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WO2010026666A1 - グルクロン酸転移酵素およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

グルクロン酸転移酵素およびそれをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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WO2010026666A1
WO2010026666A1 PCT/JP2008/066365 JP2008066365W WO2010026666A1 WO 2010026666 A1 WO2010026666 A1 WO 2010026666A1 JP 2008066365 W JP2008066365 W JP 2008066365W WO 2010026666 A1 WO2010026666 A1 WO 2010026666A1
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WO
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base sequence
represented
sequence
protein
complementary
Prior art date
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PCT/JP2008/066365
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English (en)
French (fr)
Inventor
小埜栄一郎
福井祐子
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Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
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Publication date
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Definitions

  • the present invention relates to books, documents, documents, documents containing them, and transformants.
  • La is the name of a secondary plant metabolite of the huido system, and its seed, at, is the main pigment that determines the colors of red and purple.
  • the same species, Lavono has a yellow color on its own, but it has a large influence on the color of the flower by forming an atomic complex, so it is called an auxiliary (pigment).
  • the long side of the flower color by Gume is called Gumete.
  • the Sekigi valve is loaded with 7 gkunids (guk, or guk coalesce) that are the seeds of the lab, and this seems to function as a function (se S ea Phy oche sy 2739 2741 1972).
  • () g An amino acid sequence represented by g8 has an amino acid sequence with 9 homology, and a tactic property having a glucidity is a
  • Guk coal is produced by touching the protein described in (6) to produce a guk coal from the P g material.
  • the clear Quo is useful for the production of new glucides, for example, by being introduced into transformants. It has an activity to form various forms of products, which have a wide variety of isomerism. A simple description of the surface
  • the target task (V 7G) 2 () is the one that shows the results of the PC analysis of API.
  • 2 () is a figure showing the results of PC analysis of (Api Pg).
  • 2 (C) shows the results of the PC analysis of Appi's 7 Gukunai. 2 () is
  • Figure 3 shows the results of analyzing the isomerism of the 7G container.
  • Figure 4 is a graph showing the results of 7G gene analysis by quantitative RPCR. Re-text
  • a flower that forms a flower of the genus Stagniaceae belonging to the genus Clevisaceae (ca ec metosine physics 3 (3 (6 cou a oy) g ucosy) 6 cou a oy g ucos de 5 g cos de G Yes Lab (3 g ucu onosy) c on de (, Toyo University Master's Letter, Heisei 5) Labon 7 Guknai with this as its skeleton shows a remarkable gummy fruit for Atonium. It is thought that it is related to the color of the green.
  • an ano-sequence represented by (c) g: 8 has 5 amino acids substituted, and if added, an ano-sequence, Examples of such a high-quality property are listed.
  • tanks for example, in the ano sequence represented by the array: 8, for example, ⁇ 15, ⁇ 14, 13, ⁇ 12, ⁇ 11, ⁇ 10, ⁇ 9, ⁇ 8, 7, 6 (1 ⁇ , ⁇ 5, ⁇ 4, ⁇ 3, ⁇ 2, and annotated, substituted, and / or added anolines, and a P-type property.
  • Ano's The number of conversions and / or additions is generally small.
  • P-glucidates the acid groups of carbohydrates such as ride, sti and guna for example,
  • P G for example, P G
  • equos are, for example, quas composed of a base sequence complementary to the 62nd base sequence of the base sequence represented by the sequence: 7, or an sequence represented by the sequence: 8.
  • the base sequence of the duo is a part or part of the quad that consists of a complementary base sequence.
  • a stringent condition may be a difference between a stringed condition, a stringed condition, and a stringed condition.
  • the conditions are 5 X S SC 5X, 0/5.
  • the quiesce quotient includes the base 62nd base sequence of the base sequence represented by the sequence 7 when calculated using the default parameters by homosexual search software such as S and BS. Or an array of 8 in the sequence: 60, approximately 70, 7 above, 72 above, 73 above, 74 above, 75 above, 76 above, 77 above, 78 above, 79 above, 80, 8 above, 82 above, 83 above, 84 above, 85 above, 86 above, 87 above, 88 above, 89 above, 90 above, 9 above, 92 above, 93 above, 94 above, 95 above, 96 above , 97, 98, 99, 99, 99 2, 99 3, 99 4, 99 5, 99 6, 99 7, 9 9/8, or 99 9 homology You can raise
  • the homology of the ano-base sequence is determined by the fact that Am and Bs (P o c a c a S c
  • the parameter is set to 50 odg 3, for example. .
  • a clear form of the protein is a protein consisting of an amino acid sequence represented by Sequence 8.
  • Another embodiment of the protein is a protein having an anoline represented by sequence 8.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 comprises an amino acid sequence in which ⁇ 5 anoic acids are substituted and / or added. It is a quality possessed. This attack is represented by array 8.
  • ano is missing, substituted, and / or added in the sequence of anatomical proteins, it means the same or one or more ano In this case, it means that there is substitution, insertion and / or addition of one or more amino acids, and two or more of substitution, insertion and addition occur simultaneously.
  • Ano 0 in a group They are interchangeable with each other.
  • A Isoin, Neu, Non, Non, Ara, 2Anobuta, Methio, Mechise, Gu, Tiara, Kuala B Aslagin, Guta, Isoasragi, Isocuta, 2 Zipi, 2A Nos Asragin, Guta D: The, Agi, Ochi, 24 Anobuta, 2 3 Ano Pio E: P, 3 Pun, 4 P
  • the bright tank can also be produced by chemical synthesis methods such as F oc (Omechi Oki Cabo) and oc (Octo Cabo).
  • chemical synthesis can be performed by using, for example, Address Dometech, Key, Fair, Putty Technology System, Se, Septi, Shimadzu Corporation.
  • the contents are, for example, id, sti, ku, and guna.
  • the body is, for example, P glucic acid.
  • a clear form of the protein undergoes a reaction that transfers the carrier glucide from P gucic acid to form glucan P.
  • Containers include Flavo, Furano, Rano, Isolab, Lab, Oh, and Tekin.
  • squids, squishes, apis, ons, chis, diosmets, ands can be mentioned as flavos.
  • lanthanum include ketine, chi, and hu.
  • An example of a runo is Nan.
  • Isolabs include, for example, distein, And e.
  • Lab C may include, for example, ki, isoxy and oxygen.
  • o can be mentioned.
  • categorization include categorization and textiles.
  • the sti includes a st (esve ao) and its id (p ced).
  • Rigna includes () Gino (() P no es no, () To (() P e o)) Cesano (() esa no) ()
  • Gino (() eco so ac es no) () Sesa (() esa ca eco 1) () () Sesan 2 (() Sesam Ca eco 2) (2) () Sesa 2 (() Ep sesa Ca eco 2) E 2), Gino (aa es o), etc. are included.
  • the lab has a hydroxyl group on the B 4 group.
  • the condition, squeeze, api, o, diosmethy, kuo, ke, and na is a container.
  • a gun consisting of an ano sequence of sequence 8
  • the light kuta is the light quad (For example, the deviation of the above (a) to () is included.
  • the bright Kuta contains the deviation of () (j). More preferably, the bright Kuta is The base sequence of the base sequence represented by sequence 7
  • a protein comprising an ano sequence represented by sequence 8 contains a quao containing a doc.
  • the bright Kuta is usually connected to the transferable () Puta () Puta (for example, the Quo () R element of the deviation from (a) to () above.
  • kuta constructed in this way is introduced into the host cell.
  • a method of manufacturing the kuta there is a method using a plus, a, or the like, but there is no particular limitation.
  • Kuta The physical type of Kuta is not particularly limited, and Kuta that can be expressed in the host can be selected. In other words, depending on the type of host cell, a protein sequence is selected in order to ensure that the quotient of the present invention is expressed. Goodbye.
  • a clear kuta contains expression (eg, putter, generator, and / or replica), depending on the type of main being entered.
  • expression eg, putter, generator, and / or replica
  • conventional ones for example, C, a C, and Pota
  • motors include an arose and a PC.
