[go: up one dir, main page]

WO2010001619A1 - 免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法 - Google Patents

免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010001619A1
WO2010001619A1 PCT/JP2009/003097 JP2009003097W WO2010001619A1 WO 2010001619 A1 WO2010001619 A1 WO 2010001619A1 JP 2009003097 W JP2009003097 W JP 2009003097W WO 2010001619 A1 WO2010001619 A1 WO 2010001619A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
measurement
immunological measurement
reagent
hemoglobin
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/003097
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
光章 山本
明子 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sekisui Medical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sekisui Medical Co Ltd filed Critical Sekisui Medical Co Ltd
Priority to EP09773197.0A priority Critical patent/EP2295969B1/en
Priority to CN200980125714.2A priority patent/CN102405412B/zh
Priority to JP2010518932A priority patent/JP5443355B2/ja
Priority to US13/002,467 priority patent/US8722342B2/en
Publication of WO2010001619A1 publication Critical patent/WO2010001619A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for enhancing sensitivity in immunological measurement or a method for avoiding the influence of hemoglobin and a reagent therefor.
  • an immunological measurement method there are many methods such as RIA method, EIA method, immunoturbidimetric method, latex agglutination method, metal colloid agglutination method, and immunochromatography method.
  • the latex agglutination method and the metal colloid agglomeration method are suitable for automation because they do not separate or wash the reaction solution, and are widely used.
  • immunological measurement generally, a method according to the concentration of a substance to be measured in a biological sample to be measured is properly used.
  • the latex agglutination method and the metal colloid agglutination method can measure trace substances rather than immunoturbidity, but cannot measure the trace substances as much as the RIA method and EIA method.
  • any immunological measurement method it is desired to reduce the amount of reaction system and shorten the measurement time, and it is important to enhance the measurement sensitivity.
  • Patent Documents 1 and 2 As a technique for enhancing the measurement sensitivity, a technique of adding a water-soluble polysaccharide such as polyethylene glycol or dextran to the reaction system is known (Patent Documents 1 and 2). However, since these additives have a molecular weight distribution and are not a single compound, there are disadvantages such that a stable sensitivity enhancement effect cannot be obtained.
  • any immunological measurement method there is a problem that aggregation and adsorption due to non-specific reactions with various contaminants in the sample occur in addition to the target antigen-antibody reaction, resulting in a decrease in measurement accuracy.
  • the hemoglobin may affect the measurement value in the immunological measurement.
  • an accurate measurement value cannot be obtained, and it is necessary to take a method to avoid the influence.
  • Patent Document 3 a method of adding a surfactant (Patent Document 3) and the like have been devised.
  • the method of adding a surfactant has a problem that the measurement sensitivity is lowered and the target substance cannot be measured with high accuracy.
  • Patent Document 4 describes that in a method for immunological measurement of CRP in human serum using anti-human CRP rabbit serum, nonspecific reaction due to complement components can be suppressed by adding polyhydric phenol. As a specific example, it is described that nonspecific reaction by complement or the like could be suppressed by adding 5 mM of calix sulfate (6) arene.
  • Patent Document 4 only describes the action of calixarenes on the effect of complement when human serum is used as a sample and CRP is measured using anti-human CRP rabbit serum. It does not describe at all what kind of effect the class has on the sensitivity and the effect on the influence of hemoglobin. Furthermore, there is no description of a method for measuring an antigen or antibody to be measured using an antibody against the antigen or an insoluble carrier (for example, latex particles) sensitized with the antigen against the antibody.
  • an insoluble carrier for example, latex particles
  • An object of the present invention is to provide a method for enhancing sensitivity in immunological measurement of a measurement target and an immunological measurement reagent with enhanced sensitivity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for avoiding the influence of hemoglobin in a system for measuring a substance to be measured in a biological sample such as plasma using an immunological measurement method.
  • the present inventors have studied a method for enhancing the sensitivity of measurement in an immune reaction.
  • a macrocyclic compound such as calixarene
  • the final concentration in the reaction system is 5 mM.
  • the reagent blank value becomes abnormal and the concentration-dependent increase in measurement sensitivity of the substance to be measured is not observed, at a low concentration of 0.005 to 4 mM in the reaction system, the measurement sensitivity is low. Since enhancement was observed, it was found that accurate measurement can be performed even when a sample having a low concentration of the substance to be measured is used. Further, it has been found that when a macrocyclic compound is added to the reaction system, the influence of hemoglobin in the sample can be avoided, and accurate measurement can be performed even when the concentration of the substance to be measured is low.
  • the present invention relates to an immunological measurement method for measuring a substance to be measured in a biological sample using an antigen-antibody reaction, wherein the reaction is performed in the presence of a macrocyclic compound, and the sensitivity in the immunological measurement
  • An enhancement method or a method for avoiding the influence of hemoglobin is provided.
  • the present invention relates to an immunological measurement method for measuring a substance to be measured in a sample by using an antigen-antibody reaction, comprising a sensitivity enhancer mainly comprising a macrocyclic compound or a hemoglobin influence avoiding agent.
  • a feature of the reagent for immunological measurement is provided.
  • the measurement sensitivity of the measurement target substance is enhanced, accurate measurement is possible even when a sample having a low concentration of the measurement target substance is used.
  • the immunological measurement method of the present invention the influence of hemoglobin in a sample derived from a living body can be avoided, so that accurate measurement is possible even when the sample contains hemoglobin.
  • the macrocyclic compounds for example, calixarenes and cyclodextrins
  • the macrocyclic compounds are available as a single compound, there is no difference between lots, and a stable measurement accuracy improvement effect can be obtained.
  • the sample in the method of the present invention is preferably a biological sample, and particularly preferably a biological sample in which red blood cells or hemoglobin derived from red blood cells may exist.
