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WO2010092773A1 - 微粒子測定装置及び微粒子測定方法 - Google Patents

微粒子測定装置及び微粒子測定方法 Download PDF

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WO2010092773A1
WO2010092773A1 PCT/JP2010/000721 JP2010000721W WO2010092773A1 WO 2010092773 A1 WO2010092773 A1 WO 2010092773A1 JP 2010000721 W JP2010000721 W JP 2010000721W WO 2010092773 A1 WO2010092773 A1 WO 2010092773A1
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WO
WIPO (PCT)
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frequency
electrodes
voltage
measurement
impedance
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2010/000721
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
濱田了
末廣純也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Corp
Original Assignee
Panasonic Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Corp filed Critical Panasonic Corp
Priority to JP2010550441A priority Critical patent/JP5241044B2/ja
Priority to GB1113412.9A priority patent/GB2479687B/en
Priority to US13/148,104 priority patent/US8702947B2/en
Publication of WO2010092773A1 publication Critical patent/WO2010092773A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C5/00—Separating dispersed particles from liquids by electrostatic effect
    • B03C5/005—Dielectrophoresis, i.e. dielectric particles migrating towards the region of highest field strength
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C5/00—Separating dispersed particles from liquids by electrostatic effect
    • B03C5/02—Separators
    • B03C5/022—Non-uniform field separators
    • B03C5/026—Non-uniform field separators using open-gradient differential dielectric separation, i.e. using electrodes of special shapes for non-uniform field creation, e.g. Fluid Integrated Circuit [FIC]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/0656—Investigating concentration of particle suspensions using electric, e.g. electrostatic methods or magnetic methods
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance

Definitions

  • the present invention relates to a fine particle measuring apparatus and a fine particle measuring method for measuring the number of fine particles in a sample solution using dielectrophoresis. More specifically, the present invention relates to a fine particle measuring apparatus and a fine particle measuring method for avoiding the influence of solution conductivity without pretreatment and measuring with high sensitivity and high accuracy.
  • microbiological examination can be performed on the spot to prevent or prevent food poisoning or infectious diseases.
  • biosensors In addition, in so-called biosensors, the number of fine particles in a sample when quantitatively measuring a biochemical substance in a sample using an artificial fine particle such as polystyrene labeled with a substance that specifically binds to an object such as an antibody. Alternatively, it is necessary to quantitatively measure the binding state. Thus, nowadays, there is a high demand for quickly, simply and quantitatively measuring fine particles contained in a liquid.
  • microparticles referred to in this application are polystyrene, particles with some coating on them, carbon particles, metal particles such as gold colloids, bacteria, fungi, actinomycetes, rickettsia, mycoplasma, viruses, so-called microorganisms, and protozoa
  • microorganisms and protozoa
  • living organisms or living organism-derived microparticles in a broad sense including small animals, protozoa, larvae of organisms, animal and plant cells, sperm, blood cells, nucleic acids, proteins, and the like.
  • the fine particles referred to in the present application mean all particles having a size capable of dielectrophoresis. In this application, in particular, measurement of microorganisms is assumed.
  • the detection target of the present application is assumed to be microorganisms contained in blood or saliva of humans or animals, or microorganisms collected from the surface of humans or animals such as mucous membranes to which blood or saliva adheres. Since blood or saliva of humans or animals contains ions at high concentrations, the conductivity of the measurement solution increases or fluctuates, which causes a variation in the detection method using dielectrophoresis.
  • the culture method is a method of quantifying the number of microorganisms by smearing a microorganism sample on a medium, culturing the microorganism under growth conditions, and counting the number of colonies on the formed medium.
  • DEPIM Dielectrophoretic Impedance Measurement Method
  • the DEPIM method is a method for quantitatively measuring the number of microorganisms in a sample solution by collecting microorganisms on a microelectrode by dielectrophoretic force and simultaneously measuring the impedance change of the microelectrode.
  • the measurement principle will be outlined below.
  • Microorganisms generally have a structure surrounded by cell membranes, in which the cytoplasm and cell wall are ion-rich and have a high dielectric constant and high conductivity, and have a relatively low dielectric constant and low conductivity, and can be regarded as dielectric particles.
  • a dielectrophoretic force that is a force acting in a certain direction on dielectric particles polarized in an electric field is used to collect microorganisms that are dielectric particles between gaps of microelectrodes.
  • Equation 1 the dielectrophoretic force F DEP acting on the dielectric particles is given by the following ( Equation 1) (for example, see Non-Patent Document 1).
  • Equation 1 the dielectrophoretic force F DEP acting on the dielectric particles is given by the following ( Equation 1) (for example, see Non-Patent Document 1).
  • Equation 1 the dielectrophoretic force F DEP acting on the dielectric particles is given by the following ( Equation 1) (for example, see Non-Patent Document 1).
  • a radius of microorganism when approximated to a sphere
  • ⁇ 0 dielectric constant of vacuum
  • ⁇ m relative permittivity of sample liquid
  • E electric field strength
  • ⁇ represents a gradient by an operator .
  • ⁇ E 2 is the gradient of the electric field E 2 , and means how much E 2 has an inclination at that position, that is, how suddenly the electric field E changes spatially.
  • K is called Clausius-Mosotti number and is expressed by (Expression 2).
  • Re [K]> 0 indicates positive dielectrophoresis, and microorganisms are in the same direction as the electric field gradient, that is, toward the electric field concentration part. Electrophoresed.
  • Re [K] ⁇ 0 represents negative dielectrophoresis and migrates away from the electrolytic concentration part, that is, toward the weak electric field part.
  • ⁇ b * and ⁇ m * represent the complex relative permittivity of the microorganism and the solution, respectively, and generally the complex relative permittivity ⁇ r * is expressed by (Equation 3).
  • ⁇ r represents the relative dielectric constant of the microorganism or sample solution
  • ⁇ represents the conductivity of the microorganism or sample solution
  • ⁇ represents the angular frequency of the applied electric field
  • the DEPIM method it is necessary to appropriately select these parameters, sufficiently increase the dielectrophoretic force acting on the microorganism, and reliably collect the microorganism in the electrode gap.
  • the DEPIM method is characterized in that the number of microorganisms in a sample solution is quantitatively measured by performing electrical measurement simultaneously with the collection of microorganisms on the electrode by dielectrophoresis.
  • microorganisms have the structure described above, they can be considered as fine particles having an inherent impedance electrically. Therefore, when the number of microorganisms collected between the gaps of the microelectrodes by dielectrophoresis increases, the impedance between the electrodes changes according to the number of collections.
  • the slope of the inter-electrode impedance time change becomes a value corresponding to the number of microorganisms collected between the electrode gaps per unit time, and the magnitude of the slope corresponds to the microorganism concentration in the sample solution. Therefore, it is possible to measure the microorganism concentration in the sample solution, in other words, the number of microorganisms, by measuring the slope of the interelectrode impedance time change.
  • the DEPIM method realizes microorganism measurement in a short time by quantifying the number of microorganisms from the slope of the change in impedance time immediately after the start of dielectrophoresis.
  • the measurement principle of the DEPIM method has been outlined above. For details, refer to Non-Patent Document 2.
  • the sample liquid used for the measurement in this application assumes that a microorganism collected by some method such as blood or saliva is suspended in a low conductivity liquid mainly composed of water.
  • a microorganism collected by some method such as blood or saliva
  • ions contained in the vicinity are collected at the same time.
  • the dielectric constant of the sample solution becomes almost the same value as that of water, and eventually, the dielectrophoretic force acting on the microorganism depends on the ion concentration of the sample solution, in other words, the conductivity.
  • the higher the sample solution conductivity the smaller the dielectrophoretic force. Therefore, when the measurement of the sample liquid as described above is assumed by the conventional DEPIM method, in the sample having a high sample liquid conductivity, the dielectrophoretic force acting on the microorganism is reduced and the number of microorganisms collected on the microelectrode is reduced. As a result, there was a problem that measurement sensitivity was lowered. Furthermore, since the dielectrophoretic force acting on the microorganisms differs depending on the sample solution conductivity, there is a problem that the measurement results vary greatly when sample solutions having different conductivities are measured.
  • a technique for reducing the conductivity of a sample solution by ion exchange or the like before measurement is known as a means for solving the above problems.
  • This technique is a method of analyzing microorganisms in a sample solution by dielectrophoresis after processing the sample solution with an ion exchange column before analysis and reducing the conductivity of the sample solution (see, for example, Patent Document 2). .
  • a microorganism activity measuring apparatus that performs quick and near real-time measurement to detect microorganism activity simply and quantitatively, and a method for measuring the microorganism activity used at that time are known.
  • the microorganism type and the conductivity of the sample solution are input, and the optimum voltage (amplitude and frequency) for measuring the activity is selected from the table in Table 1 (for example, see Patent Document 3).
  • a measurement method in which when performing dielectrophoresis and impedance measurement simultaneously, a voltage for inducing dielectrophoresis and a voltage and frequency for performing impedance measurement are set independently.
  • the voltage for performing dielectrophoresis is 12 Vrms or more ⁇ 1 kHz to 50 MHz, and the voltage for performing impedance measurement is 0.8 Vrms ⁇ 800 Hz (see Non-Patent Document 3).
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-125846 Japanese National Table No.11-501210 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-02224
  • the operation of microorganisms using dielectrophoresis has a problem that when the conductivity of the sample solution increases, the positive dielectrophoretic force decreases and it becomes difficult to trap the microorganisms in the electrode gap.
  • it is necessary to induce a sufficiently large dielectrophoretic force for impedance change measurement it is necessary to increase the applied voltage, and as a result, the current flowing through the electrode increases.
  • the impedance measuring circuit that the voltage condition for measuring the impedance is such that the amplitude is small and the frequency is low. That is, there is a need for means for achieving both high-precision impedance measurement and trapping of microorganisms on the electrodes by dielectrophoresis.
  • Patent Document 1 describes an example in which a sinusoidal alternating voltage having a frequency of 1 MHz and a peak voltage of 100 V is applied between flat plate electrodes.
  • the frequency of the alternating current applied at this time is arbitrary as long as it is in a frequency range in which dielectrophoresis occurs.
  • the microorganism activity measuring apparatus of patent document 3 inputs the microorganism type and the electrical conductivity of the sample solution, and selects the optimum voltage (amplitude and frequency) for measuring the activity from the table. The frequency at which the difference in force occurs is selected.
  • Non-Patent Document 3 voltage conditions for performing dielectrophoresis and impedance measurement can be individually selected, so that the change in dielectrophoretic force with respect to the increase in the conductivity of the sample liquid.
  • dielectrophoresis can be performed at a high frequency of 1 MHz or more, which is small, the influence of Warburg impedance becomes significant at low frequencies where impedance measurement is performed, and correct impedance measurement cannot be performed, and the accuracy of measurement results may be significantly impaired. It had the problem that.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is intended to detect microorganisms collected from the surface of humans or animals, such as microorganisms contained in blood or saliva, or mucous membranes to which blood or saliva has adhered. If the solution conductivity of the sample solution to be measured is high and varies from sample to sample, a dielectrophoresis trap with a high solution conductivity and a fine particle measuring device capable of achieving both high sensitivity and high accuracy impedance measurement and The object is to provide a fine particle measuring method.
  • the present inventors have a frequency region in which the influence of the solution conductivity can be avoided, particularly when performing dielectrophoresis of bacteria. Separately, the frequency region and amplitude suitable for high-precision impedance measurement. Found that there is. The present invention has been achieved based on such findings.
  • the fine particle measuring apparatus includes a cell for introducing a liquid containing fine particles contained in at least one of blood and saliva, at least a pair of electrodes immersed in the cell, and a gap between the pair of electrodes.
  • Control for calculating the number of the fine particles in the cell by calculating the time variation of the impedance between the pair of electrodes and the electrophoretic power supply unit for applying an alternating voltage, the measuring unit for measuring the impedance between the pair of electrodes
  • An arithmetic unit wherein the control arithmetic unit measures the influence of Warburg impedance for measuring an alternating voltage of a first frequency for inducing dielectrophoresis in the fine particles and an impedance between the pair of electrodes.
  • the migration power supply unit is instructed to apply an AC voltage having a second frequency, which is higher than the generated frequency, between the pair of electrodes.
  • the alternating voltage of the first frequency is applied to cause the dielectrophoretic force to act on the fine particles, and the impedance is measured by applying the alternating voltage of the second frequency that is a frequency equal to or higher than the boundary frequency.
  • a dielectrophoresis trap with high solution conductivity and high sensitivity and high accuracy impedance measurement can be made compatible.
  • the alternating voltage of the first frequency has a first amplitude
  • the alternating voltage of the second frequency has a second amplitude
  • the second amplitude is smaller than the first amplitude.
  • This configuration has an effect of preventing the AC voltage having the second frequency for measuring the impedance from affecting the induction migration.
  • control calculation unit adjusts at least one of the first frequency and the second frequency based on the solution conductivity.
  • the first frequency and the second frequency are adjusted based on the solution conductivity, dielectrophoresis and impedance measurement can be performed at an appropriate frequency even when the solution conductivity varies.
  • the particle measuring apparatus is configured to sequentially switch between the first frequency and the second frequency.
  • the time for applying the alternating voltage of the second frequency is shorter than the time for applying the alternating voltage of the first frequency.
