (2), subtracting the fluorescence intensity at this gross fluorescence intensity; related to the natural fluorescence of said cell model as measured in (a), the residual fluorescence intensity then being proportional to the amount of said molecule of interest having actually penetrated the cell, (e) correlating each intracellular concentration value of the molecule of interest measured in (c) at the residual fluorescence intensity measured in (d), and plot the correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of said molecule of interest.
  • a feature of the invention is that the step of establishing the correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of said molecule of interest and the step of measuring the intracellular amount of the molecule of interest are likely to be implemented separately in time and by different operators. Indeed, the step of establishing the correlation line must be established specifically for each molecule of interest, but once this correlation line is established, it can be used directly to measure the intracellular quantity of the molecule of interest. interest in any patient, in order to calculate the additional value related to the accumulation of said molecule. Thus, in practice, in most cases, the operator will implement only the step of measuring the intracellular quantity of molecule of interest by fluorescence measurement and carry on the correlation line.
  • the operator has a catalog of correlation lines established according to the method of the invention for a whole series of molecules.
  • This catalog can be in paper form, but also in digital form, especially in the form of software.
  • the software can be installed on a flow cytometer data interpretation computer station and can directly transfer the values measured by the flow cytometer to the right correlation line and thus provide the operator with the intracellular concentration value. in molecule of interest.
  • the establishment of the correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of said intrinsically fluorescent molecule of interest is a two-step process.
  • a first step performed using a cellular model incubated with different concentrations of intrinsically fluorescent molecule of interest, consists in establishing a first correlation line (Correlation Line 1 or DCl) between the intracellular fluorescence intensity. and the concentration of said molecule of interest in the culture medium of the cell model.
  • the second step consists in establishing a correlation line (Correlation Line 2 or DC2) between the fluorescence intensity induced by said molecule of interest and the quantity of said molecule in the cells.
  • the invention typically relates to a method for establishing a correlation line between the fluorescence intensity and the intracellular concentration for a molecule of inherently fluorescent interest, comprising the following steps:
  • step (B) establishing a second correlation line or DC2 between the fluorescence intensity of the cells and the corresponding concentration of said molecule in said cells.
  • this method is characterized in that step (A) comprises the following sub-steps: (1) determining the emission and fluorescence absorption spectra of said molecule of interest,
  • step (B) comprises the following sub-steps:
  • step (g) correlating the additional fluorescence intensities measured in sub-step (A) (5) and the intracellular amounts measured from the cell lysate to step (B) (f), and plot a correlation line or DC2 between the fluorescence intensity of the cells and the corresponding amount of said molecule in said cells.
  • the use of the correlation line DC2 can then be validated and the extrapolation of the quantity of said intrinsically fluorescent molecule can be specified, from the additional fluorescence values (IFA).
  • the additional fluorescence value read by the cytometer corresponds to the quantity of molecule present in the cell according to correlation line DC2; it is therefore sufficient to report the value of the IFA on the corresponding axis to read the quantity of said molecule on the other axis.
  • the postponement of the fluorescence intensity on the DC2 makes it possible to directly evaluate the quantity of said molecule of interest, without any obligation to perform the assay of the molecule by conventional method (HPLC).
  • the steps of establishing the DCl and the step of establishing the DC2 are likely to be implemented separately in time and by different operators.
  • the method for measuring the intracellular quantity of a molecule of inherently fluorescent interest as described above is characterized in that said correlation line is established according to the method for establishing a straight line of correlation between the fluorescence intensity and the intracellular concentration of said molecule of interest as defined above.
  • the methods according to the invention as described above have the major advantage of allowing a measurement of the intracellular quantity of a molecule of interest directly in a living cell, without denaturation or prior treatment. Such an advantage is considerable since the intracellular concentration measured with the process according to the invention faithfully reflects the in situ state of the cells tested. Another advantage is to be able to delimit on a simple morphological criteria a population of interest within a cell population, without prior separation.
  • Yet another advantage is to be able to achieve, at the same time as measuring the fluorescence of the cells, an immunophenotyping capable of identifying cells expressing one or more particular antigens (ex: CD34 + cells).
  • a fluorescent molecule according to the invention fluoresces in the spectral range from 190 nm to 800 nm.
  • it is sufficient to determine its emission and absorption spectrum as mentioned in step (1) of the process of the invention. If no fluorescence is detected, or if its fluorescence spectrum is outside the detection spectrum of the flow cytometer, then this molecule can not be quantified with the method of the invention.
  • this step (1) is carried out using a spectrophotometer having a spectral range of between 190 nm and 800 nm, particularly with a spectrophotometer having a spectral range of between 190 nm and 800 nm.
  • a spectrophotometer having a spectral range of between 190 nm and 800 nm.
  • the skilled person is able to choose the most appropriate device depending on the molecule studied.
  • Other non-limiting examples of spectrophotometers suitable for carrying out the process according to the invention are the single or double beam UV-visible spectrophotometers, having a spectral range of about 190 nm to about 3200 nm, particularly from 190 nm to 1100 nm. .
  • the step of the methods as described above consisting in parameterizing a flow cytometer comprises in particular standardizing the device settings. Such a standardization makes it possible to evaluate the fluorescence linked to the presence of the molecule of interest under the same conditions whatever are the cells, the moment of the experiment and the flow cytometer used.
  • the step of measuring the fluorescence of the cells of said sample whose intracellular quantity is desired to be known to said molecule of interest is carried out by preparing the cells so as to obtain a cell suspension, that is to say say individualized cells suspended in a solution.
  • This cell suspension may be carried out using any technique known to those skilled in the art, in particular by separation on ficoll (blood or medullary cells), immunoselection, trypsination (adherent cells) or tissue dilaceration (mechanical dissociation associated with If necessary, conventional immunophenotyping can be performed to study a subpopulation of interest in a given cell population. This approach requires the installation of the UV laser offset from other cytometer lasers.
  • the step of contacting the cell model with different concentrations of said molecule of interest typically comprises incubating a suspension of the cell model with different concentrations of molecule of interest, possibly during different incubation times, or to incubate a suspension of the cell model during different incubation times in the same concentration of molecule of interest, the incubation time being proportional to the intracellular concentration of the molecule of interest.
  • the number of cells incubated or cell density of the suspension expressed by example in cells / mL, suitable for this incubation can be routinely determined by those skilled in the art, this number depending on each cell model.
  • a suitable cell concentration typically makes it possible to ensure the survival of the cells in the incubation medium and to maintain a stable autofluorescence of the cells over time.
  • the cell concentration is between 50,000 cells / ml and 1.10 6 cells / ml.
  • the step comprising measuring the intracellular quantity of molecule of interest in the cells is typically carried out by following the following steps: recovering the cells, washing them then counting them, constituting a pellet cell containing a fixed number of cells, lyse the cells of said pellet, extract the molecule of interest from the lysate using a suitable solvent, and then quantify the molecule of interest thus extracted by a method known to man of the as in particular by HPLC (high performance liquid chromatography).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the methods according to the invention as described above have many applications in the fields of cell biology, microbiology, human and veterinary medicine, environmental biology, etc. Indeed, in all these scientific fields, the measurement of an intracellular concentration can have important applications, in particular diagnostic, prognostic, or descriptive.
  • An example of application of the method of the invention is for example the measurement of the intracellular quantity of a xenobiotic in order to detect a possible risk of toxicity. Examples of xenobiotics are pesticides, drugs, pollutants, etc.
  • Another application of the methods according to the invention is the measurement of IC 50 (intracellular inhibitory concentration).
  • PIC50 is defined as a concentration of a molecule (drug, pollutant or other types of molecules) that inhibits or destroys 50% of the target cell population.
  • a molecule drug, pollutant or other types of molecules
  • the intracellular ICso is now directly measurable in living cells.
  • doctors seek to optimize patient care by customizing the adaptation of drug doses. Indeed, it is well known that different patients may react differently to the same drug for various reasons, including related to the genetic heritage and the environment of the patient. Physicians should be able to adapt each treatment to each patient; thus, more and more, are developed diagnostic tests or prognosis to understand the quality of the disease response and / or side effects. However, few predictive biomarkers of disease progression are currently available. Moreover, in view of the increasing costs of new molecules placed on the market, it becomes essential for doctors to have tools to avoid unnecessary drug prescription because inappropriate.
  • One of the essential characteristics to determine the effectiveness of a drug in a patient is to measure the amount of this drug actually delivered to its target.
  • Many methods propose to measure the plasma level of the drug.
  • such a measure is not sufficient to determine whether the drug has been delivered to the target cells. Indeed, for the same dose of drug, the plasma level may vary not only significantly from one patient to another but also for the same patient during treatment.
  • the most appropriate way to know if a drug has actually been delivered to its target is to measure the intracellular amount of said drug in the target cells.
  • methods known to date do not measure the intracellular amount of a drug in living cells from the patient.
  • An example of application of the method according to the invention therefore relates to the measurement of the intracellular quantity of a molecule of interest, in a living cell population from the patient.
  • the evaluation of the intracellular quantity of the drug may be directly correlated to the response of the disease and / or side effects.
  • one application of the invention relates to a method for evaluating the sensitivity of a patient to a molecule of intrinsically fluorescent interest that can be used in a method of treating said patient, comprising a step of measuring in vitro the kinetics of intracellular accumulation of the intrinsically fluorescent molecule of interest in the cells of a sample obtained from said patient over time for different concentrations of molecule of interest, the measurement of the intracellular quantity by molecule of interest being carried out according to any of the methods as defined above.
  • This measurement of the kinetics of intracellular accumulation makes it possible to determine a maximum concentration of accumulation of the molecule of interest in the cells.
  • the accumulation kinetics and the maximum amount of said molecule of interest in the cells of the sample constitute two predictive parameters of resistance to treatment. These parameters must be evaluated in each system involving a given molecule and / or cell type. Moreover, these same parameters applied to normal (non-diseased) cells could constitute a predictive parameter of toxicity (or side effect) of the molecule of interest.
  • Another application of the invention relates to a method for evaluating the sensitivity of a patient to a molecule of intrinsically fluorescent interest, said patient being in the course of treatment with said molecule of interest, comprising a step of measuring the intracellular quantity in a molecule of interest in the cells of a sample obtained from said patient according to any of the methods as defined above, the absence of a molecule of interest in the cells of the sample or its presence in a smaller quantity at a threshold minimum concentration being a parameter indicative of patient resistance to said molecule of interest, the presence of a molecule of interest in the cells of the sample in an amount greater than a maximum threshold concentration being an indicative parameter. toxicity (or side effect) of said molecule of interest.
  • said minimum and maximum threshold concentrations depend on each molecule of interest studied and each cell type (of each sample). according to each treatment and each disease, the skilled person is able to determine these concentrations.
