[go: up one dir, main page]

WO2010104128A1 - ｐＨ応答性リポソーム - Google Patents

ｐＨ応答性リポソーム Download PDF

Info

Publication number
WO2010104128A1
WO2010104128A1 PCT/JP2010/054042 JP2010054042W WO2010104128A1 WO 2010104128 A1 WO2010104128 A1 WO 2010104128A1 JP 2010054042 W JP2010054042 W JP 2010054042W WO 2010104128 A1 WO2010104128 A1 WO 2010104128A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liposome
responsive
group
amphiphilic molecule
dispersion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2010/054042
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
武岡　真司
洋輔 小幡
識 中川
大坪　真也
祐治 川▲崎▼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bionanosheeter Co Ltd
Original Assignee
Bionanosheeter Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bionanosheeter Co Ltd filed Critical Bionanosheeter Co Ltd
Priority to EP10750881.4A priority Critical patent/EP2407158A4/en
Priority to US13/255,231 priority patent/US8871252B2/en
Publication of WO2010104128A1 publication Critical patent/WO2010104128A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid

Definitions

  • the present invention relates to a pH-responsive liposome capable of controlling the retention and release of a target substance by changing the pH environment. More specifically, the present invention relates to a pH-responsive liposome capable of holding a target substance in an acidic pH environment and releasing the target substance in a basic pH environment.
  • PH responsiveness is widely used as a method for encapsulating a target substance in a molecular assembly such as a liposome and controlling its release.
  • liposomes using phosphatidylethanolamine-type phospholipids are known (for example, D. Papahadjopoulos et al. Biochemistry, 24 (1985) 3091-3098 (Non-patent Document 1), D. H. Thompson et al. Langmuir, 19 ( 2003) 6408-6415 (see Non-Patent Document 2)).
  • This utilizes the property that the aggregate structure of phosphatidylethanolamine type phospholipid changes in response to pH and the membrane permeability of the target substance changes.
  • liposomes containing Dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) are limited to release of inclusions in an acidic environment (pH 5 or lower).
  • a liposome in which an anionic lipid and a cationic lipid are mixed is known (see G. Shi et al., Journal of Controlled Release 80 (2002) 309-319). .
  • this document does not describe release of inclusions from liposomes in a basic pH environment.
  • Didecyldimethylammonium bromide (DDAB) having a quaternary amino group is used as a component, and inclusion release control using ionization of amino groups is not assumed.
  • DDAB Didecyldimethylammonium bromide
  • conventionally known cationic lipids have a high cytotoxicity and are not suitable for administration to the human body.
  • liposomes containing amphiphilic molecules having a zwitterionic functional group in the hydrophilic portion as constituent lipids retain the target substance in the inner aqueous phase under a physiological pH environment, and are acidic. It has been found that the target substance is released under a pH environment (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-210953 (Patent Document 1), International Publication No. 2008/143339 (Patent Document 2)). However, a pH-responsive molecular assembly that retains a target substance in an acidic pH environment and releases the target substance in a basic pH environment has not been obtained so far.
  • a pH-responsive molecular assembly capable of holding a target substance in an acidic pH environment and releasing the target substance in a basic pH environment has not been known so far. If a pH-responsive molecular assembly having such a target substance release behavior can be obtained, the use of the pH-responsive liposome preparation is expected to be further expanded.
  • the present inventors have used a cationic amphiphilic molecule and at least one of an anionic amphiphilic molecule and an amphoteric amphiphilic molecule as a constituent lipid.
  • the liposome containing is dispersed in an aqueous medium, the liposome has a positive zeta potential in an acidic pH environment, and the liposome has a negative zeta potential in a basic pH environment.
  • the zeta potential is changed from plus to minus as the pH of the dispersion is increased, the retained target substance is found to be released, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following pH-responsive liposome and production method thereof.
  • a liposome comprising a cationic amphiphilic molecule and at least one of an anionic amphiphilic molecule and an amphoteric amphiphilic molecule, when the liposome is dispersed in an aqueous medium, A pH-responsive liposome having a positive zeta potential in an acidic environment where the pH of the dispersion is less than 6.5, and a negative zeta potential in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or more. .
  • the target substance is held in an acidic environment where the pH of the dispersion is less than 6.5, and the target substance is released in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or more.
  • the cationic amphiphilic molecule is contained in an amount of 5 to 95 mol% with respect to the total number of constituent lipids of the liposome, and the anionic amphiphilic molecule and the amphoteric amphiphilic molecule are constituted in the liposome.
  • the pH-responsive liposome according to [1] or [2] which contains 5 to 95 mol% in total with respect to the total number of moles of lipids.
  • the pH of the liposome dispersion has a positive zeta potential in an acidic environment of less than 6.5, and the pH has a negative zeta potential in a basic environment of 8.5 or more.
  • Responsive liposomes can be provided.
  • the pH-responsive liposome of the present invention can hold a target substance in an acidic pH environment and release the target substance in a basic pH environment.
  • the pH-responsive liposome of the present invention comprises a cationic amphiphilic molecule and at least one of an anionic amphiphilic molecule and an amphoteric amphiphilic molecule, and when dispersed in an aqueous medium, the dispersion It has a positive zeta potential in an acidic environment where the pH of the liquid is less than 6.5, and has a negative zeta potential in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or higher.
  • the zeta potential changes from positive to negative as the pH increases in the range where the pH of the dispersion is 6.5 or more and less than 8.5.
  • the zeta potential changes from positive to negative with increasing pH in the range where the pH of the dispersion is 7.0 or more and less than 8.0.
  • the cationic amphiphilic molecule used in the present invention is not particularly limited as long as it is an amphiphilic molecule having a cationic functional group in the hydrophilic portion.
  • the cationic amphiphilic molecule is easily ionized in an acidic environment where the pH of the dispersion is less than 6.5, and is difficult to ionize in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or more. It preferably contains a group.
  • an acidic environment where the pH of the dispersion is less than 6.5 90% or more of the cationic functional groups contained in the membrane components are ionized, and in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or more.
  • 50% or less of the cationic functional groups contained in the membrane component are ionized are preferable.
  • the “cationic functional group” is not particularly limited as long as it is a group that exhibits a cationic property in an aqueous solution.
  • those derived from amino acids are preferable, and amino groups, guanidino groups are particularly preferable.
  • Groups, imidazole groups and derivatives thereof are preferred.
  • a hydrogen atom contained in an amino group, a guanidino group or an imidazole group is a lower alkyl group (methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl etc.), an aminoalkyl group (amino Methyl, aminoethyl, aminopropyl, aminobutyl, etc.) or corresponding oligoaminoalkyl group, hydroxyl group, hydroxyalkyl group (hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl etc.), oligooxyalkyl group (oligooxymethyl group, oligooxyethyl) Group, oligooxypropyl etc.) and the like.
  • the number of substituents is not particularly limited.
  • the number of the cationic functional group contained in the cationic amphiphilic molecule is not particularly limited, and may be one or more, but is preferably one or two because of easy availability of raw materials. .
  • the cationic amphiphilic molecule includes a plurality of cationic functional groups, they may be the same or different.
  • Cationic amphiphilic molecules include general formulas (Ia) to (Ic) [Wherein, R 1 is each independently a hydrocarbon group having a cationic functional group derived from an amino acid, R 2 and R 3 are each independently a chain hydrocarbon group, and A 1 And A 2 are each independently a linking group selected from the group consisting of —COO—, —OCO—, —CONH—, and NHCO—, and p is each independently an integer of 2 to 4 M is an integer from 1 to 14, and k is an integer from 1 to 250. ] It is preferable to use the compound shown by these.
  • the compounds represented by the above formulas (Ia) to (Ic) are easy to procure and synthesize raw materials and have high liposome forming ability, the target substance can be stably retained in the inner aqueous phase.
  • the compound is highly biodegradable and the degradation product is an amino acid or a derivative thereof, or a long-chain alcohol, it has an advantage of low toxicity.
  • each R 1 is independently a hydrocarbon group having a cationic functional group derived from an amino acid.
  • R 1 may have at least one cationic functional group, but preferably has two or more cationic functional groups.
  • a compound having two or more cationic functional groups is preferred in that it has a strong electrostatic interaction with living tissue or cells in a physiological environment.
  • the combination of the cationic substituents is not particularly limited.
  • R 1 is preferably a group represented by any of the following formulas (a), (b), or (c).
  • R 2 and R 3 are each independently a chain hydrocarbon group.
  • the “chain hydrocarbon group” is not particularly limited as long as it is a hydrophobic group that can be covalently introduced into the bonding group A 1 or A 2 .
  • the chain hydrocarbon group may be either a straight chain or a branched chain, but is preferably a straight chain.
  • the number of carbon atoms in the main chain of the chain hydrocarbon group is preferably 12-30, and more preferably 12-22. When such a chain hydrocarbon group has an unsaturated bond such as a double bond or a triple bond, the number is preferably 1 to 4.
  • As the main chain of the chain hydrocarbon group an alkyl chain, an alkenyl chain or an alkynyl chain is preferable, and an alkyl chain is more preferable.
  • the chain hydrocarbon group may have a substituent selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an isoprenoid group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, and a mercapto group.
  • the alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group. And a hexyl group.
  • alkenyl group an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and examples thereof include a vinyl group, an allyl group, a propenyl group, an isopropenyl group, and 2-butenyl.
  • the alkynyl group is preferably an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include an ethynyl group, a propynyl group, and a butynyl group.
  • R 2 and R 3 are preferably an alkyl chain having 12 to 22 carbon atoms, which may have a substituent.
  • a 1 and A 2 are each independently a linking group selected from the group consisting of —COO—, —OCO—, —CONH—, and NHCO—.
  • the combination of A 1 and A 2 is not particularly limited, but it is preferable that both A 1 and A 2 are —COO— because raw materials are easily available.
  • each p is independently an integer of 2 to 4. It is preferable that p is 2 to 4 in that the chain hydrocarbon group of the compound of the formula (I) can be oriented substantially perpendicular to the plane of the film in the bimolecular film.
  • p is 2 to 4 since the hydrophilic-hydrophobic interface of the bilayer formed by aggregation of cationic amphiphilic molecules in an aqueous solution is stable and easily forms an endoplasmic reticulum structure, In addition, the effect of stabilizing the dispersed state can be expected.
  • glutamic acid or a derivative thereof can be used as a raw material, which is more preferable in terms of low cost and low toxicity.
  • m is an integer of 1 to 14.
  • m is preferably 1 to 11, more preferably 1 to 8, and still more preferably 1 to 5.
  • k is an integer of 1 to 250. k is more preferably 1 to 120, and further preferably 1 to 10.
  • n is each independently an integer of 7 to 21
  • m is an integer of 1 to 14
  • k is an integer of 1 to 250.
  • the compounds represented by the above formulas (Ia) to (Ic) can be produced by a simple method by combining known reactions.
  • a 11 and A 12 are each independently a carboxyl group, a hydroxyl group, or an amino group, and n is an integer of 2 to 4.
  • WO 2006/118327 pamphlet For details of the production method, refer to WO 2006/118327 pamphlet.
  • the cationic amphiphilic molecules can be used alone or in combination of two or more.
  • the cationic amphiphilic molecule used in the present invention preferably contains at least one selected from the group of compounds represented by the following formula. [In the formula, n is each independently an integer of 8 to 22, m is an integer of 1 to 14, and k is an integer of 1 to 250. ]
  • n is preferably 11 to 21, more preferably 11 to 17, and still more preferably 13 to 17.
  • m is preferably 1 to 11, more preferably 1 to 8, and still more preferably 1 to 5.
  • k is preferably 1 to 250, more preferably 1 to 120, and still more preferably 1 to 10.
  • the content of the cationic amphiphilic molecule is preferably 5 mol% or more, more preferably 10 mol% or more, more preferably 30 mol% or more with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the liposome. Is more preferable. Moreover, 95 mol% or less is preferable, 80 mol% or less is more preferable, 50 mol% or less is more preferable, 30 mol% or less is especially preferable.
  • the anionic amphiphilic molecule used in the present invention is not particularly limited as long as it is an amphiphilic molecule having an anionic functional group in the hydrophilic portion.
  • the “anionic functional group” is not particularly limited as long as it is anionic in an aqueous solution under a basic pH environment.
  • such an anionic functional group is preferably a carboxyl group and a phosphate group.
