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WO2010004962A1 - 線維筋痛症の検査法 - Google Patents

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WO2010004962A1
WO2010004962A1 PCT/JP2009/062305 JP2009062305W WO2010004962A1 WO 2010004962 A1 WO2010004962 A1 WO 2010004962A1 JP 2009062305 W JP2009062305 W JP 2009062305W WO 2010004962 A1 WO2010004962 A1 WO 2010004962A1
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WO
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fibromyalgia
peptide
blood
index
amino acid
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西岡　久寿樹
加藤　智啓
裕樹 藤澤
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Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
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Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
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    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing or examining fibromyalgia using a specific peptide in blood as an index (biomarker), a method for evaluating or determining a fibromyalgia drug using the peptide as an index, and the like.
  • Fibromyalgia (FM: Fibromyalgia Syndrome, sometimes referred to as FMS, hereinafter referred to as “fibromyalgia” or “FM”) is chronic, strong systemic pain, Alternatively, it is a disease whose main symptom is partial but wide-ranging chronic pain, and pain may be seen not only in muscle tissue but also in the skin. Fibromyalgia often involves not only such generalized chronic pain, but also fatigue, fatigue, depression, anxiety, morning stiffness, muscle stiffness, sleep disorders, and the like. Also accompanied by symptoms such as headache, facial pain, cognitive impairment (memory difference, lack of concentration), gastrointestinal complaints (visceral pain, digestive disorders, flatulence), frequent urine, diarrhea, constipation, dysmenorrhea Sometimes.
  • Fibromyalgia has a variety of subjective symptoms, but there are not many objective findings other than the characteristic generalized tenderness.
  • imaging examinations such as MRI and CT, pathological examination of myalgia sites, various immunology
  • virological and endocrinological examinations There are few abnormalities even after laboratory, virological and endocrinological examinations. For example, unlike rheumatoid arthritis, edema is not observed, and patients complain of extensive pain in the extremities and trunks despite the normal range of blood indicators of inflammation, ie, blood sedimentation and CRP.
  • Fibromyalgia is a disease that is very different from many common painful diseases caused by damaging or potentially noxious stimuli in living tissues, and there are no pathological findings associated with the pain site .
  • fibromyalgia In the treatment of fibromyalgia, most anti-inflammatory analgesics such as non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) frequently used for general pain treatment are not very effective.
  • various drugs such as muscle relaxants, opioid analgesics, and anxiolytics have been tried, but their effectiveness varies greatly from person to person, and no significant effect has been observed. Therefore, the treatment of fibromyalgia currently includes prescription of antidepressants or NSAIDs, administration of local anesthetics and steroids to the site of pain, massage, exercise therapy, sleep therapy, etc. Not too much.
  • the cause of fibromyalgia has not been identified, and there are large individual differences in therapeutic effects, and no therapeutic methods have been established.
  • the diagnostic method for fibromyalgia is generally based on the classification criteria proposed by the American College of Rheumatology in 1990 at this stage. According to this standard, pain is observed in any of the five parts of the upper body and lower body, the right and left bodies, and the spine or sternum from the umbilicus, and they persist for at least 3 months, or Fibromyalgia is defined as a painful sensation in 11 or more places with a gentle load of 4 kg applied to the 18 tender points in the whole body.
  • An object of the present invention is to provide a method for diagnosing or examining fibromyalgia using a specific peptide in blood as an index, and a method for effectively evaluating or judging a fibromyalgia drug using the peptide as an index. There is.
  • the inventors of the present invention have found peptides showing specific expression levels of the disease by peptidome analysis of blood of fibromyalgia patients and healthy individuals and comparing the peptide expression levels in both serum samples. .
  • the present invention is a method for diagnosing or examining fibromyalgia using such a peptide as an index (biomarker).
  • the present invention provides a method for diagnosing or examining fibromyalgia using a peptide showing a specific expression level in the blood of a fibromyalgia patient as an index (biomarker). Further, the present invention provides a method for evaluating or determining the effect of a test drug on fibromyalgia using the expression level of these peptides in fibromyalgia in blood as an index.
  • the present invention relates to a method for diagnosing or testing fibromyalgia that analyzes a specific peptide present in blood (serum) collected from a human as an index (biomarker), and more specifically, matrix-assisted laser desorption / ionization
  • the present invention relates to a method for diagnosing or examining fibromyalgia, in which a peptideome analysis in a sample is performed using a time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF / MS).
  • MALDI-TOF / MS time-of-flight mass spectrometer
  • the method for diagnosing or examining fibromyalgia of the present invention can be performed by a peptide analysis method using mass spectrometry or the like that is frequently used.
