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WO2010004695A1 - シークエンサー - Google Patents

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WO2010004695A1
WO2010004695A1 PCT/JP2009/002949 JP2009002949W WO2010004695A1 WO 2010004695 A1 WO2010004695 A1 WO 2010004695A1 JP 2009002949 W JP2009002949 W JP 2009002949W WO 2010004695 A1 WO2010004695 A1 WO 2010004695A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
substrate
fibrous
silicon
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/002949
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
中谷将也
高橋誠
牛尾浩司
ダニエル ヤズベク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Corp
Original Assignee
Panasonic Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Corp filed Critical Panasonic Corp
Priority to US13/002,691 priority Critical patent/US8962248B2/en
Priority to EP09794143.9A priority patent/EP2302028B1/en
Publication of WO2010004695A1 publication Critical patent/WO2010004695A1/ja
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    • B01J2219/00722—Nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a sequencer for measuring a nucleic acid sequence such as DNA.
  • This DNA sensor includes a substrate 1 and a functional molecule fixed on the substrate 1, that is, a DNA probe 2.
  • This DNA probe 2 forms a double strand with a complementary DNA 3 that is a ligand molecule, and this DNA probe 2 may contain various DNAs 3 such as blood, saliva, river water, etc.
  • fluorescent substances 4 are labeled on various DNAs 3 to be exposed in advance, each is reacted with the above-described DNA probe 2, and then the fluorescence of this reaction region is measured to complement the DNA probe 2.
  • a method for detecting a double-stranded forming region with the target DNA are disclosed in Patent Documents 1 and 2 below.
  • Other examples relating to sequencers for measuring nucleic acid sequences (base sequences) such as DNA are disclosed in Patent Document 3 below.
  • the sensitivity of the sensor may be lowered. This is because the formation density of functional molecules was low. That is, conventionally, it has been difficult to fix a sufficient amount of the functional molecule (DNA probe 2) in a predetermined region, and therefore, the signal generated by the binding between the functional molecule 2 and the ligand molecule (DNA 3) is also small. As a result, the signal sensed by the sensor is reduced and the sensitivity of the sensor is reduced.
  • an object of the present invention is to provide a sequencer with improved sensitivity.
  • a sensor according to the present invention includes a substrate having a surface made of silicon, A plurality of fibrous protrusions made of silicon dioxide, directly bonded to the surface of the substrate made of silicon; A plurality of functional molecules respectively formed on the fibrous protrusions; Is provided.
  • the sequencer according to the present invention comprises a substrate having a surface made of silicon, A fibrous protrusion made of silicon dioxide, directly bonded to the surface of the substrate made of silicon, A plurality of nucleic acid strands are fixed on the fibrous protrusion, and the nucleic acid sequence of the nucleic acid strand is measured.
  • the sensor according to the present invention can improve the sensitivity of the sensor.
  • the reason is that functional molecules can be fixed on the base material with high density. That is, according to the present invention, the surface area of the substrate is increased by the above-described fibrous protrusions, and functional molecules can be formed at a high density even in a narrow space. Therefore, a sufficient reaction between each functional molecule and the ligand molecule can be obtained and detected as a large signal. As a result, the sensitivity of the sensor can be improved.
  • the measurement accuracy of the nucleic acid sequence can be increased. This is because the nucleic acid density in the unit region can be increased. That is, in the present invention, a plurality of fibrous protrusions are formed on a substrate, and nucleic acids are amplified on the fibrous protrusions. Therefore, the surface area of the support increases, and the amount of nucleic acid amplified in one region increases. As a result, the signal that can be detected from the entire nucleic acid colony increases. As a result, the measurement accuracy of the nucleic acid sequence can be increased.
  • Sectional drawing of the sensor in Embodiment 1 of this invention An enlarged sectional view of the main part of the sensor SEM photo of the fibrous protrusions of the sensor Sectional drawing for demonstrating the manufacturing method of the sensor Sectional view Sectional view Sectional drawing for demonstrating the manufacturing method of the sensor typically Sectional view Sectional view Sectional view Sectional view (A)-(c) Sectional drawing which shows typically the principal part of the sensor
  • the figure which shows the X-ray-spectral-analysis result of the fibrous projection in Embodiment 1 of this invention Sectional drawing of the sensor in Embodiment 2 of this invention Sectional drawing of the sequencer in Embodiment 3 of this invention (A)-(f)
  • (b) The figure which shows the process of measuring a nucleic acid sequence using the sequencer in Embodiment 3.
  • Sectional drawing of the sequencer in Embodiment 4 of this invention Sectional view
  • the DNA sensor In Embodiment 1, a DNA sensor will be described as an embodiment of the present invention. As shown in the sectional view of FIG. 1, the DNA sensor has a substrate 5 made of silicon as a base material. The surface of the substrate 5 is divided into a plurality of regions 6 to 8, and a plurality of fibrous projections 9 made of silicon dioxide each having one end directly bonded to the substrate 5 are formed in each of the regions 6 to 8.
  • directly bonding refers to a state in which the fibrous protrusions 9 are formed directly on the substrate 5 and atoms or molecules constituting the substrate 5 and the fibrous protrusions 9 are directly bonded. This is a state in which molecules are covalently bonded.
  • silicon atoms on the surface of the substrate 5 and silicon atoms in the fibrous protrusions 9 are covalently bonded via oxygen atoms in the atmosphere. Further, a silane coupling agent adheres to the surface of the fibrous protrusions 9, thereby forming a matrix-like coating layer (not shown).
  • linker molecules (not shown) are included in these coating layers, and a plurality of DNA probes 10 are joined based on the linker molecules as shown in FIG. .
  • DNA probes 10 are bonded to the regions 6 to 8 on the silicon substrate 5. That is, the DNA probe 10 is a polymer in which monomers of adenine (A), guanine (G), thymine (T), and cytosine (C) are arranged in various orders. A DNA probe 10 having this sequence changed was formed for each region 6-8.
  • the silicon substrate 5 made of single crystal silicon is used as the substrate 5, but it is sufficient that the surface is made of silicon, and this silicon is made of single crystal, polycrystalline, amorphous, or the like. It may be in a state.
  • a so-called SOI substrate in which the front and back surfaces are silicon and a silicon dioxide layer is formed between both surfaces may be used.
  • the substrate 5 of the present embodiment is a substrate 5 having a thickness of about 400 ⁇ m. The thickness of the substrate 5 is suitably 1 mm or less.
  • the length of the fibrous projections 9 is 1 to 500 ⁇ m in total length, the thickness is 0.01 ⁇ m to 10 ⁇ m, and the interval between the plurality of fibrous projections 9 is 0.01 to 10 ⁇ m. .
  • the fibrous protrusions 9 are grown until they are finely wavy or curled in order to increase the surface area, and each one has a crimped shape. , Intertwined with each other. Furthermore, what branches in the free direction may be mixed. Since the fibrous protrusions 9 are entangled with each other and have a plurality of branches, the fibrous protrusions 9 are firmly configured.
  • the fibrous protrusions 9 of the first embodiment are made of amorphous silicon dioxide, and are thus less likely to break than single crystal silicon dioxide.
  • the fibrous protrusions 9 are considered to be made of amorphous silicon dioxide.
  • a silane coupling agent containing a linker molecule is attached to the surface of the fibrous protrusion 9 in order to make the bonding between the surface of the fibrous protrusion 9 and the DNA probe 10 easier.
  • these silane coupling agents and linker molecules are not essential components.
  • the silane coupling agent improves the bonding property on the surface of the fibrous protrusion 9, and a material having a composition other than the silane coupling agent such as poly-L-lysine may be used.
  • the linker molecule is a base of the DNA probe 10, and examples thereof include allyl acetylene, ethyl glycol oligomer, diamine, amino acid, and a mixture thereof.
  • the silane coupling agent itself may be a linker molecule.
  • the substrate 5 is divided into regions, and the boundary portions of these regions are covered with a protective film 11 made of a resin such as silicon dioxide or photoresist. 4 to 7 show only one of the regions 6 to 8 shown in FIG. (B) Next, when at least one of CF 4 , CHF 3 , C 2 F 6 , C 3 F 8 , and C 4 F 8 is decomposed in plasma and introduced into the surface of the silicon substrate 5, As shown in FIG. 5, a seed layer 12 is formed on the surface of the substrate 5.
  • a protective film 11 made of a resin such as silicon dioxide or photoresist. 4 to 7 show only one of the regions 6 to 8 shown in FIG.
  • B Next, when at least one of CF 4 , CHF 3 , C 2 F 6 , C 3 F 8 , and C 4 F 8 is decomposed in plasma and introduced into the surface of the silicon substrate 5, As shown in FIG. 5, a seed layer 12 is formed on the surface of the substrate 5.