  • red blood cells or hemoglobin derived from red blood cells may exist.
  • examples include cerebrospinal fluid, tear fluid, tissue fluid, blood, plasma, and serum.
  • blood-derived samples that is, blood, plasma, serum and the like often contain hemoglobin and are particularly useful.
  • the immunological measurement method is not particularly limited as long as it is an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction between a measurement target substance and a substance capable of antigen-antibody reaction with the target substance.
  • examples thereof include an immunodiffusion method (SRID method), an immunoturbidimetric method, an erythrocyte aggregation method, a latex aggregation method, a metal colloid aggregation method, an RIA method, and an EIA method.
  • SRID method immunodiffusion method
  • an immunoturbidimetric method an immunoturbidimetric method
  • an erythrocyte aggregation method e.g.
  • a latex aggregation method erythrocyte aggregation method
  • a latex aggregation method e.g., a metal colloid aggregation method
  • an RIA method e.g.
  • EIA method e.g., agglutination method and the metal colloid agglomeration method
  • an insoluble carrier sensitized with an antibody
  • the insoluble carrier include organic polymer particles, inorganic substance particles, and red blood cells.
  • the organic polymer particles include particles such as insoluble agarose, cellulose, and insoluble dextran, and latex particles are preferable.
  • the latex particles include polystyrene, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, acrylonitrile butadiene.
  • examples thereof include particles such as styrene copolymer, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, and polyvinyl acetate acrylate. Furthermore, you may use various modified
  • the average particle size of the latex particles to be used is appropriately selected from 0.05 to 0.50 ⁇ m depending on the measuring instrument.
  • examples of inorganic substance particles include silica and alumina.
  • the substance to be measured in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance measured by an immunological measurement method, and examples thereof include various substances such as antigens, haptens, antibodies, hormones, drugs and the like. Especially, what uses an antigen as a measuring object substance is preferable, and a protein antigen is more preferable.
  • CRP fibrin and fibrinogen degradation products
  • D dimer soluble fibrin
  • SF lipoprotein
  • a) lipoprotein
  • MMP-3 matrix metalloproteinase-3
  • PSA prostate specific antigen
  • IgG IgA, IgM, IgE, IgD
  • anti-streptolysin O rheumatoid factor
  • transferrin haptoglobin
  • ⁇ 1-antitrypsin ⁇ 1-acid glycoprotein
  • ⁇ 2-macroglobulin hemopexin
  • antithrombin-III ⁇ -Fetoprotein
  • CEA calcinoembryonic antigen
  • Anti-HBs anti-hepatitis B envelope antibody
  • HBe-Ag hepatitis B e antigen
  • Anti-HBe anti-hepatitis B e antibody
  • Anti- And the like bc hepatitis B
  • the substance capable of antigen-antibody reaction with the measurement target substance when the measurement target substance is an antigen or hapten, the antibody is used.
  • the measurement target substance is an antibody
  • the substance is used.
  • An antigen is used.
  • Antigens and antibodies as immunoreactive substances can be prepared by conventional methods.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may further be a Fab fraction, a F (ab ′) 2 fraction, or the like.
  • the macrocyclic compound used in the present invention is a functional molecule that enables the incorporation of metal ions, inorganic substances, organic substances and the like into the pores of the molecule.
  • the macrocyclic compound is not particularly limited, and various compounds can be used.
  • calixarenes, cyclodextrins, crown ethers and the like can be used.
  • these derivatives and modifications can also be used.
  • those having pores that can easily include hydrophobic molecules, but having at least four hydrophilic functional groups are preferred.
  • the hydrophilic functional group include a hydroxyl group, a carboxyl group, and a sulfonic acid group.
  • Particularly preferred macrocyclic compounds include calixarenes and cyclodextrins.
  • Calixarenes are cyclic oligomers in which phenol is a basic skeleton and 3 to 20 molecules, preferably 4 to 8 molecules of phenol are cyclically polymerized with a methylene group.
  • the calixarene is not particularly limited, and various kinds can be used.
  • calix (4) arene, calix (6) arene, calix (8) arene, calix (4) arene sulfonic acid, calix (6) arene sulfonic acid, calix (8) arene sulfonic acid, calix (4) arene acetic acid , Calix (6) arene acetic acid, calix (8) arene acetic acid, calix (4) arene carboxylic acid, calix (6) arene carboxylic acid, calix (8) arene carboxylic acid, calix (4) arene amine, calix (6) Examples are areneamine, calix (8) areneamine, salts thereof and the like.
  • calix (6) arene sulfonic acid
  • calix (8) arene sulfonic acid
  • salts thereof are preferable.
  • Calix [6] arene p-sulfonic acid, hexasodium salt, hydrate or Calix [8] arene p-sulfonic acid, octosodium salt, hydrate can be those commercially available from Dojindo Laboratories, etc. It can be preferably used because it is easily available.
  • resorcinolene having resorcinol as a basic skeleton pyrogallol allene having pyrogallol as a basic skeleton
  • calic spirol having pyrrole as a basic skeleton can also be used. Two or more of these calixarenes may be used in combination.
  • the concentration of calixarenes in the reaction system is preferably 0.005 to 4 mM, more preferably 0.005 to 3 mM, still more preferably 0.005 to 2.5 mM, and particularly preferably 0.01 to 2 mM in the final concentration. It is adjusted and used so that it becomes.
  • Cyclodextrin is a kind of cyclic oligosaccharide having a cyclic structure in which several molecules of D-glucose are bonded by ⁇ (1 ⁇ 4) glucoside bond, and one having 5 or more glucose bonded thereto is known. Generally, 6 to 8 glucose bonds are used, with 6 bonds being ⁇ -cyclodextrin (cyclohexaamylose) and 7 bonds being ⁇ -cyclodextrin. (Cycloheptaamylose), eight linked ones is ⁇ -cyclodextrin (cyclooctaamylose), but is not limited thereto.
  • modified products of the various dextrins described above can be used, and cyclodextrins in which the hydrogen atom of the hydroxyl group of cyclodextrin is substituted with various substituents or salts thereof are used.
  • cyclodextrins in which the hydrogen atom of the hydroxyl group of cyclodextrin is substituted with various substituents or salts thereof are used.
  • an alkylated cyclodextrin substituted with an alkyl group an acylated cyclodextrin substituted with an acyl group, a carboxyalkylated cyclodextrin substituted with a carboxyalkyl group, a hydroxyalkylated cyclodextrin substituted with a hydroxyalkyl group, A sulfoalkylated cyclodextrin substituted with a sulfoalkyl group, or a salt thereof.
  • cyclodextrin in which the hydroxyl group of cyclodextrin and various acids are ester-bonded or a salt thereof, such as cyclodextrin sulfate, or a salt thereof (sodium salt is also referred to as cyclodextrin sulfate), cyclodextrin phosphate or the like And the like.