  • the fine particles can be reliably trapped on the electrode without scattering the fine particles from the electrode due to the loss of the dielectrophoretic force during application of the voltage of the second frequency for impedance measurement. Highly sensitive measurement can be realized.
  • the second frequency is higher than 800 kHz and lower than the first frequency.
  • the migration power supply unit applies the alternating voltage of the first frequency and the alternating voltage of the second frequency in a superimposed manner between the pair of electrodes, Filter means for filtering out the frequency component of the AC voltage of the second frequency among the superimposed AC voltage applied between the electrodes of the second frequency, and the measurement unit is the filtered second frequency The impedance between the pair of electrodes corresponding to the frequency component of the AC voltage is measured.
  • the alternating voltage of the first frequency and the second frequency is applied in a superimposed manner, the frequency component of the alternating voltage of the second frequency is filtered and the impedance between the pair of electrodes is measured.
  • the design of the measurement circuit can be simplified and the cost can be reduced, and the trapping of the fine particles and the impedance measurement can be simultaneously performed by applying the alternating voltages of the first frequency and the second frequency in a superimposed manner. Therefore, when switching from the first frequency to the second frequency, it is possible to prevent the dielectrophoretic force acting on the fine particles from decreasing and the fine particles from separating from the electrode gap, and to perform high-precision and high-sensitivity measurement. Can be done.
  • an alternating electric field is applied between a pair of electrodes immersed in a sample liquid containing fine particles contained in at least one of blood and saliva, and the fine particles are separated by a dielectrophoretic force.
  • a fine particle measuring method for measuring the number of fine particles in the sample solution which is disposed at a predetermined position, wherein an alternating voltage of a first frequency is applied between the pair of electrodes, and a dielectrophoretic force is applied to the fine particles.
  • an AC voltage having a second frequency that is higher than the frequency at which the influence of the Warburg impedance is generated between the pair of electrodes for measuring the impedance between the pair of electrodes. Measuring the impedance between the pair of electrodes, calculating the time variation of the impedance between the pair of electrodes, And a step of calculating the number of the fine particles.
  • the alternating voltage of the first frequency is applied to cause the dielectrophoretic force to act on the fine particles, and the impedance is measured by applying the alternating voltage of the second frequency that is a frequency equal to or higher than the boundary frequency.
  • a dielectrophoresis trap with high solution conductivity and high sensitivity and high accuracy impedance measurement can be made compatible.
  • the fine particle measurement method according to the present invention includes a step of selecting the first frequency and the second frequency based on the solution conductivity.
  • the first frequency and the second frequency are selected based on the solution conductivity, dielectrophoresis and impedance measurement can be performed at an appropriate frequency even when the solution conductivity varies.
  • the fine particle measurement method includes a step of superimposing and applying the alternating voltage of the first frequency and the alternating voltage of the second frequency between the pair of electrodes, and between the pair of electrodes. And filtering the frequency component of the alternating voltage of the second frequency out of the superimposed alternating voltage applied to, and measuring the impedance between the pair of electrodes.
  • the alternating voltage of the first frequency and the second frequency is applied in a superimposed manner, the frequency component of the alternating voltage of the second frequency is filtered and the impedance between the pair of electrodes is measured.
  • the design of the measurement circuit can be simplified and the cost can be reduced, and the trapping of the fine particles and the impedance measurement can be simultaneously performed by applying the alternating voltages of the first frequency and the second frequency in a superimposed manner. it can.
  • a dielectrophoretic force is applied to the microparticles by applying an alternating voltage of a first frequency, Since the impedance is measured by applying an AC voltage having a second frequency that is equal to or higher than the frequency, a dielectrophoresis trap with high solution conductivity and high-sensitivity and high-accuracy impedance measurement can both be achieved.
  • Schematic configuration diagram for explaining a particle measuring apparatus according to a first embodiment of the present invention (1) Schematic for demonstrating the electrode tip of the particulate measuring device concerning the embodiment of the present invention. The figure which shows the electric force line 15 produced by the voltage applied between measurement electrode 11a, 11b in embodiment of this invention. 4A and 4B are explanatory views in which the fine particles 14 are trapped along the lines of electric force at the opposing edge portions of the electrodes 11a and 11b.
  • Schematic configuration diagram for explaining the particle measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention (3) FIGS.
  • 7A and 7B are graphs showing the relationship between the solution conductivity ( ⁇ S / cm) and Re [K] when the frequency of the AC voltage for dielectrophoresis is used as a parameter.
  • the graph which shows the relationship between the frequency (Hz) of the alternating voltage for dielectrophoresis, and the real part (Re [K]) of the Clausius Mosotti number
  • a graph showing the relationship between the frequency of impedance measurement AC voltage and the impedance of the solution when the number of fine particles in the solution is used as a parameter The graph which shows the relationship between the frequency (Hz) of electrophoretic voltage and Re [K] when solution conductivity ( ⁇ S / cm) is used as a parameter.
  • the figure which shows the electrode in the Example of this invention The figure which shows the mode of the electrode gap 40 seconds after voltage application in the Example of this invention when (a) is 100 kHz, (b) is 800 kHz, (c) is 3 MHz in the Example of this invention.
  • 18 (a) and 18 (b) show the state of the electrode gap when 3 MHz and 10 Vp-p are applied as the frequency of the migration voltage and 100 kHz is applied as the frequency of the measurement voltage in the embodiment of the present invention.
  • 19 (a) and 19 (b) are graphs showing logarithm display of Escherichia coli concentration and response value (capacitance slope) of DEPIM measurement in Example of the present invention.
  • Cole-Cole plot of electrode impedance when the conductivity of the solution is 240 ⁇ S / cm in an embodiment of the present invention The figure which shows the mode of an electrode gap when (a) is 100 kHz and (b) is superimposed on 800 kHz as a frequency of a measurement voltage in the Example of this invention.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of the microorganism measuring apparatus of the present embodiment
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an electrode chip of the microorganism measuring apparatus of the present embodiment.
  • 1 is a cell for holding a sample solution 2 containing microorganisms to be measured
  • 3 is an electrode chip including electrode pairs for collecting microorganisms by dielectrophoresis
  • 4 is an electrophoretic power supply unit
  • 5 is trapped by dielectrophoresis.
  • a measuring unit for measuring an optical or electrical change caused by the microorganisms applied a control calculating unit for controlling the whole microorganism measuring apparatus, performing an analysis calculation of the measurement result, input / output processing, and the like, and 7 for the sample liquid 2.
  • Conductivity input means for inputting conductivity.
  • 10 is a substrate
  • 11a and 11b are electrodes formed on the substrate 10 to form a pair of electrodes
  • 13 is a gap between the electrodes 11a and 11b.
  • a pattern of electrodes 11a and 11b is formed on the substrate 10 by a conductive material such as metal.
  • a conductive material such as metal.
  • gold, silver, copper, aluminum, platinum, or the like is desirably sufficient, and silver is used in this embodiment mode.
  • FIG. 3 shows the electric lines of force 15 generated by the voltage applied between the measuring electrodes 11a and 11b.
  • the configuration in the vicinity of the gap 13 between the measurement electrodes 11a and 11b corresponds to the electric field concentration portion, and the gap 13 is most concentrated in the electric field. Therefore, microorganisms migrate most strongly in the gap 13 portion.
  • the electrodes 11a and 11b are desirably thin films that are sufficiently thin with respect to their widths.
  • the thickness is about 1000 mm with respect to a width of 100 ⁇ m.
  • the method of patterning the electrodes 11a and 11b only needs to be able to form a desired pattern with a selected material.
  • electrodes for example, a method of forming a metal thin film by sputtering, vapor deposition, plating, etc., and forming a pattern by photolithography, laser processing, etc., a method of forming a direct pattern such as printing, etc.
  • Different processes can be selected. The most appropriate process should be selected in consideration of productivity and cost.
  • a silver thin film is formed by sputtering, and a pattern is formed by photolithography.
  • the electrodes 11a and 11b are respectively connected to the migration power supply unit 4, and the migration power supply unit 4 applies an alternating voltage of a specific frequency between the electrodes 11a and 11b.
  • the AC voltage is a voltage that changes the direction of the flow at a substantially constant cycle in addition to a sine wave, and the average values of the currents in both directions are equal.
  • the frequency applied by the electrophoresis power supply unit 4 is appropriately determined by the control calculation unit 6.
  • the fine particles 14 When a positive dielectrophoretic force acts on the fine particles 14, the fine particles 14 follow the lines of electric force along the opposing edge portions of the electrodes 11 a and 11 b in the region of the gap 13 that is the electric field concentration portion as shown in FIG. Trapped in a rosary shape called a pearl chain.
  • the measuring unit 5 measures the impedance change caused by the microorganisms trapped in the gap 13 in this way.
  • a circuit that measures the impedance between the electrodes 11 a and 11 b is configured by the measurement unit 5 between the migration power supply unit 4 and the electrode chip 3.
  • the measuring unit 5 includes a current value flowing between the electrodes 11a and 11b, a circuit for measuring the phase difference between the voltage and current applied by the electrophoresis power supply unit 4, and the like.
  • the measurement unit 5 measures changes in current and phase difference between the electrodes 11a and 11b caused by microorganisms moving by dielectrophoresis and concentrated near the electric field concentration portion.
  • the current value measurement performed here is a known method such as arranging a detection resistor in series with the electrode and converting the voltage drop to a current value, or a current-voltage conversion circuit using a general operational amplifier. Is available.
  • the current value and phase difference measured by the measurement unit 5 are passed to the control calculation unit 6.
  • the control calculation unit 6 calculates the impedance value between the electrodes 11a and 11b from the information on the current, the phase difference, and the voltage and frequency applied by the electrophoresis power supply unit 4.
  • the region filled only with the sample liquid 2 between the electrodes 11a and 11b is replaced by microorganisms having different dielectric constants by trapping by dielectrophoresis, so that the impedance between the electrodes 11a and 11b is the number of microorganisms trapped. It changes according to.
  • the number of microorganisms trapped in the gap 13 from the difference between the impedance value at a certain time and the initial impedance value immediately after voltage application, in other words, the amount of change. Since the number of trapped microorganisms depends on the concentration of microorganisms contained in the sample solution, the number of microorganisms in the sample solution can be measured.
  • the measuring unit 5 can also be realized by optical measuring means as shown in FIG.
  • the cells 1 are arranged in such a positional relationship that the gap 13 is included in the optical path between the light source 21 and the light receiving unit 22.
  • the number of microorganisms trapped in the gap 13 can be estimated by utilizing the fact that the amount of light incident on the light receiving unit 22 varies depending on the number of microorganisms trapped in the gap 13.
  • the information of the light receiving unit 22 may be transferred to the control calculation unit 6 to be imaged, and the control calculation unit 6 may directly count the number of particles using a particle determination algorithm or the like, or obtain the fine particle area with respect to the visual field area. You may convert into the number of fine particles. Since the number of microorganisms trapped in the gap 13 obtained in this way depends on the concentration of microorganisms contained in the sample solution, the number of microorganisms in the sample solution can be measured.
  • the control calculation unit 6 appropriately determines a frequency at which a sufficient dielectrophoretic force is exerted to trap the microorganisms in the gap 13, and the voltage of the determined frequency is determined by the electrophoresis power supply unit 4. Apply. Thereby, since the measurement part 5 can take out the signal which can fully be detected, the measurement of microorganism concentration can be performed with high precision and high sensitivity.
  • the control calculation unit 6 includes a CPU (not shown) and a circuit such as a memory 6a in which a program for defining a series of operations and various data are stored, and controls a series of measurement operations.
  • the conductivity input means 7 can input the conductivity of the sample solution before measurement. For example, it can be realized by a method of inputting a numerical value with a numeric keypad or a method of pressing a switch corresponding to a plurality of conductivity ranges such as “0 to 50 ⁇ S / cm” and “50 to 100 ⁇ S / cm”.
  • the memory 6 a has a frequency selection table for selecting an appropriate frequency of the voltage applied by the electrophoresis power supply unit 4 from the conductivity value of the sample solution given from the conductivity input means 7.
  • a frequency selection table for each conductivity of the sample solution 2, an optimum frequency and applied voltage value at which a sufficient dielectrophoretic force acts on microorganisms are tabulated.
  • the frequency selection table stored in the memory 6a will be described in detail.
  • Table 2 at least the conductivity of the sample solution, the amplitude of the alternating voltage to be applied, and the optimum frequency are stored in association with each other in the frequency selection table.
  • the conductivity of the sample solution may be a specific numerical value, or a table may be created by setting a certain range.
  • the control calculation unit 6 selects the amplitude and optimum frequency of the AC voltage corresponding to the given conductivity.
  • “E” of the frequency corresponding to the conductivity of 300 ⁇ S / cm ⁇ indicates an error, and indicates that measurement cannot be performed when the conductivity is too high.
  • the numerical values listed in Table 2 are merely examples, and are actually set to optimum values depending on the measurement object, conductivity, and electrode design.
  • Equation 1 the dielectrophoretic force F DEP is proportional to the real part of the Clausius Mosotti number K, that is, Re [K].
  • Re [K] depends on the conductivity of the sample solution 2 as is clear from (Equation 2) and (Equation 3).
  • FIG. 7 shows how Re [K], that is, the dielectrophoretic force changes when the conductivity of the sample solution 2 changes.
