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WO2010032458A1 - 新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法 - Google Patents

新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法 Download PDF

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WO2010032458A1
WO2010032458A1 PCT/JP2009/004657 JP2009004657W WO2010032458A1 WO 2010032458 A1 WO2010032458 A1 WO 2010032458A1 JP 2009004657 W JP2009004657 W JP 2009004657W WO 2010032458 A1 WO2010032458 A1 WO 2010032458A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fatty liver
amino acid
seq
liver disease
biomarker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/004657
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
目野浩二
鈴木秀昭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MCBI Inc
Original Assignee
MCBI Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MCBI Inc filed Critical MCBI Inc
Priority to DK09814303T priority Critical patent/DK2333552T3/en
Priority to ES09814303.5T priority patent/ES2535971T3/es
Priority to US13/119,724 priority patent/US20130281309A1/en
Priority to EP09814303.5A priority patent/EP2333552B1/en
Publication of WO2010032458A1 publication Critical patent/WO2010032458A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US14/679,332 priority patent/US10145853B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker that is a novel protein or peptide that can be used for detection of non-alcoholic fatty liver disease, and a method for detecting non-alcoholic fatty liver disease using the biomarker.
  • a technique that has been generally used in an in vitro diagnostic agent is a conventional technique.
  • the most common in-vitro diagnostic agents are those that perform diagnostic tests by analyzing blood components as biomarkers.
  • the presence of a single specific protein in blood or a so-called peptide having a molecular weight of 10,000 or less, or the activity in the case of an enzyme protein is measured, and a normal (healthy person) sample and a disease sample are measured. It has helped diagnosis with the obvious difference.
  • a specific primary antibody labeled with an enzyme that develops color when a sample is directly or diluted in advance and reacted with a substrate with a single or a plurality of specific proteins or peptides Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or chemiluminescent assay (CLIA) that measures the color development amount of the sample using a secondary antibody immunoassay) and radioimmunoassay (RIA), which uses a radioisotope conjugated to a primary or secondary antibody.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • CLIA chemiluminescent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • the inventor binds an antibody against a protein or peptide of interest to beads (including magnetic beads), captures the protein or peptide to be measured by this, and then elutes from the beads to measure by immunoassay.
  • beads including magnetic beads
  • immunoassay for the purpose of analyzing intact proteins, a method of performing mass spectrometry using the above method after digestion with trypsin or the like has also been reported (see Patent Document 1).
  • utilizing the properties of intact proteins fractionation is performed as it is, or protein molecules that are specifically adsorbed are selected and analyzed by mass spectrometry.
  • Nonalcoholic fatty liver disease is NAFLD Although it is abbreviated, it shows liver tissue features characterized by fat deposition similar to alcoholic liver injury despite no history of drinking (20 g / day or less). Viral or autoimmune cases such as HCV or HBV are excluded from this disease. This disease is regarded as a phenotype in the liver of metabolic syndrome with obesity and the like.
  • Nonalcoholic steatohepatitis is roughly divided into simple fatty liver and progressive nonalcoholic steatohepatitis. The latter is abbreviated as NASH. NASH has frequently been accompanied by liver fibrosis and has been shown to progress to cirrhosis and further to hepatocellular carcinoma, and has recently attracted attention (see Non-Patent Document 1).
  • simple fatty liver is simply referred to as fatty liver.
  • Fatty liver is suspected due to high blood neutral fat level and obesity during normal medical examination, and is diagnosed by performing abdominal ultrasonography and CT. It should be noted that about 40% of fatty livers in non-drinkers are associated with liver damage. There is no simple blood test method for non-alcoholic fatty liver, although it may be transferred to NASH.
  • NASH is considered to be a severe form of nonalcoholic fatty liver disease, but normal blood biochemical tests, especially alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels, may increase slightly. It is often overlooked to the extent that it is recognized, and it has been a problem that there is no specific test method as with fatty liver.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • the present invention relates to nonalcoholic steatohepatitis using a protein and a partial peptide thereof that are different in the presence / absence and abundance in healthy individuals and nonalcoholic fatty liver disease patients or fatty liver and nonalcoholic steatohepatitis patients. It is intended to provide a method for detecting non-alcoholic fatty liver disease, and to provide a biomarker for detecting non-alcoholic fatty liver disease such as non-alcoholic steatohepatitis comprising the protein and the partial peptide And
  • the present inventor has conducted intensive studies on a method for detecting non-alcoholic fatty liver disease, and includes non-alcoholic fatty hepatitis including non-alcoholic steatohepatitis among the liver disease biomarkers previously identified by the present inventor.
  • the present inventors have found a protein fragment capable of detecting liver disease and a partial peptide thereof.
  • the present inventor has obtained a 35 kDa protein fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 It was found that the partial peptide represented by (including glycosylated form) can be used as a biomarker for detecting nonalcoholic fatty liver disease including nonalcoholic steatohepatitis.
  • the present inventors have succeeded in measuring this protein fragment and partial peptide by using immunoblotting method and immunoMS method, and confirming that an ELISA can be constructed, thereby completing the present invention. It came to.
  • Inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a 35 kDa protein fragment of inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Bio for detecting non-alcoholic fatty liver disease comprising at least one protein or peptide selected from the group consisting of partial peptides of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 marker.
  • Inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a 35 kDa protein fragment of inter ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Protein fragment or peptide fragment having 5 or more amino acid residues generated from at least one protein or peptide selected from the group consisting of partial peptides of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a biomarker for detecting non-alcoholic fatty liver disease consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a 35 kDa protein fragment of inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Biomarker for detecting non-alcoholic steatohepatitis comprising at least one protein or peptide selected from the group consisting of partial peptides of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 .
  • Inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a 35 kDa protein fragment of inter ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Protein fragment or peptide fragment having 5 or more amino acid residues generated from at least one protein or peptide selected from the group consisting of partial peptides of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a biomarker for detecting non-alcoholic steatohepatitis consisting of.
  • Detection of non-alcoholic fatty liver disease comprising measuring at least one non-alcoholic fatty liver disease biomarker according to any one of [1] and [2] in a biological sample Method.
  • a method for detecting nonalcoholic steatohepatitis comprising measuring at least one nonalcoholic steatohepatitis biomarker according to any one of [3] and [4] in a biological sample.
  • At least one non-alcoholic fatty liver disease biomarker described in any one of [1] and [2] in a biological sample is measured, and the biomarker is present more in comparison with a normal person
  • At least one non-alcoholic steatohepatitis biomarker described in any one of [3] and [4] in a biological sample is measured, and the biomarker is present more in comparison with a normal person
  • a method for detecting nonalcoholic steatohepatitis, which is judged to be suffering from nonalcoholic steatohepatitis is measured, and the biomarker is present more in comparison with a normal person.
  • a non-alcoholic fatty liver disease detection kit for measuring at least one biomarker according to any one of [1] and [2].
  • a non-alcoholic steatohepatitis detection kit for measuring at least one biomarker according to any one of [3] and [4].
  • a non-alcoholic fatty liver disease detection kit comprising an antibody or aptamer against at least one biomarker according to any one of [1] and [2].
  • a detection kit for non-alcoholic steatohepatitis comprising an antibody or aptamer against at least one biomarker according to any one of [3] and [4].
