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WO2010001599A1 - ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法 - Google Patents

ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法 Download PDF

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WO2010001599A1
WO2010001599A1 PCT/JP2009/003039 JP2009003039W WO2010001599A1 WO 2010001599 A1 WO2010001599 A1 WO 2010001599A1 JP 2009003039 W JP2009003039 W JP 2009003039W WO 2010001599 A1 WO2010001599 A1 WO 2010001599A1
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WO
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cells
disease antigen
antigen
culture
cell
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French (fr)
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贄田美江
富山舞
武藤真人
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Medinet Co Ltd
Original Assignee
Medinet Co Ltd
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Publication date
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Priority to DK09773177.2T priority patent/DK2311470T3/en
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Priority to JP2010518923A priority patent/JP5524056B2/ja
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    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a technique for efficiently and efficiently cultivating antigen-specific CTL and ⁇ T cells effective for cancer treatment simultaneously. Furthermore, it is related with the utilization as a pharmaceutical of the cell cultured using the said culture technique.
  • Immune cell therapy is a treatment method in which the patient's own immune cells, particularly leukocytes, are extracted and activated, and then returned to the patient to artificially strengthen the immunity. Since the patient's own cells are used, there is an advantage that there are significantly fewer side effects than conventional anticancer drug treatment.
  • CTL Cytoxic T Lymphocytote
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells (hereinafter also referred to as DC)
  • DC dendritic cells
  • Non-Patent Documents 1 and 2 attempt to induce CTLs by adding a 9mer peptide such as an epitope of a specific disease antigen to peripheral blood mononuclear cells.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 CD8 positive T cells obtained by obtaining DC from peripheral blood mononuclear cells and adding an antigen peptide thereto to provide an antigen presenting function and separated from peripheral blood lymphocytes together with the DC. Is used to induce CTL specific for the disease antigen.
  • Non-Patent Document 5 DC vaccines using DC obtained from hematopoietic progenitor cells and an antigen peptide, followed by addition of antigen to monocyte-derived DC, and CD8-positive T cells separated from peripheral blood mononuclear cells Are co-cultured to induce antigen-specific CTL.
  • dendritic cells have high antigen-presenting ability among antigen-presenting cells and have high ability to induce disease antigen-specific CTLs, and therefore their technical development is being advanced.
  • ⁇ T cells activated by non-peptide antigens are cells responsible for innate immunity, but recently it has been found that they have cytotoxic activity (nonspecific activity) in a non-MHC-restricted manner against cancer cells. Studies on immunotherapy using the strong antitumor activity of ⁇ T cells have been conducted.
  • ⁇ T cells recognize and activate non-peptide antigens, it is possible to stimulate and activate and / or proliferate ⁇ T cells with, for example, alkylamines and bisphosphonates as non-peptide antigens, and in vitro peripheral blood Studies have been made on the activation and / or proliferation of non-peptide antigens recognized by ⁇ T cells isolated from the cells (for example, Non-Patent Document 6).
  • ⁇ T cells are usually present in only 1 to 5% in peripheral blood, even if a small amount of blood is collected to activate and / or proliferate ⁇ T cells, sufficient purity and number of cells are ensured for treatment. There is a problem that can not be. There is also a problem that if the amount of blood collected from a patient is increased in order to ensure sufficient purity and the number of cells for treatment, a great burden is placed on the patient.
  • Patent Document 1 discloses a method of activating and / or proliferating ⁇ T cells by adding bisphosphonate to peripheral blood mononuclear cells.
  • immune cell therapy it is very important to culture and use more effective cells, and a variety of techniques and techniques are currently being developed.
  • a disease antigen-specific CTL is MHC restricted, for example, MHC class I.
  • MHC restricted for example, MHC class I.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to induce and cultivate disease antigen-specific CTLs and ⁇ T cells at the same time in a single culture so that they can be effectively and effectively treated. .
  • the present inventors have conducted various studies to solve these problems and have come to create the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a method for simultaneously inducing a disease antigen-specific CTL and a ⁇ T cell comprising the steps of adding a disease antigen and aminobisphosphonate to peripheral blood and culturing the peripheral blood; (2) The step of adding the disease antigen and aminobisphosphonate is performed on the first day of culture, wherein the disease antigen-specific CTL and ⁇ T cell are simultaneously induced according to (1); (3) The disease antigen according to (1) or (2), characterized in that it is a pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, a salt thereof and / or a hydrate thereof (4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the specific induction of CTL and ⁇ T cells is simultaneously induced; (4) the disease antigen is a cancer antigen.