  • the electric field used for dielectrophoresis in other words, the frequency of the applied voltage is used as a parameter, and is shown as a function of the conductivity of the sample liquid 2.
  • Re [K] corresponds to the dielectrophoretic force F DEP , and the sign thereof corresponds to whether the dielectrophoretic force acts as an attractive force or a repulsive force.
  • the optimum frequency is not optimum for dielectrophoresis, but there is an acceptable frequency range that can cause sufficient dielectrophoresis to perform fine particle measurement.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the frequency (Hz) of the AC voltage for dielectrophoresis and the real part (Re [K]) of the Clausius Mosotti number when the solution conductivity ( ⁇ S / cm) is used as a parameter. .
  • the optimum frequency Is about 700 kHz to 4 MHz. In this case, in order to avoid complication of the measurement circuit due to high frequency, it is possible to adopt 700 kHz which is the lower limit frequency as the optimum frequency.
  • a sufficient dielectrophoretic force may be obtained at one specific frequency within the range of the sample solution conductivity that needs to be measured. In that case, a frequency selection table as shown in Table 3 is obtained.
  • the circuit configuration is simple and convenient.
  • the sample solution conductivity exceeds 100 ⁇ S / cm, data corresponding to the error is written as shown in the frequency selection table.
  • FIG. 9 is a flowchart for explaining the microorganism measuring method according to the present embodiment.
  • a sample solution containing the microorganism to be measured is introduced into the cell 1 (step S11).
  • the conductivity of the input sample solution is input by the conductivity input means 7.
  • the input conductivity is passed to the control calculation unit 6 (step S12).
  • the control operation unit 6 passed the conductivity of the sample solution refers to the optimum frequency table provided in the memory 6a and selects the voltage amplitude value and the frequency to be applied to the electrode (step S13).
  • the voltage amplitude value at this time (hereinafter referred to as “voltage for dielectrophoresis”) may be selected to be a value sufficient for trapping microorganisms in the gap 13 and is set to 10 Vp-p in this embodiment. .
  • the voltage for dielectrophoresis is a constant value with respect to the conductivity, but an optimum value can be selected for each conductivity. For example, if the conductivity is high, Joule heat is generated if the voltage is too high, and the microorganism trap by dielectrophoresis is affected, so the voltage for dielectrophoresis is lowered as the conductivity increases. And
  • control calculation unit 6 determines whether the frequency stored in the memory and corresponding to the input conductivity is the error code (E) (step S14). If it is an error code (E), the process proceeds to step S16, and the control calculation unit 6 instructs the display means 9 to display that the input conductivity is out of the measurement range, and ends the measurement. (Step S22).
  • step S14 when the selected frequency is not the error code (E), the control calculation unit 6 applies a voltage between the electrodes 11a and 11b to the electrophoresis power supply unit 4 with the voltage amplitude and frequency selected in the optimum frequency table. Is applied (step S15).
  • the measurement unit 5 When a predetermined voltage is applied between the electrodes 11a and 11b, the measurement unit 5 immediately measures the impedance between the electrodes 11a and 11b as data in the initial state immediately after the voltage application, and the measurement result is passed to the control calculation unit 6.
  • the initial impedance value is stored in the memory 6a (step S17).
  • impedance measurement is described as an example.
  • the measurement unit 5 measures the state of the gap 13 using optical means, the initial state can be measured without applying a voltage. Can be performed before step S15.
  • control calculation unit 6 waits until a predetermined time elapses by a clock means (not shown). At this time, the electrophoretic power supply unit 4 keeps voltage application (step S18).
  • control calculation unit 6 determines whether the predetermined number of measurements has expired (step S19), and if not, returns to step S17. Returning to step S17, the control calculation unit 6 instructs the measurement unit 5 to measure the impedance between the electrodes 11a and 11b, and stores the result in the memory 6a as a result after a predetermined time has elapsed.
  • control calculation unit 6 instructs the electrophoresis power supply unit 4 to stop voltage application (step S20).
  • control calculation unit 6 calculates the fine particle concentration in the sample liquid 2 from the time-dependent change data of the impedance between the electrodes 11a and 11b stored in the memory 6a, and causes the display unit 9 to display the result. (Step S21), a series of measurement operations are terminated (Step S22).
  • the calculation of the microorganism concentration can be obtained from a calibration curve stored in advance in the memory 6a.
  • This calibration curve uses a measurement system of the microbe measurement apparatus described in this embodiment to measure a calibration sample with a clear microbial concentration in advance, and performs regression analysis of the variation from the correlation between the number of microbes and the impedance change at that time. A function that represents the curve obtained as described above is used.
  • the microorganism concentration in the cell 1 is calculated by substituting the value of the impedance change within a predetermined time. it can.
  • the calculation result based on the conversion formula is stored in advance.
  • the present embodiment by selecting an optimum applied electric field frequency according to the conductivity of the sample solution, a sufficient dielectrophoretic force can be exerted on the microorganism to perform the measurement. Even if the conductivity of the liquid increases, microorganisms can be measured without pretreatment.
  • the microorganism measuring apparatus of the present embodiment induces dielectrophoresis on fine particles between a cell 1 for introducing a microorganism-containing liquid, at least a pair of electrodes 11a and 11b immersed in the cell 1, and a pair of electrodes 11a and 11b.
  • An electrophoretic power supply unit 4 for applying at least one of an AC voltage (hereinafter referred to as a migration voltage) for measurement and an AC voltage (hereinafter referred to as a measurement voltage) for measuring impedance between the pair of electrodes 11a and 11b;
  • a control calculation unit 6 having a function of calculating a time change in impedance between 11a and 11b and calculating the number of microorganisms in the cell 1; As will be described later, it is appropriate to use a relatively high frequency around several MHz for the electrophoretic voltage and a relatively low frequency around several hundred kHz.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the solution conductivity ( ⁇ S / cm) and the real part (Re [K]) of the Clausius Mosotti number when the frequency of the electrophoresis voltage is used as a parameter.
  • Re [K] corresponds to the dielectrophoretic force F DEP .
  • the sign of Re [K] corresponds to whether the dielectrophoretic force acts as an attractive force or a repulsive force.
  • the frequency of the electrophoresis voltage is increased to (3) 800 kHz and (4) 1 MHz, the positive dielectrophoretic force F DEP acting on the microorganism is maintained even when the solution conductivity is increased.
  • the higher the frequency of the electrophoretic voltage the less the influence of the solution conductivity is, and it is advantageous to increase the frequency of the electrophoretic voltage in order to trap microorganisms efficiently.
  • FIG. 12 is a graph showing the relationship between the frequency (Hz) of electrophoresis voltage and Re [K] when the solution conductivity ( ⁇ S / cm) is used as a parameter.
  • the conductivity of the sample solution is 20 ⁇ S / cm or more.
  • the dielectrophoretic force F DEP changes from repulsive force to attractive force at a frequency of the electrophoretic voltage of about 50 kHz or more. Therefore, the frequency of the electrophoresis voltage needs to be at least 50 kHz or more.
  • the frequency of the electrophoresis voltage is preferably between 50 kHz and 50 MHz.
  • the conductivity of the sample solution is assumed to be 100 ⁇ S / cm or more in some cases. Therefore, in order to make this sample solution measurable as well, it is most desirable because Re [K] is 0.5 or more when 700 kHz to 15 MHz is used, and a sufficient dielectrophoretic force can be induced in the microorganism.
  • the frequency of the electrophoresis voltage is 3 MHz, and the amplitude may be selected to be a value sufficient to trap the microorganisms in the gap 13 and is set to 10 Vp-p.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the frequency of the measurement voltage and the impedance of the solution when the number of microorganisms in the solution is used as a parameter.
  • the frequency is maximum (about 20 K ⁇ to 150 K ⁇ ) around 10 kHz (arrow C). Therefore, it can be said that the frequency around 10 kHz is the most suitable frequency for impedance measurement.
  • impedance measurement is performed in a relatively high frequency range of about 1 to 10 MHz, which is optimal as the frequency of electrophoresis voltage, the measurement circuit becomes complicated. Therefore, it is difficult to realize a highly accurate impedance measurement circuit. For this reason, impedance measurement is performed with the frequency of the measurement voltage as a relatively low frequency region of about 10 kHz to 1 MHz. In this embodiment, since different frequencies can be individually selected for dielectrophoresis and impedance measurement, it is possible to realize highly accurate impedance measurement with a simple measurement circuit under optimum conditions for dielectrophoresis and impedance measurement. effective.
  • the solution conductivity when the solution conductivity is about 3 ⁇ S / cm or more, it becomes a negative dielectrophoresis region.
  • microorganisms are introduced between the electrodes 11a and 11b. Not desirable for trapping. For this reason, it is desirable to increase the frequency within the range permitted by the impedance measurement accuracy, and to reduce the amplitude compared to the electrophoresis voltage.
  • the frequency of the measurement voltage is such that the negative dielectrophoresis occurs in the conductivity of the measurement sample solution. Most preferably, the frequency does not occur.
  • FIG. 13 is a diagram (referred to as a Cole-Cole plot) showing the relationship between the real part (horizontal axis) and the imaginary part (vertical axis) of electrode impedance measured by sweeping the frequency.
  • the high frequency side is a semicircular locus (left side of (1)) with the frequency (referred to as Fl) in (1) as the boundary
  • the equivalent circuit of the electrode system is a simple model of resistance and capacitance. Described.
  • the lower frequency side than Fl (the right side from (1)) is affected by the Warburg impedance, and the Cole-Cole plot is an area out of the semicircle.
  • the frequency of Fl is called the boundary frequency.
  • the impedance of the area where the plot deviates from the semicircle becomes complicated, such as the diffusion coefficient of the substance involved in electron transfer between the electrode and the solution.
  • the Cole-Cole plot may be measured with a solution (contains no bacteria) that is assumed to be an actual electrode system.
  • the magnitude of the impedance at the frequency of the measurement voltage is as large as possible in order to prevent measurement errors due to unnecessary current flowing. Therefore, it is desirable to select the frequency of the measurement voltage up to the top of the Cole-Cole plot semicircle (point (2) in FIG. 13, referred to as Fh).
  • Fh the frequency of the measurement voltage up to the top of the Cole-Cole plot semicircle
  • a frequency at which desired measurement accuracy can be ensured at a frequency of Fl to Fh determined from the measurement result can be determined as the frequency of the measurement voltage.
  • the frequency of the measurement voltage is set to 800 kHz.
  • the measurement object is for measuring fine particles contained in blood or saliva, specifically bacteria.
  • Blood or saliva has a conductivity that varies depending on the human being or animal to be measured, or depending on the sample collection time. Therefore, in order to detect only the impedance change due to the bacteria trapped on the electrode, the solution containing the bacteria to be measured in one cell has the same conductivity as the solution to be measured in the other cell, and Introducing a solution that does not contain bacteria to be measured, and canceling the impedance change due to the bacteria being trapped, the electrical conductivity of the liquids that are put into the two cells can be matched in an industrial one. It is considered effective because it is possible. However, this two-cell type cannot be used for measuring blood or saliva of humans or animals.
  • the frequency is more than the frequency that causes the influence of Warburg impedance. Stable measurement is possible by measuring at a high frequency. With respect to frequencies higher than the frequency causing the influence of Warburg impedance, in the above-described example, the frequency affected by the Warburg impedance is a value lower than 100 kHz.
  • the idea is that a signal having a higher frequency may be added.
  • the frequency of the measurement voltage is changed from 800 kHz to dielectric.
  • a voltage in a frequency range lower than the frequency for electrophoresis was applied.
  • the detection can be sufficiently stable at 800 kHz, so that measurement can be performed at a frequency slightly higher than 800 kHz.
  • it may be measured at a higher frequency, but since it cannot be separated from 3 MHz which is a frequency for dielectrophoresis in the present embodiment, up to about 2 MHz is realistic.
  • FIG. 14 is a flowchart for explaining the fine particle measurement method according to the present embodiment.
  • a series of flow from introduction of a sample to concentration, measurement, and result presentation of microorganisms in the cell 1 will be described.
  • a sample solution containing a microorganism to be measured is put into the cell 1 (step S121).
  • the control arithmetic unit 6 that senses that the sample liquid has been introduced by a user operation or liquid detection means (not shown) applies the frequency and amplitude of the measurement voltage stored in the memory 6 a in advance to the electrophoresis power supply unit 4.
  • the migration power supply unit 4 applies the instructed measurement voltage between the electrodes 11a and 11b (step S122).
  • the measurement unit 5 When the measurement voltage is applied, the measurement unit 5 immediately measures the current between the electrodes 11a and 11b in accordance with an instruction from the control calculation unit 6. The measurement result is transferred to the control calculation unit 6, impedance calculation is performed, and the result is stored in the memory 6a (step S123).
  • control calculation unit 6 determines whether or not the number of measurements (or measurement time) stored in the memory 6a in advance is satisfied (step S125).
  • the unit 4 is instructed to apply the migration voltage having the frequency and amplitude stored in the memory 6a in advance, and the migration power supply unit 4 applies the designated migration voltage between the electrodes 11a and 11b (step S124). .
  • the control calculation unit 6 instructs the migration power supply unit 4 to change the applied voltage to the measurement voltage, and the migration power supply unit 4 determines the voltage to be applied between the electrodes 11a and 11b from the migration voltage.
  • the measurement voltage is changed (step S122).