  • the antibody or aptamer is immobilized on a substrate [13] or [ 14].
  • an inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a biological sample derived from a subject, an inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 35 kDa protein fragment of chain H4 precursor and at least one protein selected from the group consisting of a partial peptide of inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or at least one of the proteins
  • the present invention also provides a diagnostic system with extremely high accuracy and specificity. According to the present invention, a highly accurate diagnosis can be made for nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis for which there has been no specific test method for biological samples such as blood. In addition, according to the present invention, it is possible to diagnose how much liver disease progresses to liver cancer. Furthermore, the biomarker of the present invention is highly useful in determining drug effects.
  • FIG. 4 demonstrates that the immunoblot of Example 2 (FIG. 1) measures a 35 kDa protein fragment of the inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor. It is a figure which shows the measurement result of the density
  • mold partial peptide which consists of an amino acid sequence represented by sequence number 3 by immunoMS method.
  • healthy individuals are shown as NR.
  • FIG. 3 shows that BMPEP1117R captures a 35 kDa protein fragment of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor, and that the captured fragment reacts with an antibody specific for its C-terminus (BMPEP1117C).
  • the peptide when a subject suffers from nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis, the type and amount of intact protein and / or its partial peptide are detected, and at the same time, intact protein and its
  • the subject is suffering from non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis or non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis It is a method for diagnosing the degree of progression of liver disease when affected.
  • the peptide generally refers to a peptide in which amino acids having a molecular weight of 10,000 or less are linked, or the number of amino acid residues is from several to about 50 or less.
  • a partial peptide of an intact protein can be used as a biomarker for detection of nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis.
  • the intact peptide partial peptide refers to a peptide having a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the intact protein, and is generated as a partial peptide in the expression synthesis process by transcription and translation; After being synthesized as an intact protein, it may be digested and decomposed in vivo to produce a digested degradation product peptide.
  • the protein synthesis and control mechanism is deregulated when the living body is in a state other than normal, such as non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis. That is, the present invention discriminates whether a subject is in a normal state or suffers from nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis using the expression synthesis and / or digestion degradation of the protein in the living body as an index. It is also a method for evaluating and discriminating the degree of progression of disease when suffering from non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis.
  • detection of non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis is an evaluation discrimination as to whether or not the subject suffers from non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis, This refers to making a diagnosis. It may also include an assessment of the risk that the subject will suffer from more severe liver disease.
  • the intact protein that can be used as a biomarker for detecting nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis specifically, consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • inter- ⁇ trypsin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as an intact protein that can be used as a biomarker for detecting nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis.
  • Inhibitor heavy chain H4 precursor a protein fragment having a molecular weight of 10,000 or more generated from a 35 kDa protein fragment of an inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is also included.
  • an inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is used.
  • Body partial peptides In the present invention, the above intact protein and partial peptide are used as a marker. From the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, one or several amino acids are deleted, substituted, or added. These proteins or peptides can also be used as biomarkers in the methods of the present invention.
  • “one or several” means “one or three”, “one or two” or “one”.
  • an inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
  • Body 35 kDa protein fragment of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and part of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor consisting of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • peptide fragments of 5 or more amino acid residues originating from the peptide are also included.
  • Non-Patent Document 2 The reason why the peptide fragment is 5 or more amino acid residues is due to the following description in Non-Patent Document 2. That is, the peptide CGGGERA in which R is replaced with K for the amino acid residue sequence IRGERA at the C-terminus (130-135) of histone H3 and IR is deleted, and the peptide CGGGERA in which CGG is bound to GERA is used instead of the peptide IRGERA. It was reported that it was recognized by the antibody obtained. This indicates that antigenic recognition is made by a peptide consisting of 4 or more amino acid residues.
  • the number of residues is increased by 1 to 5 or more, but such low molecular peptides are also targeted. It is important when using a method for detection and fractionation using immunological techniques such as immunoblotting, ELISA, and immunoMS.
  • a sugar chain may be added to an intact protein or a partial peptide thereof. Proteins and partial peptides to which these sugar chains have been added can also be used as biomarkers for detecting non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis.
  • An example of such a partial peptide is a peptide represented by SEQ ID NO: 3.
  • the present invention also includes a method for detecting liver cancer using the addition of these sugar chains as an index.
  • the biomarker may be quantified or the presence or absence may be determined by qualitative.
  • two-dimensional electrophoresis or two-dimensional chromatography can be used as a method for separating a biomarker in a biological sample such as serum.
  • the two types of chromatography in this case may be selected from known chromatography such as ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography and the like. It can also be quantified by the SRM / MRM method using the LC-MS / MS method.
  • an immunoMS that binds an antibody against the protein or peptide of interest to the beads (including magnetic beads) developed by the inventor, captures the protein or peptide to be measured, and then elutes from the bead and measures by mass spectrometry If the method is used, the presence or amount of the target protein, protein fragment, or peptide can be easily evaluated without using two-dimensional electrophoresis or chromatography.
  • the magnitude of risk related to the prognosis of non-alcoholic fatty liver disease in a subject can also be evaluated, which is useful for preventive medicine. Furthermore, when a patient suffering from non-alcoholic fatty liver disease is treated with diet or medication, the disease proceeds toward healing, and the amount of protein / partial peptide varies accordingly. By measuring this, the therapeutic effect can be evaluated and determined. Therefore, the biomarker of the present invention can be used as an endpoint for determining drug effects.
  • the type and amount of protein in a biological sample can be measured by various methods.
  • a target protein including a protein fragment and a partial peptide
  • an antibody against it primary antibody
  • Immunoblot method The simplest method. Prepare test serum diluted in several stages, drop a certain amount (around 1 microliter) onto a suitable membrane such as nitrocellulose membrane, and air dry. After treatment with a blocking solution containing a protein such as BSA, washing and reacting with the primary antibody, and after washing, a labeled secondary antibody for detecting the primary antibody is reacted. After washing the membrane, the label is visualized and the concentration is measured.
  • ELISA An antibody against a protein or a partial peptide thereof is bound to a carrier such as a microtiter plate that has been subjected to special chemical modification in advance, a sample is serially diluted, and an appropriate amount thereof is added to a microtiter plate to which an antibody is bound, followed by incubation. Thereafter, washing is performed to remove uncaptured proteins and partial peptides. Next, a secondary antibody conjugated with a fluorescent or chemiluminescent substance or enzyme is added and incubated. For detection, evaluation is performed by adding each substrate and then measuring visible light by fluorescent or chemiluminescent substances or enzymatic reactions. A substance capable of binding to a protein or a partial peptide thereof may be used instead of an antibody. For example, an aptamer or the like can be used.
  • Patent Document 2 the method (see Patent Document 2) is exemplified below, but is not limited thereto.
  • microarray is a generic term for devices in which substances that can be bound to substances to be measured are arranged (arrayed) and immobilized on a carrier (substrate).
  • antibodies or aptamers against proteins and partial peptides may be used after being aligned and immobilized.
  • add a biological sample to the immobilized antibody, etc. bind the protein or partial peptide to be measured on the microarray, and then add the secondary antibody to which the fluorescent or chemiluminescent substance or enzyme is bound.
  • Detection may be performed by adding each substrate and then measuring the fluorescent or chemiluminescent substance or visible light from the enzyme reaction.