  • the measurement sample may be appropriately pretreated as necessary.
  • pretreatment such as removing high molecular weight substances from the collected serum by ultrafiltration or the like can be performed. After the pretreatment, it is adsorbed on a reversed-phase resin-fixed chip or the like and eluted with a solvent to collect fractions, and the obtained peptide fraction is used as a measurement sample.
  • a method using mass spectrometry such as MALDI-TOF / MS, which is frequently used, can be used.
  • diagnosis or examination of fibromyalgia or evaluation or determination of a drug for fibromyalgia is performed using any of the peptides defined in (1) to (10) below as an index (biomarker). be able to.
  • Peptides in blood are measured by mass spectrometry, and mass to charge ratio (m / z) is 650.0, 656.0, 657.0, 666.0, 672.0, 679.4, 685.4, 737.5, 795.6, 810.6, 825.5, 853.7, 854.1, 861.2, 861.5, 868.4, 890.0, 911.8, 912.1, 921.4, 942.6, 949.3, 964.6, 969.8, 970.5, 1027.9, 1028.7, 1042.5, 1055.9, 1085.9, 1086.7, 1144.8, 1741.1, 1789.60, 1898.8, 1944.7, 2012.2, 2013.7, 2030.8, 2034.1, 2046.6, 2053.4, 2056.1, 2071.2, 2073.9, 2083.6, 2118.0, (2130.2), A peptide that is 2187.2, 2212.0, 2253.9, 2268.5, 2270.7, 2359.5, 2534.1, 2570.5, 260
  • the peptide in the blood is measured by mass spectrometry, and the mass to charge ratio (m / z) is 615.6, 637.4, 1020.6, 1021.3, 1061.6, 1077.8, 1206.8, 1208.0, 1262.0, 1350.7, 1350.8, 1419.6, 1420.4, A peptide that is 1465.9, 1467.6, 1521.0, 1547.6, 1562.9, 1563.0, 1564.5, 1618.9, 1972.2, 2452.7, 2452.8, 2454.6, 2646.9, 2770.5, 2934.0, 2981.7, 3193.1 or 3263.9. These peptides are present in a smaller amount in the blood (serum) of FM patients than in healthy individuals.
  • the mass-to-charge ratio values in the above (1) and (2) can be allowed to be ⁇ 2 m / z, and can be recognized as the same peptide within this allowable range. .
  • a peptide in blood corresponding to the amino acid sequence of 438-456th, 439-456th, 440-456th, or 458-477th of high molecular weight kininogen.
  • a peptide in blood corresponding to the amino acid sequence at positions 212 to 232 of apolipoprotein E.
  • Serum collected from 19 patients diagnosed with fibromyalgia (FM) Clinprot ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ System (Bruker Daltonics) using a matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF / MS) ) was used for peptidome analysis in the following manner. As normal controls, sera from 20 healthy subjects were used, and the reagents used were mass spectrometry grades recommended by Bruker Daltonics.
  • Sample preparation A Distilled water diluted sample (Sample A) Serum from FM patients and serum from healthy individuals are each diluted with distilled water, and high molecular weight substances (5,000 Da or more) are removed by ultrafiltration using a centrifugal filter, and then adsorbed on the reverse-phase resin-fixed chip Ziptip C18. The peptide fraction was collected by elution with 50% acetonitrile / 0.1% TFA and used for mass spectrum measurement. For peptide identification, peptide fractions that were adsorbed on Ziptip C18 and then eluted stepwise with 10, 20, 30, 40, 50% acetonitrile / 0.1% TFA were used.
  • sample B 10% Acetonitrile diluted sample
  • serum of FM patients and serum of healthy individuals are each diluted with 10% acetonitrile, and high molecular weight substances (5,000 Da or more) are ultrafiltered using a centrifugal filter. After removal, the peptide fraction was recovered by adsorption onto a reverse phase resin-immobilized chip Ziptip C18 and eluted with 30% or 60% acetonitrile / 0.1% TFA, and used for measurement and identification of mass spectra.
  • Clinpro tool 2 was not recognized as a signal, but for 3 signals that showed a tendency to increase in FM patients (shown in parentheses below), 2 were HMW kininogen Origin, one was confirmed to be a sequence derived from ITIH4. The results of the above test were as follows.
  • peptide signals one was identified as a peptide signal whose expression level was significantly high in FM patients and was a sequence derived from complement C3f.
  • four peptide signals with significantly low expression levels were identified in FM patients, of which three were sequences derived from fibrinopeptide A, which was also detected in sample A, and the other was transthyretin chain A
  • the sequence was derived from. The results of the above test were as follows.