  • branched cyclodextrins in which the hydroxyl group at the 6-position of glucose constituting the cyclodextrin and the hydroxyl groups of sugars such as glucose and maltose are subjected to dehydration condensation are exemplified.
  • ⁇ -cyclodextrin can be preferably used.
  • the concentration of cyclodextrin in the reaction system is preferably 1 to 400 mM, particularly 1 to 100 mM.
  • calixarenes are preferred as main components.
  • calixarenes when used as a sensitivity enhancer for measurement, calixarenes should be adjusted to a final concentration of 0.005 to 4 mM, more preferably 0.005 to 3 mM, and particularly 0.005 to 2.5 mM in the reaction system. preferable.
  • calixarenes When used as an agent for avoiding the influence of hemoglobin, calixarenes are preferably adjusted to a final concentration of 0.005 to 3 mM, more preferably 0.01 to 2 mM in the reaction system.
  • the macrocyclic compound may be present in the antigen-antibody reaction system, and may be added to the sample before the antigen-antibody reaction, or may be added to a reagent containing an immunoreactive substance. Moreover, you may add in the buffer used in the case of reaction.
  • the absorbance measurement may be performed by either the endpoint method or the rate assay method.
  • the method of the present invention is not limited to the above method, and can be carried out by appropriately changing according to the immunological measurement method to be used, and the buffer solution to be used, the measurement conditions, etc. can be appropriately changed. That's fine.
  • the reagent used in the method of the present invention is a reagent used in the above method, and the reagent contains a sensitivity enhancement agent for measurement mainly comprising the macrocyclic compound or a hemoglobin influence avoidance agent. .
  • the reagent can be appropriately set according to the type of immunological measurement method, and may be a kit comprising a plurality of constituent reagents. In this case, at least one of the constituent reagents is the macrocycle. What is necessary is just to contain a compound.
  • the pH in the immunological measurement method of the present invention is in the range of 4.5 to 9.5, preferably 5.5 to 8.5.
  • suitable buffers such as phosphate buffer, Tris-HCl buffer, succinate buffer, glycine buffer or glycylglycine, MES (2- (N-monophorino) ethanesulfonic acid), HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazine-N′-ethanesulfonic acid), TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid ), PIPES (piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)), DIPSO (3- (N′N-bis (2-hydroxyethyl) amino) -2-hydroxypropanesulfonic acid), Tricine (Tris) (Hydroxymethyl) methylglycine), TAPS (N-tris) (
  • the concentration of sodium azide is 0.01 to 1%, preferably 0.03 to 0.3%.
  • Animal serum, ⁇ -globulin or specific antibodies and albumin can be derived from cattle, horses, pigs, sheep, rabbits, humans, rats, etc., their denatured products and degradation products can be selected, and the addition concentration can also be selected appropriately it can.
  • Sodium chloride is preferably near physiological saline concentration. The use concentration of other substances can be selected as appropriate.
  • Example 1 (Measurement of Soluble Fibrin (SF)) (1) Preparation of First Reagent Calix [8] arene p-sulfonic acid, octosodium salt, hydrate or Calix [6] arene p-sulfonic acid, hexasodium salt, hydrate (manufactured by Dojindo Laboratories) First reagent added to 30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0.4% bovine serum albumin and 0.5 M sodium chloride at a concentration of 10 mM (final concentration of 0.005 to 5 mM in the reaction system) It was. As a comparative example, the first reagent not containing calixarene was used.
  • Anti-SF monoclonal antibody was diluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to 0.7 mg / mL.
  • the antibody solution and 1% suspension of polystyrene latex manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd. having an average particle size of 0.2 ⁇ m were mixed in equal amounts and stirred at 4 ° C. for 2 hours.
  • Sample Soluble fibrin was prepared by adding acid-soluble desAABB fibrin prepared by allowing thrombin to act on purified fibrinogen to a final concentration of 10.3 ⁇ g / mL in human citrate plasma. Saline was used for the measurement of the reagent blank.
  • Example 2 Measurement of Soluble Fibrin (SF)
  • acid-soluble desAABB fibrin was added to human citrate plasma to a final concentration of 10.3 and 20.1 ⁇ g / mL to prepare soluble fibrin. Measurement was performed using a reagent containing 0.005 to 2 mM of each calixarene.
  • the second reagent was the same as in Example 1. Further, as a comparative example, the first reagent not containing calixarene was used. The relationship between the obtained absorbance and the SF concentration is shown in Tables 3 and 4.
  • Example 3 (Measurement of Lipoprotein (a) (Lp (a)))
  • First Reagent Calix [8] arene p-sulfonic acid, octosodium salt, hydrate or Calix [6] arene p-sulfonic acid, hexasodium salt, hydrate (manufactured by Dojindo Laboratories)
  • the first reagent was prepared by mixing with 0.05 M glycine buffer (pH 9) containing 0.2 M sodium chloride at a concentration of 5 mM (final concentration of 0.005 to 2.5 mM in the reaction system).
  • the first reagent not containing calixarene was used.
  • Anti-Lp (a) Antibody-Immobilized Particle Suspension Using purified human apo (a) as an immunogen and obtained from mice by a conventional method, immunoaggregation occurs by using a single type Monoclonal antibody (produced by Hybridoma 28205 (FERM BP-3755) deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, hereinafter referred to as “anti-Lp (a) monoclonal antibody”) 1.4 mg / An equal amount of a solution mixed with 0.05 M glycine buffer (pH 9) at a concentration of mL and a 5% suspension of polystyrene latex (manufactured by Sekisui Medical) having an average particle size of 0.1 ⁇ m was added at 4 ° C.
  • Anti-SF monoclonal antibody was diluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to 0.7 mg / mL.
  • the antibody solution and a 1% suspension of polystyrene latex manufactured by Sekisui Medical) having an average particle size of 0.2 ⁇ m were mixed in equal amounts and stirred at 4 ° C. for 2 hours.
  • Example 5 (Measurement of soluble fibrin (SF)) In place of Calix [6] arene p-sulfonic acid, hexasodium salt, hydrate of Example 4, Calix [8] arene p-sulfonic acid, octosodium salt, hydrate (manufactured by Dojindo Laboratories) in the first reagent The measurement was performed in the same manner as in Example 4 except that 0.01 to 4 mM (final reaction system concentration of 0.005 to 2 mM) was used. The measurement results of the obtained absorbance are shown in Table 8.
  • Example 6 Measurement of Soluble Fibrin (SF) Except that in place of Calix [6] arene p-sulfonic acid, hexasodium salt, hydrate of Example 4, ⁇ -cyclodextrin was used in the first reagent at 10 mM or 40 mM (final reaction concentration 5 or 20 mM), Measurement was performed in the same manner as in Example 4. The obtained absorbance measurement results are shown in Table 9.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