  • Mass spectrometry for example, an antibody against a specific protein and its partial peptide is bound to microbeads or a substrate (protein chip) that has been specially modified in advance.
  • the microbead may be a magnetic bead. Any material can be used for the substrate.
  • the antibodies used are (1) an antibody that recognizes only the full length of a specific protein, (2) an antibody that recognizes only a partial peptide, (3) an antibody that recognizes both a specific protein and its partial peptide, or A combination of (1) and (2), (1) and (3), or (2) and (3) may be used.
  • a sample is serially diluted with a stock solution or a buffer solution, and an appropriate amount thereof is added to a microbead or a substrate to which an antibody is bound, and incubated. Thereafter, washing is performed to remove uncaptured proteins and partial peptides. Then, the proteins and partial peptides captured on the microbeads or the substrate are analyzed by mass spectrometry using MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS, etc. Measure peak intensity. A certain amount of an appropriate internal standard substance is added to the original biological sample, its peak intensity is measured, and the ratio to the peak intensity of the target substance is determined to obtain the concentration in the original biological sample. I can know. This method is called immunoMS method.
  • the sample can be diluted with a stock solution or a buffer solution or a part of protein can be removed, and then separated by HPLC and quantified by mass spectrometry using an electrospray ionization (ESI) method.
  • ESI electrospray ionization
  • the concentration in the sample can be known by absolute quantification by the SRM / MRM method using an isotope-labeled internal standard peptide.
  • proteins and partial peptides can be analyzed by a method using two-dimensional electrophoresis, a method using surface plasmon resonance, or the like.
  • the present invention provides a method for detecting a non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis by subjecting a biological sample collected from a subject to two-dimensional electrophoresis or surface plasmon resonance and using the presence or absence of the biomarker as an index. Is also included.
  • SEQ ID NO: 2 is a part of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 3 is a peptide located at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 and detected in the serum of patients with liver disease.
  • the materials used are as follows.
  • the membrane is 0.22 ⁇ m MF-millipore membrane filter, TBS is 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.15 M NaCl, TBSt is TBS containing 0.05% Tween 20, blocking solution is TBSt containing 5% BSA, BSA-TBSt is TBSt containing 0.1% BSA.
  • the operation is as follows. Draw a 5 mm square grid on the membrane. 1 ⁇ L of a serum sample diluted with TBS is dropped into each grid, air-dried, and immersed in a blocking solution. After washing the membrane with TBSt, add 2 mL of the primary antibody (BMPEP1117R, 0.68 ⁇ g / mL) prepared with BSA-TBSt and let stand. Next, the membrane is washed with TBSt, and 2 mL of a secondary antibody (HRP conjugated anti-rabbit IgG, 1: 5000, GE Healthcare) prepared with BSA-TBSt is added and allowed to stand.
  • the primary antibody BMPEP1117R, 0.68 ⁇ g / mL
  • a secondary antibody HRP conjugated anti-rabbit IgG, 1: 5000, GE Healthcare
  • control serum a TBS dilution of serum obtained from a specific chronic hepatitis patient
  • the sample from each patient was tested twice. Dividing the chemiluminescence intensity of each serum spot diluted 1/125 by the chemiluminescence intensity of 1/125 diluted control serum on the same membrane to obtain the dot blot intensity ratio, and determining the average of the two measurements .
  • FIG. 1 shows the average value as a bar graph.
  • FL indicates fatty liver patients
  • NS indicates NASH patients
  • CH indicates chronic hepatitis patients.
  • Intensity ratio 0.6 is shown as a dotted line with a threshold value. In this way, the threshold was exceeded in 0/5 patients with fatty liver, 8/13 patients with NASH, and 7/7 patients with chronic hepatitis. That is, the value increases frequently in patients with NASH.
  • the intensity measured by this immunoblot reflects the serum concentration of the 35 kDa protein fragment of the inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor, so that the 35 kDa protein fragment is chronic hepatitis.
  • it is useful for the detection of fatty liver disease, especially NASH.
  • Agilent Multiple Affinity Removal System (column size, 4.6 mm ⁇ 100 mm) was used to analyze serum samples excluding albumin, IgG, IgA, transferrin, haptoglobin and antitrypsin.
  • MILLIPORE Microcon 10 Concentrate the flow through, add 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), and concentrate to a final volume of 50 ⁇ L or less.
  • SDS-PAGE 10% acrylamide gel
  • Western blotting is performed. That is, SDS-PAGE gel is PVDF Transfer to membrane, block overnight with 5% skim milk dissolved in TBSt, After washing with TBSt, react with the primary antibody (BMPEP1117R, 0.68 ⁇ g / mL) for 1 hour. Wash with TBSt. Next, secondary antibody (HRP conjugated anti-rabbit IgG, 1: 5000, GE Healthcare), wash with TBSt, and detect with LAS3000 (Fujifilm).
  • FIG. 2 shows the result.
  • Sample IDs such as FL, NS, and CH are the same as those in the second embodiment. From comparison with molecular weight markers, these bands are 35 kDa You can see that it is around.
  • FIG. 2 shows that there are no bands that react with the primary antibody (BMPEP1117R) other than a plurality of bands around 35 kDa. This indicates that the immunoblot result of Example 2 is equal to the sum of these bands. That is, the intensity measured by immunoblot reflects the total serum concentration of the 35 kDa protein fragment of the inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor.
  • the reason why it is divided into 3 to 4 bands is considered to be mainly based on the diversity of sugar chains bound to proteins since these are known to contain acidic sugar chains. This is because, as shown in Example 5, several bands similar to this figure are also observed by an antibody specific for the C-terminus of the 35 kDa protein fragment of the inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor.
  • Magnetic beads are of the Magnosphere MS300 / Carboxyl type (JSR) and supplied as a 10 mg beads / mL slurry.
  • MES is used as 0.1 M MES (pH 5.0, pH adjusted with NaOH).
  • the measurement by immunoMS method starts by adding a certain amount of pure peptide labeled with a stable isotope to a serum sample as an internal standard. 0.1% TFA-50% aceto Add 2 ⁇ L of 100 fmol / ⁇ L stable isotope labeled peptide dissolved in nitrile to 25 ⁇ L of serum. This is A.
  • Stable isotope-labeled peptide is RLAILPASAPPATSN 12C and 14N contained in the 6th P of PD are replaced by 13C and 15N, respectively, while the average m / z [M + H] + of the unlabeled peptide is 161.993, The average m / z [M + H] + of the labeled peptide is 1697.89.
  • the purpose of this method is to measure the average m / z [M + H] + 2422 of glycosylated peptides in serum, so in serum, non-glycosylated RLAILPASAPPATSNPD peptide with extremely low values should be used for standardization. However, the value is not necessarily changed depending on the case, so the stable isotope labeling was used for the purpose of standardization.
  • the next step is pretreatment of the serum sample.
  • 100 mM Tris- containing 0.3 M NaCl and 0.2% octylglucoside in the filtrate Add 500 ⁇ L of HCl (pH 7.5) to make the sample solution.
  • the magnetic beads are then used to prepare samples for immunoprecipitation and mass spectrometry.
  • Mass spectrometry is performed in linear mode using MALDI-TOF-MS (AXIMA CFR). Since the internal standard contains 200 fmol in the sample, the fmol number of the sample can be obtained by multiplying the intensity ratio of the mass peak between the sample and the internal standard by 200.
