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WO2010011111A2 - 뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물 - Google Patents

뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물 Download PDF

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WO2010011111A2
WO2010011111A2 PCT/KR2009/004148 KR2009004148W WO2010011111A2 WO 2010011111 A2 WO2010011111 A2 WO 2010011111A2 KR 2009004148 W KR2009004148 W KR 2009004148W WO 2010011111 A2 WO2010011111 A2 WO 2010011111A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dds
composition
aging
dapsone
life
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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Application number
PCT/KR2009/004148
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English (en)
French (fr)
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WO2010011111A4 (ko
WO2010011111A3 (ko
Inventor
박상철
이준호
조성천
박문철
조윤제
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SNU R&DB Foundation
Original Assignee
SNU R&DB Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US12/737,553 priority patent/US20110152379A1/en
Publication of WO2010011111A2 publication Critical patent/WO2010011111A2/ko
Publication of WO2010011111A3 publication Critical patent/WO2010011111A3/ko
Publication of WO2010011111A4 publication Critical patent/WO2010011111A4/ko
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/13—Amines
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a composition for regulating aging and / or life extension. Specifically, the present invention relates to a composition for regulating aging and / or life extension containing dexone as an active ingredient.
  • Aging is the continuous accumulation of cell damage, cell membrane lipids and intracellular proteins, caused by many environmental hazards that are constantly exposed to the individual's life and by the products of their metabolism, such as free oxygen radicals.
  • Some kind of biological clock is embedded in the genes of all individuals, such as the damage accumulation theory of aging and the telomere hypothesis that degeneration, dysfunction, and direct or indirect DNA damage and mitochondrial degeneration occur.
  • the genetic program can be broadly divided into two classes: Genetic program theory of aging, in which aging occurs with the development and growth of individuals.
  • Depson Dapsone, 4,4'diaminodiphenylsulfone; hereinafter, Depson or DDS
  • Depson is a substance synthesized more than a century ago, is well known as a treatment for Hansen's disease, and is also used as an important drug in many other skin diseases [1, 40].
  • DDS functions as an oxidizer or an antioxidant
  • some studies suggest that DDS acts as an oxidant, causing hemolytic anemia [2, 3].
  • DDS can function as an antioxidant [5, 6].
  • dexone is not known at all about the effects of aging control, anti-aging or life extension.
  • the present inventors completed the present invention by discovering that the composition containing Depson (DDS) has an excellent life extension effect in a pretty little nematode and an inhibitory effect of paraquat induced by paraquat in human fibroblasts.
  • the composition containing the depson of the present invention has an effect of reducing mitochondrial function of pretty nematodes and expression of cytosolic ROS-producing proteins, and the effect of restoring the function of mitochondria decreased and decreased NOX expression in human fibroblasts.
  • Another object of the present invention is to provide a method for extending the lifespan of an individual comprising applying an effective amount of a depson to a subject.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for regulating senescence of cells, comprising applying the composition to senescent cells.
  • an object of the present invention is to provide a composition containing the depson of the present invention for the control of aging of cells and individuals.
  • the present invention provides a composition for regulating aging and / or life extension containing a dexone as an active ingredient.
  • the present inventors made an effort to know whether a composition containing Depson (DDS), a drug widely used in the treatment of Hansen's disease and various skin diseases and malaria diseases, has an effect of extending the life of an individual. As a result, it was found that the life extension effect was excellent in the individual.
  • DDS Depson
  • the term “senescene” has the same meaning as aging. Therefore, "aging control” refers to all the phenomena that control the aging phenomenon, such as inhibiting, preventing, relieving aging.
  • the composition of the present invention temporarily inhibits aging of cells or restores the biological function of senescent cells, thereby exhibiting a biological phenomenon similar to young cells.
  • the senescent cells treated with the composition of the present invention are responsive to growth factors such as EGF to restore signal transmission by the growth factors, and the cell cycle is normally operated.
  • the effect of inhibiting or mitigating cellular senescence affects lifespan directly or indirectly, meaning that the aging of an individual can be alleviated.
  • Pretty nematodes are nematodes that feed on bacteria from the soil and have no legs or wings, no eyes or segments, and sense the temperature, touch and smell of the surroundings through sensory organs in the head or tail.
  • Adults are about 1 mm in size and are relatively simple, multicellular organisms. The body is transparent and hermaphrodite, but there is also a woman. Since it was used as an experimental model in the 70's, it has been widely used because of its convenience, and the six chromosomal maps have been completed in 1999 and the genome project has been completed.
  • the pretty nematode becomes a nematode through four stages of molting process such as hatching from eggs, egg stage and L1 to L4 larval stage, and it takes 3 days. It has a short life expectancy of 3 weeks and can be very useful for life extension studies.
  • the effect test of Depson on the lifespan of the individual using the pretty little nematode first, E. coli is grown in the culture medium containing the dexon, and then used to feed the pretty little nematode to increase its lifespan Observe.
  • Antibiotics, dexone can reduce the growth of E. coli and affect the lifespan of pretty nematodes.
  • PABA para- aminobenzoic acid
  • the concentration of PABA is used in the concentration range of about 10uM affecting the growth of E. coli so as not to affect the life of the pretty little nematode.
  • the mechanism of extending the life of the nematode nematodes by the DDS-containing composition of the present invention can be regulated by insulin signal, mitochondrial complex, cytoplasmic ROS and pyruvate kinase. More specifically, life expectancy in pretty little nematodes following DDS can be attributed to decreased insulin signal regulation, reduced mitochondrial function (e.g., reduced mitochondrial membrane potential, reduced levels of mitochondrial complexes, reduced intracellular ATP content, and reduced intracellular oxygen consumption). ) And decreased expression of cytosolic ROS producing proteins (e.g.
  • ROS production such as by decreasing ROS producing protein content and intracellular mRNA levels
  • increased pyruvate content e.g. pyruvate kinase gene mutations--especially muscle pyruvate
  • Kinase activity e.g. pyruvate kinase gene mutations--especially muscle pyruvate
  • the mitochondrial complex in the mechanism of life extension by the DDS is preferably complex V, and the pyruvate kinase gene mutation is preferably pyk-1.
  • human fibroblasts were treated, and the treatment of paraquat increased oxidative stress, which is one of the mechanisms related to aging, and examined whether Dexon inhibited the cytotoxicity caused by paraquat. .
  • Paraquat (hereinafter, paraquat or PQ), a drug used herein, is a kind of herbicide and causes serious cell damage through a redox process.
  • PQ is widely used to induce oxidative stress in cells by generating superoxide anions during metabolism in a NADPH dependent manner.
  • Protein kinase C (PKC) is an essential element for NADPH oxidass (NOX), which is initiated and formed by ligands for the production of superoxide anions [7].
  • PQ has been reported to generate ROS through PKC-delta dependent NOX activity [8].
  • mitochondria are a major source of ROS, it is thought that they will be important in the oxidative stress induced by PQ and its toxic effects.
  • mitochondrial complex I NADH-ubiquinone oxido-reductase
  • PQ mitochondrial complex V activity
  • the insufficiency of mitochondrial organs and the reduction of mitochondrial complexes by PQ resulted in inhibition of electron transfer and production of superoxide anions [11].
  • Antioxidants inhibit ROS production, ROS elimination, and damage by ROS, and therefore, having a safe and effective antioxidant function will be important in preventing various diseases in humans induced by oxidative stress.
  • the composition containing the depson of the present invention reduces the expression of NOX by inhibiting PKC activity induced by paraquat and reduces abnormal function of mitochondria, ie changes in the amount of complex proteins in mitochondria, membrane potential Cell aging can be controlled by effectively controlling changes, increased ROS production, and the like.
  • compositions of the present invention may be formulated into cosmetic formulations, pharmaceutical formulations and dietary supplements or drink formulations by conventional methods known in the art.
  • composition of the present invention is made of a cosmetic composition
  • a cosmetic composition in addition to the active ingredient, dexone, includes components commonly used in cosmetic compositions, and for example, conventional auxiliary agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. And carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing It may be formulated as, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • composition of the present invention when prepared as a pharmaceutical composition or dietary supplement, it may include a pharmaceutically acceptable carrier or a food-acceptable carrier in addition to Depson, including carbohydrate compounds (eg, lactose, Amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose, etc.), acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, Salt solutions, alcohols, gum arabic, vegetable oils (e.g.
  • carbohydrate compounds eg, lactose, Amylose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose, etc.
  • acacia rubber e.g., calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, Salt solutions, alcohols, gum arabic
  • composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and the composition of the present invention may contain an appropriate amount of salt to maintain the physiological activity of the active ingredient.
  • it may include a buffer solution in which the PH regulator is dissolved.
  • the active ingredient of the present invention may be administered by additionally including a dispersing agent or a stabilizer.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
  • Preferred dosage forms are oral administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the patient, Usually an experienced physician can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis, or determine the dosage in several divided doses per day.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is to administer 1 mg to 150 mg of dexone per 50 kg of individual per single dose, preferably 50 to 100 mg.
  • the present invention provides a method for regulating senescence of cells, comprising applying a composition containing Depson as an active ingredient to senescent cells.
  • the present invention also provides a method for extending the lifespan of a subject comprising applying the composition to a subject.
  • the senescent cell is an animal, preferably a mammal, more preferably a human cell, most preferably a human fibroblast.
  • the subject is also an animal, preferably mammals and pretty little nematodes, most preferably humans and pretty little nematodes.
  • the present invention relates to a composition for regulating aging and / or life extension.
  • the present invention relates to a composition for aging control and / or life extension containing dexone as an active ingredient, and when the composition of the present invention is applied to a subject, aging control or life extension effect is excellent.
  • DDS Depson
  • the administration of Depson (DDS) increased lifespan independantly on daf-16 in pretty nymphs, slowed the aging process and decreased the activity of mitochondrial complex V protein and cytoplasmic dual oxidase 1 (Duox1).
  • Depson was also found to reduce ROS formation by maintaining a low oxygen consumption rate in pretty nematodes.
  • Depson treatment also reduced ROS generation by paraquat, an oxidative stress inducer, and lowered susceptibility by paraquat. Furthermore, structural predictions and molecular and biochemical analyzes suggested that pyruvate kinase was the target of Depson. In addition, in human fibroblasts, there was an effect of reducing mitochondria and decreased NOX expression in cells by dexon. This comprehensive result has shown that dexon is effective in increasing lifespan at the individual and cellular levels.
  • FIG. 1 is a graph confirming the growth of bacteria by PABA treatment. At this time, the growth of bacteria was confirmed in the PABA control group and the group treated with 2 mM DDS, respectively, and prevented the effect of dietary restriction by inhibiting the proliferation of OP50 by DDS. OP50 bacteria were treated with only PABA (2 uM) or PABA and DDS simultaneously for 36 hours.
  • Figure 2 is a graph showing the intake of DDS of pretty nematodes administered with DDS. More specifically, as a result of the chromatogram of worms containing DDS using HPLC, DDS was measured in worms fed OP50 bacteria treated with DDS, DDS 10uM was placed in HPLC as a comparative control and measured (left) and treated with DDS. One OP50 was eaten and measured by worm measurement (right). The inserted table indicated the details of the DDS peaks shown in the graph.
  • Figure 3 shows the growth curve of pretty little nematodes administered with Depson
  • Figure 4 shows the activity of the worms at 23 days of feeding or not feeding the DDS, taking a picture every 20 seconds after the DDS administration to show the results. At this time, the arrow indicates the initial position of the worm.
  • FIG. 5 shows the results of slowing the progression of aging by DDS
  • 5A is a photograph taken of the self-luminescence of lipofuscin in the small intestine of the insects fed DDS for life and after the L4 stage. At this time, the number means the day passed after the adult
  • F2 is the DDS administration and 2 generations have passed
  • L4 means the administration of DDS after L4 generation.
  • FIG. 5B is a graph showing the quantitative difference in lipofuscin accumulation in FIG. 5A, where more than 30 worms were observed daily. Error bars represent standard deviations, * denotes P ⁇ 0.0001, and ** denotes P ⁇ 0.001. Mann-Whitney t-test
  • Figure 7 is a graph showing the growth curve of a pretty little nematode with or without folP, a target substance of DDS, feeding a defective bacterium. At that time, folP showed a prolonged lifespan in pretty nematodes that fed the defective bacteria. In two of three experiments, lifespan increased significantly.
  • FIG. 8 is a graph showing mitochondrial separation and Western blot to measure the amount of complex V of mitochondria. ⁇ -tubulin is used as a comparative control. Results were statistically processed using the mean and deviation from four replicates.
  • FIG. 9 is a graph showing the measured ATP amount of pretty nematodes by DDS treatment (administration).
  • Figure 10 shows the oxygen consumption rate of pretty little nematodes by DDS treatment (administration). In this experiment, the average of four replicate experiments was calculated.
  • FIG 11 is a graph showing the result of H 2 O 2 produced by PQ being inhibited by administration of DDS.
  • the production of the generated H 2 O 2 was measured using a plate reader at 540 nm absorbance using AmplexRed. (*: Compared with the control group not treated with PQ, **: compared with the group without PQ treatment and DDS)
  • FIG. 12 is a graph showing the persistence in liquid NGM medium containing PQ (250 mM, for 7 hours) for worms treated with or without DDS. At this time, both groups were treated with PABA, and lifespan measurements were performed until the worms died ( p ⁇ 0.0001).
  • Figure 13 shows the results of measuring the amount of ceDoux1 mRNA by RT-PCT for worms and worms fed DDS. At this time, Actin was used as a comparative control, and the results were obtained by averaging four experiments (* P ⁇ 0.005).
  • Figure 15 lists pyruvate kinase sequences of different species. Potential residues (PEP binding active regions) that interact with DDS are indicated in red and dots. Abbreviations: CePYK-1, C. elegans PYK-1; CePYK-2, C. elegans PYK-2; Sc, S. cereviciae ; Tm, T. maritime; Pf, P. furiosus ; 1 pkm, cat PK; And 1a5u, rabbit PK. Residue K246, indicated by an asterisk (*), is one of the PEP binding sites of PK.
  • FIG. 16 shows the results of 'PK inhibition' by DDS in vitro (16A) and in vivo (16B).
  • the activity of PK was analyzed by decreasing the absorbance of pyruvate and NADH to lactate and NAD by lactate dehydrogenase (LDH) at 340 nm absorbance.
  • Pyruvate and ATP used here were formed from phosphoenolpyruvate (PEP) and ADP by PK.
  • In vitro analysis was carried out by measuring DDS directly and in combination with PK into the reaction mixture, and in vivo analysis by measuring insects ingesting DDS.
  • Figure 17A shows an increase in pyruvate content in pretty little nematodes by DDS treatment (administration) (* P ⁇ 0.001)
  • 17B shows an increase in pyruvate content in pyk-1 (ok1754) mutant worms not treated with DDS It is shown.
  • N2 and ok1754 mutants were fed OP50 bacteria grown in medium containing PABA only or PABA + DDS.
  • 19 is a graph showing that pyk-2 RNAi has no effect on the lifespan of wild type N2 and pyk-1 mutant animals.
  • FIG. 21 shows that DDS does not affect progeny in pretty little nematodes.
  • A shows the mRNA of genes related to progeny in worms fed or not fed DDS through RT-PCR.
  • B) was carried out using immunoassay in a transgenic (gene transgenic) nematode with a GFP :: lgg-1 marker of progeny. At this time, it can be seen from the immunoblot that there was no significant difference in the worms fed DDS. All results summarize three independent experiments.
  • Figure 22 shows that even low concentrations of DDS is almost similarly effective in extending the life of insects.
  • the survival curves of worms fed DDS 0.5 mM or 1 mM showed almost similar life extension.
  • FIG. 23 shows the effect of DDS on the viability of PQ-treated human diploid fibroblasts (HDFs) cells, pretreatment of DDS to human fibroblasts for 3 hours, and 1 mM PQ for 48 hours. Treated during. Cell Counting Kit-8 was added to the cells and cultured for 48 hours to measure cell viability.
  • DPI 5 uM
  • NAC 2 mM
  • Results were expressed as control rate (%), normalized to the control.
  • Three experiments were performed, and statistical significance was indicated by #, * Significantly different p ⁇ 0.005 (#: control group without any treatment (CC), *: control group treated with only PQ (C)).
  • FIG. 24 shows the effect of DDS on cytosolic or mitochondrial superoxide anion production induced by PQ.