  • anionic amphiphilic molecules include diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylinositol, diacylphosphatidylserine, fatty acids, carboxylic acid type amphiphilic molecules, anionic amino acid type amphiphilic molecules, and the like.
  • Anionic amphiphilic molecules may be used singly or in combination of two or more.
  • amphoteric amphiphilic molecule used in the present invention is not particularly limited as long as it is an amphiphilic molecule having both a cationic functional group and an anionic functional group in the hydrophilic portion.
  • amphoteric amphiphilic molecule the general formula (II) [Wherein q and r are each independently an integer of 1 to 4, Ra is one NH 3 + , the other Ra are all hydrogen atoms, and Rb and Rc are each independently a carbon number] 8-22 chain hydrocarbon groups] Is preferably used.
  • q and r are preferably each independently 2 or 3.
  • One Ra is NH 3 + and the other Ra are all hydrogen atoms, but the third or fourth carbon Ra from the terminal carboxyl group is NH 3 + and the other Ra is hydrogen.
  • An atom is preferred. More specifically, in formula (II), q is 3, r is 3, Ra of the fourth carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other Ra is H.
  • Zwitterionic amphiphilic molecule q is 2, r is 3, Ra of the third carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other R is H
  • q Preferred is a zwitterionic amphiphilic molecule in which R is 2, r is 2, Ra of the third carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and other Ra is H.
  • Rb and Rc are each independently a chain hydrocarbon group having 8 to 22 carbon atoms.
  • the “chain hydrocarbon group” is not particularly limited as long as it is a hydrophobic group that can be introduced by a covalent bond.
  • the chain hydrocarbon group may be linear or branched, and is preferably linear.
  • the chain hydrocarbon group may have a substituent selected from the group consisting of an alkyl chain, an alkenyl chain, an alkynyl chain, an isoprenoid chain, a vinyl group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, and a mercapto group. Good.
  • the chain hydrocarbon group preferably has 12 to 20 carbon atoms, more preferably 14 to 18 carbon atoms.
  • the chain hydrocarbon group may have an unsaturated bond such as a double bond or a triple bond, and in that case, the number is preferably 1 to 4.
  • Rb and Rc are preferably linear or branched alkyl groups having 12 to 20 carbon atoms, and particularly preferably linear alkyl groups having 14 to 18 carbon atoms.
  • the compound represented by the above formula (II) can be produced according to the method described in JP-A 2007-210953 or a method analogous thereto.
  • JP-A 2007-210953 for details of the manufacturing method, refer to Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-210953.
  • amphoteric amphiphilic molecules can be used alone or in combination of two or more.
  • an anionic amphiphilic molecule and an amphoteric amphiphilic molecule may be used in combination, or only one of them may be used.
  • the molecular assembly state constituting the liposome under a weakly basic environment changes.
  • the membrane permeability of the liposome can be changed, and the encapsulated target substance can be released.
  • the pH-responsive liposome of the present invention preferably contains at least one of an anionic amphiphilic molecule and an amphoteric amphiphilic molecule represented by the following formula as a constituent lipid. [In the formula, each n is independently an integer of 8 to 22.] ]
  • the content of the anionic amphiphilic molecule and the zwitterionic amphiphilic molecule is preferably 5 mol% or more in total with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the liposome. % Or more is more preferable, and 30 mol% or more is more preferable. Moreover, 95 mol% or less is preferable, 80 mol% or less is more preferable, 50 mol% or less is more preferable, 30 mol% or less is especially preferable.
  • the mixed molar ratio of the anionic amphiphilic molecule and the amphoteric amphiphilic molecule 10/1 to 1/10, preferably 5/1 to 1/5, more preferably 2/1 to 1/2.
  • the pH-responsive liposome of the present invention can further contain steroids.
  • steroids include all steroids having perhydrocyclopentanophenanthrene such as sterols, bile acids, provitamin D, steroid hormones and the like. Of these, sterols are preferably used. Examples of sterols include ergosterol and cholesterol. Of these, cholesterol molecules are preferred.
  • the content of steroids is not particularly limited, but is preferably 0.01 mol% or more, more preferably 0.05 mol% or more, more preferably 0.1 mol% or more with respect to the total number of moles of the constituent lipid of the liposome. More preferably, it is at least mol%.
  • Steroids can act as a stabilizer for molecular aggregates, and can be appropriately adjusted depending on the desired release rate and release rate. Steroids may be used singly or in combination of two or more.
  • the pH-responsive liposome of the present invention can further contain a polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecule.
  • the polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecule used in the present invention is not particularly limited as long as polyethylene glycol is bound to the hydrophilic portion of the amphiphilic molecule.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol part is preferably about 200 to 50,000, more preferably about 1,000 to 10,000.
  • polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecule for example, a compound represented by the following formula (III) is preferably used.
  • s is an integer of 3 to 250
  • t is an integer of 1 to 4
  • R 4 and R 5 are each independently a chain hydrocarbon group having 8 to 22 carbon atoms.
  • s may be selected so that the molecular weight of the polyethylene glycol moiety falls within the above range.
  • T is preferably 2 or 3.
  • Specific examples of the chain hydrocarbon group of R 4 and R 5 can include the same ones as exemplified for Ra and Rb in the formula (II).
  • polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecules By including a polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecule, aggregation of the liposome is suppressed, and the residence time in blood after administration in vivo can be increased.
  • Polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecules can be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the polyethylene glycol-bonded amphiphilic molecule is not particularly limited, but is preferably 0.1 mol% or more, based on the total number of moles of the constituent lipid of the liposome, 0.2 mol % Or more is more preferable, and 0.3 mol% or more is more preferable. Moreover, 50 mol% or less is preferable, 10 mol% or less is more preferable, and 5 mol% or less is further more preferable.
  • the pH-responsive liposome of the present invention includes, in addition to the above components, egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated egg yolk lecithin, hydrogenated soybean lecithin, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, sphingomyelin
  • egg yolk lecithin soybean lecithin
  • soybean lecithin hydrogenated egg yolk lecithin
  • soybean lecithin hydrogenated soybean lecithin
  • diacylphosphatidylcholine diacylphosphatidylethanolamine
  • sphingomyelin One kind or two or more kinds of phospholipids known as constituent lipids of liposomes such as various glycolipids may be contained.
  • the production method of the pH-responsive liposome of the present invention is not particularly limited, and can be produced according to a known method.
  • a mixed lipid powder or thin film containing a cationic amphiphilic molecule, at least one of an anionic amphiphilic molecule and an amphoteric amphiphilic molecule, and other optional components was hydrated and dispersed.
  • pH-responsive liposomes can be obtained using high-pressure extrusion (extrusion), ultrasonic irradiation, stirring (vortex mixing, homogenizer), high-speed stirring, French press, freeze-thaw, microfluidizer, etc. Can be manufactured.
  • pH-responsive liposomes can be produced by injecting a solution obtained by dissolving the above-described mixed lipid in an organic solvent into the aqueous phase and then removing the organic solvent such as ethanol or ether by decompression or dialysis.
  • the above mixed lipids are dispersed in an aqueous phase together with a nonionic surfactant such as sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, Triton® X, octyl glycoside or lauryl ether to form an emulsion, which is removed by dialysis and responsive to pH.
  • a nonionic surfactant such as sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, Triton® X, octyl glycoside or lauryl ether to form an emulsion, which is removed by dialysis and responsive to pH.
  • Liposomes can also be produced.
  • pH-responsive liposomes may be produced by employing a reverse phase e
  • the pH-responsive liposome of the present invention thus obtained has a positive zeta potential in an acidic environment where the pH of the liposome dispersion is less than 6.5, and in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or more. Can have a negative zeta potential. That is, in the pH-responsive liposome of the present invention, the pH of the liposome-dispersed liquid is in the range of 6.5 or more and less than 8.5, and the zeta potential of the pH-responsive liposome changes from positive to negative as the pH increases.
  • the pH of the liposome dispersion liquid is in the range of 7.0 or more and less than 8.0, and the zeta potential of the pH-responsive liposome changes from positive to negative as the pH increases.
  • the pH-responsive liposome of the present invention exhibits such behavior in response to a change in pH, so that the pH of the liposome dispersion is under an acidic environment of less than 6.5.
  • the target substance can be retained and the target substance can be released in a basic environment where the pH of the dispersion is 8.5 or more.
  • the pH-responsive liposome of the present invention retains the target substance when the pH of the dispersion is less than 7.0, and the target substance when the pH of the dispersion is 8.0 or more. Can be released.
  • “holding the target substance” means that the target substance is held in the aqueous phase of the liposome in a water-dispersed state, but some (preferably less than 10%) target substance. Release may be observed.
  • the release rate after 1 hour is preferably less than 10%, more preferably less than 5%.
  • the calcein release rate is obtained by the following equation.
  • releasing the target substance means that the target substance is preferably released 10% or more within one hour by changing the pH of the outer water phase.
  • the calcein release rate determined by the above formula is preferably 10% or more, and more preferably 20% or more.
  • the method for retaining the target substance in the liposome may be appropriately selected according to the type of the target substance.
  • the target substance when the target substance is a water-soluble drug, it can be prepared by dissolving the drug in the aqueous phase at the time of liposome production. The water-soluble drug that has not been retained can be separated from the liposome that retains the target substance by gel filtration, ultracentrifugation, or ultrafiltration membrane treatment.
  • the target substance is formed in the hydrophobic part of the bilayer vesicle. Can be held.
  • the target substance can be retained in the liposome by the same method, or the target substance can be localized on the outer surface of the bilayer vesicle.
  • the pH-responsive liposome of the present invention has a positive zeta potential under an acidic pH environment and a negative zeta potential under a basic pH environment when dispersed in an aqueous medium. Response behavior can be shown.
  • liposomes composed of DPPC / chol / PEG-Glu2C 18 showed a negative zeta potential at all pHs.
  • the liposome of Phytopresome composition used as a control also showed a negative zeta potential at all pHs.
  • Both liposomes had a low zeta potential at pH 7.4 or higher. This is presumably because the anionic ionization tendency of the polar head of the hydrophilic part of the phospholipid became stronger as the pH increased.
  • the pH-responsive liposome of the present invention comprising DPPC / Lys-Glu2C 16 / PA / chol / PEG-Glu2C 18 or DPPC / Lys-Glu2C 16 / CHEMS / PEG-Glu2C 18 has a pH value of 7.4 or 7.5 or less.
  • a positive zeta potential was exhibited, and when the pH became higher than those values, the zeta potential changed to a negative value. It is considered that the change in zeta potential from plus to minus accompanying this increase in pH is a phenomenon accompanying deprotonation of Lys-Glu2C 16 contained in the membrane component. It was also shown that the change behavior of the zeta potential varies depending on the type of anionic lipid.
  • the liposome composed of DPPC / chol / PEG-Glu2C 18 did not release calcein at all pHs. In addition, no change in the release behavior due to pH was observed for the Phytopresome composition liposome used as a control. However, since about 40% of calcein release was observed at all pHs, it was a membrane with low encapsulation stability.
  • liposomes composed of DPPC / Lys-Glu2C 16 / PA / chol / PEG-Glu2C 18 or DPPC / Lys-Glu2C 16 / CHEMS / PEG-Glu2C 18 have a calcein release rate of less than 10% at pH 6.5.
  • calcein release was promoted as pH increased.
  • the release rate of calcein was about 10% at pH 7.0, about 35% at pH 8.0, and 60% at pH 9.0 for DPPC / Lys-Glu2C 16 / PA / chol / PEG-Glu2C 18 .
  • the pH was 20% at pH 7.0, about 40% at pH 8.0, and 60% at pH 9.0. Since there is no change in particle size due to pH change, it is considered that calcein release increases membrane permeability along with changes in liposome zeta potential and facilitates the release of calcein.
  • liposomes consisting of DPPC / Lys-Glu2C 16 / CHEMS / PEG-Glu2C 18 are about 30% at pH 6.5, about 55% at pH 7.5, and pH 8.5 after 48 hours.
  • the release rate was 65%.
  • the release rate is about 40% at pH 6.5, about 65% at pH 7.5, and 80% at pH 8.5 after 48 hours.
  • the release rate was higher at each pH compared with the liposomes of DPPC / Lys-Glu2C 16 / CHEMS / PEG-Glu2C 18 . This is thought to be because palmitic acid (PA) is a single-chain lipid, so the molecular packing state of the bilayer membrane is poor and the membrane permeability is high.
  • PA palmitic acid
  • the pH-responsive liposome of the present invention is useful as a carrier for drugs, probes, nucleic acids, proteins, and the like, and has an unprecedented pH-responsive behavior, so that it is expected that the possibility of pH-responsive preparations will expand. Is done.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Abstract