  • Table 4 shows the amino acid sequences (indicated by one letter) and the sequence numbers of the peptide signals shown in Tables 1 to 3 above.
  • peptides with significantly high expression levels in FM patients are derived from HMW kininogen, ITIH4, ApoE and complement A peptide derived from C3f was identified, and a peptide with a significantly low expression level in FM patients was identified as a peptide derived from fibrinopeptide A and transthyretin chain A.
  • HMW kininogen ITIH4
  • ApoE and complement A peptide derived from C3f was identified, and a peptide with a significantly low expression level in FM patients was identified as a peptide derived from fibrinopeptide A and transthyretin chain A.
  • the physiological functions of these identified proteins and peptides are described below.
  • Kininogen Kininogen is a plasma protein consisting of 644 amino acids in humans and is known to have various physiological functions such as calcium binding, protease inhibition, cell adhesion inhibitory factor, and antithrombotic factor.
  • kallikrein is known to produce bradykinin from the fourth domain of kininogen, causing pain, vasodilation, increased vascular permeability, acute inflammatory symptoms, and the like. All of the peptides derived from kininogen identified this time are sequences contained in the fifth domain that play an important role in binding to a negatively charged surface, and are highly histidine-rich and highly hydrophilic.
  • ITIH4 ITIH4 is an inter alpha inhibitor It is a protein consisting of 930 amino acids belonging to the family, and is known to increase in serum after trauma, but is different from other molecules in this family in that it does not have a bikunin chain with protease inhibitory activity. Yes.
  • Apolipoproteins are a group of proteins that bind to lipoproteins and act as coenzymes, or activation of enzymes involved in lipoproteins recognition and lipid metabolism. There are 5 types from A to E depending on the structure and function, and further divided into subclasses. ApoE is a protein that serves as a marker when lipoproteins are recognized by cells. Recently, the relationship with dementia has been studied.
  • Fibrinopeptide A is a peptide that is cleaved and produced by thrombin from the glycoprotein fibrinogen alpha that is present in large amounts in plasma, and is used in the serum as a marker for the initiation phase of coagulation.
  • Complement C3f It is a peptide fragment excised from C3b, a protein of the complement system present in blood.
  • TTR chain A TTR another protein with low levels in FM patients
  • Chain A is present in blood and cerebrospinal fluid and is considered to be a carrier protein such as thyroid hormone and retinol.
  • familial TTR-related amyloidosis it has been reported that TTR gene mutations are involved in the disease, and in senile amyloidosis, wild-type TTR is a protein that constitutes amyloid.
  • amyloidosis neurological symptoms such as polyneuropathy and carpal tunnel syndrome are also observed as symptoms, and it is possible that a mechanism common to FM may exist.
  • amyloid deposition occurs secondary to inflammatory diseases such as rheumatism, it is possible that abnormalities in TTR degradation may occur in FM patients due to some change including inflammation.
  • peptides whose expression levels were different between the two and the proteins and peptides from which these peptides were derived are the cause of FM patients. Or it may be related to the condition. Therefore, there is a possibility that it can be used for FM diagnosis or examination by confirming the change in the expression level of these peptides.
  • the effect of these drugs on FM can be evaluated or determined using the expression level of these peptides as an index.
  • the method of the present invention can detect a peptide whose expression varies in the blood of a fibromyalgia patient compared to a healthy person, and can identify the protein or peptide from which it is derived. It was. Therefore, the present invention uses these identified peptides as fibromyalgia indices (biomarkers), and analyzes or synthesizes patient sera to analyze or test fibromyalgia or fibromyalgia. This is useful as a method for evaluating or judging pain medications.