  • Human fibroblasts were grown in 96 well plates for 24 hours, DDS, DPI (5 uM, 30 min), and NAC. (2 mM) was pretreated for 3 hours. The cells were treated with PQ 1 mM for 30 minutes, and incubated at 37 ° C. for 15 minutes with oxidant-sensitive fluorescent dyes (A) DHE (5 uM, cytosol specific) and (B) MitoSOX (5 uM, mitochondria specific). . Fluorescence changes were measured by Dwell excitation and emission wavelengths at 515 and 590 nm and MitoSOX at 520 and 580 nm using a multiwell plate reader. The results show the results of six experiments at the control rate (%). Statistical significance *, # p ⁇ 0.005; ** p ⁇ 0.05.
  • FIG. 25 shows the results of measuring DPPH-radical scavenging activity of DDS in vitro (in vitro), and for changes in protein levels of SOD1 and SOD2, enzymes that remove superoxide anions generated in HDF treated with PQ.
  • the effects of DDS are shown in (A) Cell-free system (Graphs showing the effect of DDS with radical scavenging activity in vitro on the inhibition of DPPH (200 uM) radical. Trorox, well known as water soluble vitamin E (B) Western blot analysis of (Cu / Zn-) SOD1 and (Mn-) SOD2 in human fibroblasts treated with 3 hours before DDS and 1 or 12 hours PQ 1 mM Expression was measured.
  • Figure 26 shows the effect of DDS on NOX4 mRNA increased by PQ in human fibroblasts
  • A human fibroblasts pretreated with DDS, DPI (5 uM), and NAC (2 mM) and PQ (1 mM)
  • B Quantified in% ratio compared to control (human fibroblasts not treated with anything).
  • FIG. 27 shows the effect of DDS on the activity of PQ-induced calcium dependent PKC in human fibroblasts, showing the effect of DDS on changes in the amount of PQ-induced calcium in human fibroblasts.
  • HDF cells were grown in 96 well pate and measured using Fluo-4AM to measure intracellular calcium. Different concentrations of DDS (27A) and 5 uM DPI were pretreated and 1 mM PQ (27B).
  • FIG. 28 shows PKC phosphorylation induced by PQ by Western blot method.
  • Human fibroblasts were pretreated with DDS, treated with PQ 1 mM for 1 minute or 5 minutes, and collected and analyzed for phosphorylation of PKC (statistically). Significance compared to #p ⁇ 0.05 CC * compared to p ⁇ 0.05 C).
  • the protein amounts of the constitutive complexes of mitochondria were complex I (20 kDa ND6 subunit), Complex II (30 kDa FeS, non-heme iron protein, SDHB), Complex III (47 kDa core protein 2), Complex IV (18 kDa subunit IV, and Measurements were made by Western blot method using Complex V (55 kDa subunit a ATP synthase), etc. (described above)
  • FIG. 30 is a result of staining using Mitotracker Red and visualized by confocal microscopy to analyze the structural changes of mitochondria.
  • Human fibroblasts were treated with 1 mM PQ (24 hours) and DDS (or DPI) as in the above experimental method and covered with glass coverslips.
  • the first figure shows control human fibroblasts that did not process anything, the second human fibroblasts treated with PQ only, the third human fibroblasts pretreated with PDS and treated with PQ, and the final figure, DPI and PQ.
  • C.elegans was used as a model animal to investigate the effect of Depson on the life of an individual.
  • the lines of pretty nematodes used in the experiment were wild-type N2 Bristol and mutant daf-16 (cf1038), clk-1 (e2519), isp-1 (qm150) and adls2122 [GFP :: lgg-1 , rol-6 (su10060)].
  • the amount of self-luminescence in the small intestine was measured by using the Image J 1.35 to measure the brightness of the pixels in a certain area. More than 30 pretty little nematodes were measured every day to find the mean and standard error.
  • the HPLC system consists of a JASCO HPLC pump PU-980 and a JASCO UV-975 detector.
  • a C18 150 ⁇ 4.6 mm (5 ⁇ m) column was used for sample separation and the passage rate was 1.0 mL / min.
  • DDS was performed using a solution consisting of water: acetonitrile: glacial acetic acid: triethylamine (80: 20: 1.0: 0.05, by volume), and both tests were performed at 295 nm (285 nm emi / 340 nm exi).
  • the rest was prepared as a cytoplasmic part. After freezing and thawing the sorted mitochondria and cytoplasmic sections, 0.8% CHAPS was treated before measuring the amount of mitochondrial complex V [49]. Protein quantitation was performed using the BCA Protein Assay Kit (Pierce).
  • the amount of ATP was measured by slightly modifying the previously described method [38]. To analyze the total amount of ATP, feed PABA alone or PABA and Depson together to raise a pretty nematode, and use S Basal buffer (0.1 M NaCl / 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 6.0) to remove other contaminants. Remove to prepare the measurement sample. The sample was finally set to 100ul and frozen at -80 ° C. The frozen pretty nematode immediately boiled for 15 minutes, ejected ATP to keep cold, and centrifuged (15,000 g, for 5 minutes) to remove the remains of the pretty nematode. The amount of ATP was measured using a reagent of the bioluminescence assay kit CLS II (Roche Molecular Biochemicals) and a luminometer (PerkinElmer). The amount of APT was normalized to the amount of protein.
  • S Basal buffer 0.1 M NaCl / 0.05 M potassium phosphate buffer, pH 6.0
  • PCR amplification was used by PCR Master Mix (Genenmed), the base sequence of the primers used, ceDuox1; 5′-CTTCACACCGTTGGACATTG-3 ′ (forward primer) and 5′-GAAGATGTGTGAGCCGGAAT-3 ′ (reverse primer), Actin; 5'-TCGTAGGACTTCTCGAGGGA-3 '(forward primer) and 5'-ATGTTGCCGCTCTCGTAGTT-3' (reverse primer) were used.
  • eat2 Forward primer (5′-GCAAATTCCCCATGGTACAC-3 ′) and reverse primer (5′-CATGGAAAGTGAGCACGAGA-3 ′); eat3 : Forward primer (5'- AGGCTGCATCAGAACGTCTT-3 ') and reverse primer (5'- TGTTTGTGCTCTGGATCTGC-3'); bec1: Forward primer (5′-CAAAGAAGGCCAGATTCAGC-3 ′) and reverse primer (5′-CGTTGTCGGATGGTTTTCTT-3 ′); let-512 / VPS34: Forward primer (5'-TATGCGAGTCTCCACGTCAG-3 ') and reverse primer (5'-CCAATCGATCCTTTGCTTGT-3'): T22H9.2 (atg9): Forward primer (5′-CACTTCAACGAGCTTGACCA-3 ′) and reverse primer (5′-GTGATGACGTGTTCCACCTG-3 ′); atgr-18 (atg-18)
  • lamp1 Forward primer (5′-CAACGCTTACAAGTGCTCCA-3 ′) and reverse primer (5′-ACGACGATTGGGACAACTTC-3 ′); lamp2: Forward primer (5′-GGCCAAAAGAAACTTGTCCA-3 ′) and reverse primer (5′-TTTCGTCATTGGAAGCTGTG-3 ′).
  • the Amplex Red hydrogen peroxide / peroxygenase assay kit (Molecular Probes, Eugene, OR) [39] described previously was used.
  • 150 little nymph nematodes fed with PABA alone or with PABA and Debson were treated with 250 mM paraquat for 1 hour.
  • 50ul were placed in 100 pretty little nematodes, and 50ul of Amplex Red (200uM) was added to each well. After standing at 22 ° C. for 90 minutes, the amount of hydrogen peroxide was measured using a plate reader (Tecan, infinite 200) and an absorbance of 540 nm.
  • Depth oxidative stress resistance test Five-day-old pretty nematodes with Depson for two generations were used, and 20 pretty little nematodes were soaked in 250 mM paraquat in M9 solution. The number of live pretty nematodes was measured every hour.
  • Oxygen consumption was determined by using the Clark-type oxygen electrode (782 Oxygen Meter, Strathkelvin Instruments, Glasgow, UK). Pretty nematodes were grown on NBA agar medium supplemented with PABA alone or with PABA and DDS, fed OP50, and washed 4 times using S-basal buffer to wash off the contamination. 200 ⁇ L of S-basal buffer was inserted into a Mitocell chamber equipped with a Clark-type oxygen electrode in about 1,500 nematodes, and oxygen consumption was measured for several minutes. Samples were carefully collected in this chamber, and homogenized with glass beads for 20 seconds twice at 5000 rpm using a Precellys24 homogenizer. Centrifugation at 15000g for 20 minutes was used for quantification of supernatant protein using BCA protein quantification kit. Oxygen consumption rate was corrected with total protein.
  • Clark-type oxygen electrode 782 Oxygen Meter, Strathkelvin Instruments, Glasgow, UK. Pretty nematodes were grown on NBA agar medium supplemented with
  • Z score 15.1 and 15.0 were obtained by DALI search [52] with Streptococcus pneumoniae (PDB ID; 2VEG), Cat & rabbit pyruvate kinase (PDB ID; 1PKM, 1A5U respectively) and DHPS structure. It had an RMSD value of 3.1 between 519 residues in both constructs. DDS was preferentially modeled at the aminophenyl group position, the structural PABA binding region of DHPS. The structure of cat pyruvate kinase is consistent with DHPS. The final model of the DDS was manually modified by the program COOT to control steric hindrance between the PK and possible binding regions of the DDS [53]. The residues of PK were potentially bound to DDS using the cat pyruvate kinase structure and the model of DDS, and the sequences of six different species of PK were preserved.
  • the pyruvate content was measured using a commercially available fluorescence-based assay kit (BioVision) and measured using the instructions of the purchased kit. Pyruvate content was measured as total protein and expressed as nmol / mg of protein. The measurement was performed three times.
  • Sample preparation was performed by putting the glass beads into 100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.6 at 37 ° C., and putting the glass beads into a glass bead twice at 5000 rpm for 20 seconds using a Precellys24 homogenizer. To the homogenized sample chaps were added to a final concentration of 1% and centrifuged at 15000 g for 20 minutes. Pyruvate kinase activity measurement was performed referring to the previous paper [54].
  • Measurements were performed at 37 ° C., 100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.6 at 37 ° C., 100 mM MgSO 4 , 1.3 mM ⁇ -NADH, 5000 units / mL of lactate dehydrogenase (LDH), 2 mM adenosine diphosphate (ADP), The reaction mixture was mixed with 300 ⁇ L of 17 mM phosphoenolpyruvate (PEP). The change in oxidation degree of NADH at the absorbance of 340 nm was measured. PK 1 unit was defined as the change of PEP 1.0 ⁇ mole to pyruvate at pH 7.6, 37 °C per minute.
  • Depsone (dapsone, 4,4'-diaminodiphenylsulfone, hereinafter DDS) was purchased from Taeguk Chemical Co., Ltd., and paraquat, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazal (DPPH), trolox, iodonium (DPI) and N Acetyl-L-cysteine (NAC) was purchased from Sigma and used.
  • Cell Counting Kit (CCK-8) was purchased from Dojindo Laboratory (Japan) and used. Reagent was purchased from MRC (Cincinnati, USA.
  • the radical scavenging activity measured the reducing power of DPPH contained in methanol.
  • the effect of DDS on radical scavenging was based on the previously studied method [12] and Trorox was used as a positive control.
  • various concentrations (0.1-100 uM) of DDS and Trolox dissolved in 0.5 ml of methanol were mixed in a test tube of 2.5 ml of methanol containing 200 uM of DPPH.
  • DPPH is a stable free radical with a dark purple color and absorbance at 517 nm. But when reacted with antioxidants, they become light yellow. The reaction mixture was shaded at room temperature for 30 minutes, and the absorbance was measured at 517 nm.
  • Example 18 Measurement of NADPH Oxidase 4 (NOX4) mRNA Level by RT-PCR
  • RNA from human fibroblasts was isolated using Trizol reagent (MRC Cincinnati, US), and RT-PCR was measured for NOX4 and GAPDH using Biometra T Gradient PCR (Biometra, Goettingen, Germany).
  • Specific NOX primers 5'-GGTCCTTTTGGAAGTCCATTTGAGG-3 '(forward primer) and 5'-CACAGCTGATTGATTCCGCTGAG-3' (reverse primer); Primers 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '(forward primer) and 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (reverse primer) for GAPDH were used.
  • PCR amplified DNA was isolated with 1.2% agarose gel, stained with EtBr, visualized, and photographed by UV.
  • Human fibroblasts were cultured using a 96-well plate. Human fibroblasts were pretreated with DDS, DPI (30 min) and NAC for 3 hours, treated with 1 mM PQ for 30 minutes, and then shaded with fluorescent substance, Dihydroethium (DHE) 5 M, 37 Incubate at 15 ° C. for 15 minutes. Cells were washed twice with DPBS, and the fluorescent ethidium-DNA was immediately measured at an excitation wavelength of 515 nm and an emission wavelength of 590 nm using a Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA).
  • DHE Dihydroethium
  • Mitochondrial superoxide anion was measured using a fluorescent material called MitoSOX Red.
  • the reduced fluorescent material does not fluoresce until it enters the respiratory cell, and the oxidized fluorescent probe, which is oxidized into the cell, selectively stains mitochondria [13].
  • Human fibroblasts were pretreated with DDS, DPI (30 min), and NAC for 3 hours, treated with 1 mM PQ for 30 minutes, then shaded with the fluorescent MitoSOX Red 5M for 15 minutes at 37 ° C. Incubated. Cells were washed twice with DPBS and fluorescence was immediately measured at excitation wavelength 515 nm and emission wavelength 590 nm using CEFS (Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA)) instrument.
  • CEFS Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer
  • Lysates of human fibroblasts treated with DDS and PQ were treated with sample buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8), 2% SDS, 0.14 M 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, and 0.001% bromophenol blue. Prepared by boiling), and separated by electrophoresis.
  • MS601 Total OXPHOS Complexes Detection Kit, MitoSciences, containing antibodies against SDH30 subunit of complex II (5 ⁇ g / ml), Core2 subunit of complex III (0.2 ⁇ g / ml), COXII subunit of complex IV (2 ⁇ g / ml), and subunit ⁇ of F1-ATPase of complex V (0.2 ⁇ g / ml), PCKpan-p, PCK ⁇ / ⁇ -p, PKC ⁇ -p (Phospho-PKC Antibodies such as antibody Sampler Kit, Cell Signaling Technology), PKC ⁇ , PCK ⁇ , PKC ⁇ (Life Technologies), and ⁇ -Actin (Sigma) were tested. Measurements were performed using horseradish peroxygenase-conjugated secondary antibodies (Zymed) and ECL (Pierce). The results were visualized using an autoradiographic film (Image Reader, LAS-3000 Fujifilm,
  • the amount of calcium in the cells was used Fluo-4 (5uM), a calcium-labeled fluorescent substance that passes well through the cells.
  • the cells were incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and shaded at room temperature for 30 minutes to completely de-esterify the AM ester in the cell.
  • HBSS added with 20 mM HEPES (pH7.4) removed extracellular fluorescent material, and 100 ul of HBSS was added to each cell well.
  • the fluorescence signal was measured at an excitation wavelength of 494 nm and an emission wavelength of 516 nm using a multi-well fluorescence plate Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA) [14]. The results are expressed in relative fluorescence units (RFUs).
  • the mitochondrial membrane potential ( ⁇ m) was changed using a mitochondrial-specific fluorescent cationic dye, DiOC6, and the fluorescence spectrophotometer [15, 16]. 40 nM DiOC6 was added to the culture solution and incubated for 15 minutes, and treated with PBS to remove the remaining fluorescent material. The analysis was performed using a Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA) and measured at excitation wavelength 480nm and emission wavelength 520nm.
  • CMXRos MitoTracker Red CMXRos (50 nM) was treated at 37 ° C. for 30 minutes. This dye is used as an indicator of function by labeling mitochondria with transmembrane potential of mitochondria in cells. After incubation, washed with PBS and fixed cells overnight at 4 ° C. with 4% paraformaldehyde. The next day, the solution was treated with blocking solution (2% bovine serum albumin in PBS) for 1 hour at room temperature, and also DAPI stained at room temperature for 10 minutes. After washing off, the cells were covered with coverslips and the cells visualized with a fluorescence microscope.
  • blocking solution 2% bovine serum albumin in PBS
  • C. elegans was used to study the aging process and lifespan. Analyzing the life of the pretty little nematode raised under the feeding of E. coli treated with Depson, the results are shown in Figures 1, 2, 3 and Tables 1 and 2. As can be seen from the results of FIGS. 1, 2, 3 and Tables 1 and 2, it was found that the life span of the pretty little nematodes administered with Depson significantly increased. At this time, the dexon (DDS) is difficult to dissolve in water, so it is ingested by treating the dexon to nutrient growth medium (NGM) agar plates, a culture medium of Escherichia coli OP50, which is used as a food for the pretty nematodes. It was made.
