WO2010010751A1 - 全反射蛍光観察装置 - Google Patents

Abstract

　本発明の目的は、操作性が良く、感度が高く、かつ信頼性の高い蛍光観察手法及び装置を提供することにある。 　本発明では、エバネッセント光を利用して蛍光観察を行う装置について、基板表面の角度によらず、常に励起光が基板表面で全反射となるよう励起光の入射角を調整する。この方法は、観察基板に対し励起光の角度を連続的に変化させて入射する工程と、入射後の励起光を光センサで検知する工程と、光センサの検知結果から全反射角を設定する工程とを含む。基板に対して照射された励起光は、その入射角によって進行方向が変化する。即ち、透過光，反射光，表面伝播光である。これらをそれぞれに対応する光センサで検出することにより、励起光の入射角が臨界角に対しどのような状態かを判定し、その判定結果に基づき励起光の入射角を変化させ、最適な全反射角度を実現する。

Description

細 書

明の

術分野

本 、 明を利用して 察を行う 置に関する。

A タンパク質などの 体物質を観察する際、 蛍光 素で 識を 行い、 レ ザ等の励 を照射し、 発生する 光を観察する方法が 般 的である。 年では、 分子レベルの 光を測定 能な技術として、 エバ ネッセン ト光を利用した観察 法がある 。 折率が高 媒質から低 媒質に向けて一定 上の角度をもった光が入るときに、 光が低 折率の 質に伝播せず 射が生じる。 このとき 界面 の 折率 面に、 かに光が み出す現象が生じる。 その み 出し光が、 エバネッセント と呼ばれる。 エバネッセント光の強 屈 折率 界平面から離れるに従って指数 に減衰 、 屈折率 界平面 から 5 ０ 度の 離で 度が eとなる。 このため

料を境界面に固定することにより、 励起 を境界面近傍の 料のみ に照射することが可能であり、 光体や水のラ ン に由来す る背景 を抑制し、 コントラス トな像が得られる。

さらに、 前述の 出の 術を利用したD Aシ ケンシン グが提案されている 2 ) 。 析す き試料 A 片を基 表面にランダムに ずつ 、 ずつ 長させる。 こ れを、 前述の バネッセン ト光を利用した 出によって 定し、 配列を決定する。 体的には、 屈折率 界平面上の溶 、 単一 のタ ゲットD A 子を オチン アビジ のタンパク 合を利用 して 定化する。 そして ，

、 D Aポリメラ ゼの として D A に取り込まれて A 応を保護基の 在により 止することが でき、 かつ 出され得る標識を持つ4種の Pの 導体

P) を用いて Aポリ メラ ゼ 応を行う工程、 次いで取り込まれた

Pを で検出する工程、 Pを伸長 能な状態 に戻す 程を サイクルとし、 これを繰り返すことにより D Aの 基配列を決定する。

エバネッセント 照射は、 バックグラウンドが低く 弱な 号を観察 能と うメ リットがある反面、 かつ 確な光学 角を厳 しく制御 が必要不可欠であるというデメリッ トがある。 題を解 決する手段として、 特許 載の 微鏡では、 エバネッ セン ト光の染み出し さを 定に保つような機構を備えて る。 体的 には、 記録された励起 の 角と バネッセント光の染み出し さとの 報に基づき、 ザが指定する み出し さになるよう、 自動で の 角を制御する。

また、 特許 2 載の X 分析 置では、 励起 の 角を適切に設定する手段を備えて る。 体的には 上のサンプルに 対して X線を照射し、 表面で反射した反射X線の強度をセンサ で測定し、 その 度をもとに励起X線の入 角を制御する。

術文献 2 ０ ０ 6 8 9 74

2 3 24645 2 1 N tur 1 3 Dp

2 p 1 Dp ０ 明の

明が解決しようとする課題

しかしながら、 特許 載の 度調整機能は、 完全に水平な基 に対しては有効であるが、 実際の 表面には波打ちや さが に 存在し、 また な 存在するため、 照射 ごとに人射角が変 化し、 その 度が 定せず、 観察 果にばらつきが生じる。 また、 この 、 射角度を 定に保つことは可能であるが、 仮に 全 射していても の 臨界 より大きい場合、 エバネッセ ン ト光の染み出しの さほ くなる。 また、 仮に、 が完全に水平で 入 角を一定に保つことができて ても、 角と臨界角の差が大きけ れば、 その バネッセン ト光の染み出しの さは くなる。 このため 十分な 度が得られず、 結果として の 度が弱く なってしまう。

さらに、 特許 2 載の 置にお ては、 の 折率と 質の 折率の差が大き 場合や、 の 態によっては、 例えば 態であっても 表面で 部 射が生じることがある。 つ まり 態ではなくても反射光が存在するため、 反射光を検出する だけでは一部 射光と全 射光との 別が難し 場合がある。