  • microorganisms are trapped between the electrodes 11a and 11b by applying an electrophoretic voltage, but no electrophoretic voltage is applied after switching to the measurement voltage. Since the measurement voltage is preferably a relatively low frequency of about several hundred kHz, it can be said that it is difficult to induce positive dielectrophoresis when the conductivity is high.
  • the microorganisms trapped by the electrophoresis voltage may be dispersed from the gap between the electrodes 11a and 11b by an external force such as a viscous force of the sample liquid or gravity sedimentation. Therefore, it is desirable that the measurement voltage be applied at a time as short as possible at least shorter than the application time of the electrophoretic voltage within the time that the measurement unit 5 can measure the current with necessary and sufficient accuracy. desirable. Thereby, the microorganisms trapped by the migration voltage when the measurement voltage is applied are retained without being dispersed from the electrode when the measurement voltage is applied, and it is possible to realize highly sensitive measurement.
  • step S125 If the predetermined number of times of measurement (or measurement time) is satisfied in step S125, the process proceeds to step S126 to end the measurement, and the control calculation unit 6 stops the voltage application.
  • the migration power supply unit 4 stops the voltage application.
  • the control calculation unit 6 calculates the microorganism concentration and displays the result in step S127, and completes the measurement operation. Details are the same as those in the above-described embodiment, and thus description thereof is omitted.
  • the microorganism measuring apparatus of the present embodiment traps microorganisms at a high frequency that is less affected by the solution conductivity and is advantageous for dielectrophoresis, and has a wide variation range of the absolute value
  • the measurement amount has been described as the impedance.
  • the measurement amount the current flowing through the electrode, the phase difference between the voltage and the current, the dielectric constant, the conductivity, or the electric current calculated from these. Physical characteristic values may be used.
  • fine particles are measured by measuring impedance, resistance component (conductance) and capacitance component (capacitance).
  • the control calculation unit 6 can also select the frequency of the electrophoresis voltage and the frequency of the measurement voltage based on the solution conductivity.
  • the dielectrophoretic force varies depending on the solution conductivity, and it is conceivable that the optimum frequency for impedance measurement varies depending on the conductivity. Accordingly, it is necessary to select optimum values for the frequency of the electrophoresis voltage and the measurement voltage depending on the solution conductivity.
  • the solution conductivity can be obtained from an impedance measurement result between the electrodes 11a and 11b. This is because the conductance, which is the reciprocal of the resistance component of the impedance, is a value reflecting the solution conductivity.
  • the impedance of the sample solution is measured to obtain the conductivity, and the optimum frequency of the electrophoresis voltage and the measurement voltage is selected.
  • the electrophoresis power supply unit 4 has described the microorganism measuring apparatus that sequentially applies the electrophoresis voltage and the measurement voltage. However, in the present embodiment, in the microorganism measuring apparatus described in the second embodiment, the electrophoresis is performed. A case where the power supply unit 4 applies the migration voltage and the measurement voltage simultaneously will be described. In the microorganism measuring apparatus (not shown) of the present embodiment, in the configuration shown in FIG. 5, the measuring unit 5 has a filter separation function described later.
  • the migration power supply unit 4 superimposes a high-frequency AC voltage near 1 MHz as the migration voltage and a low-frequency AC voltage around 10 kHz to 1 MHz as the measurement voltage between the pair of electrodes 11a and 11b. Apply.
  • the basis for setting these conditions is as in the second embodiment.
  • the measuring unit 5 can also filter the frequency component of the low frequency AC voltage in the vicinity of 10 KHz to 1 MHz and measure the impedance between the pair of electrodes 11a and 11b.
  • superposition means that an AC signal is generated by adding AC signals such as sine waves or rectangular waves of at least two different frequencies.
  • the filter separation function is a function for extracting only a specific frequency component from the AC signal.
  • the filter separation function can be realized by a known technique such as a passive filter constituted by an RC circuit or the like, a passive filter constituted by a passive element, an active filter constituted by an active element such as an operational amplifier, or a digital filter based on signal processing. is there.
  • the filter since it is necessary to separate a low-frequency measurement voltage signal from a signal mixed with a high-frequency migration voltage, the filter is configured as a low-pass filter.
  • a high frequency of 1 MHz or higher and a low frequency alternating voltage near 10 kHz are superimposed and applied, and the impedance is measured by filtering the frequency component of the low frequency alternating voltage near 10 kHz.
  • Trapping and impedance measurement can be performed at the same time, and only the measurement voltage is not applied, and impedance measurement can be performed while microorganisms are firmly trapped between the electrodes, realizing highly accurate and sensitive microorganism detection it can. That is, since trapping is performed at a high frequency and measurement is performed at a low frequency, it is possible to avoid the influence of conductivity and achieve both high sensitivity measurement. In addition, since measurement is performed at a low frequency, it is advantageous in design, and a simple circuit with low cost can be configured. Furthermore, measurement and trapping can be performed simultaneously by using high-frequency and low-frequency superimposed waves.
  • control calculation unit 6 may adjust the frequency of the voltage to be applied based on the solution conductivity, that is, at least one of the frequency of the migration voltage and the frequency of the measurement voltage. Is possible.
  • E. coli K-12 strain (NBRC3301, Product Evaluation Technology Infrastructure) that had been aerobically cultured at 37 ° C. for 16 hours on a standard agar medium (MB0010, Eiken Equipment Co., Ltd.) was collected with a conage rod.
  • a NaCl solution was appropriately added to the sample to prepare a sample solution conductivity.
  • the sample solution conductivity was measured with a conductivity meter (B-173, Horiba, Ltd.).
  • a conductivity meter B-173, Horiba, Ltd.
  • electrodes having a shape in which rectangles are nested as shown in FIG. 15 are used.
  • the electrode was covered with a transparent chamber and observed with a phase contrast microscope (IX70, Olympus).
  • FIG. 16 shows the state of the electrode gap 40 seconds after voltage application when the frequency of the electrophoresis voltage is (a) 100 kHz, (b) 800 kHz, and (c) 3 MHz.
  • the conductivity of the sample solution is 100 ⁇ S / cm.
  • the applied voltage is 10 Vp-p, and the alternating voltage is a sine wave.
  • Escherichia coli is trapped in the electric field concentration part between the electrode gaps (in the corner part of the electrode and in the white circle frame).
  • FIG. 17 shows the state of the electrode gap when the sample solution conductivity is 300 ⁇ S / cm and the frequency of the electrophoresis voltage is (a) 800 kHz and (b) 3 MHz.
  • the frequency was 3 MHz, more E. coli was trapped than 800 kHz, and when the conductivity increased, it was confirmed that 3 MHz was the most suitable condition.
  • FIG. 18 shows the state of the electrode gap when 3 MHz and 10 Vp-p are applied as the frequency of the electrophoresis voltage and 100 kHz is applied as the frequency of the measurement voltage.
  • the sample solution conductivity is 200 ⁇ S / cm.