  • NMM nutrient growth medium
  • DDS competitively inhibits para-aminobenzoic acid (PABA) to inhibit folic acid synthesis
  • PABA para-aminobenzoic acid
  • FIG. 1 DDS was treated with PABA (10 uM, maintaining 80% of the growth rate of the control group, FIG. 1) to reduce the antibiotic effect of DDS.
  • PABA helped the growth of bacteria and inhibited the dietary effects of starvation of nematodes.
  • Treatment of 2 mM DDS was found to accumulate about 5 mg of DDS per kg of nematode (kg) (FIG. 2). This is similar to the amount administered to patients with Hansen [42].
  • the life span of the pretty nymph nematode treated with PABA and DDS was significantly longer than that of the control treated with PABA only (FIG. 3, Table 1).
  • DDS Depson
  • DDS elegans NOX and ceDuox, another source of ROS, are also reduced by DDS (FIG. 13).
  • DDS is effective not only in the mitochondria but also in the cytoplasm. In this respect, it is very difficult to imagine how DDS affects all of these reactions.
  • DDS inhibits bacterial growth by competitively binding to PABA and the active site of the DHPS enzyme required for the synthesis of bacterial folic acid.
  • PABA the active site of the DHPS enzyme required for the synthesis of bacterial folic acid.
  • these functional mechanisms of DDS cannot be found in eukaryotes.
  • DDS binding to DHPS is well known (58), and we analyzed the protein structure to find candidate proteins with structures similar to the binding pocket of DHPS.
  • cytochrome P450 was the protein with the best conformation to DDS.
  • the cytochrome P450 is well known as a substance that binds and decomposes a foreign body compound, and DDS is recognized and decomposed by P450 even in pretty little nematodes.
  • pyruvate kinase is a candidate (FIGS. 14, 15).
  • hemolytic anemia is present in patients with PK deficiency, a major side effect of DDS in patients with leprosy (60, 61).
  • Increasing pyruvate content has been reported to extend lifespan (62).
  • the genome of a pretty nematode has two genes of PK, the pyk-1 and pyk-2 genes corresponding to F25H5.3 and ZK593.1, respectively, but a pyk-1 (ok1754) mutation with a missing pyk-1 mutation.
  • Pretty little nematode with a high pyruvate content FIG. 17B.
  • the lifespan of pyk-1 (ok1754) pretty nematodes without DDS was longer than that of N2 control worms, but shorter than that of N2 treated with DDS (FIG. 18, Table 1).
  • the search for proteins that interact with DDS can identify DDS targets. At present, it is not easy to control how to inhibit PK activation by DDS or by mutations that increase pyruvate levels. In one possibility, it is possible to supply additional amino acids and pyruvates by autophagy. However, it is not possible to confirm such a possibility because genes involved in progeny have no change in transcription level after DDS treatment and LGG-1, a progeny marker protein, does not increase after DDS treatment (FIG. 21). The second possibility is that DDS inhibits the action of other enzymes in the TCA cycle, thus lowering pyruvate consumption. At the same time, mitochondrial complex V levels and oxygen consumption are then reduced by DDS.
  • the standard DDS dose for a typical patient is 100 mg / day for a long time, but side effects are reported (59) in a clinically insignificant range, so lower concentrations of DDS may be more effective in extending lifespan. . Therefore, it was observed that pretty little nematodes treated with low concentrations of DDS of 0.5mM and 1mM effectively extended life as much as 2mM of DDS (FIG. 22, Table 2). From this point of view, the present inventors have found that DDS, which is used to treat various skin diseases, malaria, and especially Hansen's disease, contributes to the increase of lifespan by extending the lifespan of the nematodes and reducing ROS production. Therefore, it is suggested that the administration of low concentration of depson can effectively increase the life of human.
  • human fibroblasts were treated with various concentrations of DDS (0.1, 1, 5, 20, and 50 uM), DPI (5 uM), and NAC (2 mM). Pretreatment followed by PQ 1 mM for 48 hours. NAC, a well known DPI and antioxidant, well known as an inhibitor of NOX, was used as a positive control. Cell viability was measured using the Cell Counting Kit (CCK-8). Human fibroblasts treated with PQ without any pretreatment reduced cell viability by about 58.8% compared to the control without PQ. In contrast, human fibroblasts pretreated with DDS have improved viability compared to cells with PQ toxicity. In addition, DPI and NAC, used as a positive control, showed a cytotoxic inhibitory effect induced by PQ by about 80-90% compared to the control without any treatment (FIG. 23).
  • DDS inhibits the formation of superoxide anions by PQ
  • the production of superoxide anions by PQ was measured.
  • a fluorescent substance called MitoTracker Red was used to observe the formation of the dihydroetidium (DHE) and the superoxide anion of the mitochondria.
  • DHE dihydroetidium
  • This powerful fluorescent substance binds to DNA [17].
  • the superoxide anion is generated by PQ in human fibroblasts, and the produced superoxide anion is reduced by DDS concentration through the DHE assay.
  • the production of superoxide anion was also inhibited by DPI and NAC used as a positive control (FIG. 24A).
  • MitoTracker Red phosphors were used to measure the superoxide anions produced in the mitochondria, which reduced the fluorescence by entering active respiratory cells. However, when oxidized by mitonchondria superoxide anion, the amount of superoxide anion is measured by entering the mitochondria and fluorescing [13]. Human fibroblasts treated with DDS showed a concentration-dependent inhibition of superoxide anion production of mitochondria (FIG. 24B), and DPI and NAC used as positive controls also inhibited the production of superoxide anions of mitochondria.
  • DDS functions as an antioxidant
  • the inventors first examined the effects on DPPH, a well known stable free radical.
  • DDS showed no improvement in ROS removal activity against DPPH, which was tested in vitro.
  • trolox soluble vitamin E used as an antioxidant control group showed potent ROS elimination activity (FIG. 25A).
  • DDS increases the amount or activity of ROS-removing enzymes, and examined the amounts of ROS-removing enzymes SOD1 and SOD2 by treating DDS at various concentrations in human fibroblasts. Interestingly, DDS rather reduced the amount of SOD1 and SOD2 (FIG. 25B).
  • NOX4 is the major isomer of the NADPH oxidase gene in fibroblasts of human skin [18, 19], and expression of NOX4 mainly determines the amount of ROS production. Therefore, inhibition of NOX4 expression may contribute to a decrease in the production of ROS [20].
  • RT-PCR analysis of NOX4 and GAPDH was performed on human fibroblasts treated with PQ 1 mM for 5 minutes. The amount of NOX4 was increased in human fibroblasts treated with PQ.
  • DDS reduced NOX4 expression as a result of treatment with various concentrations of DDS in human fibroblasts. DPI can also be used to confirm that NOX4 is required for superoxide anion production by PQ in human fibroblasts (FIG. 26).
  • PKC isomers have been reported to be involved in NOX activity [22]
  • Conventional PKC (cPKC) or calcium dependent isomers such as PKC ⁇ , ⁇ -I, ⁇ -II, and ⁇ ) require calcium to be active.
  • cPKC calcium dependent isomers
  • PKC ⁇ , ⁇ -I, ⁇ -II, and ⁇ require calcium to be active.
  • Mitochondrial dysfunction is characterized by superoxide anion generation, membrane potential breakdown, mitochondrial DNA damage, and structural changes.
  • DDS recovered the amount of all mitochondrial complexes reduced by PQ (FIG. 29A).
  • mitochondria are elongated (FIG. 30. First).
  • Cells are mitotracker positive (MT +) fluorescence site mitochondria well observed, cytoplasmic staining mitotracker negative (MT-) can be observed cloudy staining [24].
  • MT + mitotracker positive
  • MT- cytoplasmic staining mitotracker negative
  • FIG. 30. Second small spot-shaped staining of the MT + portion of the mitochondria was observed.
  • Mitochondria of human fibroblasts pretreated with DDS and DPI and treated with PQ partially restored their original shape (FIG. 30. Third and fourth).
  • DDS is consistently used as a powerful therapeutic drug for many skin diseases.
  • DDS is also recommended by WHO as a treatment for Hansen's disease. These DDSs have been in common use since the 1940s and have been used by patients with leprosy for 30-40 years [25, 26]. Very few or clinically insignificant side effects have been reported for long-term use of the standard DDS dose (100 mg / day) in general patients [4]. Long-term use of DDS is distributed to all organs at concentrations similar to those of plasma [27]. In general, leprosy patients will receive a plasma concentration of 1-20 uM when taking 100 mg / day of DDS for 6-28 days.
  • DDS concentration of 50% growth inhibition (IC50) of human fibroblasts is about 745 uM (data not shown). So we studied using the concentration of DDS with safety. It is not yet clear whether these DDSs have oxidative or antioxidant functions, but recent papers have reported that DDS inhibits the production of superoxide anions in neutrophils, a type of phagocyte [21]. These recent results give us the meaning to study the antioxidant effects of DDS in human fibroblasts rather than phagocytes. However, since the production of ROS in human fibroblasts generally occurs at a low level, paraquat (PQ), which is well known to promote the production of superoxide anion specifically, was used.
  • PQ paraquat
  • Antioxidants are substances that remove ROS, inhibit new production, and repair oxidative damage [29]. Unremoved superoxide anion radicals can turn into more active hydroxyl radicals, which can directly induce DNA, protein and lipid damage. Some antioxidants exhibit antioxidant properties through the removal of superoxide anions radicals [30, 31], but substances that strongly inhibit the production of superoxide anions can also be used as antioxidants.
  • antioxidant DDS is not directly related to the radical scavenging system (direct radical removal or indirect increase in radical scavenging enzymes).
  • the present inventors therefore focused on the antioxidant function of inhibiting the production of radicals rather than the removal of radicals from which DDS is produced.
  • NOX NADPH oxidase
  • Oxidative stress induced by PQ is accompanied by an increase in NADPH oxidase (NOX) (but xanthine oxidase is not relevant) [8] and mitochondrial dysfunction [32, 33].
  • NOX uses oxygen molecules and NADPH as substrate and FAD as coenzyme.
  • NOX enzymes are involved in the regulation of a wide range of physiological functions such as cell survival, differentiation, proliferation, calcium signaling, and migration [20, 34].
  • NOX4 a major form of dermal fibroblasts, produces a significant amount of ROS and is increased by stimulation of TGF ⁇ [35, 36].
  • mesenial cells in the kidney increase the amount of NOX4 due to angiotensin stimulation, thereby increasing ROS [37].
  • DDS has been shown to be involved in the regulation of calcium [21]. However, although there is no result that the amount of calcium is regulated by PQ in human fibroblasts, the inventors have obtained that PQ increases the intracellular calcium and inhibits the increased calcium by DDS (FIG. 27B). Increased calcium increases the activity of calcium dependent PKC, which is required for NOX activity. It is well known that the increase of superoxide anion by PQ is associated with PKC [7, 8]. We therefore examined whether DDS can modulate the activity of PKC. In our results, DDS inhibited PKC ⁇ phosphorylation induced by PQ in human fibroblasts (FIG. 27B).
  • DDS suggests that PQ is a substance that inhibits the production of superoxide anion by restoring the amount of intracellular calcium in PQ-treated human fibroblasts and reducing NOX, which is mediated by PKC. Can be.
  • mitochondria are another major factor in ROS production, they may be considered to be involved in oxidative stress and toxicity induced by PQ.
  • Mitochondrial dysfunction by PQ has characteristics such as high superoxide anion generation, membrane potential damage, mitochondrial DNA damage, and structural changes.
  • DDS restores the abnormal properties of mitochondria induced by PQ in human fibroblasts.
  • DPI has been reported to have a function of inhibiting mitochondrial oxidase at the same time as inhibiting NOX, and the results of the present inventors also inhibit mitochondrial toxicity induced by PQ.
  • DDS may prove to be an effective inhibitor of PQ toxicity in human fibroblasts.
  • DDS inhibits oxidative stress and mitochondrial toxicity induced by PQ in human fibroblasts. These results were obtained through inhibition of NOX4 and inhibition of mitochondrial changes by the regulation of calcium and PKC activity of DDS.
  • DDS could be a new drug that can mitigate or minimize oxidative stress by inhibiting the production of new radicals rather than the removal of the radicals produced.
  • the present inventors expect to be able to guarantee the safety of the drug by patients with leprosy who have used DDS for a long time, and provide evidence that DDS contributes to long life without disease.

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Abstract

본 발명은 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 대상에 적용시 노화조절 또는 수명연장효과가 탁월하다. 구체적으로는, 뎁손(DDS)의 처리에 의해 예쁜꼬마선충에서 daf-16에 비의존적으로 수명을 증가시키며, 노화과정을 늦추고, 미토콘드리아 복합체 V 단백질과 세포질 dual oxidase 1(Duox1)의 활성을 감소시켰다. 또한 뎁손에 의해 예쁜꼬마선충에서 산소 소모율을 낮게 유지하여 ROS형성을 감소하는 것으로 확인되었다. 또한 뎁손 처리에 의하여 산화적 스트레스 유도물질인 파라쿼트(paraquat)에 의한 ROS 생성을 줄였으며, 파라쿼트에 의한 민감성도 낮았다. 게다가 구조적인 예측과 분자적, 생화학적 분석을 통하여 피루베이트 키나아제가 뎁손의 목표 물질임을 시사하였다. 또한 인간섬유아세포에서 뎁손에 의해 세포내의 NOX 발현감소 및 저하된 미토콘드리아의 기능회복 효과가 있었다. 이러한 종합적인 결과에 의해 뎁손은 개체수준 및 세포수준에서 수명을 증가시키는 효과가 탁월하다.

Description

뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물
본 발명은 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 관한 것이다.
노화란, 개체가 살아가면서 지속적으로 노출되는 여러 환경적 위해 요소 및 유리 산소(oxygen radical)와 같은 자체의 대사과정에서 생성되는 위해산물에 의해, 지속적으로 세포 손상의 축적, 세포막 지질 및 세포내의 단백질 변성에 의한 기능 저하, 직간접적인 DNA 손상 및 미토콘드리아 기능 저하 등이 일어난다고 보는 손상 축적설(Damage accumulation theory of aging) 및 텔로미어 가설과 같이, 모든 개체의 유전자 내에 일종의 생물학적 시계(biological clock)가 내재되어 그 유전적 프로그램에 따라 개체의 발달 및 성장과 함께 노화가 일어난다고 보는 노화 예정설(Genetic program theory of aging)의 두 부류로 크게 나뉠 수 있다.
한편, 뎁손(Dapsone, 4,4'diaminodiphenylsulfone; 이하, 뎁손 또는 DDS)은 1세기 전에 합성된 물질로, 한센병 치료제로써 잘 알려져 있으며, 기타 많은 피부병에서도 중요한 약물로 사용되고 있다[1, 40]. 또한 DDS가 비록 산화제 또는 항산화제로써 기능을 하는지는 분명하지 않으나, 몇몇 연구에서 DDS는 산화제로써 작용을 가지며, 용혈성 빈혈을 일으켜 사용을 제한하고자 제안하고 있다 [2, 3]. 몇몇 연구에서는, DDS가 항산화제의 기능을 할 수 있음을 시사하고 있다[5, 6]. 그러나, 이러한 뎁손이 노화조절, 노화방지 또는 수명연장 효과에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
개체의 노화를 이해하기 위해서는, 세포 수준에서의 노화, 즉 세포 노화(cellular senescence)에 대한 연구를 통해 그 분자적 기전을 규명하는 것이 필요하다. 세포 노화에 대한 많은 연구는, 개체의 노화 현상이 잘 반영되는 것으로 보고되고 있는 사람 섬유아세포[41]를 이용하여 주로 이루어지고 있다.
본 발명자들은 뎁손(DDS)을 함유한 조성물이 예쁜꼬마선충에서 수명연장 효과가 우수하며, 인간 섬유아세포에서는 파라쿼트에 의해 유도되는 세포독성의 억제효과가 우수함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 뎁손을 함유하는 조성물은 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 기능 감소 및 세포질의 ROS 생성 단백질들의 발현 감소 효과가 있으며, 인간 섬유아세포에서도 NOX의 발현을 감소 및 저하된 미토콘드리아의 기능 회복 효과가 탁월하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 뎁손의 유효량을 대상에 적용하는 단계를 포함하는 개체의 수명연장방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 노화세포에 적용하는 단계를 포함하는 세포의 노화 조절방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부된 청구범위 및 도면과 함께 하기된 상세한 기재에 의해 보다 명확하게 된다.