明の 操作性が良く 、 感度が高く 、 かつ 頼性の

察手法及び 置を提供することにある。 題を解決するための

明では、 エバネッセン ト光を利用して 察を行う 置につい て、 表面の 度によらず、 常に励起 が基 表面で全 射となるよ う の 角を調整する。 この 、 観察 に対し の 度を連続的に変化させて人射する 、 人射 の を光センサで 検知する工程と、 センサの 果から 射角を設定する工程とを 含む。

また、 明でほ、 エバネッセン ト光を利用して 察を行う 置 について、 表面の な によらず、 常に励起 が基 表面で 全 射となるよう の 角を調整する。 この 、 観察 に 対し 意の 角で を照射する と人射 の を光センサ で検知する工程と、 センサの 果をもとに、 現在の 角の 態 を判定する工程と、 前記 果をもとに、 励起 が基 表面で全 射 するよう、 励起 の 角を調整する とを含む。

に対して 射された励起 、 その 角によって進行方向が変 化する。 、 透過 射光 である。 これらをそれぞれ に対応する センサで検出することにより、 励起 の 臨界 に 対しどのような状態かを判定し、 その 果に基づき の 角 を変化させ、 最適な全 射角度を実現する。

つの 態においては、 に照射された後の励 3つの センサで検出することにより、 射の 度を自動的に設定する。 この 法では、 測定 域に励起 を照射する工程と、 人射角を連続的に 変化させる工程と、 の 3 ( ・ ・ ) をそれぞれに対応する センサで検知する工程と、・ 果をもとに励 起 が基 表面で全 射するよう、 励起 の 角を適切に設定する 程を含む。

別の実 態においては・ に照射された後の励 3つの セ ンサで検出することにより、 明を実現する励起 の 角を自 動的に設定する。 この 法では、 測定 域に励起 を照射する工程 と、 その じる または反射光または表面 をそれぞれに 対応する センサで検知する工程と、 検知 果をもとに現在の 角の 態を判定する 、 判定 果をもとに励起 の 角を変化させる 、 以上の工程を励起 が基 表面で全 射するまで連続的に行う 程を含む。

別の実 態にお ては、 に照射された後の励 つの セ ンサで検出することにより 射の 度を自動的に設定する。 この 法 では、 透過 ・ 射光・ つの センサに導く 程と、 そ れぞれの 号の 無を センサ内で区画化された 域に検知する 、 果をもとに励起 が基 表面で全 射するよう、 励起 の 角を適切に設定する 程を含む。

別の実 態においては、 に照射された後の励 つの セ ンサで検出することにより 明を実現する励起 の 角を自動 的に設定する。 この 法では、 測定 域に励起 を照射する工程と その じる または反射光または表面 つの センサ に導く 程と、 それぞれの光の有無を センサ内で区画化された 域で検知する工程と、 検知 果をもとに現在の 角の 態を判定する 、 判定 果をもとに励起 の 角を変化させる工程と、 以上の 工程を励起 が基 表面で全 射するまで連続的に行う工程を含む。 別の実 態にお ては、 に照射された後の励 2つの セ ンサで検出することにより 射の 度を自動的に設定する。 この では、 透過 射光 のうち を含む2 類に対 応する センサで検知する工程と、 検知 果をもとに励起 が基 表面 で全 射するよう、 励起 の 角を適切に設定する工程を含む。

別の実 態にお ては、 に照射された後の励 2つの セ ンサで検出することにより 明を実現する励起 の 角を自動 的に設定する。 この 法では、 測定 域に励起 を照射する工程と その じる または反射光または表面 のうち

を含む2 類の光を、 それぞれに対応する センサで検知する工程と、 検知 果をもとに現在の 角の 態を判定する工程と、 判定 果をも とに励起 の 角を変化させる工程と、 以上の 程を励起 が基 表 面で全 射するまで連続的に行う 程を含む。

別の実 態にお ては、 に照射された後の励 つの セ ンサで検出することにより 射の 度を自動的に設定する。 この 法 では、 透過 射光 のうち を含む2 類を つの センサに導く 程と、 それぞれの 号の 無を センサ内で 区画化された 域に検知する 、 検知 果をもとに励起 が基 表 面で全 射するよう、 励起 の 角を適切に設定する 程を含む。 別の実 態においては、 に照射された後の励 つの セ ンサで検出することにより 明を実現する励起 の 角を自動 的に設定する。 この 法では、 測定 域に励起 を照射する工程と その じる または反射光または表面 のうち

を含む2 類の光を つの センサに導く 程と、 それぞれの光の有無 を センサ内で区画化された 域で検知する工程と、 検知 果をも とに現在の 角の 態を判定する 、 判定 果をもとに励起 の 角を変化させる工程と、 以上の工程を励起 が基 表面で全 射す るまで連続的に行 工程を含む。

別の実 態においては、 に照射された後の励 つの セ ンサで検出することにより 射の 度を自動的に設定する。 この 法 では、 表面 を光センサで検知する工程と、 検知 果をもとに励起 が基 表面で全 射するよう、 励起 の 角を適切に設定する工程 を含む。

