WO2010008059A1 - 細胞の保存方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

　細胞の生存率を良好に維持しつつ、細胞の保存前後における処置の迅速さ、簡便さ、及び運搬の容易性の要請に応えうる細胞の保存方法及びその装置を提供する。 　当該保存方法は、保存温度を保存すべき細胞内の水の結晶化温度より高く、及び細胞の活動至適温度以下、並びに保存圧力を０．１1～１０ＭＰａにする方法である。また、当該装置は、圧力媒体を充填することにより圧力を維持できる加圧容器と、該加圧容器内に収めることが可能であって、外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有することにより内部に封入される細胞を加圧できる１個又は２個以上の細胞保存容器と、を有する保存装置である。

Description

細胞の保存方法及びその装置

　本発明は細胞の保存方法及びその装置に関し、詳しくは、細胞を冷凍することなく保存する保存方法の改良及びその装置に関する。

　生体から採取された細胞は、生体外で培養してその生理活性や生理機能を検査したり、製薬開発のための試料として種々の実験に供されたり、移植等の治療に使用されたりしている。特に近年、動物実験への社会的批判から、動物実験を最小限に抑え、実験を培養細胞等で代替することが国際的な潮流となっている。細胞の培養には、生体内での細胞の性質を高度に維持している初代培養と、一定の安定した性質を持った細胞株を作るための継体培養がある。このうち、初代培養細胞については前述の動物実験の代替ニーズが高まってきているが、そのためには、生体内での性質を維持させつつ種々の実験を数多く、さらには同一条件化での比較実験を迅速に実施できるように、細胞を良好な生存率でかつ簡便に保存及び運搬できることが求められている。また、それ以外の細胞においても迅速かつ簡便な保存方法に対する要望は高い。

　細胞の一般的な保存方法として冷凍保存があるが、この方法では前記の「迅速、簡便」という要請を満足できない。近年、食品及び微生物を冷凍せずに保存するため、５００～１００００気圧（約５０～１０００ＭＰａ）の高圧下で保存する方法が開示されている（特許文献１）。また、血液、血小板、心臓等の生物学的物質の保存において、保存溶液と組み合わせて低温下、７０～１０００気圧（約７～１００ＭＰａ）の高圧下での保存方法が開示されている（特許文献２）。これらはいずれもできる限りの低温下でかつ非凍結、そのために超高圧を付与するという技術思想である。

　したがって、これらの保存状態は極度の過冷却状態にあり、当該保存物質を運搬するような場合、運搬中の物理的ショックにより過冷却状態のバランスが崩れ、一気に保存物質中の水分が氷結して当該保存物質がダメージを受けるという危険性を含んでいる。また、該先行技術は細胞そのものについて加圧して保存するという技術ではない。

　以上の事情から、既存の保存方法の不便さを容認して実験に供するか、生体内性質の保持が最優先される場合には実験の都度生物個体から細胞を採取しているのが現状である。

特許２５３３５８４号公報 特表２００２－５２８４６９号公報

　そこで、本発明の目的は、細胞の生存率を良好に維持しつつ、細胞の保存前後における処置の迅速さ、簡便さ、及び運搬の容易性の要請に応えうる細胞の保存方法及びその装置を提供することにある。さらに、本発明の目的には、細胞に生体内又は培養時の性質を維持させつつ種々の実験を数多く実施したい場合、及び同一条件化での比較実験を迅速に実施したい場合等に、数種の細胞を一度に同一条件で保存可能な保存方法及びその装置を提供することも含まれる。

　前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、細胞を一定の圧力下に置くことにより、低温ではあるが細胞内の水の結晶化温度より高く、及び細胞の活動至適温度以下であれば細胞を高生存率で保存できることを見出し、本発明を完成した。

　すなわち、本発明の第１の観点の細胞の保存方法は、保存温度を保存すべき細胞内の水の結晶化温度より高く、及び細胞の活動至適温度以下、並びに保存圧力を０．１1～１０ＭＰａにする保存方法である。ここで、細胞の活動至適温度とは、該細胞が生命活動をする上で好適な温度のことを言い、細胞種によってその温度は異なるが、例えば、動物細胞であれば該動物の体温がそれに該当する。