또한 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 특징은 개체가 살아가면서 겪게 되는 노화에 대해서, 개체의 노화를 완화하거나 억제하기위한 노화 조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 뎁손을 함유시키는데 있다. 따라서, 본 발명의 뎁손을 함유하는 조성물을 세포 및 개체의 노화조절의 용도로 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 뎁손를 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은, 한센병 및 여러 피부 질환과 말라리아 질환 치료에 널리 사용되고 있는 약물인 뎁손(DDS)을 함유한 조성물이 개체의 수명연장효과가 있는지 알고자 예의 노력하였다. 그 결과, 개체에서 수명연장 효과가 우수하다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "노화 (senescene)"는 노화 (aging)와 동일한 의미를 갖는다. 따라서 "노화조절"은 노화를 억제, 방지, 완화 등 노화현상을 조절하는 모든 현상을 의미한다. 구체적인 예시로서, 본 발명의 조성물에 의해 세포의 노화를 일시적으로 억제되거나 노화 세포의 생물학적 기능이 회복되어 젊은 세포와 유사한 생물학적 현상을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 의해 처리된 노화 세포는 EGF와 같은 성장인자에 대한 반응성이 회복되어 성장인자에 의한 신호 전달이 회복되며, 세포순환 (cell cycle)이 정상적으로 가동하게 된다. 또한 이러한 세포 노화의 억제 또는 완화효과에 의하여 수명에 직간접적으로 영향을 미쳐 궁극적으로는 개체의 노화가 완화될 수 있음을 의미한다.
개체의 수명에 미치는 뎁손의 효과를 알아보기 위한 모델동물로서 포유동물을 포함한 다양한 동물을 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 예쁜꼬마선충을 이용하였다.
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 흙에서 박테리아를 먹고사는 선충류로서, 다리나 날개가 없고 눈이나 체절이 없으며 머리나 꼬리에 있는 감각기관을 통해서 주변의 온도와 촉감 및 냄새 등을 감지한다. 성체의 크기는 1 mm 정도이고 비교적 단순한 형태를 지닌 다세포 생물이며, 몸이 투명하며 자웅동체이지만 웅체도 존재한다. 70년대에 실험모델로 이용되기 시작한 이래, 그 조작의 편리함으로 인하여 널리 이용되고 있으며, 6개의 염색체 지도가 99년 게놈 프로젝트가 완료되어 유전자 지도와 염기서열로의 접근이 용이하다는 장점이 있다. 또한 예쁜꼬마선충은 알에서 부화된 뒤 알시기(egg stage)와 L1 내지 L4의 유충시기를 거치는 등 4단계의 탈피과정을 거쳐 선충이 되며, 기간은 3일이 소요되며, 평균수명은 2-3주 정도로서 평균수명이 짧아, 수명연장 연구에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 예쁜꼬마선충을 이용한 개체의 수명에 미치는 뎁손의 효과실험은, 우선 뎁손을 함유한 배양배지에서 대장균을 키운 후, 이를 먹이로 이용하여 예쁜꼬마선충을 키워 이의 수명을 관찰한다. 항생제인 뎁손은 대장균의 성장을 줄어들게 하여 예쁜꼬마선충의 수명에도 영향을 미칠 수 있는데, 이러한 식이제한을 방지하기위해서 뎁손이 경쟁적으로 억제하는 PABA(para-aminobenzoic acid)를 배양배지에 첨가하여 대장균의 성장을 대조군과 비슷하게 유지한다. 이때 PABA의 농도는 대장균 성장에만 영향을 미치는 10uM 내외의 농도 범위로 사용하여 예쁜꼬마선충의 수명에는 아무런 영향을 미치지 않게 한다.
또한 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 DDS 함유 조성물에 의한 예쁜꼬마선충의 수명연장 기작은 인슐린 시그널, 미토콘드리아 복합체, 세포질의 ROS 및 피루베이트 키나아제에 의해 조절될 수 있다. 더 상세하게는, DDS에 이한 예쁜꼬마선충에서의 수명연장은 인슐린 시그널 조절 감소, 미토콘드리아 기능 감소(예컨대, 미토콘드리아 막전위 감소, 미토콘드리아 복합체 등의 함량 감소, 세포내 ATP 함량 감소 및 세포내 산소소모율 감소 등) 및 세포질의 ROS 생성 단백질들의 발현 감소(예컨대, ROS 생성 단백질의 함량 및 세포질내 mRNA 수준의 감소 등에 의한 ROS 생성 억제), 피루베이트 함량 증가(예컨대, 피루베이트 키나아제 유전자 돌연변이-특히 근육의 피루베이트 키나아제 활성)를 통하여 이루어질 수 있다.
상기 DDS에 의한 수명연장 기작에서 미토콘드리아 복합체는 바람직하게는 복합체 V이며, 피루베이트 키나아제 유전자 돌연변이는 바람직하게는 pyk-1이다.
또한, 본 발명자들은, 뎁손(DDS)을 함유한 조성물에 대한 인간의 세포수준에서의 노화조절 효과가 있는지 알고자 예의 노력한 결과, 개체에서 수명연장 효과에 관여하였던 세포내 미토콘드리아 기능 조절 및 세포질 내 ROS 생성물질의 억제 효과가 우수하다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 인간의 섬유아세포를 대상으로 하였으며, 파라쿼트를 처리하여 노화에 관련한 메카니즘의 하나인 산화적 스트레스를 증가시키고, 파라쿼트에 의한 세포독성을 뎁손이 억제하는지를 살펴보았다.
본 명세서에서 사용한 약물인, 파라쿼트(Paraquat; 이하, 파라쿼트 또는 PQ)는 일종의 제초제로, 산화환원 과정을 통해서 심각한 세포 손상을 일으킨다. PQ는 NADPH 의존적으로 대사 과정에서 초과산화물 음이온(superoxide anion)를 생성시킴으로써 세포에 산화적 스트레스를 유발하는데 널리 사용되고 있다. Protein kinase C (PKC)는 초과산화물 음이온의 생성을 위한 리간드에 의해 개시되어 형성되는 NADPH oxidass (NOX)를 위해 필수적으로 필요한 요소이다 [7]. 최근에 PQ는 PKC-delta에 의존적인 NOX의 활성을 통해 ROS를 생성한다는 연구가 보고되고 있다 [8]. 또한 미토콘드리아는 ROS의 주요 원천이기 때문에, PQ에 의해 유도되는 산화적 스트레스와 그로 인한 독성 유발에 있어 중요하게 관여를 할 것이라 여겨진다. 최근의 연구에서 미토콘드리아 복합체 I (NADH-ubiquinone oxido-reductase)이 PQ에 의해 초과산화물 음이온의 생성을 위한 미토콘드리아의 중요한 장소임을 보여주고 있다 [9]. 또 다른 연구에서는 PQ가 미토콘드리아 복합체 V 활성을 유의적으로 감소시킨다는 결과를 발견하여 보고하였다 [10]. PQ에 의한 미토콘드리아 기관들의 기능 부전과 미토콘드리아 복합물의 감소는 전자전달의 억제와 초과산화물 음이온의 생성을 유도하는 결과를 가져온다 [11]. 항산화제는 ROS생성, ROS의 제거, 그리고 ROS에 의해 손상을 억제하므로, 안전성을 가지면서 효과적인 항산화 기능을 갖는다면 산화적 스트레스에 의해 유도되는 인간의 여러 가지 질병의 방지에 있어서 중요할 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 뎁손을 함유하는 조성물은 파라쿼트에 의해 유도되는 PKC 활성을 억제함으로써 NOX의 발현을 감소시키고, 미토콘드리아의 비정상적인 기능 즉, 미토콘드리아의 복합 단백질 양의 변화, 막 전위 변화, ROS 생성 증가 등을 효과적으로 조절함으로써 세포 노화를 조절할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 화장료 제형, 약학적 제형 및 건강보조식품 또는 드링크제의 제형으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우에는 상기 유효성분인 뎁손 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물 또는 건강보조식품으로 제조되는 경우에는, 뎁손 이외에 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 식품에 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이에는 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 본 발명의 조성물은 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게하기 위해서 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하여 투여할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직한 투여 형태는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으며, 일일에 단회 수회 나누어서 투여량을 결정할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 일일 투여량은 단회에 대하여 개체 50kg당 1mg 내지 150mg의 뎁손을 투여하는 것이며, 바람직하게는 50 내지 100mg이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 뎁손을 유효성분으로 함유하는 조성물을 노화세포에 적용하는 단계를 포함하는 세포의 노화 조절방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 대상에 적용하는 단계를 포함하는 개체의 수명연장방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 노화세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간의 세포이며, 가장 바람직하게는 인간의 섬유아 세포이다.
또한 상기 대상은, 동물이며, 바람직하게는 포유동물 및 예쁜꼬마선충이며, 가장 바람직하게는 인간 및 예쁜꼬마선충이다.
본 발명의 방법 및 상술한 본 발명의 조성물 가운데, 중복된 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 또한 특별히 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 대상에 적용시 노화조절 또는 수명연장효과가 탁월하다. 구체적으로는, 뎁손(DDS)의 투여에 의해 예쁜꼬마선충에서 daf-16에 비의존적으로 수명을 증가시키며, 노화과정을 늦추고, 미토콘드리아 복합체 V 단백질과 세포질 dual oxidase 1(Duox1)의 활성을 감소시켰다. 또한 뎁손에 의해 예쁜꼬마선충에서 산소 소모율을 낮게 유지하여 ROS형성을 감소하는 것으로 확인되었다. 또한 뎁손 처리에 의하여 산화적 스트레스 유도물질인 파라쿼트(paraquat)에 의한 ROS 생성을 줄였으며, 파라쿼트에 의한 민감성도 낮았다. 게다가 구조적인 예측과 분자적, 생화학적 분석을 통하여 피루베이트 키나아제가 뎁손의 목표 물질임을 시사하였다. 또한 인간섬유아세포에서 뎁손에 의해 세포내의 NOX 발현감소 및 저하된 미토콘드리아의 기능회복 효과가 있었다. 이러한 종합적인 결과에 의해 뎁손은 개체수준 및 세포수준에서 수명을 증가시키는 효과가 탁월하다.
도 1은 PABA 처리에 의한 박테리아의 성장정도를 확인한 그래프이다. 이 때, PABA 대조군과 2mM의 DDS와 함께 처리한 군에서 각각 박테리아의 성장정도를 확인하였으며, DDS에 의한 OP50의 증식 억제를 통한 식이제한 효과를 방지하였다. OP50 박테리아에 PABA (2uM)만 처리하거나 PABA와 DDS를 동시에 36시간 동안 처리하였다.
도 2는 DDS를 투여한 예쁜꼬마선충의 DDS의 섭취량을 그래프로 나타낸 것이다. 더 자세하게는 HPLC를 이용한 DDS가 포함된 벌레의 크로마토그램 결과로, DDS를 처리한 OP50 박테리아를 먹은 벌레에서 DDS를 측정하고, DDS 10uM을 비교 대조군으로 HPLC에 넣고 측정(왼쪽)하고 및 DDS를 처리한 OP50을 먹은 벌레 측정(오른쪽)하여 비교하였다. 삽입된 표는 그래프에서 보여지는 DDS 피크의 상세 정보를 표시하였다.
도 3은 뎁손을 투여한 예쁜꼬마선충의 성장곡선을 나타낸 것으로, A는 일생동안 DDS(2mM, n=129)를 투여한 예쁜꼬마선충의 생장 곡선(생존율)를 그래프로 나타낸 것이고, B는 발생이 끝나고(청년기, L4 stage) DDS(2 mM, n=107)를 투여한 예쁜꼬마선충의 생장 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 DDS를 먹이거나 혹은 먹이지 않은 23일째 되는 벌레의 활동력을 나타낸 것으로, DDS 투여 후 20초마다 사진을 찍어 그 결과를 나타내었다. 이때, 화살표는 벌레의 처음 위치를 가리킨다.
도 5는 DDS에 의해 노화의 진행을 늦추어진 결과를 나타낸 것으로, 5A는 일생 동안 및 L4 stage 이후 DDS를 먹인 벌레의 소장에서 소모성 색소(lipofuscin)의 자가발광을 찍은 사진이다. 이 때, 숫자는 성체가 된 후 지나간 날을 의미하고, F2는 DDS를 투여하고 2세대가 지났음을, L4는 L4 발생 후에 DDS의 투여를 의미한다. 도 5B는 도 5A의 lipofuscin 축적의 정량적인 차이를 나타낸 그래프로, 매일 30마리 이상의 벌레를 관찰하였다. 오차막대는 표준편차를 나타내고, *는 P<0.0001, **는 P<0.001을 나타낸다. (Mann-Whitney t-test)
도 6은 PABA를 포함한 대장균을 먹인 daf-16(cf1038) 돌연변이 벌레(n=100)와 DDS 2mM과 PABA를 포함한 대장균(n=78 and 84, respectively)을 먹인 daf-16(cf1038) 돌연변이 벌레의 생존율을 나타낸 그래프로서, DDS의 효과는 daf-16에 비의존적임을 보여준다.
도 7은 DDS의 목표 물질인 folP가 결함이 있는 박테리아를 먹이거나 또는 그렇지 않은 예쁜꼬마선충의 성장곡선을 나타낸 그래프이다. 이 때, folP가 결함이 있는 박테리아를 먹인 예쁜꼬마선충에서 수명이 연장된 결과를 보여주었다. 3번의 실험 중 2번의 결과에서 유의적으로 수명이 증가하였다.
도 8은 미토콘드리아의 복합체V의 양을 측정하기 위해 미토콘드리아 분리와 웨스턴 블럿을 수행하여 나타낸 그래프이다. α-tubulin은 비교 대조군으로 사용. 결과는 4번 반복 실험의 평균과 편차를 이용해 통계적으로 처리하였다.
도 9는 DDS 처리(투여)에 의한 예쁜꼬마선충의 ATP양을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 DDS 처리(투여)에 의한 예쁜꼬마선충의 산소 소모율을 나타낸 것이다. 이때 실험은 4번 반복 실험을 평균 계산하였다.
도 11은 PQ에 의해 생성되는 H2O2가 DDS의 투여에 의해 억제된 결과를 나타낸 그래프이다. 생성된 H2O2의 생성은 AmplexRed를 사용하여 540nm 흡광도에서 plate reader를 이용하여 측정하였다. (*: PQ를 처리 하지 않은 대조군과 비교, **: PQ처리하고 DDS를 처리하지 않은 그룹과 비교)
도 12는 DDS를 처리하거나, 또는 그렇지 않은 벌레에 대하여 PQ(250mM, 7시간 동안)가 포함된 액체 NGM 배지에서의 성존률을 나타낸 그래프이다. 이 때, 두 그룹에 PABA를 처리하였으며, 벌레가 죽을 때까지 수명 측정을 수행하였다(p<0.0001).
도 13은 DDS를 먹인 벌레와 먹이지 않은 벌레를 RT-PCT에 의해 ceDoux1 mRNA양을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 이때, Actin은 비교 대조군으로 사용하였으며, 4번의 실험을 평균해서 결과를 구했다(*P<0.005).
도 14는 DDS와 PK(PEP 결합 활성 지역)의 구조적 모델링을 나타낸 것이다.
도 15는 각기 다른 종의 피루베이트 키나아제 서열을 나열한 것이다. DDS와 상호작용하는 잠재 잔기(PEP 결합 활성 지역)는 붉은 색 및 도트로 표시하였다. 약어: CePYK-1, C. elegans PYK-1; CePYK-2, C. elegans PYK-2; Sc, S. cereviciae; Tm, T. maritime; Pf, P. furiosus; 1pkm, cat PK; 및 1a5u, rabbit PK. 별표(*)로 표시한 잔기 K246은 PK의 PEP 결합자리 중 하나임.
도 16은 시험관(in vitro)(16A) 및 생체 내(in vivo)(16B)에서 DDS에 의한 'PK 억제'결과를 나타낸 것이다. PK의 활성도는 lactate dehydrogenase(LDH)에 의해 피루베이트와 NADH로부터 lactate와 NAD로의 변화 결과를 340nm 흡광도에서 감소하는 정도를 통해 분석하였다. 여기에 사용된 피루베이트와 ATP는 PK에 의한 phosphoenolpyruvate(PEP)와 ADP로 부터 형성되었다. In vitro 분석은, DDS를 직접과 PK와 함께 위 반응 혼합물에 넣어 측정하였고, in vivo 분석은, DDS를 섭취한 벌레를 넣어 측정하였다.