  • the present inventors have studied that ⁇ T cells in peripheral blood activated by aminobisphosphonate proliferate, and that these activated and expanded ⁇ T cells exert an APC (Antigen Presenting Cell: antigen presenting cell) function.
  • APC Antigen Presenting Cell: antigen presenting cell
  • the present inventors have found that a disease antigen is presented and also promotes induction of a disease antigen-specific CTL, and the present invention has been completed.
  • the method for culturing and inducing disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells which have been cultured after obtaining desired cells through various steps, is obtained from cells from peripheral blood. It is possible to obtain a cell population with a large number of cells that is effective in simultaneously treating disease antigen-specific CTLs and ⁇ T cells simultaneously in one culture without separating them.
  • the mixed cell population of disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells obtained by this induction method can provide a treatment that is more effective than the treatment by administering a conventional single immune cell as a medicine. .
  • the method for simultaneous induction of disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells of the present invention comprises adding a disease antigen and aminobisphosphonate to peripheral blood, and culturing peripheral blood. And the step of performing.
  • ⁇ T cells in peripheral blood are activated and expanded by aminobisphosphonate, and these activated and expanded ⁇ T cells also exhibit APC function to present a disease antigen, and a disease antigen-specific CTL Is induced. Furthermore, ⁇ T cells having APC function not only act as APCs, but even when disease antigen-specific CTLs proliferate, ⁇ T cells themselves continue to proliferate, and both cells are effective for treatment. It becomes possible to obtain the number of cells.
  • peripheral blood by collecting blood. A volume of 15-25 mL is required. If this amount can be obtained, it is possible to culture appropriately. However, if the peripheral blood volume is sufficient at the start of the culture, the range is not limited to this range. If the burden on the donor to collect blood is small, the number of recovered cells of the disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells increases as the blood volume increases. A larger amount of blood collected is preferred.
  • Peripheral blood mononuclear cells are obtained, for example, by density gradient centrifugation. In terms of the number, about 1-2 ⁇ 10 7 peripheral blood mononuclear cells can be obtained from 15-25 mL of peripheral blood.
  • 3) Suspend approximately the peripheral blood mononuclear cells obtained in 2) in the culture medium AIM-V (Invitrogen).
  • a liquid in which peripheral blood mononuclear cells are suspended is referred to as a cell suspension.
  • the culture medium shown here it is used for culturing cells such as RPMI-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen, hereinafter referred to as DMEM), Iskov medium (Invitrogen, hereinafter referred to as IMEM), and the like.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • IMEM Iskov medium
  • a commercially available culture solution may be used.
  • bisphosphonate is an analog of pyrophosphate, and is a compound (PCP) in which O (oxygen atom) of P—O—P of the pyrophosphate skeleton is substituted with C (carbon atom).
  • PCP a compound
  • Amino bisphosphonate refers to a compound having N (nitrogen atom) among bisphosphonates.
  • the aminobisphosphonate used in the present invention is not particularly limited, and aminobisphosphonates disclosed in WO2006 / 006720 and WO2007 / 029689 can be used.
  • pamidronic acid, a salt thereof and / or a hydrate thereof, alendronic acid, a salt thereof and / or a hydrate thereof, zoledronic acid, a salt thereof and / or a hydrate thereof may be mentioned. It is done.
  • 5 ⁇ M zoledronic acid is added as an example.
  • the disease antigen is added together.
  • the “disease” is, for example, cancer or infectious disease.
  • the cancer is not particularly limited, and includes any cancer, such as cancer that is difficult to treat.
  • the infectious diseases include viral infections such as AIDS and hepatitis B / C, cell infections, bacterial infections, fungal infections, and infections caused by protozoa.
  • the form of the antigen peptides, proteins, etc. can be used as appropriate.
  • cell lysates of cancer cells or infectious disease cells, apoptotic cells, necrotic cells, heat-treated products thereof, and the like can be used.
  • the antigen may be derived from a patient (for example, a tumor tissue removed from a patient by surgery) or synthesized.
  • a synthetic peptide By using a synthetic peptide, the burden on the patient can be reduced as compared with the case of using a cancer antigen collected from its own cancer tissue or the like.
  • the amount to be added may be about 0.02 to 2 ⁇ g / ml for peptides. For example, 2 ⁇ g / ml is added.
  • aminobisphosphonate and the disease antigen are added is not particularly limited, and can be added at the same time, or either can be added first, but it is preferable to add them at the same time.
