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WO2010089864A1 - 動物プランクトン餌料用セレン含有単細胞微細藻類とそれを使用したセレン含有動物プランクトンの培養方法 - Google Patents

動物プランクトン餌料用セレン含有単細胞微細藻類とそれを使用したセレン含有動物プランクトンの培養方法 Download PDF

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WO2010089864A1
WO2010089864A1 PCT/JP2009/051896 JP2009051896W WO2010089864A1 WO 2010089864 A1 WO2010089864 A1 WO 2010089864A1 JP 2009051896 W JP2009051896 W JP 2009051896W WO 2010089864 A1 WO2010089864 A1 WO 2010089864A1
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WO
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selenium
feed
microalgae
zooplankton
rotifer
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French (fr)
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功 丸山
寿雄 中村
直樹 古賀
佳孝 北島
洋太郎 安藤
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Chlorella Industry Co Ltd
Original Assignee
Chlorella Industry Co Ltd
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    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A23K20/30—Oligoelements
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Definitions

  • the present invention relates to a means for preventing selenium deficiency of larvae and juveniles during breeding after hatching in fish seedling production. Specifically, the present invention relates to a zooplankton culture feed used as a feed to be fed to larvae, that is, a selenium-containing unicellular microalgae, and a selenium-containing zooplankton culture method using the selenium-containing unicellular microalgae.
  • Non-Patent Document 1 Currently, began to freshwater chlorella essential polyunsaturated fatty acids is enhanced for essential vitamins B 12 and hatched larvae fish growth for growth of rotifers are mainly used. However, rotifers cultured in these are insufficient in terms of whether all the nutritional requirements of hatched larvae are satisfied (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • Selenium is known to be an essential trace component contained in various enzymes that work in the body of animals.
  • glutathione peroxidase containing selenium is important because it acts as a catalyst for glutathione that works to eliminate cellular peroxide and reactive oxygen species.
  • the zooplankton co-poda and artemia contain selenium as a trace mineral in the body, the present inventors cannot detect selenium at all in the same zooplankton rotifer or daphnia, or are extremely low. We discovered that selenium deficiency may have occurred in marine larvae during the period when they were fed.
  • a uniplanar microalgae for feed comprising selenium in a uniplanar microalgae in a zooplankton diet.
  • a single-cell microalgae for feed having a selenium content of 6.0 to 1500 ⁇ g / 100 g per dry alga weight.
  • the single-cell microalgae for feeding are freshwater chlorella and Nannochloropsis.
  • single-cell microalgae for feed, in which the target zooplankton is an rotifer and daphnia, which is indispensable as an initial feed for fish seedling production.
  • FIG. 1 is a diagram showing the effect of selenium-containing raw chlorella and selenium-containing chlorella powder on rotifer culture.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of raw chlorella with different selenium-containing concentrations on the growth of rotifers.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the selenium content in selenium-containing raw chlorella and the selenium content enhanced by cultured rotifers.
  • Typical examples of zooplankton capable of mass culture include rotifers and daphnids.
  • Brachionus is cultivated around the world as a suitable live food to be given to larval and juvenile fish immediately after hatching in the production of seedlings for fish farming.
  • the body length is 150-250 ⁇ m, and it is in the shape of a pot. It constantly filters the floating microalgae in the water while moving the cilia, and uses it as a nutrient source to live in brackish waters. Therefore, it has the habit of gathering towards the light because it seeks microalgae for photosynthesis.
  • Nutritional components include 60% (w / w) protein per dry matter, 10% (w / w) total fat, 15% (w / w) carbohydrates, and 8% (w / w) ash content. It is characterized by high nutritional value. This rotifer can use the raw chlorella which became industrially mass-produced as the feed, and the produced live rotifer is used as a suitable biological feed of hatching larvae.
  • Chlorella used in the present invention can be used regardless of species or strains as long as it belongs to the genus Chlorella, such as Bulgaris species, Solokiniana species, and Queselli species.
  • Nannochloropsis can also be used regardless of species or strain as long as it belongs to the genus Nannochloropsis, such as Oculata and Salina.
  • the medium used for culturing the single cell microalga can be used regardless of the type as long as the medium can grow the single cell microalgae.
  • glucose 80 g / L, potassium phosphate 2.0 g / L, magnesium sulfate 2.0 g / L, Fe ⁇ EDTA 4.8 mg / L, trace mineral A 5 ( ⁇ 10) 1.08 ml / L, vitamin A medium of B 12 2.4 mg / L and urea 6.0 g / L can be used.