도 17A는 DDS 처리(투여)에 의한 예쁜꼬마선충에서 피루베이트 함량의 증가를 나타낸 것이고(*P<0.001), 17B는 DDS를 처리하지 않은 pyk-1(ok1754) 돌연변이 벌레에서 피루베이트 함량의 증가를 나타낸 것이다.
도 18은 pyk-1(ok1754) 돌연변이 동물의 수명연장을 나타낸 그래프로, DDS를 처리하지 않은 pyk-1(ok1754) 돌연변이 동물의 수명이 증가된 결과를 보인다. N2와 ok1754 mutant는 PABA만을 포함하거나 또는 PABA+DDS를 포함하는 배지에서 키운 OP50 박테리아를 먹이로 주었다.
도 19는 pyk-2 RNAi는 야생형 N2 및 pyk-1 돌연변이 동물의 수명에 아무런 영향이 없다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 20은 isp-1 mutant 벌레에서 피루베이트 함량의 증가를 나타낸 것이다(*P<0.001).
도 21은 DDS가 예쁜꼬마선충에서 자식작용에 영향을 주지 않음을 보여주는 결과로, (A)는 DDS를 먹이거나 먹이지 않은 벌레에서 자식작용과 관련된 유전자의 mRNA를 RT-PCR을 통해 확인한 것이고, (B)는 자식작용의 표지자인 GFP::lgg-1를 가지는 형질 전환(유전자 도입) 예쁜꼬마선충에서 면역 분석을 이용하여 실시하였다. 이때 면역블럿을 통해, DDS를 먹은 벌레에서 유의적인 차이를 보이지 않음을 알 수 있다. 모든 결과는 세 번의 독립된 실험을 정리한 것이다.
도 22는 낮은 농도의 DDS도 벌레의 수명 연장에 거의 유사하게 효과가 있는 것을 나타낸 결과이다. DDS를 0.5 mM 또는 1mM을 먹은 벌레의 생존 곡선에서 거의 비슷한 수명 연장의 양상을 보인다.
도 23은 PQ가 처리된 인간 섬유아세포(human diploid fibroblasts (HDFs)) 세포의 생존 능력에 대한 DDS의 효과를 나타내는 결과로서, DDS를 인간 섬유아세포에 3시간 동안 전 처리하고, 1mM PQ를 48시간 동안 처리하였다. 이 세포에 Cell Counting Kit-8를 추가하여 48시간 동안 배양하여 세포의 생존능력을 측정하였다. 또한 양성 대조군으로 DPI (5uM)를 30분 그리고 NAC (2mM)을 3시간 동안 전 처리 하고 1mM PQ를 처리하였다. 결과는 대조군으로 표준화하여 control rate (%)로 나타내었다. 세 번의 실험을 수행하였고, 통계적 유의성은 #, *Significantly different p<0.005(#: 아무것도 처리하지 않은 대조군 (CC), *: 단지 PQ만 처리한 대조군(C))로 표시하였다.
도 24는 PQ에 의해 유도되는 세포질 또는 미토콘드리아 초과산화물 음이온 생성에 대한 DDS의 효과를 나타내는 결과로서, 인간 섬유아세포는 96 well plate에 24시간 동안 키우고, DDS, DPI (5uM, 30분), 그리고 NAC (2mM)을 3시간 동안 전 처리하였다. 세포는 PQ 1mM을 30분 동안 처리하였고, oxidant-sensitive fluorescent dyes (A) DHE (5 uM, cytosol specific) and (B) MitoSOX (5 uM, mitochondria specific)를 넣어 각각 15분 동안 37℃에 배양하였다. 형광의 변화는 multiwell plate reader를 이용하여 DHE는 excitation과 emission 파장을 515와 590nm에서, MitoSOX는 520와 580nm에서 측정하였다. 결과는 control rate (%)로 6번의 실험 결과를 표시하였다. 통계적 유의성 *, # p<0.005; ** p<0.05로 나타내었다.
도 25는 시험관에서(in vitro에서), DDS의 DPPH-라디칼 소거 활성 측정한 결과이며, 그리고 PQ를 처리한 HDF에서 생성된 초과산화물 음이온을 제거하는 효소인 SOD1과 SOD2의 단백질양의 변화에 대한 DDS의 영향을 나타낸 것으로, (A) Cell-free system (in vitro에서 라디칼 소거 활성을 갖는 DDS의 효과를 DPPH(200uM) 라디칼의 억제시키는 비를 그래프로 나타낸 것이다. 수용성 비타민 E로 잘 알려진 트로록스를 양성 대조군으로 사용하였다. (B) Western blot 분석법을 이용해 DDS 3시간 전 처리와 PQ 1mM을 12시간 또는 24시간을 처리한 인간 섬유아세포에서 (Cu/Zn-) SOD1와 (Mn-) SOD2의 발현을 측정하였다.
도 26은 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 증가한 NOX4 mRNA에 대한 DDS의 효과를 나타낸 것으로, (A) 인간 섬유아세포에 DDS, DPI (5 uM), 그리고 NAC (2 mM) 전 처리하고 PQ (1 mM)를 5분 동안 처리하였다. PQ에 의해 증가되는 세포질 초과산화물 음이온 생성 원천인 NOX4 (HDF specific) mRNA의 양을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다. (B) 대조군 (아무것도 처리하지 않은 인간 섬유아세포)과 비교하여 % 비로 정량화하였다.
도 27는 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 칼슘 의존적인 PKC의 활성에 대한 DDS의 효과를 나타낸 것으로, 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 칼슘 양의 변화에 대한 DDS의 영향을 보여준다. 96 well pate에 HDF세포를 키우고, 세포 내 칼슘을 측정하는 Fluo-4AM을 이용하여 측정하였다. 여러 농도의 DDS(27A)와 5uM의 DPI를 전 처리하고 1mM PQ를 처리하였다(27B).
도 28은 PQ에 의해 유도되는 PKC 인산화를 웨스턴 블랏 방법으로 측정하여 나타낸 것으로, 인간 섬유아세포에 DDS를 전 처리하고 PQ 1mM을 1분 또는 5분 처리하고 세포를 모아서 PKC의 인산화를 분석하였다(통계적 유의성은 #p<0.05 CC와 비교 * p<0.05 C와 비교).
도 29는 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 미토콘드리아 변화에 대한 DDS의 효과를 나타낸 것이다. 강력하고 장시간의 1mM PQ의 처리에 의해 유도되는 미토콘드리아 독성에 대한 DDS의 효과를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 낮아진 미토콘드리아 구성 복합체의 단백질 양과 낮아진 미토콘드리아의 막 전위 등 PQ에 의해 유도되는 여러 가지 변화를 관찰하였다. (A) 인간 섬유아세포에 DDS, DPI, 그리고 NAC을 전 처리하고 PQ 1mM을 24시간 동안 처리하였다. 미토콘드리아의 구성 복합체의 단백질 양은 Complex I (20 kDa ND6 subunit), Complex II (30 kDa FeS, non-heme iron protein, SDHB), Complex III (47kDa core protein 2), Complex IV (18 kDa subunit IV, 그리고 Complex V (55 kDa subunit a ATP synthase) 등을 이용해(위 실험방법에 서술) Western blot 방법으로 측정하였다. (B) 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 미토콘드리아 막전위에 대한 DDS의 효과를 나타낸 것이다. 미토콘드리아의 막 전위는(ΔΨm) DiOC6를 이용하였다. 인간 섬유아세포에 DDS, DPI, 그리고 NAC을 전 처리하고, PQ 1mM을 24시간 동안 처리 한 후에, 40nM DiOC6를 15분 동안 처리하였다. 결과는 Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA) 기기를 이용하였고, excitation 파장은 480nm에서 emission 파장은 520nm에서 측정하였다.
도 30은 미토콘드리아의 구조적인 변화를 분석하기 위해서 Mitotracker Red를 이용하여 염색하여 confocal microscopy로 가시화 한 결과이다. 인간 섬유아세포에 위 실험 방법에서와 같이 1mM PQ (24시간)와 DDS (또는 DPI)를 처리하고 글래스 커버슬립을 덮었다. 첫 번째 그림은, 아무것도 처리하지 않은 대조군 인간 섬유아세포, 두 번째는, PQ만 처리한 인간 섬유아세포, 세 번째는 DDS를 전 처리하고 PQ를 처리한 인간 섬유아세포, 그리고 마지막 그림은, DPI와 PQ를 같이 처리한 인간 섬유아세포의 미토콘드리아의 염색을 그림(confocal 방법 이용)을 표시한 것이고, (A, B, C, and D: × 4000) 값은 means ±SEM (n=3)임. # p< 0.005 relative CC; * p< 0.005 relative C.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 요지가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
I. 개체의 수명에 미치는 뎁손의 효과
실시예 1. 실험 재료
개체의 수명에 미치는 뎁손의 효과를 알아보기 위해 모델동물로 예쁜꼬마선충(C.elegans)을 사용하였다. 실험에 사용한 예쁜꼬마선충의 계통은 야생형 N2 (wild-type N2 Bristol) 및 돌연변이종 daf-16(cf1038), clk-1(e2519), isp-1(qm150) 및 adls2122 [GFP::lgg-1, rol-6(su10060)]이다.
실시예 2. 뎁손의 수명연장효과
뎁손의 수명연장효과를 알아보기 위하여 다음과 같은 순서로 실험을 실시하였다. 이 때, 뎁손이 비수용성이기 때문에 배양액에 뎁손을 섞어서 대장균(E.coli)을 배양한 다음 이 대장균을 예쁜꼬마선충의 먹이로 사용하였다. 또한 10 μM PABA(para-aminobenzoic acid)를 배양액에 섞어서 대장균의 성장을 증가시킴으로써 예쁜꼬마선충의 열량제한을 방지하였다. 뎁손의 투여는 발생이 거의 끝난 L4 단계 이후부터 투여하였으며, 최적의 성장환경을 제공하기 위하여 20℃의 조건하에서 다음과 같이 실험을 실시하였다.
1) L4 시기의 어미 예쁜꼬마선충에 뎁손과 PABA가 포함된 배지에 옮겨주었고, 4일 후 성체의 1세대 자손을 새 배지에 옮겨주고 4~5시간 동안 알을 낳게 하였다. 알에서 깨어난 2세대 자손을 10마리씩 세 배지에 알을 낳지 않을 때까지 계속 옮겨주며 수명을 측정하였다.
(2) 10마리의 L4 시기의 어미 예쁜꼬마선충을 뎁손과 PABA가 포함된 배지에 옮겨주고 알을 낳지 않을 때까지 새 배지에 옮겨주며 수명을 측정하였다.
나이가 들어 죽은 것이 아닌 예쁜꼬마선충들은 통계에서 제외하였고, 예쁜꼬마선충을 건드렸을 때, 움직임이 없는 것은 죽은 것으로 간주하였다. 통계상의 평균 수명의 유의적 차이는 log-rank test를 사용하였다[47].
실시예 3. 소모성 색소의 자가발광 측정
예쁜꼬마선충의 자가발광을 525nm 대역역파기를 통해 800msec 동안 노출하여 사진을 찍었다. 각각의 사진은 아도브 포토샵 CS2를 이용하여 사진 크기만 조절하였다.
소장에서의 자가발광의 양은 Image J 1.35를 이용하여 일정한 영역에서의 픽셀의 밝기를 측정하였다. 매일 30마리 이상의 예쁜꼬마선충를 측정하여 평균과 표준오차를 구했다.
실시예 4. HPLC를 이용한 DDS 분석
Kwadijk et al. [48]의 방법을 이용하여 DDS를 분석하였다. DDS를 먹은 예쁜꼬마선충에서 샘플을 준비하기 위하여 1 mL의 아세톤과 글루타티온 혼합액 (5 mg/mL, water:methanol 1:10)에 0.26g의 예쁜꼬마선충을 넣고 완전히 섞어주었다. 2700g 에서 2분간 원심분리 한 후, 이 용액은 스피드백으로 증발시켰고, 잔여물은 80 μL의 HPLC eluent와 acetone (18:5, v/v) 혼합액으로 녹였다. 20uL씩 나누어 보관한 샘플과 농도를 알고 있는 비교용 표준물질 10uM DDS을 HPLC 컬럼에 주사하였다. 이 HPLC 시스템은 JASCO HPLC pump PU-980와 JASCO UV-975 detector로 구성되어 있다. 샘플의 분리를 위해 C18 150 X 4.6 mm (5 μm) 컬럼을 이용하였으며, 통과하는 속도는 1.0 mL/min로 하였다. DDS는 water: acetonitrile:glacial acetic acid:triethylamine (80:20:1.0:0.05, by volume)로 구성된 용해액을 이용하였고, 양 검사는 295 nm (285 nm emi/340 nm exi)에서 수행하였다.
실시예 5. 미토콘드리아의 분리, 준비
예쁜꼬마선충은 dense sucrose (원심분리)를 이용하여 분리하여 모았고, S 완충용액을 이용하여 오염을 씻어내었다. 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아를 분리하기 위해 glass bead와 Precellys24 균질기 (Medinova)를 이용하여, 0.2% BSA가 함유된 MSM 완충용액 (220 mM mannitol, 10 mM sucrose, 5 mM MOPS, pH 7.4, with KOH)으로 5000rpm, 20초간 2회 균질화하였다. 이 균질화한 예쁜꼬마선충은 MSM 완충용액를 이용한 원심분리 (380g , 5 min)를 통해 잔해와 균질화되지 않은 예쁜꼬마선충을 제거하였다. 4500g, 5 분으로 원심분리한 균질물의 침전물, 즉 미토콘드리아를 준비했다. 나머지는 세포질 부분으로 준비했다. 분류된 미토콘드리아와 세포질 부분을 얼림과 녹임을 반복 후, 미토콘드리아 복합체 V의 양을 측정하기 전에 0.8% CHAPS를 처리하였다[49]. 단백질 정량은 BCA 단백질 검정 키트(Pierce)를 이용하였다.
실시예 6. 웨스턴 블랏 분석
PABA만 먹이거나, PABA와 뎁손을 함께 먹여 키운 예쁜꼬마선충의 용해물을 준비하였다. 미토콘드리아와 세포질을 시료 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 0.14 M 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, and 0.001% 브로모페놀 블루)와 섞어 끓인다. 그리고 전기영동장치(electrophoresis)를 이용하여 분리하였다. 니트로셀룰로즈로 옮긴 후, 웨스턴 블랏 방법과 MS601 (subunit α of F1 of ATP synthase, Oxphos Complexes detection kit, Mitoscience, 1:1,000) 그리고 α-Tubulin (Sigma; 1:2,000) 항체를 이용하여 분석하였다. 호레디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트화 이차 항체와 ECL(Pierce)를 이용하여 결과를 검출하였다.
실시예 7. ATP 양 측정
ATP의 양은 이전에 설명된 방법을 약간 변형하여 측정하였다[38]. 총 ATP의 양을 분석하기 위해, PABA 만을, 또는 PABA와 뎁손을 함께 먹여 예쁜꼬마선충을 키워, S Basal 완충용액 (0.1 M NaCl/0.05 M 포타슘 포스페이트 완충액, pH 6.0)를 이용하여 기타 오염물질을 제거하여 측정 샘플을 준비하였다. 샘플은 최종적으로 100ul로 맞추고, -80℃로 얼렸다. 얼린 예쁜꼬마선충은 즉시 15분간 끓여 ATP를 분출시켜 차갑게 유지하고 원심분리(15,000g, 5 분 동안)로 예쁜꼬마선충의 잔해를 제거하였다. ATP의 양은 bioluminescence assay kit CLS II (Roche Molecular Biochemicals)의 시약과 luminometer (PerkinElmer사)기기를 이용하여 측정하였다. APT의 양은 단백질의 양으로 표준화하였다.
실시예 8. 산화적 스트레스와 관련된 유전자의 RT-PCR
전체 RNA는 MRC사의 TRI reagent를 이용하여 분리하였고, 첫 번째 cDNA 가닥은 oligo-dT와 슈퍼스크립트 II 리버스 트랜스크립타아제 (Invitrogen사)를 이용해 합성하였다. 유전자 증폭(PCR)은 PCR Master Mix (Genenmed)를 이용하였고, 사용한 primer의 염기서열은, ceDuox1 ; 5'- CTTCACACCGTTGGACATTG-3'(정방향 프라이머) 및 5'- GAAGATGTGTGAGCCGGAAT-3'(역방향 프라이머), Actin ; 5'-TCGTAGGACTTCTCGAGGGA-3'(정방향 프라이머) 및 5'-ATGTTGCCGCTCTCGTAGTT-3'(역방향 프라이머)를 사용하였다.