　免疫学的測定方法における測定の感度増強技術及びヘモグロビンの影響回避技術の提供。 　生体試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法において、カリックスアレーン類等の大環状化合物の存在下に反応を行うことを特徴とする免疫学的測定における測定の感度増強方法及びヘモグロビンの影響回避方法。

Description

免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法
　本発明は免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法及びそのための試薬に関する。
　近年、生体試料中の微量物質を測定するために免疫反応を利用する測定方法が広く用いられている。免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法、イムノクロマト法等多くの方法がある。その中でもラテックス凝集法や金属コロイド凝集法は反応液の分離や洗浄を行わないため、自動化に適しており汎用されている。免疫学的測定では、一般に、測定する生体試料中の被測定物質濃度に応じた方法の使い分けがされている。ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法は免疫比濁よりも微量物質の測定が行えるが、ＲＩＡ法やＥＩＡ法ほどの微量物質の測定は行うことができない。何れの免疫学的測定方法においても、反応系の微量化や測定時間の短縮が望まれており、測定感度を増強させることが重要な課題である。
　測定感度を増強させる技術としては、ポリエチレングリコールやデキストラン等の水溶性多糖類を反応系に添加する技術が知られている（特許文献１及び２）。しかしながら、これらの添加剤は、分子量分布を有し、単一化合物ではないため、安定した感度増強効果が得られない、等の欠点があった。
　また、何れの免疫学的測定方法においても、目的とする抗原抗体反応以外に試料中の種々の夾雑物質との非特異反応による凝集や吸着が生じ、測定精度が低下するという問題がある。特に血漿等の生体由来の試料を用い、該試料中に赤血球由来のヘモグロビンが含まれる場合には、免疫学的測定における測定値にヘモグロビンが影響を与えることがある。しかし、溶血の度合いは検体によって異なる為、正確な測定値を得ることができないことから、その影響を回避する方法を講じることが必要である。
　従来から、ヘモグロビンの影響を回避する方法として、界面活性剤を添加する方法（特許文献３）等が考案されている。しかし、免疫学的測定方法において、界面活性剤を添加する方法では測定感度が低下し、対象物質を精度良く測定することができないという問題がある。
　また、特許文献４には、抗ヒトＣＲＰウサギ血清を用いたヒト血清中のＣＲＰの免疫学的測定方法において、多価フェノールを添加することにより、補体成分による非特異反応を抑制できることが記載され、具体例として硫酸カリックス（６）アレーンを５ｍＭ添加することにより補体等による非特異反応が抑制できたことが記載されている。しかし、この特許文献４には、ヒト血清を試料とし、抗ヒトＣＲＰウサギ血清を用いてＣＲＰを測定する場合における補体の影響に対するカリックスアレーン類の作用が記載されているだけであり、カリックスアレーン類が感度に対してどのような作用をするか、また、ヘモグロビンの影響に対する効果については全く記載されていない。更に、測定対象抗原又は抗体を、当該抗原に対する抗体又は当該抗体に対する抗原を感作した不溶性担体（例えばラテックス粒子）を用いて測定する方法については何ら記載されていない。
特開昭５８－０４７２５６号公報 特開昭５９－２２０６４６号公報 特開昭６０－１６８０５０号公報 特開２０００－３２９７６４号公報
　本発明の課題は、測定対象の免疫学的測定における感度増強方法及び感度が増強した免疫学的測定用試薬を提供することにある。
　また、本発明の課題は、血漿等の生体由来試料中の測定対象物質を免疫学的測定法を用いて測定する系におけるヘモグロビンの影響を回避する方法を提供することにある。
　そこで本発明者らは、免疫反応における測定の感度増強方法について検討してきたところ、全く意外にも、反応系にカリックスアレーン類等の大環状化合物を添加した場合、反応系での終濃度５ｍＭでは試薬ブランク値が異常となってしまい、測定対象物質の濃度依存的な測定感度の増強が認められないにもかかわらず、反応系での終濃度０．００５～４ｍＭという低濃度では、測定感度の増強が認められることから、測定対象物質濃度が低濃度の試料を用いた場合であっても正確に測定できることを見出した。また、反応系中に大環状化合物を添加した場合、試料中のヘモグロビンの影響を回避でき、測定対象物質濃度が低濃度であっても正確に測定できることを見出した。
　すなわち、本発明は、生体試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法において、大環状化合物の存在下に反応を行うことを特徴とする免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法を提供するものである。
　また、本発明は、試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法において、大環状化合物を主成分とする感度増強剤又はヘモグロビンの影響回避剤を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬を提供するものである。
　本発明の方法によれば、測定対象物質の測定感度が増強するので、測定対象物質の濃度が低い試料を用いた場合であっても正確な測定が可能となる。また、本発明の免疫学的測定方法によれば、生体由来試料中のヘモグロビンの影響が回避できるので、該試料がヘモグロビンを含有する場合であっても正確な測定が可能となる。また、前記大環状化合物（例えばカリックスアレーン類やシクロデキストリン等）は、単一化合物として入手可能であるから、ロット間の差がなく、安定した測定精度の向上効果が得られる。
　本発明の方法における試料は、生体試料が好ましく、特に赤血球や赤血球由来のヘモグロビンが存在する可能性のある生体由来試料が好ましい。例えば、髄液、涙液、組織液、血液、血漿、および血清などが挙げられる。このうち、血液由来試料、すなわち血液、血漿、および血清などの場合は、ヘモグロビンを含む場合が多く、特に有用である。
　本発明において、免疫学的測定方法としては、測定対象物質と当該対象物質と抗原抗体反応が可能な物質との抗原抗体反応を使用した免疫学的測定方法であれば特に限定されない。例えば、免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）、免疫比濁法、赤血球凝集法、ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法が挙げられる。中でも、ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法は、測定感度が高く、汎用の自動分析装置への適用など、自動化にも適しており好ましい。特に、抗体を感作した不溶性担体を用いる方法がより好ましい。
　該不溶性担体としては、有機高分子粒子、無機物質粒子、赤血球などが挙げられる。有機高分子粒子としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどの粒子が例示でき、好ましくはラテックス粒子が良い。該ラテックス粒子としては、例えばポリスチレン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどの粒子が挙げられる。さらには、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）等を必要に応じて用いてもよい。用いるラテックス粒子の平均粒径は、測定機器などによって０．０５～０．５０μｍのものが適宜選択される。無機物質粒子としてはシリカ、アルミナなどが挙げられる。
　本発明の方法における測定対象物質としては、免疫学測定方法で測定される物質であれば特に限定されず種々の物質、例えば，抗原、ハプテン、抗体、ホルモン、薬剤等が挙げられる。中でも、抗原を測定対象物質とするものが好ましく、蛋白抗原がより好ましい。具体的には、例えば、ＣＲＰ、フィブリン及びフィブリノーゲン分解産物、Ｄダイマー、可溶性フィブリン（ＳＦ）、リポ蛋白（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（ＭＭＰ－３）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、抗ストレプトリジンＯ、リウマチ因子、トランスフェリン、ハプトグロビン、α１－アンチトリプシン、α１－アシドグリコプロテイン、α２－マクログロブリン、ヘモペキシン、アンチトロンビン－ＩＩＩ、α－フェトプロテイン、ＣＥＡ（カルシノエンブリオニツク抗原）、フェリチン、ＨＢｓ－Ａｇ（Ｂ型肝炎外被抗原）、Ａｎｔｉ－ＨＢｓ（抗Ｂ型肝炎外被抗体）、ＨＢｅ－Ａｇ（Ｂ型肝炎ｅ抗原）、Ａｎｔｉ－ＨＢｅ（抗Ｂ型肝炎ｅ抗体）、Ａｎｔｉ－ＨＢｃ（抗Ｂ型肝炎コア抗体）などを挙げることができる。中でもＣＲＰ、フィブリン及びフィブリノゲン分解産物、Ｄダイマー、ＳＦ、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ－３、ＰＳＡなどが好ましい。しかし、これらに限定されるものではない。
　上記測定対象物質と抗原抗体反応しうる物質（以下、免疫反応物質という）としては、測定対象物質が抗原やハプテン等の場合は、その抗体が用いられ、測定対象物が抗体の場合にはその抗原が用いられる。免疫反応物質としての抗原及び抗体は慣用の方法にて調製することができる。また、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、さらに、Ｆａｂ画分、Ｆ（ａｂ’）２画分などであってもよい。