  • animal-oriented promoters include Wi-Fi promoters such as S40 and S40.
  • the vector preferably contains at least a mosquito.
  • This is a nutritional a), drug (E,), Gene (G4 8) Gene (CP) (aeaocaca S c S 8 337 984)
  • N gene (f a S 2 P R4) (chemical 5 64 66 992 s sa a e a e e 0 49 99 each) can be used.
  • the present invention provides a transformant in which a clear quat (for example, any of the above-described quats (a) to ()) is introduced.
  • a clear quat for example, any of the above-described quats (a) to ()
  • the host used here is not particularly limited, and conventional cells can be preferably used. Specifically, for example, the large intestine (ceca a C o), (S a c c a o c e s C e e sa c S o z a s a c c a o c e S P O be) 5 (Ca O a b d S e a s), and akatsuga (X e o s a e s) can be mentioned. Because of this cell, it is well known in the art.
  • the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include the various organisms, plants and animals shown above.
  • the transformant in another embodiment of the light, can be a plant transformant.
  • the plant transformant according to the embodiment is obtained by introducing a kuta containing a clear quat into a plant so that it is expressed by the quake but is expressed.
  • the kuta is not particularly limited as long as it is capable of expressing the quota according to the present invention.
  • a plant that expresses a plant quorum for example, a plant that has a 35S plant of flower zycois, or a plant that is activated by an external stimulus. Is mentioned.
  • the plants that can be clearly transformed are whole plants, plants (e.g., petals,, roots, offspring), plants (e.g.,, soft, xylem, tube bundles, sponge weave) or, or It also means a shift in the state (eg, suspension), plasto, leaf section, force, etc.
  • the plant used for conversion is not particularly limited, and may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
  • a public conversion method for example, quatium, gene, PG, Kutopo method, etc.
  • a method using cesium is well known as a method of introducing directly into cells.
  • an appropriate quartium for example, ob aceefaces
  • the strain of Fucod can infect a sterile piece and obtain a trait, and ae et al (cboe 67 325 990)) can be used.
  • an expression tractor is introduced into the quatium, and then This is a method of introducing the converted cation into a plant or tissue by the method described in Paoecaooaa (S Gecadec Pess P bes). Where is obtained by the plant follicles. Inductors (such as 2 or PZP202) can be used to convert using the quatium method.
  • Kupo gene As a method for introducing a gene directly or into a tissue, Kupo gene is known.
  • the plant body, plant officer, or plant body may be used as is, after the section has been prepared, or a plasmid may be prepared and used.
  • the sample thus prepared can be processed using a gene (eg, P S 00 (OR)).
  • the physical conditions vary depending on the object or sample, but it is usually performed at a force of 45 to 20 degrees and 4 to degrees.
  • a cell into which a gene has been introduced or a gynecological sex is selected first, and then it is regenerated into a plant by a conventional method.
  • this can be done by those skilled in the art using public methods.
  • the trait and kuta are introduced into the cell by the gene and Kutopo method.
  • the roots and roots that can be replaced can be used as tissue or as they are, and the conventional plants are used, and the appropriate degree of ho It can be regenerated into a plant body by giving a braid or the like.
  • PCR Southern Digestion
  • noisy Digestion etc.
  • PCR can be performed under the same conditions as those used to prepare the plus.
  • the amplification product It is possible to confirm that the transformation has been carried out by performing a pore-quadge or capillar movement, coloring with thidium, SG solution, etc., and detecting the amplified product in a book.
  • amplification can be detected by performing PCR using a ply recognized by the element.
  • the object includes the object in which the quotient related to the object can be expressed, the object having the same quality as the object, or the like.
  • the trait object is a functional food object.
  • the trait object is an object whose flower color has been altered. More preferably, an object whose flower color has been altered is an object whose flower color has been altered to blue. 4.Made of light tank
  • a light tank if a light tank accumulates in a normal (e.g., ultrasound, zothy, freeze-thaw, or after disruption of a cell, normal (e.g., , Centrifuge,
  • the light tank accumulates in the nutrient solution, after completion, it can be separated from the cell by normal (for example, centrifugation, filtration, etc.) be able to.
  • the effluent obtained in this way can be prepared in accordance with the normal production method of the fine quality contained above. ⁇
  • a manufacturing method for example, Amm, Kutgley, Ioctogly, Aitgly,
  • KT, and limit methods can be used alone or in combination. 5.
  • the present invention provides a method for producing a glue composite using a clear protein.
  • the light protein reacts with the transfer of glucic acid (eg, P-glucide) to the container (eg, lyde, styrene, or guna), so by using the light protein A gung complex can be produced from the material and the raw material.
  • glucic acid eg, P-glucide
  • the container eg, lyde, styrene, or guna
  • the condition and preference is hula.
  • a gung complex By preparing the liquid and allowing it to reach 3 at 30 ° C, a gung complex can be produced. From this solution, the glucide can be separated and separated by the following method. Physically, for example, ammonium, cugly, octogly, affinity glyph, cutgray, limit method, etc. can be used alone or in combination.
  • the gung complex obtained in this way is useful as a food for functional foods, a drug for adjusting its performance, or as an agent (ao Huan ang and H (999) B och cae Bophys ca ca 472643 650).
  • a nuclease gene (mU cg ccess onNo B362988) that shows 55 uniqueness in ano to bUB T (Nagash aea Phyoche sy 53 533 538 2000) was found (no E ea P oc Na cad c U 03 1075 11080 20006) o
  • R et al. were synthesized using s a d Se s s S se fo R PCR (o e) according to the manufacturer's recommended conditions. Using this c as a mold, we attempted to isolate pF7 T by PCR using the above and 2 plies.
  • N including full length F
  • the above type CDN synthesized using To a N extracted from puffer valves was used.
  • K DP us pomerase B was 94C 2 n followed by C 5 Se 5 C 30 Se 6 C 5 mm x 5 Cyces.
  • the base sequence was recognized by pBunPVeco (eoBunTPPPConngKnvogen) and B3100 van generator (pped Bosys emS).
  • Each of the pluses obtained above was transformed into the large intestine BL2 (E3) according to the usage.
  • the obtained transformant was cultivated overnight at 37C in B (10 yponepe on 59 yeas ex ac g Na) 4 containing 50 u.
  • the nutrient solution 4 that reached the above level was inoculated into 80 of the same composition and fed at 37C.
  • (600) reached approximately 0.7 a final amount of PT was added, and the mixture was cultured at 22C for 20 hours.
  • the cultivated transformant was suspended by adding Bue20mmNammuffa (p 4) 20 dazo 0 5 Na 4 B mecaptotano 2 Ce by centrifugation (700 g 5 n). A sound wave (15SecX8) was applied (15000X0n). Add 0.12 (v) 30 n suspension. (1500 g 0 n)
  • the reaction is as follows. (2mmP G00 00 50 5Liquor buffer (pH 75)) Prepare 50 and start the reaction by adding the solution.
  • reaction was stopped by adding H 0 containing 0.5 TF and analyzed by HPLC (L 20 0 stem, Shimadzu Corporation).
  • the diosmetic B ring in which the hydroxyl group at the 4th position of the id B ring had two hydroxyl groups had a lower affinity than the one having a single acid group at the 4th position. Furthermore, since the activity against squid that does not have a hydroxyl group in the B ring was low, it was found that the hydroxyl group at the 4-position of the Ride B ring was extremely important for understanding the nature of the element.