  • IL-2 is added to the culture medium so that the concentration is 50 to 2000 U / mL, more preferably 400 to 1000 U / mL.
  • the cells are cultured at 34 to 38 ° C., more preferably 37 ° C., in the presence of 2 to 10%, more preferably 5% CO 2 .
  • a culture solution is appropriately added according to the number of cells to be cultured.
  • it is added appropriately so that the concentration of IL-2 becomes 50 to 2000 U / mL, more preferably 400 to 1000 U / mL, as the culture solution increases.
  • FCS fetal calf serum
  • AB serum autologous plasma, or the like
  • FCS fetal calf serum
  • the culture period is 7 days or more, a cell group containing disease antigen-specific CTLs and ⁇ T cells can be obtained with a high purity.
  • the addition time is generally within the range of 0 to 100 hours from the start of culture, it is possible to culture well.
  • the medicament of the present invention is a medicament comprising a disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells, and is obtained by adding a disease antigen and aminobisphosphonate to peripheral blood at the start of culture and culturing.
  • cells used in immune cell therapy are those of a single type or individually cultured, and a plurality of types of cells are used by adding them after mixing or simultaneously adding at the time of administration.
  • the medicament of the present invention is obtained by simultaneously cultivating disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells by the induction method of the present invention, and can obtain a large number of cells very easily.
  • the synergistic effect of the disease antigen-specific CTL and the ⁇ T cells has an advantage that the therapeutic effect is further enhanced as compared with the case of using conventional single immune cells.
  • the cells obtained by the culture method of the present invention are collected by centrifugation or the like. 2) Wash the collected cells with a washing solution.
  • the washing solution is preferably an isotonic solution having an osmotic pressure equal to that of cells, and more preferably a liquid that can be used as a pharmaceutical product.
  • physiological saline, PBS (phosphate buffered saline), or the like is preferably used.
  • a lymphocyte population that contains disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells obtained after washing is collected by centrifugation or the like and suspended in a liquid that can be used as a medicine, such as physiological saline.
  • a medicament can be prepared.
  • the amount of the suspension liquid used is appropriately adjusted according to the number of cells to be administered and the administration method.
  • the number of medicament used disease antigen specific CTL and ⁇ T cells predominantly comprises lymphocyte population of the present invention, administration methods, the type of disease, is appropriately selected depending on the patient's symptoms etc., usually 10 8 to The number is preferably 10 12 / person, more preferably 10 9 / person or more.
  • the medicament of the present invention can be used as a therapeutic / prophylactic agent for cancer and infectious diseases.
  • cytokines such as IL-2 and IL-12
  • the medicament of the present invention when used as an agent for treating or preventing cancer, it is also possible to combine cytokines such as IL-2 and IL-12 with the medicament of the present invention.
  • interferon- ⁇ interferon- ⁇
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • a method of administration for example, it may be injected intravenously, intradermally, subcutaneously, etc., directly injected into a lesioned part, or administered systemically as an infusion. Further, it may be injected from an artery near the lesion.
  • the treatment / prevention method of the present invention is a treatment / prevention method of administering disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells obtained by adding a disease antigen and aminobisphosphonate to peripheral blood at the start of culture and culturing.
  • the cells obtained by the culture method of the present invention are collected by centrifugation or the like.
  • Wash the collected cells with a washing solution.
  • the washing solution is preferably an isotonic solution having an osmotic pressure equal to that of cells, and more preferably a liquid that can be used as a pharmaceutical product.
  • physiological saline PBS (phosphate buffered saline), or the like.
  • a lymphocyte population that contains disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells obtained after washing is collected by centrifugation or the like and suspended in a liquid that can be used as a medicine, such as physiological saline.
  • a cell suspension for use in the treatment / prevention method can be prepared.
  • the amount of the suspension liquid used is appropriately adjusted according to the number of cells to be administered and the administration method.
  • the number of lymphocyte populations predominately containing disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells used in the treatment / prevention method of the present invention is appropriately selected depending on the administration method, the type of disease, the patient's symptoms, etc.
  • the number is preferably 10 8 to 10 12 / person, more preferably 10 9 / person or more.
  • cytokines such as IL-2 and IL-12
  • the medicament of the present invention it is possible to combine cytokines such as IL-2 and IL-12 with the medicament of the present invention.
  • interferon- ⁇ IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • a method of administration for example, it may be injected intravenously, intradermally, subcutaneously, etc., directly injected into a lesioned part, or administered systemically as an infusion. Further, it may be injected from an artery near the lesion.