  • Nannochloropsis potassium nitrate 0.5 g / L, sodium hydrogen phosphate 0.1 g / L, Fe.EDTA 4.15 mg / L, trace mineral A 5 ( ⁇ 10) 0.1 ml / L was dissolved in seawater.
  • a culture medium can be used (for example, refer nonpatent literature 3).
  • sodium selenite Na 2 SeO 3
  • sodium selenite is used by adding to a medium for microalgae growth.
  • the amount of sodium selenite added to the medium for microalgae is preferably within the range effective for rotifers and larvae without affecting the growth of microalgae, and can be strengthened by adding in the range of 18 to 1800 ⁇ g / L. good. More preferably, sodium selenite may be added in the range of 60 to 600 ⁇ g / L for strengthening.
  • microalgae there are no restrictions on the culture conditions for microalgae. For example, when the temperature is in the range of 5 ° C. to 40 ° C., the culture solution is aerated and stirred, and irradiated with light as necessary, and microalgae can be grown by culturing for 0.5 to several days.
  • Chlorella with a selenium content of 6.0-1500 ⁇ g / 100 g (per algae dry matter weight) is obtained by inoculating and culturing a seed strain using the above-mentioned medium for growing microalgae containing selenium at an appropriate concentration.
  • Nannochloropsis can be obtained. Even more preferably, 20 to 600 ⁇ g / 100 g (per dry alga body weight) of chlorella and Nannochloropsis can be obtained.
  • zooplankton is cultured using these selenium-containing raw microalgae as feed.
  • zooplankton culture method There are no restrictions on the zooplankton culture method.
  • rotifers are inoculated into seawater at a density of 10/500 to 500 / ml, this rotifer culture is kept at 10 ° C. to 35 ° C. and aerated to give microalgae enriched with selenium, starting from one day.
  • rotifers can be grown from 300 individuals / ml to 2000 individuals / ml. It is preferable to use living cells rather than dead cells for microalgae.
  • microalgae it is also possible to use a combination of microalgae, baker's yeast and other feeds.
  • the method for feeding microalgae can be given at the start of the culture, but it is preferable to measure the density of the rotifer every day and give the microalgae in an amount that the rotifer can feed on a daily basis.
  • the selenium content of cultured rotifers increases as the selenium content in the microalgae used as a feed increases, and the selenium content in the rotifers can be controlled by controlling the selenium content in the microalgae. is there.
  • the selenium content of the rotifer is preferably in the range of 10 to 500 ⁇ g / 100 g (per dry matter weight) from the viewpoint of the effect on larvae and juveniles. Further, considering the production efficiency of rotifer, the range is preferably 20 to 200 ⁇ g / 100 g (per dry matter weight).
  • single-cell microalgae containing selenium as a feed during zooplankton culture made it possible to produce zooplankton containing an appropriate amount of selenium.
  • the selenium-containing zooplankton produced in this way is used as a feed for larvae and larvae, the survival rate and vitality of larvae and larvae can be increased as compared to the conventional case.
  • the growth of zooplankton is also promoted, so that rotifers can be efficiently produced.
  • Example 1 Production of selenium-containing rotifer using selenium-containing raw chlorella as a feed
  • the selenium-containing raw chlorella was cultured using a 10 L jar fermenter.
  • the chlorella strain (Chlorella vulgaris) slant owned by our company was inoculated aseptically into the Sakaguchi flask of dark culture basal medium, and precultured at 28 ° C. After the utilization of glucose, it was transplanted to a 10 L jar fermenter, and selenium-enhanced chlorella was aseptically cultured.
  • the culture conditions were medium volume 6 L, temperature 36 ° C., aeration 3 L / min, pH 7.0, stirring speed 300 rpm / min.
  • Medium composition is glucose 80 g / L, potassium phosphate 2.0 g / L, magnesium sulfate 2.0 g / L, Fe ⁇ EDTA 4.8 mg / L, trace mineral A 5 ( ⁇ 10) 1.08 ml / L, vitamin B 12 Sodium selenite was added to basal media of 2.4 mg / L and urea 6.0 g / L at concentrations of 5.4 ⁇ g / L, 18 ⁇ g / L, 54 ⁇ g / L, 180 ⁇ g / L and 540 ⁇ g / L, respectively. The culture was started using the sample.
  • a culture test was carried out by feeding a total of four types of test feed of powder to a rotifer (S type). As test conditions, 50 L of artificial seawater having a 1.5% (w / w) salt concentration was put in each 100 L panlite water tank, the water temperature was 28 ° C., the aeration was 45 L / min, and the starting rotifer density was 80 individuals / ml.