　酸性ｐＨ環境下で目的物質を保持し、塩基性ｐＨ環境下で目的物質を放出することができるｐＨ応答性リポソームを提供する。　カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種とを構成脂質として含み、水性媒体中に分散させたとき、該分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でプラスのゼータ電位を有し、且つ、該分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でマイナスのゼータ電位を有するｐＨ応答性リポソームを用いる。

Description

ｐＨ応答性リポソーム
　本発明は、ｐＨ環境の変化によって目的物質の保持及び放出を制御することができるｐＨ応答性リポソームに関する。より詳しくは、本発明は、酸性ｐＨ環境下で目的物質を保持し、塩基性ｐＨ環境下で目的物質を放出しうるｐＨ応答性リポソームに関する。
　リポソームなどの分子集合体に目的物質を内包させ、その放出を制御する方法として、ｐＨ応答性が汎用されている。例えば、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質を用いたリポソームが知られている（例えば、D. Papahadjopoulosら Biochemistry, 24 (1985) 3091-3098（非特許文献１）、D. H. Thompsonら Langmuir, 19 (2003) 6408-6415（非特許文献２）参照）。これは、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質がｐＨに応答して、その集合構造が転移し、目的物質の膜透過性が変化する性質を利用したものである。しかし、Dioleoylphosphatidylethanolamine（DOPE)を含有するリポソームは、酸性環境（ｐＨ５以下）での内包物の放出に限られている。
　また、ｐＨ応答性リポソームとして、アニオン性脂質とカチオン性脂質とを混合したリポソームが知られている（G. Shiら、Journal of Controlled Release 80 (2002) 309-319（非特許文献３）参照）。しかし、この文献には、塩基性ｐＨ環境下でリポソームから内包物を放出したことについては記載されていない。また、構成成分として４級アミノ基を持つDidecyldimethylammonium bromide（DDAB）が使用されており、アミノ基のイオン化を利用した内包物の放出制御は想定されていない。また、従来知られていたカチオン性脂質は、細胞毒性が高く、人体に投与するには適さないという問題もある。
　本発明者らは、これまでに、親水部に両イオン性官能基を有する両親媒性分子を構成脂質として含むリポソームが、生理的なｐＨ環境下で目的物質を内水相に保持し、酸性ｐＨ環境下で目的物質を放出させることを見出した（特開２００７－２１０９５３号公報（特許文献１）、国際公開第２００８／１４３３３９号パンフレット（特許文献２）参照）。
　しかし、酸性ｐＨ環境下で目的物質を保持し、塩基性ｐＨ環境下で目的物質を放出させるｐＨ応答性分子集合体はこれまでに得られていない。
　ところで、近年、カチオン性脂質単独またはそれを含むリポソームを用いて、遺伝子と複合体を形成させることによって細胞内に遺伝子を導入する研究が行われている。本発明者らも、このような用途に適した細胞毒性が低く、合成が容易なアミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質を開発し、細胞内移行性の高い製剤が得られることを報告している（国際公開第２００６／１１８３２７号パンフレット（特許文献３）参照）。
特開２００７－２１０９５３号公報 国際公開第２００８／１４３３３９号パンフレット 国際公開第２００６／１１８３２７号パンフレット
D. Papahadjopoulosら Biochemistry, 24 (1985) 3091-3098 D. H. Thompsonら Langmuir, 19 (2003) 6408-6415 G. Shiら、Journal of Controlled Release 80 (2002) 309-319
　上記のとおり、酸性ｐＨ環境下で目的物質を保持し、塩基性ｐＨ環境下で目的物質を放出できるｐＨ応答性分子集合体はこれまでに知られていない。このような目的物質の放出挙動を有するｐＨ応答性分子集合体を得ることができれば、ｐＨ応答性リポソーム製剤の用途が一層広がるものと期待される。
　本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種とを構成脂質として含むリポソームを水性媒体中に分散させたとき、酸性ｐＨ環境下で、該リポソームがプラスのゼータ電位を有し、かつ、塩基性ｐＨ環境下で、該リポソームがマイナスのゼータ電位を有しており、該ゼータ電位が、該分散液のｐＨの増加に伴って、プラスからマイナスへと変化すると、保持していた目的物質が放出されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下に示したｐＨ応答性リポソーム及びその製造方法を提供するものである。
［１］カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種と、を含むリポソームであって、前記リポソームを水性媒体中に分散させたとき、前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でプラスのゼータ電位を有し、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でマイナスのゼータ電位を有する、ｐＨ応答性リポソーム。
［２］前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下で目的物質を保持し、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下で目的物質を放出するものである、［１］記載のｐＨ応答性リポソーム。
［３］前記カチオン性両親媒性分子を、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して５～９５モル％含み、前記アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子を、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して合計で５～９５モル％含むものである、［１］又は［２］記載のｐＨ応答性リポソーム。
［４］前記分散液のｐＨが７．０以上８．０未満の範囲で、前記ｐＨ応答性リポソームのゼータ電位がｐＨの増加とともにプラスからマイナスに変化するものである、［１］～［３］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
［５］前記ゼータ電位がプラスからマイナスに変化すると、保持していた目的物質を放出するものである、［１］～［４］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
［６］前記カチオン性両親媒性分子は、前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でイオン化し易く、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でイオン化し難い、カチオン性官能基を含むものである、［１］～［５］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
［７］前記カチオン性官能基は、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基及びこれらの誘導体からなる群より選ばれるものである、［６］記載のｐＨ応答性リポソーム。
［８］次式で示されるカチオン性両親媒性分子の少なくとも１種を構成脂質として含む、［１］～［７］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、ｎは、それぞれ独立して、８～２２の整数であり、ｍ又はｋは、それぞれ独立して、１～１４の整数である。］
［９］次式で示されるアニオン性両親媒性分子又は両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種を構成脂質として含む、［１］～［８］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、ｎは、それぞれ独立して、８～２２の整数である。］
［１０］コレステロール分子をリポソームの構成脂質の合計モル数に対して０．０１～３０モル％含むものである、［１］～［９］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
［１１］ポリエチレングリコール結合両親媒性分子をリポソームの構成脂質の合計モル数に対して０．１～５０モル％含むものである、［１］～［１０］のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
　本発明によれば、リポソームの分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でプラスのゼータ電位を有し、該ｐＨが８．５以上の塩基性環境下でマイナスのゼータ電位を有するｐＨ応答性リポソームを提供することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明のｐＨ応答性リポソームは、酸性ｐＨ環境下で目的物質を保持し、塩基性ｐＨ環境下で目的物質を放出させることができる。
実施例で得られたｐＨ応答性リポソームのゼータ電位の測定結果を示したグラフである。 実施例で得られたｐＨ応答性リポソームの粒子径の測定結果を示したグラフである。 実施例で得られたカルセイン内包リポソームにおけるカルセインの放出挙動を示したグラフである。 実施例で得られたカルセイン内包リポソームにおけるカルセインの経時的放出挙動を示したグラフである。 実施例で得られたクエン酸分散リポソームにおけるｐＨ変化挙動を示したグラフである。 実施例で得られたクエン酸分散リポソームにおける弱塩基性環境下でのリポソームからのクエン酸の放出挙動を示したグラフである。
　本発明のｐＨ応答性リポソーム及びその製造方法について以下に詳細に説明する。
　本発明のｐＨ応答性リポソームは、カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種とを含み、水性媒体中に分散させたとき、該分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でプラスのゼータ電位を有し、該分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でマイナスのゼータ電位を有するものである。すなわち、本発明のｐＨ応答性リポソームは、該分散液のｐＨが６．５以上８．５未満の範囲で、ｐＨの増加とともに、ゼータ電位がプラスからマイナスに変化するものである。本発明の好ましい態様では、本発明のｐＨ応答性リポソームは、該分散液のｐＨが７．０以上８．０未満の範囲で、ｐＨの増加とともに、ゼータ電位がプラスからマイナスに変化する。
　以下、本発明のｐＨ応答性リポソームの構成脂質及びｐＨ応答性リポソームの製造方法について説明する。
　（カチオン性両親媒性分子）