  • This seed layer 12 is a layer made of an organic polymer containing C, F element or C, F, H element, and the above-mentioned CF 4 , CHF 3 , C 2 F 6 , C 3 using plasma CVD method.
  • F 8, C 4 F 8 carbon fluoride gas such as a can be formed by decomposing in the plasma. Note that when ICP (Inductive Coupled Plasma Inductively Coupled Plasma) is used to decompose the gas in the plasma, the degree of decomposition of the gas increases and the seed layer 12 is easily formed uniformly.
  • the surface of the silicon substrate 5 is preferably made of pure silicon, but an extremely thin natural oxide film is formed. It may be in a state.
  • the protective film 11 is removed by chemical treatment using a drug.
  • the seed layer 12 formed by the plasma CVD method since the seed layer 12 formed by the plasma CVD method has relatively high chemical resistance, only the protective film 11 can be selectively removed.
  • D Thereafter, when the substrate 5 is baked at 1000 to 1150 ° C. in a low oxygen atmosphere, as shown in FIG. 7, the surface of the substrate 5 (the region where the seed layer 12 in FIG. 5 is formed) A fibrous protrusion 9 made of silicon dioxide is formed. According to this method, the fibrous protrusions 9 are in a state of being directly bonded to the silicon surface of the substrate 5 and are excellent in heat resistance and hardly peeled off. In addition, since the fibrous protrusions 9 are grown on the substrate 5 with the seed layer 12 as a nucleus, other substances are hardly mixed and the composition has few impurities.
  • the fibrous protrusions 9 are not formed on the surface of the silicon substrate 5 on which the seed layer 12 is not formed.
  • the seed layer 12 composed of C, F or C, F, and H atoms is burned out, and does not become a factor that inhibits hydrophilicity.
  • the fibrous protrusion 9 can also be formed using a metal catalyst.
  • a metal catalyst layer is first formed on the surface of the substrate 5 by vapor deposition or sputtering.
  • Au, Fe, Ni, Co or the like is desirable, and the thickness of the metal catalyst layer is about several nm.
  • fibrous protrusions 9 made of silicon dioxide are formed on the surface of the substrate 5. Also in this method, the fibrous protrusions 9 are directly bonded to the silicon surface of the substrate 5 and have excellent heat resistance and are difficult to peel off. In addition, since the fibrous protrusions 9 are grown on the substrate 5 with the seed layer 12 as a nucleus, other substances are hardly mixed and the composition has few impurities.
  • the low oxygen atmosphere is an atmosphere such as nitrogen or argon or a vacuum atmosphere.
  • the fibrous catalyst 9 may carry a metal catalyst.
  • FIGS. 8 to 13 are schematically shown by changing the scale of each component for ease of explanation.
  • a linker molecule (not shown) whose reactive group is modified with a protective group is bonded to the coating layer 13. That is, in the first embodiment, the above-described protective group is bonded to the surface of the fibrous protrusion 9 via the linker molecule and the coating layer 13.
  • a substance that can be deprotected in response to light is used as this protecting group.
  • protecting groups include ortho-nitrobenzyl derivatives, 6-nitroveratryloxycarbonyl, 2-nitrobenzyloxycarbonyl, cinnamoyl derivatives and the like.
  • the linker molecule is not used, the protective group and the reactive group of the fibrous protrusion 9 may be bonded.
  • the surface of the substrate 5 is masked with a mask 14 so that only a part of the regions 7 and 8 among the plurality of regions 6 to 8 on the substrate 5 is exposed.
  • the protecting group is removed (deprotection), and the reactive group of the linker molecule is exposed.
  • the linker molecule of the coating layer 13A shown in FIG. 9 is in a state where the protective group is removed and the reactive group is exposed.
  • the irradiation light light having a predetermined wavelength capable of deprotecting the protecting group is used.
  • the protective group and the fibrous protrusion 9 are bonded via the linker molecule, but the protective group is directly bonded to the fibrous protrusion 9 without using the linker molecule.
  • the reactive group of the fibrous protrusion 9 from which the protective group is deprotected and the monomer 15 are bonded.
  • the monomer 15 is modified with a photoreactive protecting group. This protecting group may be the same substance as the protecting group of the linker molecule, or may be another substance.
  • FIG. 11 shows the coating layer 13A and the monomer 15A from which the protecting group has been deprotected.
  • FIG. 13A schematically shows the DNA probe 10 formed on the surface of the fibrous protrusion 9 in the region 6,
  • FIG. 13B shows the region 7,
  • FIG. 13C shows the region 8. Is.
  • the number of nucleotide monomers constituting the DNA probe 10 is not particularly limited, but about 10 to 30 (length of about 0.003 to 0.01 ⁇ m) is suitable for forming a double strand.
  • DNA probes 10 of various sequences can be rapidly formed by combining the masks.
  • a photoreactive protective group is used as the protective group.
  • a substance that can be deprotected by current, electrolysis, ion beam, or the like may be used.
  • current, electrolysis, or ion beam may be applied, respectively.
  • the method of controlling the reaction region using the protecting group and polymerizing the monomer is used.
  • a method of laminating the monomer in a predetermined region using the photolithography technique is used. It may be used.
  • the fibrous protrusions 9 are first formed over the entire area of the silicon substrate 5, and then the regions 6 to 8 where the fibrous protrusions 9 are to be left are covered with a protective film such as resin, and the fibrous protrusions 9 are to be removed.
  • the fibrous protrusions 9 in the region may be removed by etching using a normal agent such as HF or BHF, and then the protective film may be removed. In this case, the aforementioned thermal oxide film is not formed on the exposed surface.
  • the DNA sensor thus formed can be formed by, for example, forming a double strand with DNA previously labeled with a fluorescent substance and the DNA probe 10 or inserting a fluorescent substance into the formed double strand,
  • the presence or absence of duplex formation can be measured with light.
  • the presence or absence of double-stranded formation can be measured not only by light but also by changes in current or voltage, surface roughness, or the like.
  • the sensitivity of the sensor can be improved.
  • the DNA probe 10 which is a functional molecule can be formed with high density. That is, according to the present invention, the surface area of the substrate 5 is increased by the above-described fibrous protrusions 9, and the receptor can be formed at a high density even in a narrow space. Therefore, a sufficient reaction between each DNA probe 10 and complementary DNA (ligand molecule) can be obtained and detected as a large signal. As a result, the sensitivity of the sensor can be improved.
  • the fibrous protrusion 9 is made of silicon dioxide, the surface thereof is more hydroxylated than the surface of the substrate 5. Therefore, the binding property with a chemical substance such as a linker molecule is enhanced, and the DNA probe 10 can be fixed at a higher density.
  • the region where the fibrous protrusions 9 are formed has higher hydrophilicity and water retention than the exposed surface of the substrate 5 (the surface where the fibrous protrusions 9 are not formed). Therefore, when a polar solvent is supplied onto the substrate 5, the polar solvent has a high affinity with the fibrous protrusions 9, so that the generation of bubbles can be suppressed in the formation region of the DNA probe 10. That is, in the first embodiment, for example, bubbles are not easily generated in a process of injecting the monomer solution onto the substrate 5 or injecting the measurement liquid. As a result, the DNA probe 10 can be formed at a higher density, or the measurement can be performed with high accuracy. In addition, if it has at least one of hydrophilic property and water retention property, it will contribute to reduction of bubbles.
  • the region where the DNA probe 10 is fixed has a lower reflectance than the flat surface. Therefore, for example, in the case of analyzing with fluorescence, the reflected light from the substrate 5 may be mixed with excitation light generated when the silicon atom is irradiated with light, which may cause noise during fluorescence detection. Since the excitation light can be reduced by being blocked by the protrusions 9, noise can be reduced as a result.
  • the main difference between the second embodiment and the first embodiment is the shape of the substrate 5 as shown in FIG. That is, in the second embodiment, the recess 18 is formed in advance on the surface of the substrate 5 by wet etching or dry etching, and the fibrous protrusion 9 is formed on the bottom surface of the recess 18.
  • the second embodiment it is possible to suppress the fibrous protrusions 9 in the regions 6 to 8 from growing beyond the regions 6 to 8. That is, the growth direction of the fibrous projections 9 is suppressed by suppressing the surface diffusion. Therefore, the shape accuracy of the region where the fibrous protrusions 9 are formed can be improved.
  • the fibrous protrusions 9 are formed on the bottom surface and the side wall surface of the recess 18, but may be formed only on the bottom surface of the recess 18 or only on the side wall surface.
  • diffusion since it is easy to suppress a spreading
  • the depth of the recess of the recess 18 is set to be several tens of ⁇ m or more deeper than the thickness of the layer on which the fibrous protrusions 9 are formed.