또한, 자식작용(autophagy)에 관련된 유전자에 대하여 다음에 나열한 프라이머를 이용하였다. eat2: 정방향 프라이머 (5'- GCAAATTCCCCATGGTACAC -3') 및 역방향 프라이머 (5'- CATGGAAAGTGAGCACGAGA -3'); eat3: 정방향 프라이머 (5'- AGGCTGCATCAGAACGTCTT -3') 및 역방향 프라이머 (5'- TGTTTGTGCTCTGGATCTGC -3' );bec1: 정방향 프라이머 (5'- CAAAGAAGGCCAGATTCAGC -3') 및 역방향 프라이머 (5'- CGTTGTCGGATGGTTTTCTT -3'); let-512 /VPS34: 정방향 프라이머 (5'- TATGCGAGTCTCCACGTCAG -3') 및 역방향 프라이머 (5'- CCAATCGATCCTTTGCTTGT -3'): T22H9.2 (atg9): 정방향 프라이머 (5'- CACTTCAACGAGCTTGACCA -3') 및 역방향 프라이머 (5'- GTGATGACGTGTTCCACCTG -3') ; atgr-18 (atg-18): 정방향 프라이머 (5'- CAGGAAGCACTGACACTGGA -3') 및 역방향 프라이머 (5'- AAAGAGCCGATGTCCATTTG -3' ); lgg-3 (atg-12): 정방향 프라이머 (5'- TGAAATTGCGAAAACTGCTG -3') 및 역방향 프라이머 (5'- GTAGGCCGGTGTAATGCTGT -3'); atgr-5 (atg-5): 정방향 프라이머 (5'- CGAATTTGCACACATTCCAC -3') 및 역방향 프라이머 (5'- TCCGTTGAGGATGATGATGA -3');
lamp1: 정방향 프라이머 (5'- CAACGCTTACAAGTGCTCCA -3') 및 역방향 프라이머 (5'- ACGACGATTGGGACAACTTC -3'); lamp2: 정방향 프라이머 (5'- GGCCAAAAGAAACTTGTCCA -3') 및 역방향 프라이머 (5'- TTTCGTCATTGGAAGCTGTG -3').
실시예 9. Amplex Red assay 방법을 이용한 과산화수소의 측정
뎁손의 ROS 소거에 대한 효과를 측정하기 위해 이전에 설명한 Amplex Red hydrogen peroxide/peroxygenase 검정 키트 (Molecular Probes, Eugene, OR)[39]를 이용하여 측정하였다. 간단히 요약하자면, PABA만을, 또는 PABA와 뎁손을 함께 먹여 키운 예쁜꼬마선충 150마리에 파라쿼트(paraquat) 250mM을 1시간 동안 처리하였다. 96-well plate에 50ul이 양으로 100마리 예쁜꼬마선충을 맞추고 Amplex Red (200uM)를 50ul씩 각 well에 첨가하였다. 22℃에서 90분 동안 방치한 후, 과산화수소의 양을 plate reader (Tecan, infinite 200), 흡광도 540nm를 이용하여 측정하였다.
실시예 10. 뎁손에 의한 산화적 스트레스 저항성 검사
뎁손에 의한 산화적 스트레스 저항성 검사는 2세대 동안 뎁손을 투여한 5일된 예쁜꼬마선충을 사용하였고, M9 용액에 250mM 파라쿼트를 녹여 예쁜꼬마선충을 20마리씩 담가주었다. 매시간 별로 살아있는 예쁜꼬마선충의 수를 측정하였다.
실시예 11. 산소소모율 측정
산소소모율은 Clark-type oxygen electrode (782 Oxygen Meter, Strathkelvin Instruments, Glasgow, UK)를 이용하여 (50, 51)의 논문의 방법을 이용하였다. 예쁜꼬마선충은 PABA만 또는 PABA와 DDS를 함께 첨가한 NGM 한천 배지에서 자라 OP50을 각각 먹여 키웠고, S-basal buffer를 4번 이용하여 오염을 씻어내었다. 약 1500 마리의 예쁜꼬마선충에 200 μL의 S-basal buffer를 Clark-type oxygen electrode로 장착된 Mitocell chamber에 넣고 몇 분간 산소 소모율을 측정하였다. 샘플은 조심이 chamber에서 회수하여, Precellys24 균질기를 이용하여 5000 rpm에서 두 번 20초간 유리 비드(glass bead)를 넣고 균질화 하였다. 15000g에서 20분간 원심분리하여 BCA 단백질 정량 kit를 이용하여 상층액 단백질의 정량에 사용하였다. 산소 소모율은 전체 단백질로 보정하였다.
실시예 12. DDS 결합 모델링
Streptococcus pneumoniae (PDB ID; 2VEG), Cat & rabbit pyruvate kinase (PDB ID; 1PKM, 1A5U respectively)와 DHPS 구조를 가지고 DALI search [52]를 수행하여 Z score 15.1 and 15.0을 얻었다. 두 구조물에서 519 잔기 사이에 RMSD value 3.1을 지녔다. DDS는 DHPS의 구조적으로 PABA 결합 지역인 aminophenyl group 위치에 우선적으로 모델링이 되었다. cat pyruvate kinase의 구조가 DHPS와 일치한다. PK와 DDS의 가능한 결합 지역 사이의 입체적 방해를 제어하기 위해 프로그램 COOT에 의해 DDS의 최종 모델이 수동으로 변형되었다[53]. PK의 residues가 잠재적으로 DDS와 결합함을 cat pyruvate kinase 구조와 DDS의 모델을 이용하여 선택하였고, 6개 다른 종의 PK의 서열이 보존되어 있다.
실시예 13. 피루베이트(Pyruvate) 함량 측정
피루베이트 함량 측정은 상업적으로 판매하는 fluorescence-based assay kit (BioVision)를 이용하였으며, 구매한 kit의 사용설명을 이용하여 측정하였다. 피루베이트 함량 측정은 전체 단백질로 보정하였으며 nmol/mg of protein로 표기하였다. 측정은 3번 수행하였다.
실시예 14. 피루베이트 키나아제(Pyruvate kinase) 활성도 측정
샘플 준비는 100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.6 at 37℃에 예쁜꼬마선충예쁜꼬마선충 유리 비드를 넣고 Precellys24 균질기를 이용하여 5000 rpm에서 두 번 20초간 glass bead를 넣고 균질화하여 얻었다. 균질화한 샘플에 최종 농도가 1%가 되도록 chaps를 첨가하고 15000g에서 20분간 원심 분리하였다. 피루베이트 키나아제 활성도 측정은 이전의 논문[54]을 참고하여 수행하였다. 측정은 37℃에서 수행하였으며, 100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.6 at 37 ℃, 100 mM MgSO4, 1.3 mM β-NADH, 5000 units/mL of lactate dehydrogenase (LDH), 2 mM adenosine diphosphate (ADP), 17 mM phosphoenolpyruvate (PEP)를 섞은 반응 혼합물 300 μL를 넣어 측정하였다. 340nm의 흡광도에서 NADH의 산화 정도의 변화를 측정하였다. PK 1 unit은 분당 pH 7.6, 37 ℃에서 PEP 1.0 μmole이 피루베이트로의 변화로 정의하였다. 단백질 정량은 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce)를 이용하여 측정했으며, 피루베이트 키나아제 활성(pyruvate kinase activity)은 units/mg of protein로 표기하였다. in vitro(시험관) 실험에서, 우리는 토끼 근육(rabbit muscle)의 Type I 피루베이트 키나아제(Sigma)를 사용하였다. DDS가 LDH의 활성 억제하는지 알아보고, 이를 배제하기 위해 대조군은 PK를 첨가하지 않았고 PEP 대신 피루베이트를 첨가하였다.
II. 세포수준에서의 노화조절 실험
실시예 15. 실험물질
뎁손(dapsone, 4,4'-diaminodiphenylsulfone, 이하 DDS)은 태극 화학사로부터 구입하고, 파라쿼트, 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라잘 (DPPH), 트로록스, iodonium (DPI) 및 N-아세틸-L-시스테인(NAC)은 시그마에서 구매하여 사용하였다. Cell Counting Kit (CCK-8)는 Dojindo Laboratory사 (Japan)로부터 구매하여 사용하였다. Reagent는 MRC (Cincinnati, USA로부터 구매하였다. 디하이드로에티이움 (DHE), Red, Fluo-4 AM, MitoTracker Red CMXRos, 및 3, 3-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6)의 형광물질들은 Molecular Probes (Eugene, OR)로부터 구매하여 사용하였다.
실시예 16. 세포의 생존성 평가
세포의 생존성 평가는 Dojindo Laboratory사(Japan)의 Counting Kit (CCK-8)를 이용하여 수행하였다. 인간 섬유아세포는 어떠한 처리도 하기 전에 96-well plate에 24시간 동안 키웠다. 인간 섬유아세포는 DDS를 3시간 전처리 하였고, 그 후 1mM의 PQ를 48시간 동안 처리하고 10ul의 CCK-8을 각각에 직접 추가하였으며 5%의 CO2 조건의 37℃에서 3시간 배양하였다. 흡광도는 450nm에서 측정하였다. 결과는 각각의 실험에 있어서의 대조군과 비교하였고 통계 분석을 하였다.
실시예 17. DDS의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정
라디칼 소거 활성은 메탄올에 포함된 DPPH의 환원력을 측정하였다. 라디칼 소거에 대한 DDS의 효과는 이전에 연구된 방법[12]을 토대로 수행하였으며, 양성 대조군로 트로록스를 사용하였다. 실험 방법을 간단히 설명하면, 0.5ml의 메탄올에 녹아있는 여러 농도(0.1-100uM)의 DDS와 트로록스를 200uM의 DPPH가 포함된 2.5ml의 메탄올을 시험관에 섞었다. DPPH는 안정된 프리 라디칼로 진한 보랏빛을 가지며 517nm에서 흡광도를 가진다. 그러나 항산화제와 반응을 하면, 연한 노란색이 된다. 이 반응 혼합물은 실온에서 빛을 차광하여 30분 동안 유지하고, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 프리라디칼 소거 활성은: % 억제 = [(대조군의 흡광도-샘플의 흡광도)/대조군 흡광도] x 100%를 이용하여 억제율을 계산하였다.
실시예 18. RT-PCR 을 이용한 NADPH 산화효소 4(NOX4) mRNA level 측정
인간 섬유아세포의 RNA는 Trizol reagent (MRC Cincinnati, US)를 이용하여 분리하였고, RT-PCR은 Biometra T Gradient PCR (Biometra, Goettingen, Germany)기기를 이용하여 NOX4와 GAPDH를 측정하였다. 특이적인 NOX 프라이머: 5'-GGTCCTTTTGGAAGTCCATTTGAGG-3' (정방향 프라이머)와 5'-CACAGCTGATTGATTCCGCTGAG-3' (역방향 프라이머) ; GAPDH를 위한 프라이머 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (정방향 프라이머) 및 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (역방향 프라이머)를 이용하였다. PCR 증폭된 DNA는 1.2%의 아가로즈 젤로 분리하였고, EtBr로 염색이 되어 시각화했으며, UV로 보여지는 사진을 촬영하였다.
실시예 19. 세포 내(세포질) 초과산화물 음이온 측정
인간 섬유아세포는 96-well plate를 이용하여 배양하였다. 인간 섬유아세포에 3시간 동안 DDS, DPI(30min) 및 NAC를 전처리 하고, 1mM의 PQ를 30분 동안 처리한 다음, 형광물질인 디하이드로에티디움 (DHE) 5?M을 빛을 차광하고 37 ℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포는 DPBS로 두 번 씻어내고, 형광을 띤 에티디움-DNA는 즉시 Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA) 기기를 이용하여 excitation 파장 515nm와 emission 파장 590nm에서 측정하였다.
실시예 20. 미토콘드리아 초과산화물 음이온 측정
미토콘드리아 초과산화물 음이온의 측정은 MitoSOX Red라는 형광 물질을 이용하여 측정하였다. 환원되어 있는 형광물질은 호흡하는 세포 내로 들어가기 전까지 형광을 띠지 않으며 세포 내로 들어가서 산화된 이 형광 탐침은 선택적으로 미토콘드리아를 염색한다[13]. 인간 섬유아세포에 3시간 동안 DDS, DPI(30min), 그리고 NAC를 전처리 하고, 1mM의 PQ를 30분 동안 처리한 다음, 형광물질인 MitoSOX Red 5?M을 빛을 차광하고 37 ℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포는 DPBS로 두 번 씻어내고, 형광은 즉시 CEFS(Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA)) 기기를 이용하여 excitation 파장 515nm와 emission 파장 590nm에서 측정하였다.
실시예 21. 웨스턴 블랏 분석법을 통한 활성화된 PKC와 미토콘드리아 복합체의 양 측정
DDS와 PQ가 처리된 인간 섬유아세포의 용해물을 시료 완충용액 (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 0.14 M 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 및 0.001% 브로모페놀블루)를 이용하여 끓여서 준비하였고, 전기이동법에 의해 분리하였다. 분리된 샘플은 nitrocellulose 에 이동시켜 웨스턴 블랏(Western blots)을 통해 MS601 (Total OXPHOS Complexes Detection Kit, MitoSciences, containing antibodies against SDH30 subunit of complex II (5 μg/ml), Core2 subunit of complex III (0.2 μg/ml), COXII subunit of complex IV (2 μg/ml), 및 subunit α of F1-ATPase of complex V (0.2 μg/ml)), PCKpan-p, PCKα/β-p, PKCδ-p (Phospho-PKC antibody Sampler Kit, Cell Signaling Technology), PKCα, PCKβ, PKCδ (Life Technologies), 그리고 β-Actin (Sigma) 등의 항체를 이용하여 실험하였다. 측정은 horseradish peroxygenase-conjugated secondary antibodies (Zymed)와 ECL (Pierce)을 이용하여 수행하였다. 결과는 오토라디오그래픽 필름 (Image Reader, LAS-3000Fujifilm, Japan)을 이용하여 가시화하여 보여주었다.
실시예 22. 세포 내의 칼슘의 양 측정
세포 내의 칼슘의 양은 세포를 잘 통과하는 칼슘 표지 형광물질인 Fluo-4 (5uM)를 이용하였다. 37℃에 30분 동안 배양하고, 완전히 세포 내 AM ester의 de-esterification을 위해 상온에서 빛을 차광하고 30분 동안 방치하였다. 20mM HEPES (pH7.4)가 첨가된 HBSS로 세포 외의 남아있는 형광물질은 제거하고, 100ul의 HBSS를 각 세포의 well에 첨가하였다. 형광신호는 multi-well fluorescence plate Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA)를 이용하여 excitation 파장은 494nm, emission 파장은 516nm에서 측정하였다 [14]. 결과는 relative fluorescenceunits (RFUs)로 표시하였다.
실시예 23. DiOC6 assay 방법을 이용하여 미토콘드리아의 막 전위를 측정
미토콘드리아의 막 전위(ΔΨm) 변화는 미토콘드리아 특이적인 형광 cationic dye, DiOC6 를 이용 하였고, 변화의 양상은 fluorescence spectrophotometer를 이용하였다 [15, 16]. 40nM DiOC6를 배양액에 넣어 15분간 배양하고, 남아있는 형광 물질의 제거를 위해 PBS를 처리하였다. 분석은 Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Varian, California, USA) 기기를 이용하였고, excitation 파장 480nm과 emission 파장 520nm에서 측정하였다.
실시예 24. MitoTracker Red를 이용한 미토콘드리아의 구조 염색(Immunofluorescence)
인간 섬유아세포는 24-웰 플레이트에 키웠다. 위의 실험 물질을 전처리하였으며, PQ를 24시간 동안 처리한 후에, 미토콘드리아 염색 물질인 MitoTracker Red CMXRos (50nM)을 30분 동안 37℃에서 처리하였다. 이 dye는 세포 내 미토콘드리아의 트랜스막전위로 미토콘드리아를 표지하여 기능의 지표로 사용된다. 배양 후에, PBS로 씻어내고 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 밤샘동안 세포를 고정시켰다. 다음날, 상온에서 1시간 동안 blocking solution (2% bovine serum albumin in PBS)을 처리했고, 또한 10분 동안 상온에서 DAPI 염색을 하였다. 씻어낸 다음, 커버슬립으로 덮어씌우고, 세포를 형광현미경으로 가시화하였다.