  • IL-2 was added at 1000 U / mL
  • zoledronic acid ZOMETA (registered trademark)
  • Mart-1 A27L, sequence: ELAGIGILTV
  • AB serum was added after the start of culture.
  • AIM-V containing 1000 U / ml of IL-2 and AB serum were added according to cell growth, and cultured for 14 days.
  • the proportion of disease antigen-specific CD8-positive T cells in the cell group obtained after culturing for 7 days or 14 days, and the proportion of cells expressing TCRV ⁇ 9 were determined as anti-CD8 antibody (BD Pharmingen).
  • lymphocyte population containing predominantly disease antigen-specific CD8-positive T cells (CTL) and ⁇ T cells can be obtained by simultaneously adding and culturing a disease antigen and aminobisphosphonate.
  • CD56 is an isoform of neural cell adhesion molecule (N-CAM) and is an adhesion factor known as a marker for NK cells. It is one of the markers serving as an index of the cytotoxic activity of ⁇ T cells.
  • N-CAM neural cell adhesion molecule
  • peripheral blood mononuclear cells were separated using a specific gravity solution for blood cell separation.
  • the obtained peripheral blood mononuclear cells were suspended in AIM-V.
  • 3) 1.8 ⁇ 10 6 /2.5 mL of peripheral blood mononuclear cells were seeded on a 12-well plate (SUMILON).
  • IL-2 was added at 1000 U / mL
  • zoledronic acid (ZOMETA) was added at 5 ⁇ M
  • the method for simultaneous induction of disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells of the present invention conventionally cultivates disease antigen-specific CTL and ⁇ T cells separately. Both can be grown and induced to the number of cells each having a therapeutic effect. As a result, both disease-specific and non-specific immune cells can be used simultaneously and simply for treatment, the therapeutic effect can be improved, and the burden on the patient can be reduced. Furthermore, since the culture process can be integrated into one, the effect can be enjoyed also in the economical aspect such as culture cost.

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Abstract

【課題】　疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞を一つの培養工程で、簡便にかつ効率よく培養する方法、及びその方法により得られた細胞を用いた医薬、治療・予防方法を提供する。 【解決手段】　血液を採血し、それにより分離して得られた末梢血単核球に、アミノビスホスホネートと疾病抗原を培養開始時に添加し、所定期間の細胞培養を行うことで、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞とを、同時かつ治療に有効なだけの細胞数まで増殖・誘導させ、治療に用いる。

Description

ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法
　本発明は、がん治療に有効な抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を同時に効率よく培養する技術に関する。更には、当該培養技術を用いて培養した細胞の医薬としての利用に関する。
　がんをはじめとする難治性疾患の新たな治療法として、近年免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者本人の免疫細胞、特に白血球を取り出して活性化した上で再度患者本人に戻し、人工的に免疫力を強化するという治療方法である。患者本人の細胞を用いるため、従来の抗癌剤治療などと比べて格段に副作用が少ないという利点がある。
　現在、免疫細胞療法としては、体外でリンパ球をリンフォカインにより抗原非特異的に活性化し、体内に戻す活性化自己リンパ球療法がすでに普及しつつあるが、さらに強力な細胞傷害活性を持ち、病変を特異的に認識・傷害する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下ＣＴＬと記す）を利用した治療法の普及が望まれている。
　ここで、現在試みられているＣＴＬを利用した治療法としては、例えばがん抗原ペプチド等を直接患者に投与するという方法がとられているが、この場合、患者の免疫能が低下していることが多いため、そのＣＴＬ誘導能には改善の余地がある。そこで、抗原提示細胞、例えば樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　Ｃｅｌｌ、以下ＤＣとも記す）等と抗原を接触させて、強力に抗原提示を行わせ、そのＤＣにより体内で疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導する樹状細胞ワクチン療法等がある
　以下、現在の疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導方法について、代表的なものをいくつか例示する。