  • the amount of food to be fed was cultured for 1 week on the basis of 0.5 to 0.7 ⁇ g / rotifer individual / day in terms of dry alga mass. The results are shown in FIG.
  • the selenium-containing raw chlorella group had a higher growth rate of the rotifer than the conventional method.
  • there was a clear difference in the form of feed between the raw state and the powdered state and almost no growth of rotifers was observed in the powdered test plots. This is thought to be due to the fact that the raw chlorella of the feed was freeze-dried, the cells were broken, and nutrient components such as protein were eluted in the rotifer's breeding water, resulting in an oligotrophic state. This was supported by the ongoing contamination of the breeding water in both districts fed with powdered feed.
  • the rotifer (S type) culture test was performed using the test foods with different selenium concentrations prepared by the above method (selenium content 0 ⁇ g, 6 ⁇ g, 19 ⁇ g, 58 ⁇ g, 191 ⁇ g, 570 ⁇ g / 100 g per dry weight). did.
  • 40 L of artificial seawater having a 1.5% (w / w) salt concentration was put in each 50 L panlite water tank, the water temperature was 28 ° C., the aeration was 45 L / min, and the starting rotifer density was 80 individuals / ml.
  • the amount of food to be fed was cultured for 4 days on the basis of 0.5 to 0.7 ⁇ g / rotifer individual / day in terms of dry alga mass.
  • the growth of rotifer was excellent when the selenium concentration in the feed was in the range of 19 to 191 ⁇ g / 100 g (per dry alga body weight). This result shows that selenium enrichment of the feed is effective for the growth of rotifer.
  • the selenium content of the rotifer was measured after the test, and the result is shown in FIG. From the results of FIG. 3, the selenium content in rotifers cultured with raw chlorella (selenium concentration: below detection limit) produced by the same method as the conventional method was below the detection limit ( ⁇ 5 ⁇ g / 100 g). In contrast, the selenium content in rotifers cultured with selenium-containing raw chlorella (selenium concentration of 6 to 570 ⁇ g / 100 g) increases with an increase in the selenium concentration in the raw chlorella, up to 200 ⁇ g / 100 g (per dry matter). ) Live rotifer was able to be produced.
  • Example 2 Production of selenium-containing daphnia using selenium-containing raw Nannochloropsis as a feed
  • Selenium-containing Nannochloropsis was cultured using a 30 L flat culture tank. Aseptically inoculate a 100 ml small flat flask containing a light culture basal medium from our company's Nannochloropsis slant, and stir with 80 ml of light culture basal medium, 5% (v / v) CO 2 aerated. Pre-culture was performed for 2 weeks at an illuminance of 2000 lux and a water temperature of 20 ° C.
  • the culture conditions were a medium volume of 25 L, 5% CO 2 aeration and stirring at 3 L / min, an illuminance of 2500 lux, and a water temperature of 20 ° C.
  • the composition of the medium was selenite in 0.5 g / L potassium nitrate, 0.1 g / L sodium hydrogen phosphate, 4.15 mg / L Fe.EDTA, 0.1 ml / L trace mineral A 5 ( ⁇ 10)
  • the culture was started using sodium 50 ⁇ g / L dissolved in diluted seawater (1% w / w salt).
  • the product was harvested and washed three times with pure water to obtain 20 g of live Nannochloropsis algae (converted to dry matter) having a selenium content of 480 ⁇ g / 100 g (per dry matter).
  • Example 3 Breeding test of flounder larvae using selenium-containing rotifer A flounder (Paralichthys olivacens) larvae breeding test was conducted using selenium-containing rotifers produced using selenium-containing raw chlorella as a feed.
  • the breeding test conditions are as follows: 500 L filtered seawater is introduced into each 600 L circular polycarbonate aquarium, water conversion rate is 100% / day, water temperature is 17-20 ° C., aeration is 500 ml / min. 0.05 mm * 1 ) 1.1 ⁇ 10 4 were accommodated.
  • Example 3 The test results of Example 3 and Comparative Example 1 are shown in Table 1.