　本発明で使用される大環状化合物は、その分子内孔に金属イオンや無機物、有機物などの取り込みを可能とする機能分子である。該大環状化合物としては特に限定されず、各種のものを用いることができる。例えば、カリックスアレーン類、シクロデキストリン、クラウンエーテル等を用いることができる。また、これらの誘導体や修飾体も用いることができる。中でも、疎水性分子を包接しやすい空孔を有するが、少なくとも４残基の親水性官能基を有するものが好ましい。該親水性官能基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基などが挙げられる。特に好ましい該大環状化合物としては、例えばカリックスアレーン類やシクロデキストリン等が挙げられる。
　カリックスアレーン類は、フェノールを基本骨格とし、フェノールの３～２０分子、好ましくは４～８分子をメチレン基で環状に重合させた環状オリゴマーである。カリックスアレーン類としては特に制限されず、各種のものを使用することができる。例えば、カリックス（４）アレーン、カリックス（６）アレーン、カリックス（８）アレーン、カリックス（４）アレーンスルホン酸、カリックス（６）アレーンスルホン酸、カリックス（８）アレーンスルホン酸、カリックス（４）アレーン酢酸、カリックス（６）アレーン酢酸、カリックス（８）アレーン酢酸、カリックス（４）アレーンカルボン酸、カリックス（６）アレーンカルボン酸、カリックス（８）アレーンカルボン酸、カリックス（４）アレーンアミン、カリックス（６）アレーンアミン、カリックス（８）アレーンアミン、それらの塩などが例示される。中でも、カリックス（６）アレーンスルホン酸、カリックス（８）アレーンスルホン酸、それらの塩が好ましい。尚、Ｃａｌｉｘ［６］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｈｅｘａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅもしくはＣａｌｉｘ［８］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｏｃｔａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅは、同仁化学研究所より市販されているもの等を用いることができ、入手が容易である点で好ましく使用できる。また、レゾルシノールを基本骨格としたレゾルシンアレン、ピロガロールを基本骨格としたピロガロールアレン、ピロールを基本骨格としたカリックスピロール等も用いることができる。これらのカリックスアレーン類は２種以上を併用してもよい。反応系におけるカリックスアレーン類の濃度は、終濃度で好ましくは０．００５～４ｍＭ、より好ましくは０．００５～３ｍＭ、さらに好ましくは０．００５～２．５ｍＭ、特に好ましくは、０．０１～２ｍＭとなるように調整されて使用される。
　シクロデキストリンは、数分子のＤ－グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し環状構造をとった環状オリゴ糖の一種であり、グルコースが５個以上結合したものが知られている。一般的にはグルコースが６個から８個結合したものが使用されており、６個結合しているものがα－シクロデキストリン（シクロヘキサアミロース）、７個結合しているものがβ－シクロデキストリン（シクロヘプタアミロース）、８個結合しているものがγ－シクロデキストリン（シクロオクタアミロース）であるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記の各種デキストリンの修飾体なども利用可能であり、シクロデキストリンの水酸基の水素原子が種々の置換基で置換されたシクロデキストリン又はそれらの塩が用いられる。例えば、アルキル基で置換されたアルキル化シクロデキストリン、アシル基で置換されたアシル化シクロデキストリン、カルボキシアルキル基で置換されたカルボキシアルキル化シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル基で置換されたヒドロキシアルキル化シクロデキストリン、スルホアルキル基で置換されたスルホアルキル化シクロデキストリン、又はそれらの塩が挙げられる。また、シクロデキストリンの水酸基と各種の酸がエステル結合されたシクロデキストリン又はそれらの塩、例えばシクロデキストリン硫酸エステル、又はそれらの塩（ナトリウム塩は硫酸シクロデキストリンともいう。）、シクロデキストリン燐酸エステル又はそれらの塩等が挙げられる。さらに、シクロデキストリンを構成するグルコースの６位の水酸基とグルコース、マルトース等の糖の水酸基が脱水縮合した分岐シクロデキストリンなどが挙げられる。
　これらのシクロデキストリンの中でも、β－シクロデキストリンが好ましく使用できる。
　反応系におけるシクロデキストリンの濃度は、１～４００ｍＭ、特に１～１００ｍＭが好ましい。
　上記の大環状化合物のうち、カリックスアレーン類を主成分とするのが好ましい。特に測定の感度増強剤として使用する場合には、カリックスアレーン類を反応系において終濃度０．００５～４ｍＭ、さらに０．００５～３ｍＭ、特に０．００５～２．５ｍＭとなるようにするのが好ましい。また、ヘモグロビンの影響回避剤として使用する場合には、カリックスアレーン類を反応系において終濃度０．００５～３ｍＭ、さらに０．０１～２ｍＭとなるようにするのが好ましい。
　なお、反応系には、必要に応じて、ポリエチレングリコール、デキストラン、ゼラチン、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ等の慣用の添加剤を加えてもよい。
　前記大環状化合物は、抗原抗体反応系中に存在させればよく、抗原抗体反応前に試料中に添加してもよいし、免疫反応物質を含有する試薬中に添加しておいてもよい。また、反応の際に用いる緩衝液中に添加しておいてもよい。
　吸光度の測定は、エンドポイント法、レートアッセイ法のいずれで行ってもよい。なお、本発明の方法は上記の方法に限定されるものではなく、使用する免疫学的測定方法に応じて適宜変更して実施することができ、使用する緩衝液、測定条件なども適宜変更すればよい。
　本発明の方法に用いる試薬は、上記の方法に使用される試薬であって、当該試薬が前記大環状化合物を主成分とする測定の感度増強剤又はヘモグロビンの影響回避剤を含有することからなる。上記の試薬は、免疫学的測定方法の種類に応じて適宜設定することができ、また複数の構成試薬からなるキットであってもよく、この場合には構成試薬の少なくとも１種が前記大環状化合物を含有すればよい。
　本発明の免疫学的測定方法におけるｐＨとしては、４．５～９．５、好ましくは５．５～８．５の範囲である。ｐＨの維持のためには適当な緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－２－ヒドロキシエチル－ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＤＩＰＳＯ（３－（Ｎ’Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＡＰＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸）等のグッド緩衝液が好適に用いられる。使用濃度は１～５００ｍＭ、好ましくは３～３００ｍＭである。
　本発明の免疫反応液中にはアジ化ナトリウム、動物血清、γ－グロブリン又はヒトＩｇＧやＩｇＭに対する特異抗体、アルブミン、塩化ナトリウムやその他の無機塩類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ＤＴＴ等のＳＨ試薬や界面活性剤等を含有させてもよい。アジ化ナトリウムの濃度としては０．０１～１％、好ましくは０．０３～０．３％である。動物血清、γ－グロブリン又は特異抗体やアルブミンは牛、馬、豚、羊、兎、ヒト、ラット等の由来のものが使用でき、それらの変性物や分解物も選択でき、添加濃度も適宜選択できる。塩化ナトリウムは生理的食塩濃度付近が好ましい。その他の物質についても使用濃度は適宜選択できる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定）
（１）第一試薬の調製
　Ｃａｌｉｘ［８］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｏｃｔａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ若しくはＣａｌｉｘ［６］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｈｅｘａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ（同仁化学研究所社製）を０．０１～１０ｍＭ（反応系での終濃度０．００５～５ｍＭ）の濃度で、０．４％　牛血清アルブミン及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に添加して第一試薬とした。尚、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。
（２）第二試薬（抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体固定化粒子懸濁液）の調製
　抗ＳＦモノクローナル抗体を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で０．７ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した抗体液と、平均粒径０．２μｍのポリスチレン系ラテックス（積水メディカル社製）１％懸濁液を等量ずつ混和し、４℃で２時間攪拌した。さらに１％牛血清アルブミンを等量加え１時間攪拌した後、遠心分離により沈殿部を集め、０．５％牛血清アルブミンを含む５ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７）で懸濁し、第二試薬（抗ＳＦ抗体固定化粒子懸濁液）を調製した。
（３）試料