  • FIG. 3 shows the results of 2 healthy subjects, 5 fatty liver patients, and 13 NASH patients. Each sample is an average of 2 to 3 times, and the bar is its standard deviation.
  • NR indicates a healthy person, and the display of FL and NS is the same as in Example 2 including the ID number (however, the ID of CH does not correspond).
  • About the glycosylated peptide concentration in serum, 8.3 fmol / ⁇ L is shown as a dotted line with a threshold value. In this case, 0/2 cases were observed in healthy subjects, 1/5 cases in fatty liver patients, and 11/13 cases in NASH patients. That is, the value increases frequently in patients with NASH.
  • the mean value and standard deviation (number of examples in parentheses) of serum concentration (fmol / ⁇ L) are as follows. Healthy people: 1.75, 2.47 (2), fatty liver: 6.36, 5.18 (5), NASH: 17.10, 9.11 (13), chronic hepatitis: 17.93, 13.82 (2).
  • FIG. 4 is a scatter diagram of the results of fatty liver and NASH in FIG. 3. As described above, the average values are 6.36 fmol / ⁇ L and 17.10 fmol / ⁇ L, respectively. When t-test is performed, the p-value is 0.026. Thus, it can be said that the serum concentration of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor glycosylated partial peptide (SEQ ID NO: 3) is significantly higher in patients with NASH than in patients with fatty liver. That is, this peptide is a useful marker for detecting NASH patients.
  • SEQ ID NO: 3 inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor glycosylated partial peptide
  • FIG. 5 shows the area of the Receiver Operating Characteristics (ROC) curve and its Area Under Curve (AUC) for the differential diagnosis ability of fatty liver and NASH.
  • the AUC is 0.862, indicating that the inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor glycosylated partial peptide is a useful diagnostic marker capable of differential diagnosis of fatty liver and NASH.
  • the inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor sugar chain-added partial peptide SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 is abbreviated as p35 peptide.
  • the antibody may be polyclonal or monoclonal. The case of a polyclonal antibody is described below.
  • Example 3 35 kDa protein fragment of inter- ⁇ trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor It was described in Example 3 (FIG. 2) that an antibody (BMPEP1117R) specific for the N-terminus of (SEQ ID NO: 2) reacts with this fragment as intended. Next, it may be confirmed that BMPEP1117R captures this fragment and that the captured fragment reacts with an antibody specific for its C-terminus. Therefore, the following tests were conducted.
  • BMPEP1117C An antibody (BMPEP1117C) specific for the C-terminus was prepared according to the method of Example 1 using SATRERRLDYQEGPPGVEIS (217-236) of SEQ ID NO: 2 as an antigen. However, purification was performed to obtain total IgG from the antiserum. BMPEP1117R captures a 35 kDa protein fragment.Bead obtained by cross-linking BMPEP1117R to Protein G Sepharose beads using dimethyl pimelimidate (DMP) according to a conventional method (adding TBS twice the wet capacity of the beads). Stored as a suspension). This bead is called an antibody bead.
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • non-alcoholic fatty liver disease including non-alcoholic steatohepatitis can be detected using the biomarker disclosed in the present invention, it can be applied to uses in the diagnostic field including diagnostic agents.

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Abstract

【課題】　健常人と非アルコール性脂肪性肝疾患患者または脂肪肝と非アルコール性脂肪性肝炎において存在の有無、存在量が異なるタンパク質およびその部分ペプチドを用いて非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患を検出する方法、ならびに該タンパク質および該部分ペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎などの非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカーの提供。 【解決手段】　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３(糖鎖付加型を含む)で表されるその部分ペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカーとその利用。

Description

新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法
　本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患の検出に用い得る新規なタンパク質またはペプチドであるバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法に関する。
　生体の正常と正常以外の状態を呈する試料を用いてその差異を判別する手段としては、一般的には体外診断薬において用いられてきた技術が主たる従来技術である。体外診断薬のうち最も多いのが、血液中の成分をバイオマーカーとして分析することで診断検査を行うものである。本分野における従来技術では、血液中の単独の特定のタンパク質または分子量１万以下のいわゆるペプチドの存在量、あるいは酵素タンパク質の場合は活性の測定を行って、正常(健常人)試料と疾患試料との明らかな差をもって診断の一助としてきた。すなわちあらかじめ一定数の健常人と疾患患者由来の試料における単独もしくは複数の特定のタンパク質またはペプチドの量もしくは活性量を計測し、異常値と正常値の範囲を決め、評価する試料を同様の方法で測定し、異常値と正常値のどちらの範囲に属するかによって検査評価を行うものである。
　具体的な計測方法としては、試料をそのまま、またはあらかじめ希釈しておき、単独または複数の特定のタンパク質またはペプチドの量を、基質と反応させると発色する酵素によって標識された特異的１次抗体または２次抗体を用いて、試料の発色量で計測する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA; enzyme linked immmunosorbent assay)や化学発光測定法(CLIA; chemiluminescent
immunoassay)と１次抗体または２次抗体に結合させたラジオアイソトープを用いて計測する放射性免疫測定法(RIA; radioimmunoassay)、タンパク質が
酵素の場合は直接基質を与えて産生物を発色などで計測する酵素活性測定法などがある。抗体を用いるこれらの方法を酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法と呼ぶこととする。また酵素の基質分解産物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析する方法もある。またHPLCと質量分析装置を組み合わせたLC-MS/MS法ならびにこれを用いたselected reaction monitoring (SRM)/multiple reaction monitoring (MRM)法もある。また、試料に適当な