　例えば、非特許文献１及び２においては、特定疾病抗原のエピトープ等の９ｍｅｒペプチドを末梢血単核球に加えることにより、そこからＣＴＬの誘導を試みている。また、非特許文献３及び４では、末梢血単核球よりＤＣを得、そこに抗原ペプチドを添加させることで抗原提示機能を付与し、そのＤＣとともに末梢血リンパ球より分離したＣＤ８陽性Ｔ細胞を培養することで、該疾病抗原特異的なＣＴＬを誘導している。
　更に、非特許文献５では、造血前駆細胞より得たＤＣと抗原ペプチドによるＤＣワクチンを行い、次いで単球由来のＤＣに抗原を加えたものと末梢血単核球より分離したＣＤ８陽性Ｔ細胞とを共培養することにより抗原特異的なＣＴＬを誘導している。
　上述した例において用いられていることでもわかる通り、樹状細胞は抗原提示細胞の中でもその抗原提示能力が高く、疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導能力が高いため、その技術開発が進められている。
　しかし、通常樹状細胞ワクチンのための樹状細胞を得るためには、ヒトの末梢血を採取し、そこから単球とよばれる細胞を分離し、ＩＬ－４やＧＭ－ＣＳＦなどを添加し、培養する必要がある。また、その工程は煩雑で、現在のところはその培養技術者の技術如何で培養細胞数やその機能も変わってしまうという問題がある。
　一方、非ペプチド抗原により活性化されるγδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞であるが、最近ではがん細胞に対してＭＨＣ非拘束性に細胞傷害活性（非特異的活性）を有することがわかり、このγδＴ細胞の有する強い抗腫瘍活性を利用した免疫療法の研究が行われている。
　γδＴ細胞は非ペプチド抗原を認識して活性化するため、非ペプチド抗原として例えば、アルキルアミンやビスホスホネートでγδＴ細胞を刺激し、活性化及び／又は増殖させることが可能であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで末梢血から分離したγδＴ細胞に非ペプチド抗原を認識させ活性化及び／又は増殖に関する研究がなされている（例えば、非特許文献６）。
　しかしながら、γδＴ細胞は通常、末梢血中に１～５％しか存在しないので、少量の血液を採取してγδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させても治療に十分な純度及び細胞数を確保することができないといった問題がある。また、治療に十分な純度及び細胞数を確保するために患者からの採血量を多くすると、患者に多大な負担がかかるといった問題もある。
　また、特許文献１では、末梢血単核球にビスホスホネートを添加することで、γδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させる方法が開示されている。
　このように、免疫細胞療法においては、より効果の高い細胞を培養・利用することが非常に重要であり、現在も多種多様な手法・技術の開発が行われている。
　更に、免疫細胞療法においては、現状一種類の細胞を主に培養し、それを治療に用いているが、上記のように、例えば疾病抗原特異的ＣＴＬはＭＨＣ拘束性に、例えばＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉに提示されたある抗原に対して特異的に目標とする細胞・組織を攻撃し、γδＴ細胞はＭＨＣ非拘束性に細胞や組織に攻撃を行うといった特性を考えれば、様々な細胞を混合して治療に用いれば良いと考えられる。
　しかしながら、実際には、複数種類の免疫細胞を培養して治療するには、その種類の数だけ培養工程を同時並行で行わなければならない。それぞれの細胞にとって適切な培養条件は異なっており、仮に一種類の細胞に合わせた従来の培養方法では、例えば疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を同時にしかも治療効果を有するだけの細胞数を効率よく培養することは非常に困難であり、そのような効果的な培養方法や誘導方法はいまだ完成されていない。
ＷＯ２００６／００６７２０
Ｓｕｇｉｙａｍａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．　２００２　Ｄｅｃ；５１(１１－１２)：６１４－２０．Ｅｐｕｂ２００２　Ｏｃｔ １８． Ａｐｐｅｌｌａ　Ｅ，　ｅｔ　ａｌ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９５　Ｍａｒ　１；１５４(５)：２２５７－６５． Ｆｕｊｉｔａ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．　Ｂｌｏｏｄ　２０００　Ｊａｎ　１；９５(１)：２８６－９３． Ｙａｓｕｋａｗａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００２　Ａｕｇ；８(８)：２６２６－３１． Ｐａｌｕｃｋａ　ＡＫ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２００４Ｊｕｎ　７；１９９(１１)：１５０３－１１．Ｅｐｕｂ　２００４　Ｊｕｎ　１． Ｆｕｍｉ　Ｍｉｙａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２００１；１６６（９）：５５０８－５５１４
　本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を一つの培養で同時に効率よく治療に効果があるだけの細胞数を誘導・培養することを課題とする。
　本発明者らは、これらの課題を解決するべく様々な研究を行い、本発明を創出するに至った。本発明は以下の通りである。
　（１）末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程と、末梢血の培養を行う工程と、を含むことを特徴とする疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（２）前記疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程は、培養開始初日に行われることを特徴とする（１）に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（３）前記アミノビスホスホネートが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（１）または（２）に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（４）前記疾病抗原が、がん抗原であることを特徴とする（１）から（３）のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（５）前記疾病抗原と前記アミノビスホスホネートを同時に添加することを特徴とする（１）から（４）のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法；（６）（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬；（７）（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法。