　精製したフィブリノゲンにトロンビンを作用させて調製した酸可溶性ｄｅｓＡＡＢＢフィブリンを、ヒトクエン酸血漿にそれぞれ最終濃度１０．３μｇ／ｍＬとなるように添加して可溶性フィブリンを調製した。尚、試薬ブランクの測定には生理食塩水を用いた。
（４）測定
　試料３μＬに第一試薬１００μＬを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬１００μＬを加えて撹拌後１～５分の主波長５７０ｎｍ及び副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度値を表１及び表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び２から明らかなように、カリックスアレーン類を、反応系終濃度５ｍＭで添加すると試薬ブランク値が異常となり、正確な測定ができないものの、反応系終濃度０．００５～４ｍＭの範囲ではＳＦの測定感度が上昇していることがわかる。
実施例２（可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定）
　実施例１同様、酸可溶性ｄｅｓＡＡＢＢフィブリンを、ヒトクエン酸血漿にそれぞれ最終濃度１０．３、及び２０．１μｇ／ｍＬとなるように添加して可溶性フィブリンを調製し、第一試薬に反応系終濃度で０．００５～２ｍＭの各カリックスアレーンを含む試薬を用いて測定した。尚、第二試薬は実施例１と同じものを用いた。また、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。得られた吸光度とＳＦ濃度の関係を表３及び４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３及び４から明らかなように、カリックスアレーン類を添加すると、反応系終濃度０．００５～２ｍＭの範囲では比較例のカリックスアレーン類を含まない場合に比べ測定感度が上昇していることがわかる。また、その反応は抗原濃度依存的であり、特に、低値域の測定に有用であることがわかる。
実施例３（リポ蛋白（ａ）（Ｌｐ（ａ））の測定）
（１）第一試薬の調製
　Ｃａｌｉｘ［８］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｏｃｔａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ若しくはＣａｌｉｘ［６］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｈｅｘａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ（同仁化学研究所社製）を０．０１～５ｍＭ（反応系での終濃度０．００５～２．５ｍＭ）の濃度で、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ　グリシン緩衝液（ｐＨ９）に混和し、第一試薬を調製した。尚、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。
（２）第二試薬（抗Ｌｐ（ａ）抗体固定化粒子懸濁液）の調製
　精製ヒトａｐｏ（ａ）を免疫原として、定法によりマウスから得られた、単独種類の使用により免疫凝集を生じさせるモノクローナル抗体（工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたハイブリドーマ２８２０５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－３７５５）により生産されるもの。以下「抗Ｌｐ（ａ）モノクローナル抗体」と称する。〕を１．４ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９）に混和した液と平均粒径０．１μｍのポリスチレン系ラテックス（積水メディカル社製）５％懸濁液を等量加え、４℃にて２時間撹拌した。遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に２％牛血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９）を加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を集め、これを２％牛血清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９）で懸濁し、抗Ｌｐ（ａ）抗体固定化粒子懸濁液を調製した。
（３）試料
　Ｌｐ（ａ）濃度既知血清を用いた。
（４）Ｌｐ（ａ）の測定
　Ｌｐ（ａ）を含有する試料液２．５μＬに第一試薬１００μＬを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬１００μＬを加えて撹拌後１～５分の主波長５７０ｎｍ及び副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＬｐ（ａ）濃度の関係を表５及び６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５及び６から明らかなように、カリックスアレーン類を反応系での終濃度０．００５～２．５ｍＭ添加するとＬｐ（ａ）の測定感度が上昇していることが判る。
実施例４（可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定）
（１）第一試薬の調製
　Ｃａｌｉｘ［６］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，　ｈｅｘａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ（同仁化学研究所社製）を０．０１～６ｍＭ（反応系終濃度０．００５～３ｍＭ）、及び０．４％牛血清アルブミン、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を第一試薬とした。尚、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。
（２）第二試薬（抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体固定化粒子懸濁液）の調製
　抗ＳＦモノクローナル抗体を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で０．７ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した抗体液と、平均粒径０．２μｍのポリスチレン系ラテックス（積水メディカル社製）１％懸濁液を等量ずつ混和し、４℃で２時間攪拌した。さらに１％牛血清アルブミンを等量加え１時間攪拌した後、遠心分離により沈殿部を集め、０．５％牛血清アルブミンを含む５ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７）で懸濁し、第二試薬（抗ＳＦ抗体固定化粒子懸濁液）を調製した。
（３）試料
　ヘモグロビン試料として、干渉チェックＡプラス（Ｓｙｓｍｅｘ社製）の溶血ヘモグロビンを用いて、ヘモグロビン濃度０～５００ｍｇ／ｄＬの試料を調製した。
（４）測定
　試料３μＬに第一試薬１００μＬを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬１００μＬを加えて撹拌後１～５分の主波長５７０ｎｍ及び副波長８００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度の測定結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７から明らかなように、大環状化合物としてカリックス（６）アレーンを添加した場合、検討した反応系終濃度０．００５～３ｍＭの範囲で、ヘモグロビンの吸光度測定値への影響が抑制されていることがわかる。
実施例５（可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定）
　実施例４のＣａｌｉｘ［６］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｈｅｘａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅに変えて、Ｃａｌｉｘ［８］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｏｃｔａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅ（同仁化学研究所社製）を第一試薬中で０．０１～４ｍＭ（反応系終濃度０．００５～２ｍＭ）を用いた以外は、実施例４と同様に測定した。得られた吸光度の測定結果を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８から明らかなように、大環状化合物としてカリックス（８）アレーンを添加した場合、検討した反応系終濃度０．００５～２ｍＭの範囲で、ヘモグロビンの吸光度測定値への影響が抑制されていることがわかる。
実施例６（可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定）
　実施例４のＣａｌｉｘ［６］ａｒｅｎｅ　ｐ－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｈｅｘａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｈｙｄｒａｔｅに変えて、β－シクロデキストリンを第一試薬中で１０ｍＭ若しくは４０ｍＭ（反応系終濃度５若しくは２０ｍＭ）を用いた以外は、実施例４と同様に測定した。得られた吸光度の測定結果を表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９から明らかなように、大環状化合物としてβ－シクロデキストリンを添加した場合、検討した反応系終濃度５～２０ｍＭの範囲で、ヘモグロビンの吸光度測定値への影響が抑制されていることがわかる。