  • (A) is a case where the amplitude of 100 kHz (frequency of the measurement voltage) is 3 Vp-p
  • (b) is a case where the amplitude of 100 kHz is 1 Vp-p. It can be seen that in the case of 3Vp-p where the amplitude of the low-frequency measurement voltage is high, the amount of E. coli trapped is smaller than that of 1Vp-p. Therefore, it was confirmed that the optimum amplitude of the measurement voltage was about 1 Vp-p.
  • FIG. 21 shows the state of the electrode gap when 3 MHz and 10 Vp-p are applied as the frequency of the electrophoretic voltage and (a) 100 kHz and (b) 800 kHz are superimposed and applied as the frequency of the measurement voltage.
  • the sample solution conductivity is 200 ⁇ S / cm. It can be seen that the amount of E. coli trapped at 800 kHz having a high frequency is larger than that at 100 kHz having a low measurement voltage frequency. Therefore, it was confirmed that the frequency of the measurement voltage is optimum at about 800 kHz.
  • FIG. 19 shows a graph in which the horizontal axis represents the E. coli concentration and the vertical axis represents the logarithmic value of the response value (capacitance slope) of DEPIM measurement.
  • (A) shows the case where the migration voltage and the measurement voltage are both 800 kHz
  • (b) shows the case where the migration voltage is 3 MHz and the measurement voltage is 800 kHz.
  • the conductivity of the sample solution is increased to 100 ⁇ S / cm
  • the dielectrophoretic force acting on the microorganism is decreased, and as a result, the response value of the DEPIM measurement is also decreased.
  • the electrophoretic voltage and the measurement voltage are set appropriately, even if the sample solution conductivity increases to 400 ⁇ S / cm, no response decrease is observed, and high-accuracy measurement can be performed. Indicated.
  • the present invention is useful as a fine particle measuring apparatus and a fine particle measuring method capable of making both a dielectrophoresis trap with high solution conductivity and high sensitivity and high precision impedance measurement compatible.

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Abstract

　検出対象である（本願における微粒子の定義に含まれる）微生物と共に血液や唾液が混在した試料液における微粒子測定において、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法を提供する。微粒子測定装置は、微粒子含有の液体を導入するセル１と、セル１内部に浸漬する少なくとも一対の電極１１ａ，１１ｂと、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に１ＭＨｚ付近の高周波数の交流電圧を印加し、微粒子に誘電泳動力を作用させる泳動電源部４と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧を印加し、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定する測定部５と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスの時間変化を演算し、セル１内の微粒子数を算出する制御演算部６とを備える。

Description

微粒子測定装置及び微粒子測定方法
　本発明は、誘電泳動を用いて試料液中の微粒子数を測定するための微粒子測定装置及び微粒子測定方法に関する。更に詳しくは、溶液導電率の影響を前処理なしに回避し、高感度、高精度に測定する微粒子測定装置及び微粒子測定方法に関する。
　昨今、食中毒や感染症などの原因となり、人体に何らかの害を及ぼす可能性がある微生物を、迅速、簡便、高感度に定量測定するニーズは特に高い。食品の製造工程や微生物検査施設を備えない診療所などにおいて、その場で微生物検査を実施することで、食中毒や感染症などの防止、予防が可能になるためである。
　また、いわゆるバイオセンサにおいて、抗体など、測定対象に特異的に結合する物質を標識したポリスチレンなどの人工微粒子を用いて、検体中の生化学的物質を定量測定する際に、検体中の微粒子数あるいはその結合状態を定量測定する必要がある。このように、昨今、液体中に含まれる微粒子を迅速、簡便、定量的に測定する要求は高い。
　ここで、本願における微粒子の定義について説明する。本願で言う微粒子とは、ポリスチレンやそれらに何らかのコーティングを施した粒子、カーボンナノチューブ、金コロイドなどの金属粒子、細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物、原生動物や原虫のうちの小型のもの、生物体の幼生、動植物細胞、精子、血球、核酸、蛋白質等も含む広い意味での生体又は生体由来の微粒子である。この他にも、本願で言う微粒子とは、誘電泳動可能な大きさのあらゆる粒子を意味する。本願では特に、微生物の測定を想定している。
　特に本願の検出対象は、ヒト又は動物の、血液及び唾液中に含まれる微生物、若しくは、ヒト又は動物の、血液や唾液が付着した粘膜等の表面から採取された微生物を想定する。ヒト又は動物の、血液や唾液中には、イオンが高濃度で含まれるため、測定溶液の導電率の上昇や変動を招き、誘電泳動を利用した検出方法の変動要因となる。
　従来、微生物の検査法として最も一般的に用いられるのは培養法である。培養法は、培地上に微生物検体を塗抹し、微生物が生育条件下で培養を行い、形成される培地上のコロニー数を計数することで微生物数を定量する方法である。
　しかし、コロニー形成までに通常１～２日、微生物種によっては数週間を要するため、迅速な検査を実施できない問題があった。また、濃縮や希釈、培地への塗抹などが必要なため、専門家による操作が必要であり、簡便な検査が実施できない、あるいは操作上のバラツキによる精度低下の問題があった。
　これら従来の問題を解決するため、本発明者は他の発明者らと共に、迅速、簡便、高感度な微生物数測定法として、誘電泳動とインピーダンス計測を組み合わせたＤＥＰＩＭ（Dielectrophoretic Impedance Measurement Method）法を提案した（例えば、特許文献１を参照）。
　ＤＥＰＩＭ法は、微生物を誘電泳動力によってマイクロ電極に捕集し、同時にマイクロ電極のインピーダンス変化を測定することによって試料液中の微生物数を定量測定する方法である。以下、その測定原理について概説する。
　微生物は一般に、イオンリッチで誘電率及び導電率の高い、細胞質及び細胞壁が、比較的誘電率及び導電率の低い、細胞膜に囲まれた構造を有し、誘電体粒子とみなすことができる。ＤＥＰＩＭ法では、電界中で分極した誘電体粒子に一定方向に働く力である誘電泳動力を利用し、誘電体粒子である微生物をマイクロ電極のギャップ間に捕集する。
　誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の（数１）で与えられることが公知である（例えば、非特許文献１を参照）。以下、誘電体粒子が、微生物である場合を例として説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　ここで、a：球形近似したときの微生物の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：試料液の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、▽は演算子で勾配（gradient）を表す。この場合、▽Ｅ２は、電界Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜を持っているか、つまり電界Ｅが空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、（数２）で表され、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、微生物は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電解集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、εｂ ＊及びεｍ ＊はそれぞれ、微生物及び溶液の複素比誘電率を表し、一般に複素比誘電率εｒ ＊は（数３）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　ここで、εｒ：微生物あるいは試料液の比誘電率、σ：微生物あるいは試料液の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。
　（数１）（数２）（数３）から、誘電泳動力は、微生物の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部（以下、Ｒｅ［Ｋ］と表す）及び電界強度に依存することが分かる。また、Ｒｅ［Ｋ］は、試料液及び微生物の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することが分かる。
　そのため、ＤＥＰＩＭ法では、これらのパラメータを適切に選択し、微生物に働く誘電泳動力を十分大きくし、微生物を電極ギャップに確実に捕集する必要がある。また、ＤＥＰＩＭ法では、上記誘電泳動による電極への微生物捕集と同時に、電気的計測を行い、試料液中の微生物数を定量測定することを特徴としている。
　微生物は、前述した構造を有するため、電気的には固有のインピーダンスを持った微粒子と考えることができる。そのため、誘電泳動によりマイクロ電極のギャップ間に捕集される微生物数が増加すると、その捕集数に応じて電極間のインピーダンスが変化する。
　従って、電極間インピーダンス時間変化の傾きは、単位時間当たりに電極ギャップ間に捕集される微生物数に応じた値となり、傾きの大きさは試料液中の微生物濃度に対応する。よって、電極間インピーダンス時間変化の傾きを測定することで、試料液中の微生物濃度、言い換えれば微生物数を測定することが可能となる。
　更に、ＤＥＰＩＭ法では、誘電泳動を開始直後のインピーダンス時間変化の傾きから微生物数を定量することで、短時間での微生物測定を実現している。以上、ＤＥＰＩＭ法の測定原理について概説したが、詳しくは非特許文献２を参照されたい。
　ところで、本願で測定に用いる試料液は、血液や唾液など、何らかの方法によって採取した微生物を、水を主成分とする低導電率の液体で懸濁したものを想定しているが、微生物を採取する際、微生物だけでなく周辺に含まれるイオンも同時に採取されると考えられる。この場合、試料液の誘電率は水とほぼ同じ値になり、結局、微生物に働く誘電泳動力は試料液のイオン濃度、言い換えれば、導電率に依存することになる。
　一般に、試料液導電率が高くなるほど誘電泳動力は小さくなる。そのため、従来のＤＥＰＩＭ法で上記のような試料液の測定を想定した場合、試料液導電率の高い試料では、微生物に働く誘電泳動力が低下しマイクロ電極に捕集される微生物数が少なくなる結果、測定感度が低下するという問題があった。更に、試料液導電率によって微生物に働く誘電泳動力が異なるため、異なる導電率の試料液を測定したときの測定結果バラツキが大きいという問題があった。
　誘電泳動を利用した微生物等の測定に際し、上記問題を解決するための手段として、測定前にイオン交換等により試料液導電率を低減する技術が公知である。この技術は、分析前に試料液をイオン交換カラムで処理を行い、試料液導電率を低減した後、誘電泳動により試料液中の微生物を分析する方法である（例えば、特許文献２を参照）。
　また、微生物の活性を測定する場合に、ほぼリアルタイムの迅速測定を行い、微生物活性を簡便且つ定量的に検出する微生物活性測定装置及びそのとき使用する微生物活性の測定方法が知られている。この方法は、微生物種類と試料液の導電率を入力し、活性を測定する最適な電圧（振幅と周波数）を表１のテーブルから選択するものである（例えば、特許文献３参照）。
　また、誘電泳動とインピーダンス計測を同時に行う際に、誘電泳動を誘起するための電圧とインピーダンス計測を行うための電圧及び周波数をそれぞれ独立して設定する測定方法が知られている。典型的には誘電泳動を行うための電圧は１２Vrms以上・１ｋＨｚ～５０MHｚ、インピーダンス計測を行うための電圧は０．８Vｒｍｓ・８００Hzとされている（非特許文献３参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
日本国特開２０００－１２５８４６号公報 日本国特表平１１－５０１２１０号公報 日本国特開２００３－０００２２４号公報
Hywel Morgan、他:「AC Electrokinetics:colloids and nanoparticles」、RESERCH STUDIES PRESS LTD.2003年出版、pp.15~63 J.Suehiro, R.Yatsunami, R.Hamada, M,Hara，J.Phys. D: Appl. Phys. 32(1999)2814-2820 DWE Allsopp et al,J.phys.D:Appl.Phys.32(1999)PP.1066-1074
　誘電泳動を利用した微生物の操作は一般に、試料液の導電率が上昇したときに正の誘電泳動力が小さくなり、微生物を電極ギャップにトラップすることが困難になるという課題を有している。この課題を解決するためには、試料液導電率の上昇に対して誘電泳動力の変化（低下）が小さい、１ＭＨｚ以上の比較的高い周波数で誘電泳動を行う必要がある。また、インピーダンス変化測定のために十分な大きさの誘電泳動力を誘起する必要があるため、印加電圧は大きくする必要があり、結果として電極に流れる電流が大きくなる。このように、周波数が高く、且つ、測定する電圧（電流）の振幅が大きい場合、スルーレートが高くなるため、アンプ回路など素子の性能の制限から、一般にインピーダンス測定は困難になり、測定精度が低下してしまう。このため、インピーダンス測定回路にとっては、インピーダンスを測定するための電圧の条件は、振幅が小さく、周波数が低い方が有利となる。すなわち、誘電泳動による微生物の電極へのトラップと、高精度なインピーダンス計測を両立するための手段が必要である。
　しかしながら、特許文献１には、平板電極間に周波数１ＭＨｚでピーク電圧１００Ｖの正弦波交流電圧を印加する例が記載され、この時印加する交流の周波数は誘電泳動が生じる周波数範囲であれば任意に選ぶことが可能とされているが、周波数選択により溶液導電率の影響を回避すること、及び高精度なインピーダンス測定を両立するための手段に関する示唆はない。
　また、特許文献２に記載の技術によれば、誘電泳動による分析を行う前にイオン交換という前処理が必要であるため、微生物測定の簡便性が損なわれるし、測定全体にかかる時間も長くなるという問題があった。さらに、イオン交換処理後の試料液導電率は、イオン交換処理前の試料液導電率に依存するため、試料毎の導電率バラツキによって、ＤＥＰＩＭ法など、誘電泳動を用いた微生物測定の結果にバラツキを生じるという問題を解決できない。
　また、特許文献３の微生物活性測定装置は、微生物種類と試料液の導電率を入力し、活性を測定する最適な電圧（振幅と周波数）をテーブルから選択するものであり、活性状態によって誘電泳動力に差が生じる周波数を選択するものである。
　また、非特許文献３に記載の技術によれば、誘電泳動とインピーダンス計測それぞれを行うための電圧条件を個別に選択することができるため、試料液の導電率上昇に対して誘電泳動力の変化が小さい１ＭＨｚ以上の高周波で誘電泳動を行うことができるが、インピーダンス計測を行う低周波においてワールブルグインピーダンスの影響が顕著になり、正しいインピーダンス計測ができず、測定結果の正確さを著しく損なう場合があるという課題を有していた。
　上述したワールブルグインピーダンスの影響を具体的に示す例として、非特許文献３に記載の技術において、一方のセルに含まれるサンプルの導電率、及び他方のセルに含まれる測定対象の導電率を精度よく一致させた上でインピーダンス計測をしないと、電極の分極（electrode polarization）の寄与度が大きくなり、正しいインピーダンス測定が測定結果の正確さを著しく損なう場合がある。