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Abstract

　本発明者らは、従来の方法で培養した動物プランクトンにはセレンが検出できないか、また極めて低いことを発見し、これら生物餌料を摂餌している時期の海産仔稚魚ではセレン欠乏症が起きている可能性を見出した。 　セレンを含有した動物プランクトンの生産方法について開発を行い、あらかじめセレンを単細胞微細藻類に含有させ、その単細胞微細藻類を餌として動物プランクトンを培養することによりセレン含有動物プランクトンの生産に成功し、今までセレンが不足していた魚類仔稚魚の生残率と活力を飛躍的に向上させることができるようになった。

Description

動物プランクトン餌料用セレン含有単細胞微細藻類とそれを使用したセレン含有動物プランクトンの培養方法
　本発明は、魚類の種苗生産において孵化後の育成時における仔稚魚のセレン欠乏を防止する手段に関する。具体的には、仔稚魚に与える餌料として使用される動物プランクトンの培養用餌料すなわちセレン含有単細胞微細藻類、及びそのセレン含有単細胞微細藻類を使用したセレン含有動物プランクトンの培養方法に関する。
　魚類の養殖は、近年世界的な漁業資源の減少と健康志向の高まりの中で増加している。その養殖方法には、大きく分けて二種類ある。天然の稚魚を捕獲して配合飼料を与え、出荷サイズまで養育する方法と親魚から採卵し、孵化させたあとに養育する方法である。後者の場合、孵化後一定期間は卵黄と呼ばれる栄養分で成長し、その後開口と共に摂餌を開始するが、良好な成長を促すためにはシオミズツボワムシ（以下ワムシと略称）やミジンコといった生きた動物プランクトンが一般的に使用されている。
　その大きな理由として、孵化仔稚魚は消化管が未分化で消化力が弱いために人工配合飼料をうまく利用できないことや活発に動き回る生きた動物プランクトンを好んで摂餌することなどが挙げられる。特に単為生殖を行うワムシは、従来から生のパン酵母やナンノクロロプシスなどを給餌して大量に培養されてきた。しかし、工業的に生産されてきたパン酵母の場合は、増殖に必要な栄養素が不足することから起こる大量へい死を頻発させる。
　現在では、ワムシの増殖にとって必須のビタミンＢ１２や孵化仔稚魚の成長にとって必須の高度不飽和脂肪酸が強化された淡水産クロレラが主に利用されるようになった。しかし、これらで培養されたワムシも孵化仔稚魚の栄養要求をすべて満たしているかという点においては不十分である（例えば、非特許文献１参照）。
　セレンは、動物の生体内で働く種々の酵素類に含有され、必須の微量成分であることが知られている。特に、セレンを含有するグルタチオンペルオキシダーゼは、細胞の過酸化物や活性酸素種の消去などに働くグルタチオンに対して触媒として働き、重要である。
　今までに、魚類の養殖において使用される配合飼料を起因とする疾患や寄生虫症の治療及びその予防剤として、酵母や微細藻類などにセレンを強化した素材が開示されている（例えば、特許文献１、２、３参照）。しかし、その用途は、配合飼料が給餌できるステージ、即ち孵化後２～３週間以降の消化管が十分に発達した養殖魚を対象としたものであり、孵化直後の消化管が未分化な仔稚魚にこれらを直接与えても満足な成育は望めない。
　孵化仔稚魚の餌料には、生きたワムシ等が汎用されている。ワムシは海水中で増殖させることから、その体内には海水由来のセレンが存在し、それを与えた仔稚魚にはセレン欠乏は起こらないと考えられてきた。従って、この動物プランクトンにセレンを強化する研究開発は今まで皆無であり、更にそのワムシや孵化仔稚魚に対する効果は、全く知られていなかった。
先行技術文献
特許公開　平４－４０８８８号公報 特許第２９７３０５３号公報 特許第２９７３０７４号公報 水産学シリーズ（１３７）、養殖魚の健全性に及ぼす微量栄養素、２２～３０頁、恒星社厚生閣 国際化学物質安全性カード、ＩＣＳＣ番号０６９８ 藻類研究法、２８１～３０５頁、共立出版
　本発明者らは、動物プランクトンのコペポーダやアルテミアがその体内に微量ミネラルとしてセレンを含有しているにもかかわらず、同じ動物プランクトンであるワムシやミジンコには全くセレンが検出できないか、または極めて低いことを発見し、これらを摂餌している時期の海産仔稚魚ではセレン欠乏症が起きている可能性を見出した。
　従って、適正濃度のセレンを含有したワムシやミジンコを効率よく生産するための技術開発、及びセレンを含有したワムシやミジンコを用いて健全な仔稚魚を効率よく生産するための技術開発が課題であった。
　これらの課題を解決するために、セレンを含有した動物プランクトンの生産方法について開発を行った。セレン強化にもっともよく使用されるものとして水溶性の亜セレン酸ナトリウムがあるが、これをそのままワムシ等に添加しても毒性を示すことから、安定してセレンを含有させることは困難であった（例えば、非特許文献２参照）。そこで、あらかじめセレンを生きた単細胞微細藻類に含有させ、それを餌として動物プランクトン類を培養することにより、セレン含有動物プランクトンの生産に成功した。
　すなわち、動物プランクトンの餌料において、単細胞微細藻類にセレンを含有させた餌料用単細胞微細藻類。　
　及びそのセレン含有量が、藻体乾燥物重量当たり６．０～１５００μg／１００ｇである餌料用単細胞微細藻類。　
　及びその単細胞微細藻類が、淡水産クロレラ及びナンノクロロプシスである餌料用単細胞微細藻類。　
　及び対象となる動物プランクトンが、魚類種苗生産の初期餌料として不可欠な、ワムシ類（Rotifer）及びミジンコ類である餌料用単細胞微細藻類。　
　及びセレン含有単細胞微細藻類を動物プランクトンの餌料として使用し、生産された動物プランクトンのセレン含有量が乾燥物重量当たり１０～５００μｇ／１００ｇである動物プランクトンの培養方法。
図１は、セレン含有生クロレラとセレン含有クロレラ粉末のワムシ培養への影響を示す図である。 図２は、セレン含有濃度の違う生クロレラが、ワムシの増殖に与える影響を示す図である。 図３は、セレン含有生クロレラ中のセレン含量と培養されたワムシに強化されたセレン含量の関係を示す図である。
　大量培養が可能な動物プランクトンとして代表的なものにワムシ類やミジンコ類が挙げられる。特にワムシ類の中でもシオミズツボワムシ（Brachionus）は、魚類養殖の種苗生産において、孵化直後の仔稚魚に与える好適な生きた餌料として、世界中で培養されている。体長は、１５０～２５０μｍで、つぼ型をしており、常に繊毛を動かしながら水中の浮遊微細藻類を濾しとり、それを栄養源として汽水域で生活している。従って光合成を行う微細藻類を求めることから、光に向かって集まる習性をもっている。また栄養成分としては、乾燥物当りタンパク質６０％（ｗ/ｗ）、全脂質１０％（ｗ/ｗ）、炭水化物１５％（ｗ/ｗ）、灰分８％（ｗ/ｗ）とタンパク含量が多く、栄養価が高いのが特徴である。このワムシは、その餌料として工業的大量生産が可能となった生クロレラを用いることができ、生産された生きたワムシは孵化仔魚類の好適な生物餌料として使用されている。
　本発明のセレン含有動物プランクトンを生産するための餌料を得るには、適正量のセレンを含有したクロレラやナンノクロロプシスを培養することからはじめる。本発明に使用するクロレラは、ブルガリス種、ソロキニアナ種、ケセリ種など、クロレラ属であれば種や株に関わりなく使用することができる。ナンノクロロプシスも、オキュラタ種、サリーナ種などナンノクロロプシス属であれば種や株に関わりなく使用することができる。
　単細胞微細藻類の培養に用いる培地は、単細胞微細藻類が増殖できる培地であれば種類を問わず使用することができる。例えば、クロレラでは、グルコース８０ｇ／Ｌ、リン酸カリウム２．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム２．０ｇ／Ｌ、Ｆｅ・ＥＤＴＡ４．８ｍｇ／Ｌ、微量ミネラルＡ５（×１０）１．０８ml／Ｌ、ビタミンＢ１２　２．４ｍｇ／Ｌ、尿素６．０ｇ／Ｌの培地を使用できる。例えば、ナンノクロロプシスでは、硝酸カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、Ｆｅ・ＥＤＴＡ４．１５ｍｇ／Ｌ、微量ミネラルＡ５（×１０）０．１ml／Ｌを海水に溶解した培地を用いることができる（例えば、非特許文献３参照）。
　使用するセレンは、無機の亜セレン酸やセレン酸なども使用できるが、微細藻類の培養への影響が少ない亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｅＯ３）が最も好適である。亜セレン酸ナトリウムは、微細藻類増殖用の培地に添加して用いる。亜セレン酸ナトリウムの微細藻類用培地への添加量は微細藻類の増殖に影響を与えずに、ワムシおよび仔稚魚に有効な範囲が好ましく、１８～１８００μg／Ｌの範囲で添加して強化すれば良い。更により好ましくは、亜セレン酸ナトリウムを６０～６００μg／Ｌの範囲で添加して強化すれば良い。
　微細藻類の培養条件に制限はない。例えば、温度は５℃から４０℃の範囲で、培養液を通気・撹拌し、必要に応じて光を照射し、０．５日から数日間の培養によって微細藻類を増殖させることができる。
　上記の適正な濃度のセレンを含む微細藻類増殖用の培地を用い、種株を植菌して培養を行うことによって、セレン含量６．０～１５００μg／１００ｇ（藻体乾燥物重量当たり）のクロレラおよびナンノクロロプシスを得ることができる。さらにより好ましくは２０～６００μg／１００ｇ（藻体乾燥物重量当たり）のクロレラおよびナンノクロロプシスを得ることができる。
　次にこれらセレン含有生微細藻類を餌料として動物プランクトンの培養を行う。　
　動物プランクトンの培養方法に制限はない。例えば、ワムシを海水に１０個体/mlから５００個体/mlの密度で接種し、このワムシ培養液を１０℃から３５℃に保って通気を行い、セレンを強化した微細藻類を与えて１日から１０日程度培養することによって、ワムシを３００個体/mlから２０００個体/mlの密度まで増殖させることができる。微細藻類は死細胞よりも生きた細胞を用いる方が好ましい。また、微細藻類とパン酵母やその他の餌料を併用して与えることも可能である。微細藻類の給餌方法は、培養開始時に一度に与えることもできるが、毎日ワムシ密度を測定し、ワムシが１日に摂餌できる量の微細藻類を毎日与える方が好ましい。
　培養したワムシのセレン含量は、餌料として用いた微細藻類中のセレン含量の増加に伴って増加し、微細藻類中のセレン含量のコントロールによって、ワムシ中のセレンの含有量をコントロールすることが可能である。
　ワムシのセレン含有量は、仔稚魚に対する効果の面から、１０～５００μg／１００ｇ（乾燥物重量当たり）の範囲が好適である。さらにワムシの生産効率を考慮すると、好ましくは２０～２００μｇ／１００ｇ（乾燥物重量当たり）の範囲である。
　なお、動物プランクトンの飼育水に直接無機セレンを添加する方法も考えられるが、セレンは飼育水によって希釈されるために強化効率が極めて悪く、高濃度に添加すると増殖も不安定であった。また、セレン強化酵母などを直接与えて培養する方法も考えられるが、安定的な増殖が困難であり、セレンの強化効率も非常に低かった。
　次に、上記の方法により得られたセレン含有ワムシを用いて海産仔稚魚の飼育試験を行った。その結果、従来の方法で培養したワムシに比べてセレン含有ワムシを給餌した試験区では、孵化仔稚魚の生残率と活力が著しく向上した。
　セレンを含有させた単細胞微細藻類を動物プランクトン培養時の餌料として用いることによって、適正量のセレンを含有した動物プランクトンの生産が可能になった。こうして生産されたセレン含有動物プランクトンを仔稚魚の餌料として用いると、従来に比べて仔稚魚の生残率と活力を高めることができる。さらに、セレンを含有させた単細胞微細藻類を与えて動物プランクトンを培養することにより、動物プランクトンの増殖も促進されるため、ワムシの効率的な生産が可能になる。
　本発明によると、魚類養殖に必要な、健全な種苗を歩留まり良く生産することが可能となる。その結果として、出荷サイズまでの飼育や放流魚の生産に対して多大な恩恵を与えることができる。
　以下に本発明に対する実施例を図１～図３及び表１に基づいて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　セレン含有生クロレラを餌料としたセレン含有ワムシの生産
　１０Ｌジャーファーメンターを用いて、セレン含有生クロレラの培養を行った。当社保有のクロレラ株（Chlorella vulgaris）スラントから暗培養基礎培地の坂口フラスコに無菌的に植菌して、２８℃で前培養を行った。グルコースの資化終了後に１０Ｌジャーファーメンターに植え継ぎ、セレン強化クロレラの無菌培養を行った。培養条件は、培地液量６Ｌ、温度３６℃、通気３Ｌ／分、ｐＨ７．０、撹拌速度３００rpm／分とした。培地組成は、グルコース８０ｇ／Ｌ、リン酸カリウム２．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム２．０ｇ／Ｌ、Ｆｅ・ＥＤＴＡ４．８ｍｇ／Ｌ、微量ミネラルＡ５（×１０）１．０８ml／Ｌ、ビタミンＢ１２　２．４ｍｇ／Ｌ、尿素６．０ｇ／Ｌの基礎培地に、亜セレン酸ナトリウムを５．４μg／Ｌ、１８μg／Ｌ、５４μg／Ｌ、１８０μg／Ｌ、５４０μg／Ｌ、の濃度で各々加えたものを用いて、培養を開始した。増殖中に高度不飽和脂肪酸（ドコサヘキサエン酸６０％濃度）１．５ｇ／Ｌを各々添加し、グルコースの資化終了後に純水で３回水洗を行い、セレン含有量６～５７０μｇ／１００ｇ（乾燥物重量当たり）の範囲で生クロレラ藻体を各々２００ｇ（乾燥物換算）得た。
　上記の方法で培養したセレン含量１９１μｇ/１００ｇ（藻体乾燥物重量当たり）の生クロレラと従来法で培養した生クロレラ（セレン濃度＜５μg／１００ｇ：検出限界以下）及びその各々を凍結乾燥させた粉末の合計４種類の試験餌料をワムシ（S型）に給餌して培養試験を行った。試験条件は、各１００Ｌ容パンライト水槽に１．５％（ｗ/ｗ）塩濃度の人工海水５０Ｌを入れ、水温２８℃、通気４５Ｌ／分、開始ワムシ密度８０個体／mlとした。給餌量は、藻体乾燥物換算で０．５～０．７μg／ワムシ個体／日を基準として、１週間培養を行った。その結果を図１に示した。
　図１の結果より、セレン含有生クロレラ区は、従来法の生クロレラ区よりワムシの増殖率が優れていた。また餌料の形態において生の状態と粉末状態では明らかな差がみられ、粉末化された試験区では両区ともにワムシの増殖はほとんどみられなかった。この原因は、餌料の生クロレラを凍結乾燥することにより、その細胞が壊れ、タンパク質などの栄養成分がワムシの飼育水に溶出し、貧栄養状態になったものと考えられる。粉末化された餌料を与えた両区ともに、その飼育水の汚染が進行したことからもこのことが裏付けられた。
　次に、上記の方法により作成したセレン濃度の違う試験餌料（セレン含量　０μg、６μg、１９μg、５８μg、１９１μg、５７０μg／１００ｇ乾燥物重量当たり）を使って、ワムシ（Ｓ型）の培養試験を実施した。試験条件は、各５０Ｌ容パンライト水槽に１．５％（ｗ/ｗ）塩濃度の人工海水４０Ｌを入れ、水温２８℃、通気４５L／分、開始ワムシ密度８０個体／mlとした。給餌量は、藻体乾燥物換算で０．５～０．７μg／ワムシ個体／日を基準として、４日間培養を行った。その結果、図２に示すように、餌料中のセレン濃度が１９～１９１μg／100ｇ（藻体乾燥物重量当たり）の範囲でワムシの増殖が優れていた。この結果は、ワムシの増殖に関して、その餌料のセレン強化が有効であることを示している。
　また試験終了後にワムシのセレン含量を測定し、その結果を図３に示した。　
　図３の結果より、従来法と同様の方法で生産された生クロレラ（セレン濃度：検出限界以下）で培養したワムシ中のセレン含量は、検出限界（＜５μg／１００ｇ）以下であった。それに対して、セレン含有生クロレラ（セレン濃度　６～５７０μｇ/１００ｇ）で培養したワムシ中のセレン含量は、生クロレラ中のセレン濃度の増加に伴って増加し、最大で２００μｇ／１００ｇ（乾燥物当り）の生きたワムシを生産できた。
　尚、全てのセレン含量の測定は、検体を硝酸-過塩素酸により加水分解を行った後にジアミノナフタレンを使った蛍光分析法を用いた。
＜実施例２＞
　セレン含有生ナンノクロロプシスを餌料としたセレン含有ミジンコの生産
　３０Ｌ容扁平培養槽を用いて、セレン含有ナンノクロロプシスの培養を行った。当社保有のナンノクロロプシス（Nannochloropsis）のスラントから明培養基礎培地入りの１００ml容小型扁平フラスコに無菌的に植菌して、８０mlの明培養基礎培地、５％（ｖ/ｖ）ＣＯ２通気攪拌、照度２０００ルクス、水温２０℃で２週間前培養を行った。藻体濃度が２ｇ／L（乾燥物当たり）に達した時点で３０Ｌ扁平培養槽に植え継ぎ、セレン強化培養を行った。培養条件は、培地液量２５Ｌ、５％ＣＯ２通気撹拌３Ｌ／分、照度２５００ルクス、水温２０℃温度とした。培地組成は、硝酸カリウム０．５ｇ／L、リン酸水素ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、Ｆｅ・ＥＤＴＡ４．１５ｍｇ／Ｌ、微量ミネラルＡ５（×１０）０．１ｍｌ／Ｌの基礎培地に、亜セレン酸ナトリウム５０μｇ／Ｌを希釈海水（塩分１％ｗ/ｗ）に溶解させたものを用いて、培養を開始した。４週間培養を行った後に収穫して、純水で３回水洗を行い、セレン含量４８０μｇ／１００ｇ（乾燥物当り）の生きたナンノクロロプシス藻体２０ｇ（乾燥物換算）を得た。
　次にこの試験餌料を用いて、淡水ミジンコの培養試験を実施した。培養条件は、５０Ｌ容パンライト水槽に水道水４０Lを入れ、水温２８℃、通気３L／分、開始の個体密度を１０個体／mlで、給餌量は藻体乾燥物換算で３０～４０μg／ミジンコ個体／日を基準として１週間培養を継続した結果その密度は４５個体／mlとなり、水洗を３回行った後にセレン含量を測定した。その結果、セレン含量８５μg／１００ｇ（乾燥物当り）の生きたミジンコを生産できた。
＜実施例３＞
　セレン含有ワムシを使ったヒラメ仔魚の飼育試験
　セレン含有生クロレラを餌料として生産したセレン含有ワムシを用いて、ヒラメ（Paralichthys olivacens）仔魚の飼育試験を実施した。飼育の試験条件は各６００L容円型ポリカーボネイト水槽に、５００Ｌのろ過海水を投入して、換水率１００%／日、水温１７～２０℃、通気５００ml／分とし、孵化仔魚（体長２.１±０．０５mm＊１）を１．１×１０４尾収容した。試験餌料として、セレン含有ワムシ（セレン含量１００μg／１００ｇ乾燥重量当たり）を用いて飼育を開始し、飼育水中のワムシ密度が６～１２個体／mlとなるように１日２回給餌を行い、合計２水槽（ａ、ｂ）で１７日間飼育試験を行った。その結果、試験期間中のヒラメ仔魚の摂餌は旺盛で、順調な成育がみられた。
＜比較例１＞
　従来法による生クロレラで培養したワムシを使ったヒラメ仔魚の飼育試験
　従来の生クロレラを餌料として生産したワムシ（セレン濃度＜５μg／１００ｇ：検出限界以下）を用いて、ヒラメ仔魚の飼育試験を実施した。飼育の環境条件及び給餌条件は、上記と同様とし、合計２水槽（ｃ、ｄ）で１７日間飼育試験を行った。その結果、実施例３の場合とほぼ同様の成育がみられたが、飼育期間中の斃死個体数は増加した。
　実施例３及び比較例１の試験結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＊１：Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝５０）
　＊２：網による３０秒間空中露出後の生残率（ｎ＝５０）
　表１の各１７日間のヒラメ仔魚飼育試験結果より、従来法で生産したワムシ給餌区に比べてセレン含有ワムシ給餌区は、体長に大きな差はみられなかったものの、生残率及び活力において優れていた。これは、ワムシ給餌期のヒラメ孵化仔魚にとってワムシ餌料のセレン強化が、その生残率や活力において大きく影響を与えることを示す。
　近年、世界的な魚介類の需要増加と天然資源の減少に伴い、水産物の養殖に対する比重が高まっている。その中でも孵化仔稚魚の量産技術は、魚類養殖の根幹をなすもので、当該動物プランクトンのセレン強化方法により、魚類養殖種苗の生産性を飛躍的に向上させることが可能となる。

Claims (5)

  1. 　動物プランクトンの餌料において、単細胞微細藻類にセレンを含有させることを特徴とする餌料用単細胞微細藻類。
  2. 　セレン含有量が、藻体乾燥物重量当たり６.０～１５００μg／１００ｇであることを特徴とする請求項１記載の餌料用単細胞微細藻類。
  3. 　単細胞微細藻類が、淡水産クロレラ及びナンノクロロプシスであることを特徴とする請求項１記載の餌料用単細胞微細藻類。
  4. 　動物プランクトンが、魚類種苗生産の初期餌料として不可欠な、ワムシ類及びミジンコ類であることを特徴とする請求項１記載の餌料用単細胞微細藻類。
  5. 　請求項１記載のセレン含有単細胞微細藻類を動物プランクトンの餌料として使用し、生産された動物プランクトンのセレン含有量が乾燥物重量当たり１０～５００μｇ／１００ｇであることを特徴とする動物プランクトンの培養方法。
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