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Abstract

　本発明は、新たなグルクロン酸転移酵素、およびそれをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：７で表される塩基配列の第１番目～第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド）などを提供する。これにより、基質特異性の広い、新たなグルクロン酸転移酵素などが提供される。

Description

グ ク ン およびそれを ド ク オ 術分野
本 、 グ ク 、 それを ド ク オ 、 それ を含有する クタ 、 形質 換体などに関する。
ラ はフ プ イド系の植物二次代謝 物の 称であり、 そ の 種であるア ト は主に赤、 ～ 紫色の 色を決定する主要な色素 である。 じ の 種である ラボ ノ の はそ れ自身で 黄色を呈するものの、 ア ト 素 複合体を形成すること で花の色調に大きな影響を与えるこ ら、 補助 ( ピグメント) 呼ばれ 。 般に グメ による花色 長側 の フトは グメ テ ョ 呼ばれる。
ソ キ ギ 弁には ラボ の 種である の7 グ ク ナイド (グ ク 、 ある は グ ク 合体 も ) が 積しており、 これが グメント して機能 して ると考えられる( se S e a Phy oche s y 2739 2741 1972)。 また、 キク キク ヤグ eaca の 弁の 金属 体を形成して るが、 その にお ても ラボ 7 グ ク ナイ が見出されて る( 2 h ono e a Na u e 436 791 792 2００5) ナ Sc e a a ba c )の根には イカ 呼ばれる消炎 用のある ラボン7 グ ク ナイ が 積しており その根は健胃 果のある漢方 ( ン) して利用されて る( 3 ao ・ e a B oche ca e B ophys ca c a 472 643 65０ 999) の 根 ら イカ イ の7位に対してグ ク ン酸を転移する酵素 して bUB T ( b7 T ) が精製 れており ( 4 Nagash a e a ・ Phy oche s y 53 533 538 2０００) このSb7 Tに対応する遺伝子は enBank に登録されて る (アクセ ョ No B０42277) が、 その 能に ては確認され て な 。 また、 日常に食して る同科 J e c りの葉にも多様 な ラボ の7 グ ク ナイ が 積して るこ も近年明ら にな ており、 その の 康における機能性が期待されて る( 5 : a azak ・ e a Phy ochem s y 62 987 998 2００3)
このよ に ラボン7 グ ク ナイ は花色および 康食品分野にお て非 常に注目される植物二次代謝 物であるにも関わらず、その 合成 ( えば、 グ ク ) に ては未知な部分が多 。 sen e a Phy oche s y 2739 2741 972
2 h ono e a Na e 436 791 792 2００5
3 ao Z e a B oche ca e B ophys ca c a 1472 643 65０ 999 4 Nagash a S e a phy ochem s y 53 533 538 2０００
5 amazak e a Phy oche s y 62 987 998 2００3 明の
このよ な状況の 、 基 異性の 、 新たなグ ク 、 およ びそれを ドする遺伝子を同 するこ が求められて た。
上記 況に みてなされたものであり、 下記に示す、 グ ク 、 それを ド ク オ 、 ならびに、 それを含有する クタ 、 および 換体などを提供する。 (1) 下の (a) ～ (f ) の ずれ に記載の ク オ
(a) : 7で表される 基配列の ～ 62 目の 基配列 らなる ク オ を含有する ク オ
(b) : 8 わ れるア ノ 列を有するタン ク質を ド
ク オ を含有する ク オ (c) 8で表わされるア ノ 列にお て ～ F個のア ノ酸が 、 置換、 および もし は付加されたア ノ 列 らなり、
P グ ク 性を有する ク質を ド ク オ を含有する ク オ
( ) 8で表わされるア ノ 列に対して、 8 上の相同 を 有するア ノ 列を有し、 グ ク ン 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ
(e) : 7 れる 基配列の R 6 目の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ ス ト ンジ な条件下で イブ 、 グ ク 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ または
( f ) : 8で表わされるア ノ 列 らなるタ ク質を ド ク オ の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ ス ト ンジ な条件下で イブ 、 グ ク
性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ 。
(2) 下の ( ) ( ) の ずれ である に記載 ク オ ( ) 8で表わされるア ノ 列にお て n 下のア ノ酸が 、 置換、 および もし は付加されたア ノ 列 らなり、 r グ ク 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ
( ) g : 8で表わされるア ノ 列に対して、 9 上の相同性を 有するア ノ 列を有し、 グ ク 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ
( ) : 7で表される 基配列の ～ R 目の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ イス ト ンジ ン な条件下 で イブ 、 グ ク 性を有するタ ク 質を ド ク オ を含有する ク オ または
( ) 8で表わされるア ノ 列 らなるタ ク質を ド ク オ の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ イス ジ な条件下で イブ 、 P グ ク
性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ 。
(3) 7で表される 基配列の ～ 62 目の 基配列 ら なる ク オ を含有する、 上記(1)に記載の ク オ 。
(4) 8で表わされるア ノ 列からなるタン ク質を ド ク オ を含有する、 上記(1)に記載の ク オ 。
(5) である、 上記(1)～(3)の ずれ 項に記載の ク オ 。(6) (1) (5)の ずれ 項に記載の ク オ に ドされるタ ク 。
(7) (1)～(5) れ 項に記載の ク オ を含有する クタ 。 (8) 5(1)～(5)の ずれ 項に記載の ク オ が導入された形質 換体。
(9) (7)に記載の クタ が導入された形質 換体。
(1０) 5(8)又は(9)に記載の 換体を用 る上記(6)のタ ク質の製 。
(11) (6)に記載 タ ク質を触 して、 P グ ク 容体 質 らグ ク 合体を生成する、 グ ク 合体 。 明の ク オ は、例えば、形質 換体に導入されることによ て、 新たなグ ク 素の 造に有用である。 明の まし 態様のグ ク 、 異性が広 、 多様な 容体 グ ク 化 する活性を有する。 面の 単な説明
は、 大腸 タ ク質を確認した P Eの 真である。 サイズ カ 、 Pペ ット 、 C 、 、 5０ 5０ ゾ 、 2００ 2００ ゾ 、 5００ 5００ ダ ゾ 、 矢印:大 現させた目的のタ ク (V 7G ) 2 ( ) は、 アピ の P C 析の 果を示す ヤ である。 2 ( ) は、 (アピ P グ ク ) の P C 析の 果を示す ヤ トである。 2 (C) は、 アピ の7 グ ク ナイ の P C 析の 果を示す ヤ である。 2 ( ) は、 (アピ
P グ ク )の O Sによる 定の 果を示す ヤ トであ る。
3は、 7G の 容体 の 異性を解析した結果を示す である。
4は、 定量R PCRによる 7G 伝子の の 析の 果を示すグラ である。 リ テキス
N
2 N
3 N
4 N
5 N
6 N
9 N
０ N
N
2 N
3 N
4 N 明を実施するための 良の
下に、 明のグ ク ン 、それを ド ク オ それを含有する クタ 、 形質 換体などを詳細に説明する。
花を形成する クサ科のクワガタソウ属に属するオオイヌノ グ ( ca e cめ ア トシ ン デ フィ ジ 3 (3 (6 cou a oy ) g ucosy ) 6 cou a oy g ucos de 5 g cos de Gあり ラボ は (3 g ucu onosy ) c on de である( 、東洋大学修士 文、 平成 5 )。 この を骨格とする ラボン7 グ ク ナイ は ア ト ン 素に対して 著な グメ 果を示 すこ らオオイヌノ グ の 色に関与して る 考えられる。 らは、 オオイヌノフグ c N らPCRによる 7 グ ク ン
(F avo o d 7 g ucu onosy ans e as F7 T) 子を単離し、 明の の 様の ク オ ( 得た。 ・ 明の ク オ
まず、 、 (a) 7で表される 基配列 ～ 62 目 基配列 らなる ク オ を含有する ク オ ( 体的 には、 N 、 以下、 これらを単に N とも する) (b) 8で、 表わされるア ノ 列を有するタン ク質を ド ク オ を含 有する ク オ を提供する。 明で対象 する DN は、 上記 グ ク ン 素を ドする N に限定されるも ではな 、 こ タ ク 能的に同等なタ ク質を ドする他 N を含む。
に同等なタ ク しては、 例えば、 (c) g : 8で表わされる ア ノ 列にお て 5個のア ノ酸が 、 置換、 および もし は付加されたア ノ 列 らな 、 P グ ク 性を 有するタ ク質が挙げられる。 このよ タン ク としては、 配列 : 8 で表わされるア ノ 列にお て、例えば、 ～15 、 ～14 、 13 、 ～12 、 ～11 、 ～1０ 、 ～9 、 ～8 、 7 、 6 (1～ )、 ～5 、 ～4 、 ～3 、 ～2 、 個 ア ノ が欠 、 置 換、 および または付加されたア ノ 列 らなり、 P グ ク 性を有するタ ク質が挙げられる。 ア ノ の 、 換、 および または付加の数は、 一般的には小さ まし 。
また、機能的に同等なタ ク としては、 例えば、 (d) 8で表わ されるア ノ 列に対して、8０ 上の相同性を有するア ノ 列を有し、
P グ ク 性を有するタ ク質も挙げられる。 この タ ク しては、 配列 8で表わされるア ノ 列に対して、 8０ 上、 81 上、 82 上、 83 上、 84 上、 85 上、 86 上、 87 上、 88 上、 89 上、 9０ 上、 91 上、 92 上、 93 上、 94 上、 95 上、 96 上、 97 上、 98 上、 99 上、 99 上、 99 2 上、 99 3 上、 994 上、 99 5 上、 99 6 上、 99 7 上、 99 8 上、 99 9 上の相同性を有するア ノ 列を有し、 P グ ク 性を有するタ ク質が挙げられる。 同性の 一般的 に大き まし 。
ここで、 P グ ク とは、 ラ イド、 スチ および グナ 等の糖 容体 の 酸基をグ ク 化し ( えば
をその7位 水酸基でグ ク 化し)、グ ク 合体を生じる反 応を する活性を 。
P グ ク 、 例えば、 P グ ク
容体 ( えば、 フラボ ) を評価対象となる酵素の で反応さ 、 得ら れる反応物をHP 等で分析するこ によ て 定することができる(より具体的 には、 後述の の 載を参照)。
また、 、 (e) 7で表される 基配列の ～ 6 2 目の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ ス ンジ な条件下で イブ 、 P グ ク ン 性を有 するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ
(f ) : 8で表わされるア ノ 列 らなるタ ク質を ド ク オ の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ ス ジ な条件下で イブ 、 P グ ク
性を有するタン ク質を ド ク オ を含有する ク オ も 含する。 明細書中、 ポ ク オ は、 またはR を意味する。 ま し は、 である。
明細書中、 ス リ ジ ン な条件下で イ ク オ は、 例えば、 配列 : 7で表 れる 基配列の 62 目の塩基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ 、 または配列 : 8で表わされるア ノ 列を ド ク オ の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ の 部または一部をプ ブとして、
イ ダイゼ ョン 、 プラ ク イブ ダイゼ ョ またはサザ ン イブ ダイゼ ョン法などを用 るこ によ 得られる ク オ を 。 イ リダイゼ ョ の 法 しては、例えば S a b o o R s s e o e c a C o a b o a o Y a a o 3 Co d S a b o a b o a o P e s s 2 ０ s b e C e P o o c o s o e c a o o
J o W e Y S o s 987 997 などに記 載されて る方法を利用するこ ができる。
明細書中、 ス トリンジ ン な条件 とは、 ス ト ジ な条件、 中 ス ンジ な条件及び ス ト ジ な条件の ずれでもよ 。 ス ト ジ な条件 は、例えば、 5 X S SC 5X ト 、 0・ 5 。
S S 5０ ホ ムア ド、 32 Cの 件である。 また、 ス ジ な条件 は、例えば、 5 X S SC 5X ン ト 、 0・ 5 S S 5０ 。
ホ ムア ド、 42Cの 件である。 ス ト ジ な条件 は、 例えば、 。 5XSSC 5X 、 0・ 5 S S 5０ ホ ムア ド、 5０C の 件である。 これらの 件にお て、 温度を上げるほど高 相同性を有する が効率的に得られるこ が期待できる。 ただし、 イブ ダイゼ ョ の ス ト ジ に影響する要素 しては温度、 プ ブ 度、 プ ブの 、 イオン 度、 時間、 塩 度など複数の 素が考えられ、 当業者であればこれ ら要素を適 択するこ で同様のス ンジ を実現するこ が可能で ある。 なお、 イブ ダイゼ ショ に市販のキッ を用 る場合は、 例えば o s e c a b e Re a e s (ア ム ファ シア ) を用 ることができる。 この 、 キッ に プ ト にしたが 、 標識したプ のイ キ ョンを一晩 た後、 。
ン を55 Cの 件下で0・ 。 ( ) S Sを含む ッ ファ で 、 イ した を検出するこ ができる。
記以外に イブ イズ 能な ク オ としては、 S 、 B S などの 同性検索ソ トウ アにより、 デフォ の ラメ タ を用 て計算したときに、 配列 7で表される 基配列の ～ 62 目の 基配列の 、 または配列 : 8で表わされるア ノ 列を ドする 6０ 上、 約7０ 上、 7 上、 72 上、 73 上、 74 上、 75 上、 76 上、 77 上、 78 上、 79 上、 8０ 上、 8 上、 82 上、 83 上、 84 上、 85 上、 86 上、 87 上、 88 上、 89 上、 9０ 上、 9 上、 92 上、 93 上、 94 上、 95 上、 96 上、 97 上、 98 上、 99 上、 99 上、 99 2 上、 99 3 上、 99 4 上、 99 5 上、 99 6 上、 99 7 上、 9 9・ 8 上、 または99 9 上の相同性を有する をあげるこ がで きる。
なお、 ア ノ 基配列の 同性は、 カ およびア チ によ るア ムB S (P o c a c a S c
S 872264 2268 99０ o c a c a d SC S 9０ 5873 993) を用 て決定できる。 B S のア ズムに基 たB S や S X 呼ばれるプ グラ 開発されて る ( s c S e a o B o 2 5 4０3 99０) S を用 て 基配列を解析 する場合は、 ラメ タ は、 例えば ００ Wo d e
2 する。 また、 B S Xを用 てア ノ 列を解析する場合は、 ラメ タ は、 例えば 5０ o d g 3 する。 。
S B S グラムを用 る場合は、 プ グラ ムのデフォ ラメ タ を用 る。
記した 明の ク オ は、 の 伝子 的手法または の 法によ て取得するこ が可能である。 2・ 明のタ ク
、 さらに別の実 態にお て、 上記 明の ク オ に ド れるタ ク質も提供する。 明のある態様のタ ク質は、配列 8で表わされるア ノ 列 らなるタン ク質である。 明の別の態様 ン ク質は、配列 8で表わされるア ノ 列を有するタ ク質である。