　本発明に用いられるカチオン性両親媒性分子は、カチオン性官能基を親水部に有する両親媒性分子であれば特に制限されない。カチオン性両親媒性分子は、前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でイオン化し易く、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でイオン化し難い、カチオン性官能基を含むものであることが好ましい。例えば、該分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下で、膜成分に含まれるカチオン性官能基の９０％以上がイオン化し、該分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下で、膜成分に含まれるカチオン性官能基の５０％以下がイオン化するものが好ましい。
　本明細書において、「カチオン性官能基」は、水溶液中でカチオン性を示す基であれば特に制限されないが、生体適合性の観点からは、アミノ酸由来のものが好ましく、特に、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基及びこれらの誘導体が好ましい。
　ここで「誘導体」としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基に含まれる水素原子が、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル等）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）又は対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が挙げられる。置換基の数は特に制限されない。
　カチオン性両親媒性分子に含まれるカチオン性官能基の数は、特に制限されなく、１個又は複数有していてもよいが、原料入手が容易であることから、１個又は２個が好ましい。カチオン性両親媒性分子にカチオン性官能基が複数含まれる場合、それらは同一でも異なっていてもよい。
　カチオン性両親媒性分子としては、一般式（I-a）～（I-c）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒ１は、それぞれ独立して、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ－、―ＣＯＮＨ－、及びＮＨＣＯ－からなる群から選択される結合基であり、ｐは、それぞれ独立して、２～４の整数であり、ｍは、１～１４の整数であり、ｋは、１～２５０の整数である。］
で示される化合物を用いることが好ましい。
　上記式（I-a）～（I-c）で表される化合物は、原料の調達及び合成が容易であり、リポソーム形成能が高いため、目的物質を安定にその内水相に保持することができる。また、該化合物は、生分解性が高く、分解物もアミノ酸またはその誘導体、あるいは長鎖アルコールなどであるので低毒性であるといった利点もある。
　上記式中、Ｒ１は、それぞれ独立して、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基である。
　Ｒ１は、カチオン性官能基を少なくとも一つ有していればよいが、カチオン性官能基を二つ以上有していることが好ましい。特にカチオン性官能基を二つ以上有している化合物は、生理的環境下にて生体組織又は細胞への静電的な相互作用が強い点で好ましい。カチオン性置換基を二つ以上有している場合は、カチオン性置換基の組み合わせは特に制限されない。
　例えば、Ｒ１としては、次式（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかで表される基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基である。「鎖状炭化水素基」は、結合基Ａ１またはＡ２に共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に制限されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよいが、直鎖が好ましい。鎖状炭化水素基の主鎖の炭素数は、１２～３０が好ましく、１２～２２がより好ましい。このような鎖状炭化水素基に二重結合または三重結合などの不飽和結合がある場合、その数は１～４であることが好ましい。鎖状炭化水素基の主鎖としては、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖が好ましく、アルキル鎖がより好ましい。
　鎖状炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソプレノイド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、及びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。ここで、アルキル基としては、炭素数１～６のアルキル基が好ましく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。アルケニル基としては、炭素数１～６のアルケニル基が好ましく、例えば、ビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２－ブテニル等が挙げられる。アルキニル基としては、炭素数１～６のアルキニル基が好ましく、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
　これらの鎖状炭化水素基の中でも、Ｒ２及びＲ３としては、置換基を有していてもよい、炭素数１２～２２のアルキル鎖が好ましい。
　また、上記式中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ－、―ＣＯＮＨ－、及びＮＨＣＯ－からなる群から選択される結合基である。Ａ１及びＡ２の組み合わせは特に制限されないが、原料入手が容易であることから、Ａ１及びＡ２が、いずれも、－ＣＯＯ－であることが好ましい。
　上記式中、ｐは、それぞれ独立して、２～４の整数である。ｐが２～４であると、二分子膜中で式（I）の化合物の鎖状炭化水素基を膜平面に対して略垂直に配向させることができる点で好ましい。また、ｐが２～４であると、水溶液中でカチオン性両親媒性分子が集合して形成する二分子膜の親－疎水界面が安定であり小胞体構造を形成しやすいため、小胞体構造ならびに分散状態を安定化させる効果を期待できる。特に、ｐが２であると、グルタミン酸やその誘導体を原料にできるため、低価格や低毒性の点でより好ましい。
　上記式中、ｍは、１～１４の整数である。ｍは１～１１が好ましく、１～８がより好ましく、１～５がさらに好ましいい。
　また、上記式中、ｋは、１～２５０の整数である。ｋは１～１２０がより好ましく、１～１０がさらに好ましい。
　上記式（I-a）～（I-c）で示される化合物の具体例としては、次式で示される化合物を好ましく挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、ｎは、それぞれ独立して、７～２１の整数であり、ｍは、１～１４の整数であり、ｋは、１～２５０の整数である。］
　上記式（I-a）～（I-c）で示される化合物は、公知の反応を組み合わせることによって簡便な方法で製造することができる。例えば、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ａ１１及びＡ１２は、それぞれ独立して、カルボキシル基、水酸基、またはアミノ基であり、ｎは、２～４の整数である。］
を有する三官能性コア化合物に、鎖状炭化水素基の供給源及びカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源を順次反応させることによって製造することができる。なお、製造方法の詳細については、国際公開第２００６／１１８３２７号パンフレットを参照されたい。
　カチオン性両親媒性分子は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。
　本発明に用いられるカチオン性両親媒性分子としては、次式で示される化合物群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、ｎは、それぞれ独立して、８～２２の整数であり、ｍは、１～１４の整数であり、ｋは、１～２５０の整数である。］
　上記式中、ｎは、１１～２１が好ましく、１１～１７がより好ましく、１３～１７がさらに好ましい。ｍは、１～１１が好ましく、１～８がより好ましく、１～５がさらに好ましい。ｋは、１～２５０が好ましく、１～１２０がより好ましく、１～１０がさらに好ましい。
　本発明のｐＨ応答性リポソームにおいて、カチオン性両親媒性分子の含有量は、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して５モル％以上が好ましく、１０モル％以上がより好ましく、３０モル％以上がさらに好ましい。また、９５モル％以下が好ましく、８０モル％以下がより好ましく、５０モル％以下がさらに好ましく、３０モル％以下が特に好ましい。
　（アニオン性両親媒性分子）
　本発明に用いられるアニオン性両親媒性分子は、親水部にアニオン性官能基を有する両親媒性分子であれば特に制限されない。本発明において、「アニオン性官能基」は、水溶液中、塩基性ｐＨ環境下でアニオン性を示すものであれば特に制限されない。例えば、このようなアニオン性官能基としては、カルボキシル基及びリン酸基が好ましく挙げられる。 
　アニオン性両親媒性分子の具体例としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、脂肪酸、カルボン酸型両親媒性分子、アニオン性アミノ酸型両親媒性分子などが挙げられる。
　アニオン性両親媒性分子は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　（両イオン性両親媒性分子）
　本発明に用いられる両イオン性両親媒性分子は、親水部にカチオン性官能基及びアニオン性官能基を併有する両親媒性分子であれば特に制限されない。
　両イオン性両親媒性分子としては、一般式（II）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、ｑ、ｒはそれぞれ独立して１～４の整数であり、Ｒａは一つがＮＨ３ ＋であり、その他のＲａは全て水素原子であり、ＲｂおよびＲｃはそれぞれ独立して炭素数８～２２の鎖状炭化水素基である］
で表される化合物が好ましく用いられる。
　式（II）中、ｑ、ｒはそれぞれ独立して２または３であることが好ましい。また、Ｒａは一つがＮＨ３ ＋であり、その他のＲａは全て水素原子であるが、末端カルボキシル基から数えて３番目または４番目の炭素のＲａがＮＨ３ ＋であり、その他のＲａが水素原子であることが好ましい。より具体的には、式（II）中、ｑが３であり、ｒが３であり、末端カルボキシル炭素から数えて４番目の炭素のＲａがＮＨ３ ＋であり、その他のＲａがＨである両イオン性両親媒性分子；ｑが２あり、ｒが３であり、末端カルボキシル炭素から数えて３番目の炭素のＲａがＮＨ３ ＋であり、その他のＲがＨである両イオン性両親媒性分子；ｑが３であり、ｒが２であり、末端カルボキシル炭素から数えて４番目の炭素のＲａがＮＨ３ ＋であり、その他のＲａがＨである両イオン性両親媒性分子；ｑが２であり、ｒが２であり、末端カルボキシル炭素から数えて３番目の炭素のＲａがＮＨ３ ＋であり、その他のＲａがＨである両イオン性両親媒性分子が好ましく挙げられる。
　ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立して、炭素数８～２２の鎖状炭化水素基である。「鎖状炭化水素基」は共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に制限されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよく、直鎖であることが好ましい。また、鎖状炭化水素基は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、イソプレノイド鎖、ビニル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。鎖状炭化水素基の炭素数は、好ましくは１２～２０であり、より好ましくは１４～１８である。また、鎖状炭化水素基は二重結合や三重結合などの不飽和結合を有していてもよく、その場合にその数は１～４であることが好ましい。これらの中でも、ＲｂおよびＲｃとしては、直鎖または分岐鎖の炭素数１２～２０のアルキル基であることが好ましく、直鎖の炭素数１４～１８のアルキル基であることが特に好ましい。
　上記式（II）で表される化合物は、特開２００７－２１０９５３号公報に記載の方法またはそれに準じた方法に従って製造することができる。製造方法の詳細は、特開２００７－２１０９５３号公報を参照されたい。
　これらの両イオン性両親媒性分子は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。
　本発明においては、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子を組み合わせ用いてもよいし、これらのいずれか１種のみを用いてもよい。本発明においては、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子のいずれか少なくとも１種を構成脂質として含むことにより、弱塩基性環境下にてリポソームを構成する分子集合状態が変化してリポソームの膜透過性を変化させ、内包する目的物質を放出させることができる。
　中でも、本発明のｐＨ応答性リポソームは、次式で示されるアニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種を構成脂質として含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、ｎは、それぞれ独立して、８～２２の整数である。］
　　これらの化合物は公知であり、Cholesteryl hemisuccinate(CHEMS)並びにHexacosanoic acid (式中n:24)はSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)から容易に入手できる。
　本発明のｐＨ応答性リポソームにおいて、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の含有量は、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して合計で５モル％以上が好ましく、１０モル％以上がより好ましく、３０モル％以上がさらに好ましい。また、９５モル％以下が好ましく、８０モル％以下がより好ましく、５０モル％以下がさらに好ましく、３０モル％以下が特に好ましい。
　アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子を組み合わせて用いる場合、アニオン性両親媒性分子と両イオン性両親媒性分子の混合モル比（アニオン性両親媒性分子/両イオン性両親媒性分子）は、１０/１～１/１０が好ましく、５/１～１/５がより好ましく、２/１～１/２がさらに好ましい
　本発明のｐＨ応答性リポソームは、ステロイド類をさらに含むことができる。ステロイド類としては、ステロール、胆汁酸、プロビタミンＤ、ステロイドホルモンなど、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられる。中でもステロール類を用いることが好ましい。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられる。中でもコレステロール分子が好ましい。
　ステロイド類の含有量は、特に制限されるものではないが、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して、０．０１モル％以上が好ましく、０．０５モル％以上がより好ましく、０．１モル％以上がさらに好ましい。また、３０モル％以下が好ましく、１０モル％以下がより好ましく、５モル％以下がさらに好ましい。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができ、所望の放出速度および放出率などによって適宜調整することができる。ステロイド類は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　また、本発明のｐＨ応答性リポソームは、ポリエチレングリコール結合両親媒性分子をさらに含むことができる。本発明に用いられるポリエチレングリコール結合両親媒性分子は、両親媒性分子の親水部にポリエチレングリコールが結合したものであれば特に制限されない。ポリエチレングリコール部の分子量は、２００～５万程度であることが好ましく、１０００～１万程度であることがより好ましい。
　ポリエチレングリコール結合両親媒性分子としては、例えば、次式（III）で示される化合物が好ましく用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、ｓは、３～２５０の整数であり、ｔは１～４の整数であり、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して炭素数８～２２の鎖状炭化水素基である。］
　上記式（III）中、ｓは、ポリエチレングリコール部の分子量が上記の範囲になるように選択すればよい。また、ｔは、２または３であることが好ましい。Ｒ４及びＲ５の鎖状炭化水素基の具体例は、式（II）のＲａ及びＲｂで例示したものと同じものを挙げることができる。
　ポリエチレングリコール結合両親媒性分子を含むことにより、リポソームの凝集が抑制され、生体内に投与した後の血中滞留時間を増大させることができる。ポリエチレングリコール結合両親媒性分子は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。
　本発明において、ポリエチレングリコール結合両親媒性分子の含有量は、特に制限されるものではないが、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して、０．１モル％以上が好ましく、０．２モル％以上がより好ましく、０．３モル％以上がさらに好ましい。また、５０モル％以下が好ましく、１０モル％以下がより好ましく、５モル％以下がさらに好ましい。
　本発明のｐＨ応答性リポソームは、上記成分のほか、本発明の目的を損なわない範囲で、　卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質などのリポソームの構成脂質として知られているリン脂質を１種または２種以上含んでもよい。
　本発明のｐＨ応答性リポソームの製造方法は特に制限されるものではなく、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種と、その他の任意成分とを含む混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、高速攪拌法、フレンチプレス法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などを用いて、ｐＨ応答性リポソームを製造することができる。あるいは、上記混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールまたはエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去してｐＨ応答性リポソームを製造することもできる。また、上記混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X、オクチルグリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去してｐＨ応答性リポソームを製造することもできる。その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用してｐＨ応答性リポソームを製造してもよい。
　こうして得られる本発明のｐＨ応答性リポソームは、リポソーム分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でプラスのゼータ電位を有し、該分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でマイナスのゼータ電位を有することができる。すなわち、本発明のｐＨ応答性リポソームは、リポソーム分散液のｐＨが６．５以上８．５未満の範囲で、ｐＨ応答性リポソームのゼータ電位がｐＨの増加とともにプラスからマイナスに変化する。より好ましくは、本発明のｐＨ応答性リポソームは、リポソーム分散液のｐＨが７．０以上８．０未満の範囲で、ｐＨ応答性リポソームのゼータ電位がｐＨの増加とともにプラスからマイナスに変化する。
　本発明の好ましい態様によれば、本発明のｐＨ応答性リポソームは、表面電荷がｐＨ変化に応答してこのような挙動をもつために、リポソーム分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下で目的物質を保持し、該分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下で目的物質を放出することができる。本発明のさらに好ましい態様によれば、本発明のｐＨ応答性リポソームは、前記分散液のｐＨが７．０未満で目的物質を保持し、前記分散液のｐＨが８．０以上で目的物質を放出することができる。
　なお、本明細書において「目的物質を保持する」というときは、水分散状態でリポソーム内水相に目的物質が保持されていることを意味するが、多少（好ましくは１０％未満）の目的物質の放出が認められてもよい。例えば、蛍光物質であるカルセインを用いた場合、１時間後の放出率は１０％未満であることが好ましく、５％未満であることがより好ましい。なお、カルセインの放出率は次式で求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　また、「目的物質を放出する」というときは、外水相のｐＨを変えて１時間以内に目的物質を好ましく１０％以上放出することを意味する。例えば、上記式で求められるカルセインの放出率は１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましい。
　リポソームに目的物質を保持させる方法は、目的物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば目的物質が水溶性薬物の場合には、リポソーム製造時に薬物を水相に溶解させて調製することができる。保持されなかった水溶性薬物はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより目的物質を保持したリポソームと分離できる。他方、脂溶性薬物の場合には、混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で薬物を混合して、上述した方法でリポソームを形成することにより、例えば二分子膜小胞体の疎水部に目的物質を保持させることができる。プローブ、核酸、タンパク質などの場合は同様の方法でリポソームに目的物質を保持させるか、あるいは二分子膜小胞体の外側表面上に目的物質を局在させることができる。
　本発明のｐＨ応答性リポソームは、水性媒体に分散させたとき、酸性ｐＨ環境下でプラスのゼータ電位を有し、かつ、塩基性ｐＨ環境下でマイナスのゼータ電位を有するといった、従来にないｐＨ応答挙動を示すことができる。本発明のｐＨ応答性リポソームに目的物質を保持させることによって、ｐＨ応答性製剤の用途が広がるものと期待される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより制限されるものではない。