前処理を施した後、2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)を行ってタンパク質またはペプチドを分離した後、目的のタンパク質またはペプチドについて銀染色、クマシーブルー染色、あるいは対応する抗体を用いた免疫染色(ウエスタン・ブロッティング)を行って、試料中の濃度を測定する方法もある。また、生体試料をカラムクロマトグラフィーによって分画し、その画分に含まれるタンパク質とペプチドを質量分析によって分析する手法がある。またカラムクロマトグラフィーではなく、前処理としてプロテインチップを用いて質量分析する方法や、前処理として磁気ビーズを用いて質量分析する方法がある。
　さらに、発明者はビーズ(磁気ビーズを含む)に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質またはペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法を開発している。またインタクトなタンパク質の解析を目的としてトリプシンなどで分解した後、上記の方法で質量分析まで行う方法も報告されている(特許文献１参照)。しかしいずれもインタクトなタンパク質の性質を利用して、そのまま分画し、または特異的に吸着するタンパク質分子を選別して質量分析で解析するものである。
　非アルコール性脂肪性肝疾患(nonalcoholic fatty liver disease)はNAFLD
と略称され、飲酒歴がない(20 g/日以下)にもかかわらず、アルコール性肝障
害に類似した脂肪沈着を特徴とする肝組織所見を示す。HCVまたはHBVのようなウイルス性ないし自己免疫性の場合は、この疾患から除外される。この疾患は肥満などを伴うメタボリックシンドロームの肝臓における表現型とみなされている。非アルコール性脂肪性肝疾患は単純性脂肪肝と進行性の非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis)に大きく分かれる。後
者はNASHと略称される。NASHは肝線維化を伴うことが多く、肝硬変、さらには肝細胞がんに進行することが明らかにされたことから、近年注目を集めるようになった(非特許文献１参照)。以下、単純性脂肪肝を単に脂肪肝と称する。
　脂肪肝は通常の健診で血中中性脂肪値が高いこと、肥満があることなどから疑われ、腹部超音波検査やCTを行って診断される。非飲酒者の脂肪肝では約40％に肝障害を伴うことに注意を要する。非アルコール性脂肪肝ではNASHに移行するものがあるとされるにもかかわらず、簡便な血液検査方法がない。
　NASHは非アルコール性脂肪性肝疾患の重症型とされるが、通常の血液の生化学的検査、とくにアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の値が軽度に上昇することが認められる程度で、見過ごされることが多く、脂肪肝と同様に特定の検査方法がないことが問題とされてきた。
特開2004-333274号公報
特開2006-308533号公報
日本肝臓学会編「NASH・NAFLDの診療ガイド」(2006)
N. Benkiraneら、J. Biol. Chem. Vol. 268, 26279-26285, 1993
　本発明は、健常人と非アルコール性脂肪性肝疾患患者または脂肪肝と非アルコール性脂肪性肝炎患者において存在の有無、存在量が異なるタンパク質およびその部分ペプチドを用いて非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患を検出する方法を提供し、さらに該タンパク質および該部分ペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎などの非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカーの提供を目的とする。
　本発明者は、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出する方法について鋭意検討を行い、過去に本発明者が同定した肝疾患バイオマーカーのなかに非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患を検出することができるタンパク質断片ならびにその部分ペプチドを見出した。
　具体的には、本発明者は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３(糖鎖付加型を含
む)で表されるその部分ペプチドが非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカーとして用い得ることを見出した。
　本発明者らは、さらに、イムノ・ブロット法、immunoMS法を用いることにより、このタンパク質断片と部分ペプチドを測定することに成功し、ELISAが構築可能なことを確認して、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならび
に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
[２]　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならび
に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のタンパク質断片またはペプチド断片からなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
[３]　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならび
に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカー。
[４]　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならび
に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のタンパク質断片またはペプチド断片からなる非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカー。
[５]　生体試料中の[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーを測定することを含む、非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
[６]　生体試料中の[３]および[４]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝炎バイオマーカーを測定することを含む、非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
[７]　生体試料中の[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患していると判断する非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
[８]　生体試料中の[３]および[４]のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝炎バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患していると判断する非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
[９]　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる[５]および[７]のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
[１０]　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる[６]および[８]のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
[１１]　[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための非アルコール性脂肪性肝疾患の検出キット。
[１２]　[３]および[４]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための非アルコール性脂肪性肝炎の検出キット。
[１３]　[１]および[２]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む非アルコール性脂肪性肝疾患の検出キット。
[１４]　[３]および[４]のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む非アルコール性脂肪性肝炎の検出キット。
[１５]　 抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている[１３]または[
１４]に記載の検出キット。
　本発明によれば、被験者由来の生体試料中の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配
列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質または該タンパク質の少なくとも１つの消化分解産物ペプチド等の部分ペプチドの種類および量を計測することにより、被験者が非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患しているかを診断することができる。
　本発明は、また精度および特異性の両方が極めて高い診断システムを提供する。本発明によって血液のような生体試料について特定の検査方法がなかった非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎に対して精度の高い診断がはじめて可能になる。また、本発明によって、肝がんへの肝疾患の進行度がどの程度かも診断することができる。さらに、本発明のバイオマーカーは、薬剤効果判定においても有用性が高い。
脂肪肝(FL)、非アルコール性脂肪性肝炎(NS)、慢性肝炎(CH)の各患者の血清に１次抗体としてBMPEP1117Rを用いてイムノ・ブロット法を適用した結果を示す図である。 実施例２(図１)のイムノ・ブロットがインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片を測定していることを証明する図である。 immunoMS法による配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチドの血清中濃度の測定結果を示す図である。ただし、健常人をNRとして示す。 immunoMS法による配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチドの血清中濃度の測定結果を示す散布図で、脂肪肝(FL)とNASHを比較している。 immunoMS法による配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチドの血清中濃度による診断能力を示すROC曲線とAUC値で、脂肪肝(FL)とNASHを鑑別診断できる能力を有していることを示す。 BMPEP1117R がインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片を捕捉すること、捕捉された断片がそのC末端に特異的な抗体(BMPEP1117C)と反応することを示す図である。
　本発明は、被験者が非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患しているとき、インタクトなタンパク質および／またはその部分ペプチドの種類および量を検出すると同時に、インタクトなタンパク質とその部分ペプチドの種類と量の変動を測定することにより被験者が非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患しているか、非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している場合の肝疾患の進行度を診断する方法である。ここで、ペプチドは、一般的には分子量１万以下のアミノ酸が連結したものをいい、あるいはアミノ酸残基の数としては数個から50個以下程度のものをいう。本発明においては、インタクトなタンパク質の部分ペプチドを非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカーとして用い得るが、部分ペプチドという場合、インタクトなタンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドであって分子量１万以下のものをいう。本発明において、インタクトなタンパク質の部分ペプチドとは、インタクトなタンパク質の有するアミノ酸配列の一部の部分的アミノ酸配列を有するペプチドをいい、転写・翻訳による発現合成過程で部分ペプチドとして生成する場合と、インタクトなタンパク質として合成された後に、生体内で消化分解を受けて消化分解産物ペプチドとして生成する場合がある。この原因としては、生体が非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎等の正常以外の状態にあるときに、タンパク質の合成および制御機構が脱制御されることが挙げられる。すなわち、本発明は、生体内のタンパク質の発現合成および／または消化分解を指標として被験者が正常状態であるか非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患しているかを判別し、また非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している場合の疾患の進行度をも評価判別する方法でもある。本発明において、非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎の検出とは、被験者が非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎に罹患しているかどうかの評価判別、すなわち診断を行うことをいう。また、被験者がより重篤な肝疾患に罹患するリスクの評価等も含み得る。
　本発明の方法において、非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカーとして用い得るインタクトなタンパク質として、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDa
タンパク質断片が挙げられる。さらに、本発明の方法において、非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカーとして用い得るインタクトなタンパク質として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片から生じる分子量1万以上のタンパク
質断片も含まれる。
　また、非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカーとして用い得るこれらの部分ペプチドとして、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドが挙げられる。本発明においては、上記のインタクトなタンパク質および部分ペプチドをマーカーとして用いるが、配列番号１～３に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるタンパク質およびペプチドも含み、これらのタンパク質またはペプチドも本発明の方法においてバイオマーカーとして用いることができる。ここで、「１個または数個」とは「1個または３個」、「１個または２個」または「１個」をいう。さらに、非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカーとして用い得るこれらの部分ペプチドとして、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３で表されるアミノ
酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからから生じるアミノ酸残基５個以上のペプチド断片も含まれる。ペプチド断片についてアミノ酸残基５個以上とした理由は、非特許文献２の以下の記載による。すなわち、ヒストンH3のC端(130-135)のアミノ酸残基配列IRGERAについてRをKに置換したペプチドおよびIRを欠失させ、代わりにCGGをGERAに結合させたペプチドCGGGERAがペプチドIRGERAを免疫原として得た抗体によって認識されたとの報告である。これは、抗原性の認識が４個以上のアミノ酸残基からなるペプチドによってなされることを示している。本発明では、ヒストンH3のC端以外にも一般性を持たせるために、残基数を１つ増やして、５個以上としたが、このような低分子のペプチドをも対象とすることは、イムノ・ブロット法、ELISA法、immunoMS法などのような免疫学的手法を用いて検出ならびに分別する方法を用いるときに重要である。
　なお、インタクトなタンパク質またはその部分ペプチドに糖鎖が付加されることがある。これらの糖鎖が付加したタンパク質および部分ペプチドも非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカーとして用い得る。このような部分ペプチドとして、例えば配列番号３で表されるペプチドが挙げられる。さらに本発明は、これらの糖鎖の付加を指標に肝がんを検出する方法も包含する。
　なお、本発明において、バイオマーカーを定量してもよいし、定性により存在、非存在を決定してもよい。
　本発明で血清等の生体試料中のバイオマーカーを分離する方法としては、二次元電気泳動あるいは二次元クロマトグラフィーを用い得る。この場合の２種類のクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィーから選択すればよい。またLC-MS/MS法を用いたSRM/MRM法で定量することもできる。さらに、発明者が開発したビーズ(磁気ビーズを含む)に対象となるタンパク質またはペプチドに対する抗体を結合させ、これにより測定したいタンパク質またはペプチドを捕捉したのち、ビーズから溶出して質量分析により測定するimmunoMS法を用いれば、二次元電気泳動あるいはクロマトグラフィーを用いることなく、簡便に目的のタンパク質、タンパク質断片、ペプチドの有無あるいは量を評価することができる。
　本発明の方法によれば、被験者の非アルコール性脂肪性肝疾患の予後に関するリスクの大きさも評価することができ、予防医学にも有用である。さらに、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患した患者に食事療法や薬物療法を行った場合、その疾患は治癒する方向に進み、それに応じてタンパク質／部分ペプチドの量も変動する。これを測定することにより、治療効果の評価判定を行うこともできる。従って、本発明のバイオマーカーは、薬剤効果判定のエンドポイントとして利用できる。
　生体試料中のタンパク質の種類および量は種々の方法で測定することができる。対象となるタンパク質(タンパク質断片および部分ペプチドを含む)が特定されていて、それに対する抗体(１次抗体)が得られている場合は、以下の方法を用いることができる。
　１．イムノ・ブロット法
　最も単純な方法である。数段階に希釈した被験血清を用意し、その一定量(１マイクロリットル前後)をニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに滴下し、風乾する。BSAなどのタンパク質を含むブロッキング溶液で処理した後、洗浄し、１次抗体を反応させ、洗浄後１次抗体を検出するための標識された２次抗体を反応させる。メンブレンを洗浄後、標識を可視化して濃度を測定する。
　２．ウエスタン・ブロット法
　等電点ないしSDS-PAGEを含む一次元ないし二次元ゲル電気泳動を行った後で、分離されたタンパク質を一旦、ニトロセルローズ・メンブレンなどの適当なメンブレンに転写し、１次抗体と標識された２次抗体を用いて上述のイムノ・ブロット法と同様に操作して、目的のタンパク質の存在量を測定する。
　３．ELISA
　タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、試料を段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加えてインキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドを除く。次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。抗体の代わりにタンパク質またはその部分ペプチドに結合し得る物質を用いてもよい。例えば、アプタマー等を用いることができる。
　さらに以下に方法(特許文献２参照)を例示するが、それらには限定されない。
　４．マイクロアレイ(マイクロチップ)を用いた方法
　マイクロアレイとは、担体(基板)上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列(アレイ)固定化させたデバイスを総称していう。本発明の場合、タンパク質および部分ペプチドに対する抗体またはアプタマーを整列固定化させて用いればよい。測定は、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質または部分ペプチドを結合させ、次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた２次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
　５．質量分析法
　質量分析法においては、例えば、特定のタンパク質とその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロビーズ、もしくは基板(プロテインチップ)に結合させる。マイクロビーズは磁気ビーズであってもよい。基板の素材は問わない。使用する抗体は(１)特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、(２)部分ペプチドのみを認識する抗体、(３)特定のタンパク質とその部分ペプチドの両方を認識する抗体のすべて、または上記(１)と(２)、(１)と(３)、もしくは(２)と(３)の組み合わせでもよい。試料を原液または緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロビーズまたは基板にこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドを除く。その後、マイクロビーズまたは基板上に捕捉されたタンパク質および部分ペプチドをMALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MSなどを用いた質量分析によって分析し、タンパク質、タンパク質断片および部分ペプチドのピークの質量数とピーク強度を計測する。適当な内部標準物質をもとの生体試料に一定量加えておき、そのピーク強度を測定して、対象となる物質のピーク強度との比を求めることにより、もとの生体試料中の濃度を知ることができる。この方法をimmunoMS法という。また試料を原液または緩衝液で希釈または一部のタンパク質を除去した後、HPLCで分離、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法を用いた質量分析によって定量することができる。その際に、同位体標識した内部標準ペプチドを用いたSRM/MRM法による絶対定量によって試料中の濃度を知ることができる。
　さらに、上記の方法の他、二次元電気泳動を用いた方法、表面プラズモン共鳴を用いた方法等によっても、タンパク質および部分ペプチドを解析することが可能である。
　本発明は、被験者から採取した生体試料を二次元電気泳動ないし表面プラズモン共鳴法に供し、前記バイオマーカーの有無を指標に非アルコール性脂肪性肝疾患ないし非アルコール性脂肪性肝炎を検出する方法をも包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　配列番号２のN末端に特異的な抗体(BMPEP1117R)の作製
　RLAILPASC-KLHをウサギに免疫して一定期間後採血して、対応するペプチドを結合させたカラムに吸着させて精製することにより作製した。配列番号２は配列番号１の一部であり、配列番号３は配列番号２のN末端にあり、肝疾患患者の血清中に検出されるペプチドである。
配列番号１　インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体
001 MKPPRPVRTC SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF RPGVLSSRLL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR VMNIKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER RLDYQEGPPG VEISCWSVEL
配列番号２　インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片
001 RLAILPASAP PATSNPDPAV SRVMNIKIEE TTMTTQTPAP IQAPSAILPL
051 PGQSVERLCV DPRHRQGPVN LLSDPEQGVE VTGQYEREKA GFSWIEVTFK
101 NPLVWVHASP EHVVVTRNRR SSAYKWKETL FSVMPGLKMT MDKTGLLLLS
151 DPDKVTIGLL FWDGRGEGLR LLLRDTDRFS SHVGGTLGQF YQEVLWGSPA
201 ASDDGRRTLR VQGNDHSATR ERRLDYQEGP PGVEISCWSV EL
配列番号３　インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチド
RLAILPASAPPATSNPD
　上記部分ペプチドは下に示すように糖鎖が付加された状態で血清中に存在した。
RLAILPASAPPATSNPD + -GlcNAc-Hex-GlcNAc-Hex
　健常人、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、慢性肝炎の各患者血清に１次抗体としてBMPEP1117Rを用いたイムノ・ブロット法の適用
　用いた材料は以下のとおりである。メンブレンは0.22 μm MF-millipore メンブレンフィルター、TBSは0.15 M NaClを含む20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、
TBStは0.05% Tween 20を含むTBS、ブロッキング溶液は5% BSAを含むTBSt、
BSA-TBStは0.1% BSAを含むTBSt。
　操作は以下のとおりである。メンブレンに5 mm角の格子を描く。各格子内
にTBSで希釈した血清サンプルを1 μL滴下して風乾後、ブロッキング溶液に
浸漬する。TBStでメンブレンを洗浄したのち、BSA-TBStで調製した1次抗体(BMPEP1117R, 0.68 μg/mL)を2 mL加えて放置する。次にメンブレンをTBStで
洗浄し、BSA-TBStで調製した2次抗体(HRP conjugated anti-rabbit IgG, 1:5000, GE Healthcare)を2 mL加えて放置する。TBStでメンブレンを数回洗
浄し、さらにTBSで洗浄したのち、各スポットの化学発光の強度を測定する。メンブレンごとに特定の慢性肝炎患者から得た血清(対照血清と呼ぶ)のTBS希釈液を滴下して同様に処理する。
　各患者からのサンプルについて2回繰り返して試験した。1/125希釈した各血清のスポットの化学発光の強度を同一メンブレン上の1/125希釈した対照血清の化学発光の強度で割ってドットブロット強度比とし、2回の測定の平均値を求めた。
　図１は上記の平均値を棒グラフで示したものである。FLは脂肪肝患者、NSはNASH患者、CHは慢性肝炎患者を示す。強度比0.6を閾値として点線で示した。このようにすると閾値を越える場合が、脂肪肝患者では0/5例、NASH患者では8/13例、慢性肝炎患者では7/7例に認められた。すなわち、NASH患者では高頻度で値が上昇している。実施例３に示すが、このイムノ・ブロットで計測される強度はインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタン
パク質断片の血清中濃度を反映しているので、該35 kDaタンパク質断片が慢
性肝炎のみならず、脂肪性肝疾患、とくにNASHの検出に有用であることを示している。
　実施例２のイムノ・ブロットがインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片を測定していることの証明
　Agilent Multiple Affinity Removal System (column size, 4.6 mm×100
mm)を用いて、血清サンプルからalbumin、IgG、IgA、transferrin、haptoglobin、antitrypsinを除いて分析した。血清35 μLにBuffer A 175 μLを加え
て混和、0.45 μm遠心フィルターで不溶物を除去、その200 μLを供与し、
0.5 μL/minで10分間buffer Aを流す。Microcon 10 (MILLIPORE)を使って
flow throughを濃縮し、さらに20 mM phosphate buffer (pH 7.0)を加えて最
終容量が50 μL以下となるように濃縮する。濃縮物に対しタンパク質定量を
行った後、150 μg分についてSDS-PAGE (10% アクリルアミドゲル)を行い、
次いでウェスタン・ブロッティングを行う。すなわち、SDS-PAGE gelをPVDF
膜に転写し, TBStに溶解した5% スキムミルクで一夜ブロッキングを行い、
TBStで洗浄したのち、1次抗体(BMPEP1117R, 0.68 μg/mL)と1時間反応させて
TBStで洗浄する。次に、2次抗体(HRP conjugated anti-rabbit IgG, 1:5000,
GE Healthcare)と反応させ、TBStで洗浄し、LAS3000(富士フイルム)で検出
を行う。
　図２はその結果を示したものである。FL、NS、CHなどのサンプルIDは実施例２と同じである。分子量マーカーとの比較から、これらのバンドが35 kDa
前後にあることが分かる。また図２は35 kDa前後の複数のバンド以外に1次
抗体(BMPEP1117R)に反応するバンドが皆無であることを示している。このことは実施例２のイムノ・ブロットの結果がこれらの複数のバンドの総和に等しいことを表す。すなわち、イムノ・ブロットで計測される強度はインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片の総血清中
濃度を反映する。3～4バンドに分かれているのは、これらが酸性糖鎖を含むことが知られているので、主としてタンパク質に結合している糖鎖の多様性に基づくものと判断される。実施例５に示すように、インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片のC末端に特異的な抗体
によってもこの図と同様の数個のバンドが見られるからである。
　immunoMS法による配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチド(配列番号３)の血清中濃度の測定
　immunoMS法に用いるビーズの作製は以下のとおりである。磁気ビーズはMagnosphere MS300/Carboxylタイプ(JSR社)あり、10 mg beads/mLのスラリーと
して供給される。MESは0.1 M MES (pH 5.0、NaOHでpH調整)として用い、EDC
は1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorideであ
り、10 mg/mL (52.2 mM)の濃度になるように氷冷したMESに用時溶解して調製
する。分散させたビーズスラリー1 mL (10 mg beads)を、マイクロチューブ
(2.0 mL 容量)に分取する。上清の除去は、磁気スタンド磁気ビーズを沈降さ
せてのち行う。MESを1.0 mL加えて撹拌した後、上清を除去し、抗体であるBM
PEP1117R溶液を加えて室温でゆるやかに攪拌する。EDCを100 μL加え、室温
でゆるやかに攪拌して反応させる。TBStで洗浄することを4回繰り返した後、TBSt 1 mLを加えて4℃に保存する。
　immunoMS法による測定は、内部標準として血清サンプルに安定同位体で標識した純粋なペプチドを一定量加えることから始まる。0.1% TFA-50% aceto
nitrileに溶解した100 fmol/μLの安定同位体標識ペプチド2 μLを血清25 μLに加える。これをAとする。安定同位体標識ペプチドはRLAILPASAPPATSN
PDの6番目のPに含まれる12Cおよび14Nをそれぞれ、13Cおよび15Nで置換したものであり、非標識ペプチドの平均m/z [M+H]+が1691.93であるのに対し、
標識ペプチドの平均m/z [M+H]+は1697.89である。本法では血清中の糖鎖付
加型ペプチドの平均m/z [M+H]+ 2422を測定するのが目的なので、血清ではき
わめて低値の糖鎖非付加型のRLAILPASAPPATSNPDペプチドを標準化に用いることが可能であるが、場合によってその値が変動しないとも限らないので、標準化の目的で安定同位体標識体を用いた。
　次のステップは血清サンプルの前処置である。上述のAに0.1% TFAを475 μL加えて混和し、100℃で15分間熱処理する。氷中で冷却後、超音波処理を行って遠心し、上清をmicrocon 10 (MILLIPORE)に移して14000×g、4℃で80
分間遠心する。ろ液に0.3 M NaClと0.2% octylglucosideを含む100 mM Tris-
HCl (pH 7.5)を500 μL加えてサンプル溶液とする。
　次に磁気ビーズを用いて免疫沈降と質量分析のためのサンプル調製を行う。磁気ビーズ懸濁液20 μLを先のサンプル溶液に加えて、ゆるやかに攪拌す
る。上清の除去および、洗浄は磁気スタンド磁気ビーズを沈降させてのち行う。上清を除去した後、TBSを加えて洗浄することを繰り返す。さらに、50 mM ammonium bicarbonate (pH 7.5)で洗浄する。2-propanol:H2O:formic acid (4:4:1)溶液を50 μL加えて対象のペプチドを溶出する。溶出操作を合計2回
繰り返して溶出液を計100 μL回収した後、遠心真空ポンプで乾固する。乾固
した後、0.095% TFA-5% acetonitrile溶液を20 μL加えて超音波(160 W)で
再溶解し、C18チップ(PerfectPure C18 Tip, Eppendolf)にペプチドを吸着さ
せ、0.1% TFAでチップを洗浄した後、0.1% TFA-50% acetonitrile 2 μLでペ
プチドを溶出して質量分析用ターゲットプレートに添加して乾燥させる。次いで、マトリクス溶液を載せる。すなわち0.3 mg/mL CHCAのethanol:acetone (2:1)溶液 1 μLをターゲットプレート上の乾燥したサンプルに滴下し、乾燥
させる。
　質量分析はMALDI-TOF-MS (AXIMA CFR)を用い、リニアモードで測定を行
う。内部標準はサンプル中に200 fmol入っているので、サンプルと内部標準
の質量ピークの強度比を200倍するとサンプルのfmol数が求められる。
　図３に健常人2例、脂肪肝患者5例、NASH患者13例の結果を示す。各サンプル2回から3回の平均値であり、バーはその標準偏差である。NRは健常人を示しており、FL、NSの表示はID番号を含めて実施例２と同じである(ただし、CHのIDは対応しない)。血清中の糖鎖付加型ペプチド濃度について、8.3 fmol
/μLを閾値として点線で示した。このようにすると閾値を越える場合が、健常人では0/2例、脂肪肝患者では1/5例、NASH患者では11/13例に認められた。すなわち、NASH患者では高頻度で値が上昇している。血清中濃度(fmol/μL)の平均値と標準偏差(カッコ内は例数)は以下のとおりである。健常人: 1.75, 2.47 (2)、脂肪肝：6.36, 5.18 (5)、NASH：17.10, 9.11 (13)、慢性肝炎：
17.93, 13.82 (2)。
　図４は図３の脂肪肝とNASHにおける結果を散布図としたもので、前述のように平均値はそれぞれ6.36 fmol/μL、17.10 fmol/μL で、t-検定を行う
と、p値は0.026となり、NASH患者では脂肪肝患者より有意にインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチド(配列番号３)の血清中濃度が高いことがいえる。すなわち、このペプチドはNASH患者を検出する上で有用なマーカーとなる。
　図５は脂肪肝とNASHの鑑別診断能を受信者動作特性(ROC: Receiver Operating Characteristics)曲線とそのArea Under Curve (AUC)の面積を示
したものである。AUCは0.862であり、インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチドは脂肪肝とNASHを鑑別診断できる有用な診断マーカーであることを示している。なお、図５ではインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体糖鎖付加型部分ペプチド(配列番号３)をp35 peptideと略称している。
　インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片
測定のためのELISAの構築
　常法にしたがい、エピトープを異にする2種類の抗体で抗原を挟む形のサンドイッチ法を構築する。抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。以下にポリクローナル抗体の場合について記載する。
　インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片
(配列番号２)のN末端に特異的な抗体(BMPEP1117R)が目的どおり、この断片と反応することについては実施例３(図２)に記載した。次に、BMPEP1117R がこ
の断片を捕捉すること、捕捉された断片がそのC末端に特異的な抗体と反応することが確かめられるとよい。そのために、以下の試験を行った。
　配列番号２のSATRERRLDYQEGPPGVEIS (217-236)を抗原として実施例１の方
法にしたがってC末端に特異的な抗体(BMPEP1117C)を作製した。ただし、精製は抗血清からtotal IgGを取得する精製であった。BMPEP1117R が35 kDaタン
パク質断片を捕捉する実験はBMPEP1117Rを常法にしたがってdimethyl pimelimidate (DMP)を用いてProtein G Sepharoseビーズにクロスリンクして
得たビーズ(ビーズの湿容量の2倍容量のTBSを加えて懸濁液として保存する)を用いて行った。このビーズを抗体ビーズと称する。
　インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断の存在が確認されている肝炎患者3例の血清のそれぞれ35 μLにTBS 1 mLを加えて混和し、上述の抗体ビーズ懸濁液30 μLを加える。室
温で2時間ゆるやかに攪拌した後、全体をスピンカラムに移す。遠心後TBSを加えて遠心するビーズの洗浄操作を繰り返した後、遠心して上清を除去する。ろ過面上に残った抗体ビーズに結合しているタンパク質断片を0.2 M glycine-HCl (pH 2.5) 100 μLで溶出する。これを繰り返して計200 μL
の上清を得る。1 M Trisを加えて中和し、microcon 10 (MILLIPORE)を用い
て、溶媒を20 mM phosphate buffer (pH 7.0)に置換しながら、遠心を繰り
返して40 μLまで濃縮する。これをサンプルとして10% アクリルアミドゲル
でSDS-PAGEを行う。次いで、1次抗体をBMPEP1117C (1:1000)、2次抗体をHRP conjugated anti-rabbit IgG (1:5000) (GE Healthcare)としてウエスタン
・ブロッティングを行う。
　上記のウエスタン・ブロッティングの結果を図６に示す。テストされた慢性肝炎患者3例のいずれでも、35 kDa付近に数個のバンドが見られ、その位
置は図２に一致している。このことは、BMPEP1117R がインターαトリプシン
インヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片(配列番号２)を捕捉する
こと、捕捉された該断片がそのC末端に特異的な抗体と反応することを示している。すなわち、インターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDa
タンパク質断片(配列番号２)測定のためのELISAの構築が可能であることが示された。
本発明において開示されたバイオマーカーを用いて、非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性脂肪性肝疾患を検出することができるので、診断薬を含む診断分野における用途に適用できる。

Claims (15)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
  2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のタンパク質断片またはペプチド断片からなる非アルコール性脂肪性肝疾患検出のためのバイオマーカー。
  3. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドからなる非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカー。
  4. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の35 kDaタンパク質断片ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはペプチドから生じるアミノ酸残基５個以上のタンパク質断片またはペプチド断片からなる非アルコール性脂肪性肝炎検出のためのバイオマーカー。
  5. 　生体試料中の請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーを測定することを含む、非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
  6. 　生体試料中の請求項３および４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝炎バイオマーカーを測定することを含む、非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
  7. 　生体試料中の請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患していると判断する非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
  8. 　生体試料中の請求項３および４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの非アルコール性脂肪性肝炎バイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患していると判断する非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
  9. 　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる請求項５および７のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法。
  10. 　検出がイムノ・ブロット法またはウエスタン・ブロット法、酵素もしくは蛍光もしくは放射性物質標識抗体法または質量分析法またはimmunoMS法または表面プラズモン共鳴法により行われる請求項６および８のいずれか１項に記載の非アルコール性脂肪性肝炎の検出方法。
  11. 　請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための非アルコール性脂肪性肝疾患の検出キット。
  12. 　請求項３および４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを測定するための非アルコール性脂肪性肝炎の検出キット。
  13. 　請求項１および２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む非アルコール性脂肪性肝疾患の検出キット。
  14. 　請求項３および４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーを含む非アルコール性脂肪性肝炎の検出キット。
  15. 　抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている請求項１３または１４に記載の検出キット。
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