明のさらに別 態様のタ ク質は、 配列 8で表わされるア ノ 列にお て ～ 5個のア ノ酸が 、 置換、 および もし は付加され たア ノ 列 らなり、 P グ ク 性を有するタ ク質である。 このよ タ ク しては、 配列 8で表わされる
上記したよ 相同性を有するア ノ 列を有し、 P グ ク 性を有するタ ク質が挙げられる。 このよ タ ク 質は a b ook sse o ec a on ng Labo a o y an a o 3 Co d p ngHa bo Labo a o yP ess2００1 usube en P o oco s n o ec a B o ogy John ey ons 9 7 1997 Nuc c ds es ０ 6487 (1982) 、 P oc Na cad c U 79 64０9 (1982) ene 34 w
315 ( 985) 、 Nuc c ds es 3 4431 (1985) 、 P oc Na cad c U 82 488 (1985) 等に記載の 変異 を用 て、 取得すること ができる。
明のタ ク質のア ノ 列にお て 1 ( えば ～ 5 、 好ま し は ) のア ノ が欠 、 置換、 および または付加され た は、同一 の 意か 1もし は複数のア ノ の 置にお て、 1 または複数のア ノ の 、 置換、 入及び 又は付加があるこ を意 味し、 、 置換、 入及び付加の 2 以上が同時に生じても 。
下に、 相互に置換 能なア ノ 基の例を示す。 一群に含まれるア ノ ０ 相互に置換 能である。 イ 、 イソ イ ン、 ノ イ 、 、 ノ ン、 アラ 、 2 ア ノブタ 、 メチオ 、 メチ セ 、 グ 、 チ アラ 、 ク アラ B アス ラギン 、 グ タ 、 イソアス ラギ 、 イソク タ 、 2 ジピ 、 2 ア ノス アス ラギン、 グ タ D : ジ 、 ア ギ 、 オ チ 、 2 4 ア ノブタ 、 2 3 ア ノ プ ピオ E :プ 、 3 プ ン、 4 プ
F :セ 、 ス オ 、 セ :フ アラ 、 。
また、 明のタン ク質は、 F oc ( オ メチ オキ カ ボ )、 oc ( オキ カ ボ ) 等の化学合成法によ ても製造す ることができる。 また、 アド スド ムテック 、 キ 、 ァ ア 、 プ テイ テクノ ジ イ ス トゥ メ ト 、 セ 、 セプティ 、 島津製作所等の を利用して 化学合成するこ もできる。
ここで、 明のタン ク質は、 グ ク 素である。 グ ク
は、 体 ら 容体 グ ク を転移し、 グ ク 合体を生じる反応を する。 明にお て、 容体 、 例え ば イド、 スチ 、 ク 、 および グナ である。 また、 体は、 例えば P グ ク 酸である。 明のある態様のタン ク質は、 P グ ク 酸から 容体 グ ク を転移し、 グ ク ン 合体 Pとを生じる反応を する。
容体 には、 フラボ 、 フラ ノ 、 ラ ノ 、 イ ソ ラボ 、 ラボ 、 オ 、 および テキン等が含まれる。 この ち、 フラボ しては、例えば、 イカ イ 、 スク イ 、 アピ 、 オ ン、 チ 、 ジオスメチ 、 および オ を挙げること ができる。 ラ ノ としては、 例えば、 ケ チン、 チ 、 および フ を挙げるこ ができる。 ラ ノ としては、 例えば、 ナ ン を挙げるこ ができる。 イソ ラボ としては、 例えば、 ジ ステイン、 およびホ を挙げるこ ができる。 ラボ C として は、 例えば、 キ 、 イソ キシ およびオ チ を挙げることがで きる。 としては、 例えば、 オ を挙げることができる。 カテ キ しては、 例えば、 カテキ お び テキ ガ を挙げるこ ができる。
スチ には、 ス ト ( esve a o )およびその イ ド(p ce d)等が含まれる。
リグナ には、 ( ) ジノ (( ) P no es no 、 ( ) ト (( ) P e o ) ) セサ ノ (( ) esa no ) ( )
ジノ (( ) eco so a c es no ) ( ) セサ (( ) esa ca eco 1) ( ) ( ) セサ ン 2 (( ) Sesam Ca eco 2) ( 2) ( ) セサ 2 (( ) Ep sesa Ca eco 2) E 2)、 および ジノ ( a a es o )等が含まれる。
明のある態様では、 容体 である。 明の別の態 様では、 容体 、 B 4 基に水酸基を有する ラボ である。 明の さらに別の態様では、 容体 、 スク イ 、 アピ 、 オ 、 ジオスメチ 、 ク オ 、 ケ 、 およびナ
らなる群 ら選択される少な も の 容体 である。
そして、 例えば、 配列 8のア ノ 列 らなるグ ク ン
( ) は、 容体 、 スク イ 、 イカ イ 、 アピ 、 オ 、 ジオスメチ 、 および オ 等の ラボン、 ケ および ロ 等の ノ 、 ならびにナ 等の ノンの きに活性を示し、特に、 スク イ 、アピ 、 オ 、 ジオスメチン、 ク オ 、 ケンフ 、 およびナ ン の き に他の糖 容体 と比較して強 性を示す。 3・ クタ びこれを導入した形質 換体
はまた、 別の実 態にお て、 明の ク オ を含有する 発現 クタ を提供する。 明の クタ は、 明の ク オ ド ( えば、 前記 (a) ～ ( ) の ずれ の ク オ 含有する。 まし は、 明の クタ は、 前記 ( ) (j ) の ずれ の ク オ を含有する。 さらに好まし は、 明の クタ は、 配列 7で表される 基配列の ～ 62 目の 基配列 らなる
、 又は、 配列 8で表わされるア ノ 列 らなるタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ を含有する。
明の クタ は、 通常、 ( ) で転写 能なプ モ タ ( ) プ タ に結合した、 明 ク オ ( えば、 前記 (a) ～ ( ) の ずれ の ク オ ( ) R 子
および リアデ 化に関し、 宿主 する グナ を構成 素として カセットを含むよ に構成される。 このよ に構築される クタ は、 宿主 胞に導入 れる。 クタ の 製方法 しては、 プラス 、 ァ 、 または などを用 る方法が挙げられるが特に限定されな 。
クタ の 体的な種類は特に限定されず、 宿主 で発現可能な クタ が 択され得る。 すなわち、 宿主 胞の 類に応じて、 確実に本 明の ク オ を発現さ るために プ タ 列を選択し、 これ 明 の ク オ を各種プラス 等に組み込んだ クタ を発現 クタ と して ればよ 。
明の クタ は、 入される き 主の 類に依存して、 発現 ( えば、 プ タ 、 タ ネ タ 、 および または複製 ) を含 有する。 クタ のプ モ タ としては、慣用的なプ モ タ ( えば、 Cプ タ 、 a Cプ タ 、 プ モ タ 等) が使 用され、 プ モ タ しては、 例えば、 グ セ ア デヒド3 デ ヒド ゲナ ゼプ タ 、 P O5プ タ 等が挙げられ、
モ タ しては、 例えば、 ア ラ ゼ、 PC等が挙げられる。 また動物 主用プ モ タ しては、 ウイ ス プ モ タ えば、 S 4０ プ タ 、 S 4０ プ タ 等 挙げられる。
ベクタ は、 少な とも の カ を含むこ が好まし 。 この よ な カ しては、 栄養 カ a )、 薬剤 カ ( e、 )、 ジ ネ ン 伝子 (G4 8 ) 伝子(C P ) ( a e a o c a c a S c S 8 337 984)
ン 伝子 (f a S 2 P R4) (それぞれ 化学 5 64 66 992 s s a e e a e e ０ 49 99 ) などが利用 能である。
また、 、 明の ク オ ( えば、 前記 (a) ～ ( ) の ずれ の ク オ 導入された形質 換体を提供する。
換体の 製方法 ( ) は特に限定されな が、 例えば、 上述した ０ クタ を 主に導入して 換する方法が挙げられる。 ここで用 ら れる宿主 特に限定されるものではな 、 従来 胞を好適に用 ることができる。 体的には、 例えば、 大腸 ( c e c a C o ) 等 細 、 ( S a c c a o c e s C e e s a e S c z o s a c c a o c e S P O be) 5 (Ca O a b d S e e a s)、 ア カツ ガ (X e o s a e s) の 挙げることができる。 記の 胞のため 切な および 当分野で周知である。 また、 形質 換 の 象となる生物も特に限定されるものではな 、 上記 示した各種 生物、 植物または動物が挙げられる。
2０ 胞の 換方法としては一般に用 られる の 法が利用できる。
