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WO2010147138A1 - 脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子およびその用途 - Google Patents

脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子およびその用途 Download PDF

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WO2010147138A1
WO2010147138A1 PCT/JP2010/060186 JP2010060186W WO2010147138A1 WO 2010147138 A1 WO2010147138 A1 WO 2010147138A1 JP 2010060186 W JP2010060186 W JP 2010060186W WO 2010147138 A1 WO2010147138 A1 WO 2010147138A1
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WO
WIPO (PCT)
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fatty acid
lipid
seq
polynucleotide
amino acid
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2010/060186
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English (en)
French (fr)
Inventor
美佐 落合
昌 清水
英治 櫻谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Holdings Ltd filed Critical Suntory Holdings Ltd
Publication of WO2010147138A1 publication Critical patent/WO2010147138A1/ja
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a fatty acid chain length extending enzyme and its use.
  • Fatty acids are important components constituting lipids such as phospholipids and triacylglycerols.
  • malonyl CoA is decarboxylated by a series of reactions of condensation, reduction, dehydration, and reduction by fatty acid synthase (FAS), and the number of carbon atoms is increased by two.
  • FOS fatty acid synthase
  • Saturated fatty acids are synthesized. Saturated fatty acids having up to 16 or 18 carbon atoms can be biosynthesized by novel fatty acid synthesis.
  • the chain length of fatty acids is increased by increasing the number of carbons by two by decarboxylation of acyl CoA and malonyl CoA through a series of condensation, reduction, dehydration and reduction reactions. This reaction involves fatty acid chain length extension enzyme (ELO).
  • ELO fatty acid chain length extension enzyme
  • the gene encoding the fatty acid chain extender has been cloned from humans, mice, nematodes, microorganisms and the like.
  • Fatty acid chain-lengthening enzymes are classified according to the differences in the chain length specificity of the fatty acid used as a substrate and the number of unsaturated bonds and the specificity of the position, and can be broadly divided into two groups in the phylogenetic tree analysis of amino acid sequences.
  • One is a group using polyunsaturated fatty acids (PUFA) as a substrate, and the other is a group using saturated fatty acids (SFA) or monounsaturated fatty acids (MUFA) as a substrate
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • SFA saturated fatty acids
  • MUFA monounsaturated fatty acids
  • GLELO GeneBank AF206662
  • GLA highly unsaturated fatty acid ⁇ -linolenic acid
  • STA stearidonic acid
  • DGLA Dihomo- ⁇ -linolenic acid
  • ETA eicosatetraenoic acid
  • Patent literature 1 Special table 2002 -523098
  • MAELO GeneBank AF268031
  • ELO3 GenBank GP050836
  • the fourth is MALCE1 (GenBank DL184064), palmitic acid (16: 0), palmitoleic acid (16: 1 ⁇ 9), oleic acid (18: 1 ⁇ 9), linoleic acid (18: 2 ⁇ 9,12), ⁇ -linolene Acid (18: 3 ⁇ 9,12,15) has substrate specificity, and these fatty acids are converted to 18: 0, cis-bacsenic acid (18: 1 ⁇ 11), eicosenoic acid (2 carbon atoms added) 20: 1 ⁇ 11), eicosadienoic acid (20: 2 ⁇ 11,14), and eicosatrienoic acid (20: 3 ⁇ 11,14,17) (PTL 4: JP 2008-73030).
  • the identity of ELO3 and MALCE1 is 98.9%.
  • An EloA gene derived from a cellular slime mold, Dictyostelium discoideum, is known as a chain-lengthening enzyme that acts on palmitoleic acid to produce cis-bactenoic acid (Non-patent Document 1: Biochem Biophys Res). Commun. 2008 Sep 19; 374 (2): 226-30).
  • the EloA gene is shown to have an activity of acting on 16: 0, 16: 1 ⁇ 9 and 18: 1 ⁇ 11, and converting to 18: 0, 18: 1 ⁇ 11 and 20: 1 ⁇ 13, as a result of expression in yeast. .
  • Cis-vaccenic acid has a colon cancer cell growth inhibitory action (Non-patent Document 3: Cancer® Letters, 1995, Vol. 91, No. 1, pp .55 -61) and an oxidative stress inhibitory effect (Non-patent Document 4: American) Journal of Physiology, 1991, Vol.260, pp.L481-488) has been reported, and its health functions are attracting attention. It has also been reported that cis-vaccenic acid has an effect of promoting the growth of lactobacilli useful for improving the intestinal environment (Patent Document 5: JP-A-2006-262778).
  • M.M. It is required to identify a novel fatty acid chain length extension enzyme responsible for the fatty acid chain length extension reaction of lipid producing bacteria such as alpina and a gene encoding the same.
  • M. is a lipid-producing bacterium.
  • the present invention was completed by successfully cloning a fatty acid chain lengthenzyme gene responsible for the fatty acid chain lengthening reaction of alpina. That is, the present invention includes the following polynucleotides, proteins, expression vectors, transformants, methods for producing foods using the transformants, foods produced by such methods, and test lipid-producing bacteria. Provide an evaluation or selection method.
  • polynucleotide according to any one of the following groups selected from the group consisting of (a) to (e): (A) a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4; (B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (C) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 100 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added and having fatty acid chain length extending enzyme activity A polynucleotide; (D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having fatty acid chain extender activity; and (e) SEQ ID NO: A polynucleotide encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising
  • [6] A protein encoded by the polynucleotide according to any one of [1] to [5] above.
  • [6a] A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • [6b] A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted and / or added, and having fatty acid chain length extending enzyme activity.
  • [6c] A protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having fatty acid chain length extending enzyme activity.
  • [7] A vector containing the polynucleotide according to any one of [1] to [5] above.
  • [7a] The vector according to [7] above, comprising an expression cassette comprising the following components (a) to (c): (A) a promoter capable of being transcribed in a host cell; (B) the polynucleotide according to any one of the above [1] to [5] bound to the promoter, and (c) a signal that functions in a host cell with respect to transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule.
  • the host cell is a lipid-producing bacterium (for example, M. alpina) or yeast (for example, S. cerevisiae).
  • [8] A non-human transformant into which the polynucleotide according to any one of [1] to [5] is introduced.
  • [9] A non-human transformant into which the vector according to [7] is introduced.
  • [9a] A fatty acid composition containing a larger amount of fatty acids, particularly cis-vaccenic acid, than the host in which the vector according to [7] is not introduced by introducing the vector according to [7] above.
  • the transformant according to [9] above, wherein [10] The transformant according to [8] or [9] above, wherein the transformant is a lipid-producing bacterium.
  • [11] The transformant according to [10], wherein the lipid-producing bacterium is Mortierella alpina.
  • [12] A method for producing a lipid or fatty acid composition using the transformant according to any one of [8] to [11].
  • [13] A method for producing a food, pharmaceutical or industrial raw material using the transformant according to any one of [8] to [11].
  • [13a] The production method according to [13] above, wherein the food is a food containing fats and oils.
  • [14] A food, drug or industrial raw material produced by the method described in [13] above.
  • [14a] The food or industrial raw material according to [14] above, wherein the food is a food containing fats and oils.
  • [15] A method for evaluating the ability to extend the fatty acid chain length of a test lipid-producing bacterium, using a primer or probe designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4.
  • [15a] A method for selecting a lipid-producing bacterium having a high fatty acid chain length extension ability by the method of [15] above.
  • [15b] A method for producing fats and oils using the lipid-producing bacteria selected by the method described in [15a] above.
  • [16] The ability to extend the fatty acid chain length of the test lipid-producing bacterium by culturing the test lipid-producing bacterium and measuring the expression level of the fatty acid chain length extension enzyme gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 How to evaluate.
  • a test lipid-producing bacterium is evaluated by the method described in [16] above, and a lipid-producing bacterium having a high expression level of the fatty acid chain length extending enzyme gene is selected.
  • a method for selecting lipid-producing bacteria is selected by the method described in [16a] above.
  • Reference lipid production bacteria and test lipid production bacteria are cultured, and the expression level of each fatty acid chain elongation enzyme gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 is measured in each lipid production bacteria.
  • a method for selecting a lipid-producing bacterium, wherein a test lipid-producing bacterium in which the gene is expressed more highly than a bacterium is selected.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for transformation of lipid-producing bacteria (for example, M. alpina), yeast, plants, and the like, and thus obtained transformed lipid-producing bacteria, transformed yeast, or transformation Plants and the like can be used for the production of fatty acid compositions, foods, cosmetics, medicines, soaps and the like.