［１］混合脂質の調製
　表１に示した各混合脂質をt-ブチルアルコールに溶解した後、凍結乾燥し、混合脂質粉末を調製した。カチオン性両親媒性分子として1,5-Dihexadecyl N-lysyl-L-glutamate (Lys-Glu2C16)、アニオン性両親媒性分子としてCholesteryl Hemisuccinate (CHEMS)又はパルミチン酸(PA)を用いた。PEG5000-GLu2C18の修飾量は、総脂質の0.3mol%とした。用いた脂質の化学構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［２］リポソームの調製
　各混合脂質20 mgを20 mMリン酸緩衝液（1 mL, pH6.5）に分散し、6時間攪拌後、高圧押出法（最終孔径0.22μm）にて粒子径200‐300 nmのリポソームを調製した。調製したリポソームの脂質濃度は、リポソーム分散液中のDPPC濃度より算出した。
［３］ゼータ電位の測定
調製したリポソーム（10μL, [lipid]=10 mg/ml）を20 mM Tris-buffer 990μl（pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0）に添加し、終濃度[lipid]=1 mg/mLとして37℃におけるゼータ電位測定を行った(Marvern Zetasizer)。その結果を図１に示す。
　図１に示されるように、DPPC/chol/PEG-Glu2C18からなるリポソームは、すべてのpHでマイナスのゼータ電位を示した。また、コントロールとして用いたPhytopresome組成のリポソームも同様に、すべてのpHでマイナスのゼータ電位を示した。両リポソーム共に、pH7.4以上でゼータ電位が小さくなった。これは、pHの上昇と共にリン脂質の親水部の極性頭部のアニオン性イオン化傾向が強まったためであると考えられる。
　一方、DPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18又はDPPC/Lys-Glu2C16/CHEMS/PEG-Glu2C18からなる本発明のｐＨ応答性リポソームは、pH値が7.4または7.5以下でプラスのゼータ電位を示し、それらの値よりもpHが高くなるとゼータ電位がマイナスの値に変化した。このpH上昇に伴うゼータ電位のプラスからマイナスへの変化は、膜成分に含有するLys-Glu2C16の脱プロトン化に伴う現象であると考察される。またアニオン性脂質の種類によってゼータ電位の変化挙動が異なることが示された。
［４］粒子径の測定
　調製したリポソーム（10μL, [lipid]=10 mg/ml）を20 mM Tris-buffer 990μl（pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0）にそれぞれ添加し、終濃度を[lipid]=1 mg/mLとして粒子径測定を、動的光散乱法を用いて測定した(BECKMAN COULTER N4 PLUS)。その結果を図２に示す。
　図２に示されるとおり、調製した4種のリポソームの粒子径は200-300 nm程度であり、測定したすべてpHにおける粒子径の変化は見られず、pH変化に対して安定であった。従って、各pHにおけるリポソームの粒子径はpH6.5で調製した時の粒子径にほぼ一致しており変化していなかった。
［５］カルセイン内包リポソームの調製
　4種類の混合脂質20 mgに1 mMのカルセイン水溶液(2 mL, pH6.5)を添加し、6時間水和攪拌を行った。その後エクストルージョン法(最終孔径: 0.22μm)により粒子径約200 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルろ過(Sephadex G-75)にて除去した。
［６］カルセインの放出挙動
　調製した4種類のカルセイン内包リポソーム（[lipid]=1 mg/mL, 30μL）を570μLの20 mM Tris-buffer（pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0）に添加し、37oCで1時間静置した。その混合液100μLを1.9 mLの20 mM Tris-buffer（pH6.5）にて希釈し蛍光測定（λex: 490 nm, λem: 520 nm）を行った。カルセインの放出率は以下の式にて算出した。その結果を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　図３に示されるとおり、DPPC/chol/PEG-Glu2C18からなるリポソームは、すべてのpHでカルセインの放出は認められなかった。また、コントロールとして用いたPhytopresome組成のリポソームについてもpHによる放出挙動の変化は認められなかった。しかしすべてのpHで40%程度のカルセイン放出が観察されたことから、内包安定性が低い膜であった。
一方、DPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18又はDPPC/Lys-Glu2C16/CHEMS/PEG-Glu2C18からなるリポソームでは、pH6.5でのカルセイン放出率は10%未満であるのに対し、pH上昇に伴いカルセインの放出が促進した。カルセインの放出率は、DPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18では、pH7.0で約10%、pH8.0で約35%、pH9.0で60%であった。またDPPC/Lys-Glu2C16/CHEMS/PEG-Glu2C18のリポソームでは、pH7.0で20%、pH8.0で約40%、pH9.0で60%であった。pH変化による粒子径の変化がないことから、カルセインの放出はリポソームのゼータ電位変化に伴って膜透過性が増し、カルセインが放出しやすくなったと考察される。またDPPC/cholesterol/PEG-Glu2C18からなるリポソームではカルセイン放出が起きないことから、内包カルセインの放出にはゼータ電位がプラスからマイナスに変化して二分子膜を構成する脂質分子の充填状態が変化する挙動が必要であることが明らかとなった。
［７］カルセインの経時的放出挙動
　次に、pH6.5、pH7.5、pH8.0におけるカルセインの放出速度に関する評価を行った。調製したそれぞれのカルセイン内包リポソーム（[lipid]=1 mg/mL, 30μL）を570μLの20 mM Tris-buffer（pH 6.5, 7.5, 8.5）に添加し、37℃で混合した。各pHにおける所定時間経過後の放出率は、次式により算出した。その結果を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
　図４に示されるとおり、DPPC/Lys-Glu2C16/CHEMS/PEG-Glu2C18からなるリポソームは、48時間後にpH6.5で約30%、pH7.5で約55%、さらにはpH8.5で65%の放出率であった。
　一方、DPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18では、48時間後にpH6.5で約40%、pH7.5で約65%、さらにはpH8.5で80%の放出率であったことから、DPPC/Lys-Glu2C16/CHEMS/PEG-Glu2C18のリポソームと比較して、各pHにおいて放出速度が高いことが示された。これはパルミチン酸（PA）が１本鎖の脂質であることから、二分子膜の分子充填状態が悪く膜透過性が高いためと考えられる。
［８］クエン酸分散リポソームの調製
　各混合脂質20 mgを20 mM クエン酸（pH2.2）に水和し、その後分散液をエクストルージョン法（最終孔径: 0.22μm）にて粒子径200-300 nmのリポソームを調製した。また必要に応じてこのリポソーム分散液（[lipid]=55 mg/mL, 10μL）又はクエン酸（20 mM, 10μL）を4 mLの300μM水酸化ナトリウム水溶液（pH10.5）に添加した直後からのpH変化挙動をpHメーターにて測定した。その結果を図５に示す。
　図５に示されるとおり、水酸化ナトリウム水溶液にクエン酸を添加すると、瞬時にpHが7.0に低下した。このpH変化はクエン酸と水酸化ナトリウムの中和反応であると考えられる。次に、DPPC/chol/PEG-Glu2C18リポソーム分散液を添加すると、徐々にpHが低下し6時間後にはpH7.7に変化した。Phytopresomeも同様のpH変化を示したが、滴下直後のpH低下はDPPC/cholesterol/PEG-Glu2C18よりも早かった。クエン酸のみを添加すると、pHが瞬時に低下したのに対し、リポソーム分散系ではpHが徐々に低下した。これはリポソーム内にあるクエン酸が外水相とのpH変化によるプロトンの濃度勾配によって漏出し、pHを低下させているためにpH変化は遅くなっていると考察できる。
　次に、DPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18からなるリポソームを添加すると、6時間後にpH7.5まで低下した。これはこのリポソームが外水相の弱塩基性環境に応答してクエン酸を放出するためにDPPC/cholesterol/PEG-Glu2C18やPhytopresomeよりも素早くpHが低下したものと考えられる。これらの結果から、pH変化に伴う内包クエン酸のリポソームからの放出挙動が示された。またDPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18リポソームが弱塩基性環境下で内包するクエン酸を放出しやすいことが示唆された。
［９］弱塩基性環境下でのリポソームからのクエン酸の放出挙動
　弱塩基性環境下でのリポソームからのクエン酸の放出挙動を検討した。まず、リポソーム分散クエン酸水散液（[lipid]=250μM, 4 mL）又はクエン酸水溶液（30 mM, pH2.2、4 mL）に2M 水酸化ナトリウム水溶液170μLを加え、混合液のpHを6.5に調製した。その後、300 mMの水酸化ナトリウム水溶液60μLを添加し、混合液のpHを7.5-8.5に変化させた。その後のpH変化挙動をpHメーターにて経時的に測定した。その結果を図６に示す。
　図６に示されるとおり、クエン酸のみでは瞬時にpHが低下し、pH7でほぼ一定の値を示した。次にコントロールリポソームDPPC/cholesterol/PEG-Glu2C18やPhytopresomeでは、混合液pHを6.5から8に調製してもpHの変化がほとんど起きなかった。これは内包しているクエン酸(30 mM, pH2.2)が30分ではほとんどしないことを示していた。
　他方、pH応答性リポソームDPPC/Lys-Glu2C16/PA/chol/PEG-Glu2C18では、pHが8.０となると混合液のpHが低下した。pH変化に伴い内包されていたクエン酸がリポソーム内水相から放出し、分散液のpHが制御されたものと考えられる。
　以上の結果より、リポソーム膜成分にカチオン性脂質;Lys-Glu2C16とアニオン性脂質; PAまたはCHEMSを用いると、リポソーム分散媒のpHが上昇した際にリポソームのゼータ電位がプラスからマイナスへの変化し、リポソーム分散状態を保持したままリポソームの膜透過性が上昇することがわかった。本発明によれば、内水相に蛍光物質やクエン酸などを内包させておくと、弱塩基性環境下で内包物を放出できることを示すことができた。
　本発明のｐＨ応答性リポソームは、薬物、プローブ、核酸及びタンパク質等の運搬体として有用であり、これまでにないｐＨ応答性挙動を有することから、ｐＨ応答性製剤の可能性が広がるものと期待される。