　本発明者らは、研究により、アミノビスホスホネートにより活性化された末梢血中のγδＴ細胞が増殖し、これら活性化し増殖したγδＴ細胞がＡＰＣ（Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ：抗原提示細胞）機能を発揮することにより疾病抗原を提示し、疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導をも促すということを見出し、本発明を完成させた。
　本発明によれば、従来の方法であれば、様々な工程を経て所望の細胞を得た後に培養を開始していた疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞の培養・誘導方法について、末梢血から細胞を分離することなく、一つの培養で疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞を同時に効率よく、しかも治療効果が優れた細胞数の多い細胞集団を得ることが可能となる。この誘導方法により得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の混合細胞集団は、医薬として従来の単一の免疫細胞を投与することによる治療よりも効果の高い治療を提供することが可能となる。
　特に、これまでＣＴＬを誘導するためには、（１）血液から単核球を分取し、（２）サイトカインを添加して樹状細胞を誘導し、（３）樹状細胞に抗原をパルスし、（４）抗原をパルスした樹状細胞とリンパ球を共培養し、ＣＴＬを誘導する、という工程が必要であった。しかし、本方法を用いれば樹状細胞を誘導する工程を省略することができるため、作業量を減らすことができ、また、コンタミネーションのリスクを低減することができ、更には、樹状細胞を誘導する期間（およそ７日間）を短縮することができる。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
　＜第一の実施形態：本発明の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法＞
　本発明の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法（以下、単に「本発明の誘導方法」とも言う）は、末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程と、末梢血の培養を行う工程とを含むことを特徴とする。
　従来であれば、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を、それぞれ治療に有効な程度の量を同一培養工程で得ることは非常に困難であったが、本発明の誘導方法では、上記工程を経ることで簡便かつ高効率に得ることが可能である。
　本発明の誘導方法では、末梢血中のγδＴ細胞がアミノビスホスホネートにより活性化され、増殖し、これら活性化し増殖したγδＴ細胞がＡＰＣ機能をも発揮して疾病抗原を提示し、疾病抗原特異的ＣＴＬが誘導される。さらに、ＡＰＣ機能を有したγδＴ細胞が単にＡＰＣとして活動するだけでなく、疾病抗原特異的ＣＴＬが増殖してもなお、γδＴ細胞自身も増殖を続け、どちらの細胞も治療に効果を有するだけの細胞数を得ることが可能となる。
　以下、本発明の誘導方法につき、具体的な手順を説明する。
　１）採血により末梢血を得る。量としては１５～２５ｍＬを必要とする。これだけの量を得られれば、好適に培養することが可能である。ただし、培養開始時に十分な末梢血量であればこの範囲に限らず、また、採血するドナーの負担が少ないようであれば、採血量が多くなるほど疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の回収細胞数は増加するので、より多くの採血量が好ましい。
　２）例えば密度勾配遠心法により、末梢血単核球を得る。個数としては１５～２５ｍＬの末梢血からはおおむね１～２×１０７個の末梢血単核球を得ることができる。
　３）２）で得られたおよそ末梢血単核球を培養液ＡＩＭ－Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＲＰＭＩ－１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下ＤＭＥＭという）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下ＩＭＥＭという）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。
　４）３）で得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。
　５）フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が０．０５～１００μＭ、好ましくは０．１～３０μＭとなるようにアミノビスホスホネートを添加する。
　ここで、ビスホスホネートとはピロリン酸のアナログであり、ピロリン酸骨格のＰ－Ｏ－ＰのＯ（酸素原子）をＣ（炭素原子）で置換した化合物（Ｐ－Ｃ－Ｐ）である。一般的に骨粗鬆症の治療薬として用いられている。アミノビスホスホネートはビスホスホネートのうちＮ（窒素原子）を有する化合物をいう。例えば、本発明で用いられるアミノビスホスホネートとしては特に制限されないが、ＷＯ２００６／００６７２０及びＷＯ２００７／０２９６８９に開示されたアミノビスホスホネート等を用いることができる。具体的には、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物等が挙げられる。ここで、更に、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１～３０μＭ、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１～３０μＭ、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物では０．１～１０μＭにすることが好ましい。ここでは例としてゾレドロン酸を５μＭ添加する。
　６）５）でアミノビスホスホネートを添加するときに、合わせて疾病抗原を添加する。ここで「疾病」とは、例えば、がんや感染症等である。がんとしては、特に制限されず、あらゆるがんを含み、例えば、治療困難であるがん等が挙げられる。感染症としては、例えば、エイズ、Ｂ型・Ｃ型肝炎等のウイルス感染症や、細胞感染、細菌感染、真菌感染、又は原虫による感染症が上げられる。
　抗原の形態としては、ペプチドや、タンパクなど適宜用いることができる。また、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及びそれらの熱処理物等を使用することができる。
　抗原としては、患者由来のもの（例えば、患者から外科手術によって摘出された腫瘍組織等）でも、合成したものでも良い。合成ペプチドを利用すれば、自己のがん組織等から採取したがん抗原を使用する場合と比べ、患者の負担を少なくすることができる。
　添加する量は、ペプチドであれば０．０２～２μｇ／ｍｌ程度添加すれば良い。例えば２μｇ／ｍｌを添加する。
　アミノビスホスホネートと疾病抗原を添加する順序は、特に制限はされず、同時に添加することも、どちらかを先に添加することも可能であるが、同時に添加することが好ましい。