えば、 ク ト ポ ョ ( ackenx e D・ e a pp Env on c ob o1・ 66 4655 466 2０００)、 ティク デ ( 2００5 の に記載の )、ス プラス (P o c a c a d S c S 75 929 ( 25 978)) チウム (J Ba c e o o g 53
63 ( 983)) P o c a c a d S c
75 929 ( 978) e o d s e a s e e c s 2０００ Ed o Co d S
a b o a b o a o Co s e a a などに記載の ) で実施 能であるが、 これらに限定されな 。
明の別の態様にお て、 形質 換体は、 植物 換体であり得る。 実 施 態に係る植物 換体は、 明に係る ク オ を含む クタ を、 ポ ク オ によ て ドされる が発現され るよ に植物 に導入することによ て取得される。
クタ を用 る場合、 植物体の 換に用 られる
クタ は、 で本 明に係る ク オ を発現させることが可 能な クタ であれば特に限定されな 。このよ クタ しては、例えば、 植物 ク オ を構成 に発現さ るプ タ ( えば、 フラワ ザイクウイ スの35Sプ タ を有する クタ 、 または 外的な 激によって に活性化されるプ タ を有する クタ が挙げ られる。
明にお て 換の 象となる植物は、 植物体全体、 植物 ( えば 、 花弁、 、 根、 子など) 、 植物 ( えば 、 、 柔 、 木部、 管束、 、 海綿 織など) または 、 ある は の 態 の ( えば、 懸濁 ) 、 プ プラスト、 葉の切片、 力 など の ずれをも意味する。 換に用 られる植物 しては、 特に限定されず、 単子葉植物 または双子葉植物 に属する植物の ずれでもよ 。
物 の 伝子の 入には、 当業者に公 の 換方法 ( えば、 クテ ウム 、 遺伝子 、 P G 、 ク ト ポ ョ 法など) が用 ら れる。 えば、 クテ ウムを介する方法 直接 胞に導入する方、法 が周知である。 クテ ウム法を用 る場合は、 構築した 物用 ク タ を適当な クテ ウム ( えば、 クテ ウム・チ メファシ ス ( ob a c e e f a c e s) 導入し、 の株を フディスク ( 、 植物 伝子操作 ア ( 9０) 27～3 、 講談社サイ ティフィッ 、 東京) などに従 て無菌 片 に感染 、 形質 物を得るこ ができる。 また、 a e らの ( c b o e 67 325 99０) ) が用 られ得る。 この 、まず、例えば発現 クタ を クテ ウムに導入し、次 で、 換された クテ ウムをP a o e c a o o a a (S Ge c a d e c P e s s P b e s) に記載の 法で植物 または 織に導入する方法で ある。 ここで、 は、 植物 胞の によ て得られる を 。 クテ ウム法を用 て 換を行 場合には、 イナ クタ ( 2 または PZP2０2など) を使用することができる。
また、 遺伝子を直接 または 織に導入する方法としては、 ク ポ ョ 、 遺伝子 が知られて る。 伝子 を用 る場合は、 植 物体、 植物 官、 植物 体をそのまま 用してもよ 、 切片を調製した後に 用してもよ 、 プ プラス を調製して使用してもよ 。 このよ に調製し た試料を 伝子 ( えばP S ００ ( O R ) など) を用 て処理するこ ができる。 理条件は 物または試料によ て異なるが、 通常は45 ～2 ０ S 度の 力、 4～ 度の 離で行 。
伝子が導入された細胞または 、 まず グ イ ン 性などの 性で選択され、 次 で定法によ て植物体に再生される。 胞 ら 物体の 、 植物 胞の 類に応じて当業者に公 の 法で行 こ が可 能である。
胞を 主として る場合は、 形質 、 クタ を 伝 子 、 ク ト ポ ョ 法などで 胞に導入する。 換の られる ト、 毛抜根などは、 そのまま 、 組織 または 用 ることが可能であり、また従来 られて る植物 を用 、 適当な 度の ホ (オ キ ン、 サイトカイ 、 、 ア ジ 、 チ 、 ブラ ライドなど) の 与などによ て植物体に再生さ ることができる。
伝子が 物に導入 れた 否 の 、 PCR 、 サザン イ ダイゼ ョン 、ノ ザ イブ ダイゼ ショ 法などによ て行 こ ができる。 えば、 形質 物 ら を調製し、 プライ を設計して PCRを行 。 PCRは、 前記プラス を調製するために使用した条件 同様 の 件で行 こ ができる。 その後は、 増幅 物に て ガ スゲ 、 ポ アク ア ドゲ またはキャピラ 動などを行 、 チジウム、 S G 液などによ て 色し、そして増幅 物を 本の ド して検出することによ て、 形質 換されたこ を確認するこ ができる。 また、 素などによ て 識したプライ を用 てP C R を行 、 増幅 物を検出することもできる。 さらに、 イク プ トなどの に増幅 物を結合 、 蛍光または酵素 応などによ て増幅 物を確認する 方法も採用することができる。
明に係る ク オ がゲノム内に組み込まれた形質 物体が一 得されれば、 物体 性生殖または無性生殖によ て子孫を得ること ができる。 また、 物体またはその 、 ある はこれらのク ら、 例えば、 子、 果実、 切 、 、 根、 株、 力 ス、 プ トプラス トなどを得 て、それらを基に当 物体を することができる。 したが て、 明には、 明に係る ク オ が発現可能に導入された 物体、 もし は、 物体 同一の 質を有する 物体 、 またはこれら 来の 含ま れる。
また、 の 物に対する形質 換方法が既に報告されて る。 明に係る 形質 換体 物 しては、 例えば、 、 イネ、 タ 、 オオ 、 ム 、 ナ タネ、 ポテト、 ト 、 ポプラ、 ナナ、 カ 、 サツ イモ、 タイズ、 ア ファ ファ、 ピ 、 ウ 、 カ ラワ 、 ラ、 キク、 カ ネ
、 キ ギ ソウ、 クラメ 、 ラ 、 ト ギキョウ、 フ ジア、 、 グラジオラス、 カス ソウ、 カラ 、 、 ウム、 ゼラ ウ ム、 ペチ ア、 ト ア、 チ ップ、 ギョウ、 シ イ ナズナ、 およ び グサなどが挙げられるがこれらに限定されな 。
明のある態様によれば、形質 物体は機能性食品 物体である。 明の別の態様によれば、形質 物体は花色が改変された 物体である。 まし は、花色が改変された 物体は、花色が青色に改変された 物体である。 4・ 明のタン ク質の製
はまた、 別の実 態にお て、 上記の 換体を用 る 明のタ ク質の製 法を提供する。
体的には、 上記 換体の 物 ら、 明のタン ク質を分離・ することによ て、 明のタ ク質を得るこ ができる。 ここで、 と は、 養液、 もし は 、 または もし は 胞の の ずれをも意味する。 明のタ ク質の分 ・ 、 通常の 法に 従 て こ ができる。
体的には、 明のタン ク質が もし は に蓄積 れ る場合には、 、 通常の ( えば、 超音波、 ゾチ ム、 凍結 解な で もし は細胞を破砕した後、 通常の ( えば、 遠心 、
により 明のタ ク質の粗 出液を得るこ ができる。 明のタン ク質 が 養液中に蓄積される場合には、 了後、通常の ( えば、遠心 、 過など) により もし は細胞 上 とを分離することにより、 明 タン ク質を含む 上 得ることができる。
このよ にして得られた 出液もし は 上 に含まれる 明のタ 質の精 、 通常の ・ 製方法に従 て ことができる。 ・ 製方 法 しては、 例えば、 ア モ ウム 、 ク トグラ ィ 、 イ オ ク トグラ ィ 、 ア ィ ティ ク トグラ ィ 、
ク トグラ ィ 、 、 限外 法などを単独で、 または み合わ て ることができる。 5・ グ ク 合体の
さらに、 、 明のタ ク質を用 てグ ク 合体を製造す る方法を提供する。 明のタ ク質は、 容体 ( えば、 ラ イ ド、 スチ 、 または グナ ) に ( えば、 P グ ク ) らグ ク 酸を転移する反応を するので、 明のタン ク質を用 る ことにより、 容体 および を原料 して、 グ ク ン 合体を 製造するこ ができる。 容体 、 好まし は、 フラ である。
えば、 の 容体 、 の 、 5 の シ ウム ッファ ( P 7 5 ) 、 および の 明のタ ク質を含む 。
液を調製し、 3０Cで、 3 させるこ により、 グ ク ン 合体を 製造することができる。 こ 液 ら、 グ ク 合体は、 の 法によ り分離・ することができる。 体的には、 例えば、 アンモ ウム 、 ク グラ ィ 、 イオ ク トグラ ィ 、 アフィ ティ ク トグラ ィ 、 ク トグラ ィ 、 、 限外 法な どを単独で、 または み合わ て ることができる。