  • Yet another application of the invention relates to a method for monitoring a patient treated with a molecule of fluorescent interest comprising the following steps: (1) measuring, at different phases of the treatment, the intracellular quantity of the molecule of interest in cells of a sample obtained from said patient using any of the methods as defined above, and (2) comparing the intracellular levels of the molecule of interest with the different phases of the treatment.
  • Such a method makes it possible in particular to evaluate the consequences of a change of dose of molecule of interest on the intracellular concentration.
  • the physician is able to adjust the doses of the molecule of interest to be administered to the patient.
  • the doctor may decide to increase the doses of this molecule of interest to restore an intracellular level of molecule of interest sufficient to obtain the desired effect.
  • the processes as described above are characterized in that, simultaneously, separately or sequentially, is implemented a method of measuring the plasma level of said molecule of interest.
  • the measurement of the plasma level can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by HPLC, as described in particular in document WO 2008/036792.
  • sample means any type of sample containing individualisconces viable cells. These samples can be taken from humans, animals or plants, but also from the natural environment, for example when taking microorganisms (in soil, water, 'air). A sample according to the invention may also be any type of cell line used in the laboratory. Examples of samples taken from humans or the animal are typically biological samples or biopsies, including for example biopsies of organs, tumors, including intestinal tumors, lymph nodes, hematopoietic bone marrow, blood samples, provided that the cells removed be individualized. A conventional method for individualizing the cells of a sample, that is to say breaking the contacts between the cells and / or their matrix, is a trypsin treatment. Any other method known to those skilled in the art (mechanical dissociation associated with enzymatic digestion) is also conceivable, insofar as the cells of the samples are then in the form of cell suspensions, ready to be analyzed by flow cytometer.
  • the term "patient” means a human or an animal, in particular a mammal.
  • the invention particularly relates to the use of the method as described above for optimizing the treatment of patients with Chronic Myeloid Leukemia (CML).
  • CML Chronic Myeloid Leukemia
  • a reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22 (named t (9; 22) (q34; ql1) or Philadelphia chromosome) in hematopoietic stem cells (HSCs) induces the formation of a hybrid gene Bcr- Abl.
  • the fusion gene encodes a chimeric protein having a constitutively active tyrosine kinase, which induces dysregulation of HSC proliferation, producing invasion of bone marrow and blood of uncontrollably proliferating granulocytes.
  • N- ⁇ 5- [4- (4-methyl-piperazino-methyl) -benzoylamido] -2-methylphenyl ⁇ -4- (3-pyridyl) -2-pyrimidine-amine mesylate salt (Imatinib mesylate, STI571, Glivec®) has been approved by the FDA for the treatment of CML; it belongs to the class of tyrosine kinase inhibitors, or ITK. Imatinib is therefore the first targeted therapy for a molecular abnormality that characterizes cancer. This treatment has significantly improved the survival rate of patients.
  • the document WO2008 / 036792 proposes a treatment method based on the adaptation of the plasma Imatinib level to improve the response of the treated patients.
  • the document WO2008 / 036792 proposes a treatment method based on the adaptation of the plasma Imatinib level to improve the response of the treated patients.
  • plasma level values with the same dose of imatinib, and significant overlap in response group values.
  • these measures were not sufficient to elucidate the mechanisms of resistance of patients to imatinib.
  • This type of technique has many disadvantages: long to implement, not very reproducible and performed on non-living denatured material, comprising a variable mixture of leukemic or target cells and normal cells, and thus not reflecting the state of the target cells in vivo / in situ.
  • An object of the present invention therefore proposes to apply the methods as described above to the treatment of CML.
  • the methods as described above are characterized in that said patient is a patient suffering from a CML.
  • said cells the intracellular quantity of which is measured by a molecule of intrinsic fluorescence interest, are cells of a sample obtained from a patient suffering from leukemia. chronic myeloid (CML).
  • said molecule of inherently fluorescent interest is a tyrosine kinase inhibitor (TKI).
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • the methods according to the invention are also applicable to the measurement of the ICso for ITK.
  • This IC 50 corresponds for example to the amount of plasma ITK capable of inhibiting / destroying 50% of the target tumor cells (eg Chronic Myeloid Leukemia (CML) cells).
  • CML Chronic Myeloid Leukemia
  • Two approaches are currently used in the literature to measure the inhibition or destruction of CML tumor cells and thus the extracellular IC 50 (Whiteet et al., BLOOD, 2005, 106, (7): 2520-2526, Golemovic et al.
  • These approaches can be applied to the measurement of the intracellular ICso with the method according to the invention, since, in a particular embodiment, the intracellular concentration measured according to the method of the invention is an IC 50 .
  • the method according to the invention makes it possible to determine the intracellular concentration of ITK capable of: inhibiting 50% of the BCR-ABL tyrosine kinase activity and / or of inducing the mortality of 50% of the tumor or leukemia cells .
  • To measure the intracellular ICso with the method according to the invention it is thus necessary to measure the intracellular concentration of ITK with the method according to the invention and to measure in parallel the inhibition or destruction of the target tumor cells.
  • the intracellular ICso therefore constitutes a reference value for estimating the effectiveness of the ITKs. Indeed, the relationship between the amount of drug available in the cytoplasm of the target cells and its effect being direct, the measurement of ICso intracellular with the method according to the invention is an essential biological data.
  • the invention also relates to a particular method, entitled "functional test”.
  • This method makes it possible to determine, in a patient with CML, and even before the start of treatment, whether the patient is sensitive to a particular TKI. Such a method allows the physician to avoid starting an inefficient treatment and to select upstream the ITK or the most suitable for the patient.
  • This embodiment therefore relates to a method for determining, in a patient with CML, the sensitivity of said CML to an ITK, comprising the steps of:
  • the cells of said sample obtained in the patient suffering from CML are cells of the neutrophilic line.
  • the invention also relates to another particular method applied to the monitoring of patients with CML during their treatment. Indeed, once the therapy is set up by the doctor, it is very important to monitor the patient to ensure the right response to the patient's treatment over time.
  • the invention also relates to a method for monitoring a patient suffering from LMC and treated with an ITK, comprising the following steps:
  • “Cytologically equivalent” cells are cells of the same origin and of the same lineage. More particularly, these cells are at the same stage of differentiation.
  • the step (3) making it possible to obtain a residual fluorescence value makes it possible to accurately evaluate the fluorescence linked to the sole presence of the ITK.
  • the doctor or the technician in view of the evolution of the intracellular quantities of ITK over time, will be able for example to increase the dosage of the ITK and then check if this increase of dose has made it possible to increase the quantity of said molecule in the target cells.
  • the cellular model used to establish the correlation line (s) is in particular the K562 cell line (Lozzio and Lozzio, 1975).
  • a K562 cell suspension is typically used in a concentration of the order of 150,000 cells / ml, a cell density corresponding to the exponential growth phase for this line.
  • the step of the methods as described above consisting in bringing the cells of said sample into contact with different concentrations of molecule of interest is characterized in that, when the molecule of interest is an ITK, the K562 cells with different concentrations (0, 0.2, 1, 5, 25, 50, 125, etc.) are contacted during different incubation times (5, 15, 30, 60, 120 ... minutes). ⁇ M) of ITK.
  • said sample of the patient with CML is typically a sample of blood, bone marrow, or ganglion. More particularly, the cells of the sample are granulocyte cells corresponding to the leukemic haematopoietic line. If the cells removed are not individualized in their native state, then these cells are previously individualized as previously described and a cell suspension is prepared for the flow cytometer analysis.
  • the different phases of the treatment to which a measurement of the intracellular concentration of ITK can be made are, for example: after 14 days of treatment (day 14) after one month (30 days) of treatment (Ml), after three months of treatment (M3), after 6 months of treatment (M6), after 12 months of treatment (M 12), and / or - after 18 months of treatment (M 18).
  • the quantification of the intracellular ITK according to the invention can be associated with: (1) a measurement of the ITK plasma level.
  • the measurement of the plasma level can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by HPLC, as described in particular in document WO 2008/036792.
  • the measurement of the plasma level of ITK is carried out at the same stages of the treatment as the measurement of the intracellular concentration, namely during the first days of the treatment, for example the same day of the beginning of the treatment or the day after the beginning. treatment at 14, M1, M3, M6, M12 and / or M18; and / or (2) an evaluation of the expression and / or activity of the membrane pumps.
  • the expression can be evaluated at the transcriptomic (qRT-PCR), proteomic (western blot and / or flow cytometry) level; the activity of the pumps is particularly studied on living cells, in the presence of a substrate and selected inhibitors to evaluate the functions of influx and efflux.
  • the term "ITK” or "tyrosine kinase inhibitor” means organic compounds for inhibiting a protein tyrosine kinase and in particular the protein tyrosine kinase Bcr-Abl.
  • the ITKs according to the invention have an IC 50 value of less than 0.1 ⁇ M measured for example with the test described by BJ. Druker in Nat. Med. 1996, 2, 561-566.
  • An example of ITK according to the invention is imatinib and its pharmaceutically active salts, more particularly imatinib mesylate (STI571, Glivec®).
  • Other nonlimiting examples of ITK are dasatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, nilotinib, sunitinib and their pharmaceutically acceptable salts.
  • Fig. 1 Diagram showing the main steps of a method according to the invention.
  • A The cells of a sample are incubated with different concentrations of molecule of interest and the fluorescence of the cells is measured using a flow cytometer.
  • B A correlation line between the fluorescence intensity (fluorescence units) and the concentration of molecule of interest in the incubation medium is established (DCl).
  • C For each concentration of molecule of interest in the medium, cells are removed and then lysed, and the intracellular concentration of molecule of interest is measured by HPLC from the lysate. A correlation line between the intracellular concentration of the molecule of interest and the fluorescence intensity is then established (DC2).
  • Fig. 2 Measurement of the auto fluorescence of the different cell populations of the K562 cell line (fluorescence units as a function of time).
  • Fig. 3-5 Penetration kinetics of Imatinib mesylate in the different cell populations of the K562 cell line (fluorescence units as a function of time).
  • Fig. 6 Relationship between the fluorescence values and the concentration of Imatinib initially deposited in the culture medium.
  • Fig. 7 Establishment of a correlation between additional fluorescence and intracellular imatinib concentration.
  • Fig. 10 Kinetics of accumulation of imatinib in normal polynuclear cells
  • Fig. 11 Kinetics of accumulation of imatinib in the cells of patients with
  • Fig. 13 Evaluation of the level of IMIC in subpopulations (A) normal and (B) leukemia after Ih incubation in the presence of 5 and 50 ⁇ M of imatinib.
  • Fig. 14 Demonstrative example of comparison of accumulation kinetics of 2nd generation ITKs in the cells of a patient LMC.
  • Fig. Fig. 15 Study of extracellular dose / intracellular quantity of (A) dasatinib in LAMA-84 and K562 and (B) nilotinib in K562 cells.
  • the inventors measured the intracellular quantity of a tyrosine kinase inhibitor, imatinib (Novartis Pharma), a targeted therapy adapted to the physiopathological mechanism of Chronic Myeloid Leukemia (CML).