  • the range of the recessed part 18 can be suitably selected according to the objective.
  • a DNA sensor is taken as an example of the sensor, and the functional molecule is a DNA probe.
  • the functional molecule may be RNA.
  • RNA can be easily formed in a predetermined region using a protecting group.
  • the sequencer of the third embodiment is also selectively formed on the substrate 19 as a base material and the regions 20 to 22 of the substrate 19 in the same manner as the DNA sensor of the first embodiment.
  • a plurality of fibrous protrusions 23 are provided.
  • the interval between the plurality of fibrous protrusions 23 in each region 20 to 22 is set to 1 to 10 ⁇ m, and the thickness is set to 0.01 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the length of the fibrous protrusion 23 is about 1 to 500 ⁇ m in total length.
  • the fibrous protrusions 23 are grown until they are finely wavy or curled in order to increase the surface area, and each one has a crimped shape. And densely intertwined with each other. Furthermore, what branches in the free direction may be mixed. This makes it easy to disperse the stress load against the external pressure and provides a structure with high mechanical strength. Further, the fibrous protrusions 23 of the third embodiment are made of amorphous silicon dioxide as in the first embodiment, and are less likely to break than single crystal silicon dioxide.
  • the manufacturing method of such a fibrous protrusion 23 is the same as that of the DNA sensor shown in the first embodiment.
  • a fluorocarbon gas is decomposed in plasma by using a plasma CVD method.
  • a seed layer made of an organic polymer containing C, F element or C, F, H element is formed. It can be formed by firing at 1000 to 1150 ° C. in a low oxygen atmosphere.
  • the fibrous protrusions 23 can also be formed using a metal catalyst. Details are the same as those in the first embodiment, and thus the description thereof is omitted.
  • nucleic acid DNA or RNA (hereinafter referred to as nucleic acid) whose nucleic acid sequence (base sequence) is to be measured is randomly divided using an enzyme such as EcoRI or HhaI to form a nucleic acid fragment 24 shown in FIG. .
  • the length of the nucleic acid fragment 24 is usually 10 to 4000 base pairs, although it depends on the readout accuracy in the sequence readout step described later.
  • the nucleic acid fragment 24 may be either single-stranded or double-stranded.
  • an adapter 25 containing the oligonucleotide sequence Y1 is attached to one end of the nucleic acid fragment 24, and an adapter 26 containing the oligonucleotide sequence Z1 is attached to the other end, and a nucleic acid template T1 as shown in FIG. Form.
  • Oligonucleotide sequence refers to a short nucleotide sequence consisting of several base pairs, and a base of adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) or uracil (U). It is a component.
  • Oligonucleotide sequence Y1 and oligonucleotide sequence Z1 are preferably composed of about 5 to 100 nucleotides.
  • the oligonucleotide sequences Y1 and Z1 are bound to the most end of the nucleic acid template T1, but the vicinity of the end (preferably, the 5 ′ end of the nucleic acid template T1 or the 0 to 100 nucleotides from the 3 ′ end. Can be joined to the support 1.
  • a plurality of colony primers X1 and X2 are prepared.
  • the colony primer X1 has a sequence capable of hybridizing with the oligonucleotide sequence Z1
  • the colony primer X2 is an oligonucleotide sequence (Z2 described later) of a nucleic acid template (T2 described later) formed by extension of the colony primer X1.
  • the colony primer X2 has a sequence capable of hybridizing to. That is, the colony primer X2 has a sequence corresponding to the oligonucleotide sequence Y1.
  • a solution containing the colony primers X1 and X2 and the nucleic acid template T1 is provided on the surface of the functionalized fibrous protrusion 23.
  • the colony primers X1 and X2 and the nucleic acid Each 5 ′ end of the template T1 is covalently bonded to the surface of the fibrous protrusion 23.
  • the hatched portion in FIG. 17B indicates the fibrous protrusion 23.
  • the surface of the fibrous protrusion 23 is bonded to the colony primers X1 and X2 and the nucleic acid template T1 by amide bonds, but other bonds include covalent bonds such as ester bonds and thiol bonds. Can be mentioned.
  • the nucleic acid template T1 and the colony primer X1 bound to the fibrous protrusions 23 are derived, and the oligonucleotide sequence Z1 (adapter 26) and the colony primer of the nucleic acid template T1 are derived. Hybridize with X1.
  • the induction condition at this time includes, for example, subjecting to a temperature of about 65 ° C.
  • G Thereafter, as shown in FIG.
  • nucleic acid polymerase such as a DNA-dependent DNA polymerase or reverse transcriptase molecule, or RNA polymerase
  • the four nucleotide precursors That is, four types of deoxynucleoside triphosphates (deoxyadenosine triphosphate (hereinafter abbreviated as dATP), deoxyguanosine triphosphate (hereinafter abbreviated as dGTP), deoxycytidine triphosphate (hereinafter abbreviated as dCTP), Nucleic acid is synthesized using thymidine triphosphate (hereinafter abbreviated as dTTP)] as a substrate.
  • dATP deoxyadenosine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP deoxycytidine triphosphate
  • Nucleic acid is synthesized using thymidine triphosphate (hereinafter abbreviated as dTTP)] as a substrate.
  • the nucleic acid polymerase extends the colony primer X1 from its 3 ′ end using the nucleic acid template T1 as a template, and when this primer extension is completed, the second nucleic acid strand complementary to the first nucleic acid template T1, ie, A nucleic acid template T2 is generated.
  • the separated two nucleic acid strands are immobilized on the fibrous protrusions 23 as shown in FIG. It becomes.
  • the nucleic acid template T1 immobilized first and the nucleic acid strand (nucleic acid template T2) formed by extending the colony primer X1 function as a nucleic acid template.
  • the nucleic acid template T1 and the nucleic acid template T2 are hybridized with other immobilized colony primer X1 or colony primer X2, respectively, primer extension occurs, the nucleic acid chain is separated, and is immobilized on the fibrous protrusions 23.
  • the amplified nucleic acid strand is amplified. In this way, the nucleic acid strand is amplified and a nucleic acid colony is generated.
  • the nucleic acid colony includes a sequence corresponding to the first nucleic acid template T1 and a sequence complementary to the nucleic acid template T1 (that is, corresponding to the nucleic acid template T2).
  • nucleic acid colony composed of two types of nucleic acid strands can be formed using a randomly divided nucleic acid as a template. This nucleic acid colony contributes to further miniaturization by forming at a small interval of, for example, less than 10 ⁇ m.
  • the nucleic acid sequence can be measured.
  • the nucleic acid strand complementary to the nucleic acid template T1 may be cut off from the fibrous protrusion 23. That is, since the nucleic acid template T2 is bonded to the fibrous protrusion 23 via the colony primer X1, the colony primer X1 can be separated from the fibrous protrusion 23 with a restriction enzyme or the like.
  • a nucleic acid colony consisting only of a nucleic acid chain corresponding to the nucleic acid template T1 can be formed.
  • a primer 27 capable of hybridizing with the oligonucleotide sequence Z1 on the 3 ′ end side of the nucleic acid template T1, four modified nucleotide precursors (A, T, C, G shown in FIG. 18 (a)), And a solution containing the nucleic acid polymerase is allowed to flow on the fibrous protrusions 23.
  • the four types of nucleotide precursors are modified with various fluorescent substances so as to emit different excitation lights. Then, this fluorescent substance is excited by laser light at the moment when the nucleotide precursor is hybridized, and develops fluorescence.
  • the color development of each wavelength can be confirmed by the nucleic acid colony.
  • the four nucleotide precursors and the enzyme are poured again onto the fibrous protrusions 23 so that the next nucleotide precursor is extended from the primer 27 and becomes the nucleic acid template T1. Hybridizes and develops color at a specific wavelength.
  • nucleotide precursor is chemically modified so that no extension reaction occurs after one hybridization reaction, one nucleotide sequence on one strand is converted. Can be determined with certainty. That is, the reaction can be reliably determined one by one by removing the chemically modifying substance and flowing the chemically modified nucleotide precursor again.
  • the nucleic acid template can analyze not only the sequence of the nucleic acid fragment but also the sequence of the original nucleic acid by preparing a large number of nucleic acids whose sequence is to be measured in advance and dividing them at random. .
  • the support 1 is divided into a plurality of regions, and the fibrous protrusions 23 are selectively formed in the divided regions, and nucleic acid colonies are formed in each region. Therefore, as shown in Table 1, the entire sequence of the original nucleic acid is read little by little by comparing the sequences read from the nucleic acid colonies of each region and arranging the same sequence portion so that they overlap. You can go.