Claims (11)

  1. 　カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種と、を含むリポソームであって、前記リポソームを水性媒体中に分散させたとき、前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でプラスのゼータ電位を有し、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でマイナスのゼータ電位を有する、ｐＨ応答性リポソーム。
  2. 　前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下で目的物質を保持し、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下で目的物質を放出するものである、請求項１記載のｐＨ応答性リポソーム。
  3. 　前記カチオン性両親媒性分子を、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して５～９５モル％含み、前記アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子を、リポソームの構成脂質の合計モル数に対して合計で５～９５モル％含むものである、請求項１又は２記載のｐＨ応答性リポソーム。
  4. 　前記分散液のｐＨが７．０以上８．０未満の範囲で、前記ｐＨ応答性リポソームのゼータ電位がｐＨの増加とともにプラスからマイナスに変化するものである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
  5. 　前記ゼータ電位がプラスからマイナスに変化すると、保持していた目的物質を放出するものである、請求項１～４のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
  6. 　前記カチオン性両親媒性分子は、前記分散液のｐＨが６．５未満の酸性環境下でイオン化し易く、前記分散液のｐＨが８．５以上の塩基性環境下でイオン化し難い、カチオン性官能基を含むものである、請求項１～５のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
  7. 　前記カチオン性官能基は、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基及びこれらの誘導体からなる群より選ばれるものである、請求項６記載のｐＨ応答性リポソーム。
  8. 　次式で示されるカチオン性両親媒性分子の少なくとも１種を構成脂質として含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、ｎは、それぞれ独立して、８～２２の整数であり、ｍ又はｋは、それぞれ独立して、１～１４の整数である。］
  9. 　次式で示されるアニオン性両親媒性分子又は両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種を構成脂質として含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、ｎは、それぞれ独立して、８～２２の整数である。］
  10. 　コレステロール分子をリポソームの構成脂質の合計モル数に対して０．０１～３０モル％含むものである、請求項１～９のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
  11. 　ポリエチレングリコール結合両親媒性分子をリポソームの構成脂質の合計モル数に対して０．１～５０モル％含むものである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｐＨ応答性リポソーム。
PCT/JP2010/054042 2009-03-11 2010-03-10 ｐＨ応答性リポソーム Ceased WO2010104128A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10750881.4A EP2407158A4 (en) 2009-03-11 2010-03-10 LIPOSOME SENSITIVE TO PH
US13/255,231 US8871252B2 (en) 2009-03-11 2010-03-10 pH-responsive liposome