  • imatinib Novartis Pharma
  • CML Chronic Myeloid Leukemia
  • the absorption spectrum of solubilized Imatinib mesylate in water was realized using a BIOWAVE IL spectrophotometer. The results show a maximum absorbance at 258 nm.
  • the emission spectrum of the solubilized Imatinib mesylate in water was also determined using a BIOWAVE IL spectrophotometer. The results show a maximum emission at 412 nm.
  • Imatinib Mesylate is a tyrosine kinase inhibitor (TKI) that is inherently fluorescent in the UV; it is therefore possible to monitor its accumulation in the cell by the flow cytometry technique.
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • a direct quantification of the amount of Imatinib present in the intracellular compartment can then be performed, which is proportional to the amount of light emitted by each cell.
  • there is intrinsic fluorescence specific to each cell It is therefore better to know, for each cell population, the amount of light emitted naturally.
  • the difference in fluorescence units treated cells / control cells will be proportional to the amount of molecules having entered the cell.
  • the model of choice used for the development of intracellular Imatinib mesylate detection in CML patients is the K562 cell line (Lozzio and Lozzio, 1975). It has the following advantages: (i) positive human line for the Philadelphia chromosome and (ii) sensitive to Imatinib Mesylate (rapid penetration of the molecule and binding to the BCR-ABL target protein). 2.1.1. Choice of cell concentration
  • a first series of experiments made it possible to choose the most appropriate cell concentration. Different concentrations were tested: 1.10 6 , 500,000, 250,000 and 150,000 cells / mL. For each test, the K562 cells are seeded the day before the experiment in flasks 75 cm. A follow-up of the auto fluorescence of the cells was then carried out over time. At each time, an aliquot of cell suspension is taken and directly placed in the ice, making it possible to slow down at maximum cell activity. The concentration retained is 150,000 cells / ml, which makes it possible to have living cells that are mostly active and whose self-fluorescence is stable over time. At high concentrations, a significant nonspecific cell loss is observed in our culture conditions. Our method makes it possible to differentiate the different cellular subpopulations ("small”, “medium” and "large” cells), Fig. 2, characteristics of the K562 line.
  • Imatinib Mesylate is thus established by measuring, at each time ( ⁇ t, 15min, 30min, 1h, 2h and 4h), the amount of light emitted in the UV light by control and treated cells ( Fig. 3-5).
  • EDTA causes a nonspecific signal increase (FIG. 9A) as well as a decrease in the accumulation of imatinib (FIG. 9B), which could hinder the measurement results of the amount of IMIC in the cells. patients and functional tests. It is likely that EDTA cation chelation will alter the activity of membrane pumps and, consequently, the influx and efflux of imatinib. Thus, the samples are preferably collected on lithium heparin.
  • the kinetics of accumulation of imatinib in normal peripheral blood cells were then evaluated.
  • the profile observed is similar to that obtained with the K562 line (FIG. 10).
  • accumulation of imatinib in normal granulocytes is apparently higher than in K562 cells.
  • the maximum level of IMIC obtained after 30 minutes of incubation
  • the maximum level of IMIC is about 6.5 ⁇ g / cell for primary cells in the presence of 50 ⁇ M imatinib, whereas it is not greater at 2.7 ⁇ g / cell for the K562 line.
  • Data from 8 healthy volunteers were pooled, and the profiles obtained for each of the controls were similar and relatively homogeneous.
  • lymphocytes and monocytes the kinetics obtained are identical to those of PNN.
  • IMIC is dependent on cell morphology, with lower levels in small cells (data not shown). This relationship between intracellular ITK level and cell volume was also mentioned by Hatziiercmia S et al., Exp Hematol. 2009; 37 (6): 692-700).
  • LMC stem cells are much less sensitive to imatinib than mature cells, and that the persistence of these cells may lead to relapse after discontinuation of ITK.
  • the response of LMC CSs is variable (some patients are in remission).
  • Our previous results showed a rate Since stem cells are morphologically close to lymphocytes and monocytes, we expected a level of IMIC close to that observed in these cells, as shown in Figure 13, the IMIC of CD34 cells.
  • Example 2 Application of the process according to the invention the 2 nd generation ITKs: Nilotinib (Tasigna®) and Dasatinib (Sprycel®)
  • the method according to the invention is also applicable to ITKs of 2nd generation as nilotinib and dasatinib. Indeed, as shown in FIGS. 14 and 15, it is possible to detect the fluorescence of these ITKs and to study the penetration of these molecules into the cells. It is therefore possible to measure the intracellular concentration of these ITKs with the method according to the invention.

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Abstract

L'invention concerne des procédés de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes de : mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré avec les spectres d'émission et d'absorption de ladite molécule d'intérêt, cette valeur de fluorescence étant reportée sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt. L'invention concerne également les applications de ces procédés.

Description

PROCEDES DE MESURE DE LA QUANTITE INTRACELLULAIRE DE
MOLECULES D'INTERET INTRINSEQUEMENT FLUORESCENTES PAR
CYTOMETRIE EN FLUX ET LEURS APPLICATIONS
L'invention concerne des procédés de mesure de la quantité intracellulaire de molécules d'intérêt intrinsèquement fluorescentes par cytométrie en flux et leurs applications.
La quantification intracellulaire de molécules d'intérêt dans les cellules vivantes est un enjeu majeur. En effet, dans tous les domaines de la science, la possibilité de mesurer la quantité exacte d'une molécule directement dans une cellule vivante, amène à de nombreuses applications notamment dans le domaine de la médecine, puisqu'une telle mesure reflète au plus près l'état réel in vivo/in situ de la cellule, aucune détérioration du matériel biologique n'ayant été effectuée.
Pourtant, jusqu'à aujourd'hui, aucune technique connue ne permet d'effectuer une telle mesure : on dispose soit de la mesure du taux plasmatique qui influence mais ne reflète pas la quantité intracellulaire, soit de la quantification réalisée sur des lysats cellulaires, c'est-à-dire sur du matériel dénaturé, notamment par HPLC, qui ne correspond pas exactement au contenu cellulaire.
Il existe donc un besoin pour développer une technique permettant de mesurer la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt, directement dans une cellule vivante.
Les inventeurs ont ainsi eu le mérite d'inventer un procédé de mesure de la quantité intracellulaire de molécules d'intérêt intrinsèquement fluorescentes dans les cellules d'un échantillon à l'aide d'un cytomètre en flux. En effet, alors que la cytométrie en flux ne permettait jusqu'alors que de détecter des molécules fluorescentes (voir notamment US 2009/004213, WO 2007/010014, WO2007/022588, EP0617287, et Ferrandiz et al., DNA repair, vol.8, no.3, p.390-399), les inventeurs ont mis au point une technique permettant de quantifier les molécules fluorescentes, et cela directement dans les cellules vivantes, sans dénaturation ou traitement préalable. Plus particulièrement, l'invention concerne en premier lieu un procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente par cytométrie en flux à l'aide d'une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt. En second lieu l'invention concerne un procédé permettant d'établir ladite courbe de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt.
Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes de : mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré avec les spectres d'émission et d'absorption de ladite molécule d'intérêt, cette valeur de fluorescence étant reportée sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt.
Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes :
(1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt,
(2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à l'étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt,
(3) établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt dans un modèle cellulaire. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que l'étape (3) comprend les sous-étapes suivantes :
(a) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2),
(b) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt,
(c) mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt pour chaque concentration, (d) mesurer l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence l'intensité de fluorescence liée à la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (a), l'intensité de fluorescence résiduelle étant alors proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule,
(e) corréler chaque valeur de concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt mesurée en (c) à l'intensité de fluorescence résiduelle correspondante mesurée en (d), et tracer la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt.
Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne un procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes suivantes :
(A) une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, comprenant les étapes suivantes :
(1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à l'étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt,
(3) établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt dans un modèle cellulaire,
(B) mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré comme décrit à l'étape (2), reporter cette valeur de fluorescence dans une droite de corrélation obtenue comme décrit à l'étape (A), et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt, les étapes (A) et (B) étant susceptibles d'êtres mises en œuvre par des opérateurs différents et/ou séparément dans le temps. De manière particulière, le procédé tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que l'étape (A)(3) comprend les sous-étapes suivantes :
(a) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), (b) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt,
(c) mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt pour chaque concentration,
(d) mesurer l'intensité de fluorescence associée à chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence brute l'intensité de fluorescence liée à la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (a), l'intensité de fluorescence résiduelle étant alors proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (e) corréler chaque valeur de concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt mesurée en (c) à l'intensité de fluorescence résiduelle mesurée en (d), et tracer la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt.
Une caractéristique de l'invention est que l'étape consistant à établir la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt et l'étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt sont susceptibles d'être mises en œuvre de manière séparée dans le temps et par des opérateurs différents. En effet, l'étape consistant à établir la droite de corrélation doit être établie spécifiquement pour chaque molécule d'intérêt, mais une fois que cette droite de corrélation est établie, celle-ci est directement utilisable pour mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt chez n'importe quel patient, afin de pouvoir calculer la valeur additionnelle liée à l'accumulation de ladite molécule. Ainsi, en pratique, dans une majorité des cas, l'opérateur ne mettra en œuvre que l'étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt par mesure de fluorescence et report sur la droite de corrélation. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, l'opérateur dispose d'un catalogue de droites de corrélation établies selon le procédé de l'invention pour toute une série de molécules. Ce catalogue peut se présenter sous forme papier, mais également sous forme numérique, notamment sous forme de logiciel. Le logiciel peut être installé sur une station informatique d'interprétation des données du cytomètre en flux et permettre de reporter directement les valeurs mesurées par le cytomètre en flux sur la droite de corrélation adéquate et de fournir ainsi à l'opérateur la valeur de concentration intracellulaire en molécule d'intérêt.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'établissement de la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente est un processus en deux étapes. Une première étape, réalisée à l'aide d'un modèle cellulaire incubé avec différentes concentrations de molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, consiste à établir une première droite de corrélation (Droite de Corrélation 1 ou DCl) entre l'intensité de fluorescence intra cellulaire et la concentration de ladite molécule d'intérêt dans le milieu de culture du modèle cellulaire. La deuxième étape consiste à établir une droite de corrélation (Droite de Corrélation 2 ou DC2) entre l'intensité de fluorescence induite par ladite molécule d'intérêt et la quantité de ladite molécule dans les cellules. Ainsi, l'invention concerne typiquement un procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes :
(A) établir, pour un modèle cellulaire incubé avec différentes concentrations de molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, une première droite de corrélation ou DCl entre l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire et la concentration correspondante de ladite molécule d'intérêt dans le milieu de culture du modèle cellulaire, et
(B) établir une deuxième droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la concentration correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules. De manière particulière, ce procédé est caractérisé en ce que l'étape (A) comprend les sous étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt,
(2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à la sous étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt dans les cellules,
(3) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2),
(4) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, (5) mesurer l'intensité de fluorescence brute (IFB) des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence brute la valeur de fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (3), l'intensité de fluorescence obtenue correspondant à une fluorescence additionnelle (IFA) proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (6) corréler l'intensité de fluorescence additionnelle (IFA) obtenue mesurée en (5) à la valeur correspondante de concentration de ladite molécule dans le milieu de culture et tracer une droite de corrélation ou DCl entre l'intensité de fluorescence et la concentration de ladite molécule dans le milieu de culture dudit modèle cellulaire, et l'étape (B) comprend les sous étapes suivantes :
(a) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, dans les mêmes conditions qu'à la sous étape (A)(4), (b) récupérer les cellules à chaque concentration, puis les laver et les compter,
(c) constituer un culot cellulaire contenant un nombre fixe de cellules,
(d) lyser les cellules dudit culot puis mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt dans le lysat cellulaire,
(e) extraire la molécule d'intérêt du lysat cellulaire à l'aide d'un solvant approprié, (f) quantifier ladite molécule d'intérêt,
(g) corréler les intensités de fluorescence additionnelles mesurées à la sous étape (A)(5) et les quantités intracellulaires mesurées à partir du lysat cellulaire à l'étape (B)(f), et tracer une droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la quantité correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules.