　特に、上述のように、本願における微粒子の定義に含まれ、且つ検出対象である微生物と共に、血液や唾液が混在した試料液では、検体を採取するヒト又は動物、若しくはその検体を採取する時間が異なると、導電率が大きく変化してしまう。そのため、非特許文献３に記載の技術において、検出対象である微生物と共に、血液や唾液が混在した試料液を測定する場合、一方のセルに含まれるサンプルの導電率と、他方のセルに含まれる測定対象の導電率を精度よく一致させる必要があるが、これは困難である。したがって、正しいインピーダンス測定ができず、測定結果の正確さを著しく損なう。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒト又は動物の、血液又は唾液中に含まれる微生物、若しくは、血液又は唾液が付着した粘膜などの表面から採取された微生物を検出対象とし、測定する試料液の溶液導電率が高く、且つ検体毎に変動する場合、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法を提供することを目的としている。
　本発明者らは、微粒子のなかでも特に、細菌を誘電泳動する際に、溶液導電率の影響を回避可能な周波数領域があり、それとは別に、高精度なインピーダンス計測に適した周波数領域及び振幅があることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき達成されたものである。
　本発明に係る微粒子測定装置は、血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する液体を導入するセルと、前記セル内部に浸漬する少なくとも一対の電極と、前記一対の電極間に交流電圧を印加する泳動電源部と、前記一対の電極間のインピーダンスを測定する測定部と、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出する制御演算部と、を備え、前記制御演算部は、前記微粒子に誘電泳動を誘起するための第１の周波数の交流電圧、及び前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧、を前記一対の電極間に印加するよう、前記泳動電源部に指示する。
　この構成によれば、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第１の周波数の交流電圧が、第１の振幅を有し、前記第２の周波数の交流電圧が、第２の振幅を有するものである。
　この構成によれば、第１の周波数の交流電圧は第１の振幅を有し、第２の周波数の交流電圧は第２の振幅を有するので、誘電泳動とインピーダンス計測のそれぞれに適切な電圧を印加することができる。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の振幅が、前記第１の振幅より小さいものである。
　この構成によれば、インピーダンスを測定するための第２の周波数の交流電圧が、誘導泳動に影響を及ぼすことを防ぐ効果がある。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数の少なくともいずれかを調整するものである。
　この構成によれば、溶液導電率に基づいて第１の周波数及び第２の周波数を調整するので、溶液導電率が変動した場合でも、適切な周波数で誘電泳動及びインピーダンス計測を行うことができる。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第１の周波数と前記第２の周波数を逐次切り替えるものである。
　この構成によれば、第１の周波数と第２の周波数を逐次切り替えるので、誘電泳動及びインピーダンス計測を迅速に行うことができ、それぞれに最適な条件を選択することができる。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の周波数の交流電圧を印加する時間が、第１の周波数の交流電圧を印加する時間より短いものである。
　この構成によれば、インピーダンス測定を行う第２の周波数の電圧を印加中に、誘電泳動力が喪失することによって電極から微粒子が飛散することなく、確実に微粒子を電極にトラップすることができるため、高感度な測定を実現できる。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の周波数が、８００ｋＨｚより高く、前記第１の周波数よりも低いものである。
　この構成によれば、高周波で微粒子をトラップし低周波でインピーダンスを計測するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、低周波数でインピーダンス計測を行うことによる高感度及び高精度なインピーダンス計測とを両立させることができる。
　また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記泳動電源部が、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離するフィルタ分離手段を備え、前記測定部が、フィルタ分離された前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分に対応する前記一対の電極間のインピーダンスを測定するものである。
　この構成によれば、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極間のインピーダンスを測定するので、計測回路の設計を簡素化して低コスト化することができるとともに、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加することにより、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができるため、第１の周波数から第２の周波数に切替を行った際に微粒子に働く誘電泳動力が低下して電極ギャップから微粒子が離れることを防ぐことができ、高精度・高感度の測定を行うことが出来る。
　また、本発明に係る微粒子測定方法は、血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する試料液に浸漬した一対の電極間に交流電界を印加し、誘電泳動力により前記微粒子を所定位置に配置し、前記試料液中における前記微粒子の数を測定する微粒子測定方法であって、前記一対の電極間に第１の周波数の交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させるステップと、前記一対の電極間に、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧を前記一対の電極間に印加し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出するステップと、を有する。
　この構成によれば、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
　また、本発明に係る微粒子測定方法は、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数を選択するステップを有する。
　この構成によれば、溶液導電率に基づいて第１の周波数及び第２の周波数を選択するので、溶液導電率が変動した場合でも、適切な周波数で誘電泳動及びインピーダンス計測を行うことができる。
　また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧、及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加するステップと、前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち、前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、を有する。
　この構成によれば、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極間のインピーダンスを測定するので、計測回路の設計を簡素化して低コスト化することができるとともに、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加することにより、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができる。
　本発明によれば、血液や唾液など、本願における微粒子の定義に含まれる微生物を測定対象とした微粒子測定において、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（１） 本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置の電極チップを説明するための概略図 本発明の実施形態において測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す図 図４（ａ）、（ｂ）は電極１１ａ、１１ｂの対向するエッジ部に微粒子１４が電気力線に沿ってトラップされる説明図 本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（２） 本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（３） 図７（ａ）、（ｂ）は誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合に、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ 誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ 本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート 誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合における、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ 溶液内の微粒子数をパラメータにした場合における、インピーダンス測定用交流電圧の周波数と溶液のインピーダンスの関係を示すグラフ 溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、泳動電圧の周波数（Ｈｚ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ 本発明の実施例における、周波数を掃引して測定した場合の電極インピーダンスの実部（横軸）と虚部（縦軸）の関係を示す図 本発明の第２の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート 本発明の実施例における電極を示す図 本発明の実施例における、泳動電圧の周波数を、（ａ）は１００ｋＨｚ、（ｂ）は８００ｋＨｚ、（ｃ）は３ＭＨｚとしたときの、電圧印加４０秒後の電極ギャップの様子を示す図 本発明の実施例における、試料液導電率を３００μＳ／ｃｍとし、泳動電圧の周波数を（ａ）は８００ｋＨｚ、（ｂ）は３ＭＨｚとしたときの電極ギャップの様子を示す図 図１８（ａ）、（ｂ）は本発明の実施例における、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ－ｐを印加し、測定電圧の周波数として１００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子を示す図 図１９（ａ）、（ｂ）は本発明の実施例における、大腸菌濃度とＤＥＰＩＭ測定の応答値（キャパシタンスの傾き）を対数表示したグラフを示す図 本発明の実施例における、溶液の導電率が２４０μＳ／ｃｍのときの電極インピーダンスのコールコールプロット 本発明の実施例における、測定電圧の周波数として（ａ）は１００ｋＨｚ、（ｂ）は８００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子を示す図
（第１の実施形態）
　以下、本発明の実施の形態の微生物測定装置について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態の微生物測定装置の構成図、図２は、本実施形態の微生物測定装置の電極チップを表す概略図である。
　図１において、１は測定対象の微生物が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微生物を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は誘電泳動によってトラップされた微生物によって生じた光学的あるいは電気的な変化を測定する測定部、６は微生物測定装置全体の制御や測定結果の解析演算や入出力処理などを行う制御演算部、７は試料液２の導電率を入力するための導電率入力手段である。
　図２において、１０は基板、１１ａ、１１ｂは基板１０上に形成され一対の極をなす電極、１３は電極１１ａと１１ｂとの電極間ギャップである。基板１０には、金属などの導電性材料によって電極１１ａ、１１ｂのパターンが形成される。好ましい材料の一例としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金など、十分な導電性を有することが望ましく、本実施の形態では銀を使用している。
　図３は、測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す。本実施の形態では測定電極１１ａ，１１ｂ間のギャップ１３付近の構成が電界集中部にあたり、中でも最も電界が集中するのはギャップ１３である。従ってギャップ１３部分にもっとも強く微生物が泳動される。
　電極１１ａ、１１ｂはその幅に対して十分に薄い薄膜であることが望ましく、例えば１００μmの幅に対して厚さ１０００Å程度である。これにより、厚さ方向で見たエッジ部分に不平等電界が形成され、微生物を効率的に誘電泳動することが可能となる。
　電極１１ａ、１１ｂのパターニングを行う方法は、選択した材料で所望のパターンを形成できれば良い。例えば、金属薄膜をスパッタあるいは蒸着、めっきなどにより形成し、フォトリソグラフィー、レーザー加工などによってパターンを形成する方法、印刷などの、直接パターンを形成する方法など、電極を形成するために用いられる一般的なプロセスが選択可能である。生産性やコストなどを勘案して最も適切なプロセスを選択すればよい。本実施の形態では、スパッタによって銀の薄膜を形成し、フォトリソグラフィーによってパターンを形成している。
　電極１１ａ、１１ｂはそれぞれ泳動電源部４に接続されており、泳動電源部４は電極１１ａ、１１ｂ間に特定周波数の交流電圧を印加する。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであり、且つ両方向の電流の平均値が等しいものである。後述するが、泳動電源部４が印加する周波数は、制御演算部６によって適切に決定される。
　電極チップ３が試料液２中に浸漬され、電極１１ａ、１１ｂが試料液２に接した状態で、電極１１ａ、１１ｂ間に交流電圧が印加されると、試料液２中に含まれる微生物が、電極１１ａと１１ｂに挟まれたギャップ１３に、誘電泳動力によって捕捉される。
　微粒子１４に正の誘電泳動力が働く場合は図４（ａ）のように電界集中部であるギャップ１３の領域中、電極１１ａ、１１ｂの対向するエッジ部に、微粒子１４が電気力線に沿ってパールチェーンと呼ばれる数珠状にトラップされる。
　一方、微粒子１４に負の誘電泳動が働く場合は、図４（ｂ）のように、電界集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部であるギャップ１３の領域中、電極１１ａ、１１ｂの対向する中心部分にかけてトラップされる。
　測定部５は、このようにしてギャップ１３にトラップされた微生物によるインピーダンス変化を測定する。具体的には、図５に示すように、泳動電源部４と電極チップ３の間に、測定部５を電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定する回路を構成する。
　この場合、測定部５は電極１１ａ、１１ｂ間に流れる電流値と、泳動電源部４が印加した電圧と電流の位相差を測定するための回路等から構成される。測定部５は、誘電泳動によって微生物が移動し電界集中部近傍に濃縮されることに起因する電極１１ａ、１１ｂ間の電流及び位相差の変化を測定する。尚、ここで行う電流値の測定は、電極に直列に検出抵抗を配置し、その電圧降下から電流値に変換したり、一般的なオペアンプを用いた電流―電圧変換回路など、公知の方法が利用可能である。
　測定部５で測定した電流値と位相差は、制御演算部６に渡される。制御演算部６は、これら電流、位相差、及び、泳動電源部４が印加している電圧及び周波数の情報から、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス値を計算する。
　電圧印加前、電極１１ａ、１１ｂ間の試料液２のみで満たされた領域が、誘電泳動によるトラップによって誘電率の異なる微生物で置き換えられることで、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスはトラップされた微生物数に応じて変化する。
　従って、ある時間におけるインピーダンス値と、電圧印加直後の初期インピーダンス値との差分、言い換えれば変化分から、ギャップ１３にトラップされた微生物数を推定することが可能である。そして、トラップされた微生物数は試料液中に含まれる微生物濃度に依存するものであるから、試料液中の微生物数を測定することが可能になる。
　測定部５はまた、図６に示すように、光学的測定手段によっても実現可能である。この場合、光源２１と受光部２２の光路内にギャップ１３が含まれるような位置関係にセル１を配置する。ギャップ１３にトラップされた微生物数によって、受光部２２に入射する光量が変化することを利用して、ギャップ１３にトラップされた微生物数を推定することができる。
　あるいは、受光部２２の情報を制御演算部６に渡して画像化し、制御演算部６が粒子判定アルゴリズムなどを用いて直接粒子数を計数してもよいし、視野面積に対する微粒子面積を求めることで微粒子数に換算してもよい。このようにして得られたギャップ１３にトラップされた微生物数は試料液中に含まれる微生物濃度に依存するものであるから、試料液中の微生物数を測定することが可能になる。
　以上のように微生物をギャップ１３にトラップするためには、微生物に働く粘性力や重力、ブラウン運動など、誘電泳動以外の全ての外力に対して十分大きな誘電泳動力を誘起する必要がある。これが不十分であれば、測定部５が測定できる微生物数が減少するため、測定感度及び精度が著しく低下し、測定部５が測定可能な信号の大きさを下回ると微生物の測定が出来なくなる。
　従って、本実施の形態では、微生物をギャップ１３にトラップするために十分な誘電泳動力が働くような周波数を、制御演算部６が適切に決定し、決定した周波数の電圧を泳動電源部４が印加する。これにより、測定部５が十分に検出可能な信号を取り出すことが出来るため、微生物濃度の測定が高精度且つ高感度に行える。