別の実 態においては、 に照射された後の励 1つの セ ンサで検 することにより 明を実現する励起 の 角を自動 的に設定する。 この 法では、 測定 域に励起 を照射する工程と その じる表面 を光センサで検知する工程と、 検知 果をも とに現在の 角の 態を判定する工程と、 判定 果をもとに励起 の 射角を変化させる工程と、 以上の工程を励起 が基 表面で全 射す るまで連続的に行う工程を含む。 明の

明によれば、 励起 が全 態となるよう 角を自動的に設 定することが可能となり、 操作性が向上する。 また観察 域の 態 に左右されず常に最適な入 角を制御できるため、 従来 と比較して 頼性が向上する。 さらに、 必要以上に入 角を浅くすることが無いため バネッセン ト 度を強く つことができ、 その と比較し て強い 度を得ることができる。 面の 単な説明

図は実施 における装置の 。

2図は実施 における角度調整のフロ 。 3図は実施 2における装置の 。

4図は実施 3における装置の 。

5図は実施 4における装置の 。

6図は実施 5における装置の 。 明を実施するための

下、 上記及びその他の本 明の な特徴を実施 により具体的に 説明するが、 はこれらの に限定されるものではなく 、 の み合わせが可能である。

では、 表面に 料が配置された 、 に励起 を照 射する 、 板から生じる発光を測定する検出 、 に照射 の を検知する センサ センサの 果に基づいて の 角を調整する調整 有する 置を開示す る。

また、 実施 でほ、 明を利用して 察を行う 置におい て、 励起 の 角を自動的に調整する方法であって 面に 料 が配置された に対し、 励起 の 角を連続的に変化させ

が基 することにより じる 、 又は反射光の なく とも つを センサで検知し 射角 御機構が センサの バタ ンをもとに励起 の 射角となるよう 角を調整 する 法を開示する。

また、 実施 では、 明を利用して 察を行う 置におい て、 励起 の 角を自動的に調整する方法であって 面に 料 が配置された に対し・ の 角を連続的に変化させ

が基 することにより じる 、 又は表面 の なく と も つを センサで検知し 御機構が、 センサの パタ ンをもとに励起 の 射角となるよう 角を調整する 法を開示する。

また、 実施 でほ、 明を利用して 察を行う 置におい て、 励起 の 角を自動的に調整する方法であって 面に 料 が配置された に対し・ の 角を連続的に変化させ

が基 射することにより じる表面 反射光の なく とも つを センサで検知し 射角 御機構が、 センサの パタ ン をもとに励起 の 射角となるよう 角を調整する 法 を開示する。

また、 実施 では、 明を利用して 察を行う 置におい て、 励起 の 角を自動的に設定する方法であって 面に 料 が配置された に対し、 励起 の 角を連続的に変化させ

が基 射することにより じる表面 を光センサで検知し

御機構が、 センサの パタ ンをもとに励起 の

射角となるよう 角を調整する 法を開示する。

また、 実施 では、 、 光を透過する 成されていること を開示する。

また、 実施 では、 に照射 の 、 透過 、 射光を含むことを開示する。

また、 実施 では、 センサが、 透過 、 又は反射光の いずれか、 若しくはその み合わせを検知することを開示する。

また、 実施 では、 制御機構が、 透過 、 射光の 果の み合わせから、 現在の 角の 態を判定することを開示 する。 ０

また、 実施 では、 制御機構が、 現在の 角の 態をもとに、 駆動 機構に対し次の動作を指示するためのアルゴリズムを内部に備えている ことを開示する。 図は、 本実施 における、 角度調整機能を有するD A 基配列 置の である。 型の 微鏡のような構成であり、 に する 光分子を 出にて 定する。 なお 立型の 成にすることも可能である。 なお、 出法に基づ く 合、 測定は EPAフィル を介したク リ ンルームのような環境 にて行う。

連の の 応基 上で行う。 は透明 質でできており 材質としては例えば合成 英などが使用できる。 にはプライ が複 数 定されている。 えばプライ の 5 端が オチン されており 表面がアビジン されており、 ビオチン アビジン 合を利用して 面に固定されて る。 プライ は 上にランダムに配置され ていても わないが、 観察 の 率を考慮し、 規則的に配置されている ことが望ましい。

起用のレ ザ 2 YAGレ ザ 5 3 2 からのレ ザ 2 aは、 4 3を通過して円偏光となり、 ミラ ニッ ト 4を介して の プリズム 5に され の 側 から照射される。 プリズム 5 は グリセリ ンを介し て させており、 レ ザ光はその 面で反射することなく 、 に 導入される。 ミ ラ ニッ トは自動で ・ 置調整 能な自動ステ ジ 反射 ミ ラ から 成されており、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6 によって制御されている。 に入 したレ ザ光は、 表面のサンプルを照射した後、 その 角によって進行方向が変化する。 射角が臨界 より小さい場合、 レ ザ光は基 表面で全 せず、 表面 と透過する