  • Embodiment 3 the density of the nucleic acid in the unit region increases, and the measurement accuracy of the nucleic acid sequence can be increased. This is because a plurality of fibrous protrusions 23 are formed on the substrate 19 and nucleic acids are amplified on the fibrous protrusions 23. Thereby, in this Embodiment 3, the surface area of the support body 1 increases and the amount of nucleic acid amplification in one region increases. As a result, the signal that can be detected from the entire nucleic acid colony increases, and the measurement accuracy of the nucleic acid sequence can be increased.
  • the fibrous protrusions 23 are made of silicon dioxide, the surface thereof is more hydroxylated than the surface of the substrate 19. Therefore, the binding property with a chemical substance for binding a nucleic acid template, a colony primer, and the like is increased, and the nucleic acid template and the colony primer can be fixed at a higher density.
  • the regions 20 to 22 where the fibrous projections 23 are formed are higher in hydrophilicity than the exposed surface of the substrate 19 (the surface where the fibrous projections 23 are not formed). It has sex. Therefore, when supplying a polar solvent onto the substrate 19, since the polar solvent has a high affinity with the fibrous protrusions 23, the generation of bubbles in the formation region of the nucleic acid template T1 and the colony primers X1 and X2 is suppressed. Can do. Therefore, the measurement can be performed with high accuracy.
  • the region where the nucleic acid template T1 is fixed has a lower reflectance than the flat surface. Therefore, for example, in the case of analyzing with fluorescence, the reflected light from the substrate 19 may be mixed with excitation light generated when the silicon atoms are irradiated with light, which may cause noise during fluorescence detection. Since the excitation light can be reduced by being blocked by the protrusions 23, noise can be reduced as a result.
  • a plurality of fibrous protrusions 23 are formed in each region 20-22, but one fibrous protrusion 23 may be formed in each region 20-22. Also in this case, the surface area of the substrate 19 is increased, and the nucleic acid can be further amplified.
  • the nucleic acid template T1 is used as a template on the fibrous protrusion 23 to amplify the immobilized nucleic acid.
  • the nucleic acid chain may be immobilized by other methods.
  • a nucleic acid amplified in advance may be allowed to flow on the fibrous protrusion 23, and each may be bound and fixed.
  • the sequencer using the fibrous projections 23 of the third embodiment is used for immobilizing various nucleic acids.
  • the number of nucleic acids that can be immobilized in a unit region increases and the signal that can be measured also increases. Therefore, the measurement accuracy of the nucleic acid sequence can be increased.
  • a method for measuring a nucleic acid sequence a method for analyzing fluorescence due to hybridization between a fixed nucleic acid chain (nucleic acid template) and a nucleotide precursor is taken as an example. It is an example and various methods can be used. For example, there is a method in which an electromagnetic field state that is changed by a hybridization reaction between a fixed nucleic acid chain and a nucleotide precursor is measured as a change in light or electrical signal.
  • the main difference between the fourth embodiment and the third embodiment is the shape of the substrate 19 as shown in FIG. That is, in the fourth embodiment, the concave portion 28 is formed in advance on the surface of the substrate 19 by wet etching or dry etching, and the fibrous protrusions 23 are formed on the bottom surface of the concave portion 28.
  • the fourth embodiment it is possible to suppress the fibrous protrusions 23 in the respective regions 20 to 22 from growing beyond the regions 20 to 22. That is, the growth direction of the fibrous protrusions 23 is suppressed by suppressing the surface diffusion. Therefore, the shape accuracy of the region where the fibrous protrusions 23 are formed can be improved.
  • each nucleic acid colony can be formed for each of the regions 20 to 22, and the signal can be measured with high accuracy.
  • the fourth embodiment for example, in the step of injecting the monomer solution onto the substrate 5 or injecting the measurement liquid, it is possible to prevent the monomer solution or the measurement liquid from diffusing. Accordingly, the inspection sensitivity of the sensor is improved.