　６）更に、上記培養液にＩＬ－２を濃度が５０～２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００～１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加する。
　７）ＩＬ－２を添加した後３４～３８℃、より好ましくは３７℃で、２～１０％、より好ましくは５％ＣＯ２存在下で培養する。この際、培養する細胞数に応じ、培養液を適宜添加する。更に、培養液の増加に伴い、ＩＬ－２の濃度が５０～２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００～１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。
　８）更に、上記培養液に血清を０．１～２０％添加する。血清として、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳという）、ＡＢ血清又は自己血漿等を使用してもよい。
　以上、培養期間としては７日間以上であれば高純度で疾病抗原特異的ＣＴＬ及びγδＴ細胞を含む細胞群が得られるが、更に細胞数を増やすには、１４日間程度培養することが好ましい。
　また、上記培養工程中、培養液に血漿を添加することが好ましい。添加時期としては、おおむね培養開始０～１００時間の範囲内であれば良好に培養することが可能である。
　＜第二の実施形態：疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬＞
　本発明の医薬は疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬であって、末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを培養開始時に添加して培養することにより得られる医薬である。
　従来の免疫細胞療法に用いられる細胞はその種類で単体、もしくは個別に培養したものを投与時に混合後もしくは同時に添加することにより複数種類の細胞を用いるものであった。
　しかし、本発明の医薬は本発明の誘導方法により同時に疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞とを培養することで得られるものであり、非常に簡便にかつ多くの細胞数を得ることができる。そのような医薬を用いた場合、疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞との相乗効果により、従来の単一の免疫細胞を用いた場合よりも更に治療効果が高くなるという利点を有する。
　以下、具体的に本発明の医薬の説明を行う。
　１）本発明の培養方法によって得られた細胞を遠心分離法等により回収する。
　２）回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。
　３）洗浄後に得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団を遠心分離法等により回収し、医薬品として可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の医薬を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。
　本発明の医薬に用いる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団の数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８～１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
　４）ついで生理食塩水に懸濁して本発明の医薬を得る。本発明の医薬はがんや感染症を対象とした治療・予防剤として用いることができる。
　ここで、がんの治療・予防剤として使用する場合には、ＩＬ－２及びＩＬ－１２等のサイトカインと本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。
　更に、ウイルス感染症の治療・予防剤として使用する場合には、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）等と本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。
　５）投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、病変部に直接注入しても、また点滴として全身投与してもよい。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよい。
　＜第三の実施形態：疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法＞
　本発明の治療・予防方法は末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを培養開始時に添加して培養することにより得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法である。
　以下、具体的に本発明の治療・予防の説明を行う。
　１）本発明の培養方法によって得られた細胞を遠心分離法等により回収する。
　２）回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。
　３）洗浄後に得られた疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団を遠心分離法等により回収し、医薬品として可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の治療・予防方法に用いる細胞懸濁液を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。
　本発明の治療・予防方法に用いる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団の数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８～１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
　４）ついで生理食塩水に懸濁して細胞懸濁液を得る。
　ここで、がんの治療・予防を行う場合には、ＩＬ－２及びＩＬ－１２等のサイトカインと本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。
　更に、ウイルス感染症の治療・予防を行う場合には、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）等と本発明の医薬とを組み合わせることも可能である。
　５）投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、病変部に直接注入しても、また点滴として全身投与してもよい。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよい。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