L'utilisation de la droite de corrélation DC2 peut alors être validée et l'extrapolation de la quantité de ladite molécule intrinsèquement fluorescente peut être précisée, à partir des valeurs de fluorescence additionnelle (IFA). En effet, la valeur de fluorescence additionnelle lue par le cytomètre correspond à la quantité de molécule présente dans la cellule selon la droite de corrélation DC2 ; il suffit donc de reporter la valeur de l'IFA sur l'axe correspondant pour lire la quantité de ladite molécule sur l'autre axe. Ainsi, le report de l'intensité de fluorescence sur la DC2 permet d'évaluer directement la quantité de ladite molécule d'intérêt, sans obligation à chaque fois de réaliser le dosage de la molécule par méthode classique (HPLC .).
Par ailleurs, selon l'invention, les étapes consistant à établir la DCl et l'étape consistant à établir la DC2 sont susceptibles d'être mises en œuvre de manière séparée dans le temps et par des opérateurs différents.
Dans un mode réalisation particulier de l'invention, le procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que ladite droite de corrélation est établie conformément au procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt tel que défini précédemment.
Les procédés selon l'invention tels que décrits précédemment présentent l'avantage majeur de permettre une mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt directement dans une cellule vivante, sans dénaturation ou traitement préalable. Un tel avantage est considérable puisque la concentration intracellulaire mesurée avec le procédé selon l'invention reflète de manière fidèle l'état in situ des cellules testées. Un autre avantage est de pouvoir délimiter sur des critères morphologiques simples une population d'intérêt au sein d'une population cellulaire, sans séparation préalable.
Encore un autre avantage est de pouvoir réaliser, en même temps que la mesure de la fluorescence des cellules, un immunophénotypage capable d'identifier des cellules exprimant un ou des antigènes particuliers (ex : cellules CD34+).
Par ailleurs, un autre avantage de ce procédé est qu'il s'applique à tout type de molécule d'intérêt, à l'unique condition que cette molécule soit intrinsèquement fluorescente, c'est-à-dire qu'elle possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). Particulièrement, une molécule fluorescente selon l'invention fluoresce dans la gamme spectrale allant de 190nm à 800nm. En pratique, pour déterminer si une molécule est fluorescente, il suffit de déterminer son spectre d'émission et d'absorption comme mentionné à l'étape (1) du procédé de l'invention. Si aucune fluorescence n'est détectée, ou si son spectre de fluorescence est en dehors du spectre de détection du cytomètre en flux, alors cette molécule ne pourra pas être quantifiée avec le procédé de l'invention. Typiquement, cette étape (1) est réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre de gamme spectrale comprise entre 190nm à 800nm, particulièrement avec un spectrophotomètre UV-visible de gamme spectrale comprise entre 190nm à 800nm. L'homme du métier est à même de choisir l'appareil le plus approprié en fonction de la molécule étudiée. D'autres exemples non limitatifs de spectrophotomètres convenant à la mise en œuvre du procédé selon l'invention sont les spectrophotomètres UV-visible mono ou double faisceaux, possédant une gamme spectrale de 190 nm à 3200 nm environ, particulièrement de 190 nm à 1100 nm.
D'autres avantages du procédé selon l'invention sont sa rapidité et sa reproductibilité. En effet, une fois que la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt est établie, les mesures de concentrations intracellulaires de cette molécule dans les échantillons est extrêmement rapide, et cela grâce à la rapidité d'acquisition des données du cytomètre en flux. Par ailleurs, aucun marquage biologique ni traitement préalable de la cellule n'est nécessaire puisque la technique est basée sur la fluorescence naturelle de la molécule d'intérêt. De plus, selon l'invention, l'étape des procédés tels que décrits précédemment consistant à paramétrer un cytomètre en flux, comprend en particulier de standardiser les réglages de l'appareil. Une telle standardisation permet d'évaluer la fluorescence liée à la présence de la molécule d'intérêt dans les mêmes conditions quelles que soient les cellules, le moment de l'expérience et le cytomètre en flux utilisé. Pour standardiser le cytomètre en flux, on peut notamment utiliser des billes de latex calibrées pour la fluorescence de la molécule d'intérêt. L'analyse systématique des billes et le réglage du cytomètre pour que l'intensité de fluorescence des billes soit identique d'une expérience à l'autre, permet de s'affranchir des variations liées à la technique. Cette technique de standardisation est réalisable en routine par l'homme du métier. L'homme du métier est par ailleurs libre de choisir une autre méthode permettant de standardiser le cytomètre en flux. Par ailleurs, selon l'invention, l'homme du métier est à même de choisir le modèle de cytomètre en flux le plus adapté à la fluorescence de la molécule d'intérêt qu'il souhaite étudier. Un exemple de cytomètre convenant à la mise en œuvre de l'invention est le cytomètre Coulter EPICS Elite™.
Selon l'invention, l'étape consistant à mesurer la fluorescence des cellules dudit échantillon dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt, est réalisée en préparant les cellules de manière à obtenir une suspension cellulaire, c'est-à-dire des cellules individualisées en suspension dans une solution. Cette suspension cellulaire peut être réalisée à l'aide de toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par séparation sur ficoll (cellules sanguines ou médullaires), immunosélection, trypsination (cellules adhérentes) ou dilacération de tissus (dissociation mécanique associée à une digestion enzymatique) Si nécessaire, un immunophénotypage classique peut être réalisé et permettre d'étudier une sous- population d'intérêt dans une population cellulaire donnée. Cette approche nécessite l'installation du laser UV en décalé par rapport aux autres lasers du cytomètre.
Dans les procédés de l'invention, l'étape comprenant de mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, comprend typiquement d'incuber une suspension du modèle cellulaire avec différentes concentrations de molécule d'intérêt, éventuellement pendant différents temps d'incubation, ou d'incuber une suspension du modèle cellulaire pendant différents temps d'incubation dans une même concentration de molécule d'intérêt, le temps d'incubation étant proportionnel à la concentration intracellulaire en molécule d'intérêt. Le nombre de cellules incubées ou densité cellulaire de la suspension, exprimé par exemple en cellules/mL, convenant à cette incubation peut être déterminé en routine par l'homme du métier, ce nombre dépendant de chaque modèle cellulaire. Une concentration cellulaire convenable permet typiquement d'assurer la survie des cellules dans le milieu d'incubation et de conserver une autofluorescence stable des cellules au cours du temps. Par exemple et de manière non limitative, la concentration cellulaire est comprise entre 50.000 cellules/mL et 1.106 cellules/mL.
Par ailleurs, dans les procédés de l'invention, l'étape comprenant de mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt dans les cellules est typiquement réalisée en suivants les étapes suivantes : récupérer les cellules, les laver puis les compter, constituer un culot cellulaire contenant un nombre fixe de cellules, lyser les cellules dudit culot, extraire la molécule d'intérêt du lysat à l'aide d'un solvant approprié, puis quantifier la molécule d'intérêt ainsi extraite par une méthode connue de l'homme du métier, comme notamment par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance).
Les procédés selon l'invention tels que décrits précédemment possèdent de nombreuses applications dans les domaines de la biologie cellulaire, la microbiologie, la médecine humaine et vétérinaire, la biologie environnementale, etc. En effet, dans tous ces domaines scientifiques, la mesure d'une concentration intracellulaire peut avoir des applications importantes, notamment diagnostiques, pronostiques, ou descriptives. Un exemple d'application du procédé de l'invention est par exemple la mesure de la quantité intracellulaire d'un xénobiotique afin de détecter un éventuel risque de toxicité. Des exemples de xénobiotiques sont les pesticides, les médicaments, les polluants, etc. Une autre application des procédés selon l'invention est la mesure de l'ICso (concentration inhibitrice à 50%) intracellulaire. Au niveau cellulaire, PIC50 se définit par une concentration d'une molécule (médicament, polluant ou autres types de molécules) inhibant ou détruisant 50% de la population cellulaire cible. Jusqu'à présent, seule l'ICso extracellulaire était mesurable. Grâce au procédé selon l'invention, l'ICso intracellulaire est maintenant directement mesurable dans les cellules vivantes. Par ailleurs, les médecins cherchent à optimiser la prise en charge des patients en personnalisant l'adaptation des doses de médicaments. En effet, il est bien connu que différents patients peuvent réagir différemment à un même médicament pour des raisons diverses, notamment liées au patrimoine génétique et à l'environnement du patient. Les médecins devraient donc pouvoir adapter chaque traitement à chaque patient ; ainsi, de plus en plus, sont développés des tests diagnostics ou pronostic permettant de comprendre la qualité de la réponse de la maladie et/ou les effets secondaires. Cependant, peu de biomarqueurs prédictifs de l'évolution de la maladie sont actuellement disponibles. Par ailleurs, au vu des coûts de plus en plus élevés des nouvelles molécules mises sur le marché, il devient fondamental pour les médecins de disposer d'outils permettant d'éviter toute prescription médicamenteuse inutile car inadaptée.