) 。 射角が臨界 と同等の 合、 基 表面を伝播する

。 臨界 より大き 場合、 レ ザ光は基 表面で全 射す る 射光) 。 このとき 表面のごく近傍に バネッセン ト光が発生 する。 なお、 臨界 、 の 折率と、 表面に存在する 質の 折率から 下の式によって められる。

9 ar n 2

の 折率 2 質の 折率、 2

2図は、 本実施 における人射角 フロ 図である。 体的 な角度調整 以下の 順に従って行う。 表面の 域に対し 意の 角でレ ザ光を照射する。 例えば45度である。

レ ザ光は臨界 との 係から、 透過 またほ または 射光となる。 置には透過 射光を検出するため の センサ7 8 9が設置されており、 これらのセンサの

ミラ ニッ トコントロ ラ 6 送られる。

ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6はその 報をもとに、 ミラ ニッ ト 4を駆動させる。 動の 電動 イクロメ タによる。 この他にも ステ ジ ガル ミラー ポリ ミ ラ (A O ) 等が利用 能である。 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6は内部に下 に示す 5つのモ ドを有しており、 センサ7 8 9の パタ ンより、 モ ドを決定する。 それぞれのモ ドごとに決められたル ル に従ってミラ ニッ ト 4は人射角が 射角度となるよう自動で調整 を行う。 しくは、 ミ ラ ニッ トコントロ ラ 6はミ ラ ニット 4 2

に対し、 それぞれのモ ドごとに決められた動作の 示を出す。 ミ ラ ニッ ト 4はこの 示に従って駆動し、 レ ザ光が基 表面で全 射す るよ 、 人射角を調整する。

、 表における 号のあり 号なし は、 測定値そのもの をしめすものではなく 、 レベルの 念を示す記号である。

えば、 が合成 質が水の場合、 臨界 6 6度であ り、 人射角45度でレ ザ 2 aを照射した場合、 レ ザ 2 a

を 過する。 このとき センサ7 8 9の パタ ンは

射光) ０ ０ となる。 この パタ ンを受 け、 ミ ラ ニットコントロ ラ 6はモ ドA 判定し、 ル ル に 角を大きくするよう 整を行う。 しくは、 この パ タ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トローラ 6はモ ドA 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に対し入 角を大きくするよう指示を出す。

射角が 6 6度に達すると表面 が発生し センサ7 8 9の パタ ンは 射光 ０ ０ となる。 この パタ ンを受け、 ミラ ニットコン トロ ラ 6はモ ードB 判定し、 ル ルに 更に入 角を大きくするよう 整を行う。 しくは、 この パタ ンを受け、 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ドB 判定し、 ミ ラ ニット 4に対し更に人射角を 大きくするよう指示を出す。

臨界 を超えた瞬間、 表面 消え 代わりに 射光 が発生する。 このときの パタ ン ( 射 光) (０ 0 となる。 この バタ ンを受け、 ミラ ニッ トコントロ ラ 6はモ ド C 判定し、 角度調整を停止する。 しくほ この パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ド C 3

定し ニット 4に対し 度調整 止の 示を出す。

また、 例えば、 がサファイ で 質が空気の 合の

34度であり、 45度でレ ザ 2 aを照射した場合、 レ ザ 2 aは 面で全 射する。 このとき センサ 7 8 9の パ タ ンは 射光 ０ 0 となる。 こ の パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ド 判 定し、 ル ルに 角を小さくするよう 整を行う。 射角が 34度に達すると表面 が発生し センサ7 8 9の タ ンは 射光 ０ ０ となる この パタ ンを受け、 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ドB 判定し、 ル ルに 角を大きくするよう 整を行う。

臨界 を超えた瞬間、 表面 消え 代わりに 射光が 発生する。 このときの パタ ンは 射光 ０ ０ となる。 この パタ ンを受け、 ミラ ニットコ ントロ ラ 6はモ ド C 判定し、 角度調整を停止する。

なお の 折率と 質の 折率の差が大き 場合や、 の 態によっては、 例えば 態であっても 面で 部 射が 生じることがある。 このため、 モ ドAおよびBのときに反射光センサ 9が反応する場合がある。 4

ラー ットコントロー のモード( モードA モード モード モード

C モードD

射角・ 角 射角 臨界 射角 射角 射角

射角 の大 ) ( 45

2

O O

センサ

O

センサ

射光

センサ または または

モード まで人射モードCまで人射 モード まで人射 ステ ジ 射角 動停止 に 角を大きする 角を大き する 角を小さ する 対して 5 モード から 始時に のみ 行する の 択される あり 号なし

により、 内でのレ ザ 2 aの 角は常に約 6 6 ( の 折率と試料 の 折率によって変化する) とな り、 面で全 射し、 エバネッセント 明となる。 これにより、 高 S で 定が可能になる。 なお、 レ ザの 2 とした。

体的な配列 、 以下の 順に従って行う。 サンプルで ある一本 酸を、 上に固定されたプライ にハイブリ さ せる。 、 例えば、 6 ０ 間で行う。 プライ の 、 前記 少なく とも一部が相補 であればよ 。 なお、 プライ の 、 イブリダイゼ ショ ン 率を鑑みて ０ 上であるこ とが望ましい。 5

次に、 標識された A P P C P G Pを 加しながら 応を行い、 プライ 流の 基配列を解読する。

えば、 まずC 3 A P 、 D Aポリメラ ゼを含む

2 ０ M C 3 A P ０ a D Aポリ メラ ゼ ０ M s C 7 8 2mM C 2 ) を、 グメント 5 させる。 次に、 洗浄 、

ソファ ０ s C 7 8 2 M M C 2) によって、 応の C 3 A Pを除去する。

バッファ は試薬保管 ニッ ト ０に保管し、 分注 ニッ ト を介し、 チ 2を通じて に送られる。 薬保管 ニット ０には、 試料 、 4種の標 P ０ ０ c e P tur ０ ポ リ メラ ゼ ０ バッファ ０ 等が用意される 反応 の 、 廃液チ 3を通じて 4に まる。

5 3 2 而のYAGレ ザを励起 として 射し、 C 3 A Pの り込みが行われた グメントから蛍光 5を発生させる。 な お、 C 3 子から発生する 、 強 の 射で消光するため にはより低い 度で観察を行う ことが望ましい。

、 例えば、 ０ ０ W である。 光を抑制する手段として は、 脱酸素 の 加も有効である。 これほ・ C 3 子の 光が、 液 中の 素との 応に起因するためである。 酸素 、 例えば、 ペ ルオキシダ ス パ オキシドディス タ ゼなどが使用できる。

5は、 集光レンズ ( レンズ) 6で集められ、 フィル ニッ ト 7で必要な波長の 光を取り出し、 結像レンズ 8で、 2 センサカメラ 9で を検出する。 フィル ニッ ト 7には、 する 光に対応したフィル が複数 持されており、 その 制御 PC2 が行う。 えば、 4種の蛍 素が付加された Pを使う 場合は、 フィル ニッ ト 7で 当する 4種の蛍光体 フィル を 切り替えて を検出することなどで対応できる。 2 センサカメ ラ 9の 間の 定、 蛍光画像の り込みタイミ ングなどの

2 センサカメラコントロ ラ 2 ０を介して制御PC 2 が行う。 2 センサカメラ 9は、 例えば、 サイズが 6 X 6 で、 5 EM C カメラで、 蛍光 の

０ ０ である。 その 般的な C C カメラの 、 C MOSエリアセンサなどの カメラなどを使う ことができる。 センサ は冷却 が望ましく 、 2 ０ 度以下にすることで、 センサの ダ クノイズを低減でき、 測定の 度を高めることができる。 り込まれ た デ タはモニタ 2 2で観察できる。

デ タをもとにC 3 A Pの り込みが行われた グメントの 置を特定し、 配列を決定する。 C 3 光を観察後、 強 を照射するなどして、 既に取り込まれたC 3 A P 来の 光が次 程で生じないようにする。 上の 連の 程を P P C P G Pの順に行う。 この 作を 8 ０サイクル う ことで、 フラグメントの 側のおよそ2 ０～3 ０ 基が解読でき る。 実施 では、 蛍光 素としてC 3を、 励起 として 5 3 2 mのYAGレ ザを用いているが、 標識 の み合わせは これに限るものではない。

また、 本実施 では、 類の 素を用い、 応による 基 配列 読を行っているが、 別の方式を用いても わな 。 えば、 4 類の Pの 3 O 基に対し、 ニトロベンジル基を介して異なる 7

4 類の 素を結合させた Pを用 る場合、 本実施 の よ に Pを 類ずつ させなくても良い。 すなわち、 3 O 基の蛍 素が保護基となり 取り込みが行われた段階でその後の 伸 応が進まなくなる。 このことを利用して、 塩基配列の 読を行う 例えば、 4 類の 、 A リメラ ゼを含む

2 ０ M P ture ・

Aポリ メラ ゼ ０ s C 7 8 2 M C 2 、 グメント 5 させる。 次に洗浄バッファ s C 7・ 8 2

C 2 t よって、 応の を除去する。 を照射し 2 センサカメラで B4 類の 光を観察し、

の り込みが行われた グメントを特定し、 配列を決定 する。 4 類の 素としてほ、 例えばC 3 C 5 C 5・ 5 a f u r 48 8を用いることができる。 光のクロス コンタミネ ショ ンを防ぐため、 なる く 光波長 が離れているもの を選択することが好ましい。 、 それぞれの 素の 性 に適した励起 を用いるか、 バンドパ フイルタ等を用いて 光 から目的の 分を分離して る。 同様に、 それぞれの 素の 性に適したバンドパスフィルタ等を用 て、 目的の 分を分離して 察を行う。 察後、 化学的 物理的手段によって 素を切り離し、 直前に取り込まれた の 3 o 基を解放する。 り離す 、 例えば 3 6 ０ 下の V 射などである。 り離じた 素を洗浄バッファ により除去する。 上の 連の 作を 数回行う ことで、 塩基配列の 可能である。 実施 では、 フィル ニッ ト 7内の4種のフィル を切り替え 8

番に 定するが、 4種の蛍光波長を同時に 定することもできる。 たとえば、 フィル ニッ トに変えて2 ニッ トを使用すれば 2 元の 像で多色 定が可能である。 この 合、 プライ は 上に 則的に配置されていることが望ましい。 また、 2 ニットと して、 例えば、 プリズムなどを光学系の中に配置し、 画像の 方向に色 分散させることで プライ 置からの 光を同時に検出し、 さ らに、 4 上の波 を同時に検出することができる。 、 分散 プ ライ の ピッチより も小さくなるようにする。 またこの 式では連 続的に反応させ、 連続的に計測することもできる。

上の操作により、 明を利用して 察を行う 置につい て、 表面の 度によらず、 常に励起 が基 表面で全 射となるよ う の 角を調整する。 なお・ 実施 では、 観察 域で人射角 の 整を行っているが、 別の領域で調整を行っても良 。 えば、 既に サンプルが固定された を観察する際、 サンプル

人射角 整を行う とで、 調整に伴うレ ザ光の照 によって サン プルの 光が消光することを防ぐことが可能である。

また 体、 つまり、 の 位置ごとの パラメ タをあら かじめ 定して記憶しておき、 の 定位置を変えたときに、 その デ タをもとに 角度調整を連続的に行う ことも可能である。

実施 によれば、 射角度の ニ アル 作が不要となり、 従来 と比較して 作性が向上する。 また、 表面の 打ち等に影響 されずに常に全 射角度 一定に保つことが可能なため、 従来 と比較 して安定性 頼性が向上する。

( 2 )

では、 3つの センサで透過 、 射光を 9

知しているが、 これら 3つの光を つの センサ2 3で検出すること もできる。 体的には、 前述の 3 類の光は、 直接もしくはミ ラ 等の 光 子によって センサ2 3の 画化された 3 域にそれぞれ かれ る。 センサ2 3の 、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6 送ら れる。 ミ ラ ニットコン トロ ラ 6はその 報をもとに、 ミラ ニ 、 4を駆動させる。 ミラ ニッ トコントロ ラ 6は実施 様、 内部に 5つのモ ドを有しており、 それぞれのモ ドごとに決められた ル ルに従ってミ ラ ニット 4は人射角が 射角度となるよう自動 で調整を行う。 しくは、 ミラ ニットコントロ ラ 6は、 実施 様、 内部 Z 5つのモ ドを有しており、 センサ 2 3の パタ ン より、 モ ドを判定する。 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6はミラ ニ 4に対し、 それぞれのモ ドごとに決められた動作の 示を出す。 ミラ ニット 4はこの 示に従って駆動し、 レ ザ光が基 表面で全 射するよう、 人射角を調整する。

( 3

では、 透過 、 射光の 3つの光を検知し ているが、 検知する光は透過 と表面 2つとすることもできる 様、 基 面の 域に対し、 任意の 角でレ ザ 2 aを照射する。 、 例えば、 45度である。 置には透過

を検出するための センサ 7 8が設置されており、 これらの センサの 、 ミラ ニッ トコントロ ラ 6 送られる。 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6はその 報をもとに、 ミ ラ ニッ ト 4を駆 動させる。 実施 様の 段で行う。 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6は内部に下 に示す5つのモ ドを有しており センサ 7 8 の パタ ンより、 モ ドを決定する。 それぞれのモ ドごとに決め 2０

られたル ルに従ってミラ ニッ ト 4は 射角度となるよ う自動で調整を行う。 しくは・ ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6は実施 様、 内部に 5つのモ ドを有しており、 センサ7 8の パ タ ンより、 モ ドを判定する。 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6はミ ラ ニッ ト 4に対し、 それぞれのモ ドごとに決められた動作の 示を す。 ミ ラ ニッ ト 4はこの 示に従って駆動し、 レ ザ光が基 表 面で全 射するよう、 角を調整する。

えば、 が合成 質が水の場合、 臨界 6 6度であ り、 45度でレーザ 2 aを照射した場合、 レ ザ 2 aは を 過する。 このとき センサ7 8の パタ ンは

( ０ となる。 この パタ ンを受け、 ミラ ニ ットコン トロ ラ 6はモ ドA 判定し、 ル ルに 角を 大きくするよう 整を行う。 しくは、 この パタ ンを受け、 ミラー ニッ トコン トロ ラ 6はモ ドA 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4 に対し入 角を大きくするよう指示を出す。

射角が 6 6度に達すると表面 が発生し センサ 7 8の パタ ンは ０ となる。 この タ ンを受け、 ミ ラ ニットコン トロ ラ 6はモードB 判定し、 ル ルに 更に入 角を大きくするよう 整を行う。 し くは、 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニットコン トロ ラ 6はモ ドB 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に対し入 角を大きくするよう指示を 出す。

射角が臨界 を超えた瞬間、 表面 消え 代わりに 射光 が発生する。 このときの パタ ンは ( ０ ０ ) となる。 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6 2

モ ド C 判定し、 角度調整を停止する。 しくは、 この パタ ンを受け、 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ド C 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に対し 度調整 止の 示を出す。

実施 では、 透過 と表面 の センサを に用意して いるが、 実施 2のように つの センサの 画化された 2 域に導く 方式であっても良い。

ミラー 、 トコントロ のモ ド

モード モードA モード モードC モードD ) ・ 角 射角 臨界

射角 の大 ( ( ) 5

O O O

センサ

O O

センサ

モード まで人射モードCまで人射 モード まで人射 ステージに 射角 射角 動停止

角を大きする 角を大きする 角を小さする 対して 5 モード から 始時に のみ 行する の 択される

Ⅹ あり 号なし

( 4

では、 透過 、 射光の 3つの光を検知し ているが、 検知する光は表面 と反射光の 2つでも実現できる。

様、 基 面の 域に対し・ 意の 角でレ ザ 2 aを照射する。 例えば4 5度である。 置には表面

射光を検出するための センサ8 9が設置されており、 これらの 、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6 送られる。 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6はその 報をもとに、 ミ ラ ニッ ト 4を駆動さ せる。 実施 様の 段で行う。 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6は内部に下 に示す5つのモ ドを有しており センサ8 9の バタ ンより、 モードを決定する。 それぞれのモ ドごとに決められ たル ルに従ってミ ラ ニッ ト 4は人射角が 射角度となるよう自 動で調整を行う。 しくは、 ミ ラ ニッ トコントロ ラ 6は実施 様、 内部に 5つのモ ドを有しており、 センサ8 9の パタ ンより、 モ ドを判定する。 ミラ ニットコン トロ ラ 6はミラ ニット 4に対し、 それぞれのモ ドごとに決められた動作の 示を出す ミ ラー ニッ ト 4はこの 示に従って駆動し、 レ ザ光が基 表面で全 射するよう、 人射角を調整する。

えば、 が合成 質が水の場合、 臨界 6 6度であ り、 45度でレ ザ 2 aを照射した場合、 レ ザ 2 aは

過する。 このとき センサ8 9の パタ ン

射光 ０ ０ となる。 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコントロ ラ 6はモ ドA 判定し、 ル ルに 角を大 きくするよう 整を行う。 しくは、 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニットコン トロ ラ 6はモ ドA 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に 対し入 角を大きくするよう指示を出す。

6 6度に達すると表面 が発生し センサ8 9の パタ ンは 射光) ０ となる。 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ドB 判定し、 ル ルに 更に入 角を大きくするよう 整を行う。 し くは、 この バタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6は B 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に対し入 角を大きくするよう指示を 出す。

射角が臨界 を超えた瞬間、 表面 消え 代わりに 射光 が発生する。 このときの パタ ンは 射光 ０ となる。 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6 はモ ド C 判定し、 角度調整を停止する。 しくは、 この バタ ンを受け、 ミラ ニットコン トロ ラ 6はモード C 判定し、 ミ ラー ニット 4に対し 度調整 止の 示を出す。 実施 では、 表面

と反射光 の センサを に用意しているが、 実施 2のように つの センサの 画化された 2 域に導く方式であっても良 。 3

ラー ットコントロー のモード( A モード モード モード モードC モードD ( 射角・ 射角 臨界 射角 射角 射角

射角 の M 2) 5

O

センサ

射光

センサ または または

モード まで人射モードCまで人射 モード まで人射 ステージ 射角 射角 に 角を大き する 角を大き する 角を小さする 対して45 モード から 始時に の 行する のみ 択される あり 号なし

( 5

では、 、 射光の 3つの光を検知し ているが、 検知する光は表面 のみでも実現できる。

面の 域に対し、 人射角 9 ０度でレ ザ 2 aを照射する 装置には表面 を検出するための センサ8が設置されており、 こ の ミ ラ ニットコントロ ラ 6 送られる。 ミ ラ ニッ トコントロ ラ 6はその 報をもとに、 ミ ラ ニッ ト 4を駆動させる 実施 様の 段で行う。 ミラ ニッ トコン トロ ラ 6は内 部に下 に示す4つのモ ドを有しており、 センサ8の パタ ン より、 モ ドを決定する。 それぞれのモ ドごとに決められたル ルに ってミラ ニット 4は 射角度となるよう自動で調整を 行う。 しくは、 ミラー ニットコン トロ ラ 6は内部に下 に示す4 つのモ ドを有しており、 センサ 8の パタ ンより、 モ ドを判 定する。 ミラ ニットコン トロ ラ 6はミラ ニッ ト 4に対し、 そ れぞれのモ ドごとに決められた動作の 示を出す。 ミラ ニット はこの 示に従って駆動し、 レ ザ光が基 表面で全 射するよう、 人 射角を調整する。