本発明の培養・誘導方法
　１）健常人ドナーから末梢血を４２ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
　２）得られた末梢血単核球を、ＡＩＭ－Ｖに懸濁した。
　３）６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、８×１０６／４ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ－２を１０００Ｕ／ｍＬ加え、更に、ゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））を５μＭ、ペプチドとしてＭａｒｔ－１（Ａ２７Ｌ、配列；ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を２μｇ／ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
４）更に培養開始後にＡＢ血清を１０％添加した。
５）細胞の増殖に応じて、ＩＬ－２を１０００Ｕ／ｍｌ含有するＡＩＭ－Ｖ、及び、ＡＢ血清を添加し１４日間培養した。
６）上述のとおり、７日間もしくは１４日間培養した後に得られた細胞群中の疾病抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合、またＴＣＲＶγ９を発現している細胞の割合を抗ＣＤ８抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｔ－Ｓｅｌｅｃｔ　ＨＬＡ－Ａ＊０２０１　Ｍａｒｔ－１　Ｔｅｔｒａｍｅｒ　ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＢＬ）、抗ＴＣＲＶγ９抗体（ベックマン・コールター）、抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、を用いて、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（以下ＦＡＣＳという、Ｅｐｉｃｓ　ＸＬ－ＭＣＬ　ＡＤＣ，ベックマン・コールター）により測定した。測定により得られた値を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上の結果により、疾病抗原とアミノビスホスホネートを同時に添加し、培養することによって、疾病抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とγδＴ細胞を優位に含むリンパ球集団を得られることが確認された。
＜疾病抗原の添加がγδＴ細胞上のＣＤ５６発現率に及ぼす影響についての検討＞
　以下の手順により疾病抗原の添加がγδＴ細胞上のＣＤ５６発現率に影響を与えないかを調べた。ＣＤ５６は神経系細胞接着分子（Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｎ－ＣＡＭ）のアイソフォームで、ＮＫ細胞のマーカーとして知られる接着因子である。γδＴ細胞の有する細胞傷害活性の指標となるマーカーの一つである。
　１）健常人ドナーから末梢血を８ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
　２）得られた末梢血単核球を、ＡＩＭ－Ｖに懸濁した。
　３）１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１．８×１０６／２．５ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ－２を１０００Ｕ／ｍＬ加え、更に、ゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ）を５μＭ、ペプチドとしてＭａｒｔ－１（Ａ２７Ｌ）を２μｇ／ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
４）更に培養開始後にＡＢ血清を１０％添加した。
５）細胞の増殖に応じて、ＩＬ－２を１０００Ｕ／ｍｌ含有するＡＩＭ－Ｖ、及び、ＡＢ血清を添加し最大１４日間培養した。
６）上述のとおり、最大１４日間培養した後に得られた細胞群中のＴＣＲＶγ９を発現している細胞の割合、またはＣＤ５６を発現している細胞の割合を抗ＴＣＲＶγ９抗体（ベックマン・コールター）、抗ＣＤ５６抗体（ベックマン・コールター）、抗ＣＤ３抗体（ベックマン・コールター）、を用いて、ＦＡＣＳ（Ｅｐｉｃｓ　ＸＬ－ＭＣＬ　ＡＤＣ、ベックマン・コールター）により測定した。測定により得られた値を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示した通り、疾病抗原を添加しなかった場合（－）と添加した場合（＋）とでγδＴ細胞の表面抗原の発現率に差は見られず、疾病抗原の添加は、γδＴ細胞のＣＤ５６発現率に大きな影響を及ぼさないことが確認された。
　以上説明したように、本発明の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法は、従来であれば疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の培養を別々に行っていたところ、一度の採血により、両方をそれぞれが治療効果を有する細胞数まで増殖・誘導させることを可能にするものである。これにより、疾病特異的・非特異的双方免疫細胞を同時かつ簡便に治療に用いることが可能となり、治療効果も向上するし、患者への負担も軽減することが可能となる。更に、培養工程を一つに集約することが可能となるため、培養コストなど経済的な面においても、その効果を享受することができる。
 

Claims (7)

  1. 末梢血に疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程と、
    　末梢血の培養を行う工程と、
    　を含むことを特徴とする疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
  2. 前記疾病抗原とアミノビスホスホネートとを添加する工程は、培養開始初日に行われることを特徴とする請求項１に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
  3. 前記アミノビスホスホネートが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
  4. 前記疾病抗原が、がん抗原であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
  5. 前記疾病抗原と前記アミノビスホスホネートを同時に添加することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞の同時誘導方法。
  6. 請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞からなる医薬。
  7. 請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により得られる疾病抗原特異的ＣＴＬとγδＴ細胞を投与する治療・予防方法。
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