このよ にして得られるグ ク ン 合体は、 機能性食品の 料、 その での 能を調 るための 薬、ある は、 化剤など して有用である ( ao Huan ang and H ( 999) B och cae B ophys ca c a 472643 65０ ) 。
、 以下の によ てさらに詳細に説明されるが、 これらに限定さ れる きではな 。
伝子ク グ
実施 にお て る分子生物学的手法は、 他で詳述しな 限り、 o e c a C O (S a b O o Co S
a b o a b o a o P e s s 2００ ) に記載の 法に 従 た。
析による相同性検索により のグ ク
bUB T (Nagash a e a Phy oche s y 53 533 538 2０００) に対 してア ノ で 55 一性を示す キ ギ 化酵素 伝子 ( mU cg ccess onNo B362988)を見出した ( no E e a P oc Na cad c U ０3 1０75 11０8０ 2００6) o
科であるオオイヌノ グ の 7 グ ク pF7 Tを ドする遺伝子を単離するために、この キ ギ 列を基に以下に示す2種のプライ ( および2) を設計した。 F7 T F 5 T T T TT TTT T T
2
F7 T 3 5 C T 3 R e a s P a (Q G )を使用して、 オオイヌノフグリの 弁 ら R を抽出した後、 S e S c
s a d S e s s S s e f o R PCR ( o e ) を製造業者が推奨する条件に従 て使用し て、 R らc を合成した。 このc を 型にして、 上 記の および2 プライ を用 たPCRにより、 pF7 Tを ドす る遺伝子 離を試みた。
体的にはPCR (50 )は、オオイヌノフグ c は 、 X a b f f e ( a a a o) O 2 d s、 プライ ( および2) 0・ 4 o 1 1
。 e a s e 2 5 らなるもの した。 PCR 応では、 94C 。 。
で3 さ た後、 94Cで 間、 5０Cで 間、 72。Cで2 間の 応 を35サイク の 幅を行 た。
P R ０・8 ガ スゲ により分離したところ、 1・ b のサイ に増幅 片を得た。 この 幅した 片を T P クタ
( nv ogen ) チク グサイ に 入し、 片の 基配列を、
S e e c e o de 3 ００ ( e o s S S ) を使用して、 合成オ ク オ ドプライ を用 る ライ ウォ キ グ法によ て決定した。 られた 基配列を U T L プ グ ラム (Ⅶ E T 7・2・2ソ トウ ア、 cce y ) で解析した結果、 キ ギ U Tcg および bUB 高 配列 一性を示したこ ら、 c Aを pF7 の 補遺伝子とした。
し しながら U Tcg アライメン した結果、 得られたc N 5
2０ および3 域が欠損して る不完全 F( pen ead ngF ame)であ た。そこで、 Ge e Ra c e ( o e を製造業者の す る方法に従 てRa d f c a o O f C
d ( 下、 R C ) を行 、 c 片の5 および3 域を増幅した。R C には以下の 3 6に示す pF7 T 伝子に特異 なプライ セ ッ を用 た。 3
pF7 T 5 TT C A C 3
4
pF7 nes 5 T T C T TT
5
pF7 T F 5 T T T C TT C 3
6
pF7 T nes Fw 5 T T T R Eによ て得られた増幅 片に て合成オ ク オ ドプライ を 用 たプライ ウォ キ グ法によ て 基配列を決定し、 完全長OR を pF7 T 補遺伝子およびそのア ノ 列を得た ( 7( pF7 TのcN )、 配列 8 ( pF7 Tのア ノ )
この pF7 T 補遺伝子はア ノ でキ ギ mU Tcg および bUB それぞれ6および5 一性を示した。 2
クタ
で得られた pF7 T タ ク 、 本 の 化学的な機能 を明らかにするために、 c N を発現する大腸 ベクタ を構築した。 全長 Fを含む N を、 配列 9および1０ される pF7 T 補遺伝子 なプライ セッ によ てPCR法で増幅した。 型には上記のオオイヌノ フグ 弁 ら抽出したTo a N を用 て合成したcDN を用 た。 9
Nde pF7 F 5 T T C T C
1０
ho pF7 T v 5 T T T T T T 。
P (K DP usポ メラ ゼ B )は、94C 2 nで さ た後、 C 5 Se 5 C 3０ Se 6 C 5 mm n X 5 Cyc esで行 た。 幅 れたDN 片をp B un P Vec o ( e o B un T P P C on ng K nv ogen ) ク グ 、 B 31００ van ジ ネティッ ナライ ザ ( pp ed B osys emS )に て 基配列の 認を行 た。
られたプラス はNde ho の 素で完全 化し 生じた 全長 R を含む約1・5kb DN 片を大腸 ク ET 5 (Novagen )のNde ho サイトに連結し、 大腸 クタ を得た。 3
大 タ ク および
上 得られたそれぞれのプラス を用 法に従 て大腸 BL2 ( E3) を形質 換した。 られた形質 換体を、 5０ u の を含む B (1０9 yp onepe on 59 yeas ex ac g Na ) 4 に 37C で一晩 養した。 に達した 養液4 を同組成の 8０ に接種 、 37Cで 養した。 ( 6００)がおよそ０・ 7に達した時点で終 ０・5㎜ の PT を添加し、 22Cで2０ h 養した。
下のす 。
ての 4Cで行 た。 養した形質 換体を遠心 (7 ００ g 5 n) にて Bu e 2０㎜ ナ ウム ッファ (p 4) 2０ dazo 0 5 Na 4 B メ カプト タノ 2 Ce を添加し、懸濁した。 て 音波 (15SecX8 )を行 (15 ０００X ０ n) した。 られた ０・12 ( v) ポ チ ンイ を添加し 懸濁 3０ n した。 (15 ００ g ０ n) を行 、
して回収した。 Bu e にて平衡 したH p T ap E Hea hca e)にアプライ 、 遠心 (7０Xg 3０ Sec) した。 Bu 6００
、 1００ 2００ 5００㎜ dazo eを含むBu 6００ は に結合 タン ク質を段階的に溶出した。 c ocon 3０ ( m con)を用 て2０㎜ ン カ ウム ッ ァ (p 5) 4㎜ メ カプ タノ に ッファ 換した。
D P E 析の 果、 2００㎜ dazo e にお て 7G のア ノ 列 ら推定される 5０ a 近に精製 れた発現 ク質を確認、 したので、 この 析に用 た ( 、 矢印 : 的のタ ク ) 。 4
および 分析
な反応 以下の りである。 (2㎜ P グ ク ００ 容体 5０㎜ リ カ ウム ッファ (pH 7 5) ) 5０ は 調製し、 液を添加するこ で反応を開始さ 。
せ、 3０C、 さ た。 ０・5 TF を含む H ０ を添加することにより 応を停止さ HPLC (L 2０ ０ ステム、 島津製作所) にて分析した。
HPL 以下の りである。 カラ はDeve os 3０ U 5(4 6 mX 5０ m )を ムオ 4０Cで用 、 移動 (０ T H０) 移動 B (０ TF 9０ H N) を用 た。 15 間の ( ０ ０ ) の 、 さらに一分間 ０ 保持した。 その 再びB2０ 戻し2０ 間 平衡 した。 で行 た。 P ０ Pho od ode ayde ec o ( (株) 津製作所) を用 て28０および36０nm た。 条件で
ン( )、キ ギ ソウ 弁 ら 製した 7 グ ク ナイ および 7 グ ( )はそれぞれ 間約 、 8・ 36 および8・ 22分に溶出される ( 2 (A) 、 2 (C) アピ 7 グ ク ナイド) 。
アピ を 容体 、 U P グ ク ン酸を糖 した L 析の 果、 標 7 グ ク ナイ 保持 間が一致する新 たな生成 が確認、 れた ( 2 ( ))
L の 、 e e o s C3 G 3カラム ( ㈱、 3・ 0 X 5O ) を用 、移動 、 として０・ 1 酸を含む水を、B して０・ 酸を含む ００ を用 た。 2 間の
b ( 2０ 7０ ) を用 て溶出し、 その 、 7０ 5 間のアイソク ラティッ 出を行 た。 ( : ０ 2 、 カラムオ ブン 4０C) フォ ダイオ ドア イ ( PD ０ 、㈱ 津製作所) で23０ 5００nm のデ タを収集し、 337 のク トグラムを測定した。 またPD 器の後にT F ( T F P e e o ass UK) を接続し、 以下の 件で生成 の の 定を行 た。 の ネガティ ドで行 た (イオン E Lock S ay e e ence イ ァ ( z 554 2615 H ) 、 ap a y 2 k one 3０ S Co s o ene gy 2０e )