　制御演算部６は、図示しないＣＰＵや、一連の動作を規定するプログラムや各種データが格納されたメモリ６ａなどの回路から構成され、一連の測定動作を制御する。導電率入力手段７は、試料液の導電率を、測定前に入力できるようになっている。例えば、テンキーで数値入力する方法や、「０～５０μＳ／ｃｍ」、「５０～１００μＳ／ｃｍ」など複数の導電率範囲に対応したスイッチを押下するなどの方法で実現できる。
　メモリ６ａは、導電率入力手段７から与えられた試料液の導電率の値から、泳動電源部４が印加する電圧の適切な周波数を選択するための周波数選択テーブルを有する。周波数選択テーブルには、試料液２の導電率毎に、微生物に十分な誘電泳動力が働く最適な周波数と印加電圧値がテーブル化されている。
　ここで、メモリ６ａに格納されている周波数選択テーブルについて詳説する。表２に示すように、周波数選択テーブルは少なくとも、試料液の導電率、印加する交流電圧の振幅、最適周波数が互いに関連付けられて格納されている。試料液の導電率は特定の数値であってもよいし、ある範囲を設定してテーブルを作成してもよい。制御演算部６は、与えられた導電率に該当する交流電圧の振幅と最適周波数を選択する。尚、導電率３００μS／ｃｍ～に対応する周波数の“Ｅ”は、エラーであることを示しており、あまりにも導電率が高い場合には測定が出来ないことを表している。尚、表２に挙げた数値はあくまでも一例であり、実際には測定対象や導電率、電極設計によって最適な値とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、最適周波数について説明する。（数１）において、誘電泳動力ＦＤＥＰは、クラウジウス・モソッティ数Ｋの実部、すなわちＲｅ［Ｋ］に比例する。そして、Ｒｅ［Ｋ］は、（数２）及び（数３）から明らかなように、試料液２の導電率に依存する。試料液２の導電率が変化した場合、Ｒｅ［Ｋ］すなわち誘電泳動力がどのように変化するかを示したものが図７である。
　図７においては、誘電泳動に用いる電界、言い換えれば印加電圧の周波数をパラメータに、試料液２の導電率の関数として示している。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応しており、その正負は誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
　図７（ａ）に示すように、たとえば、誘電泳動用交流電圧の周波数が（１）１０ｋＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
　一方、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
　なお、図７（ｂ）は、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚ及び（３）８００ｋＨｚの場合に、溶液導電率を１μＳ／ｃｍ～１０００μＳ／ｃｍまで変化させた場合の誘電泳動力ＦＤＥＰの変化を示す。周波数が（２）１００ＫＨｚの場合、約２０μＳ／ｃｍ以上でＲｅ［Ｋ］＜０となるが、８００ＫＨｚでは導電率上昇に対する誘電泳動力の低下が抑えられ、約２５０μＳ／ｃｍまでＲｅ［Ｋ］＞０となり引力によりギャップ１３のエッジ部にトラップすることができる。
　このことは、試料液の導電率上昇に対して最も誘電泳動力の低下が小さくなる最適な周波数が存在することを示している。この最適周波数を決定するには、次のような実験を行って決定するのがよい。すなわち、同じ微粒子濃度で、導電率を変えた複数の試料液を用意し、それぞれの試料液に対して印加電圧の周波数を変えながら測定を行う。その結果、測定応答が最も大きくなった周波数が、それぞれの試料液導電率に対する最適周波数となる。表２に示した最適周波数は、このようにして決定する。
　しかしながら、あまりにも周波数が高いと測定回路の実現が困難となり、あまりにも周波数が低いとジュール熱による対流や、極端な場合、電気分解による気泡発生が測定に悪影響をもたらす。このため、最適周波数は、誘電泳動にとって最適とはいえないが、微粒子測定を行うのに十分な誘電泳動を働かせることの出来る、許容範囲の周波数が存在する。
　図８は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。試料液の導電率１００μＳ／ｃｍにおいて、正の誘電泳動を利用して微粒子の測定を行う場合、測定応答を得られる十分な誘電泳動力がＲｅ［Ｋ］＞０．４であるため、最適周波数は約７００ｋＨｚ～４ＭＨｚとなる。この場合、高周波による測定回路の複雑化を避けるために、下限の周波数である７００ｋＨｚを最適周波数として採用することも可能である。
　また、測定する必要がある試料液導電率の範囲内で、ある特定の一つの周波数で十分に誘電泳動力が得られることがある。その場合は、表３に示すような周波数選択テーブルになる。
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　例えば、測定する必要のある試料液導電率の範囲が０～１００μＳ／ｃｍであった場合、周波数８００ｋＨｚであれば、全ての導電率領域に対してＲｅ［Ｋ］＞０．４となり、単一の周波数で所望の試料液導電率の範囲で測定を行うことができるため、回路構成が簡易となり好都合である。この場合、試料液導電率が１００μＳ／ｃｍを超えた場合には、周波数選択テーブルに示されるよう、エラーに該当するデータが書き込まれている。
　図９は、本実施形態にかかる微生物測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微生物の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。まず、初期状態では、セル１に測定対象の微生物が含有された試料液を投入する（ステップＳ１１）。
　次に、導電率入力手段７によって、投入した試料液の導電率を入力する。入力された導電率は、制御演算部６に渡される（ステップＳ１２）。
　試料液の導電率を渡された制御演算部６は、メモリ６ａに備わる最適周波数テーブルを参照し、電極に印加すべき電圧振幅値及び周波数を選択する（ステップＳ１３）。この時の電圧振幅値（以下、「誘電泳動のための電圧」と呼ぶ）は、微生物をギャップ１３にトラップするために十分な値を選択すればよく、本実施の形態では１０Ｖｐ－ｐとしている。
　また、表２及び表３では、誘電泳動のための電圧は導電率に対して一定の値としているが、それぞれの導電率で最適な値を選択することができる。例えば、導電率が高い場合は、あまりに電圧が高すぎるとジュール熱が発生し、誘電泳動による微生物トラップに影響が出るため、導電率が高くなるに従い、誘電泳動のための電圧を低くする、などとする。
　次いで、制御演算部６は、メモリ上に保存された、入力された導電率に対応する周波数がエラーコード（Ｅ）であるか判断する（ステップＳ１４）。エラーコード（Ｅ）であった場合には、ステップＳ１６に進み、制御演算部６は、入力された導電率が測定範囲外であることを表示手段９に表示するよう指示し、測定を終了する（ステップＳ２２）。
　ステップＳ１４において、選択した周波数がエラーコード（Ｅ）でなかった場合、制御演算部６は泳動電源部４に対し、最適周波数テーブルで選択した電圧振幅及び周波数にて、電極１１ａ、１１ｂ間に電圧を印加させる（ステップＳ１５）。
　電極１１ａ、１１ｂ間に所定の電圧が印加されると、測定部５は直ちに電圧印加直後の初期状態のデータとして、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、測定結果は制御演算部６に渡され、メモリ６ａに初期のインピーダンス値として保存する（ステップＳ１７）。
　ここでは、インピーダンス測定を例として記載するが、測定部５が光学的な手段を用いてギャップ１３の状態を測定するのであれば、電圧を印加しなくても初期状態が測定できるので、ステップＳ１７はステップＳ１５の前に行うことも可能である。
　次に、制御演算部６は、図示しない時計手段によって所定の時間が経過するまで待つ。この時、泳動電源部４は電圧印加を保持したままである（ステップＳ１８）。
　所定の時間が経過すると、制御演算部６は所定の測定回数が満了したかを判断し（ステップＳ１９）、満了していなければステップＳ１７に戻る。ステップＳ１７に戻り、制御演算部６は測定部５に命じ、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、その結果をメモリ６ａに所定時間経過後の結果として保存する。
　所定の測定回数が満了した場合、制御演算部６は泳動電源部４に電圧印加を止めるよう指示する（ステップＳ２０）。
　電圧印加を停止後、制御演算部６は、メモリ６ａに保存された、電極１１ａ、１１ｂ間インピーダンスの経時変化データから、試料液２中の微粒子濃度を算出し、表示手段９に結果を表示させ（ステップＳ２１）、一連の測定動作を終了する（ステップＳ２２）。
　微生物濃度の算出は、メモリ６ａに予め保存された、検量線から求めることができる。この検量線は、微生物濃度が明らかな校正用試料を、本実施の形態で説明した微生物測定装置の測定系を用いて予め測定し、その時の微生物数とインピーダンス変化の相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあらわす関数を使用する。
　この変換式を制御演算部６のメモリ６ａに記憶させ、微生物濃度が未知の試料を測定する場合には、所定時間内におけるインピーダンス変化の値を代入することにより、セル１内の微生物濃度を算出できる。なお、換算テーブルを用いる場合は、変換式による演算結果を予めメモリさせている。
　以上、本実施の形態によれば、試料液の導電率に応じて、最適な印加電界周波数を選択することにより、測定を行うために十分な誘電泳動力を微生物に働かせることができるため、試料液の導電率が上昇しても、前処理無く、微生物の測定を行うことができる。
（第２の実施形態）
　次に、本発明の第２の実施形態にかかる微生物測定装置について図面を参照しながら説明する。本実施形態の微生物測定装置の基本構成は、第１の実施形態とほぼ同様であるため、図５及び図２を参照して説明する。
　本実施形態の微生物測定装置は、微生物含有の液体を導入するセル１と、セル１内部に浸漬する少なくとも一対の電極１１ａ，１１ｂと、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に微粒子に誘電泳動を誘起するための交流電圧（以下、泳動電圧と呼ぶ）及び、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定するための交流電圧（以下、測定電圧と呼ぶ）の少なくともいずれかを印加する泳動電源部４と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定する測定部５と、泳動電源部４に対し、印加する電圧の周波数及び振幅が、適切な値になるよう指示命令を行う機能と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスの時間変化を演算し、セル１内の微生物数を算出する機能を有する制御演算部６とを備える。後述するが、泳動電圧は数ＭＨｚ付近の比較的高周波を、測定電圧は数百ｋＨｚ付近の比較的低周波を用いるのが適当である。
　図１０は、泳動電圧の周波数をパラメータとした場合における、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応している。Ｒｅ［Ｋ］の正負は、誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
　同図に示すように、たとえば、泳動電圧の周波数が（１）１０ｋＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微生物に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
　一方、泳動電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微生物に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
　さらに泳動電圧の周波数を、（３）８００ｋＨｚ、（４）１ＭＨｚと高めると、溶液導電率が高くなっても微生物に作用する正の誘電泳動力ＦＤＥＰが維持される。このように、泳動電圧の周波数は高い方が溶液導電率の影響が軽微であり、微生物を効率良くトラップするために、泳動電圧の周波数を高くする方が有利であることが分かる。
　図１２は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、泳動電圧の周波数（Ｈｚ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフである。ここで、試料液の導電率は２０μS／ｃｍ以上である可能性が高い。試料液の導電率が２０μS／ｃｍの場合、泳動電圧の周波数は、約５０ｋHｚ以上で誘電泳動力ＦＤＥＰが斥力から引力に変化する。従って、泳動電圧の周波数は最低５０ｋＨｚ以上である必要がある。一方、泳動電圧の周波数が高すぎると、溶液導電率に関わらずＲｅ［Ｋ］は低下し、５０ＭＨｚで誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。このため、泳動電圧の周波数は、５０ｋＨｚ～５０ＭＨｚの間が望ましい。
　試料液の導電率は、場合によっては１００μS／ｃｍ以上のものが想定される。よって、この試料液も測定可能とするためには、７００ｋＨｚ～１５ＭＨｚとするとＲｅ［Ｋ］が０．５以上となるため、微生物に十分な誘電泳動力を誘起することが出来るため、最も望ましい。
　本実施の形態では、泳動電圧の周波数を３ＭＨｚ、振幅は、微生物をギャップ１３にトラップするために十分な値を選択すればよく、１０Vｐ－ｐとしている。
　一方、図１１は、溶液内の微生物数をパラメータとした場合に、測定電圧の周波数と溶液のインピーダンスの関係を示すグラフである。同図に示すように、微生物数が（１）３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～（５）３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに対して、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜の変化幅は、測定電圧の周波数が１０ｋＨｚ付近（矢印Ｃ）で最大（約２０ＫΩ～１５０ＫΩ）となる。このため、１０ｋＨｚ前後が、インピーダンス測定にとって最も最適な周波数であると言える。
　一般的に、周波数が高くなるほどインピーダンス計測の精度を保つのは難しくなり、泳動電圧の周波数として最適な、１～１０ＭＨｚ程度の比較的高周波の領域においてインピーダンス測定を行おうとすると、測定回路の複雑化を招き、高精度のインピーダンス測定回路の実現が困難である。このため、測定電圧の周波数を１０ｋＨｚ～１ＭＨｚ程度の比較的低周波領域としてインピーダンス測定を行う。本実施の形態では、誘電泳動とインピーダンス計測に別の周波数を個別に選択できるため、誘電泳動とインピーダンス計測それぞれに最適な条件を、簡易な測定回路で、且つ高精度なインピーダンス計測を実現できるという効果がある。
　ところで、測定電圧として最も適した周波数１０ｋＨｚ付近は、溶液導電率が約３μS／ｃｍ以上となると負の誘電泳動の領域となり、泳動電圧による誘電泳動を阻害するため、電極１１ａ，１１ｂ間に微生物をトラップするためには望ましくない。このため、周波数はインピーダンス測定精度が許す範囲内で高くし、且つ、泳動電圧に比較して振幅を小さくすることが望ましく、測定電圧の周波数は、測定試料液の導電率において負の誘電泳動が生じない周波数であることが最も好ましい。
　更に、インピーダンス計測に最適な周波数を選択する際、電極と試料液界面における拡散の影響に起因する、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数領域でインピーダンス計測を行うと、正確なインピーダンスが計測できないという問題がある。図１３は、周波数を掃引して測定した、電極インピーダンスの実部（横軸）と虚部（縦軸）の関係を示す図（コールコールプロットと呼ぶ）である。
　図１３において、（１）における周波数（Fｌと呼ぶ）を境界に、高周波側は半円上の軌跡（（１）よりも左側）となり、電極系の等価回路が抵抗と容量の単純なモデルで記述される。一方、Fｌよりも低周波側（（１）よりも右側）はワールブルグインピーダンスの影響を生じ、コールコールプロットが半円から外れる領域となる。本発明においてはFｌの周波数を境界周波数と呼ぶ。プロットが半円から外れた領域のインピーダンスは、抵抗と容量の並列回路からなる単純な等価回路モデルとは異なり、電極と溶液間の電子授受に関わる物質の拡散係数など複雑となるため、電極に微生物がトラップされたことによるインピーダンス変化を正確に算出することができない。このため、ＤＥＰＩＭ法の測定を行うためには、ワールブルグインピーダンスの影響が生じないFｌ以上の周波数領域でインピーダンス測定を行う必要がある。測定電圧の周波数を決定するには、実際の電極系と想定している導電率の溶液（細菌は含まない）でコールコールプロットを測定すればよい。
　また、インピーダンス計測回路の観点から、不要な電流が流れることによる計測誤差を防ぐため、測定電圧の周波数におけるインピーダンスの大きさは可能な限り大きい方が望ましい。従って、測定電圧の周波数は、コールコールプロット半円の頂点（図１３における（２）の点、Ｆｈと呼ぶ）までの周波数を選択することが望ましい。
　測定結果から求められたFｌ以上、Ｆｈ以下の周波数で、所望の測定精度が確保できる周波数を測定電圧の周波数と決めることができる。本実施の形態では、測定電圧の周波数を８００ｋHｚとしている。
　すなわち、本実施の形態において、測定対象物は、血液又は唾液中に含まれる微粒子、具体的には細菌を測定するものである。血液又は唾液は、測定対象のヒト又は動物によって、若しくは、その検体採取時間によって、導電率がばらつくものである。従って、電極に細菌がトラップされたことによるインピーダンス変化のみを検出するために、一方のセルに測定対象の細菌を含む溶液を、他方のセルに測定対象の溶液と同じ導電率をもち、且つ、測定対象の細菌を含まない溶液を導入し、細菌がトラップされたこと以外によるインピーダンス変化分をキャンセルすることは、工業的なものにおいては、２つのセルに投入する液体の導電率を合わせることが可能のため、有効と考えられる。しかし、ヒト又は動物の血液又は唾液を測定するものにおいては、この２セルタイプを活用できない。何故なら、前述のごとく、検体の導電率は被験者あるいは採取時間によって導電率が大きく変わってしまうため、同じ導電度の溶液を検体毎に準備するのは極めて困難であり、場合によっては不可能である。このようなことを考慮し、検体を採取するヒト又は動物、若しくは検体採取時間が異なっても、安定に測定できることを想定し、鋭意検討した結果、上述のごとくワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数で計測することで、安定な測定が可能となる。ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数について、上述した例では、ワールブルグインピーダンスの影響を受ける周波数は１００ｋＨｚより低い値であったので、これより高い周波数の信号を加えればよいという発想になる。しかし、上述のごとくヒト又は動物は、それぞれのヒト又は動物、更には、検体採取時間によって大きくその導電率が変わるため、これらのことを考慮し、本実施形態では測定電圧の周波数を８００ｋＨｚから誘電泳動のための周波数よりも低い周波数範囲の電圧を加えることとした。その中でも、本実施形態では、８００ｋＨｚで十分その検出に安定性を持たせることが出来たので、８００ｋＨｚより少しでも高い周波数で測定が可能である。もちろん、より高い周波数で測定しても構わないが、本実施の形態における誘電泳動のための周波数である３ＭＨｚと分離できなくなるため、２ＭＨｚ程度までが現実的であった。