Une des caractéristiques essentielles pour déterminer l'efficacité d'un médicament chez un patient est de mesurer la quantité de ce médicament effectivement délivré à sa cible. De nombreuses méthodes proposent de mesurer le taux plasmatique du médicament. Cependant, une telle mesure n'est pas suffisante pour déterminer si le médicament a bien été délivré jusqu'aux cellules cibles. En effet, pour une même dose de médicament, le taux plasmatique peut varier non seulement significativement d'un patient à l'autre mais également pour un même patient au cours du traitement. Ainsi, le moyen le plus approprié pour savoir si un médicament a effectivement été délivré à sa cible est de mesurer la quantité intracellulaire dudit médicament dans les cellules cibles. Or, les méthodes connues jusqu'à aujourd'hui ne permettent pas de mesurer la quantité intracellulaire d'un médicament dans des cellules vivantes issues du patient. En effet, actuellement, pour connaître une quantité intra-cellulaire d'un médicament, il est nécessaire de lyser au préalable les cellules pour pouvoir mesurer la quantité moyenne de médicament pour un nombre de cellules donné. Ce type de technique comporte de nombreux désavantages : longue à mettre en œuvre, peu reproductible et réalisée sur des cellules mal identifiées (mélange des cellules cibles et de cellules normales) et sur du matériel dénaturé non vivant et donc ne reflétant pas l'état in vivo/in situ des cellules.
Un exemple d'application du procédé selon l'invention concerne donc la mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt, dans une population cellulaire vivante issue du patient. L'évaluation de la quantité intra-cellulaire du médicament peut-être directement corrélée à la réponse de la maladie et/ou aux effets secondaires. Ainsi, une application de l'invention concerne un procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente susceptible d'être utilisée dans une méthode de traitement dudit patient, comprenant une étape consistant à mesurer in vitro la cinétique d'accumulation intracellulaire de la molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient au cours du temps pour différentes concentrations de molécule d'intérêt, la mesure de la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt étant réalisée selon l'un quelconque des procédés tels que définis précédemment. Cette mesure de la cinétique d'accumulation intracellulaire permet de déterminer une concentration maximale d'accumulation de la molécule d'intérêt dans les cellules. La cinétique d'accumulation et la quantité maximale de ladite molécule d'intérêt dans les cellules de l'échantillon constituent deux paramètres prédictifs de résistance au traitement. Ces paramètres doivent être évalués dans chaque système impliquant une molécule donnée et/ou un type cellulaire donné. Par ailleurs, ces mêmes paramètres appliqués à des cellules normales (non malades) pourraient constituer un paramètre prédictif de toxicité (ou effet secondaire) de la molécule d'intérêt. Une autre application de l'invention concerne un procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, ledit patient étant en cours de traitement par ladite molécule d'intérêt, comprenant une étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient selon l'un quelconque des procédés tels que définis précédemment, l'absence de molécule d'intérêt dans les cellules de l'échantillon ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un paramètre indicatif de résistance du patient à ladite molécule d'intérêt, la présence de molécule d'intérêt dans les cellules de l'échantillon dans une quantité supérieure à une concentration maximale seuil étant quant à elle un paramètre indicatif de toxicité (ou effet secondaire) de ladite molécule d'intérêt. Par ailleurs, lesdites concentrations minimale et maximale seuils dépendent de chaque molécule d'intérêt étudiée et de chaque type de cellule (de chaque échantillon). Selon chaque traitement et chaque maladie, l'homme du métier est apte à déterminer ces concentrations.
Encore une autre application de l'invention concerne un procédé de suivi d'un patient traité par une molécule d'intérêt fluorescente comprenant les étapes suivantes : (1) mesurer, à différentes phases du traitement, la quantité intracellulaire de la molécule d'intérêt dans des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient à l'aide de l'un quelconque des procédés tels que définis précédemment, et (2) comparer les taux intracellulaire de la molécule d'intérêt aux différentes phases du traitement. Un tel procédé permet notamment d'évaluer les conséquences d'un changement de dose de molécule d'intérêt sur la concentration intracellulaire. En pratique, grâce à la méthode de suivi de la quantité intracellulaire de la molécule d'intérêt fluorescente selon l'invention, le médecin est à même d'ajuster les doses de molécule d'intérêt à administrer au patient. En particulier, si le suivi du patient au cours du temps révèle une diminution de la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt alors que les doses de molécules d'intérêt administrées sont restées identiques, le médecin peut prendre la décision d'augmenter les doses de cette molécule d'intérêt pour rétablir un taux intracellulaire de molécule d'intérêt suffisant pour obtenir l'effet escompté.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les procédés tels que décrits précédemment sont caractérisés en ce que, de manière simultanée, séparée ou séquentielle, est mis en oeuvre un procédé consistant à mesurer le taux plasmatique de ladite molécule d'intérêt. La mesure du taux plasmatique peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par HPLC, comme notamment décrit dans le document WO 2008/036792.
Selon l'invention, on entend par « échantillon » tout type de prélèvement contenant des cellules individualisâmes et viables. Ces échantillons peuvent être prélevés chez l'homme, chez l'animal ou chez un végétal, mais également dans le milieu naturel, lorsqu'il s'agit de prélever par exemple des microorganismes (dans le sol, dans l'eau, dans l'air...). Un échantillon selon l'invention peut également être tout type de lignée de cellules utilisée en laboratoire. Des exemples d'échantillons prélevés chez l'homme ou l'animal sont typiquement les échantillons biologiques ou biopsies, incluant par exemple les biopsies d'organes, de tumeurs, notamment les tumeurs intestinales, les ganglions lymphatiques, la moelle osseuse hématopoïétique, les échantillons de sang, à la condition que les cellules prélevées soient individualisâmes. Une méthode classique pour individualiser les cellules d'un échantillon, c'est-à-dire rompre les contacts entres les cellules et/ou leur matrice, est un traitement à la trypsine. Toute autre méthode connue de l'homme du métier (dissociation mécanique associée à une digestion enzymatique) est également envisageable, dans la mesure où les cellules des échantillons se trouvent alors sous la forme de suspensions cellulaires, prêtes à être analysées par cytomètre en flux.
Toujours selon l'invention, par « patient » on entend un humain ou un animal, en particulier un mammifère.
Dans un autre aspect, l'invention concerne tout particulièrement l'utilisation du procédé tel que décrit précédemment pour l'optimisation du traitement de patients atteints de Leucémie Myéloïde Chronique (LMC). Dans la LMC, une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22 (nommée t(9;22)(q34;ql l) ou chromosome de Philadelphie) dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH) induit la formation d'un gène hybride Bcr-Abl. Ce gène de fusion code pour une protéine chimérique possédant une tyrosine kinase constitutivement active, qui induit une dérégulation de la prolifération des CSH, produisant l'envahissement de la moelle osseuse et du sang de granulocytes proliférant de manière non contrôlée. En mai 2001, le sel de mésylate du N-{5-[4-(4-méthyl-pipérazino-méthyl)- benzoylamido]-2-méthylphényl}-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidine-amine (Imatinib mésylate, STI571, Glivec®) a été approuvé par la FDA pour le traitement de la LMC ; il appartient à la classe des inhibiteurs de tyrosine kinase, ou ITK. L 'Imatinib est donc la première thérapie ciblée par rapport à une anomalie moléculaire caractérisant un cancer. Ce traitement a permis une amélioration considérable du taux de survie des patients. En effet, une étude récente a montré que 89% des patients ayant reçu de l'Imatinib comme médicament de première ligne ont survécus (Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, et al., New Eng J Med 2006; 355:2408-17).Pour autant, un certain nombre de patients présente des réponses insatisfaisantes à PImatinib, ce qui a justifié le développement d'autres ITK (appelés ITK de seconde génération). Les résistances et les intolérances à l'imatinib restent mal comprises. Deux paramètres biologiques sont aujourd'hui disponibles pour tenter d'expliquer un cas de réponse non satisfaisante : 1) la présence d'une mutation ponctuelle de la molécule BCR-ABL, gênant ou empêchant la fixation de l'imatinib sur sa molécule cible ; ce mécanisme ne concerne qu'une minorité des cas de résistance à la phase chronique (Jabbour et al., 2006 20 : 1767-73) ; 2) le taux plasmatique d'Imatinib. En effet, il semble exister une relation entre le taux plasmatique de l'imatinib et la qualité de la réponse de la LMC, suggérant d'utiliser ce paramètre pour adapter le traitement. (Mahon et al., Blood. 106(1 l,Part 1) Nov. 16 2005. 565 A ; Peng B. et al, J. Clin. Oncol. 2004, 22, 935-942). Ainsi, le document WO2008/036792 propose une méthode de traitement basé sur l'adaptation du taux plasmatique d'Imatinib pour améliorer la réponse des patients traités. Cependant, il existe une grande hétérogénéité des valeurs des taux plasmatiques avec une même dose d'imatinib, et un chevauchement important des valeurs des groupes de réponse. De plus, on observe une variabilité importante chez un même patient, sans explication satisfaisante. C'est pourquoi il est très difficile de prendre une décision à partir du taux plasmatique d'imatinib d'un patient donné, alors qu'une différence statistique a été observée de part et d'autre d'un seuil de 1000 ng/mL. Ainsi, ces mesures n'ont pas suffit à élucider les mécanismes de résistance des patients à l'imatinib. Une telle mesure ne permet pas de savoir si l'imatinib a bien été délivré aux cellules cibles, en particulier au niveau des granulocytes malins, une inconnue qui pourrait expliquer certains cas de résistance à taux plasmatique satisfaisant. Ainsi, le moyen le plus approprié pour savoir si l'imatinib a effectivement été délivré à sa cible serait de mesurer la quantité intracellulaire d'Imatinib dans les cellules cibles. Malheureusement, les méthodes connues jusqu'à aujourd'hui ne permettent pas de mesurer la quantité intracellulaire d'un médicament dans des cellules vivantes. La seule méthode fiable est l'utilisation d'imatinib marqué au 14C, inutilisable chez l'homme. Une méthode alternative consiste, comme expliqué précédemment, à lyser préalablement les cellules cibles en laboratoire puis à mesurer la quantité de la molécule d'intérêt dans le lysat notamment par HPLC. Ce type de technique comporte de nombreux désavantages : longue à mettre en œuvre, peu reproductible et réalisée sur du matériel dénaturé non vivant, comprenant un mélange variable de cellules leucémiques ou cibles et de cellules normales, et donc ne reflétant pas l'état des cellules cibles in vivo/in situ.
Un objet de la présente invention propose donc d'appliquer les procédés tels que décrits précédemment au traitement de la LMC.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les procédés tels que décrits précédemment sont caractérisés en ce que ledit patient est un patient atteint d'une LMC. De même, selon ce mode de réalisation, dans les procédés tels que décrits précédemment, lesdites cellules dont on mesure la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente sont des cellules d'un échantillon obtenu chez un patient atteint d'une leucémie myéloïde chronique (LMC). Par ailleurs, de manière particulière, ladite molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente est un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK). Les caractéristiques de mise en œuvre de ces procédés particuliers appliqués aux ITK sont telles que décrites précédemment pour les procédés généraux et ne sont donc pas répétées ici.