실시예 25. 통계분석
실험 결과의 비교는 one-way ANOVA를 이용하여 그룹간의 차이를 통계적 유의성을 평가하였다. 유의 확률이 P<0.05와 P<0.005일 때 통계적으로 유의성을 가짐을 인정하였다.
<실시예 결과>
1. 개체의 수명에 미치는 뎁손의 효과
표 1
Figure PCTKR2009004148-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2009004148-appb-T000002
노화의 과정과 수명의 연구를 위하여 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 사용하였다. 뎁손을 처리한 대장균을 먹이하에 키운 예쁜꼬마선충의 수명을 분석하여 도 1, 2, 3 및 표 1, 2에 그 결과를 나타내었다. 도 1, 2, 3 및 표 1, 2의 결과에서도 알 수 있듯이, 뎁손을 투여한 예쁜꼬마선충의 수명이 유의적으로 증가함을 발견하였다. 이 때, 뎁손(DDS)이 물에 잘 녹지 않기 때문에 예쁜꼬마선충의 먹이로 사용하는 Escherichia coli OP50의 배양배지인 nutrient growth medium (NGM) agar plates에 뎁손을 처리하여, 예쁜꼬마선충이 자라는 동안 섭취하도록 하였다. 게다가 DDS는 para-aminobenzoic acid (PABA)를 경쟁적으로 억제해서 엽산의 합성을 억제하기 때문에 PABA (10uM, 대조군의 성장율의 80% 유지, 도 1)를 처리하여 DDS의 항생제 효과를 줄여 배양하였다. PABA의 처리는 박테리아의 성장에 도움이 되어, 선충의 기아상태에 의한 식이제한 효과를 억제하였다. DDS를 2mM을 처리하면 예쁜꼬마선충의 무게당(kg) 약 5mg의 DDS가 축적됨을 알 수 있었다(도 2). 이는 한센인 환자에게 투여되는 양과 유사하다[42]. PABA와 DDS를 함께 처리한 예쁜꼬마선충의 수명은 PABA만 처리한 대조군에 비해 유의적으로 길게 나타났다(도 3, 표 1). 전체 일생과 사람의 청년기인 L4단계 후부터 DDS를 먹은 예쁜꼬마선충 모두에서 평균수명과 최대수명이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 3A, B). 게다가 성인기 이후 23일의 상태를 본 결과, 놀랍게도 DDS를 처리한 예쁜꼬마선충이 훨씬 더 활동적인 이동성을 보였다(도 4). 이러한 결과가 노화의 시작을 늦추는지 또는 단지 노화 단계(정도)를 연장하는지 알아보고자 lipofuscin의 축적(55) 정도를 측정하였다. 전체 일생과 청년기 후부터 DDS를 먹은 예쁜꼬마선충에서 수일 동안의 lipofuscin 생성이 늦춰졌고(도 5), 이는 DDS가 노화의 시작을 대조군 보다 늦추고 있음을 예상할 수 있다.
2. 뎁손의 수명연장 기작
한편, 예쁜꼬마선충의 수명을 연장시킴에 있어서 여러 가지 주요 인자들; 감소한 인슐린 시그널, 식이 제한, 미토콘드리아 기능의 감소 등의 요인이 중복되지 않게 영향을 미친다고 보고 되고 있다(56). 뎁손(DDS)의 가능한 메커니즘들 중에서, 첫 번째로 인슐린 시그널이 관여하는지 알아보고자 하였고, 도 6과 표 1에서 보여주듯이 인슐린 시그널의 중요 조절자인 daf-16 mutant(43)를 이용하여 실험한 결과 수명이 짧은 daf-16 mutant 예쁜꼬마선충의 수명을 DDS가 증가시킴을 보임으로써 수명 연장에 있어서 DDS가 인슐린 시그널에 비의존적임을 알 수 있다. 앞에서 언급했듯이, 우리는 DDS에 의한 식이제한 효과의 결과를 피하기 위해 PABA를 함께 처리하여 DDS에 의한 박테리아 성장억제를 배제하였다(도 1). 그래서 식이제한이 DDS 처리한 예쁜꼬마선충의 수명 연장의 원인이 아님을 밝혔다. 이 연구 결과와 함께, DDS의 직접적인 목표 물질인 folP가 결손 된 박테리아(57)로 키운 예쁜꼬마선충의 성장에서도 DDS를 처리하면 대조군 예쁜꼬마선충보다 더 오래 사는 것을 알 수 있다(도 7, 표 2). DDS에 의한 예쁜꼬마선충의 수명 연장에 daf-16과 식이제한에 비의존적이기 때문에, 우리는 다음으로 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아에 대한 DDS의 효과를 알아 보았다. DDS의 처리가 미토콘드리아의 기능과 ATP의 생성율에 효과가 있는지 알아보기 위해, 우리는 예쁜꼬마선충에서 미토콘드리아를 분리하여 mitochondrial complex V 단백질의 양을 알아보기 위해 웨스턴블럿을 수행하였다(도 8). DDS를 처리한 예쁜꼬마선충에서 정량적인 분석 결과 complex V의 양이 현저히 감소함을 알았다. 또한 ATP의 양도 DDS를 처리한 예쁜꼬마선충에서 낮게 관찰되었다(도 9). DDS를 처리한 예쁜꼬마선충에서 유의적으로 산소소모율이 감소하였다(도 10). 이상의 결과를 종합하면 DDS는 ROS의 생성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다. DDS가 ROS 생성을 억제하는지 알아보기 위해, 우리는 세포 내 활성산소를 생성하는 물질인 PQ와 함께 DDS를 처리하지 않거나 동시에 처리한 예쁜꼬마선충에서 H2O2의 생성을 측정하였다. 우리는 DDS의 처리가 유의적으로 PQ에 의한 ROS의 생성을 억제함을 발견했다(도 11). 따라서 PQ(250mM)가 포함된 NGM 액체배지에서 예쁜꼬마선충의 생존에 있어서 DDS를 처리한 예쁜꼬마선충이 대조군 예쁜꼬마선충보다 유의적으로 증가함을 알 수 있고(도 12), 이러한 결과는 DDS가 산화스트레스에 대한 예쁜꼬마선충의 저항성이 증가함을 예측할 수 있다. 흥미롭게 ROS의 또 다른 소스인 C. elegans NOX, ceDuox의 mRNA양도 DDS에 의해 감소됨을 알 수 있고(도 13), 이 결과로 DDS가 미토콘드리아 뿐만 아니라 세포질에서도 효과가 있음을 예측할 수 있다. 이러한 점에서, 이러한 모든 반응에 DDS가 어떻게 영향을 주는지 상상하기에 매우 어렵다.
DDS의 항생제로써 작용 메커니즘은 잘 알려져 있다. DDS가 박테리아의 folic acid의 합성에 필요한 DHPS 효소의 활성 장소와 PABA와 경쟁적으로 결합하여 박테리아의 성장을 억제한다고 잘 알려져 있다. 그러나 진핵세포에는 DHPS가 없으므로 DDS의 이러한 기능 메커니즘을 진핵생물에서 찾을 수 없다. 그런데 세포실험과 예쁜꼬마선충의 결과에서 보듯이 DDS에 의해 산화스트레스나 항산화 효과가 있음을 설명하기 위해서 우리는 진핵생물에서 DDS의 목표 단백질을 확인하고자 한다. DDS가 DHPS와 결합의 구조는 잘 알려져 있으며(58), 우리는 DHPS의 결합 pocket과 비슷한 구조를 갖는 후보 단백질을 찾기 위해 단백질 구조 분석을 하였다. 우리는 cytochrome P450이 DDS와 제일 잘 맞는 구조를 가진 단백질 임을 발견하였다. 이 cytochrome P450은 생체이물 화합물과 결합하고 분해하는 물질로 잘 알려져 있고, 예쁜꼬마선충에서도 P450에 의해 DDS가 인식되고 분해된다. 두 번째로 피루베이트 키나아제가 후보 물질이다 (도 14, 15). 사실 PK 결함이 있는 환자에게서 용혈성 빈혈 (hemolytic anemia)를 보이며, 이러한 사실은 한센병 환자에서 DDS의 주요 부작용이다(60, 61). 그리고 피루베이트 함량의 증가가 수명 연장에 관련이 보고되고 있다(62). DDS가 수명 연장에 있어서 PK가 실질적인 목표인지를 알아보고자 하였고, in vitro와 in vivo에서 PK의 생화학적 활성을 억제함을 알 수 있다(도 16). 또한 기대하지 않은 결과로, DDS를 먹은 예쁜꼬마선충에서 피루베이트(pyruvate)의 함량이 대조군에 비해 높게 나타났다(도 17A). 그러나 이러한 결과와 일치되는, DDS를 복용한 한센병 환자에서 DDS를 복용하지 않은 대조군에 비해 피루베이트 함량이 높다는 보고가 있다(63). 이때, 예쁜꼬마선충의 PK(피루베이트 키나아제) 유전자에 집중하였다. 예쁜꼬마선충의 게놈은 PK의 두 가지 유전자 즉, 각각 F25H5.3 및 ZK593.1에 해당하는 pyk-1 및 pyk-2 유전자를 가지는데, pyk-1에 결손이 있는 pyk-1 (ok1754)돌연변이를 가지는 예쁜꼬마선충은 피루베이트 함량이 높았다(도 17B). 본 발명자들은 DDS를 처리하지 않은 pyk-1 (ok1754) 예쁜꼬마선충의 수명이 N2 대조군 벌레보다 연장되었으나, DDS를 처리한 N2의 경우 보다는 짧았다(도 18, 표 1). 이러한 결과는 수명연장에서 pyk-1 보다는 추가적인 DDS 처리에 의한 표적화가 있음을 의미한다. pyk-2 돌연변이 사용에 대한 실험이 없었기 때문에, 수명에서 pyk-2 RNAi 효과를 조사하였다. 도 19의 결과에서도 알 수 있듯이, pyk-2 RNAi는 단독으로 또는 pyk-1 (ok1754) 돌연변이와 연합하여도 수명에 아무런 효과를 발휘하지 못하였다. 이러한 결과로부터, pyk-2는 DDS 효과를 가지지 못함을 시사하고 있다. 이전 연구에서 pyk-1는 주로 근육에서, pyk-2는 주로 소장에서 발현된다고 보고되고 있어(66), 수명에서 DDS 효과는 소장이 아닌 근육의 PK 활성을 통해서 이루어짐을 시사한다. 이러한 모든 결과들에서 예쁜꼬마선충의 DDS 주요 목표 물질이 근육성 PK임을 강력하게 시사하고 있으며, 다른 미확인 목표 물질이 있음을 강하게 시사하고 있다. DDS와 상호작용하는 단백질의 탐색을 통하여 DDS 목표 물질을 확인할 수 있다. 현재, DDS 의한 또는 피루베이트 수준을 증가시키도록 하는 돌연변이에 의한 PK 활성화를 어떻게 저해시키는지를 조절하는 방법은 쉽지 않다. 한 가지 가능성으로, 자식작용(autophagy)에 의해 추가적인 아미노산 및 피루베이트를 공급할 가능성이 있다. 그러나 자식작용에 관련된 유전자가 DDS 처리 후 전사 수준에 아무런 변화가 없고, 자식작용 마커 단백질인 LGG-1이 DDS 처리 후에 증가하지 않기 때문에 그러한 가능성을 확정할 수 없다(도 21). 두 번째 가능성으로, DDS가 TCA cycle에서 다른 효소의 작용을 저해하여 피루베이트의 소비를 낮게 조절되는 것이다. 이와 동시에, 이 때 미토콘드리아 복합체 V 수준과 산소 소비율이 DDS에 의해 감소된다. 대신에, PK 활성의 억제는 보상적인 메커니즘 차원에서 TCA cycle의 억제 조절할 수 있음을 생각할 수 있다. 이러한 가능성은 미토콘드리아 복합체 III에 결함이 있으면서 수명이 연장된 isp-1 돌연변이 예쁜꼬마선충에서 피루베이트 함량이 높게 유지되는 결과를 통해 설명될 수 있다(도 20). 이러한 결과에 의해 수명연장에 있어서 피루베이트의 함량은 중요한 것으로 결론내릴 수 있다.
노화는 단일 세포와 완전한 객체에서 구조적, 생화학적 변화들이 복합적인 과정(원인)으로 일어난다. 노화의 근원적인 정확한 메커니즘은 잘 이해되지 않으나, 수명과 활성 산소의 생성 사이에 관련이 있음이 명확하다(64, 65). 이 연구에서 우리는 DDS가 ROS의 생성을 제어를 통해 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수명을 연장시킴을 보여주었다. 우리의 결과는 DDS가 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수명 증가에 있어서 중요성이 있음을 밝히고 있으며, 이러한 결과는 사람에게도 가능할 것이다. 추후의 연구에서 DDS가 여러 가지 다른 기능들, 즉 면역반응, 대사작용, 뇌기능 등에 영향을 주어 수명에 영향을 주는지 알아 보아야 할 것이다.
일반적인 환자들의 DDS 복용 표준 농도는 100mg/day로 오랜 기간 복용하였지만 임상적으로 유의적이지 않는 범위에서 부작용이 보고(59) 되고 있기 때문에 수명 연장에 있어서 낮은 농도의 DDS 사용이 좀 더 효과적일 수 있다. 그래서 0.5mM과 1mM의 낮은 농도의 DDS를 처리한 예쁜꼬마선충이 2mM의 DDS를 처리한 경우 만큼 효과적으로 수명이 연장되었다는 것을 관찰하였다(도 22, 표 2). 이러한 관점에서 본 발명자들은 여러 가지 피부 질환, 말라리아, 그리고 특히 한센병 환자의 치료로 사용하고 있는 DDS가 예쁜꼬마선충의 수명을 연장시키고, ROS 생성을 감소시킴으로써 수명 증가에 기여함을 알 수 있었다. 따라서 낮은 농도의 뎁손의 투여가 사람의 수명에도 효과적으로 증가시킬 가능성을 시사하고 있다.
II. 세포수준에서의 노화조절 실험
1. DDS가 PQ의해 유도되는 세포독성을 개선하다
DDS의 PQ에 의한 세포독성을 억제하는 효과가 있는지 평가하기 위해, 인간 섬유아세포를 DDS의 여러 가지 농도 (0.1, 1, 5, 20, and 50uM),DPI (5uM), 그리고 NAC (2mM)의 미리 처리하고, 다음에 PQ 1mM을 48시간 동안 처리하였다. NOX의 억제물질로 잘 알려진, DPI와 항산화 물질로 잘 알려진, NAC을 양성 대조군으로 사용하였다. 세포의 생존능력은 Cell Counting Kit (CCK-8)를 이용하여 측정하였다. 아무것도 미리 처리하지 않고 PQ를 처리한 인간 섬유아세포는 PQ를 처리하지 않은 대조군에 비해 약 58.8% 정도로 세포 생존능력이 감소하였다. 이와는 대조적으로, DDS를 미리 처리한 인간 섬유아세포에서는 PQ의 독성을 갖는 세포에 비해 생존 능력을 개선되었다. 또한 양성 대조군으로 사용한, DPI와 NAC은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 약 80-90% 정도까지 PQ에 의해 유도되는 세포독성 억제효과를 보였다 (도 23).
2. DDS는 PQ에 의한 초과산화물 음이온의 생성을 억제한다
PQ에 의한 초과산화물 음이온의 생성을 측정하였다. 세포질의 초과산화물 음이온을 관찰하기 위해 디하이드로에티디움 (DHE)과 미토콘드리아의 초과산화물 음이온의 생성을 관찰하기 위해 MitoTracker Red라는 형광 물질을 이용하였다. DHE는 초과산화물 음이온의해 oxoethidium로 산화되면 이 강력한 형광 물질은 DNA와 결합한다 [17]. 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 초과산화물 음이온이 생성이 되고, 생성된 초과산화물 음이온은 DDS의 농도에 의존적으로 감소됨을 DHE assay를 통해 보였다. 또한 양성 대조군으로 사용한 DPI와 NAC에 의해서도 초과산화물 음이온의 생성이 억제되었다 (도 24A).
미토콘드리아에서 생성되는 초과산화물 음이온를 측정하기 위해 MitoTracker Red 형광물질을 이용하였는데, 이 환원된 형광 물질은 활동적으로 호흡하는 세포로 들어가서 형광을 띠지 않는다. 그러나 미톤콘드리아 초과산화물 음이온에 의해 산화가 되면, 미토콘드리아로 들어가 형광을 띰으로써 초과산화물 음이온의 양을 측정하게 된다 [13]. DDS를 처리한 인간 섬유아세포는 농도에 의존적으로 미토콘드리아의 초과산화물 음이온 생성을 억제함을 보여주고 (도 24B), 또한 양성 대조군으로 사용한 DPI와 NAC도 미토콘드리아의 초과산화물 음이온의 생성을 억제하였다.