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Abstract

本発明の目的は、血液中の特定のペプチドを指標として線維筋痛症を診断又は検査する方法並びに前記ペプチドを指標にして線維筋痛症用薬剤を効果的に評価又は判定する方法を提供することにある。本発明は、線維筋痛症患者の血液中において特異的な発現量を示すペプチドを線維筋痛症の指標（バイオマーカー）として利用して、患者血清をペプチド解析することにより、線維筋痛症の診断又は検査し、或いは線維筋痛症用薬を評価又は判定する方法として有用性が高いものである。

Description

線維筋痛症の検査法
　本発明は、血液中の特定のペプチドを指標（バイオマーカー）として線維筋痛症を診断又は検査する方法並びに当該ペプチドを指標にして線維筋痛症用薬剤を評価又は判定する方法等に関する。
近年、生命科学の研究においては、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析といったメッセンジャーRNAや蛋白質の遺伝子産物を網羅的に解析する手法が進展している。特にプロテオーム解析では、新しい疾患マーカーや治療標的が見出されるという成果をあげてきている。他方、ペプチドにも生体内でホルモン、循環調節因子、神経伝達・調節因子等として多様な反応に関与し、生体の情報伝達・制御を担っているものがあり、最近では疾患特異的な低分子ペプチドが存在することもわかってきている。そのため、プロテオーム解析等と同様、ペプチドーム解析が疾患マーカーの開発、病態の解明、新しい治療標的の特定において有用な手法として期待されてきている。
　線維筋痛症（Fibromyalgia、FM：線維筋痛症候群 Fibromyalgia Syndrome、FMSと呼ばれることもあるが、以下「線維筋痛症」又は「FM」と呼ぶ。）は、慢性的で全身性の強い疼痛、あるいは部分的でも広範囲の慢性疼痛を主症状とする疾患であり、筋肉組織だけでなく、皮膚に痛みがみられることもある。線維筋痛症では、このような全身性の慢性疼痛だけでなく、疲労感、倦怠感、鬱、不安感、朝のこわばり感、筋肉の硬直、睡眠障害等を伴うことが多い。また、頭痛、顔面痛、認識障害（記憶違い、集中力の欠如）、胃腸の愁訴（内臓痛、消化器系の障害、鼓腸）、頻尿、下痢、便秘、月経困難症等の症状を伴うこともある。
　米国の一般人口に対する線維筋痛症の有病率は2％（女性3.4％、男性0.5％）と報告されており、カナダでは一般人口の2.7％（女性4.9％、男性1.6％）とされている。日本でも有病率は人口比1.7％とされ、米国にほぼ匹敵する頻度を有することがわかってきている。この疾患は概ね25～50歳の女性に好発し、患者の約80％が女性である。線維筋痛症は自覚症状が多彩である反面、他覚所見は特徴的な全身の圧痛以外にはあまりなく、MRI、CT等の画像検査のほか、筋痛部位の病理検査、各種の免疫学的、ウイルス学的、内分泌学的検査をしてもほとんど異常がみられない。例えば、リウマチ性関節炎と異なり浮腫はみられず、炎症の程度を示す血液中の指標、すなわち血沈やCRPが正常範囲にもかかわらず、患者は四肢や体幹の広範囲にわたる疼痛を訴える。
　線維筋痛症の発症の原因やメカニズムについては、現在のところ、ストレス等の心理的要因、ウイルス感染、遺伝、免疫異常や神経伝達物質の異常等が推察されているが、まだ解明されていない。線維筋痛症は、生体組織の損傷あるいは損傷の可能性のある侵害刺激によってもたらされる多くの一般的疼痛性疾患と極めて異なる疾患であり、疼痛部位には関連する病理学的所見は認められない。
　線維筋痛症の治療には、一般の疼痛治療に繁用されている非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）等の消炎鎮痛剤のほとんどはあまり効果が認められない。また、筋弛緩薬、オピオイド性鎮痛薬、抗不安薬等様々な薬剤が試用されてもいるが、その有効性は個人差が大きく、顕著な効果は認められていない。従って現在、線維筋痛症の治療には、抗うつ薬またはこれとNSAIDsの処方、発痛部位への局所麻酔薬やステロイド剤の投与、マッサージ、運動療法、睡眠療法等が取り入られているに過ぎない。ただし、いずれの治療剤、方法においても、線維筋痛症の原因が特定されていないこともあり、治療効果の個人差が大きく、治療法として確立されてはいない。
　線維筋痛症の診断方法としては、現段階では米国リウマチ学会が1990年に提唱した分類基準によるのが一般的である。この基準では、臍部を基点として上半身と下半身、右半身と左半身、さらに脊椎部または胸骨部の５ヶ所の何れの部位にも痛みを認め、それらが少なくとも3ヶ月以上持続する場合、あるいは、規定された全身18ヶ所の圧痛点に4kgの緩やかな荷重を加え、11ヶ所以上で痛覚を感じた場合を線維筋痛症とする。このような圧痛点の刺激による診断以外には、血液、レントゲン、CRP（炎症反応）、筋電図、筋肉の酵素、CT、MRIを検査しても異常がなく、線維筋痛症の診断検査はないため、患者の多くは診断されるまで、何ヶ所もの医療機関を何年にもわたってまわり続けるような状況であった。
　上述したように、現在のところ、線維筋痛症の発症の原因とメカニズムが明確でないこともあって、線維筋痛症を特定の指標によって的確に診断できるような臨床的検査方法はなく、またある薬剤が線維筋痛症に有効かどうかを効果的に評価又は判定する方法も存在しない。そのため、医療の現場において、そのような診断又は検査方法や評価又は判定方法が求められている。