Les procédés selon l'invention sont également applicables à la mesure de l'ICso pour les ITK. Cet IC50 correspond par exemple à la quantité d'ITK plasmatique capable d'inhiber/détruire 50% des cellules tumorales cibles (ex : cellules de Leucémie Myéloïde Chronique (LMC)). Deux approches sont utilisées actuellement dans la littérature pour mesurer l'inhibition ou la destruction des cellules tumorales de LMC et ainsi l'IC50 extracellulaire (Whiteet al, BLOOD, 2005,106, (7) : 2520-2526 ; Golemovic et al.,. Clin Cancer Res, 2005;l l(13) , 2005 : 4941-4947) : - évaluer l'inhibition de la phosphorylation d'une molécule intra-cytoplasmique, cible de la protéine de fusion BCR-ABL, et ainsi calculer la concentration d'ITK plasmatique ou du milieu d'incubation des cellules capable d'inhiber 50% de l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL, évaluer la mortalité et/ou l'apoptose cellulaire induite par différentes doses d'ITK, et ainsi déterminer la concentration pour laquelle 50% des cellules sont détruites. Ces approches peuvent être appliquées à la mesure de l'ICso intracellulaire avec le procédé selon l'invention, puisque, dans un mode de réalisation particulier, la concentration intracellulaire mesurée selon le procédé de l'invention est une IC50. Ainsi, le procédé selon l'invention permet de déterminer la concentration intracellulaire d'ITK capable : d'inhiber 50% de l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL et/ou d'induire la mortalité de 50% des cellules tumorales ou leucémiques. Pour mesurer l'ICso intracellulaire avec le procédé selon l'invention il convient ainsi de mesurer la concentration intracellulaire en ITK avec le procédé selon l'invention et de mesurer en parallèle l'inhibition ou la destruction des cellules tumorales cibles. Afin d'évaluer l'inhibition ou la destruction des cellules tumorales, il est possible de mesurer à une phase précoce d'incubation la diminution d'une ou de plusieurs molécule(s) intracytoplasmique(s) connue(s) pour être surexprimée(s) dans les cellules tumorales ou leucémiques. Il est également possible de mesurer la proportion de cellules mortes ou en voie d'apoptose par cytométrie en flux (ex : association d'iodure de propidium et d'annexine V). Ainsi, la courbe établie entre, soit la diminution d'une des molécules cibles intracytoplasmiques, soit la proportion de cellules vivantes et la concentration intracellulaire d'ITK, permettra de calculer la valeur de l'ICso intracellulaire pour chaque suspension cellulaire testée.
L'ICso intracellulaire constitue donc une valeur de référence pour estimer l'efficacité des ITK. En effet, la relation entre la quantité de médicament disponible dans le cytoplasme des cellules cibles et son effet étant directe, la mesure de l'ICso intracellulaire avec le procédé selon l'invention constitue une donnée biologique essentielle.
En plus des procédés décrits précédemment et appliqués aux ITK, l'invention concerne également un procédé particulier, intitulé "test fonctionnel". Ce procédé permet de déterminer, chez un patient atteint d'une LMC, et avant même le début du traitement, si celui est sensible à un ITK particulier. Un tel procédé permet au médecin d'éviter de commencer un traitement inefficace et de sélectionner en amont la ou les ITK les mieux adaptés au patient. Ce mode de réalisation concerne donc un procédé pour déterminer, chez un patient atteint d'une LMC, la sensibilité de ladite LMC à un ITK, comprenant les étapes suivantes :
(1) incuber in vitro des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient avec différentes concentrations dudit ITK, et (2) mesurer à l'aide d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6 la quantité intracellulaire en ITK présente dans les cellules incubées en (1), l'absence dudit ITK dans les cellules ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un indice de résistance du patient audit ITK, la présence dudit ITK au-delà de ladite concentration minimale seuil étant indicative d'une sensibilité de la LMC audit ITK.De manière particulière, les cellules dudit échantillon obtenu chez le patient atteint de LMC sont des cellules de la lignée neutrophile.
Toujours en plus des procédés décrits précédemment et appliqués aux ITK, l'invention concerne également un autre procédé particulier, appliqué au suivi des patients atteints de LMC au cours de leur traitement. En effet, une fois la thérapie mise en place par le médecin, il est très important d'assurer un suivi du patient pour s'assurer de la bonne réponse au traitement du patient dans la durée. Ainsi, l'invention concerne également un procédé de suivi d'un patient atteint de LMC et traité par un ITK, comprenant les étapes suivantes :
(1) mesurer, avant le début du traitement, la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, cette valeur correspondant à la fluorescence non spécifique des cellules de l'échantillon étudiée, (2) mesurer à différentes phases du traitement la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, lesdites cellules dudit échantillon étant cytologiquement équivalentes aux cellules de l'échantillon obtenu en (1), (3) soustraire à la valeur de fluorescence mesurée en (2) la valeur de fluorescence non spécifique mesurée en (1) et obtenir une valeur de fluorescence résiduelle, (4) reporter la valeur de fluorescence résiduelle obtenue en (3) sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence induite par ledit ITK et la quantité dudit ITK dans les cellules, ladite droite ayant été obtenue selon un procédé tel que décrit précédemment, et lire la quantité intracellulaire en ITK à chaque phase du traitement.
Par des cellules « cytologiquement équivalentes » on entend des cellules de même origine et de même lignée. Plus particulièrement, ces cellules sont à un même stade de différenciation.
Selon ce procédé particulier de l'invention, l'étape (3) permettant d'obtenir une valeur de fluorescence résiduelle permet d'évaluer de manière précise la fluorescence liée à la seule présence de l'ITK.
Le médecin ou le technicien, au vu de l'évolution des quantités intracellulaires d'ITK au cours du temps, va pouvoir par exemple augmenter la posologie de l'ITK puis vérifier si cette augmentation de dose a permis d'augmenter la quantité de ladite molécule dans les cellules cibles.
Dans les procédés appliqués aux ITK selon l'invention, le modèle cellulaire utilisé pour établir la ou les droites de corrélation est notamment la lignée cellulaire K562 (Lozzio and Lozzio, 1975). Selon ce mode réalisation, on utilise typiquement une suspension de cellules K562 dans une concentration de l'ordre de 150.000 cellules/mL, densité cellulaire correspondant à la phase exponentielle de croissance pour cette lignée. Par ailleurs, de manière particulière, l'étape des procédés tels que décrits précédemment consistant à mettre en contact les cellules dudit échantillon avec différentes concentrations de molécule d'intérêt est caractérisé en ce que, lorsque la molécule d'intérêt est un ITK, l'on met en contact pendant différentes durées d'incubation (5, 15, 30, 60, 120 ... minutes) les cellules K562 avec différentes concentrations (0, 0.2, 1, 5, 25, 50, 125 ....μM) d'ITK.
Toujours dans les procédés appliqués aux ITK selon l'invention, ledit échantillon du patient atteint de LMC est typiquement un échantillon de sang, de moelle osseuse, ou de ganglion. Plus particulièrement, les cellules de l'échantillon sont des cellules granulocytaires correspondant à la lignée hématopoïétique leucémique. Si les cellules prélevées ne sont pas individualisées dans leur état natif, alors ces cellules sont préalablement individualisées comme décrit précédemment et une suspension cellulaire est préparée pour l'analyse au cytomètre en flux. Encore selon cette application particulière, les différentes phases du traitement auxquelles peuvent être réalisées une mesure de la concentration intracellulaire en ITK sont par exemple : - après 14 jours de traitement (J 14) après un mois (30 jours) de traitement (Ml), après trois mois de traitement (M3), après 6 mois de traitement (M6), après 12 mois de traitement (M 12), et/ou - après 18 mois de traitement (M 18).
Pour disposer d'éléments complémentaires permettant de comprendre les mécanismes de pénétration des ITK dans les cellules cibles, la quantification de l'ITK intracellulaire selon l'invention peut être associée à : (1) une mesure du taux plasmatique en ITK. La mesure du taux plasmatique peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par HPLC, comme notamment décrit dans le document WO 2008/036792. De manière particulière, la mesure du taux plasmatique d'ITK est réalisée aux mêmes phases du traitement que la mesure de la concentration intracellulaire, à savoir durant les premiers jours du traitement, par exemple le jour même du début du traitement ou le lendemain du début du traitement, à J14, Ml, à M3, à M6, à M12 et/ou à Ml 8 ; et/ou à (2) une évaluation de l'expression et/ou de l'activité des pompes membranaires. L'expression peut être évaluée au niveau transcriptomique (qRT-PCR), protéomique (western blot et /ou cytométrie en flux) ; l'activité des pompes s'étudie notamment sur les cellules vivantes, en présence d'un substrat et d'inhibiteurs choisis permettant d'évaluer les fonctions d'influx et d'efflux.
Selon l'invention, on entend par « ITK » ou « inhibiteur de tyrosine kinase » des composés organiques permettant d'inhiber une protéine tyrosine kinase et en particulier la protéine tyrosine kinase Bcr-Abl. De manière particulière, les ITK selon l'invention possèdent une valeur d'IC50 inférieure à 0,1 μM mesurée par exemple avec le test décrit par BJ. Druker dans Nat. Med. 1996, 2, 561-566. Un exemple d'ITK conforme à l'invention est l'Imatinib et ses sels pharmaceutiquement actifs, plus particulièrement l'Imatinib mésylate (STI571, Glivec®). D'autres exemples non limitatifs d'ITK sont le dasatinib, l'erlotinib, le gefitinib, le lapatinib, le nilotinib, le sunitinib et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
D'autres aspects et avantages de la présente invention sont décrits dans les figures et exemples suivants, qui doivent être considérés à titre illustratif et comme ne limitant pas la portée de l'invention.
FIGURES
Fig. 1 : Schéma présentant les principales étapes d'un procédé selon l'invention. A : les cellules d'un échantillon sont incubées avec différentes concentrations de molécule d'intérêt et la fluorescence des cellules est mesurée à l'aide d'un cytomètre en flux. B : Une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence (unités de fluorescence) et la concentration en molécule d'intérêt dans le milieu d'incubation est établie (DCl). C : Pour chaque concentration de molécule d'intérêt dans le milieu, des cellules sont prélevées puis lysées, et la concentration intracellulaire en molécule d'intérêt est mesurée par HPLC à partir du lysat. Une droite de corrélation entre la concentration intracellulaire en molécule d'intérêt et l'intensité de fluorescence est alors établie (DC2).
Fig. 2 : Mesure de l'auto fluorescence des différentes populations cellulaires de la lignée cellulaire K562 (unités de fluorescence en fonction du temps). Fig. 3-5 : Cinétique de pénétration de l'Imatinib Mésylate dans les différentes populations cellulaires de la lignée cellulaire K562 (unités de fluorescence en fonction du temps).
Fig. 6 : Relation entre les valeurs de fluorescence et la concentration en Imatinib initialement déposée dans le milieu de culture. Fig. 7 : Etablissement d'une corrélation entre la fluorescence additionnelle et la concentration intracellulaire en imatinib. Fig. 8 : (A) Cinétique d'accumulation de l'imatinib dans les cellules K562 (n=6) et (B) étude de la relation dose extracellulaire/quantité intracellulaire (n=2) [n étant le nombre de répétitions de l'expérience].