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009058063A JP5588619B2 (ja) 2009-03-11 2009-03-11 ｐＨ応答性リポソーム
JP2009-058063 2009-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010104128A1 true WO2010104128A1 (ja) 2010-09-16

Family

ID=42728416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/054042 Ceased WO2010104128A1 (ja) 2009-03-11 2010-03-10 ｐＨ応答性リポソーム

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8871252B2 (ja)
EP (1) EP2407158A4 (ja)
JP (1) JP5588619B2 (ja)
KR (1) KR20110128335A (ja)
WO (1) WO2010104128A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016010112A1 (ja) * 2014-07-17 2016-01-21 富士フイルム株式会社 イミダゾール化合物およびそれを含有するリポソーム
WO2018033883A3 (en) * 2016-08-18 2019-01-31 University Of Kwazulu Natal PH-SENSITIVE LIPIDS

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6462073B1 (ja) * 2017-09-04 2019-01-30 一丸ファルコス株式会社 ｐＨ感受性リポソームの製造方法
CN111132753B (zh) * 2017-09-04 2022-05-27 一丸自然美健有限公司 pH敏感性脂质体及其制造方法
JP6399530B1 (ja) * 2017-09-04 2018-10-03 一丸ファルコス株式会社 ｐＨ感受性リポソーム
JP7406057B2 (ja) 2021-03-03 2023-12-27 東洋ビューティ株式会社 外用微粒子カプセル製剤及び皮膚外用剤
CN119552796A (zh) * 2024-11-29 2025-03-04 艾美行动生物制药有限公司 一种用于细胞培养添加物包载的pH敏感脂质体及制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005526727A (ja) * 2002-02-19 2005-09-08 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト ｐＨ感受性カチオン脂質、それを含有するリポソーム及びナノカプセル
WO2006118327A1 (ja) 2005-04-27 2006-11-09 Oxygenix Co Ltd カチオン性アミノ酸型脂質
JP2007210953A (ja) 2006-02-09 2007-08-23 Oxygenix:Kk ｐＨ応答性分子集合体
WO2008143339A1 (ja) 2007-05-17 2008-11-27 Waseda University 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途
JP2009507876A (ja) * 2005-09-15 2009-02-26 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト 両性リポソームにおけるまたはそれに関する改善

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8382004B2 (en) * 2001-04-04 2013-02-26 Graftech International Holdings Inc. Flexible graphite flooring heat spreader
JP5093547B2 (ja) * 2001-08-24 2012-12-12 日本ケミカルリサーチ株式会社 両イオン性脂質およびその用途
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
ES2967961T3 (es) * 2004-05-03 2024-05-06 Ipsen Biopharm Ltd Liposomas útiles en la administración de fármacos
JP2008518998A (ja) * 2004-11-05 2008-06-05 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト 活性物質としてオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物におけるまたはそれに関する改善
EP1764089A1 (en) 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Serum stable liposomes comprising amphoter II lipid mixtures
US8367628B2 (en) * 2005-12-01 2013-02-05 Pronai Therapeutics, Inc. Amphoteric liposome formulation
EP2125031B1 (en) * 2006-12-19 2017-11-01 Marina Biotech, Inc. Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements
US20080145413A1 (en) * 2006-12-19 2008-06-19 Steffen Panzner Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements
JP5711535B2 (ja) 2007-10-12 2015-05-07 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド 中性脂質を含む両性リポソーム
WO2009051712A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-23 Pronai Therapeutics, Inc. Dnai amphoteric liposome formulation
US20100129430A1 (en) * 2008-11-24 2010-05-27 Stavroula Sofou Liposome drug carriers with ph-sensitivity

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005526727A (ja) * 2002-02-19 2005-09-08 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト ｐＨ感受性カチオン脂質、それを含有するリポソーム及びナノカプセル
WO2006118327A1 (ja) 2005-04-27 2006-11-09 Oxygenix Co Ltd カチオン性アミノ酸型脂質
JP2009507876A (ja) * 2005-09-15 2009-02-26 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト 両性リポソームにおけるまたはそれに関する改善
JP2007210953A (ja) 2006-02-09 2007-08-23 Oxygenix:Kk ｐＨ応答性分子集合体
WO2008143339A1 (ja) 2007-05-17 2008-11-27 Waseda University 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUDKER, V. ET AL.: "pH-sensitive, cationic liposomes: A new synthetic virus-like vector", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 14, 1996, pages 760 - 764, XP002937150 *
D. H. THOMPSON ET AL., LANGMUIR, vol. 19, 2003, pages 6408 - 6415
D. PAPAHADJOPOULOS ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 24, 1985, pages 3091 - 3098
G. SHI ET AL., JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 80, 2002, pages 309 - 319
SEBYAKIN, Y. L. ET AL., BIOLOGICHESKIE MEMBRANY, vol. 24, no. 3, 2007, pages 259 - 265, XP009171434 *
SEBYAKIN, Y. L. ET AL., RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, vol. 32, no. 5, 2006, pages 407 - 412, XP019406884 *
See also references of EP2407158A4 *
YOSUKE KOBATA ET AL.: "Symposium on Macromolecules Yokoshu", vol. 57, 2008, pages: 4942 - 4943, XP008171327 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016010112A1 (ja) * 2014-07-17 2016-01-21 富士フイルム株式会社 イミダゾール化合物およびそれを含有するリポソーム
JP2016023149A (ja) * 2014-07-17 2016-02-08 富士フイルム株式会社 イミダゾール化合物およびそれを含有するリポソーム
US9795566B2 (en) 2014-07-17 2017-10-24 Fujifilm Corporation Imidazole compound and liposome containing same
WO2018033883A3 (en) * 2016-08-18 2019-01-31 University Of Kwazulu Natal PH-SENSITIVE LIPIDS

Also Published As

Publication number Publication date
JP5588619B2 (ja) 2014-09-10
EP2407158A4 (en) 2013-09-04
EP2407158A1 (en) 2012-01-18
KR20110128335A (ko) 2011-11-29
US8871252B2 (en) 2014-10-28
JP2010209012A (ja) 2010-09-24
US20120064148A1 (en) 2012-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kumar et al. Nonionic surfactant vesicular systems for effective drug delivery—an overview
JP5588619B2 (ja) ｐＨ応答性リポソーム
JP5831588B2 (ja) リポソームの製造方法
Sheoran et al. Recent patents, formulation techniques, classification and characterization of liposomes
JP2020158542A (ja) リポソーム組成物および医薬組成物
JP7621657B2 (ja) リポソームの製造方法
JPWO2008120736A1 (ja) 薬物送達制御用経肺投与リポソーム
CN106456546A (zh) 用于黏膜递送的脂质体组合物
JP6230538B2 (ja) 安定なオキサリプラチン封入リポソーム水分散液及びその安定化方法
Patel et al. Niosome: a vesicular drug delivery tool
KR20200005541A (ko) 단층 리포좀에서 친수성 화합물의 고효율 캡슐화
Akter et al. Self-assembled potential bio nanocarriers for drug delivery
Koyra et al. Recent developments with pH-responsive lyotropic liquid crystalline lipid nanoparticles for targeted bioactive agent delivery
Reddy et al. Niosomes as nanocarrier systems: a review
ES2640060T3 (es) Proceso para producir una partícula fina revestida
Liang et al. Improving the physicochemical stability of soy phospholipid-stabilized emulsions loaded with lutein by the addition of sphingomyelin and cholesterol: Inspired by a milk fat globule membrane
JPH035426A (ja) 安定な電解質含有レシチン分散液
KR20230022415A (ko) 지질-중합체 조성물 및 사용 방법
JP2009132629A (ja) リポソーム製剤の製造方法
Xu et al. Preparation and characterization of stable pH-sensitive vesicles composed of α-tocopherol hemisuccinate
JPWO2005021012A1 (ja) ゲムシタビン封入薬剤担体
JP5253716B2 (ja) ｐＨ応答性分子集合体
JP6322733B2 (ja) 親水性領域において正の全電荷を示す両親媒性分子種ａおよび両親媒性分子種ｂおよびポリフェノールｃを含む分子混合物、該分子混合物の製造方法、ならびにその使用
WO2005123078A1 (ja) 水難溶性カンプトテシン含有リポソーム製剤
JP3128223B2 (ja) リポソーム

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10750881

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010750881

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117023505

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13255231

Country of ref document: US