이러한 결과는 PQ에 의해 생성된 세포질과 미토콘드리아 초과산화물 음이온을 DDS이 억제함으로써 PQ에 의해 유도된 세포독성을 조절한다고 시사한다.
3. DDS는 ROS 제거의 활성을 개선하지 않는다
DDS가 항산화로써 기능을 갖는지 분석하기 위해, 본 발명자들은 잘 알려진 안정된 유리 라디칼인 DPPH에 대한 효과를 처음으로 알아보았다. 그러나 DDS는 시험관에서 실험한, DPPH에 대한 ROS 제거 활성도에 있어서 어떠한 개선도 보이지 않았다. 반면, 항산화제 대조군으로 사용한 트로록스(수용성 비타민 E)는 강력한 ROS 제거 활성을 보였다 (도 25A).
많은 항산화제들은 생성된 ROS의 제거 효소들의 활성과 관련된 효소적 산화 방어능력을 보인다. 그래서 본 발명자들은 DDS가 ROS를 제거하는 효소들의 양이나 활성을 증가시키는지 가정하고, 인간 섬유아세포에 DDS를 여러 가지 농도로 처리하여 ROS 제거 효소인 SOD1와 SOD2의 양을 알아보았다. 흥미 있게, DDS는 오히려 SOD1와 SOD2양을 감소 시켰다(도 25B).
이러한 결과는 DDS가 생성된 ROS를 제거보다는 ROS의 생성을 억제와 좀 더 관련이 있음을 시사한다. DDS의 항산화 효과를 연구하기 위하여, 인간 섬유아세포에 초과산화물 음이온 생성 물질로 잘 알려진 파라쿼트을 이용해 산화적 스트레스를 유도하였다.
4. DDS는 PQ에 의해 증가하는 NOX4의 발현을 억제한다
NOX4는 인간 피부의 섬유아세포의 NADPH 산화효소 유전자의 주된 이성질체이고 [18, 19], NOX4의 발현이 ROS 생성 양을 주로 결정한다. 그러므로 NOX4의 발현 억제는 ROS의 생성의 감소의 원인이 될 수 있다 [20]. PQ 1mM을 5분 동안 처리한 인간 섬유아세포에서 NOX4와 GAPDH의 RT-PCR 분석을 하였다. PQ를 처리한 인간 섬유아세포에서 NOX4의 양이 증가하였다. DDS가 PQ를 처리한 인간 섬유아세포에서 초과산화물 음이온 생성에 효과가 있는지 분석하기 위해 여러 가지 농도의 DDS를 인간 섬유아세포에 처리한 결과, DDS는 NOX4의 발현을 감소시켰다. 또한 DPI는 인간 섬유아세포에서 PQ에 의한 초과산화물 음이온 생성을 위해 NOX4가 필요하다는 사실을 확인하는데 사용할 수 있다 (도 26).
5. DDS는 칼슘 조절을 통해 PQ에 의해 증가되는 PKC의 활성을 조절한다.
DDS가 세포내의 칼슘의 양을 조절할 수 있다는 보고가 있다 [21]. PQ에 의해 증가하는 칼슘에 DDS의 역할을 확인하기 위해, 본 발명자들은 Fluo-4라는 형광 물질을 이용하여 여러 가지 조건에서 칼슘의 양을 측정하였다. DDS의 산화적 반응에 있어서 억제효과를 보이는 농도에서 PQ에 의해 증가한 칼슘의 양이 감소되었다 (도 27).
PKC 이성질체는 NOX의 활성에 관련이 있다는 보고가 있다 [22]Conventional PKC (cPKC) 또는 칼슘 의존적인 이성질체 (such as PKC α, β-I, β-II, and γ)는 활성을 위해서 칼슘이 필요하다 [23]. PKC의 활성을 통한 NOX 활성의 형태를 분석하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴 블랏 분석법으로 PQ에 의해 인산화가 유도된 PKC에 DDS의 효과를 조사하였다. 그 결과 PQ는 인간 섬유아세포에서 PKCβ 인산화 (활성)를 증가시켰고. 증가된 인산화는 DDS에 의해 감소되는 효과를 보였다 (도 28).
이러한 결과는 칼슘 양의 증가에 의해 PQ가 PKC의 활성을 증가 시키고 ROS 생성을 증가시킴을 나타내며, DDS가 칼슘의 양을 조절함으로써 이러한 결과를 억제하였다.
6. DDS는 PQ에 의해 증가하는 미토콘드리아 기능 부전을 조절한다.
미토콘드리아 기능 부전은 초과산화물 음이온 생성, 막 전위 파손, 미토콘드리아 DNA 손상, 그리고 구조적인 변화 등으로 특성화 된다.
DDS가 미토콘드리아의 기능 부전 발생에 있어서 관련이 있는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 여러 가지 방법으로 PQ에 의해 유도되는 손상에 DDS가 효과가 있는지 검사하였다.
첫 번째로, 본 발명자들은 Western blot 분석법을 통해, 미토콘드리아의 복합 단백질의 양의 변화에 DDS의 효과를 알아보았다. DDS는 PQ에 의해 감소된 모든 미토콘드리아 복합체의 양을 회복하였다 (도 29A).
두 번째로, 본 발명자들은 미토콘드리아의 막 전위의 변화를 DiOC6 형광물질을 이용하여 조사하였다. PQ 1mM을 24시간 동안 처리한 인간 섬유아세포의 미토콘드리아 막 전위는 대조군에 비해서 76.8%로 감소되었다. DDS(3시간)와 DPI(30분)를 사전 처리한 세포에서는 PQ에 의해 유도되는 미토콘드리아의 막 전위의 감소를 유의적으로 유지하고 있다 (도 29B).
세 번째로, 본 발명자들은 미토콘드리아의 구조적인 변화를 Mitotracker 형광 물질을 이용하여 알아보았다. 일반적인 인간 섬유아세포에서 미토콘드리아는 길게 늘어진 모양을 보인다(도 30. 첫번째). 세포는 mitotracker 양성 (MT+) 형광을 띠는 부위는 미토콘드리아가 잘 관찰되고, 세포질의 염색은 mitotracker 음성 (MT-)으로 흐린 염색을 관찰할 수 있다 [24]. 인간 섬유아세포를 PQ 1mM을 24시간 동안 처리하면, 미토콘드리아의 MT+부분이 사라진 작은 점 모양의 염색을 보인다 (도 30. 두번째). DDS와 DPI를 전 처리하고 PQ를 처리한 인간 섬유아세포의 미토콘드리아는 부분적으로 원래의 모양을 회복시켰다 (도 30. 세 번째 및 네 번째).
7. 논의
DDS는 꾸준히 많은 피부병에 강력한 치료 약물로 사용하고 있다. 또한 DDS는 WHO에서 한센병의 치료 약물로 사용을 권장하고 있다. 이러한 DDS는 1940년대 이후로 일반적으로 사용하고 있으며, 30-40년 이상 한센병 환자들이 복용하고 있다 [25, 26]. 일반 환자에 DDS 표준 복용량(100mg/day)을 장기간의 복용 시 극히 적거나 또는 임상적으로 유의적이지 않은 부작용이 보고되고 있다 [4]. 장기간 DDS의 복용은 혈장의 농도와 비슷한 농도로 모든 장기에 분포가 된다 [27]. 일반 한센병 환자가 100mg/day의 DDS를 6-28일 복용 시 혈장농도가 1-20 uM정도가 된다. 더욱이 인간 섬유아세포의 50% 성장 억제 (IC50)의 DDS농도는 약 745 uM정도이다 (데이터 표기 안함). 그래서 본 발명자들은 안전성을 가진 DDS의 농도를 이용하여 연구하였다. 이러한 DDS가 산화적 기능을 갖는지 항산화적 기능을 갖는지 아직 분명하지 않지만, 최근의 논문에서 DDS가 식세포의 일종인호중구 세포에서 초과산화물 음이온의 생성을 억제한다는 보고가 있다 [21]. 이러한 최근의 결과는 우리가 식균세포가 아닌 인간 섬유아세포에서의 DDS의 항산화 효과를 연구하는 의미를 부여해준다. 그런데 인간 섬유아세포에서 ROS의 생성은 일반적으로 낮은 수준으로 일어나므로 특이적으로 초과산화물 음이온의 생성을 촉진한다고 잘 알려진 파라쿼트(PQ)를 연구에 이용하였다.
PQ의 ROS 생성을 통한 세포독성은 식세포에서 주로 연구가 되었다 [28]. 본 발명자들의 연구에서, 식세포가 아닌 인간 섬유아세포에서도 PQ에 의한 세포독성을 나타내고 있고, DDS가 이러한 세포독성을 억제하였다 (도 23). 본 발명자들은 DDS가 PQ에 의해 유도되는 세포질과 미토콘드리아의 초과산화물 음이온 생성을 억제하는 효과가 있음을 증명하였다 (도 24).
항산화제는 생성된 ROS를 제거하고, 새로운 생성을 억제하며, 산화적 손상을 회복하는 물질이다 [29]. 제거되지 못한 초과산화물 음이온 radicals은 보다 활성이 큰 hydroxyl radicals로 바뀔 수 있고, 이 물질은 DNA, protein 그리고 lipid 등에 손상을 직접적으로 유도할 수 있다. 몇몇 항산화제는 초과산화물 음이온 radicals의 제거를 통한 항산화적 특징을 보이지만 [30, 31], 초과산화물 음이온의 생성을 강력히 억제하는 물질도 또한 항산화제로써 사용이 가능하다.
본 발명자들의 연구에서, 본 발명자들은 DDS가 식세포뿐만 아니라 식세포가 아닌 세포에서도 라디칼의 생성을 효과적으로 억제하는 기능의 가능성을 깊이 숙고했다. DDS의 효과를 이해하기 위해, 안정된 라디칼로 잘 알려진 DPPH에 대한 라디칼 제거 활성도를 시험관에서 (in vitro) 조사한 결과, DDS는 DPPH를 제거하는 기능을 보이지 않았다. 반면 양성 대조군로 사용한 트로록스는 강력한 DPPH 라디칼의 제거능력을 보였다 (도 25A). 또한 본 발명자들은 생성된 초과산화물 음이온을 제거하는 항산화 효소인 SOD1과 SOD2의 단백질 양을 조사하였다. 본 발명자들은 DDS가 인간 섬유아세포에서 이 두 유전자의 양을 오히려 감소시킨다는 결과를 얻었다 (도 25B). 이 결과들은 항산화 기능의 DDS가 라디칼 제거 시스템(직접 라디칼을 제거하거나 간접적으로 라디칼 제거 효소의 증가)과 직접적인 관련이 없음을 강력히 시사하고 있다. 그러므로 본 발명자들은 DDS가 생성된 라디칼의 제거보다는 라디칼의 생성을 억제하는 항산화 기능에 초점을 맞추었다.
PQ에 의해 유도되는 산화적 스트레스는 NADPH 산화효소(NOX)의 증가 (그러나 xanthine 산화효소는 관련이 없다는 보고가 있다) [8]와 미토콘드리아의 기능부전에 의해 수반된다 [32, 33]. NOX는 기질로써 산소 분자와 NADPH를 그리고 조효소로써 FAD를 이용한다. NOX 효소는 세포의 생존, 분화, 증식, 칼슘 신호, 그리고 이동 등과 같은 광범위한 생리적 기능의 조절에 관여를 한다 [20, 34]. 피부 섬유아세포의 주요 형태인 NOX4는 상당한 양의 ROS를 생성하고, TGFβ의 자극에 의해서 증가된다 [35, 36]. 또한 신장의 혈관간세포(mesangial cells는 angiotensin의 자극에 의해서 NOX4의 양이 증가하고, 이로 인해 ROS가 증가된다 [37]. 이러한 자극들은 NOX의 전사적 양을 조절함으로써 ROS의 생성을 증가시킨다. 본 발명자들의 결과에서 PQ는 인간 섬유아세포에서 NOX4의 mRNA 양을 증가시키고, DDS가 이를 억제함을 보였다. 게다가 특이적으로 NOX를 억제하는 물질로 잘 알려진 DPI를 이용한 실험 결과, 인간 섬유아세포에서 PQ가 NOX4에 의존적으로 ROS를 생성한다고 보여주고 있다 (도 26).
DDS는 칼슘의 조절에 관여한다는 연구가 있다 [21]. 그러나 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 칼슘의 양이 조절된다는 결과가 없지만, 본 발명자들은 PQ가 세포 내 칼슘의 증가시키고, 증가된 칼슘을 DDS에 의해 억제된다는 결과를 얻었다 (도 27B). 증가된 칼슘은 칼슘에 의존적인 PKC의 활성을 증가시키고, 이 PKC는 NOX의 활성에 필요하다. PQ에 의한 초과산화물 음이온의 증가는 PKC와 관련이 있다고 잘 알려져 있다 [7, 8]. 그러므로 본 발명자들은 DDS가 PKC의 활성의 조절할 수 있는지 알아보았다. 본 발명자들의 결과에서 DDS는 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 PKCβ 인산화을 억제했다 (도 27B).
이 결과들을 토대로, DDS는 PQ가 처리된 인간 섬유아세포에서 세포 내 칼슘의 양을 회복시키고, PKC에 중재되어 활성을 갖는 NOX를 감소시킴으로써 초과산화물 음이온의 생성을 억제하는 물질임을 시사하고 있음을 알 수 있다.
미토콘드리아는 ROS생성에 있어서 또 다른 주요 요소이기 때문에, PQ에 의해 유도되는 산화적 스트레스와 독성에 관여함을 고려할 수 있다. PQ에 의한 미토콘드리아의 기능 부전은 높은 초과산화물 음이온 생성, 막 전위의 손상, 미토콘드리아 DNA 손상, 그리고 구조적인 변화 등의 특성을 갖게 한다. 본 발명자들의 연구는 또한, DDS는 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 미토콘드리아의 비정상적인 특성들을 회복하는 결과를 증명하였다. 기대하지 않게도 DPI는 NOX를 억제함과 동시에 미토콘드리아 산화효소를 억제의 기능을 가지고 있음이 보고되고 있고 [34], 본 발명자들의 결과에서도 PQ에 의해 유도되는 미토콘드리아 독성을 억제하고 있다. 그래서 DDS는 인간 섬유아세포에서 PQ 독성에 효과적인 억제 물질로 판명이 될 수 있다.
요약하면, 본 발명자들은 본 연구에서 DDS가 인간 섬유아세포에서 PQ에 의해 유도되는 산화적 스트레스와 미토콘드리아 독성을 억제한다는 결과를 보여주었다. 이러한 결과는 DDS의 칼슘과 PKC의 활성의 조절에 의한 NOX4의 억제와 미토콘드리아 변화의 억제를 통해 얻었다.
더 상세한 DDS의 연구를 통해 일반적인 산화적 스트레스와 관련된 병적 상태의 예방에 있어서 DDS의 유효성을 수립하는 것이 필요하다. 그러나 한 가지, DDS가 생성된 라디칼의 제거가 아닌 새로운 라디칼의 생성을 억제함으로써 산화적 스트레스를 완화하거나 최소화 할 수 있는 새로운 약물이 될 수 있다고 제안할 수 있다. 그래서 본 발명자들은 DDS를 오랫동안 사용한 한센병 환자에 의해 약물의 안전성을 보증할 수 있고, 질병에 걸리지 않고 오랫동안 살아감에 있어 DDS가 기여한다는 증거를 제공할 수 있을 것이라고 기대한다.
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Claims (12)

  1. 뎁손(dapsone)를 유효성분으로 함유하는 노화조절용 또는 수명연장용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 미토콘드리아의 낮은 에너지 수준을 유지하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 Duox의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항의 조성물을 원료로 하는 노화 완화용 식품 또는 음료.
  5. 제 1 항의 조성물을 원료로 하는 피부 세포의 노화 완화용 화장료 조성물.
  6. 제 1 항의 조성물을 원료로 하는 개체의 노화 완화 또는 노화 세포의 생물학적 기능회복용 약학적 조성물.
  7. 제 1 항의 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포의 노화조절방법.
  8. 제 1 항의 조성물을 세포 노화에 기인하는 증상 또는 질환을 완화 또는 예방하기 위해서 대상에 적용시키는 방법.
  9. 뎁손의 유효량을 개체에 적용하는 단계를 포함하는 개체의 수명연장 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 개체는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 동물은 예쁜꼬마선충인 것을 특징으로 하는 방법.
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