Fig. 9 : Définition des conditions pré-analytiques : (A/B) choix de l'anticoagulant et (C) influence de la température (n=2).
Fig. 10 : Cinétique d'accumulation de l'imatinib dans les polynucléaires normaux
(n=8).
Fig. 11 : Cinétique d'accumulation de l'imatinib dans les cellules de patients atteints de
LMC (n=ll). Fig. 12 : Relation dose extracellulaire/quantité intracellulaire dans les cellules de patients atteints de LMC (n=15).
Fig. 13 : Evaluation du taux d'IMIC dans les sous populations (A) normales et (B) leucémiques après Ih d'incubation en présence de 5 et 50μM d'imatinib.
Fig. 14 : Exemple démonstratif de comparaison des cinétiques d'accumulation des ITK de 2eme génération dans les cellules d'un patient LMC.
Fig. 15 : Etude de la relation dose extracellulaire/quantité intracellulaire de (A) dasatinib dans les lignées LAMA-84 et K562 et (B) nilotinib dans les cellules K562.
EXEMPLES
Exemple 1 : Mesure de la concentration intracellulaire d'imatinib
Un exemple de réalisation du procédé de l'invention est décrit ci-après. Les inventeurs ont mesuré la quantité intracellulaire d'un inhibiteur de tyrosine kinase, l'imatinib (Novartis Pharma), thérapie ciblée adaptée au mécanisme physiopathologique de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC). Cette molécule est disponible depuis 2001, son dosage plasmatique est réalisable en routine, et il existe des lignées cellulaires issues de clones de LMC sensibles à l'imatinib. /. Etablissement du spectre de l'Imatinib
On a réalisé le spectre d'absorption de l'Imatinib Mésylate solubilisé dans l'eau à l'aide d'un spectrophotomètre BIOWAVE IL Les résultats montrent une absorbance maximale à 258 nm. On a également réalisé le spectre d'émission de l'Imatinib Mésylate solubilisé dans l'eau à l'aide d'un spectrophotomètre BIOWAVE IL Les résultats montrent une émission maximale à 412 nm.
2. Evaluer la capacité à détecter en Cytométrie en Flux la fluorescence UV en utilisant les caractéristiques déterminées en 1)
L'Imatinib Mésylate est un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK) intrinsèquement fluorescent dans l'UV ; il est donc possible de suivre son accumulation dans la cellule par la technique de cytométrie en flux. Une quantification directe de la quantité d'Imatinib présent dans le compartiment intracellulaire peut alors être réalisée, celle-ci étant proportionnelle à la quantité de lumière émise par chaque cellule. Cependant, il existe une fluorescence intrinsèque propre à chaque cellule. Il est donc préférable de connaître, pour chaque population cellulaire, la quantité de lumière émise naturellement. Ainsi, la différence d'unités de fluorescence cellules traitées/cellules témoins sera proportionnelle à la quantité de molécules ayant pénétré dans la cellule. 2.1 Etudier V effet-dose avec un modèle de lignée cellulaire
Le modèle de choix utilisé pour la mise au point de la détection de l'Imatinib Mésylate intracellulaire chez les patients atteints de LMC est la lignée cellulaire K562 (Lozzio and Lozzio, 1975). Elle présente des avantages suivants : (i) lignée d'origine humaine positive pour le chromosome de Philadelphie et (ii) sensible à l'Imatinib Mésylate (pénétration rapide de la molécule et fixation sur la protéine cible BCR-ABL). 2.1.1. Choix de la concentration cellulaire
Une première série d'expérience a permis de choisir la concentration cellulaire la plus adaptée. Différentes concentrations ont été testées : 1.106, 500.000, 250.000 et 150.000 cellules/mL. Pour chaque test, les cellules K562 sont ensemencées la veille de l'expérience dans des flasques 75 cm . Un suivi de l'auto fluorescence des cellules a ensuite été réalisé au cours du temps. A chaque temps, un aliquote de suspension cellulaire est prélevé et directement placé dans la glace, permettant de ralentir au maximum l'activité cellulaire. La concentration retenue est 150.000 cellules/mL, ce qui permet d'avoir des cellules vivantes pour la plupart actives et dont l'auto fluorescence est stable au cours du temps. Aux concentrations élevées, on observe dans nos conditions de culture une perte cellulaire non spécifique significative. Notre procédé permet de différencier les différentes sous-populations cellulaires (« petites », « moyennes » et « grandes » cellules), Fig. 2, caractéristiques de la lignée K562.
2.1.2. Etablissement d'une cinétique d'accumulation intracellulaire de l'Imatinib dans la lignée cellulaire K562 La veille de l'expérience, les cellules sont ensemencées à raison de 150 000 cellules/ml dans des flasques de 75 cm , ce qui permet d'obtenir le jour de l'expérience des cellules vivantes et pour la plupart actives. Le traitement par l'Imatinib Mésylate est réalisé en introduisant directement dans chaque flasque une fraction d'une solution mère d'Imatinib Mésylate solubilisé dans l'eau. Différentes concentrations ont ainsi été testées (5/10 et 50μM).
A chaque temps, un millilitre de suspension cellulaire est prélevé et directement placé dans la glace, permettant de bloquer le métabolisme cellulaire et de diminuer au maximum l'activité des pompes membranaires. La cinétique de pénétration de l'Imatinib Mésylate est ainsi établie en mesurant, à chaque temps (To, 15min, 30min, Ih, 2h et 4h), la quantité de lumière émise dans l'UV par des cellules témoins et des cellules traitées (Fig. 3-5).
2.2. Etablir une relation de proportionnalité entre les unités de fluorescence et la concentration d'Imatinib et standardiser la technique Nous avons tout d'abord standardisé les réglages du cytomètre en flux pour évaluer la fluorescence UV liée à la présence de la molécule cible dans les mêmes conditions quelles que soient les cellules et le moment de l'expérience. La méthode choisie est l'utilisation de billes de latex calibrées pour la fluorescence dans l'UV. En analysant systématiquement les billes et en réglant le cytomètre pour que leur intensité de fluorescence soit identique d'une expérience à l'autre, nous nous affranchissons des variations liées à la technique. A partir des valeurs de fluorescence obtenues au temps Ih (plateau), nous pouvons établir une courbe représentant les valeurs de fluorescence en fonction de la concentration en Imatinib initialement déposée dans le milieu de culture (Fig. 6). En parallèle, un nombre précis de cellules, préalablement incubé en présence d'une concentration définie d'Imatinib durant 30 minutes, est recueilli, lavé avec du PBS pour éliminer l'excès d'Imatinib et lysé. L'Imatinib intracellulaire est ensuite extrait à partir du lysat cellulaire en utilisant un solvant approprié, et dosé par HPLC. Ces valeurs permettent d'établir une droite de corrélation entre la dose et la quantité intracellulaire d'Imatinib (voir point 3). Cette droite de corrélation servira de référence pour les dosages intracellulaires d'Imatinib des cellules des patients.
3. Etablissement d'une corrélation Fluorescence additionnelle-quantité d'IMatinib Intracellulaire (IMIC)
Afin d'établir une correspondance entre fluorescence additionnelle et quantité d'IMIC (exprimée en pg/cellule), différents types cellulaires (lignées LMC, cellules primaires normales et cellules primaires LMC) ont été incubés en présence de différentes concentrations (OμM=contrôle, lμM, 5μM, 50μM) d'imatinib pendant Ih à 37°C. L 'imatinib présent dans le milieu est éliminé par un premier lavage des cellules avec 30ml de milieu de culture, puis 50ml de PBS- 1% BSA. Le culot cellulaire est ensuite repris dans ImI de PBS-1% BSA. Dans ces conditions les éventuelles traces résiduelles d'imatinib dans le milieu sont négligeables et ne peuvent modifier le résultat de l'analyse intracellulaire. Puis 150μL de suspension cellulaire sont prélevés et analysés par cytométrie en flux, afin de mesurer la fluorescence additionnelle. Après l'étude de la numération et l'étude de la viabilité, le reste de la suspension cellulaire est centrifugé, et les cellules sont congelées à -800C sous forme d'un culot sec. La quantité d'imatinib présente dans les cellules est ensuite déterminée par la technique de dosage classique après lyse cellulaire. Une corrélation entre la fluorescence additionnelle et la concentration intracellulaire en imatinib est ensuite établie. Un coefficient de corrélation 1^=0,8098 a été obtenu. La droite de corrélation entre la mesure de la fluorescence de l' Imatinib et la concentration intracellulaire est représentée à la figure 7. 4. Validation du procédé sur la lignée cellulaire K562
Afin de standardiser les résultats, toutes les expériences ont été réalisées à partir de cellules K562 ensemencées à 50 000 cellules/ml (densité permettant une croissance exponentielle). L'imatinib a été dissous dans de l'eau distillée (solution stock à 1OmM). La cinétique d'accumulation de l'imatinib (figure 8A) dans les cellules K562 montre une accumulation rapide de cet ITK. Après seulement 5 minutes d'incubation, le taux d'IMIC est d'environ 0,5 et 1,8 pg/cellule, pour des concentrations extracellulaires de 5 et 50 μM, respectivement. Au bout de 30 minutes, et quelle que soit la concentration extracellulaire en imatinib, le taux d'IMIC reste stable au cours du temps (environ 2,5 pg/cellule pour 50 μM). Ce profil nous a permis de choisir d'incuber les cellules pendant 1 heure (phase plateau) pour étudier la relation existant entre concentration extracellulaire et quantité intracellulaire. Ainsi, l'incubation des cellules Ih en présence de doses croissantes d'imatinib (figure 8B) a montré une corrélation linéaire entre le taux d'IMIC et la dose extracellulaire, pour des concentrations variant de 0.2 à 50μM. En présence de concentrations extracellulaires en imatinib plus élevées (50 à lOOμM), nous observons une phase plateau avec un taux d'IMIC stable à environ 4pg/cellule. Toutes les expériences réalisées sur la lignée cellulaire K562 ont montré une accumulation de type dose réponse ainsi qu'une une bonne reproductibilité des résultats obtenus (faibles écart-types).
5. Détermination des conditions pré-analytiques
Avant d'appliquer notre technique sur des cellules primaires normales et des cellules de patients atteints de LMC, nous avons défini les conditions pré-analytiques les plus appropriées, notamment concernant l'anticoagulant et la température. L'EDTA provoque une augmentation de signal non spécifique (figure 9A) ainsi qu'une diminution de l'accumulation de l'imatinib (figure 9B), ce qui pourrait gêner les résultats de mesure de la quantité d'IMIC au sein des cellules des patients et des tests fonctionnels. Il est probable que la chélation de cations par l'EDTA modifie l'activité des pompes membranaires et, par conséquent, l'influx et l'efflux de l'imatinib. Ainsi, les échantillons sont de préférence collectés sur héparinate de lithium.