  • the fibrous protrusions 23 are formed on the bottom surface and the side wall surface of the recess 28, but may be formed only on the bottom surface of the recess 28 or only on the side wall surface.
  • the depth of the recess of the recess 18 is set to be several tens of ⁇ m or more deeper than the thickness of the layer on which the fibrous protrusions 9 are formed.
  • the range of the recessed part 18 can be suitably selected according to the objective.
  • a flat substrate is used as the base material.
  • base materials having various shapes such as a spherical shape and a cube shape may be used.
  • the sensor according to the present invention can be used as a DNA sensor.
  • DNA sensors it can be used for various sensors such as protein sensors, sugar sensors, and antigen-antibody sensors.
  • a receptor or a reactive substance capable of capturing a ligand molecule to be detected is bound to the surface of the fibrous protrusion, and a sensor for measuring the binding with the ligand molecule, or a functional molecule, Examples include a sensor that binds a ligand molecule to be measured to the surface of a fibrous protrusion and reacts with these receptors and reactive substances.
  • the functional molecule is a polymer, the monomer can be polymerized in a predetermined region using a protective group.
  • the sequencer of the present invention can measure nucleic acid sequences such as DNA with high accuracy.

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Abstract

　核酸鎖の核酸配列を測定するシークエンサーは、シリコンからなる表面を有する基材と、前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、を備え、前記繊維状突起物上に複数の核酸鎖を固定している。

Description

シークエンサー
　本発明は、ＤＮＡなどの核酸配列を測定するシークエンサーに関する。
　従来のセンサとして、例えば図２０に示すようなＤＮＡセンサがある。このＤＮＡセンサは、基板１と、この基板１上に固定された機能性分子、すなわちＤＮＡプローブ２とからなる。このＤＮＡプローブ２は、リガンド分子である相補的ＤＮＡ３と二本鎖を形成するものであり、このＤＮＡプローブ２に各種ＤＮＡ３を含んでいる可能性のある、血液、唾液、河川水、等の被験体材料を暴露した後、二本鎖形成の有無を検知することで、これらの被験体材料中に検知対象のＤＮＡ３が存在しているかどうかを検出出来る。
　分析方法としては、例えば予め暴露する各種ＤＮＡ３に蛍光物質４を標識しておき、それぞれを前述のＤＮＡプローブ２と反応させた後、この反応領域の蛍光を測定することによって、ＤＮＡプローブ２と相補的ＤＮＡ３との二本鎖形成領域を検出する方法がある。
　このようなＤＮＡセンサに類似する例は、下記の特許文献１、２に開示されている。
　その他ＤＮＡなどの核酸配列（塩基配列）を測定するシークエンサーに関する例は、下記の特許文献３に開示されている。
特表平４‐５０５７６３号公報 特開２００７‐２８５９２７号公報 特表２００２‐５２５１２５号公報
　従来のセンサでは、センサの感度が低くなることがあった。その理由は、機能性分子の形成密度が低かったからである。すなわち、従来は所定領域に十分な量の機能性分子（ＤＮＡプローブ２）を固定するのが難しく、したがって機能性分子２とリガンド分子（ＤＮＡ３）との結合により発する信号も少なかった。その結果、センサが感知する信号も少なくなり、センサの感度が低下していた。
　そこで、本発明の目的は、感度を向上させたシークエンサーを提供することである。
　本発明に係るセンサは、シリコンからなる表面を有する基材と、
　前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物と、
　前記繊維状突起物上にそれぞれ形成された複数の機能性分子と、
を備える。
　さらに本発明に係るシークエンサーは、シリコンからなる表面を有する基材と、
　前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、を備え、
　前記繊維状突起物上に複数の核酸鎖を固定し、前記核酸鎖の核酸配列を測定する。
　本発明に係るセンサによれば、センサの感度を向上させることができる。その理由は、基材上に機能性分子を高密度に固定することができるからである。すなわち本発明は、上述の繊維状突起物により基材の表面積が増え、狭いスペースにも機能性分子を高密度に形成することができる。したがって、各機能性分子とリガンド分子との反応を十分得ることができ、大きな信号として検出することができる。その結果、センサの感度を向上させることができる。
　さらに本発明に係るシークエンサーによれば、核酸配列の測定精度を高めることができる。その理由は、単位領域における核酸の密度を増大することができるからである。すなわち本発明は、基板上に複数の繊維状突起物を形成し、この繊維状突起物上で核酸を増幅させるため、支持体の表面積が増え、一領域における核酸の増幅量が多くなる。そしてその結果、核酸コロニー全体から検出できる信号が大きくなる。その結果、核酸配列の測定精度を高めることができる。
本発明の実施の形態１におけるセンサの断面図 同センサの要部拡大断面図 同センサの繊維状突起物のＳＥＭ写真 同センサの製造方法を説明するための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同センサの製造方法を摸式的に説明するための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 （ａ）～（ｃ）同センサの要部を模式的に示す断面図 本発明の実施の形態１における繊維状突起物のＸ線分光分析結果を示す図 本発明の実施の形態２におけるセンサの断面図 本発明の実施の形態３におけるシークエンサーの断面図 （ａ）～（ｆ）同実施の形態３におけるシークエンサーを用いて核酸を増幅する工程を示す図 （ａ）（ｂ）同実施の形態３におけるシークエンサーを用いて核酸配列を測定する工程を示す図 本発明の実施の形態４におけるシークエンサーの断面図 従来のＤＮＡセンサの断面図
（実施の形態１）
　実施の形態１では、本発明の一実施の形態としてＤＮＡセンサを例に挙げ説明する。
　図１の断面図に示すように、ＤＮＡセンサはシリコンからなる基板５を基材としている。この基板５の表面は、複数の領域６～８に区分けされており、これらの領域６～８毎に、それぞれ一端が基板５に直接接合した二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物９が形成されている。ここで、「直接接合」とは、基板５上に繊維状突起物９が直接形成され、基板５と繊維状突起物９を構成する原子または分子が直接結合している状態を指し、通常は分子間が共有結合をしている状態である。本実施の形態１では、基板５の表面の珪素原子と繊維状突起物９中の珪素原子とが、雰囲気中の酸素原子を介して共有結合している。またこれらの繊維状突起物９の表面には、シランカップリング剤が付着し、これによりマトリクス状のコーティング層（図示せず）が形成されている。そして本実施の形態１では、これらのコーティング層にリンカー分子（図示せず）が含まれており、このリンカー分子を土台に、図２に示すように、複数のＤＮＡプローブ１０が接合されている。
　なお、本実施の形態１では、シリコン基板５上の領域６～８毎に異なる機能性分子、すなわちＤＮＡプローブ１０を接合している。すなわち、ＤＮＡプローブ１０は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）のモノマーが種々の順番で配列されたポリマーであるが、本実施の形態１では、上述の領域６～８毎に、この配列を変えたＤＮＡプローブ１０を形成した。
　なお、本実施の形態１では、基板５としては、単結晶シリコンからなるシリコン基板５を用いたが、表面がシリコンで形成されていればよく、このシリコンは単結晶、多結晶、アモルファス等の状態であってもよい。また、例えば表面および裏面がシリコンで、両面の間に二酸化珪素層が形成された、いわゆるＳＯＩ基板を用いても良い。また本実施の形態の基板５は、厚み約４００μｍの基板５を用いた。基板５の厚みは１ｍｍ以下が適している。
　さらに本実施の形態１では、繊維状突起物９の長さは全長で１～５００μｍ、太さを０．０１μｍ～１０μｍとし、複数の繊維状突起物９の間隔を０．０１～１０μｍとした。
　また、この繊維状突起物９は、図３に示すように、より表面積を大きくするため、細かくうねったりカールしたりするまで成長させたものであり、一本一本は縮れた形状であって、互いに絡み合った状態で密集している。さらに自由な方向へ枝分かれしているものが混在していてもよい。繊維状突起物９が互いに絡み合い、複数の枝分かれをしていることで、繊維状突起物９が強固に構成される。
　また本実施の形態１の繊維状突起物９は、アモルファスの二酸化珪素からなり、これにより単結晶の二酸化珪素と比較して折れにくい構成となっている。なお、この繊維状突起物９が形成された領域をＸ線分光分析で測定すると、図１４に示すように、２θ／ｄｅｇｒｅｅ＝約４７°の領域にあるＳｉ(１１０)のピークを除き大きなピークはなく、繊維状突起物９はアモルファスの二酸化珪素からなると考えられる。
　なお、本実施の形態１では、繊維状突起物９の表面とＤＮＡプローブ１０との結合をより容易にするため、繊維状突起物９の表面に、リンカー分子を含むシランカップリング剤を付着させているが、これらのシランカップリング剤およびリンカー分子は必須の構成ではない。
　なお、シランカップリング剤は繊維状突起物９表面の結合性を向上させるものであり、ポリ－Ｌ－リシンなど、シランカップリング剤以外の組成からなるものを用いてもよい。
　またリンカー分子は、ＤＮＡプローブ１０の土台となるものであり、例えばアリルアセチレン、エチルグリコールオリゴマー、ジアミン、アミノ酸等やこれらの混合物が挙げられる。なお、上述のシランカップリング剤自体がリンカー分子となる場合もある。
　次に、本実施の形態１のＤＮＡセンサの製造方法を説明する。
　（ａ）はじめに、図４に示すように基板５を領域に区分けし、これらの領域の境界部分を二酸化珪素やフォトレジストなどの樹脂からなる保護膜１１で覆う。なお、図４～７では図１に示す領域６～８のいずれか一つのみ示している。
　（ｂ）次に、ＣＦ４、ＣＨＦ３、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、の少なくともいずれか一つのガスをプラズマ中で分解し、シリコン基板５表面に導入すると、図５に示すように、基板５表面にシード層１２が形成される。
　このシード層１２は、Ｃ、Ｆ元素またはＣ、Ｆ、Ｈ元素を含んだ有機ポリマーからなる層であり、プラズマＣＶＤ法を用いて、前述のＣＦ４、ＣＨＦ３、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８等のフッ化炭素系のガスをプラズマ中で分解することによって形成できる。
　なお、上記ガスをプラズマ中で分解するにはＩＣＰ（Inductive Coupled Plasma誘導結合プラズマ）を用いるとガスの分解度が高くなり、シード層１２の均一な形成が行われやすい。
　なお、シード層１２によって後の工程で形成される繊維状突起物９を均一に形成するには、シリコン基板５表面は純粋なシリコンからなることが望ましいが、極薄い自然酸化膜が形成された状態でもよい。
　（ｃ）次に、図６に示すように、保護膜１１を、薬剤を用いた化学的処理によって除去する。なお、本実施の形態１のように、プラズマＣＶＤ法で形成したシード層１２は比較的耐薬剤性が強いため、保護膜１１のみを選択的に除去することができる。
　（ｄ）その後、基板５を、低酸素雰囲気下にて、１０００～１１５０℃で焼成すると、図７に示すように、基板５の表面（図５のシード層１２が形成された領域）に、二酸化珪素からなる繊維状突起物９が形成される。この方法によれば、この繊維状突起物９は、基板５のシリコン表面と直接接合した状態となり、耐熱性に優れるとともに、剥がれにくくなる。またこの繊維状突起物９は、基板５がシード層１２を核に成長するものであるため、他の物質が混在しにくく、不純物の少ない組成となる。
　なお、この焼成工程では、シード層１２が形成されていないシリコン基板５表面には、繊維状突起物９は形成されない。
　ここでこの焼成工程では、Ｃ、ＦまたはＣ、Ｆ、Ｈの各原子からなるシード層１２は焼失していると考えられ、親水性を阻害する要因とはならない。

　なお、繊維状突起物９は、金属触媒を用いて形成することも可能である。その場合は、はじめに基板５表面に、蒸着やスパッタ等によって、金属触媒層を形成する。触媒として使用する金属としては、Ａｕ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等が望ましく、金属触媒層の厚さとしては、数ｎｍ程度である。
　次に、金属触媒層を形成した上記基板５を、低酸素雰囲気下にて、１０００～１１５０℃で焼成すると、基板５の表面に、二酸化珪素からなる繊維状突起物９が形成される。この方法においても、この繊維状突起物９は、基板５のシリコン表面と直接接合した状態となり、耐熱性に優れるとともに、剥がれにくくなる。またこの繊維状突起物９は、基板５がシード層１２を核に成長するものであるため、他の物質が混在しにくく、不純物の少ない組成となる。
　なお、低酸素雰囲気とは、窒素、アルゴン等の雰囲気あるいは真空雰囲気からなる。
　なお、繊維状突起物９を、金属触媒を用いて上記方法により形成した場合は、繊維状突起物９に金属触媒が担持されていてもよい。
　次に、図８～１３を用いて、上述の繊維状突起物９とＤＮＡプローブ（図２の１０）とを結合させる方法について説明する。なお、図８～図１３は、説明を容易にするため、各構成要素で縮尺を変え、模式的に表したものである。
　（ａ）図８に示すように、基板５の表面を、シランカップリング剤を含むコーティング層１３で被覆する。このコーティング層１３には、その反応基を保護基で修飾されたリンカー分子（図示せず）が結合している。すなわち本実施の形態１では、前述の保護基は、リンカー分子およびコーティング層１３を介して繊維状突起物９の表面と結合している。この保護基は、本実施の形態１では、光に反応して脱保護可能な物質を用いた。保護基の例としては、オルト－ニトロベンジル誘導体、６－ニトロベラトリルオキシカルボニル、２－ニトロベンジルオキシカルボニル、シンナモイル誘導体などが挙げられる。なお、リンカー分子を用いない場合は、保護基と繊維状突起物９の反応基とを結合させればよい。
　（ｂ）次に、図９に示すように、基板５上の複数の領域６～８の内、一部の領域７、８のみ露出するように、マスク１４で基板５の表面をマスキングする。
　（ｃ）次いで、マスク１４の上方から基板５の表面に光を照射すると、保護基が除去され（脱保護）、リンカー分子の反応基が露呈する。図９で示すコーティング層１３Ａのリンカー分子は、保護基が除去され、反応基が露呈した状態である。ここで、照射光としては、保護基を脱保護可能な所定波長の光を用いる。
　（ｄ）その後、シリコン基板５上に、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）のいずれかのヌクレオチドモノマー１５を含む溶液を注入すると、図１０に示すように、露呈したリンカー分子の反応基と前述のモノマー１５とが結合する。
　なお、本実施の形態１では、リンカー分子を介して保護基と繊維状突起物９とが結合しているが、リンカー分子を用いず、保護基を直接繊維状突起物９と結合させている場合は、保護基が脱保護された繊維状突起物９の反応基とモノマー１５とが結合する。
　ここで、本実施の形態１では、このモノマー１５は、光反応性の保護基で修飾されたものを用いた。この保護基は、リンカー分子の保護基と同じ物質でもよく、別の物質でもよい。
　（ｅ）次に、図１１に示すように、また別のマスク１６をして、一部の領域６、７のみ露出させる。この露出させる領域６、７は、先の工程でモノマー１５を結合させた領域と同じでもよい。そしてこの領域６、７に、所定波長の光を照射して、領域７のモノマーおよび領域６のコーティング層のリンカー分子の保護基をそれぞれ脱保護する。なお図１１では、保護基が脱保護されたコーティング層１３Ａとモノマー１５Ａとを示す。
　（ｆ）そして、図１２に示すように、前述のモノマー１５を固定する工程と同じく、保護基で修飾されたモノマー１７の溶液を注入し、領域７の保護基が脱保護されたモノマー１５Ａ、および領域６の保護基が脱保護されたリンカー分子と結合させる。
　このように、異なるマスクを用い、四種のヌクレオチドモノマーをそれぞれ結合させる工程を繰り返すと、領域６～８毎に異なる種類のＤＮＡプローブ１０を形成することができる。
　なお、図１３（ａ）は領域６、図１３（ｂ）は領域７、図１３（ｃ）は領域８の繊維状突起物９表面に形成されたＤＮＡプローブ１０を、それぞれ模式的に示したものである。このＤＮＡプローブ１０を構成するヌクレオチドモノマーの数は、特に限定されないが、１０個～３０個程度（長さ０．００３～０．０１μｍ程度）が二本鎖形成に適している。またマスクの組み合わせにより、多種の配列のＤＮＡプローブ１０も迅速に形成することができる。
　また本実施の形態１では、保護基として光反応性保護基を用いたが、例えば電流や電解、イオンビームなどにより脱保護可能な物質を用いてもよい。この場合、保護基を脱保護する工程では、それぞれ電流や電解、イオンビームを印加すればよい。
　なお、本実施の形態１では、前述のように保護基を用いて反応領域を制御し、モノマーを重合させる方法を用いたが、例えばモノマーを、フォトリソ技術を用いて所定領域に積層する方法を用いても良い。
　また、上記実施の形態１では、基板５の所定領域６～８に選択的に繊維状突起物９を形成する方法として、予め基板５表面に保護膜（図４の１１）を形成する方法を例に挙げたが、その他の方法であってもよい。例えば先にシリコン基板５上の全域に繊維状突起物９を形成し、その後繊維状突起物９を残したい領域６～８を、樹脂等の保護膜で覆い、繊維状突起物９を除去したい領域の繊維状突起物９を、ＨＦやＢＨＦなど通常の薬剤を用いてエッチングして除去し、その後保護膜を除去すればよい。この場合は、露出した面に前述の熱酸化膜は形成されない。
　なお、保護膜を除去する方法としては、溶剤などの化学的処理によって保護膜を除去することが望ましい。それは、機械的処理に比べ、化学的処理の方が、微細な繊維状突起物９が壊れにくいからである。
　このように形成したＤＮＡセンサは、例えば予め蛍光物質などで標識したＤＮＡとＤＮＡプローブ１０とで二本鎖を形成させたり、あるいは形成された二本鎖に蛍光物質を挿入したりすることによって、二本鎖形成の有無を光で測定することができる。その他、二本鎖形成の有無は、光以外にも、電流や電圧の変化、あるいは表面の粗さなどで測定することができる。
　以下に本実施の形態１における効果を説明する。
　本実施の形態１ではセンサの感度を向上させることができる。その理由は、機能性分子であるＤＮＡプローブ１０を高密度に形成することができるからである。すなわち本発明は、上述の繊維状突起物９により基板５の表面積が増え、狭いスペースにも受容体を高密度に形成することができる。したがって、各ＤＮＡプローブ１０と相補的ＤＮＡ（リガンド分子）との反応を十分得ることができ、大きな信号として検出することができる。そしてその結果、センサの感度を向上させることができる。
　また本実施の形態１では、繊維状突起物９が二酸化珪素で構成されているため、その表面は基板５の表面と比較して、よりヒドロキシル化されている。したがって、リンカー分子などとの化学物質との結合性が高まり、ＤＮＡプローブ１０をより高密度に固定することができる。
　また、繊維状突起物９が形成されている領域は、基板５の露出面（繊維状突起物９が形成されていない面）と比較して、高い親水性および保水性を有している。したがって、この基板５上に極性溶媒を供給する場合、極性溶媒は繊維状突起物９との親和性が高いため、ＤＮＡプローブ１０の形成領域において気泡の発生を抑制することができる。すなわち本実施の形態１では、例えば基板５上にモノマー溶液を注入したり、あるいは測定液を注入したりする工程において、気泡が発生しにくい。そしてその結果、ＤＮＡプローブ１０をより高密度に形成し、あるいは測定を高精度に行うことができる。なお親水性、保水性の少なくとも一方を有していれば、気泡の低減に寄与する。
　さらに、本実施の形態１では、ＤＮＡプローブ１０を繊維状突起物９上に形成しているため、このＤＮＡプローブ１０が固定される領域は、フラットな面と比較して反射率が低くなる。したがって、例えば蛍光で分析する場合、基板５からの反射光にはシリコン原子に光を照射した場合に生じる励起光が混じり、蛍光検出の際にノイズ要因となることがあるが、本発明では繊維状突起物９に遮られて前記励起光が低減できるので結果としてノイズを低減することができる。
（実施の形態２）
　本実施の形態２と実施の形態１との主な違いは、図１５に示すように、基板５の形状である。すなわち本実施の形態２では、予め基板５の表面にウエットエッチングあるいはドライエッチングなどにより凹部１８を形成し、その凹部１８の底面に繊維状突起物９を形成したものである。これにより本実施の形態２では、各領域６～８の繊維状突起物９が、各領域６～８を越えて成長するのを抑制することができる。すなわち、表面拡散の抑制により、繊維状突起物９の成長方向が抑制される。従って、繊維状突起物９が形成される領域の形状精度を向上することができる。
　さらに本実施の形態２では、例えば基板５上にモノマー溶液を注入したり、あるいは測定液を注入したりする工程において、モノマー溶液や測定液の拡散を防ぐことができる。従って、センサの検査感度が向上する。
　なお、本実施の形態２では、繊維状突起物９を凹部１８の底面および側壁面に形成したが、凹部１８の底面のみ、または側壁面のみに形成してもよい。
　なお、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも深くすることで、拡散を抑制しやすいため好ましい。より好ましくは、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも数十μｍ以上深くすることがよい。なお、凹部１８の範囲は目的に応じて適宜選択することができる。
なお、その他の実施の形態１と同様の構成および効果については説明を省略する。
　なお、上記実施の形態２では、センサとしてＤＮＡセンサを例に挙げ、機能性分子はＤＮＡプローブとしたが、機能性分子をＲＮＡにしてもよい。ＲＮＡもＤＮＡと同様に、保護基を用いて容易に所定領域に形成することができる。
（実施の形態３）
　本実施の形態３では、ＤＮＡなどの核酸配列（塩基配列）を測定するシークエンサーについて説明する。
　図１６に示すように、本実施の形態３のシークエンサーも、実施の形態１のＤＮＡセンサと同様に、基材としての基板１９と、この基板１９の領域２０～２２上に選択的に形成された複数の繊維状突起物２３を有している。本実施の形態３では、各領域２０～２２内における複数の繊維状突起物２３の間隔（根元部分における間隔）を１～１０μｍとし、太さを０．０１μｍ～１０μｍとした。また繊維状突起物２３の長さは全長で１～５００μｍ程度である。
　また、この繊維状突起物２３は、実施の形態１と同様に、より表面積を大きくするため、細かくうねったりカールしたりするまで成長させたものであり、一本一本は縮れた形状であって、互いに絡み合った状態で密集している。さらに自由な方向へ枝分かれしているものが混在していてもよい。これにより外圧に対しても応力負荷を分散しやすく、機械的強度の強い構造となる。
　また本実施の形態３の繊維状突起物２３は、実施の形態１と同様にアモルファスの二酸化珪素からなり、単結晶の二酸化珪素と比較して折れにくい構成となっている。
　このような繊維状突起物２３の製造方法については、実施の形態１に示すＤＮＡセンサと同様であり、まず基板１９上で、プラズマＣＶＤ法を用いてフッ化炭素系のガスをプラズマ中で分解し、Ｃ、Ｆ元素またはＣ、Ｆ、Ｈ元素を含んだ有機ポリマーからなるシード層を形成する。低酸素雰囲気下にて、１０００～１１５０℃で焼成することで形成できる。なお、繊維状突起物２３は、金属触媒を用いて形成することも可能である。詳細については、実施の形態１と同様である為説明を省略する。
　次に、本実施の形態３のシークエンサーを用いた核酸増幅方法について説明する。
　（ａ）はじめに、核酸配列（塩基配列）を測定したいＤＮＡまたはＲＮＡ（以下核酸という）をＥｃｏＲＩやＨｈａＩなどの酵素を用いてランダムに分断し、図１７（ａ）に示す核酸断片２４を形成する。核酸断片２４の長さは、後述する配列読み出し工程における読み出し精度にもよるが、通常１０から４０００塩基対の長さである。この核酸断片２４は一本鎖または二本鎖の形態のいずれでもよい。
　（ｂ）次に、この核酸断片２４の一端にオリゴヌクレオチド配列Ｙ１を含むアダプター２５、他端にオリゴヌクレオチド配列Ｚ１を含むアダプター２６を結合させ、図１７（ａ）に示すような核酸鋳型Ｔ１を形成する。なお、オリゴヌクレオチド配列とは、いくつかの塩基対からなる短いヌクレオチド配列の配列を指し、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）あるいはウラシル（Ｕ）の塩基を構成要素とする。
　オリゴヌクレオチド配列Ｙ１およびオリゴヌクレオチド配列Ｚ１は、５～１００程度のヌクレオチドで構成されることが好ましい。また本実施の形態３では、核酸鋳型Ｔ１の最も末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙ１およびＺ１を結合させたが、末端近傍（好ましくは、核酸鋳型Ｔ１の５’末端、あるいは３’末端から０から１００ヌクレオチド以内）であれば支持体１と接合できる。
　（ｃ）さらに本実施の形態３では、複数のコロニープライマーＸ１およびＸ２を準備する。このコロニープライマーＸ１は、オリゴヌクレオチド配列Ｚ１とハイブリタイズ可能な配列を有し、コロニープライマーＸ２は、コロニープライマーＸ１の伸長により形成された核酸鋳型（後述のＴ２）のオリゴヌクレオチド配列（後述のＺ２）とハイブリタイズ可能な配列を有する。すなわちコロニープライマーＸ２は、オリゴヌクレオチド配列Ｙ１と対応する配列を有する。
　（ｄ）次に本実施の形態３では支持体１の繊維状突起物２３のＯＨ基をＡＴＳ（アミノプロピルトリエトキシシラン）などで誘導し、繊維状突起物２３表面を、二官能性結合剤により官能化する。
　（ｅ）そしてこの官能化された繊維状突起物２３表面に、コロニープライマーＸ１、Ｘ２と核酸鋳型Ｔ１を含む溶液を提供し、図１７（ｂ）に示すように、コロニープライマーＸ１、Ｘ２と核酸鋳型Ｔ１のそれぞれの５’末端を繊維状突起物２３表面と共有結合させる。なお、図１７（ｂ）の斜線部分は、繊維状突起物２３を示す。ここで本実施の形態３では、アミド結合により繊維状突起物２３表面とコロニープライマーＸ１、Ｘ２および核酸鋳型Ｔ１を結合したが、その他の結合としては、エステル結合やチオール結合などの共有結合なども挙げられる。
　（ｆ）次に、図１７（ｃ）に示すように、繊維状突起物２３に結合した核酸鋳型Ｔ１およびコロニープライマーＸ１を誘導し、核酸鋳型Ｔ１のオリゴヌクレオチド配列Ｚ１（アダプター２６）とコロニープライマーＸ１とを、ハイブリダイゼーションさせる。この時の誘導条件としては、例えば約６５℃の温度に供することが挙げられる。
　（ｇ）その後、図１７（ｄ）に示すように、適切な温度条件および核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素分子、またはＲＮＡポリメラーゼなど）の存在下、４種のヌクレオチド前駆体、すなわち４種のデオキシヌクレオシド３リン酸〔デオキシアデノシン３リン酸(以下ｄＡＴＰと略)、デオキシグアノシン３リン酸(以下、ｄＧＴＰと略)、デオキシシチジン３リン酸(以下、ｄＣＴＰと略)、デオキシチミジン３リン酸（以下、ｄＴＴＰと略）〕を基質として核酸を合成する。
　（ｈ）このように核酸ポリメラーゼが、コロニープライマーＸ１をその３’末端から核酸鋳型Ｔ１を鋳型として伸長させ、このプライマー伸長が完了したら、最初の核酸鋳型Ｔ１に相補な第２の核酸鎖、すなわち核酸鋳型Ｔ２が生成する。
　（ｉ）その後、例えば加熱することにより、図１７（ｅ）に示すように、繊維状突起物２３上には、分離された２つの核酸鎖（核酸鋳型Ｔ１、Ｔ２）が固定化された状態となる。
　（ｊ）そして図１７（ｆ）に示すように、最初に固定化された核酸鋳型Ｔ１、およびコロニープライマーＸ１が伸長して形成された核酸鎖（核酸鋳型Ｔ２）は、いずれも核酸鋳型として機能する。すなわち、核酸鋳型Ｔ１及び核酸鋳型Ｔ２は、他の固定化されたコロニープライマーＸ１あるいはコロニープライマーＸ２とハイブリタイズし、それぞれプライマー伸長が起こり、核酸鎖が分離して、繊維状突起物２３に固定化された核酸鎖を増幅していく。このように核酸鎖が増幅され、核酸コロニーは生成される。なお本実施の形態３では、この核酸コロニーは、最初の核酸鋳型Ｔ１に対応する配列であるものと、この核酸鋳型Ｔ１に相補的（すなわち核酸鋳型Ｔ２に対応）な配列であるものを含む。
　以上のように、支持体１上の他の領域でも同様に、ランダムに分断された核酸を鋳型にして、二種類の核酸鎖からなる核酸コロニーを形成できる。この核酸コロニーは、たとえば１０μｍ未満の小さい間隔で形成することによって、より小型化に寄与する。
　次に、上述のように核酸を増幅させた後には、核酸配列を測定することができる。
　本実施の形態３では、核酸コロニーを構成する二種類の核酸鎖のうち、核酸鋳型Ｔ１の配列について測定する。この時、例えば核酸鋳型Ｔ１に相補的な核酸鎖は、繊維状突起物２３から切り離せばよい。すなわち、核酸鋳型Ｔ２はコロニープライマーＸ１を介して繊維状突起物２３と結合しているため、コロニープライマーＸ１を制限酵素などで繊維状突起物２３から切り離すことができる。これにより、図１８（ａ）に示すように、核酸鋳型Ｔ１に対応する核酸鎖のみからなる核酸コロニーを構成することができる。
　次に、核酸鋳型Ｔ１の３’末端側のオリゴヌクレオチド配列Ｚ１とハイブリタイズできるプライマー２７と、修飾された四種のヌクレオチド前駆体（図１８（ａ）に示すＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、および核酸ポリメラーゼを含む溶液を繊維状突起物２３上に流す。この時、四種のヌクレオチド前駆体をそれぞれ異なる励起光を発するように、種々の蛍光物質で修飾しておく。するとこの蛍光物質は、ヌクレオチド前躯体がハイブリタイズする瞬間に、レーザ光によって励起され、蛍光発色する。この時、一つの核酸コロニーでは四種のヌクレオチド前躯体のうち一種が結合するため、核酸コロニーによってそれぞれの波長の発色を確認する事ができる。次に図１８（ｂ）に示すように、再び繊維状突起物２３上に四種のヌクレオチド前躯体と酵素とを流し込むことによって、次のヌクレオチド前躯体がプライマー２７から伸長して核酸鋳型Ｔ１にハイブリタイズし、特異な波長で発色する。
　このようにプライマー２７が伸長し、３’末端側から核酸鋳型Ｔ１と相補的な核酸配列が形成されていく過程では、核酸鋳型Ｔ１のヌクレオチド配列によって種々の順番で発色がおこる。したがって、この発色をレコードすることによって、核酸コロニー毎に、核酸鋳型のヌクレオチド配列を読み取ることができ、それぞれの拡散断片の配列が明らかとなる。
　なお、上記図１８（ａ）において、ヌクレオチド前駆体に、一つのハイブリタイズ反応が起こった後に続けて伸長反応が起こらないように化学修飾しておけば、一本鎖上の一つのヌクレオチド配列を確実に決定できる。つまり、この後に化学修飾物質を除去し、再び化学修飾されたヌクレオチド前駆体を流すことで、反応を一つ一つ確実に決定できる。
　ここで核酸鋳型は、配列を測定したい核酸を予め多数準備し、それらをランダムに分断して形成しておけば、核酸断片の配列だけでなく、もとの核酸の配列まで分析することができる。本実施の形態３では、支持体１を複数の領域に区分けし、この区分けされた領域に選択的に繊維状突起物２３を形成するとともに、領域毎にそれぞれ核酸コロニーを形成している。したがって、表１に示すように、それぞれの領域の核酸コロニーから読み取った配列を比較し、同じ配列部分があればその部分を重複するように並べることによって、少しずつ元の核酸の全体配列を読み取っていくことが出来る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施の形態３における効果を以下に説明する。
　本実施の形態３では、単位領域における核酸の密度が増し、核酸配列の測定精度を高めることができる。その理由は、基板１９上に複数の繊維状突起物２３を形成し、この繊維状突起物２３上で核酸を増幅させたからである。これにより本実施の形態３では、支持体１の表面積が増え、一領域における核酸の増幅量が多くなる。そしてその結果、核酸コロニー全体から検出できる信号が大きくなり、核酸配列の測定精度を高めることができる。
　また、本実施の形態３では、繊維状突起物２３が二酸化珪素で構成されているため、その表面は基板１９の表面と比較して、よりヒドロキシル化されている。したがって、核酸鋳型やコロニープライマーなどを結合するための化学物質との結合性が高まり、より高密度に核酸鋳型およびコロニープライマーを固定することができる。
　また、図１６に示すように、繊維状突起物２３が形成されている領域２０～２２は、基板１９の露出面（繊維状突起物２３が形成されていない面）と比較して、高い親水性を有している。したがって、この基板１９上に極性溶媒を供給する場合、極性溶媒は繊維状突起物２３との親和性が高いため、核酸鋳型Ｔ１およびコロニープライマーＸ１、Ｘ２の形成領域において気泡の発生を抑制することができる。したがって測定も高精度に行うことができる。
　さらに、本実施の形態３では、核酸鋳型Ｔ１を繊維状突起物２３上に形成したため、この核酸鋳型Ｔ１が固定される領域は、フラットな面と比較して反射率が低くなる。したがって、例えば蛍光で分析する場合、基板１９からの反射光にはシリコン原子に光を照射した場合に生じる励起光が混じり、蛍光検出の際にノイズ要因となることがあるが、本発明では繊維状突起物２３に遮られて前記励起光が低減できるので結果としてノイズを低減することができる。
　なお、本実施の形態３では、各領域２０～２２に複数の繊維状突起物２３を形成したが、各領域２０～２２に一つの繊維状突起物２３を形成してもよい。この場合も、基板１９の表面積は増え、核酸をより増幅させることができる。
　また本実施の形態３では、繊維状突起物２３上で核酸鋳型Ｔ１を鋳型にして、固定化された核酸を増幅したが、核酸鎖の固定方法はこれ以外でもよい。例えば、予め増幅した核酸を繊維状突起物２３上に流し、それぞれを結合させ、固定してもよい。このように本実施の形態３の繊維状突起物２３を用いたシークエンサーは、種々の核酸の固定に用いられる。そしてそれぞれの方式のシークエンサーにおいて、繊維状突起物２３によって基板１９の表面の表面積が大きくなっているため、単位領域で固定できる核酸の数が増え、測定できる信号も大きくなる。したがって、核酸配列の測定精度を高めることができる。
　更に、本実施の形態３では、核酸配列の測定方法として、固定された核酸鎖（核酸鋳型）とヌクレオチド前躯体とのハイブリタイズによる蛍光を分析する方法を例に挙げたが、この測定方法は一例であり、種々の方法を用いることができる。例えば固定された核酸鎖とヌクレオチド前駆体とのハイブリタイズ反応によって変化する電磁場状態を、光、あるいは電気的な信号の変化として配列を測定する方法などもある。
（実施の形態４）
　本実施の形態４と実施の形態３との主な違いは、図１９に示すように、基板１９の形状である。すなわち本実施の形態４では、予め基板１９の表面にウエットエッチングあるいはドライエッチングなどにより凹部２８を形成し、その凹部２８の底面に繊維状突起物２３を形成したものである。これにより本実施の形態４では、各領域２０～２２の繊維状突起物２３が、領域２０～２２を越えて成長するのを抑制することができる。すなわち、表面拡散の抑制により、繊維状突起物２３の成長方向が抑制される。従って、繊維状突起物２３が形成される領域の形状精度を向上することができる。したがって、領域２０～２２毎に各核酸コロニーを形成することができ、信号を高精度に測定できる。さらに本実施の形態４では、例えば基板５上にモノマー溶液を注入したり、あるいは測定液を注入したりする工程において、モノマー溶液や測定液の拡散を防ぐことができる。従って、センサの検査感度が向上する。
　なお、本実施の形態４では、繊維状突起物２３を凹部２８の底面および側壁面に形成したが、凹部２８の底面のみ、または側壁面のみに形成してもよい。
　なお、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも深くすることで、拡散を抑制しやすいため好ましい。より好ましくは、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも数十μｍ以上深くすることがよい。なお、凹部１８の範囲は目的に応じて適宜選択することができる。
　なお、その他の実施の形態１と同様の構成および効果については説明を省略する。その他の実施の形態３と同様の構成および効果については説明を省略する。
　なお、上記実施の形態１～４では、基材として平板状の基板を用いたが、例えば球形やキューブ形など、種々の形状の基材を用いてもよい。
　本発明に係るセンサは、ＤＮＡセンサとして用いることができる。また、ＤＮＡセンサ以外にも、タンパク質センサや糖センサ、抗原抗体センサ等の各種センサに用いることが出来る。これら各種センサに用いるには、それぞれ検出したいリガンド分子を捕捉可能な受容体や反応性物質を繊維状突起物表面に結合させ、リガンド分子との結合を測定するセンサや、あるいは機能性分子として、測定したいリガンド分子を繊維状突起物表面に結合させ、これらの受容体や反応性物質と反応させるセンサが挙げられる。機能性分子がポリマーであれば、保護基を用いてモノマーを所定領域に重合できる。さらに本発明のシークエンサーでは、ＤＮＡなどの核酸配列を高精度に測定することができる。
５　基板
６、７、８　領域
９　繊維状突起物
１０　ＤＮＡプローブ（機能性分子）
１１　保護膜
１２　シード層
１３　コーティング層
１３Ａ　コーティング層
１４　マスク
１５　モノマー
１５Ａ　モノマー
１６　マスク
１７　モノマー
１８　凹部
１９　基板
２０～２２　領域
２３　繊維状突起物
２４　核酸断片
２５　アダプター
２６　アダプター
２７　プライマー
２８　凹部

Claims (4)

  1. 　シリコンからなる表面を有する基材と、
    　前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、
    を備え、
    　前記繊維状突起物上に複数の核酸鎖を固定し、前記核酸鎖の核酸配列を測定するシークエンサー。
  2. 　前記核酸鎖は、前記繊維状突起物上で同一の配列を持つ複数の核酸鎖が同一領域に固定されている、請求項１に記載のシークエンサー。
  3. 　シリコンからなる表面を有する基材と、
    　前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、
    を備え、
    　前記繊維状突起物上に核酸鋳型を固定して、前記核酸鋳型を鋳型として核酸を増幅し、増幅された核酸鎖の配列を測定するシークエンサー。
  4. 　シリコンからなる表面を有する基材と、
    　前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、
    を備え、
    　前記基材上には凹部が形成され、前記凹部の底面もしくは側壁面の少なくとも一方には、前記繊維状突起物が形成されている請求項１又は３に記載のシークエンサー。
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