この 件下で、保持 分に溶出される である はm269 ０44 H の イオ を与えた。 方、 保持 72分に溶出され る生成 m 445 ０75 H の イオ を与え、 アピ にグ ク 酸 が一個付加したものである 確認、された ( 2 ( )。また 析によ て、 この の イオ 一致するm 269 ０45 H グ メントイオ が検出された。
上の結果 ら オオイヌノフグ F7 T 性を有するタン ク質で あるこ が示された。 5
pF7 Tの
Noguch e a P an J 54 415 427 2００8 同様の 法で本 素のU P に対する選択 ( 容体 ) を測定した ころ、 UDP グ ク ン酸を1００ した相対 U P スは5・8 、 P ク スは検出 下であり、 素のU P グ ク 酸に対する高 特異性が確認、 れた。 また 素の およびU P グ ク 酸に対する (Km)はそれぞれ1０ 7 74 および36 6 8・7 であり、 アピ に対する (kca )は8・64 であ た。
素の 容体 の ( Pグ ク ) に て検討し た ころ、内在 の である に対して最も高 性を示した( 3) に対する活性を1００ とした相対 ラボンである イン、 イカ イン、 オ ン、 ジオスメチ 、 および オ
ノ である チ 、 および フ ならびに ノ で あるナ に対してそれぞれ88 3 9
9 34 ０ ０ 3 および ０ であ た。
特に イドB環の4 位に水酸基のメチ されたジオスメチ B環に 二個 上の水酸基を持 では4 位に単独の 酸基を持 ものと比 素の 性が低 た。さらにB環に水酸基を持たな イカ イ に対する 活性が低 たこと ら、 ラ イドB環の4 位の水酸基が本 素の 容体 の 識に極めて重要であることが分 た。
また 件にお ては チ である ト 、 ク である チ 、 グナ であるセサ ノ 、 イソ ラボ であるタイゼ イン、 ジ ステイ 、および ラボ グ である キ 、 オ チ に対してはグ ク ン 性が認められな た。 したが て の中でも特にB環の4 位に水酸基を有する ラボ に対して 性を持 ことが示された。
ラボ : 、 オリ 、 ジオスメチ 、 ク オ 、 イ カ イ 、 および イ
ラボ グ キ 、 およびオ チ
、 下記 cは スを表す。
Figure imgf000027_0001
OH O
Apgenn 4 O
eo R3 O R4 O
ome
C ysoe o
Figure imgf000027_0002
acae 6 O
Sc e a e R4 O R6 O
sov ex 4 O R6 CGc
O e 3 O R4 O R8 CGc
ノ チ 、 および ンフ
Figure imgf000028_0001
OH O
Kaempfero R4= H)
Quece n (R3= H R4= H)
ノ
Figure imgf000028_0002
Na ngenn 6
F7 T 伝子の Noguch e a P an J 54 415 427 2００8 同様の 法で pF T 伝 子の タ を75００ ea T e P ys e ( pp ed B osys e s)を 用 た定量 T P によ て解析を行 た。 オオイヌノフグ の ( 、 花、 果実、 、 ) ら実施 1 同様の 法でト タ ㎜を抽出し、 その ち 9 を逆転写 ) 応するこ によ て 官の N を得、 これをP の 型とし た。
P に用 る 伝子 プライ はP e Exp ess 3・０プ グラム ( pp edB osys e s)を用 て以下の4種をデザイ した。 pF7 プライ ゼ して配列 1および12を用 た。 伝子 してオオイヌノ グ ㎜ 5０9785) を採用し、 以下の 13および14の 伝子 プライ を用 て増幅した。 11
q pF7 T F 5 T T T T T 3
12
q pF7 v 5 T T T TT T TT
3
q p N F 5 T T T
14
q p N v: 5 T T T T pF7 Tの を内部 伝子の 準化し、 A A ( pp ed B osys e s)によ て相対 を得た。 その 果、 pF7 T 伝子は 著に花弁 で高 現して ることが明ら な た ( 4) 。 素が与える ラボ 7 ク ン酸の蓄 位と本 伝子 域が一致するこ ら、 素が グメン 成を介してオオイヌノフグ の 色発現に関わ て ることを強 支持した。また、葉にお ても pF7 Tの 現が認められたにも関わらず 著な発 色は認められな こ は、 主色素であるアン シ が花弁 比 し な こ に起因する 考えられた。 上のよ に 明によ てオオイヌノ グ の7位にグ ク 酸を転移する酵素 ( pF7 T) が単離できた。 素を利用するこ によ て、 花色が改変 れた 物体 ( えば、 青 花) の および 能性食品 材の 発などが可能になる。 上の利用 能性
明の P グ ク 、 性が広 、 のグ ク ン 合体の 造に有用である。 明 グ ク 素を利用すること によ て、 例えば、 花色が改変 れた 物体 ( えば、青 花)、 ある は機能性 材の 発などが可能になる。

Claims

求 の 下の (a) ～ (f ) ずれ に記載の ク オ
(a) 7で表される 基配列の ～ 1 362 目の 配列 らなる ク オ を含有する ク オ
(b) 8で表わされるア ノ 列を有するタン ク質を ド ク オ を含有する ク オ
(c) 8で表わされるア ノ 列にお て ～ 個のア ノ酸が 、 置換、 および もし は付加されたア ノ 列 らな 、 P グ ク 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ
(d) E で表わされるア ノ 列に対して、 8 上の相 同性を有するア ノ 列を有し、 P グ ク ン
性を有するタン ク質を ド ク オ を含有する (e) 7で表される 基配列の ～ 目の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ ス ト ジ な条件下で イ 、 P グ ク 性を 有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ または
(f ) 8で表わされるア ノ 列 らなるタ ク質を ド ク オ の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ ス ト ジ な条件下で イブ 、
グ ク 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ 。
・ 下の ( ) ( ) の ずれ である に記載の ク オ (g) 8で表わされるア ノ 列にお て ０ 下のア
3０ 酸が 、 置換、 および もし は付加されたア ノ 列 らな 、 P グ ク 性を有するタン ク質を ド ク オ を含有する ク オ
( ) 8で表わされるア ノ 列に対して、 9０ 上の相 性を有するア ノ 列を有し、 P グ ク ン
性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ
( ) 7で表される 基配列の 62 目の 基配列 相補 な 基配列 らなる ク オ イス ト ジ な条件下で イブ 、 P グ ク
性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ または
( ) : 8で表わされるア ノ 列 らなるタン ク質を ド ク オ の 基配列 相補 な 基配列 らなる
イス ジ な条件下で イブ 、
P グ ク 性を有するタ ク質を ド ク オ を含有する ク オ 。
・ 7で表される 基配列の 362 目の 基配列 らなる ク オ を含有する、 請求 に記載の ク オ 。
・ 8で表わ れるア ノ 列 らなるタン ク質を ド ク オ を含有する、 請求 に記載の ク オ 。
・ である、 請求 ～3の ずれ 項に記載の ク オ 。
・ ～5の ずれ 項に記載の ク オ に ドされるタ ク 。 ～5の ずれ 項に記載の ク オ を含有する ・ ～5の ずれ 項に記載の ク オ が導入された形質 換体。 ・ 7に記載の クタ が導入 れた形質 換体。
・ 8又は9に記載の 換体を用 る 6のタ ク質の製 。
・ 6に記載のタ ク質を触 して、 P グ ク
容体 質 らグ ク 合体を生成する、 グ ク 合体の 。
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