えば、 が合成 質が水の場合、 臨界 6 6度であ り、 9 ０度でレ ザ 2 aを照射した場合、 レ ザ 2 aは を 過する。 このとき センサ8の パタ ンは ) (０ となる。 この パタ ンを受け、 ミラ ニッ トコントロ ラ 6はモ ドA 判定し、 ル ルに 角を大きくするよう 整を行う。 しくは、 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニットコ ントロ ラ 6はモ ドA 、 ミ ラ ニッ ト 4に対し入 角を大 きくするよう指示を出す。

射角が 6 6度に達すると表面 が発生し、 センサ8の パ タ ンは ) ( となる。 この パタ ンを受け ニッ トコン トロ ラ 6はモ ドB 判定し、 ル ルに 更に入 角を大きくするよう 整を行う。 しくは、 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニッ トコン トロ ラ 6はモ ドB 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に対し入 角を大きくするよう指示を出す。

射角が臨界 を超えた瞬間、 表面 消え、 代わりに 射光 が発生する。 このときの パタ ンは (０ となる この タ ンを受け、 ミラー ニッ トコントロ ラ 6はモ ド C 判定し、 角度調整を停止する。 しくほ、 この パタ ンを受け、 ミ ラ ニットコン トロ ラ 6はモ ド C 判定し、 ミ ラ ニッ ト 4に 対し 度調整 止の 示を出す。

ラー 、 トコントロー のモード 5

モードD モードA モード モードC 射角・ 角 射角 臨界 射角 射角

射角 9 の大

O O

センサ

モード まで人射モ ドCまで人射 ステージに 射角 射角 動停止

角を大き する 角を大き する 対して

モード から 始時に の 行する の 択される あり 号なし

上の利用 能性

、 察に有用である。 したがって、 生物 含むライフサイエンス 野において 広く 能である。 号の 2 レ ザ

2 a レ ザ

3 4

ミ ラ ニット

5 プリズム

6 ミ ラ ニッ トコントロ ラ

7 センサ

8 センサ

9 射光 センサ

０ 薬保管 ニッ ト

０ a

０ ０ c e

０ f P xtur

０ バッファ

０ ポリメラ ゼ

ニット

2 チ ー

3 チ

4

5

6 レンズ フイル ニッ ト

レンズ

2 センサカメラ

2 センサカメラコン トロ ラ P C

モニタ

センサ

Claims

求 の

(

面に 料が配置された

に励起 を照射する 、

前記 板から生じる発光を測定する検出 、

前記 に照射 の を検知する センサ 、

前記 センサの 果に基づいて の 角を調整する調整 有することを特徴とする 。

( 2 )

載の 置にお て、

前記 光を透過する 成されていることを特徴とする装 置。

3 )

載の 置にお て、

前記 に照射 の 、 透過 、 射光を含 むことを特徴とする装置。

( 4

載の 置にお て、

前記 センサが、 透過 、 又は反射光のいずれか 若し くはその み合わせを検知することを特徴とする装置。

( 5 )

載の 置にお て、

前記 御機構が、 透過 、 射光の 果の み 合わせから・ 在の 角の 態を判定することを特徴とする装置。 6

載の 置において、

前記 御機構が、 現在の 角の 態をもとに、 駆動機構に対し次の 動作を指示するためのアルゴリズムを内部に備えていることを特徴とす る装置。

7

明を利用して 察を行う 置において、 励起 の 角 を自動的に調整する方法であって

面に 料が配置された に対し、 励起 の 角を連続的に 変化させ

が前記 射することにより じる

、 又は反射光の なくとも つを センサで検知し

御機構が、 センサの パターンをもとに励起 の 射角となるよう 角を調整する

。

8

明を利用して 察を行う 置において、 励起 の 角 を自動的に調整する方法であって

面に 料が配置された に対し、 励起 の 角を連続的に 変化させ

が前記 射することにより じる 、 又は表面 の なく とも つを センサで検知し

御機構が、 センサの パタ ンをもとに励起 の 射角となるよう人射角を調整する

。 3０ 9 )

明を利用して 察を行う 置において、 励起 の 角 を自動的に調整する方法であって

面に 料が配置された に対し、 励起 の 角を連続的に 変化させ

が前記 射することにより じる表面 反 射光の なく とも つを センサで検知し

射角 御機構が、 センサの パタ ンをもとに励起 の 射角となるよう 角を調整する

。

０

明を利用して 察を行う 置において、 励起 の 角 を自動的に設定する方法であって

面に 料が配置された に対し、 励起 の 角を連続的に 変化させ

が前記 することにより じる表面 を光セ ンサで検知し

御機構が、 センサの タ ンをもとに励起 の 射角となるよう人射角を調整する

。