　好適には、前記保存温度が１℃～３７℃、及び前記保存圧力が０．１1～６．５ＭＰａである。

　好適には、前記保存条件下において液体である培地に、細胞を培地に播種又は懸濁した状態で保存する。

　好適には、外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有する保存容器に細胞を封入し、圧力媒体により前記保存容器を介して細胞を加圧する。

　好適には、前記細胞の保存方法は、外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有する保存容器内に細胞を封入する工程と、該細胞を封入した１個又は２個以上の前記保存容器を加圧容器内に収める工程と、該加圧容器内を前記温度内に維持する工程と、及び前記加圧容器内に圧力媒体を充填することにより前記圧力を維持し、前記保存容器内の細胞を加圧する工程と、を備えている。

　好適には、前記圧力媒体は液体である。

　本発明の第２の観点の細胞保存装置は、圧力媒体を充填することにより圧力を維持できる加圧容器と、該加圧容器内に収めることが可能であって、外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有することにより内部に封入される細胞を加圧できる１個又は２個以上の細胞保存容器と、を有する。

　好適には、前記圧力媒体を流体移送装置により前記加圧容器内に送入することにより、前記加圧容器内の圧力を調整する前記細胞保存装置である。

　好適には、前記圧力媒体が液体である前記細胞保存装置である。

　好適には、前記流体移送装置によって前記圧力媒体の送入及び排出を制御することにより、加減圧速度を調整可能とする前記細胞保存装置である。

　本発明によれば、細胞の生存率を良好に維持しつつ、細胞の保存前後における処置の迅速さ、簡便さ、及び運搬の容易性の要請に応えて細胞を保存することができる。さらに本発明によれば、生体内又は培養時の性質を維持させつつ種々の実験を数多く実施したい場合、及び同一条件化での比較実験を迅速に実施したい場合等に、数種の細胞を一度に同一条件で保存することができる。

本発明の細胞保存装置の一例の全体概略を示す図である。 保存容器を加圧容器に収めた状態であって、両容器の断面図を概略的に表したものである。

　本発明について、その具体的態様を以下に詳述する。本発明で保存できる細胞は特に限定されず、動物細胞、微生物細胞等の保存に適用できるが、保存目的からすれば動物細胞が好ましく、例えば、マウス、ラット、モルモット、鳥類、犬、猫、豚、羊、馬、牛、サル、ヒト等の動物から採取された種々の細胞の保存に適用することができる。細胞種としては、脳細胞、神経細胞、表皮細胞、繊維細胞、筋細胞、肝細胞、及び幹細胞等に適用することができ、また、胚性幹細胞や人口多能性幹細胞に適用することも可能と考えられる。

　本発明の保存方法では、プレートやフラスコのような細胞培養容器の容器壁に前記細胞を接着させた状態若しくは前記接着後に前記フラスコ内を培養液で満たした状態、又は前記細胞を適当な容器内の固体若しくは液体培地に播種した状態、あるいは適当な容器内の液体培地に前記細胞を懸濁させた状態で保存することができる。細胞に均一に圧力を付与するという観点から好ましくは、液体培地に細胞を懸濁させた状態で保存する。液体培地としては、例えばＤｕｌｂｅｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ （通称 ＤＭＥＭ）等を使用する。以後、前記細胞を保存するための容器を「保存容器」と称する。

　細胞に圧力を付与する方法としては、前記保存容器を圧力を付与するための容器（以後、「加圧容器」と称する）内に収め、圧力媒体として気体または液体を用いて前記保存容器内の細胞に圧力を付与する。該加圧容器内へ収める保存容器は１個であってもよく、又は数種の細胞を一度に同一条件下で保存したい場合等には２個以上の複数個であってもよい。装置の設計上からは該加圧容器内へ収める保存容器の個数は１００個以下が好ましい。

　ここで、圧力媒体とは、前記保存容器内の細胞に直接又は間接的に所定の圧力を付与し、及びその圧力を維持するための物質であって、気体又は液体状のものをいう。気体としては、空気、酸素、二酸化炭素、窒素、希ガス又はこれらの混合ガス等を使用することができる。前記気体は細胞種及び保存期間等により適宜選択する。液体としては特に制限は無いが、水、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリン、不凍液、食塩若しくは芒硝等の無機塩水溶液、又は糖類の水溶液、あるいはこれらの混合物等を使用することができる。簡便さ、費用の点で水が好適である。

　圧力媒体として気体を使用する場合の第１の方法は、前記保存容器を開放状態で加圧容器内に入れて圧力を付与する。なおこの場合は、加圧容器を使用せず、保存容器内を前記気体で直接圧力を付与した後密封して加圧状態にしても良い。保存容器の材質としては、付与する圧力に耐えられれば特に制限は無いが、例えば、ガラス、ステンレス、又はポリエチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂、シリコン樹脂、若しくはテフロン（登録商標）等の樹脂製品を使用することができ、付与する圧力の大きさによって適宜選択する。

　圧力媒体として気体を使用する場合の第２の方法は、下記の圧力媒体として液体を使用する場合と同様、細胞に所定の圧力を付与するため外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有する保存容器を使用し、該保存容器は密封して加圧容器内に収める。

　圧力媒体として液体を使用する場合は、細胞が該液体と接触するのを防止するため保存容器は密封して加圧容器内に入れる必要がある。したがってこの場合には、細胞に所定の圧力を付与するため外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有する保存容器を使用する。本要件を満足するものであれば特に制限は無いが、例えば、シリコン樹脂、天然ゴム、ＳＢＲ等の合成ゴム、塩化ビニル樹脂等の合成樹脂、及びテフロン（登録商標）等を使用することができる。この場合、保存容器内の細胞に的確に圧力が伝達されるように、細胞は液体培地に懸濁されて保存容器内に密封されていることが望ましい。

　前記、圧力媒体に気体を使用する場合の第２の方法と液体を使用する場合においては、細胞は保存容器に保存期間等により適宜選択した培地と共に入れて密封され、したがって、圧力媒体とは直接触れないため該圧力媒体は細胞の種類と共に代える必要はない。

　前記保存容器の形態は、内部に圧力が伝達されるものであればどのような形態でもよく、例えば、球形、円筒形、又は点滴バッグのような袋状であってもよい。

　以上のようにして保存容器内に入れられた細胞を、細胞内の水の結晶化温度より高く、及び細胞の活動至適温度以下、並びに０．１1～１０ＭＰａの圧力下で保存する。前記水の結晶化温度は細胞種によって異なるが、一般的には０～－１０℃である。結晶化温度以下では細胞内の水が結晶化して細胞を破壊するおそれがあり、活動至適温度より高い温度では、一般的に細胞にとって不適な環境であり、細胞の生存率が低下するからである。圧力が０．１１ＭＰａより低いときは大気圧で保存する場合と比較して有意差が見られず細胞生存率が低く、１０ＭＰａを超えるとやはり細胞生存率が低いからである。なお、物理的ショックによる細胞中の水分の凍結の不安を払拭する点において、保存温度は－３℃以上が好ましく、保存後すぐに実験等に供する点及び細胞生存率の点で－１℃以上がより好ましく、１℃以上がさらに好ましい。また、前述した通り細胞の種類により至適温度は異なるが、保存後すぐに実験等に供する点で、４０℃以下が好ましく、３７℃以下がさらに好ましい。保存圧力については、細胞生存率の点で０．１１ＭＰａ以上が好ましく、保存時の圧力漏洩のおそれを考慮すると、０．１５ＭＰａ以上がより好ましい。又、最大圧力については、細胞生存率を長期間維持する点で６．５ＭＰａ以下が好ましく、５．５ＭＰａ以下がより好ましい。

　なお、多くの細胞を保存する場合、細胞の保存処理の迅速性と当該細胞の生存率の高さを両立させる上で、保存される細胞を静水圧で均一に加圧する事が好ましいため、前記方法において、保存する細胞を外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を有する保存容器内で液体培地に懸濁させて密封し、該保存容器を加圧容器内に入れて液体圧力媒体で加圧する方法が好ましい。

　以上のようにして圧力が付与された保存容器又は保存容器が収められた加圧容器を、恒温槽、恒温室、又は前記保存温度が維持できれば室内で保存する。

　本発明の細胞保存装置をより具体的に説明すると以下の通りである。まず、加圧容器は圧力調整用のためのバルブを有し、該バルブは加圧と減圧を兼ねるものであっても良く、加圧と減圧が別々のバルブであっても良い。バルブの型式は前記圧力に耐えられれば特に制限は無く、例えば、ゲートバルブ、ボールバルブ、ニードルバルブ、及びストップバルブ等を使用することができる。

　前記加圧容器内を所望の圧力に昇圧する方法としては、圧力媒体が気体の場合は流体移送装置としてコンプレッサー等を使用する方法があり、液体の場合は送液ポンプを使用する方法がある。前記理由により、送液ポンプ等の送液装置を使用して液体圧力媒体により加圧することが好ましい。保存後、保存細胞を取り出すために加圧容器内を大気圧に戻す操作においては、単にバルブを開放して圧力媒体を排出させて減圧してもよく、送液ポンプ等を減圧装置として使用して圧力媒体を排出させてもよい。

　本発明の前記細胞保存装置の好ましい態様は、前記の通り保存細胞に均一に圧力をかけるため、図１に示すような構成からなるものである。すなわち、外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質からなる保存容器、該保存容器を１個又は複数個内部に収めることができる加圧容器、前記液体圧力媒体、該液体圧力媒体を貯蔵する貯蔵槽、該液体圧力媒体を移送する送液ポンプ（流体移送装置）及び配管を基本構成とする。また、圧力付与状態を監視するために、前記加圧容器には内部圧力を表示するための圧力ゲージ等の圧力表示器を取り付けるのが好ましい。さらに、前記加圧容器内部を観察するためにガラス又は透明な樹脂製の窓を適宜取り付けてもよい。

　なお、前記加圧容器には前記圧力調整用のバルブが取り付けられており、加圧処理をした後バルブを閉め、配管及び送液ポンプ等を取り外すことにより、前記加圧容器（内部には細胞保存容器が収められている）のみを運搬することができる。前記配管の管の材質としては特に制限は無く、ステンレス、鉄鋼、銅、真鍮、若しくは塩化ビニル樹脂等が挙げられ、又はテフロン（登録商標）チューブ、シリコンチューブ、若しくは耐圧ゴム管等のフレキシブルタイプの管も好適である。

　本発明の前記細胞保存装置の大きさについては、理論的かつ製造面で可能であれば特に制限は無いが、細胞の保存という目的において、細胞保存容器の容量として０．０１ｍL～数Lが実用的であり、好ましくは０．１ｍＬ～１Ｌである。加圧容器は、該保存容器の大きさ及び該加圧容器へ収める該保存容器の個数に合わせて設計する。

　以上述べた本発明の細胞の保存方法及びその装置によると、生体から採取直後の細胞又は培養中の細胞を迅速かつ簡便に保存環境におくことができる。本発明においては、極端な低温とする必要も無く、極端な高圧とする必要も無く、かつ保存溶液の調整及び該保存溶液と細胞の混合操作も必要としないためである。したがって、後の実験または細胞移植等のために、必要であれば数種の細胞又は培地の異なる同種の細胞等を、同一の条件で迅速に保存環境におくことができ、比較実験の精度向上や生体機能の保持に有効である。

　本発明の方法及び装置により、細胞は１日間から数週間の間高い生存率で保存することができ、保存状態を解除するに当たっても、加圧状態が極端に高圧ではないため短時間に大気圧に戻すことができる。また、該保存細胞は凍結等されていないので、保存期間終了後直ぐにプレートなどに該細胞を接着させる等、迅速に実験準備に着手できる。なお、前記保存期間の長さについては、細胞種によって生命力の強さ又は環境変化に対する適応性に差があるため一概には言えないが、２～４週間保存することが可能である。

　後述の実施例にて詳述するが、本発明の保存方法を用いることにより、圧力を付与せず保存した場合と比較して細胞の生存率が飛躍的に増加する。本効果が得られる理由は、明確ではないが、オタマジャクシが高圧下で仮眠状態になるのが知られているように加圧により細胞が仮眠状態（麻酔効果が働き）になることにより代謝が遅くなり、培地の栄養等の消費も少なく長時間培地も代えることなく生存出来るのではないかと推測される。

　次に、本発明の実施形態について図を参照しながら以下に説明する。前述した図１は本発明の細胞保存装置の代表例を概念的に示したものである。また、図２は保存容器を加圧容器に収めた状態であって、両容器の断面図を表したものである。なお、図２では該保存容器が圧力媒体中で浮遊しているように描かれているが、これは判り易くするためであって、実際は、加圧容器の内壁と接触しているか、又は加圧容器内に保存容器用支持体を設けているときにはその支持体によって支持されている。貯蔵槽１に液体圧力媒体を充填し、送液ポンプ２と配管９で連結する。本実施形態では、液体圧力媒体として水を主体として使用し、配管はテフロン（登録商標）チューブを使用している。

　細胞、例えばラット新生仔脳の初代培養系（２×１０^７／ｄｉｓｈ）を２０～３０日間培養し,グリア細胞が成熟後トリプシン（０．０５％）ではがし取り、保存容器３に液体培地に懸濁させて充填する。液体培地としては、広く種々細胞培養用培地を使用することができ、本実施形態ではＤＭＥＭ培地を使用した。表1に本研究で用いたＧＩＢＣＯ社製のＤＭＥＭ培地の組成を示した。保存容器３は円筒形のものを使用し、筒部分はシリコン樹脂チューブであり、円筒の上面及び底面部はガラス又はテフロン（登録商標）樹脂製の栓を用いて該シリコン樹脂チューブに栓をする構造である。該円筒の上面又は底面に栓をし、細胞懸濁液体培地を充填後もう一方の面も栓をして密封する。

　前記の細胞を封入した保存容器３を加圧容器４内に収める。本実施形態では該加圧容器４はステンレス製の円筒形状で、上面又は底面に開閉ハッチ７を備えており、該ハッチから前記保存容器３を中に収める。本実施形態では、前記保存容器３を前記加圧容器４の中で特に支持はしていないが、加圧容器内に支持体を設けて、保存容器３を例えば加圧容器の中央に支持できるようにすることもできる。複数の保存容器を同時に保存するために支持体を複数加圧容器内に設置することも好適である。

　なお、図１の加圧容器４には前記開閉ハッチとしてビューポート（観察窓）１１付のものを示しているが、窓は別の位置に設置されたものであってもよく、当該窓部はなくてもよい。さらには、開閉ハッチは必須ではなく、保存容器３を加圧容器４内に収めることができれば、その装置構造はどのようなものであってもよい。

　送液ポンプ２と加圧容器４とは、バルブ５を介してテフロン（登録商標）チューブにより連結され、保存容器３を該加圧容器４内に収めて開閉ハッチを閉じた後、バルブ６を開放状態にして、送液ポンプ２により貯蔵槽１の水を加圧容器４内に送入する。あるいは保存容器を収める前に加圧容器内に水を送入してもよい。加圧容器４の内部が完全に水で満たされたらバルブ６を閉じる。この状態で該加圧容器４内の圧力を圧力表示器８でモニターしながら、所望の圧力になるまでさらに水を送入する。このとき、圧力媒体である水は所望の保存温度に保持されていることが望ましい。

　前記細胞保存装置をあらかじめ恒温室に設置し、前記操作終了後そのまま所望の温度で保存してもよく、又は前記したとおり保存容器３を内包している加圧容器４を送液ポンプ等から取り外し、該加圧容器４（保存容器３を内包）のみを恒温槽等で保存してもよい。

　本実施形態では保存容器３及び加圧容器４いずれも円筒形の例を示したが、前述の通り保存容器３は球形や点滴バッグのようなバッグ形状であってもよく、加圧容器４も中が空洞である直方体又は立方体、いわゆるクーラーボックス様であってもよい。すなわち、例えばクーラーボックス様の加圧容器内に点滴バッグ様の保存容器を整列させて複数個収めるような保存方法であってもよい。

　本発明の保存装置は、前記したとおり加圧容器４のみを取り外すことができるので、細胞を採取等した場所と実験場所あるいは治療場所が離れている場合にも簡便に運搬することができる。必要であれば、該加圧容器をさらにクーラーボックス等の恒温容器に入れて所望の温度を保持しつつ運搬することができる。

　保存状態を解除して細胞を取り出す場合は、バルブ５又は６、あるいは両方を開放して液体圧力媒体（本実施形態では水）を排出させて圧力を大気圧に戻せばよい。あるいは大気圧に戻す際の減圧速度を精密にコントロールしたい場合は、送液ポンプを使用して所望の速度で該液体圧力媒体を排出させてもよい。なお、細胞の保存時の温度と保存後の処置時の温度が異なる場合、圧力を大気圧に戻す前に温度調節を行ってもよく、圧力を大気圧に戻した後に温度調節を行ってもよいが、好ましくは温度調節を行ってから大気圧に戻すほうがよい。

　以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳しく説明する。本実験は培養細胞の分離、加圧処理、及び保存後の細胞観察の３つの部分に大きく分けられる。

＜実験方法及び条件＞
１．培養細胞の分離
　試料の細胞としてはラット新生仔脳の初代培養系（２×１０^７ｄｉｓｈ）を２０～３０日間培養し、グリア細胞が成熟した状態のものを使用した。また、細胞数等の条件は細胞をカウントしてなるべく同じになるように調整しているが細胞のロット等で必ずしも同じ条件にはならない。そこで毎回同じ細胞を３つに分け、比較として必ず１つは未加圧（すなわち大気圧；約０．１ＭＰａ）で保存し、残り２つを加圧保存試料とした。

（１）ラット新生仔脳から取り出した初代培養系（２×１０^７ｄｉｓｈ）グリア細胞を３７℃のＣＯ_２インキュベーター（ＷＡＫＥＮＹＡＫＵ　Ｍｏｄｅｌ９１００、ＣＯ_２濃度５％）を用いて２０～３０日間、２５０mL培養フラスコでＤＭＥＭ培地を用いて培養し成熟させた。グリア細胞はフラスコの底面に接着し、突起を伸ばした状態で生存している。

（２）前記（１）の培養フラスコから細胞を取り出すため、まず、該フラスコから培地をアスピレーターで吸い出した。

（３）細胞に付着している培地をさらに洗い流すために、前記フラスコにＰＢＳ（生理食塩水入りのリン酸緩衝液）を６ｍＬ加え軽く振った後、該洗浄溶液をアスピレーターで吸って取り除いた。

（４）酵素反応を利用して前記フラスコに付着している細胞を剥離すために該フラスコに０．０５％トリプシンを２ｍＬ加えた。

（５）トリプシンを効率よく働かせるため３７℃の恒温槽に２～３分間保持した。その後インキュベーターから取り出し、前記フラスコを軽くたたいて細胞を剥がした。

（６）馬の血清２ｍＬとＰＢＳ６ｍＬとを前記フラスコに加えてトリプシンの活性をとめた。

（７）前記フラスコから遠沈管に溶液を移し、日立製遠心機ｈｉｍａｃ－ＣＴ４ｉを用い８００ｒｐｍで７分間遠心して剥離した細胞を沈殿させ、底に沈殿している細胞を吸い取らないように注意しながら上澄み液をアスピレーターで吸い取った。

（８）１．５ｍＬのＤＭＥＭ培地を前記遠沈管に加え、細胞を十分に懸濁させた。

（９）以後の実験で前記細胞懸濁溶液を数個に小分けして使うが、このとき各小分けしたものの該細胞溶液の濃度（細胞の個数）を同じにするためには、でき得る限り該細胞が1個ずつ単独で均一に培地中に分散していることが必要である。そこで、複数個が凝集している細胞の大部分を取り除くため、１００μｍのフィルターでロ過し、該細胞がほぼ１個ずつ単一に分散しているロ液（細胞懸濁液）を回収した。

（１０）ピペットマンで前記細胞懸濁液を少量取り、均一に分布するように血球計算板に入れ、定法に従って顕微鏡で視野内の細胞数を数え、細胞数を計算した。

（１１）前記（１０）で計算した細胞数をもとに細胞濃度が４×１０^６～６×１０^６個／３００μLになるようにＤＭＥＭ培地で濃度を調整した。

（１２）前記（１１）の細胞懸濁液を３００μLずつ均一に量り取って、保存容器であるシリコンチューブに入れ、空気が入らないように注意してテフロン（登録商標）のふたで密封した。

２．加圧処理（保存条件）
（１３）加圧容器（最大加圧可能圧力１５ＭＰａ）に、各保存温度に設定した水（圧力媒体）を入れた。前記温度はそれぞれ０℃、４℃、２０℃又は３７℃のいずれかである。なお、保存温度が０℃のときには、圧力媒体が氷るのを防ぐため、水にエチレングリコールを少量加えたものを使用した（なお、以後、該水－エチレングリコール混合液も含め本実施例及び比較例の圧力媒体は水と総称する）。

（１４）前記（１２）で準備した保存容器を水で満たした前記加圧容器に収めた。

（１５）島津製ＨＰＬＣ用送液ポンプＬＣ６Ａを使用して、水を送液して加圧容器内部を静水圧で加圧した。０．１５～５．０ＭＰａ／分の加圧速度で目的の保存圧力まで加圧した。圧力は山崎製作所製の圧力ゲージで測定した。保存圧力は、下記表２～４に示した各圧力とした。

（１６）各設定保存温度及び設定保存圧力下で１日間、４日間又は５日間保存した。

３．保存後の細胞観察
（１７）保存容器を加圧容器から取り出した後、テフロン（登録商標）のふたを取り外し、細胞を均一に懸濁させた後、液体培地と共にピペットで吸い取り、１５ｍLのコーニングチューブに移した。

（１８）前記コーニングチューブに血清入りのＤＭＥＭ培地を３ｍＬ加えて細胞の濃度を１．５×１０^５～２×１０^５個／３００μLに希釈後、１２穴の培養用プレートの３ヶ所の穴に分けて前記培地と共に播いた。

（１９）前記培養用プレートを３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に入れて、該保存後の細胞を２日間培養した。

（２０）細胞の生存率の評価は次のように行った。本実施例で用いた細胞は培養用プレートから剥離すると球形の形状になるという性質があるので、保存時には該細胞は球状で液体培地中に懸濁している。保存後、該細胞が生存していれば、再度培養用プレートに播くと１～２日ほどでプレートの底に接着し、突起をのばして成長するのが観察される。その反面、生存していなければ球状で液体培地中に浮遊したままである。そこで、前記（１９）の培養後にプレート底面に接着した細胞の数を顕微鏡で数えて生存細胞数とする。一方、前記「１．培養細胞分離」で調製した細胞懸濁液を保存せず直ぐに、前記（１８）及び（１９）の処理を行った場合の生存細胞数をブランクとし、これに対する生存細胞数の割合を百分率で表したものを細胞の生存率とした。

　細胞生存率の良否は次の基準で評価した。すなわち、◎（生存率：６０％以上）、○（生存率：６０％未満及び３０％以上）、△（生存率：３０％未満及び１０％以上）、×（生存率：１０％未満）とした。

実施例１～４
　上記実験方法及び条件に従い、保存温度４℃下、保存圧力０．１１、１．０、７．５、又は１０．０ＭＰａ（順に実施例１、２、３、４、以後同様）で１日間保存した後、細胞生存率を測定した。その結果、いずれの場合も細胞生存率は６０％以上で良好であった。

比較例１～２
　保存圧力を０．１又は１４ＭＰａ（順に比較例１、２、以後同様）とする以外は実施例１と同じ条件で保存した。その結果、０．１ＭＰａ下では細胞の生存率は約２０％であり、１４ＭＰａでは１０％未満であった。

実施例５
　保存温度を３７℃、保存圧力を１０ＭＰａとする以外は実施例１と同じ条件で保存した。その結果、細胞生存率は約５０％であった。

比較例３～４
　保存温度を４１℃、保存圧力を０．１１又は１０ＭＰａとする以外は実施例１と同じ条件で保存した。その結果、いずれの場合の細胞生存率もほぼ０％であった。

実施例６～７
　上記実験方法及び条件に従い、保存温度０℃下、保存圧力０．１１又は１０．０ＭＰａで４日間保存した後、細胞生存率を測定した。その結果、いずれの場合も細胞生存率は６０％以上で良好であった。

比較例５～６
　保存圧力を０．１又は１１ＭＰａとする以外は実施例６と同じ条件で保存した。その結果、いずれの場合の細胞生存率も１０％未満であった。

実施例８～１１
　保存温度を４℃、保存圧力を０．２、０．５、１．０、又は６．５ＭＰａとする以外は実施例６と同じ条件で保存した。その結果、保存圧力を０．２、０．５又は１．０ＭＰａの場合の細胞生存率はいずれも６０％以上で良好であった。６．５ＭＰａの場合は約５０％であった。