Dans un second temps, afin de déterminer la température la plus appropriée pour le transport des échantillons sanguins, nous avons incubé les cellules primaires avec l'imatinib pendant 1 heure à 37°C. Les cellules ont ensuite été lavées, puis placées dans un milieu sans imatinib, et le taux d'IMIC a été suivi pendant deux heures. Les résultats présentés sur la figure 9C montrent que l'efflux de l'imatinib est plus important à 37°C qu'à température ambiante (RT) ou à 4°C (ce qui pourrait être du à l'activité des pompes d'efflux). Même si la différence entre les résultats obtenus à RT et à 4°C n'est pas significative, nous avons choisi de garder les échantillons à 4°C jusqu'à l'analyse afin d'être aussi proche que possible du taux d'IMIC in vivo. Nous avons également vérifié que le taux d'IMIC reste stable pendant 24 heures (données non présentées).
6. Application du procédé aux cellules primaires
6. a. Cellules primaires normales
La cinétique d'accumulation de l'imatinib dans les cellules normales du sang périphérique a ensuite été évaluée. Le profil observé est similaire à celui obtenu avec la lignée K562 (figure 10). Cependant, l'accumulation de l'imatinib dans les granulocytes normaux est apparemment plus élevée que dans les cellules K562. En effet, le taux maximum d'IMIC (obtenu après 30 minutes d'incubation), est d'environ 6,5 pg/cellule pour cellules primaires en présence de 50 μM d'imatinib, alors qu'il n'est pas supérieur à 2,7 pg/cellule pour la lignée K562. Les données de 8 volontaires sains ont été regroupées, et les profils obtenus pour chacun des témoins sont similaires et relativement homogènes. Concernant les lymphocytes et les monocytes, les cinétiques obtenues sont identiques à celle des PNN. Toutefois, nous avons noté que le taux d'IMIC est dépendant de la morphologie des cellules, avec des taux plus faibles dans les petites cellules (données non présentées). Cette relation entre le taux d'ITK intracellulaire et le volume cellulaire a également été évoquée par Hatziiercmia S et al, Exp Hematol. 2009;37(6):692-700).
6.b. Cellules primaires de patients atteints de LMC
Une fois notre procédé validé sur la lignée K562 puis sur les cellules primaires normales, nous avons réalisé une étude pilote avec les cellules de patients atteints de LMC, au diagnostic, et avant tout traitement par Glivec®. Les résultats obtenus ont montré une accumulation plus lente que dans les polynucléaires normaux, avec une tendance à accumuler l'imatinib de façon continue (figure 11). D'autre part, les résultats obtenus sont plus hétérogènes que ceux obtenus avec les cellules normales. L'étude de la relation dose extracellulaire/quantité intracellulaire après Ih d'incubation à 37°C avec l'imatinib révèle une relation linéaire entre le taux d'IMIC et l'ensemble des concentrations extracellulaires, suggérant qu'il n'existe peut-être pas de saturation du système d'import de l'imatinib. D'autre part, nous observons une hétérogénéité plus importante que celle observée avec les cellules normales. Une analyse préliminaire des résultats semble mettre en évidence plusieurs groupes de patients (figure 12): Deux patients ont eu une très faible accumulation, certains se situent autour de la médiane et d'autres semblent accumuler l'imatinib de façon plus rapide et plus importante.
6. c. Cellules souches CD34+
Enfin, il a été montré à plusieurs reprises que les cellules souches (CS) de LMC étaient beaucoup moins sensibles à l'imatinib que les cellules matures, et que la persistance de ces cellules pouvait conduite à une rechute après l'arrêt du traitement par ITK. Cependant, il est possible que la réponse des CS de LMC soit variable (quelques patients sont en rémission). Pour cette raison nous avons également évalué le taux d'IMIC dans les sous populations de cellules LMC CD34+, CD34+CD38" et CD34+CD38+ au moment du diagnostic, ainsi que dans les cellules normales. Nos précédents résultats ont montré un taux d'IMIC dépendant de la morphologie des cellules. Les cellules souches étant morphologiquement proches des lymphocytes et des monocytes, nous attendions un taux d'IMIC proche de celui observé dans ces cellules. Comme le montre la figure 13, l'IMIC des cellules CD34 est de l'ordre de celui des lymphocytes dans les cellules normales. Par contre, concernant les cellules souches de LMC, nous avons noté un taux d'IMIC plus faible dans les cellules CD34+CD38" .Ces résultats sont en accord avec ceux présentés au congrès ASH 2008 par le groupe de T. Hughes, et récemment publiés (Engler JR et al., Leukemia 2010, on Une). Ces résultats sont encore préliminaires. Exemple 2 : Application du procédé selon l'invention aux ITKs de 2eme génération : Nilotinib (Tasigna®) et Dasatinib (Sprycel®)
Le procédé selon l'invention est également applicable aux ITKs de 2eme génération comme le nilotinib et le dasatinib. En effet, comme cela est montré aux figures 14 et 15, il est possible de détecter la fluorescence de ces ITKs et d'étudier la pénétration de ces molécules dans les cellules. Il est donc possible de mesurer la concentration intracellulaire de ces ITKs avec le procédé selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes de : mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré avec les spectres d'émission et d'absorption de ladite molécule d'intérêt, cette valeur de fluorescence étant reportée sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt.
2. Procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à l'étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt, (3) établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt dans un modèle cellulaire.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape (3) comprend les sous- étapes suivantes :
(a) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2),
(b) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, (c) mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt pour chaque concentration, (d) mesurer l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence l'intensité de fluorescence liée à la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (a), l'intensité de fluorescence résiduelle étant alors proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule,
(e) corréler chaque valeur de concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt mesurée en (c) à l'intensité de fluorescence résiduelle correspondante mesurée en (d), et tracer la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt.
4. Procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes :
(A) établir, pour un modèle cellulaire incubé avec différentes concentrations de molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, une première droite de corrélation ou DCl entre l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire mesurée à l'aide d'un cytomètre en flux et la concentration correspondante de ladite molécule d'intérêt dans le milieu de culture du modèle cellulaire, et
(B) établir une deuxième droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la concentration correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape (A) comprend les sous étapes suivantes :
(1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt,
(2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à la sous étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt dans les cellules,
(3) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2), (4) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt,
(5) mesurer l'intensité de fluorescence brute (IFB) des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence brute la valeur de fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (3), l'intensité de fluorescence obtenue correspondant à une fluorescence additionnelle (IFA) proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (6) corréler l'intensité de fluorescence additionnelle (IFA) obtenue mesurée en (5) à la valeur correspondante de concentration de ladite molécule dans le milieu de culture et tracer une droite de corrélation ou DCl entre l'intensité de fluorescence et la concentration de ladite molécule dans le milieu de culture dudit modèle cellulaire, et l'étape (B) comprend les sous étapes suivantes :
(a) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, dans les mêmes conditions qu'à l'étape (A)(4),
(b) récupérer les cellules à chaque concentration, puis les laver et les compter,
(c) constituer un culot cellulaire contenant un nombre fixe de cellules, (d) lyser les cellules dudit culot puis mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt dans le lysat cellulaire,
(e) extraire la molécule d'intérêt du lysat cellulaire à l'aide d'un solvant approprié,
(f) quantifier ladite molécule d'intérêt,
(g) corréler les intensités de fluorescence additionnelles mesurées à l'étape (A)(5) et les quantités intracellulaires mesurées à partir du lysat cellulaire à l'étape (B)(f), et tracer une droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la quantité correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt est établie selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2-5.
7. Procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente susceptible d'être utilisée dans une méthode de traitement dudit patient, comprenant une étape consistant à mesurer in vitro la cinétique d'accumulation intracellulaire de la molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient au cours du temps pour différentes concentrations de molécule d'intérêt, la mesure de la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt étant réalisée selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6.
8. Procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, ledit patient étant en cours de traitement par ladite molécule d'intérêt, comprenant une étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6, l'absence de molécule d'intérêt dans les cellules dudit échantillon ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un paramètre indicatif de résistance du patient à ladite molécule d'intérêt, la présence de molécule d'intérêt dans les cellules dudit échantillon dans une quantité supérieure à une concentration maximale seuil étant quant à elle un paramètre indicatif de toxicité ou d'un effet secondaire de ladite molécule d'intérêt.
9. Procédé de suivi d'un patient traité par une molécule d'intérêt fluorescente comprenant les étapes suivantes : (1) mesurer, à différentes phases du traitement, la quantité intracellulaire de la molécule d'intérêt dans des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient à l'aide du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou
6, et
(2) comparer les taux intracellulaire de la molécule d'intérêt aux différentes phases du traitement.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7-9, caractérisé en ce que ledit patient est un patient atteint d'une leucémie myéloïde chronique (LMC).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 6, 7-10, caractérisé en ce qu'il est associé, de manière simultanée, séparée ou séquentielle, à un procédé consistant à mesurer le taux plasmatique de ladite molécule d'intérêt.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce que lesdites cellules dont on mesure la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente sont des cellules d'un échantillon obtenu chez un patient atteint d'une leucémie myéloïde chronique (LMC).
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente est un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK).
14. Procédé pour déterminer, chez un patient atteint d'une LMC, la sensibilité de ladite LMC à un ITK, comprenant les étapes suivantes :
(1) incuber in vitro des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient avec différentes concentrations dudit ITK, et
(2) mesurer à l'aide d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6 la quantité intracellulaire en ITK présente dans les cellules incubées en (1), l'absence dudit ITK dans les cellules ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un indice de résistance du patient audit ITK, la présence dudit ITK au-delà de ladite concentration minimale seuil étant indicative d'une sensibilité de la LMC audit ITK.
15. Procédé de suivi d'un patient atteint de LMC et traité par un ITK, comprenant les étapes suivantes : (1) mesurer, avant le début du traitement, la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, cette valeur correspondant à la fluorescence non spécifique des cellules de l'échantillon étudiée,
(2) mesurer à différentes phases du traitement la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, lesdites cellules dudit échantillon étant cytologiquement équivalentes aux cellules de l'échantillon obtenu en (1),
(3) soustraire à la valeur de fluorescence mesurée en (2) la valeur de fluorescence non spécifique mesurée en (1) et obtenir une valeur de fluorescence résiduelle,
(4) reporter la valeur de fluorescence résiduelle obtenue en (3) sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence induite par ledit ITK et la quantité dudit ITK dans les cellules, ladite droite ayant été obtenue selon un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2-5, et lire la quantité intracellulaire en ITK à chaque phase du traitement.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce la quantification de l'ITK intra-cellulaire est associée à une mesure du taux plasmatique d'ITK et/ou à une évaluation de l'expression et/ou de l'activité des pompes membranaires.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13-16, caractérisé en ce que l'ITK est l'Imatinib ou un de ses sels pharmaceutiquement actifs.
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