　本発明に関連する先行技術は存在しない。
　本発明の目的は、血液中の特定のペプチドを指標として線維筋痛症を診断又は検査する方法並びに前記ペプチドを指標にして線維筋痛症用薬剤を効果的に評価又は判定する方法を提供することにある。
本発明者らは、線維筋痛症患者及び健常人の血液をペプチドーム解析して、両血清サンプル中のペプチド発現量を比較することにより、当該疾患に特異的な発現量を示すペプチドを見出した。本発明は、このようなペプチドを指標（バイオマーカー）として利用した線維筋痛症の診断又は検査方法である。
　本発明は、線維筋痛症患者の血液中において特異的な発現量を示すペプチドを指標（バイオマーカー）として利用した線維筋痛症の診断又は検査方法を提供するものである。また、線維筋痛症に対するこれらペプチドの血液中における発現量を指標として、被験薬の線維筋痛症に対する効果を評価又は判定する方法を提供するものである。
　本発明は、ヒトから採取した血液（血清）中に存在する特定のペプチドを指標（バイオマーカー）として解析する線維筋痛症の診断又は検査方法に関し、より具体的にはマトリックス支援レーザー脱離イオン化時間飛行型質量分析装置（MALDI-TOF/MS）を用いて試料中のペプチドーム解析を行う線維筋痛症の診断又は検査方法等に関する。
　本発明の線維筋痛症の診断又は検査方法は、繁用されているマススペクトロメトリー等を用いたペプチド解析の方法により行うことができる。測定試料は必要に応じて適宜前処理を施してもよく、例えば、採取した血清から限外ろ過等により高分子量物質を除去する等の前処理を行うことができる。該前処理の後、逆相樹脂固定チップ等に吸着させ溶媒で溶出して分画回収し、得られたペプチド画分を測定試料とする。ペプチド解析においては、MALDI-TOF/MS等の繁用されているマススペクトロメトリー等を用いた方法を利用することができる。
　本発明においては、以下の（１）から（１０）に定めるいずれかのペプチドを指標（バイオマーカー）として、線維筋痛症の診断又は検査、或いは線維筋痛症用薬の評価又は判定を行うことができる。
（１）血液中のペプチドをマススペクトロメトリーで測定し、質量電荷比（ｍ／ｚ）が650.0、656.0、657.0、666.0、672.0、679.4、685.4、737.5、795.6、810.6、825.5、853.7、854.1、861.2、861.5、868.4、890.0、911.8、912.1、921.4、942.6、949.3、964.6、969.8、970.5、1027.9、1028.7、1042.5、1055.9、1085.9、1086.7、1144.8、1741.1、1789.60、1898.8、1944.7、2012.2、2013.7、2030.8、2034.1、2046.6、2053.4、2056.1、2071.2、2073.9、2083.6、2118.0、(2130.2)、
2187.2、2212.0、2253.9、2268.5、2270.7、2359.5、2534.1、2570.5、2600.8、2604.1、2625.4、2726.2、2819.4、3325.9、3364.2又は3380.1であるペプチド。これらのペプチドは、FM患者の血液（血清）中において健常人より多量に存在する。
（２）血液中のペプチドをマススペクトロメトリーで測定し、質量電荷比（ｍ／ｚ）が615.6、637.4、1020.6、1021.3、1061.6、1077.8、1206.8、1208.0、1262.0、1350.7、1350.8、1419.6、1420.4、1465.9、1467.6、1521.0、1547.6、1562.9、1563.0、1564.5、1618.9、1972.2、2452.7、2452.8、2454.6、2646.9、2770.5、2934.0、2981.7、3193.1又は3263.9であるペプチド。これらのペプチドは、FM患者の血液（血清）中において健常人より少量存在する。
　なお、本発明においては、上記（１）及び（２）における質量電荷比の値は、±２ｍ／ｚが許容可能であり、この許容範囲内であれば同一のぺプチドとして認め得るものである。
（３）高分子キニノーゲン、フィブリノーゲン、インターアルファトリプシンインヒビターＨ４、アポリポプロテインＥ、補体Ｃ３ｆ又はトランスチレチンＡ鎖に由来する血液中のペプチド。
（４）高分子キニノーゲンの４３８～４５６番目、４３９～４５６番目、４４０～４５６番目又は４５８～４７７番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチド。
（５）フィブリノーゲンα鎖の１９～３５番目、２０～３５番目、２１～３５番目、２２～３５番目、２４～３５番目、２６～３５番目又は２８～３５番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチド。
（６）インターαトリプシンインヒビターＨ４の６２６～６４２番目又は６６９～６８７番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチド。
（７）アポリポプロテインＥの２１２～２３２番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチド。