比較例７
　保存温度を４℃、保存圧力を０．１ＭＰａとする以外は実施例６と同じ条件で保存した。その結果、細胞生存率はほぼ０％であった。

実施例１２
　保存温度を２０℃、保存圧力を０．６ＭＰａとする以外は実施例６と同じ条件で保存した。その結果、細胞生存率は６０％以上で良好であった。

比較例８
　保存温度を２０℃、保存圧力を１１ＭＰａとする以外は実施例６と同じ条件で保存した。その結果、細胞生存率はほぼ０％であった。

実施例１３
　保存温度を３７℃、保存圧力を０．１１ＭＰａとする以外は実施例６と同じ条件で保存した。その結果、細胞生存率は６０％以上で良好であった。

実施例１４
　上記実験方法及び条件に従い、保存温度４℃下、保存圧力３．０ＭＰａで５日間保存した後、細胞生存率を測定した。その結果、細胞生存率は約５０％であった。

比較例９～１０
　保存圧力を０．１又は１１ＭＰａとする以外は実施例１４と同じ条件で保存した。その結果、いずれの場合の細胞生存率もほぼ０％であった。

　保存期間１日間の結果を表２に示す。

　保存期間４日間の結果を表３に示す。

　保存期間５日間の結果を表４に示す。

　細胞は、医療分野、製薬分野、畜産分野、及び生化学等の学術分野など広範な範囲で各種目的の実験等に供されている。又、移植治療等にも重要な役割を担っている。これら細胞を使った実験、例えば培養実験などにおいて一時的に実験を中断して保存が必要になる場合がある。このような場合において、単に冷蔵するだけでは細胞の生存率が低いばかりでなく、細胞によっては保存ができないものもある。一方、細胞を冷凍したり保存溶液を使用したりする場合には前述したとおり、保存及び実験再開の迅速性に欠け当該方法を採用できない場合もある。本発明の保存方法によればこれらの欠点を解決し、迅速かつ簡便に保存及び実験の再開ができるため、例えば、生体内での性質を維持している初代培養細胞を迅速に実験に供したい場合等、広範な分野での細胞保存の要請に応えることができる。

１…液体圧力媒体貯蔵槽、２…送液ポンプ（流体移送装置）、３…保存容器、４…加圧容器、５、６…バルブ、７…開閉ハッチ、８…圧力表示器、９…配管、１０…液体培地に懸濁した細胞、１１…観察窓

Claims (12)

1. 　保存条件において、保存温度を保存すべき細胞内の水の結晶化温度より高く、及び細胞の活動至適温度以下、並びに保存圧力を０．１1～１０ＭＰａにする、
   　細胞の保存方法。
2. 　前記保存条件下において液体である培地に、細胞を播種又は懸濁した状態で保存する、
   　請求項１に記載の細胞の保存方法。
3. 　外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を具備する保存容器に細胞を封入し、圧力媒体により前記保存容器を介して細胞を加圧する、
   　請求項１又は２に記載の細胞の保存方法。
4. 　前記保存容器内に細胞を封入する工程と、
   　該細胞を封入した１個又は２個以上の前記保存容器を加圧容器内に収める工程と、
   　該加圧容器内を前記温度内に維持する工程と、
   　及び前記加圧容器内に圧力媒体を充填することにより前記圧力を維持し、前記保存容器内の細胞を加圧する工程と、を具備する、
   　請求項３に記載の細胞の保存方法。
5. 　前記圧力媒体は液体である、
   　請求項３に記載の細胞の保存方法。
6. 　前記圧力媒体は液体である、
   　請求項４に記載の細胞の保存方法。
7. 　保存温度が１℃～３７℃、及び保存圧力が０．１1～６．５ＭＰａである、
   　請求項１に記載の細胞の保存方法。
8. 　圧力媒体を充填することにより圧力を維持できる加圧容器と、
   　該加圧容器内に収めることが可能であって、外部からの圧力を内部の物質に伝達できる材質を具備することにより内部に封入される細胞を加圧できる１個又は２個以上の細胞保存容器と、を有する、
   　細胞保存装置。
9. 　前記圧力媒体を流体移送装置により前記加圧容器内に送入することにより、前記加圧容器内の圧力を調整する、
   　請求項８に記載の細胞保存装置。
10. 　前記圧力媒体は液体である、
    　請求項８又は９に記載の細胞保存装置。
11. 　前記流体移送装置によって前記圧力媒体の送入及び排出を制御することにより、加減圧速度を調整可能とする、
    　請求項９に記載の細胞保存装置。
12. 　前記流体移送装置によって前記圧力媒体の送入及び排出を制御することにより、加減圧速度を調整可能とする、
    　請求項１０に記載の細胞保存装置。

Images