  • lipid-producing bacteria for example, M. alpina
  • yeast for example, yeast, plants, and the like
  • Plants and the like can be used for the production of fatty acid compositions, foods, cosmetics, medicines, soaps and the like.
  • the transformant of the present invention has a production efficiency of cis-bacsenic acid having a colon cancer cell growth inhibitory action, an oxidative stress inhibitory action, a lactobacillus growth promoting action useful for improving the intestinal environment, and the like. Is very good. Therefore, the present invention can be effectively used for the production of pharmaceuticals or health foods containing cis-vaccenic acid.
  • M. is a lipid-producing bacterium.
  • MALCE2 novel fatty acid chain length extension gene
  • M.M The base sequence of the genomic DNA of the fatty acid chain extender derived from alpina strain 1S-4 and the deduced amino acid sequence of the fatty acid chain extender were also obtained.
  • the ORF sequence of MALCE2, the deduced amino acid sequence of MALCE2, the CDS sequence of MALCE2 and the genomic sequence of MALCE2 are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • These polynucleotides and enzymes can be obtained by the techniques described in the examples below, known genetic engineering techniques, known synthetic techniques, and the like.
  • the present invention provides a polynucleotide according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (e).
  • a polynucleotide encoding a protein having (D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having fatty acid chain extender activity; and (e) SEQ ID NO:
  • a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • polynucleotide hybridizing under stringent conditions means, for example, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4, or the amino acid of SEQ ID NO: 2.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher identity can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
  • the above-described polynucleotide of the present invention can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • Protein of the present invention provides the following proteins.
  • [6] A protein encoded by the polynucleotide.
  • [6a] A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • [6b] A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted and / or added, and having fatty acid chain length extending enzyme activity.
  • [6c] A protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having fatty acid chain length extending enzyme activity.
  • the protein described in (6b) or (6c) above is typically a naturally occurring variant of the protein of SEQ ID NO: 2.
  • a protein having a fatty acid chain length extending enzyme activity consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted and / or added”.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-31, 1-3 29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1 19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1 1, 1 to 10, 1 to 9 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 Examples include proteins having an amino acid sequence in which ⁇ 2 or 1 amino acid residue is deleted, substituted, inserted and / or added, and having fatty acids
  • such a protein includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more. 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89 % Or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99 .2% or higher, 99.3% or higher, 99.4% or higher, 99.5% or higher, 99.6% or higher, 99.7% or higher, 99.8% or higher, or 99.9% or higher
  • the fatty acid chain length extending enzyme activity is, for example, a transformant introduced with a vector capable of expressing a polynucleotide encoding the enzyme and a vector that cannot be expressed (for example, an empty vector not containing the enzyme gene).
  • a vector capable of expressing a polynucleotide encoding the enzyme and a vector that cannot be expressed (for example, an empty vector not containing the enzyme gene).
  • the former contains a large amount of fatty acids having a large number of carbon atoms, it can be said that there is fatty acid chain length extension activity.
  • the enzyme has an activity of extending the fatty acid chain length against palmitoleic acid.
  • deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in one or more amino acid sequences in the same sequence It means that there are deletion, substitution, insertion and / or addition of amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. .
  • the vector of the present invention and a transformant incorporating the vector also provides, in another embodiment, an expression vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • the vector of the present invention usually contains (i) a promoter that can be transcribed in a host cell; (ii) the polynucleotide according to any one of (a) to (g) bound to the promoter; and (iii) Concerning transcription termination and polyadenylation of RNA molecules, it is constructed to include an expression cassette that contains as a component a signal that functions in the host cell.
  • the vector thus constructed is introduced into a host cell. Examples of suitable host cells used in the present invention include lipid producing bacteria, yeast and the like.
  • lipid-producing bacteria examples include MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265 (1992) can be used.
  • microorganisms belonging to the genus Mortierella such as Mortierella elongata IFO8570, Mortierella excigua (Mortierella exigua) IFO8571, Mortierella hygrophila IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC3221C, BSC3243, BSCC3430 .72, CBS 528.72
  • Microorganisms belonging to the subgenus Mortierella such as CBS 529.72, CBS 608.70, CBS 754.68, or Mortierella isabellina CBS 194.28, IFO 6336, IFO 7824, IFO 8873, IFO 8874, IFO 8874 IFO 7884, Mortierella nana IFO 8190, Mortierella ramaniana IFO 5426, IFO 8186, CBS
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, and the like.
  • These host cells transformed with the vector of the present invention can produce a fatty acid composition containing a larger amount of fatty acids having a larger number of carbons than host cells not transformed with the vector of the present invention.
  • a fatty acid composition containing a large amount of cis-vaccenic acid can be produced with high efficiency.
  • pDura5 Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004)
  • any of a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (YIp type) can be used.
  • YEp type vector J.R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983
  • YCp type as .Cp type.
  • YIp5 K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979
  • the promoter / terminator for regulating gene expression in the host cell may be any combination as long as it functions in the host cell.
  • the promoter of histon H4.1 gene when used in lipid-producing bacteria, the promoter of histon H4.1 gene, the promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene, and the like can be used.
  • Selection markers used for transformation include auxotrophic markers (ura5, niaD), drug resistance markers (hyromycin, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc).
  • cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (Ashigaki, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992, respectively; Hussain et al., Gene, 101, 149) , 1991) can be used.
  • lipid-producing bacteria As a host cell transformation method, a commonly known method can be used. For example, in the case of lipid-producing bacteria, electroporation method (Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000) or particle delivery method (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-287403 “Lipid producing bacteria” Can be used. In the case of yeast, electroporation method, spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)), lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, p163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Manual, etc., but is not limited thereto.
  • electroporation method Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ.
  • the host is inoculated in a Czapek-Dox medium and cultured at 28 ° C. for 2 weeks to form spores. Subsequently, the spores are collected, and the gene is introduced by a particle delivery method (a method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-287403 “Method of Breeding Lipid-Producing Bacteria”). Thereafter, a transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing an antibiotic or the like used as a selection marker, or on an agar medium lacking nutrients used as a marker when an auxotrophic marker is used.
  • the host is a standard nutrient medium (eg, YEPD medium “Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)”, etc.), and the value of OD 600 nm is 1-6.
  • YEPD medium “Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)”, etc.
  • OD 600 nm is 1-6.
  • the cultured cells are collected by centrifugation, washed and pretreated with alkali metal ions, preferably lithium ions, at a concentration of about 0.1 to 0.2M.
  • the cells are allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes, and then left at about 30 ° C. for about 60 minutes together with the DNA to be introduced (about 1 to 20 ⁇ g).
  • Polyethylene glycol preferably about 4,000 daltons, is added to a final concentration of about 20% to 50%.
  • the cells After standing at about 30 ° C. for about 30 minutes, the cells are heated at about 42 ° C. for about 5 minutes.
  • the cell suspension is washed with a standard nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes.
  • a transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing an antibiotic or the like used as a selection marker, or on an agar medium lacking nutrients used as a marker when an auxotrophic marker is used.
  • the present invention also provides a method for producing a lipid or fatty acid composition using the above transformed lipid-producing bacterium or yeast.
  • the “lipid” refers to a simple lipid containing a compound in which a fatty acid and an alcohol are ester-linked (for example, glyceride) or an analog thereof (for example, a cholesterol ester), a part of the simple lipid, and phosphoric acid.
  • ester-linked for example, glyceride
  • an analog thereof for example, a cholesterol ester
  • oil and fat refers to an ester (glyceride) of glycerol and a fatty acid.
  • fatty acid refers to an aliphatic monocarboxylic acid represented by the general formula RCOOH (R is an alkyl group) (a carboxylic acid having one carboxyl group and having carbon atoms linked in a chain).
  • RCOOH R is an alkyl group
  • Fatty acids include saturated fatty acids that do not have double bonds in the hydrocarbon chain and unsaturated fatty acids that contain double bonds.
  • the lipid or fatty acid composition of the present invention can be extracted from the cells transformed according to the present invention as follows.
  • cultured cells are obtained according to conventional methods such as centrifugation and filtration after completion of the culture.
  • the cells are thoroughly washed and preferably dried. Drying can be performed by freeze drying, air drying, or the like. If necessary, the dried cells are crushed by dynomill or ultrasonic waves, and then extracted with an organic solvent, preferably under a nitrogen stream.
  • organic solvent ether, hexane, methanol, ethanol, chloroform, dichloromethane, petroleum ether, or the like can be used, or by alternately extracting methanol and petroleum ether or extracting with a single solvent of chloroform-methanol-water. Good results can be obtained.
  • Fatty acid-containing lipids can be obtained by distilling off the organic solvent from the extract under reduced pressure.