（８）補体Ｃ３ｆの９～１６番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチド。
（９）トランスチレチンＡ鎖の１０１～１２３番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチド。
（１０）アミノ酸配列が配列番号１～１５いずれかである血液中のペプチド。
線維筋痛症（FM）と診断された患者19名から採取された血清について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化時間飛行型質量分析装置（MALDI-TOF/MS）によるペプチドーム解析システムClinprot System（Bruker Daltonics社）を用いて、以下の要領でペプチドーム解析を行った。尚、正常対照としては健常人20名の血清を用い、また、試薬はいずれもBruker Daltonics社が推奨する質量分析グレードのものを使用した。
（１）サンプルの調製
A）蒸留水希釈サンプル（サンプルA）
FM患者の血清及び健常人の血清を各々蒸留水で希釈し、遠心ろ過フィルターを用い高分子分子量物質（5,000Da以上）を限外ろ過により除去した後、逆相樹脂固定チップZiptip C18に吸着させ、50％アセトニトリル／0.1％TFAで溶出させてペプチド画分を回収し、マススペクトルの測定に用いた。尚、ペプチドの同定のためには、Ziptip C18に吸着させた後、10、20、30、40、50％アセトニトリル／0.1％TFAで段階的に溶出させたペプチド画分を用いた。
B）10％アセニトリル希釈サンプル（サンプルB）
キャリア蛋白質に結合するペプチドの回収を高める目的で、FM患者の血清及び健常人の血清を各々10％アセトニトリルで希釈し、遠心ろ過フィルターを用い高分子分子量物質（5,000Da以上）を限外ろ過により除去した後、逆相樹脂固定チップZiptip C18に吸着させ、30％または60％のアセトニトリル／0.1％TFAで溶出させてペプチド画分を回収し、マススペクトルの測定及び同定に用いた。
（２）MALDI-TOF/MSによるマススペクトル測定
上記（１）で得られたペプチド画分（サンプルA及びB）を各々マトリクス溶液（α-Cyano-4-Hydoroxycinnamic Acid）と混合し、ターゲットプレート上に塗布して、MALDI-TOF/MS （Ultraflex TOF/TOF、Bruker Daltonics社）を使用し、マススペクトル（測定範囲；サンプルA：m/z 800-3,500　サンプルB：m/z
600-3,500）を測定した。
（３）発現変動ピークの検出と同定
上記（２）で測定したマススペクトルはClinPro Tool 2（Bruker Daltonics社）を用いて解析し、FM患者の血清と健常人の血清とを比較して、ペプチド発現量に変化の見られたピークをシグナルとして認識した。これらのペプチトシグナルについて、Post Source Decay (PSD) MS/Msによりアミノ酸配列を解析し、蛋白質・ペプチド同定用ソフトウエアMascot（Matrix Science社）を用いて同定を行った。
上記試験の結果は次の通りであった。
（A）サンプルA
FM患者血清サンプルと健常人血清サンプルを比較・解析した結果、ペプチドシグナルが72個検出された。このうち、FM患者で発現量が健常人に比して有意に高いペプチドシグナルは31個存在し、このうち4個について同定され、2個が high
moleculer weight (HMW) kininogen由来、1個がinter alpha trypsin inhibitor H4（ITIH4）由来、1個がapolipoprotein E（ApoE）由来の配列であった。一方、FM患者で発現量が健常人に比して有意に低いペプチドシグナルは17個存在し、このうち6個について同定され、いずれもfibrinogen由来の配列であった。
また、Clinpro tool 2ではシグナルとは認識されなかったが、FM患者で増加する傾向の見られた3個のシグナルについては（下記で括弧付の質量電荷比で示した）、2個はHMW kininogen由来、1つはITIH4由来の配列であることが確認された。
上記試験の結果は次の通りであった。
〔FM患者で発現量が有意に高いペプチドシグナル〕
810.6、825.5、854.1、861.5、868.4、890.0、912.1、921.4、949.3、970.5、1028.7、1042.5、1055.9、1086.7、1144.8、(1789.60)、1898.8、(1944.7)、 2013.7、2030.8、2046.6、2053.4、2073.9、2083.6、2118.0、(2130.2)、
2187.2、2212.0、2270.7、2534.1、2570.5、2604.1、2625.4、2819.4
〔FM患者で発現量が有意に低いペプチドシグナル〕
1021.3、1061.6、1077.8、1208.0、1262.0、1350.8、1420.4、1467.6、1521.0、1547.6、1564.5、1618.9、2454.6、2770.5、2934.0、3193.1、3263.9
同定されたペプチドシグナルについて、結果の一例を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（B）サンプルB
FM患者血清サンプルと健常人血清サンプルを比較・解析した結果、30％アセトニトリルによる溶出の場合は、ペプチドシグナルが39個検出され、このうち、FM患者で発現量が有意に高いペプチドシグナルは11個、有意に低いペプチドシグナルは7個であった。また、60％アセトニトリルによる溶出の場合は、ペプチドシグナルが55個検出され、このうち、FM患者で発現量が有意に高いペプチドシグナルは20個、有意に低いペプチドシグナルは9個であった。
これらのペプチドシグナルのうち、FM患者で発現量が有意に高いペプチドシグナルについては1個が同定され、complement C3f由来の配列であった。また、FM患者で発現量が有意に低いペプチドシグナルについては4個が同定され、そのうち3個はサンプルAでも検出されていたペプチドシグナルであるfibrinopeptide A由来の配列で、もう1個はtransthyretin chain A由来の配列であった。
上記試験の結果は次の通りであった。
〔FM患者で発現量が有意に高いペプチドシグナル〕
650.0、656.0、657.0、666.0、672.0、679.4、685.4、737.5、795.6、853.7、861.2、911.8、942.6、964.6、969.8、1027.9、1085.9、1741.1、2012.2、2071.2、2034.1、2056.1、2253.9、2268.5、2359.5、2600.8、2726.2、3325.9、3364.2、3380.1
〔FM患者で発現量が有意に低いペプチドシグナル〕
615.6、637.4、1020.6、1206.8、1350.7、1419.6、1465.9、1562.9、1563.0、1972.2、2452.7、2452.8、2646.9、2981.7
同定されたペプチドシグナルについて、30％アセトニトリルによる溶出は表2に、また60％アセトニトリルによる溶出は表3に、これらの結果の一例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記表１乃至３に示す各ペプチドシグナルのアミノ酸の配列（一文字表記）及び配列番号を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
上述した通り、FM患者血清サンプルと健常人血清サンプルを比較・解析した結果、FM患者で発現量が有意に高いペプチドについては、HMW kininogen由来、ITIH4由来、ApoE由来及びcomplement
C3f由来のペプチドであるものが同定され、また、FM患者で発現量が有意に低いペプチドについては、fibrinopeptide A由来及びtransthyretin chain A由来のペプチドであるものが同定された。
これらの同定された蛋白質及びペプチドの生理機能等について以下に述べる。
（１）Kininogen
　Kininogenはヒトでは644アミノ酸からなる血漿蛋白質で、カルシウム結合、プロテアーゼ阻害、細胞接着抑制因子、抗血栓因子等の様々な生理機能を持っていることが知られている。また、kallikreinによってkininogenの第4ドメインからbradykininが産生され、発痛、血管拡張、血管透過性亢進、急性炎症症状等を引き起こすことが知られている。今回同定されたkininogen由来のペプチドはいずれも陰電荷表面との結合に重要な役割を果たす第5ドメインに含まれる配列で、ヒスチジンが多く非常に電荷に富み親水性を示すものである。
（２）ITIH4
　ITIH4はInter alpha inhibitor
familyに属する930アミノ酸からなる蛋白質で、外傷後などに血清で増加することが知られているが、プロテアーゼ阻害活性を持つbikunin chainを持っていない点で、このfamilyの他の分子とは異なっている。
（３）Apolipoproteins
　Apolipoproteinsはlipoproteinsと結合し、lipoproteinsの認識や脂質代謝に関与する酵素群の活性化あるいは補酵素として働く一群の蛋白質である。構造や機能によりAからEまでの5種に大別され、さらにサブクラスに分けられる。ApoEは細胞にlipoproteinsが認識される際のマーカーとなる蛋白質であるが、近年痴呆との関連が研究されてきている。
（４）Fibrinopeptide
　今回FM患者血清における発現量が低いとして同定できたペプチドは、ほとんどがfibrinopeptide A由来の配列であった。fibrinopeptide Aは、血漿中に大量に存在する糖蛋白質fibrinogen alphaからトロンビンにより切断・産生される、血清中に比較的多量に存在するペプチドであり、凝固の促進開始期の指標として用いられている。
（５）Complement C3f
　血液中の存在する補体系の蛋白質であるC3bから切り出されるペプチドフラグメントである。
（６）TTR chain A
　FM患者で低値が認められたもう一つの蛋白質であるTTR
chain Aは、血液や脳脊髄液に存在し、甲状腺ホルモンやレチノール等のキャリア蛋白質と考えられている。家族性TTR関連アミロイドーシスでは、TTRの遺伝子変異が疾患に関与することや、老人性アミロイドーシスでは野生型TTRがアミロイドを構成する蛋白質となっていることが報告されている。アミロイドーシスでは症状として多発性ポリニューロパシー等の神経症状や手根管症候群等も観察されることから、FMと共通の機序の存在する可能性が考えられる。また、アミロイド沈着はリウマチ等の炎症疾患により続発性にも生じることから、炎症を含めた何らかの変化により、TTRの分解異常がFM患者で起きている可能性も考えられる。
　今回、FM患者血清サンプルと健常人血清サンプルを比較して解析した結果、両者で発現量に差が見られたペプチドや、これらのペプチドが由来する上述したような蛋白質及びペプチドはFM患者の病因又は病態と関係している可能性がある。従って、これらペプチドの発現量の変化を確認することによりFMの診断又は検査に利用できる可能性がある。また、FM用薬の探索・開発を目的とした研究において、これらのペプチドの発現量を指標として該薬剤のFMに対する効果を評価又は判定できる可能性もある。
上記のとおり、本発明方法により、線維筋痛症患者の血液において、健常人と比較して発現が変動するペプチドを検出し、いくつかについてはそれが由来する蛋白質またはペプチドを同定することができた。従って、本発明は、これらの同定されたペプチドを線維筋痛症の指標（バイオマーカー）として利用して、患者血清をペプチド解析することにより、線維筋痛症の診断又は検査し、或いは線維筋痛症用薬を評価又は判定する方法として有用である。

Claims (12)

  1. 　血液中のペプチドをマススペクトロメトリーで測定し、質量電荷比（ｍ／ｚ）が650.0、656.0、657.0、666.0、672.0、679.4、685.4、737.5、795.6、810.6、825.5、853.7、854.1、861.2、861.5、868.4、890.0、911.8、912.1、921.4、942.6、949.3、964.6、969.8、970.5、1027.9、1028.7、1042.5、1055.9、1085.9、1086.7、1144.8、1741.1、1789.60、1898.8、1944.7、2012.2、2013.7、2030.8、2034.1、2046.6、2053.4、2056.1、2071.2、2073.9、2083.6、2118.0、2130.2、
    2187.2、2212.0、2253.9、2268.5、2270.7、2359.5、2534.1、2570.5、2600.8、2604.1、2625.4、2726.2、2819.4、3325.9、3364.2又は3380.1であるペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  2. 　血液中のペプチドをマススペクトロメトリーで測定し、質量電荷比（ｍ／ｚ）が615.6、637.4、1020.6、1021.3、1061.6、1077.8、1206.8、1208.0、1262.0、1350.7、1350.8、1419.6、1420.4、1465.9、1467.6、1521.0、1547.6、1562.9、1563.0、1564.5、1618.9、1972.2、2452.7、2452.8、2454.6、2646.9、2770.5、2934.0、2981.7、3193.1又は3263.9であるペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  3. 　高分子キニノーゲン、フィブリノーゲン、インターアルファトリプシンインヒビターＨ４、アポリポプロテインＥ、補体Ｃ３ｆ又はトランスチレチンＡ鎖に由来する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  4. 　高分子キニノーゲンの４３８～４５６番目、４３９～４５６番目、４４０～４５６番目又は４５８～４７７番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  5. 　フィブリノーゲンα鎖の１９～３５番目、２０～３５番目、２１～３５番目、２２～３５番目、２４～３５番目、２６～３５番目又は２８～３５番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  6. 　インターαトリプシンインヒビターＨ４の６２６～６４２番目又は６６９～６８７番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  7. 　アポリポプロテインＥの２１２～２３２番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の検査法。
  8. 　補体Ｃ３ｆの９～１６番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  9. 　トランスチレチンＡ鎖の１０１～１２３番目のアミノ酸配列に相当する血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  10. アミノ酸配列が配列番号１～１５のいずれかである血液中のペプチドを指標とする線維筋痛症の診断又は検査法。
  11. 請求項１～１０に記載のペプチドを指標とする線維筋痛症用薬剤の評価又は判定方法。
  12. 請求項１１に記載の評価又は判定方法により評価又は判定された線維筋痛症用薬剤。
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