Claims (12)

  1. 　生体試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法において、大環状化合物の存在下に反応を行うことを特徴とする免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法。
  2. 　大環状化合物がカリックスアレーン類又はシクロデキストリンである請求項１記載の方法。
  3. 　免疫学的測定方法が、抗体を感作した不溶性担体を用いるものである請求項１又は２記載の方法。
  4. 　免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法又は金属コロイド凝集法である請求項１又は３記載の方法。
  5. 　測定対象物質が蛋白抗原である請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　カリックスアレーン類の反応系における終濃度が０．００５ｍＭ～４ｍＭである請求項２～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　感度増強方法である請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　ヘモグロビンの影響回避方法である請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  9. 　生体試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法に使用される試薬であって、大環状化合物を主成分とする感度増強剤又はヘモグロビンの影響回避剤を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬。
  10. 　大環状化合物がカリックスアレーン類である請求項９記載の免疫学的測定用試薬。
  11. 　免疫学的測定方法が、抗体を感作した不溶性担体を用いるものである請求項９又は１０記載の免疫学的測定用試薬。
  12. 　カリックスアレーン類の反応系における終濃度が０．００５ｍＭ～４ｍＭである請求項１０又は１１記載の免疫学的測定用試薬。
PCT/JP2009/003097 2008-07-04 2009-07-03 免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法 Ceased WO2010001619A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09773197.0A EP2295969B1 (en) 2008-07-04 2009-07-03 Method for enhancing sensitivity or method for avoiding influence of hemoglobin in immunological measurement
CN200980125714.2A CN102405412B (zh) 2008-07-04 2009-07-03 免疫学测定的灵敏度增强方法或避免血红蛋白影响的方法
JP2010518932A JP5443355B2 (ja) 2008-07-04 2009-07-03 免疫学的測定におけるヘモグロビンの影響回避方法及びそのための試薬
US13/002,467 US8722342B2 (en) 2008-07-04 2009-07-03 Method for enhancing sensitivity or method for avoiding influence of hemoglobin in immunological measurement

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-175817 2008-07-04
JP2008175817 2008-07-04
JP2008175816 2008-07-04
JP2008-175816 2008-07-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010001619A1 true WO2010001619A1 (ja) 2010-01-07

Family

ID=41465725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/003097 Ceased WO2010001619A1 (ja) 2008-07-04 2009-07-03 免疫学的測定における感度増強方法又はヘモグロビンの影響回避方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8722342B2 (ja)
EP (2) EP2295969B1 (ja)
JP (2) JP5443355B2 (ja)
CN (2) CN102405412B (ja)
WO (1) WO2010001619A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103477226A (zh) * 2011-03-31 2013-12-25 积水医疗株式会社 能将不含试样的样品确定为不当操作样品的免疫层析检测方法及其使用的测试条
CN105424936A (zh) * 2011-03-28 2016-03-23 积水医疗株式会社 Psa测定方法及其试剂
JPWO2016136918A1 (ja) * 2015-02-25 2017-11-30 積水メディカル株式会社 免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104931700B (zh) * 2015-06-01 2017-03-08 上海凯创生物技术有限公司 沙门氏菌乳胶法检测试剂盒
US11422128B2 (en) * 2016-04-13 2022-08-23 Lsi Medience Corporation Immunoassay employing sulfated polysaccharide
CN106932594A (zh) * 2017-03-14 2017-07-07 吉林省富生医疗器械有限公司 一种优选胱抑素c检测试剂盒及其制备方法
CN108872606B (zh) * 2018-08-14 2020-12-22 山东博科生物产业有限公司 一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白（hp）检测试剂盒
KR20210068048A (ko) * 2018-09-28 2021-06-08 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법
CN109613257B (zh) * 2018-12-01 2021-02-26 山东博科生物产业有限公司 一种转铁蛋白(trf)检测试剂盒
CN112888945B (zh) * 2018-12-06 2022-07-12 武汉全景生物技术有限公司 免疫检测中消除阿霉素干扰的方法及免疫检测试剂盒