　図１４は、本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微生物の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。
　まず、初期状態では、セル１に測定対象の微生物が含有された試料液を投入する（ステップＳ１２１）。試料液が投入されたことを、ユーザの操作あるいは図示しない液検知手段によって感知した制御演算部６は、泳動電源部４に対し、予めメモリ６ａに記憶された測定電圧の周波数、及び振幅を印加するよう指示し、泳動電源部４は、指示された測定電圧を電極１１ａ，１１ｂ間に印加する（ステップＳ１２２）。
　測定電圧が印加されると、制御演算部６の指示により、即座に測定部５は電極１１ａ，１１ｂ間の電流測定を行う。測定結果は、制御演算部６に渡され、インピーダンス演算が行われ、メモリ６ａに記憶される（ステップＳ１２３）。
　インピーダンス測定を終えると、制御演算部６は、予めメモリ６ａに記憶された測定回数（あるいは測定時間）を満たしているか判断し（ステップＳ１２５）、満たしていない場合、制御演算部６は、泳動電源部４に対し、予めメモリ６ａに記憶された周波数、及び振幅の泳動電圧を印加するよう指示し、泳動電源部４は、指示された泳動電圧を電極１１ａ，１１ｂ間に印加する（ステップＳ１２４）。
　所定の時間が経過すると、制御演算部６は、泳動電源部４に対し、印加電圧を測定電圧に変更するよう指示し、泳動電源部４は電極１１ａ，１１ｂ間へ印加する電圧を泳動電圧から測定電圧に変更する（ステップＳ１２２）。このとき、電極１１ａ，１１ｂ間には、泳動電圧の印加によって微生物がトラップされているが、測定電圧に切り替えた後は泳動電圧は印加されていない。測定電圧は数百ｋＨｚ程度の比較的低周波が望ましいため、導電率が高い状態では正の誘電泳動を誘起しにくい条件と言える。このため、測定電圧を印加する時間が長ければ、泳動電圧によってトラップした微生物が試料液の粘性力や重力沈降などの外力によって電極１１ａ，１１ｂ間のギャップから分散してしまう可能性がある。よって、測定電圧は、測定部５が必要十分な精度で電流を測定できる時間内で、少なくとも泳動電圧の印加時間より短く、可能な限り短時間の印加とするほうが望ましく、１０ｍｓ～１００ｍｓ程度が最も望ましい。これにより、測定電圧印加時に泳動電圧によってトラップされた微生物が、測定電圧印加時に電極から分散することなく保持され、高感度な測定を実現できるという効果がある。
　以下、同様のステップを繰り返し、ステップＳ１２５で所定の測定回数（あるいは測定時間）を満たしていれば、測定終了のためステップＳ１２６に進み、制御演算部６は電圧印加を停止するよう泳動電源部４に指示し、泳動電源部４は電圧印加を停止する。その後、制御演算部６は、ステップＳ１２７で微生物濃度の算出と、結果表示を行い、測定動作を完了する。詳細については前述の実施例と同様のため説明を省略する。
　このように本実施形態の微生物測定装置は、溶液導電率の影響が軽微で誘電泳動に有利な高周波数で微生物をトラップし、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜の変化幅が広く、言い換えればインピーダンス測定が容易で感度が高い低周波数でインピーダンス計測を行うので、高溶液導電率条件下での微生物の誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
　尚、本実施の形態においては、測定量がインピーダンスであるとして説明したが、測定量として、電極を流れる電流、電圧と電流との位相差、誘電率、導電率、あるいはこれらから算出される電気物理的な特性値を用いて良い。本実施の形態ではこの中でも特に、インピーダンス及びその抵抗成分（コンダクタンス）と容量成分（キャパシタンス）の測定によって微粒子の測定を行っている。
　また、本実施形態の微生物測定装置において、制御演算部６は、溶液導電率に基づいて泳動電圧の周波数及び測定電圧の周波数を選択することも可能である。前述の通り、誘電泳動力は溶液導電率によって変化するし、導電率によってインピーダンス計測に最適な周波数が異なることも考えられる。よって、溶液導電率によって泳動電圧及び測定電圧の周波数はそれぞれ最適な値を選ぶ必要がある。
　ここで、溶液導電率は、電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンス計測結果から求めることが可能である。なぜなら、インピーダンスの抵抗成分の逆数であるコンダクタンスは、溶液導電率を反映した値になるからである。よって、測定に先立ち、試料液のインピーダンスを計測して導電率を求め、泳動電圧及び測定電圧の最適周波数を選択する。
　これにより、導電率が変化する試料液でも、確実な誘電泳動による微生物のトラップと、高精度なインピーダンス計測を実現することが可能である。
（第３の実施形態）
　第２の実施形態では、泳動電源部４が、泳動電圧と測定電圧とを逐次印加する微生物測定装置について説明したが、本実施形態では、第２の実施形態で説明した微生物測定装置において、泳動電源部４が、泳動電圧と測定電圧とを同時に印加する場合について説明する。本実施形態の微生物測定装置（図示せず）は、図５に示す構成において、測定部５が、後述するフィルタ分離機能を有するものである。
　本実施形態において、泳動電源部４は、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に、泳動電圧として１ＭＨｚ付近の高周波数の交流電圧及び、測定電圧として１０ｋＨｚ～１ＭＨｚ付近の低周波数の交流電圧を重畳して印加する。これら条件設定の根拠は、第２の実施形態の通りである。また、測定部５は、１０ＫＨｚ～１ＭＨｚ付近の低周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定することもできる。
　ここでいう重畳とは、少なくとも異なる２つの周波数の正弦波あるいは矩形波などの交流信号同士を加算して交流信号を生成することを指す。また、フィルタ分離機能とは、交流信号から特定の周波数成分のみを取り出す機能である。フィルタ分離機能は、例えば、ＲＣ回路などにより構成される、受動素子によるパッシブフィルタ、及び、オペアンプなどの能動素子により構成されるアクティブフィルタ、あるいは信号処理によるディジタルフィルタなど、公知の技術により実現可能である。本実施の形態では、高周波の泳動電圧が混合された信号から、低周波の測定電圧の信号を分離する必要があるため、フィルタはローパスフィルタの構成としている。
　また、振幅の大きい泳動電圧の信号から、振幅の小さい測定電圧の信号を分離する必要があるため、高ノイズ成分を含む信号から、特定周波数の低レベル信号を取り出すことが可能な、位相検波方式によって測定電圧の周波数成分のみを取り出し、高精度なインピーダンス測定を実現している。
　この構成によれば、１ＭＨｚ以上の高周波数及び１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧を重畳して印加し、１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離してインピーダンスを測定するので、微生物のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができ、測定電圧のみが印加される状態にならず、微生物を強固に電極間にトラップしたままインピーダンス測定ができるため、高精度且つ高感度の微生物検出を実現できる。すなわち、高周波でトラップし低周波で計測するので、導電率影響の回避と高感度測定の両立が可能になる。また、計測を低周波で行うので、設計上有利となり、低コストな簡易回路で構成することができる。さらに、高周波と低周波の重畳波を使うことで、測定とトラップが同時に可能となる。
　なお、本実施形態の微生物測定装置において、制御演算部６は、溶液導電率に基づいて印加する電圧の周波数、つまり、少なくとも泳動電圧の周波数及び測定電圧の周波数のいずれか一方を調整することも可能である。
　このように、泳動電圧及び測定電圧の周波数を、試料液の導電率に応じてそれぞれ適切な値に設定することで、微生物のトラップ及びインピーダンス測定をより確実に、高精度に行うことができるという効果を有する。
　以下に、実施の形態３についての実施例を示す。
（１）泳動電圧の周波数及び測定電圧の振幅の設定
　泳動電圧、測定電圧の周波数及び振幅の最適値を検討するための実験を行った。標準寒天培地（ＭＢ００１０、栄研器材（株））上で３７℃、１６時間の好気培養を行った大腸菌Ｋ－１２株（ＮＢＲＣ３３０１、製品評価技術基盤機構）をコンラージ棒で採取し、０．１Ｍ　Ｄ－マニトール溶液（導電率、約５μＳ／ｃｍ）に懸濁、適宜希釈したものを試料とした。試料に、ＮａＣｌ溶液を適宜追加し、試料液導電率を調製した。試料液導電率は、導電率計（Ｂ－１７３、堀場製作所（株））により測定した。微生物が誘電泳動される様子を観察するため、電極は図１５に示すような矩形が入れ子になった形状の電極を用いた。電極上を透明なチャンバで覆い、位相差顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス）にて観察を行った。
　図１６は、泳動電圧の周波数を、（ａ）１００ｋＨｚ、（ｂ）８００ｋＨｚ、（ｃ）３ＭＨｚとしたときの、電圧印加４０秒後の電極ギャップの様子を示す。試料液の導電率は１００μＳ／ｃｍである。印加電圧は１０Ｖｐ－ｐ、交流電圧は正弦波である。周波数の高い（ｂ）、（ｃ）の場合、電極ギャップ間（電極のコーナー部、白丸枠内）の電界集中部に大腸菌がトラップされている様子が分かる。一方、周波数の低い（ａ）の場合、電極に殆ど大腸菌はトラップされておらず、試料液の導電率が１００μＳ／ｃｍの場合、１００ｋＨｚでは電極に微生物をトラップできないことが分かった。
　図１７は、更に試料液導電率を３００μＳ／ｃｍとし、泳動電圧の周波数を（ａ）８００ｋＨｚ、（ｂ）３ＭＨｚとしたときの電極ギャップの様子である。周波数を３ＭＨｚでは８００ｋＨｚに比べ、大腸菌が多くトラップされており、導電率が上昇した場合、３ＭＨｚが最も適した条件であることを確認した。
　図１８は、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ－ｐを印加し、測定電圧の周波数として１００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子である。試料液導電率は２００μＳ／ｃｍである。（ａ）は１００ｋＨｚ（測定電圧の周波数）の振幅を３Ｖｐ－ｐ、（ｂ）は１００ｋＨｚの振幅を１Ｖｐ－ｐとした場合である。周波数の低い測定電圧の振幅が高い３Ｖｐ－ｐの場合、１Ｖｐ－ｐに比べトラップされる大腸菌の量が少ないことが分かる。よって、測定電圧の振幅は１Ｖｐ－ｐ程度が最適であると確認した。
　図２０は、溶液の導電率が２４０μＳ／ｃｍのときの電極インピーダンスのコールコールプロットである。同図より、Fｌ＝１００ｋＨｚであることが分かる。このため、測定電圧の周波数は１００ｋＨｚ以上である必要がある。図２１は、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ－ｐを印加し、測定電圧の周波数として（ａ）１００ｋＨｚ、（ｂ）８００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子である。試料液導電率は２００μＳ／ｃｍである。測定電圧の周波数が低い１００ｋＨｚに比べて、周波数が高い８００ｋＨｚのトラップされる大腸菌の量が多いことが分かる。よって、測定電圧の周波数は８００ｋＨｚ程度が最適であると確認した。
（２）微生物測定
　前述した実験から、泳動電圧を３ＭＨｚ、１０Ｖｐ－ｐ、測定電圧を８００ｋＨｚ、１Ｖｐ－ｐと定め、図５の装置で大腸菌濃度及び導電率を適宜調整した試料液の測定を行った。比較のため、泳動電圧と測定電圧を同一の８００ｋＨｚ、１０Ｖｐ－ｐとして同様の測定を行った。図１９は、横軸に大腸菌濃度、縦軸にＤＥＰＩＭ測定の応答値（キャパシタンスの傾き）を対数表示したグラフを示す。（ａ）は泳動電圧及び測定電圧をいずれも８００ｋＨｚにした場合を、（ｂ）は泳動電圧を３ＭＨｚ、測定電圧を８００ｋＨｚにした場合を示す。（ａ）の場合、試料液導電率が１００μＳ／ｃｍまで上昇すると、微生物に働く誘電泳動力が低下する結果、ＤＥＰＩＭ測定の応答値にも低下が見られる。一方、（ｂ）に示すように、泳動電圧及び測定電圧をそれぞれ適切に設定した場合、試料液導電率が４００μＳ／ｃｍまで上昇しても応答低下が見られず、高精度な測定ができることが示された。
　本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　本出願は、２００９年２月１０日出願の日本特許出願（特願２００９－０２８９２７）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
　本発明は、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法として有用である。
１　セル
２　試料液
３　電極チップ
４　泳動電源部
５　測定部
６　制御演算部
６ａ　メモリ
７　導電率入力手段
９　表示手段
１０　基板
１１ａ，１１ｂ　電極
１３　ギャップ
１４　微粒子
１５　電気力線
１７　攪拌手段
２１　光源
２２　受光部

Claims (11)

  1. 　血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する液体を導入するセルと、
    　前記セル内部に浸漬する少なくとも一対の電極と、
    　前記一対の電極間に交流電圧を印加する泳動電源部と、
    　前記一対の電極間のインピーダンスを測定する測定部と、
    　前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出する制御演算部と、を備え、
    　前記制御演算部は、前記微粒子に誘電泳動を誘起するための第１の周波数の交流電圧、及び前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧、を前記一対の電極間に印加するよう、前記泳動電源部に指示する微粒子測定装置。
  2. 　請求項１記載の微粒子測定装置であって、
    　前記第１の周波数の交流電圧は、第１の振幅を有し、
    　前記第２の周波数の交流電圧は、第２の振幅を有する微粒子測定装置。
  3. 　請求項２記載の微粒子測定装置であって、
    　前記第２の振幅は、前記第１の振幅より小さいものである微粒子測定装置。
  4. 　請求項１記載の微粒子測定装置であって、
    　前記制御演算部は、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数の少なくともいずれかを調整する微粒子測定装置。
  5. 　請求項１記載の微粒子測定装置であって、
    　前記第１の周波数と前記第２の周波数を逐次切り替える微粒子測定装置。
  6. 　請求項５記載の微粒子測定装置であって、
    　前記第２の周波数の交流電圧を印加する時間が、第１の周波数の交流電圧を印加する時間より短い微粒子測定装置。
  7. 　請求項１記載の微粒子測定装置であって、
    　前記第２の周波数が、８００ｋＨｚより高く、前記第１の周波数よりも低い、微粒子測定装置。
  8. 　請求項１記載の微粒子測定装置であって、
    　前記泳動電源部は、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、
    　前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離するフィルタ手段を備え、
    　前記測定部は、フィルタ分離された前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分に対応する前記一対の電極間のインピーダンスを測定する微粒子測定装置。
  9. 　血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する試料液に浸漬した一対の電極間に交流電界を印加し、誘電泳動力により前記微粒子を所定位置に配置し、前記試料液中における前記微粒子の数を測定する微粒子測定方法であって、
    　前記一対の電極間に第１の周波数の交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させるステップと、
    　前記一対の電極間に、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧を前記一対の電極間に印加し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、
    　前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出するステップと、を有する微粒子測定方法。
  10. 　請求項９記載の微粒子測定方法であって、
    　溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数を選択するステップを有する微粒子測定方法。
  11. 　請求項９記載の微粒子測定装置であって、
    　前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧、及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加するステップと、
    　前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち、前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、を有する微粒子測定方法。
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