  • separation of fatty acids from lipids containing the above fatty acids is performed by concentrating and separating in the state of mixed fatty acids or mixed fatty acid esters by a conventional method (for example, urea addition method, cooling separation method, column chromatography method, etc.). It can be carried out.
  • a conventional method for example, urea addition method, cooling separation method, column chromatography method, etc.
  • a lipid or fatty acid composition having a high content ratio of fatty acids having a high carbon number, particularly cis-vaccenic acid can be obtained. It is particularly useful when it is necessary to produce such fatty acid compositions in large quantities and / or efficiently.
  • the lipid or fatty acid composition thus obtained can be used in accordance with a conventional method, for example, for applications such as production of foods and oils containing fats and oils, industrial raw materials (raw materials such as cosmetics and soaps). More specifically, the transformant of the present invention has a production efficiency of cis-bacsenic acid having a colon cancer cell growth inhibitory action, an oxidative stress inhibitory action, a lactobacillus growth promoting action useful for improving the intestinal environment, and the like. Is very good.
  • the present invention can be effectively used for the manufacture of pharmaceuticals containing cis-bacsenic acid (for example, anticancer agents, oxidative stress inhibitors, etc.) or health foods (foods having an effect of promoting the growth of lactobacilli). .
  • cis-bacsenic acid for example, anticancer agents, oxidative stress inhibitors, etc.
  • health foods foods having an effect of promoting the growth of lactobacilli.
  • the present invention also provides a method for producing foods, cosmetics, pharmaceuticals, soaps and the like using the transformed lipid-producing bacterium or the transformed yeast of the present invention.
  • This method includes the step of producing lipid or fatty acid using the transformed lipid-producing bacterium or transformed yeast of the present invention.
  • Preparation of foods, cosmetics, medicines, soaps, and the like containing the produced lipids or fatty acids is according to a conventional method.
  • foods, cosmetics, medicines, soaps and the like produced by the production method of the present invention contain lipids or fatty acids produced using the transformed lipid-producing bacteria or transformed yeasts of the present invention.
  • the present invention further provides foods, cosmetics, medicines, soaps and the like produced by such methods.
  • the dosage form of the cosmetic (composition) or pharmaceutical (composition) of the present invention is not particularly limited, and can be any dosage form such as a solution, paste, gel, solid, or powder.
  • the cosmetic composition or pharmaceutical composition of the present invention includes oil, lotion, cream, emulsion, gel, shampoo, hair rinse, hair conditioner, enamel, foundation, lipstick, funny, pack, ointment, perfume, powder, eau de cologne.
  • Cosmetics such as toothpastes, soaps, aerosols, cleansing foams, or other external preparations for skin, anti-aging agents for skin aging, anti-inflammatory agents for skin inflammation, bath preparations, hair nourishing agents, skin cosmetics, sunscreen agents, or injuries, scratches, It can be used as an agent for improving and preventing rough skin caused by cracks.
  • the cosmetic composition of the present invention may further contain other fats and oils and / or dyes, fragrances, preservatives, surfactants, pigments, antioxidants and the like as necessary. These blending ratios can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose (for example, fats and oils in the composition are 1 to 99.99% by weight, preferably 5 to 99.99% by weight, more preferably 10 to 99.95% by weight).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain other pharmaceutically active ingredients (for example, anti-inflammatory ingredients) or auxiliary ingredients (for example, lubricating ingredients, carrier ingredients) as necessary.
  • moisturizers include acne agents, anti-dandruff / itching agents, antiperspirant deodorants, burn agents, anti-ticks / lice agents, keratin softeners, dry skin agents , Antiviral agents, transdermal absorption enhancers and the like.
  • acne agents include acne agents, anti-dandruff / itching agents, antiperspirant deodorants, burn agents, anti-ticks / lice agents, keratin softeners, dry skin agents , Antiviral agents, transdermal absorption enhancers and the like.
  • Examples of the food of the present invention include nutritional supplements, health foods, functional foods, infant foods, infant formulas, premature infant formulas, and elderly foods.
  • food is a generic term for solids, fluids, and liquids, and mixtures thereof that can be consumed.
  • Nutritional supplements refer to foods that are enriched with specific nutritional components. Healthy food means food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements, natural foods, diet foods, and the like.
  • Functional food means food for replenishing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use.
  • Infant food refers to food for children up to about 6 years old.
  • the food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food.
  • Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old.
  • Premature infant formula refers to formula that is given to premature infants until about 6 months after birth.
  • Examples of these food forms include meat, fish, nuts and other natural foods (treated with oils and fats), Chinese food, ramen, soups and other foods that add oils, tempura, fries, fried rice, fried rice, Foods using fats and oils as a heat medium such as donuts, sugar sugar, butters, margarines, mayonnaise, dressings, chocolates, instant ramen, caramels, biscuits, cookies, cakes, ice creams, etc. or processed foods with added fats during processing Examples include foods that are sprayed or coated with oils and fats during processing finishes such as oysters, hard biscuits and bread rolls. However, it is not limited to foods containing fats and oils.
  • bread, noodles, rice, confectionery (candy, chewing gum, gummi, tablet confectionery, Japanese confectionery), agricultural products such as tofu and processed products, sake, medicinal products Fermented foods such as liquor, mirin, vinegar, soy sauce, miso, livestock foods such as yogurt, ham, bacon, sausage, marine foods such as kamaboko, fried tempura, hampen, fruit juice drinks, soft drinks, sports drinks, alcoholic drinks, tea It may be.
  • the food of the present invention is also in the form of a pharmaceutical preparation such as a capsule, or a natural liquid food or semi-digested nutritional food in which the fat of the present invention is blended in protein, saccharide, fat, trace element, vitamins, emulsifier, fragrance, etc. , And processed forms such as component nutrient foods, drinks, enteral nutrients, and the like.
  • the present invention also provides (i) fatty acid chain length extension having a base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 in a method for evaluating a fatty acid-producing ability of a test lipid-producing bacterium of the present invention and a method for selecting a lipid-producing bacterium.
  • the genome of a test lipid-producing bacterium is prepared.
  • any known method such as a commercially available kit such as DNeasy plant kit (QIAGEN) can be used.
  • QIAGEN DNeasy plant kit
  • the primer or probe designed based on the nucleotide sequence of the fatty acid chain extender gene of SEQ ID NO: 1 or 4 the gene or its gene It is checked whether or not a specific sequence exists.
  • the primer or probe can be designed using a known method.
  • Detection of a gene or a specific sequence can be performed using a known technique.
  • a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used as one primer, and the upstream or downstream of this sequence is used as the other primer.
  • the nucleic acid of the lipid-producing bacterium is amplified by PCR, and the presence or absence of the amplified product, Measure molecular weight.
  • the number of bases of the polynucleotide used for the primer is usually 10 bp or more, preferably 15 to 25 bp. Further, the base number of the sandwiched portion is usually 300 to 2000 bp.
  • the reaction conditions for the PCR method are not particularly limited.
  • the denaturation temperature 90 to 98 ° C.
  • the annealing temperature 40 to 60 ° C.
  • the extension temperature 60 to 75 ° C.
  • the number of cycles 10 times or more should be used.
  • the obtained reaction product is separated by electrophoresis using an agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured.
  • the ability to extend the fatty acid chain length of the lipid-producing bacterium is predicted / evaluated depending on whether the molecular weight of the amplified product is large enough to include a specific portion of the DNA molecule.
  • the test lipid-producing bacterium is cultured, and the expression level of the fatty acid chain length extending enzyme gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 is measured to thereby obtain the fatty acid chain of the test lipid-producing bacterium. Long extension ability can also be evaluated.
  • the test lipid-producing bacterium is cultured, and mRNA or protein, which is a product of the fatty acid chain length extending enzyme gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4, can be quantified. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. For example, mRNA can be quantified by, for example, Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein can be quantified by, for example, Western blotting (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
  • test lipid-producing bacterium is cultured, the expression level of the fatty acid chain length extension enzyme gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 is measured, and the gene expression according to the target fatty acid chain length extension ability
  • a suitable lipid-producing bacterium can be selected.
  • a reference lipid-producing bacterium and a test lipid-producing bacterium are cultured, the gene expression level in each lipid-producing bacterium is measured, and the gene expression level of the reference lipid-producing bacterium and the test lipid-producing bacterium is compared to obtain a desired
  • the test lipid-producing bacterium may be selected.
  • a suitable lipid-producing bacterium can be selected by selecting a test lipid-producing bacterium in which the gene is expressed at a higher level than the reference lipid-producing bacterium.
  • a desired lipid-producing bacterium can be obtained by culturing a test lipid-producing bacterium and selecting a lipid-producing bacterium having a high or low fatty acid chain length extending ability or a high or low fatty acid chain length extending enzyme activity. You can choose.
  • examples of the test lipid-producing bacterium or the reference lipid-producing bacterium include a lipid-producing bacterium introduced with the above-described vector of the present invention, and a lipid production in which the expression of the above-described polynucleotide (DNA) of the present invention is suppressed.
  • Bacteria, lipid-producing bacteria that have been subjected to mutation treatment, naturally-mutated lipid-producing bacteria, and the like can be used. The ability to extend the fatty acid chain length can be measured by comparing the fatty acid composition in the cells.
  • the ability to extend the fatty acid chain length of a lipid-producing bacterium is evaluated, and a desired lipid-producing bacterium (for example, a lipid-producing bacterium having a high fatty acid chain length-extending ability, ie, a carbon Since a lipid-producing bacterium capable of producing a large number of fatty acids can be selected, fats and oils having a desired composition can be efficiently produced. Furthermore, using the expression level of the gene as an index, it can also be used for examination of culture conditions, culture management, etc. for efficient fatty acid production.
  • Genomic analysis of Mortierella alpina M. alpina 1S-4 strain was inoculated into 100 ml of GY2: 1 medium (2% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0) and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 days. Cells were collected by filtration, and genomic DNA was prepared using DNeasy (QIAGEN). The base sequence of the genomic DNA was determined using Roche 454 GS FLX Standard. At that time, the base sequence of the fragment library was determined for 2 runs, and the base sequence of the mate pair library was determined for 3 runs. By assembling the obtained base sequences, 300 Super Contigs were obtained.
  • Poly (A) + RNA was purified from total RNA using Oligotex-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (Takara Bio). Using this, a cDNA library was prepared using the ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (STRATAGENE).
  • ELO fatty-acid-chain elongase enzyme
  • MALCE2-1 5'-ctccgattcaagtcctgtcatttcaacc-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • MALCE2-2 5'-ccattgagggtgattctttctatgcgaac-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • DNA Polymerase was PrimeSTAR TM (TaKaRa), and the reaction was carried out under a temperature condition of 30 cycles (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 2 minutes).
  • the obtained PCR product was inserted into the restriction enzyme HincII site of the pUC118 vector to obtain a plasmid pUC-MALCE2.
  • SEQ ID NO: 3 which is the nucleotide sequence of the CDS of MALCE2
  • SEQ ID NO: 4 The genomic sequence of MALCE2 (SEQ ID NO: 4) and the CDS sequence of MALCE2 (SEQ ID NO: 3) were compared (Fig. 1). There were three introns in the MALCE2 gene, and exons were thought to be at positions 1-428, 579-649, 757-936, and 1050-1318 of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence derived from the MALCE2 CDS base sequence (SEQ ID NO: 3) is shown in FIG. Among those already reported as ELO genes from M. alpina are MALCE1, MAELO, and GLELO. When comparing the identity of these with MALCE2, the amino acid sequences were 51.1%, 21.1%, and 21.7%, respectively. Although MALCE1 had the highest identity with MALCE2 among the amino acid sequences registered in Genebank, the identity was still as low as 51.1%.
  • ELO homologue from Rhizopus oryzae (CAX48926) (identity 45.1%) and ⁇ 9-PUFA-specific fatty acid chain length extension enzyme (CAD58540) (identity 24.1%) from Isochrysis galbana were also found by homology search It was. In addition, as described later, it was 20.3% identical to D. discoideum-derived EloA, which is known to act on palmitoleic acid to produce 18: 1 ⁇ 11 as in MALCE2. An amino acid sequence alignment between MALCE2 and a known chain extender is shown in FIG. The storage area of ELO indicated by double underlining was also stored in MALCE2 of the present invention.
  • yeast expression vector To insert the MALCE2 CDS into the yeast expression vector pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995), place an EcoRI site upstream of the start codon and downstream of the stop codon. A primer with XhoI site was prepared. The underlined portion is each restriction enzyme site.
  • MALCE2-3 5'-g gaattc atggagtccattcagatcttg-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • MALCE2-4 5'-g ctcgag cttactcttccttcttggc-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • PCR was performed using the plasmid pUC-MALCE2 prepared as described above as a template under the same conditions as described above (cloning of the chain length extension enzyme gene).
  • This PCR product and the yeast expression vector pYE22m were cleaved with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and then ligated using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa).
  • plasmid pYE-MALCE2 Japanese Patent Laid-Open No. 2008-73030 was used as an expression vector for MALCE1 yeast.
  • transformed yeast Yeast EH13-15 (trp1, MAT ⁇ ) (Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989) was transformed by the lithium acetate method using plasmids pYEMALCE2, pYM3ELO20, and pYE22m.
  • the transformed strain is SC-Trp (6.7 g of Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) per liter, 20 g of glucose amino acid powder (1.25 g of adenine sulfate, 0.6 g of arginine, 3 g of aspartic acid, 3 g of glutamic acid).
  • the ratios of 18: 1 ⁇ 9, 18: 1 ⁇ 11 and 20: 1 ⁇ 11 were increased and fatty acids having 16 carbon atoms were decreased compared to the control.
  • the ratio of cis-vaccenic acid (18: 1 ⁇ 11) was remarkably increased and palmitoleic acid (16: 1 ⁇ 9) was decreased as compared with the control.
  • Cis-vaccenic acid is useful as a raw material for pharmaceuticals, health foods, and the like because it has a colon cancer cell growth inhibitory action, an oxidative stress inhibitory action, and a growth promoting action of lactobacilli useful for improving the intestinal environment.
  • MALCE2 in the MALCE2 expression strain of the present invention, 20: 1 ⁇ 11 was slightly generated when cultured in SR-Trp medium. That is, known MALCE1 has the activity of extending the length of palmitic acid (16: 0), 16: 1 ⁇ 9, 18: 1 ⁇ 9, whereas MALCE2 mainly extends the length of 16: 1 ⁇ 9 to 18: 1 ⁇ 11. It has been found that it has activity and has a slight activity of extending the chain length of 16: 0 and 18: 1 ⁇ 9.
  • SR-Trp liquid medium with tritonX-100 added at 0.1% and various fatty acids at 50 ⁇ g / ml was cultured in the same manner as above, and the fatty acid composition of the cells was determined. analyzed. When 15: 0 and 17: 0 were added, they were not completely dissolved in the medium, but were cultured as they were. The results are shown in Table 3-6.
  • MALCE1 expressing strains the chain lengths of the ⁇ 9 fatty acids 18: 2 ⁇ 9,12 and 18: 3 ⁇ 9,12,15 are extended to produce 20: 2 ⁇ 11,14 and 20: 3 ⁇ 11,14,17.
  • MALCE2 did not extend 18: 2 ⁇ 9,12 at all and slightly extended 18: 3 ⁇ 9,12,15, but its conversion rate was 1/10 or less compared to MALCE1.
  • MALCE1 is 15: 0 to 17: 0, 17: 1 ⁇ 9 19: 1 ⁇ 11 has a high activity for extending the chain length
  • MALCE2 of the present invention is considered to have a high activity for extending the length of 15: 1 ⁇ 9 to 17: 1 ⁇ 11.
  • MALCE2 was also found to have a slight activity of extending the chain length from 15: 0 to 17: 0 and 17: 1 ⁇ 9 to 19: 1 ⁇ 11.
  • the present invention relates to the production of fatty acid compositions containing a large amount of fatty acids having a large number of carbon atoms, particularly fatty acid compositions containing a large amount of cis-vaccenic acid, and / or the production of foods, cosmetics and / or soaps containing desired fatty acids. Useful.

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Abstract

【課題】新規な脂肪酸鎖長延長酵素を提供する。 【解決手段】本発明は、脂肪酸鎖長延長反応を担う脂肪酸鎖長延長酵素、それをコードするポリヌクレオチドなどに関する。本発明は、例えば、配列番号：１または４の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含有する発現ベクター及び形質転換体、該形質転換体を用いる食品等の製造方法、そのような製法によって製造された食品、被検脂質生産菌の評価もしくは選択方法などを提供する。

Description

脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子およびその用途
　本発明は、脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子およびその用途に関する。
　脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等の脂質を構成する重要な成分である。
新規脂肪酸合成は、脂肪酸合成酵素（FAS）により、アセチルＣｏＡにマロニルＣｏＡが縮合・還元・脱水・還元の一連の反応により脱炭酸的に結合して炭素数が2つずつ伸長していき、各種飽和脂肪酸が合成される。炭素数16または18までの飽和脂肪酸は新規脂肪酸合成で生合成することが可能である。
　一方、脂肪酸の鎖長延長は、アシルCoAに、マロニルCoAが縮合・還元・脱水・還元の一連の反応により脱炭酸的に結合して炭素数が2つずつ伸長していく。この反応には脂肪酸鎖長延長酵素（ＥＬＯ）が関与している。
　脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子は、ヒト、マウス、線虫、微生物などからクローン化されている。脂肪酸鎖長延長酵素は、基質とする脂肪酸の鎖長の特異性や不飽和結合の数や位置の特異性の違いから分類され、アミノ酸配列の系統樹解析においても大きく２つのグループに分けられる。一方は高度不飽和脂肪酸（PUFA）を基質とするグループであり、もう一方は飽和脂肪酸（SFA）もしくは１価不飽和脂肪酸（MUFA）などを基質とするグループ（非特許文献１：Biochem Biophys Res Commun. 2008 Sep 19;374(2):226-30）である。
　脂質生産菌であるモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）については、これまでに４つの脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が知られている。１つめは、GLELO（GenBank AF206662）であり、３個又は４個の二重結合を含み18個の炭素原子を有する高度不飽和脂肪酸であるγ－リノレン酸（GLA；18:3n-6、18：3Δ６,９,１２）及びステアリドン酸（STA；18:4n-3、18：3Δ6,9,12,15）に基質特異性があり、これらの脂肪酸を、炭素原子が２個付加された脂肪酸であるジホモ－γ－リノレン酸（DGLA；20:3n-6、２０：３Δ8,11,14）及びエイコサテトラエン酸（ETA；20:4n-3、２０：４Δ8,11,14,17）に変換する（非特許文献２：Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.97, No.15, p.8254-8289 (2000)；特許文献１：特表2002-523098号）。2つめは、MAELO（GenBank AF268031）であり、超長鎖飽和脂肪酸を鎖長延長する活性を有する（特許文献１：特表2002-523098号；特許文献２：特開2005-287403号）。3つめは、ELO3（GenBank GP050836）であり、パルミチン酸（16：0）選択的に鎖長延長し、炭素原子が２個付加された脂肪酸であるステアリン酸（１８：０）に変換する活性がある（特許文献３：特表2009-512437号）。４つ目は、MALCE1で（GenBank DL184064）あり、パルミチン酸（16：0）、パルミトレイン酸（16：1Δ9）、オレイン酸（18：1Δ9）、リノール酸（18：2Δ9,12）、α-リノレン酸（18：3Δ9,12,15）に基質特異性があり、これらの脂肪酸を、炭素原子が2個付加された脂肪酸である18：0、シス-バクセン酸（18：1Δ11）、エイコセン酸（20：1Δ11）、エイコサジエン酸（20：2Δ11,14）、エイコサトリエン酸（20：3Δ11,14,17）に変換する活性を有する（特許文献４：特開2008-73030号）。なお、ＥＬＯ3とＭＡＬＣＥ１の同一性は98.9％である。
　パルミトレイン酸に作用し、シス-バクセン酸を生成する鎖長延長酵素としては、細胞性粘菌キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）由来のEloA遺伝子が知られている（非特許文献１：Biochem Biophys Res Commun. 2008 Sep 19;374(2):226-30）。EloA遺伝子は、酵母で発現させた結果から、16：0、16：1Δ9と18：1Δ１１に作用し、18：0、18：1Δ１１と20：1Δ13に変換する活性を有することが示されている。
　シス-バクセン酸には、結腸癌細胞増殖抑制作用（非特許文献３：Cancer Letters、1995、Vol.91、No.1、pp .55 －61）や酸化ストレス抑制作用（非特許文献４：American Journal of Physiology、1991、Vol.260、pp.L481-488）などが報告され、その健康機能が注目されている。また、シス-バクセン酸には、腸内環境の改善に有用な乳酸桿菌の増殖促進作用があることも報告されている（特許文献５：特開2006-262778号）。
Biochem Biophys Res Commun. 2008 Sep 19;374(2):226-30 Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.97, No.15, p.8254-8289 (2000) Cancer Letters、1995、Vol.91、No.1、pp .55－61 American Journal of Physiology、1991、Vol.260、pp.L481-488
特表2002-523098号 特開2005-287403号 特表2009-512437号 特開2008-73030号 特開2006-262778号
　上述のような状況下で、Ｍ．ａｌｐｉｎａをはじめとする脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長反応を担う新規脂肪酸鎖長延長酵素、およびそれをコードする遺伝子を同定することが求められている。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａの脂肪酸鎖長延長反応を担う脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のポリヌクレオチド、タンパク質、発現ベクター、形質転換体、該形質転換体を用いる食品等の製造方法、そのような製法によって製造された食品等、ならびに被検脂質生産菌の評価もしくは選択方法を提供する。
〔１〕以下の（ａ）～（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１または４の塩基配列を含有するポリヌクレオチド； 
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１～１００個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号：１または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔２〕以下の（ｆ）または（ｇ）のいずれかに記載の上記〔１〕に記載のポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕配列番号：１または４の塩基配列を含有する、上記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、上記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔５〕ＤＮＡである、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド。　
〔６〕上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
〔６ａ〕配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔６ｂ〕配列番号：２のアミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質。
〔６ｃ〕配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質。
〔７〕上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔７ａ〕以下の（ａ）～（ｃ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記〔７〕に記載のベクター：
　（ａ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター、
　（ｂ）該プロモーターに結合した、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および
　（ｃ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナル。
〔７ｂ〕上記宿主細胞が、脂質生産菌（例えば、Ｍ．ａｌｐｉｎａ）または酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、上記〔７ａ〕に記載のベクター。　
〔８〕上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
〔９〕上記〔７〕に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
〔９ａ〕上記〔７〕に記載のベクターを導入することによって、上記〔７〕に記載のベクターが導入されていない宿主よりも炭素数の多い脂肪酸、特にシス－バクセン酸を多く含む脂肪酸組成物を生産できる上記〔９〕に記載の形質転換体。
〔１０〕前記形質転換体が脂質生産菌である、上記〔８〕または〔９〕に記載の形質転換体。
〔１１〕前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎａ）である、上記〔１０〕に記載の形質転換体。
〔１２〕上記〔８〕～〔１１〕のいずれかに記載の形質転換体を用いる脂質または脂肪酸組成物の製造方法。
〔１３〕上記〔８〕～〔１１〕のいずれかに記載の形質転換体を用いる食品、医薬品または工業原料の製造方法。
〔１３ａ〕前記食品が、油脂を含む食品である、上記〔１３〕に記載の製造方法。
〔１４〕上記〔１３〕に記載の方法で製造された食品、医薬品または工業原料。
〔１４ａ〕前記食品が、油脂を含む食品である、上記〔１４〕に記載の食品または工業原料。
〔１５〕配列番号：１または４の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能について評価する方法。
〔１５ａ〕上記〔１５〕の方法によって、脂肪酸鎖長延長能が高い脂質生産菌を選別する方法。
〔１５ｂ〕上記〔１５ａ〕に記載の方法によって選別された脂質生産菌を用いて油脂を製造する方法。
〔１６〕被検脂質生産菌を培養し、配列番号：１または４の塩基配列を含有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現量を測定することによって、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能を評価する方法。
〔１６ａ〕上記〔１６〕に記載の方法で、被検脂質生産菌を評価し、上記脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現量が高い脂質生産菌を選別する、シス－バクセン酸の生成能が高い脂質生産菌を選別する方法。
〔１６ｂ〕上記〔１６ａ〕に記載の方法によって選別された脂質生産菌を用いて油脂を製造する方法。
〔１７〕基準脂質生産菌および被検脂質生産菌を培養して配列番号：１または４の塩基配列を含有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の各脂質生産菌における発現量を測定し、基準脂質生産菌よりも該遺伝子が高発現している被検脂質生産菌を選択する、脂質生産菌の選択方法。
　本発明のポリヌクレオチドは、脂質生産菌（例えば、Ｍ．ａｌｐｉｎａ）、酵母、植物等の形質転換に利用することができ、そのようにして得られる形質転換脂質生産菌、形質転換酵母または形質転換植物等は脂肪酸組成物、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。
　より具体的には、本発明の形質転換体は、結腸癌細胞増殖抑制作用、酸化ストレス抑制作用、腸内環境の改善に有用な乳酸桿菌の増殖促進作用などを有するシス-バクセン酸の生産効率が極めて良い。したがって、本発明は、シス-バクセン酸を含有する医薬品あるいは健康食品の製造に有効に使用することができる。
ＭＡＬＣＥ２のゲノム配列とＣＤＳ配列のアライメントを示す図である。 ＭＡＬＣＥ２のＣＤＳ配列を示す図である。 ＭＡＬＣＥ２と機能的に近い脂肪酸鎖長延長酵素（DdEloA（ACJ09597）、IgELO（AAV67801）、MALCE1(DL184064)）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。二重下線部は、膜の細胞質側に位置すると考えられているELOの保存領域を示す。
　本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａ　１Ｓ－４株由来の新規脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ＭＡＬＣＥ２）の全長ｃＤＮＡのクローニングに初めて成功した。また、Ｍ．ａｌｐｉｎａ　１Ｓ－４株由来の脂肪酸鎖長延長酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列、および該脂肪酸鎖長延長酵素の推定アミノ酸配列も得られた。ＭＡＬＣＥ２のＯＲＦ配列、ＭＡＬＣＥ２の推定アミノ酸配列、ＭＡＬＣＥ２のＣＤＳ配列及びＭＡＬＣＥ２のゲノム配列は、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４である。これらのポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法などによって取得することが可能である。
１．本発明のポリヌクレオチド
　まず、本発明は、以下の（ａ）～（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号：１または４の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１～複数個（例えば、１００個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号：１または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号：１または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば“Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．　３，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”、“Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７－１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％　（ｗ／ｖ）　ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：１または４のＤＮＡ、または配列番号：２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７２２６４－２２６８，　１９９０；　ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：　５８７３，　１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：　４０３，　１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
２．本発明のタンパク質
　本発明は、次に示すタンパク質を提供する。
〔６〕上記ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
〔６ａ〕配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔６ｂ〕配列番号：２のアミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質。
〔６ｃ〕配列番号：２のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質。
　上記（６ｂ）または（６ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号：２のタンパク質の変異体であるが、例えば、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．　３，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”、“Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７－１９９７”、“Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　１０，　６４８７　（１９８２）”、“Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７９，　６４０９　（１９８２）”、“Ｇｅｎｅ，　３４，　３１５　（１９８５）”、“Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　１３，　４４３１　（１９８５）”、“Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２，　４８８　（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　本明細書中、「配列番号：２のアミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質」としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１～１００個、１～９０個、１～８０個、１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３９個、１～３８個、１～３７個、１～３６個、１～３５個、１～３４個、１～３３個、１～３２個、１～３１個、１～３０個、１～２９個、１～２８個、１～２７個、１～２６個、１～２５個、１～２４個、１～２３個、１～２２個、１～２１個、１～２０個、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個（１～数個）、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／もしくは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　なお、脂肪酸鎖長延長酵素活性は、例えば、当該酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させることができるベクターを導入した形質転換体と、発現させることができないベクター（例えば当該酵素遺伝子を含まない空ベクター）を導入した形質転換体の脂肪酸組成を比較し、前者が、炭素数の多い脂肪酸を多く含む場合には、脂肪酸鎖長延長活性があるということができる。例えば、前者のパルミトレイン酸の比率が減少し（例えば、１０％以上の減少、好ましくは２０％以上の減少）、シス－バクセン酸の比率が上昇している場合（例えば、１０％以上の増加、好ましくは２０％以上の増加）には、当該酵素にパルミトレイン酸に対する脂肪酸鎖長延長活性があるということができる。　
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　また、本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換体
　本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
　本発明のベクターは、通常、（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；（ｉｉ）該プロモーターに結合した、上記（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例としては、脂質生産菌、酵母等が挙げられる。
　脂質生産菌としては、例えば、ＭＹＣＯＴＡＸＯＮ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＶ，Ｎｏ．２，ｐｐ．２５７－２６５（１９９２）に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ　２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２８．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等のモルティエレラ亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ　Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に属する微生物、またはモルティエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＣＢＳ１９４．２８、ＩＦＯ６３３６、ＩＦＯ７８２４、ＩＦＯ７８７３、ＩＦＯ７８７４、ＩＦＯ８２８６、ＩＦＯ８３０８、ＩＦＯ７８８４、モルティエレラ・ナナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｎａｎａ）ＩＦＯ８１９０、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｒａｍａｎｎｉａｎａ）ＩＦＯ５４２６、ＩＦＯ８１８６、ＣＢＳ１１２．０８、ＣＢＳ２１２．７２、ＩＦＯ７８２５、ＩＦＯ８１８４、ＩＦＯ８１８５、ＩＦＯ８２８７、モルティエレラ・ヴィナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｖｉｎａｃｅａ）ＣＢＳ２３６．８２等のマイクロムコール亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ　Ｍｉｃｒｏｍｕｃｏｒ）に属する微生物等を挙げることができる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎａ）が好ましい。
　また、酵母の例としては、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４等が挙げられる。本発明のベクターで形質転換されたこれらの宿主細胞は、本発明のベクターで形質転換されていない宿主細胞に比べて、炭素数の多い脂肪酸を多く含む脂肪酸組成物を産生することができ、特に、シス‐バクセン酸を多く含む脂肪酸組成物を高効率で産生することができる。
　脂質生産菌に導入する際に用いるベクターとしては、例えば、ｐＤｕｒａ５(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))が利用可能であるが、これに限定されない。
　酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４（Ｊ．　Ｒ．　Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　８３，　１９８３）、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０（Ｍ．　Ｄ．　Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，　ｇｅｎｅ，　６０，　２３７，　１９８７）、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５（Ｋ．　Ｓｔｒｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＰ，　７６，　１０３５，　１９７９）が知られており、容易に入手することができる。　
　宿主細胞中での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、宿主細胞中で機能する限り、任意の組み合わせでよい。例えば、脂質生産菌で利用する場合はｈｉｓｔｏｎＨ４．１遺伝子のプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどを利用可能である。
　形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８１，　３３７　１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，　ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，　生化学，　６４，　６６０，　１９９２；　Ｈｕｓｓａｉｎ　ｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　ｇｅｎｅ，　１０１，　１４９，　１９９１）などが利用可能である。
　宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、脂質生産菌の場合、エレクトロポレーション法（Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000）やパーティクルデリバリー法（特開２００５－２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）が利用できる。また、酵母の場合は、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７５　ｐ１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１５３，　ｐ１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７５　ｐ１９２９　（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　２０００　Ｅｄｉｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。
 より具体的には、脂質生産菌の場合、宿主をCzapek-Dox培地に植菌し、２８℃にて２週間培養し、胞子を形成させる。つづいて胞子を回収し、パーティクルデリバリー法（特開２００５－２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）などにより遺伝子を導入する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上あるいは、栄養要求性マーカーを用いる場合は、マーカーとして用いる栄養素を欠いた寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。また、酵母の場合は、宿主を標準栄養培地（例えば、ＹＥＰＤ培地“Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．　Ｖｏ１．１，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１１７（１９７９）”等）で、ＯＤ６００ｎｍの値が１～６となるように培養する。この培養細胞を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約０．１～０．２Ｍのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約６０分間静置した後、導入するＤＮＡ（約１～２０μｇ）とともに約３０℃で、約６０分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約４，０００ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約２０％～５０％となるように加える。約３０℃で、約３０分間静置した後、この細胞を約４２℃で約５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準栄養培地に入れて、約３０℃で約６０分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上あるいは、栄養要求性マーカーを用いる場合は、マーカーとして用いる栄養素を欠いた寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．　３，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”、“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｉｔｉｃｓ、Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ）”等を参照することができる。
４．本発明の脂質または脂肪酸組成物の製造方法
　本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換脂質生産菌または酵母を用いる脂質または脂肪酸組成物の製造方法を提供する。
　本明細書中、「脂質」とは、脂肪酸とアルコールとがエステル結合した化合物（例えば、グリセリド）またはその類似体（例えば、コレステロールエステル）などを含む単純脂質、単純脂質の一部にさらにリン酸、アミノ酸、糖などが結合した複合脂質、および脂質の加水分解物で水に溶けない誘導脂質をいうものとする。
　本明細書中、「油脂」とは、グリセロールと脂肪酸のエステル（グリセリド）のことをいう。
　本明細書中、「脂肪酸」とは、一般式ＲＣＯＯＨ（Ｒはアルキル基）で表される脂肪族モノカルボン酸（カルボキシル基を一個有し、炭素原子が鎖状に連結したカルボン酸）のことをいう。脂肪酸には、炭化水素鎖中に二重結合を有さない飽和脂肪酸と、二重結合を含む不飽和脂肪酸とが含まれる。
　本発明の脂質または脂肪酸組成物は、本発明に従って形質転換した菌体から以下のようにして抽出することができる。生物（例えば、脂質生産菌または酵母）の形質転換株について、培養終了後、遠心分離法、ろ過等の常法に従って培養菌体を得る。菌体を十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥菌体を、必要に応じて、ダイノミルや超音波などにより破砕した後、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、またはメタノールおよび石油エーテルの交互抽出またはクロロホルム－メタノール－水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。
　さらに、上記脂肪酸を含有する脂質からの脂肪酸の分離は、混合脂肪酸または混合脂肪酸エステルの状態で、常法（例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法など）により濃縮分離することにより行うことができる。
　本発明の脂質または脂肪酸組成物の製造方法によれば、例えば、酵母を宿主として用いた場合、炭素数の多い脂肪酸、特にシス‐バクセン酸の含有比率の高い脂質または脂肪酸組成物が得られるため、このような脂肪酸組成物を大量におよび／または効率よく生産することが必要な場合に、特に有用である。
　このようにして得られた脂質または脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造などの用途に使用することができる。
　より具体的には、本発明の形質転換体は、結腸癌細胞増殖抑制作用、酸化ストレス抑制作用、腸内環境の改善に有用な乳酸桿菌の増殖促進作用などを有するシス-バクセン酸の生産効率が極めて良い。したがって、本発明は、シス-バクセン酸を含有する医薬品（例えば、抗癌剤、酸化ストレス抑制剤など）あるいは健康食品（乳酸桿菌の増殖促進作用を有する食品など）の製造に有効に使用することができる。
　本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換脂質生産菌または形質転換酵母を用いる食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造方法を提供する。この方法は、本発明の形質転換脂質生産菌または形質転換酵母を用いて脂質または脂肪酸を生成する工程を包含する。生成された脂質または脂肪酸を含有する食品、化粧料、医薬、石鹸等の調製は、常法による。このように、本発明の製造方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等は、本発明の形質転換脂質生産菌または形質転換酵母を用いて生成された脂質または脂肪酸を含有する。本発明はさらに、そのような方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等を提供する。
　本発明の化粧料（組成物）または医薬（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の化粧料組成物または医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、香水、パウダー、オーデコロン、歯磨、石鹸、エアロゾル、クレンジングフォーム等の化粧料もしくは皮膚外用薬の他、皮膚老化防止改善剤、皮膚炎症防止改善剤、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤あるいは、外傷、あかぎれ、ひびわれ等による肌荒れの防止改善剤等に用いることができる。　
　本発明の化粧料組成物は、必要に応じてさらに、その他の油脂、および／または色素、香料、防腐剤、界面活性剤、顔料、酸化防止剤等を適宜配合することができる。これらの配合比率は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る（例えば、油脂は、組成物中に、１～９９．９９重量％、好ましくは、５～９９．９９重量％、より好ましくは、１０～９９．９５重量％含有され得る）。また、本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）または補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいても良い。例えば、化粧料あるいは皮膚外用薬におけるその他の常用成分としては、にきび用薬剤、ふけ・かゆみ防止剤、制汗防臭剤、熱傷用薬剤、抗ダニ・シラミ剤、角質軟化剤、乾皮症用薬剤、抗ウイルス剤、経皮吸収促進剤等が挙げられる。　
　本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品などが挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、および液体、ならびにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
　栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的なまたは健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品などを含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化および吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
　これらの食品の形態の例としては、肉、魚、ナッツなどの天然食品（油脂で処理したもの）、中華料理、ラーメン、スープなどの調理時に油脂を加える食品、天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖などの熱媒体として油脂を用いた食品、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリームなどの油脂食品または加工時に油脂を加えた加工食品、おかき、ハードビスケット、あんパンなどの加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布した食品などを挙げることができる。しかしながら、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐およびその加工品などの農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそなどの発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージなどの畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺんなどの水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などであってもよい。
　本発明の食品はまた、カプセルなどの医薬製剤の形態、またはタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料などに本発明の油脂が配合された自然流動食、半消化態栄養食、および成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤などの加工形態であってもよい。
５．本発明の被験脂質生産菌の脂肪酸産生能の評価方法および脂質生産菌の選択方法
　本発明はまた、別の実施形態において、（ｉ）配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能について評価する方法、（ｉｉ）被検脂質生産菌を培養し、配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現量を測定することによって、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能を評価する方法、および（ｉｉｉ）基準脂質生産菌および被検脂質生産菌を培養して配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の各脂質生産菌における発現量を測定し、基準脂質生産菌よりも該遺伝子が高発現している被検脂質生産菌を選択する、脂質生産菌の選択方法を提供する。
　このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８－２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
　まず、被検脂質生産菌のゲノムを調製する。調製方法は、ＤＮｅａｓｙ　ｐｌａｎｔ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）などの市販のキットを用いるなど、公知の如何なる方法を用いることができる。得られたゲノムを対象にして、配列番号：１または４の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検脂質生産菌のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
　遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法によって脂質生産菌の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０ｂｐ以上であり、１５～２５ｂｐであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００～２０００ｂｐが適当である。
　ＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：９０～９８℃、アニーリング温度：４０～６０℃、伸長温度：６０～７５℃、サイクル数：１０回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のＤＮＡ分子を含む大きさかどうかによって、その脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
　また、本発明においては、被検脂質生産菌を培養し、配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現量を測定することによって、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能を評価することもできる。この場合は、被検脂質生産菌を培養し、配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の産物であるｍＲＮＡまたはタンパク質を定量することによって可能である。ｍＲＮＡまたはタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９９４－２００３）。
　さらに、被検脂質生産菌を培養して、配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現量を測定し、目的とする脂肪酸鎖長延長能に応じた前記遺伝子発現量の被検脂質生産菌を選択することによって、好適な脂質生産菌を選択することができる。また、基準脂質生産菌および被検脂質生産菌を培養し、各脂質生産菌における前記遺伝子発現量を測定し、基準脂質生産菌と被検脂質生産菌の前記遺伝子発現量を比較して、所望の被検脂質生産菌を選択してもよい。具体的には、例えば、基準脂質生産菌および被検脂質生産菌を培養して配列番号：１または４の塩基配列を有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の各脂質生産菌における発現量を測定し、基準脂質生産菌よりも該遺伝子が高発現している被検脂質生産菌を選択することによって好適な脂質生産菌を選択することができる。
　あるいは、被検脂質生産菌を培養して、脂肪酸鎖長延長能の高いまたは低い、あるいは脂肪酸鎖長延長酵素活性の高いまたは低い脂質生産菌を選択することによって、所望の被検脂質生産菌を選択することができる。これらの場合、被検脂質生産菌または基準脂質生産菌としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した脂質生産菌、上述した本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された脂質生産菌、突然変異処理が施された脂質生産菌、自然変異した脂質生産菌などが使用され得る。脂肪酸鎖長延長能は、菌体内の脂肪酸組成を比較することにより測定することができる。
　このように、本発明により、脂質生産菌（例えば、Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の脂肪酸鎖長延長能を評価し、所望の脂質生産菌（例えば、脂肪酸鎖長延長能の高い脂質生産菌
すなわち、より炭素数の多い脂肪酸を生産できる脂質生産菌）を選択することができるため、効率よく所望の組成の油脂を製造することができる。
　さらに、当該遺伝子の発現量を指標にして、脂肪酸生産を効率よく行うための培養条件の検討、培養管理、などにも利用できる。
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。
モルティエレラ・アルピナのゲノム解析
　M. alpina 1S-4株を１００ｍｌのGY2：1培地（2％グルコース、1％酵母エキス、ｐH6.0）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを調製した。
　上記ゲノムDNAの塩基配列を、 Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を3ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、300個のスーパーコンティグ（Super Contig）が得られた。
ｃＤＮＡライブラリーの作製
　M. alpina 1S-4株を100mlの培地（1.8％グルコース、１％酵母エキス、pH6.0）に植菌し、４日間28℃で振とう培養した。菌体を回収し、塩酸グアジニン/CsCl法でtotal RNAを調製した。Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、total RNAからpoly(A)+RNAの精製を行った。これを用いて、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)により、cDNA ライブラリーを作製した。
新規脂肪酸鎖長延長酵素のクローニング
　M. alpina 1S-4株のゲノム情報に対して、既知の脂肪酸鎖長延長酵素（ELO）遺伝子との相同性検索を行い、新たなELOホモログと考えられる配列（配列番号：４）を含む配列番号：５を見出した。配列番号：５の塩基配列をもとに、目的遺伝子の開始コドンの直前の配列と終始コドンの直後の配列から以下のプライマーを作成した。
 
　MALCE2-1    5’- ctccgattcaagtcctgtcatttcaacc-3’ （配列番号：６）
　MALCE2-2    5’- ccattgagggtgattctttctatgcgaac-3’ （配列番号：７）
 
　これらのプライマーを用いて、M. alpina 1S-4株のcDNAライブラリーより、PCR法を用いて当該遺伝子のｃDNAの増幅を試みた。DNA PolymeraseはPrimeSTARTM(TaKaRa)を用い、反応は、（98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を2分間）を30サイクルという温度条件で行った。
　得られたPCR産物を、pUC118ベクターの制限酵素ＨｉｎｃＩＩサイトに挿入し、プラスミドｐUC-MALCE2を得た。
　このプラスミドｐUC-MALCE2挿入断片の塩基配列を解析したところ、MALCE2のCDSの塩基配列である配列番号：３の配列が得られた。ＭＡＬＣＥ2のゲノム配列（配列番号：４）とＭＡＬＣＥ2のＣＤＳ配列（配列番号：３）を比較した（図1）。ＭＡＬＣＥ2遺伝子には3つのイントロンがあり、エキソンは配列番号：４の1-428、579-649、757-936、および1050-1318の位置にあると考えられた。
配列解析
　MALCE2のCDSの塩基配列（配列番号：３）から導かれるアミノ酸配列を、図2に示す。
　M. alpina由来のELO遺伝子としてすでに報告されているものに、MALCE1、ＭＡＥＬＯ、およびＧＬＥＬＯがある。これらとMALCE2のアミノ酸配列の同一性を比較したところ、それぞれ51.1%、21.1％、および21.7％の同一性であった。ＭＡＬＣＥ1は、Genebankに登録されているアミノ酸配列の中でＭＡＬＣＥ2と最も同一性が高かったものの、それでもその同一性は51.1％と低いものであった。他に、Rhizopus oryzae由来のELOホモログ（CAX48926）（同一性45.1％）や、Isochrysis galbana由来のΔ9-PUFA特異的な脂肪酸鎖長延長酵素（CAD58540）（同一性24.1%）なども相同検索によって見つかった。また、あとで述べるように、MALCE2と同様にパルミトレイン酸に作用して18：1Δ11を生成することが知られているD.discoideum由来のEloAとは20.3%の同一性であった。MALCE2と既知の鎖長延長酵素とのアミノ酸配列のアラインメントを図3に示す。二重下線で示したELOの保存領域は、本発明のMALCE2でも保存されていた。
酵母発現用ベクターの構築
　MALCE2のCDSを酵母発現用ベクターpYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)に挿入するために、開始コドンの上流にEcoRIサイトを、終止コドンの下流にXhoIサイトをもつプライマーを作成した。下線部が各制限酵素サイトである。
 
　MALCE2-3　　5’-ggaattcatggagtccattcagatcttg-3’（配列番号：８）
　MALCE2-4　　5’-gctcgagcttactcttccttcttggc-3’（配列番号：９）
 
　上述のとおり作成したプラスミドｐUC-MALCE2を鋳型として、上記（鎖長延長酵素遺伝子のクローニング）と同様の条件でPCRを行った。このPCR産物及び酵母発現用ベクターpYE22mを、制限酵素EcoRIとXhoIにより切断した後、DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (TaKaRa)を用いてライゲーションし、得られたプラスミドをｐYE-MALCE2とした。一方、MALCE1の酵母用発現ベクターとしてはプラスミドpYM3ELO20（特開2008-73030）を用いた。
形質転換酵母の取得
　プラスミドｐYEMALCE2、pYM3ELO20、ｐYE22ｍを用いて酢酸リチウム法により、酵母EH13-15（trp1,MATα）(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) ６．７ｇ、グルコース２０ｇアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ、）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。
形質転換酵母の脂肪酸組成分析
　任意の形質転換株各2株ずつを、SC-Trp液体培地10ｍｌに植菌し、30℃、1日間振とう培養した。得られた培養物1ｍｌをYPD（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、グルコース2％）液体培地10mlまたはＳＲ－Ｔｒｐ液体培地（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) ６．７ｇ、ラフィノース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ、）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
　培養物をネジ口試験管に移し、遠心分離により菌体のみ回収し、水洗したあと、凍結乾燥した。塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸分析を行った。結果を表1（ＹＰＤ）と表２（ＳＲ－Ｔｒｐ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　既知のMALCE1発現株では、コントロールに比べて18：1Δ9、18：1Δ11および20：1Δ11の比率が上昇し、炭素数16の脂肪酸が減少していた。一方、本発明のMALCE2発現株では、コントロールに比べてシス-バクセン酸（18：1Δ11）の比率が顕著に増加し、パルミトレイン酸（16：1Δ9）が減少していた。シス-バクセン酸は、結腸癌細胞増殖抑制作用、酸化ストレス抑制作用、腸内環境の改善に有用な乳酸桿菌の増殖促進作用などを有するため、医薬品、健康食品などの原料として有用である。また、本発明のMALCE2発現株では、20：1Δ11はＳＲ-Ｔｒｐ培地で培養した場合は僅かに生成した。
　すなわち、既知のMALCE1はパルミチン酸（16：0）、16：1Δ9、18：1Δ9を鎖長延長する活性を有するのに対して、MALCE2は主に16：1Δ9を18：1Δ11に鎖長延長する活性を有し、16：0や18：1Δ9を鎖長延長する活性を僅かながら有することが分かった。
　次に、本培養の培地としてＳＲ－Ｔｒｐ液体培地にtritonX-100を0.1％、各種脂肪酸が50μｇ/ｍｌとなるよう添加したものを使って、上記と同様に培養し、菌体の脂肪酸組成を分析した。なお、15：0と17：0を添加した場合、培地に完全に溶解しなかったがそのまま培養した。結果を表3-6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 +：僅かにピークが検出される。
　既知のＭＡＬＣＥ1発現株では、Δ9脂肪酸である18：2Δ9,12と18：3Δ9,12,15を鎖長延長して20：2Δ11,14と20：3Δ11,14,17を生成するが、本発明のＭＡＬＣＥ2は、18：2Δ9,12をまったく鎖長延長せず、18：3Δ9,12,15を僅かに鎖長延長するが、ＭＡＬＣＥ1と比べるとその変換率は、1/10以下であった。
　奇数鎖脂肪酸であるペンタデカン酸（15：0）やヘプタデカン酸（17：0）を添加した結果（表5および表6）から、既知のＭＡＬＣＥ1は、15：0を17：0に、17：1Δ9を19：1Δ11にそれぞれ鎖長延長する活性が高く、一方、本発明のＭＡＬＣＥ2は、15：1Δ9を17：1Δ11に鎖長延長する活性が高いと考えられる。またＭＡＬＣＥ2は、15：0を17：0、17：1Δ9を19：1Δ11に鎖長延長する活性も僅かに有することが分かった。
　本発明は炭素数の多い脂肪酸を多く含む脂肪酸組成物、特にシス‐バクセン酸を多く含む脂肪酸組成物の製造、および／または所望の脂肪酸を含有する食品、化粧料および／または石鹸等の製造に有用である。

Claims (17)

  1. 以下の（ａ）～（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
    （ａ）配列番号：１または４の塩基配列を含有するポリヌクレオチド； 
    （ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１～１００個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｅ）配列番号：１または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　以下の（ｆ）または（ｇ）のいずれかに記載の請求項１に記載のポリヌクレオチド：
    （ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸鎖長延長酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  3. 　配列番号：１または４の塩基配列を含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　ＤＮＡである、請求項１～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
  7. 　請求項１～５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  8. 　請求項１～５のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
  9. 　請求項７に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
  10. 　前記形質転換体が脂質生産菌である、請求項８または９に記載の形質転換体。
  11. 　前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎａ）である、請求項１０に記載の形質転換体。
  12. 　請求項８～１１のいずれかに記載の形質転換体を用いる脂質または脂肪酸組成物の製造方法。
  13. 　請求項８～１１のいずれかに記載の形質転換体を用いる食品、医薬品または工業原料の製造方法。
  14. 　請求項１３に記載の方法で製造された食品、医薬品または工業原料。
  15. 　配列番号：１又は４の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能について評価する方法。
  16. 　被検脂質生産菌を培養し、配列番号：１または４の塩基配列を含有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現量を測定することによって、被検脂質生産菌の脂肪酸鎖長延長能を評価する方法。
  17. 　基準脂質生産菌および被検脂質生産菌を培養して配列番号：１または４の塩基配列を含有する脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の各脂質生産菌における発現量を測定し、基準脂質生産菌よりも該遺伝子が高発現している被検脂質生産菌を選択する、脂質生産菌の選択方法。
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