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5847256A (ja) 1981-09-14 1983-03-18 Mitsubishi Chem Ind Ltd 抗原抗体反応の測定法
JPS59220646A (ja) 1983-05-30 1984-12-12 Green Cross Corp:The 凝集試験用水性溶媒
JPS60168050A (ja) 1984-02-10 1985-08-31 Wako Pure Chem Ind Ltd ヘモグロビンの影響回避方法
JPS62248500A (ja) * 1986-04-22 1987-10-29 Kanto Kagaku Kk 酵素活性測定用試薬
JPH1090271A (ja) * 1996-09-13 1998-04-10 Masao Karube 表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫測定方法及び装置
JPH11248706A (ja) * 1998-03-03 1999-09-17 Wako Pure Chem Ind Ltd 非特異的吸着防止剤
JP2000329764A (ja) 1999-05-24 2000-11-30 Internatl Reagents Corp 免疫学的測定法及び試薬
JP2001292795A (ja) * 2000-02-25 2001-10-23 Lifescan Inc テトラゾリウム化合物に基づく診断
JP2004061263A (ja) * 2002-07-29 2004-02-26 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 生体試料中の特定成分の定量方法及び定量用試薬

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886744A (en) * 1985-04-25 1989-12-12 Polaroid Corporation Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay system
US4847209A (en) * 1987-11-09 1989-07-11 Miles Inc. Latex agglutination immunoassay in the presence of hemoglobin
WO1991005605A1 (en) * 1989-10-10 1991-05-02 Kosak Kenneth M Cyclodextrin labels for immunoassay and biochemical analysis
US5902731A (en) * 1998-09-28 1999-05-11 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
DE10226097A1 (de) * 2002-06-12 2004-01-15 Jörg Martin Dipl.-Chem. Dormann Schnelltestverfahren zum Nachweis von mindestens einem Antigen sowie dessen Verwendung
FR2849205B1 (fr) * 2002-12-20 2005-02-11 Afssa Procede d'amplification de la detection de la prpsc et utilisation d'un ligand adjuvant macrocyclique pour une telle amplification
CN1320974C (zh) * 2003-01-21 2007-06-13 武汉大学 水溶性纳米粒子的制备方法
CN1769894A (zh) * 2004-11-01 2006-05-10 上海申索佑福医学诊断用品有限公司 一种高敏c反应蛋白测定试剂盒
FR2880883B1 (fr) 2005-01-19 2009-01-09 Mane Fils Sa V Nouveaux derives de trimethylcyclododecatriene, leur utilisation et produits parfumes les contenant
PL1863833T3 (pl) 2005-03-08 2014-03-31 Boehringer Ingelheim Int Sposób otrzymywania związków makrocyklicznych
CN101189523A (zh) * 2005-06-30 2008-05-28 富士胶片株式会社 利用磁性纳米颗粒分离靶成分的方法
JP5442179B2 (ja) * 2005-10-21 2014-03-12 アルフレッサファーマ株式会社 反応性物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法および該微小粒子含有試薬
US20080261328A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Alfresa Pharma Corporation Method of preventing precipitation of a reactive substance-bound microparticle, and reagent containing the micro particle

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5847256A (ja) 1981-09-14 1983-03-18 Mitsubishi Chem Ind Ltd 抗原抗体反応の測定法
JPS59220646A (ja) 1983-05-30 1984-12-12 Green Cross Corp:The 凝集試験用水性溶媒
JPS60168050A (ja) 1984-02-10 1985-08-31 Wako Pure Chem Ind Ltd ヘモグロビンの影響回避方法
JPS62248500A (ja) * 1986-04-22 1987-10-29 Kanto Kagaku Kk 酵素活性測定用試薬
JPH1090271A (ja) * 1996-09-13 1998-04-10 Masao Karube 表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫測定方法及び装置
JPH11248706A (ja) * 1998-03-03 1999-09-17 Wako Pure Chem Ind Ltd 非特異的吸着防止剤
JP2000329764A (ja) 1999-05-24 2000-11-30 Internatl Reagents Corp 免疫学的測定法及び試薬
JP2001292795A (ja) * 2000-02-25 2001-10-23 Lifescan Inc テトラゾリウム化合物に基づく診断
JP2004061263A (ja) * 2002-07-29 2004-02-26 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 生体試料中の特定成分の定量方法及び定量用試薬

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2295969A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105424936A (zh) * 2011-03-28 2016-03-23 积水医疗株式会社 Psa测定方法及其试剂
US10119963B2 (en) 2011-03-28 2018-11-06 Sekisui Medical Co., Ltd. PSA assay and reagent therefor
CN103477226A (zh) * 2011-03-31 2013-12-25 积水医疗株式会社 能将不含试样的样品确定为不当操作样品的免疫层析检测方法及其使用的测试条
JPWO2016136918A1 (ja) * 2015-02-25 2017-11-30 積水メディカル株式会社 免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬

Also Published As

Publication number Publication date
EP2295969A1 (en) 2011-03-16
EP3062104A1 (en) 2016-08-31
CN104535756A (zh) 2015-04-22
US20110104825A1 (en) 2011-05-05
JPWO2010001619A1 (ja) 2011-12-15
EP2295969A4 (en) 2012-04-04
CN102405412B (zh) 2015-01-14
EP2295969B1 (en) 2016-05-18
JP2014052390A (ja) 2014-03-20
CN102405412A (zh) 2012-04-04
JP5443355B2 (ja) 2014-03-19
US8722342B2 (en) 2014-05-13
JP5735615B2 (ja) 2015-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5735615B2 (ja) 免疫学的測定における感度増強方法及びそのための試薬
CN105548565B (zh) 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用
JP5362797B2 (ja) 凝集反応安定化方法
JP4140524B2 (ja) アッセイ法
JP3623657B2 (ja) 非特異反応抑制剤、免疫測定試薬及び免疫測定方法
JP5364310B2 (ja) 反応性物質が結合した微小粒子の安定化方法および該微小粒子含有試薬
JP4668768B2 (ja) 免疫測定方法及び非特異反応抑制方法
JPWO2001092885A1 (ja) 免疫学的ラテックス比濁分析方法及びその試薬
JP3899029B2 (ja) 免疫学的分析方法
JP4879067B2 (ja) 免疫測定用検体前処理液、免疫測定用試薬キット及び免疫測定方法
JPWO2002003068A1 (ja) 不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬
WO2008057767A2 (en) Reduction of non-specific binding in immunoassays
JP5177677B2 (ja) 抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬
JP2003207512A (ja) イムノアッセイに用いるための第三級アミン化合物
JPH0727764A (ja) Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬
JP2000146974A (ja) 免疫測定法
US20140356885A1 (en) Reducing Non-Specifically Bound Molecules on Supports
JP2004347614A (ja) 非特異反応抑制剤、免疫測定試薬及び免疫測定方法
JP2000258415A (ja) ヒトα２−プラスミンインヒビターの定量方法及び測定キット
JP2001330611A (ja) 免疫測定試薬
JP2000329768A (ja) 免疫測定試薬及び免疫測定試薬の製造方法
JP2001330613A (ja) 免疫測定試薬
HK1130536A (en) Immunological assay reagents and assay method

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980125714.2

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09773197

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010518932

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009773197

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13002467

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE