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WO2010074083A1 - 表面プラズモンおよび蛍光共鳴エネルギー転移を利用した免疫アッセイ - Google Patents

表面プラズモンおよび蛍光共鳴エネルギー転移を利用した免疫アッセイ Download PDF

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WO2010074083A1
WO2010074083A1 PCT/JP2009/071331 JP2009071331W WO2010074083A1 WO 2010074083 A1 WO2010074083 A1 WO 2010074083A1 JP 2009071331 W JP2009071331 W JP 2009071331W WO 2010074083 A1 WO2010074083 A1 WO 2010074083A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
thin film
metal thin
antigen
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/071331
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 日影
高敏 彼谷
英隆 二宮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP2010544084A priority Critical patent/JP5720248B2/ja
Publication of WO2010074083A1 publication Critical patent/WO2010074083A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method using surface plasmon and fluorescence resonance energy transfer, and a system and kit for the assay. More specifically, the present invention relates to an immunoassay method using surface plasmon based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS; Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy) and applying FRET technology to fluorescence detection.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • irradiation is performed by generating a dense wave (surface plasmon) on the surface of the metal thin film under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection (ATR) on the surface of the metal thin film.
  • ATR total reflection
  • the amount of photons contained in the laser light is increased to several tens to several hundreds times (the electric field enhancement effect of the surface plasmon), and this effectively excites the fluorescent dye in the vicinity of the metal thin film, resulting in a trace amount and / or extremely low concentration of the analog. It is a method that can detect light.
  • Patent Document 1 discloses an electric field enhanced by surface plasmon by disposing a primary antibody-immobilized film using carboxymethyldextran on the surface of a metal substrate. Discloses a method for detecting a fluorescent dye associated with an antigen.
  • analyte for example, a target antigen
  • the amount of fluorescent dye in the complex associated with the antigen in the assay is also extremely small, and this becomes a bottleneck of the amount of fluorescence generated. Even if plasmon electric field enhancement is used, the amount of fluorescence signal is not enhanced, and it is difficult to improve assay sensitivity.
  • Patent Document 2 examines amplifying signals and reducing non-specific reactions by complexly combining a reaction with an apoenzyme or holoenzyme and an immune reaction on a sensor substrate.
  • extremely precise molecular orientation technology is a prerequisite, and if the apo / holoenzyme reaction is preferential or dominant over the immune reaction, the risk that the measurement system itself cannot be established High nature.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the assay method of the present invention (FIG. 2) constituted by a mechanism in which substantially only the immune complex emits light was completed.
  • the present invention has excellent specificity that is indispensable for an immunoassay, and preferably combines surface plasmon and fluorescence resonance energy transfer with high sensitivity and high accuracy by independently combining an immune reaction field and a detection field. It is an object to provide an assay method, system and kit for the assay.
  • the present invention which is a highly sensitive assay method capable of specifically enhancing and measuring only the fluorescence of the immune complex even with a very small amount of target antigen, has the following constitution. That is, An immunoassay method for measuring the amount of antigen in a specimen using a primary antibody bound with a fluorescent dye as a donor molecule and a secondary antibody bound with a fluorescent dye as an acceptor molecule, comprising at least Step (a): An antigen-antibody reaction is caused between the antigen contained in the specimen and both the primary antibody and the secondary antibody, and the immune complex sandwiched by the two antibodies is used as a metal thin film substrate.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the specimen and the secondary antibody are brought into contact, and then the secondary antibody bound with the antigen is brought into contact with the metal thin film substrate on which the primary antibody is immobilized. It is desirable to fix it on a metal thin film substrate.
  • a metal thin film substrate on which the primary antibody is immobilized is brought into contact with a specimen, and then the secondary antibody is applied to the substrate, whereby the immune complex is placed on the metal thin film substrate. It may be fixed.
  • the primary antibody and the secondary antibody are brought into contact with a specimen, and the formed immune complex is brought into contact with a metal thin film substrate, whereby the immune complex is placed on the metal thin film substrate. It may be fixed.
  • the donor molecule and acceptor molecule are a FRET pair.
  • FRET pair Preferably from Alexa Fluor647 / Cy5.5, HiLyte Fluor647 / Cy5.5, fluorescein isothiocyanate (FITC) / tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), R-phycoerythrin (R-PE) / allophycocyanin (APC) The selected FRET pair.
  • the metal thin film substrate is a plasmon excitation sensor substrate having at least a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface thereof.
  • the laser light irradiation by the surface plasmon excitation fluorescence method means that the laser light is irradiated via the prism from the other transparent substrate surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is not formed. It is.
  • kits for the above assay comprising at least a plasmon excitation sensor, a primary antibody bound with a fluorescent dye serving as a donor molecule, which is an antibody immobilized on the surface of the metal thin film substrate,
  • an immune antibody reaction is caused by generating a sandwich-type antigen-antibody reaction between the primary antibody, the antigen in the sample, and the secondary antibody. It is a kit used for carrying out the step of forming a complex.
  • the metal thin film is formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum.
  • the plasmon excitation sensor is composed of the metal thin film and the transparent flat substrate, and further has a spacer layer, and the spacer layer is formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate. It is preferable.
  • the spacer layer is preferably SAM (Self Assembled Monolayer).
  • the present invention includes at least A primary antibody bound to a fluorescent dye serving as a donor molecule, which is immobilized on a metal thin film substrate of a plasmon excitation sensor, A secondary antibody to which a fluorescent dye serving as an acceptor molecule is bound, A plasmon excitation sensor, a light source for surface plasmon excitation fluorescence method, and a fluorescence detector, and cause a sandwich-type antigen-antibody reaction between both the primary antibody and the secondary antibody and the antigen contained in the specimen.
  • the plasmon excitation sensor emits light by fluorescence resonance energy transfer from the fluorescent dye of the primary antibody excited by irradiating the immune complex immobilized on the metal thin film substrate with laser light by the surface plasmon excitation fluorescence method.
  • an immunoassay system that measures the amount of the antigen by measuring the amount of fluorescence of the acceptor molecule.
  • the conventional sandwich immunoassay method When detecting an extremely small amount of analyte, the conventional sandwich immunoassay method had a small amount of fluorescence signal and relatively increased background noise, so that the S / N ratio was deteriorated. Even when SPFS is introduced into the detection system, a mismatch occurs between the surface plasmon electric field enhancement (example of electric field enhanced photon amount) and the amount of fluorescent dye (example of fluorescent photon amount) of a very small amount of analyte, resulting in a sensitivity limit. There was a possibility.
  • the immunoassay method of the present invention a mechanism in which only the immune complex emits light by providing luminescence enhancement based on the FRET technique in detection with a plasmon excitation sensor (SPFS) is provided. Furthermore, it is desirable to make the immune reaction field and the detection field independent. This increases the difference between the excitation wavelength and the fluorescence wavelength and increases the fluorescence signal emitted from the immune complex. On the other hand, fluorescence such as secondary antibodies that are not involved in the immune reaction is not detected, so background noise is generated. Reduced to allow for high S / N ratio assays.
  • SPFS plasmon excitation sensor
  • analyte eg, target antigen
  • concentration of 10 ⁇ 18 mol (1 amol / L) to 10 ⁇ 12 mol (1 pmol / L) per liter from a sample containing an analyte (eg, target antigen) at a concentration of 10 ⁇ 18 mol (1 amol / L) to 10 ⁇ 12 mol (1 pmol / L) per liter,
  • the analyte can be detected with high sensitivity and high accuracy.
  • the FRET pairs When the FRET pairs are separated from each other by 10 nm or more, the FRET disappears and the emission of the acceptor on the secondary antibody is significantly attenuated. Therefore, only the fluorescence derived from the immune complex is substantially detected through FRET that is expressed when the donor / acceptor pair is at an appropriate distance, and a washing operation (B / F separation) is not required. .
  • the assay of the present invention can completely separate the immune reaction field and the fluorescence detection field, the immune reaction conditions and the detection conditions can be optimized separately, and is less susceptible to scattering noise and background noise. Furthermore, since it has three sensitivity amplification mechanisms, namely, immune reaction optimization, chemical amplification and physical amplification, it is possible to provide an extremely sensitive and highly accurate SPFS / FRET immunoassay.
  • FIG. 1 schematically shows a conventional sandwich immunoassay.
  • the fluorescent dye (50) is labeled only on the secondary antibody (40, 41, 42).
  • the secondary antibody (42) non-specifically bound by excitation (100) and the fluorescent dye (50) of the free secondary antibody (41) also emit light, increasing noise (300). For this reason, a cleaning operation is required.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a sandwich immunoassay using SPFS / FRET of the present invention.
  • the primary antibody (20) and the secondary antibody (40, 41, 42) are labeled with a fluorescent dye (60) serving as a donor molecule and a fluorescent dye (70) serving as an acceptor molecule, respectively.
  • the secondary antibody (40) oriented at an appropriate distance from the excited (100) fluorescent dye (60) of the primary antibody (20) only when the immune complex (500) to be detected is formed
  • the energy is transferred to the fluorescent dye (70) and emits fluorescence (FRET (400)).
  • FRET fluorescence
  • analyte is a substance to be assayed, that is, a test substance, and refers to a relatively large molecule mainly designated as “antigen”. Low molecular weight compounds (haptens) such as substances can also be targeted.
  • the “fluorescent dye” is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating predetermined excitation light or using the electric field effect in the present invention. Including luminescence.
  • SPFS Surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy or surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the immunoassay method of the present invention comprises: An immunoassay method for measuring the amount of antigen in a specimen using a primary antibody bound with a fluorescent dye as a donor molecule and a secondary antibody bound with a fluorescent dye as an acceptor molecule, comprising at least Step (a): An antigen-antibody reaction is caused between the antigen contained in the specimen and both the primary antibody and the secondary antibody, and the immune complex sandwiched by the two antibodies is used as a metal thin film substrate.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the second half of the assay is to detect the immune complex thus formed with high sensitivity. That is, the fluorescent dye of the donor molecule is excited by SPFS for the purpose of specifically detecting only a small amount of the immune complex. From the other surface of the substrate where the thin film is not formed, the immune complex is irradiated with a laser beam via a prism, and the FRET phenomenon occurs between the fluorescent dye and the acceptor molecule of the excited donor molecule. To express. The fluorescence of the acceptor molecule of the secondary antibody excited by this FRET is detected by a plasmon excitation sensor, and the amount of emitted fluorescence is obtained.
  • the immunoassay method of the present invention employs a method in which the immune complex formed as described above is detected with high sensitivity by SPFS / FRET, but a primary dye conjugated with a fluorescent dye serving as a donor molecule for FRET expression.
  • a secondary antibody to which an antibody and a fluorescent dye as an acceptor molecule are bound is used.
  • the primary antibody used in the assay of the present invention is an antibody that can recognize and bind to an analyte (for example, a target antigen) contained in a specimen. At the same time, the primary antibody binds a fluorescent dye that becomes the FRET donor molecule. Further, the primary antibody is immobilized on the surface of the metal thin film substrate constituting the plasmon excitation sensor, preferably a spacer layer, for example, SAM (Self Assembled Monolayer), or immobilized on the substrate during fluorescence detection. (FIG. 2).
  • the secondary antibody is a specific antibody against the same target antigen as the primary antibody, and is bound with a fluorescent dye serving as the FRET acceptor molecule.
  • the secondary antibody recognizes and binds to an epitope of the same target antigen (however, an epitope different from that of the primary antibody).
  • the primary antibody and the secondary antibody specifically bind to different sites of the same antigen to form a sandwich-type immune complex, and this is immobilized on the surface of the metal thin film substrate constituting the plasmon excitation sensor. This is the first half of the immunoassay.
  • the secondary antibody may bind non-specifically to the primary antibody but not the target antigen, but in this case it is necessary to prevent FRET from being expressed.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by gene recombination, and antibody fragments.
  • AFP anti- ⁇ fetoprotein
  • CEA anti-carcinoembryonic antigen
  • the secondary antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the primary antibody is a monoclonal antibody
  • the secondary antibody is preferably a monoclonal antibody that recognizes an epitope that the primary antibody does not recognize, or a polyclonal antibody.
  • the primary antibody immobilized on the plasmon excitation sensor is an AFP monoclonal antibody
  • the secondary antibody that binds to it is a monoclonal antibody that can recognize and bind to an antigen that competes with AFP contained in the specimen. Requires an antibody or polyclonal antibody.
  • Preferable examples include immunoglobulins (antibodies) each consisting of a pair of H and L chains, their Fabs (antigen-binding fragments), or similar protein fragments showing effective epitope affinity. .
  • analyte is a low molecular weight substance (such as a hapten) that is difficult to be recognized as an epitope having a different antigen
  • Fab, scFv, or the like as a binding partner instead of the antibody. Details of such a non-competitive immunoassay are disclosed in US Pat.
  • “Specimen” refers to a biological sample, environmental sample, or the like that has been pretreated as required for this assay.
  • the sample include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (eg, cerebrospinal fluid, ascites fluid, pleural effusion), and the like, and appropriately diluted with a desired solvent, buffer solution, etc. May be.
  • body cavity fluid eg, cerebrospinal fluid, ascites fluid, pleural effusion
  • blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred. These may be used alone or in combination of two.
  • Antigen contained in the specimen is a molecule or molecular fragment that can be specifically recognized (or recognized) and bound by the secondary antibody and the primary antibody immobilized (or immobilized) on the substrate surface. It is.
  • molecules or “molecular fragments” include nucleic acids (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., Or nucleosides, nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modifications thereof Examples thereof include molecules, complexes, and the like. Specifically, it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), a tumor marker, a signal transducing substance, a hormone, and the like,
  • an antigen-antibody reaction is caused by bringing the sample into contact with the antibody.
  • the temperature is usually 4 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C.
  • the time is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
  • a positive control and a negative control are also performed at the same time, it is convenient to perform on a multi-well plate.
  • step (a) of immobilizing the formed immune complex on the plasmon excitation sensor metal thin film substrate there are the following three modes for causing an antigen-antibody reaction.
  • the specimen is brought into contact with the secondary antibody, and then the secondary antibody bound with the antigen is brought into contact with the metal thin film substrate (of the plasmon excitation sensor) on which the primary antibody is immobilized.
  • a method of immobilizing the immune complex on a metal thin film substrate (for a plasmon excitation sensor) In the step (a), the primary antibody and the secondary antibody are brought into contact with a specimen, and the formed immune complex is brought into contact with a metal thin film substrate (of a plasmon excitation sensor) to thereby form the immune complex.
  • This is a method of immobilizing on a metal thin film substrate (for a plasmon excitation sensor).
  • the immune complex formed is immobilized by some interaction that occurs between the primary antibody and the binding partner on the metal thin film substrate (of the plasmon excitation sensor) or on the spacer layer.
  • the interaction may be, for example, a gold-S bond, biotin- (strept) avidin, or an antibody against the primary antibody.
  • the above-mentioned “contact” is a state in which the surface on which the primary antibody of the plasmon excitation sensor is immobilized is immersed in a liquid (reaction solution) that has been applied or sent. This refers to bringing the immune complex contained in the liquid into contact with the metal thin film substrate or spacer layer of this plasmon excitation sensor.
  • reaction solution a liquid
  • the specific method will be described in detail in the section “Plasmon Excitation Sensor” below.
  • the “contact” between the reaction solution and the plasmon excitation sensor includes, for example, an immune complex formed in the liquid supply circulating in the flow path, and the primary antibody of the plasmon excitation sensor is immobilized.
  • a mode in which the plasmon excitation sensor and the reaction liquid in the step (a) are brought into contact with each other is preferable. This is easily realized by fixing the plasmon excitation sensor to the flow path so that the surface on which the primary antibody is fixed becomes a part of the flow path.
  • the first method should be adopted when the primary antibody needs to be stably immobilized on the substrate surface.
  • the second method when the surface of the substrate can easily bind the primary antibody that forms an immune complex with the secondary antibody, or when the spacer described below is installed and in such a state Can be adopted. Since the primary antibody, the secondary antibody and the antigen are in a free state in the solution and cause an antigen-antibody reaction, there is a feature that there is no interference such as steric hindrance.
  • Both of these systems are characterized in that the immune reaction field and the detection field of the formed immune complex are independent of each other. Therefore, there is an advantage that a washing operation for the purpose of B / F (binding / free) separation is not required. It greatly contributes to the reduction of fluorescence background noise.
  • Another remaining format is similar to the conventional sandwich immunoassay format, where the primary antibody is a solid phase antibody
  • a method in which the immune complex is immobilized on a metal thin film substrate of a plasmon excitation sensor by contacting the specimen with a metal thin film substrate on which the primary antibody is immobilized, and then applying a secondary antibody to the substrate. is there.
  • the secondary antibody to which the fluorescent dye of the acceptor molecule is bound is applied to the plasmon excitation sensor metal thin film substrate in contact with the specimen.
  • Contact in the case of “contacting the metal thin film substrate on which the primary antibody is immobilized and the specimen, and then applying the secondary antibody to the substrate” is as described above. That is, a solution containing the secondary antibody is brought into contact with the substrate by liquid feeding or the like.
  • a sample solution is applied to the substrate (or spacer layer), the substrate is washed with a washing buffer, and then a secondary antibody solution is added in a predetermined amount to the surface of the substrate on which the primary antibody is immobilized. For a certain period of time. An antigen-antibody reaction occurs between the primary antibody and the secondary antibody that bind to the antigen contained in the specimen.
  • the washing operation is an operation of washing the surface after applying the specimen to the substrate surface having the primary antibody. Therefore, the washing operation is preferably included before and / or after the application of the secondary antibody.
  • a surfactant such as Tween 20 or Triton X100 is dissolved in the same solvent or buffer solution, and preferably contains 0.00001 to 1% by weight.
  • This mode should be adopted when the primary antibody needs to be stably immobilized on the surface of the substrate and it is preferable to first bind the primary antibody and the antigen.
  • the temperature is usually 4 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C.
  • the time is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
  • the immune complex is immobilized on the metal thin film surface of the metal thin film substrate.
  • a spacer layer is installed as described later, it may be fixed on the surface of the spacer layer.
  • the plasmon excitation sensor includes a metal thin film and a transparent flat substrate, and a spacer layer may be formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate.
  • a method for immobilizing the primary antibody on the substrate surface an optimal crosslinking method according to the terminal functional group on the substrate surface can be selected. Further, depending on the properties of the substrate surface, a method of directly adsorbing directly to the surface can also be mentioned as an effective means.
  • a conventionally used fluorescent labeling method for proteins see, for example, JP-A-6-109732
  • the fluorescent dye molecule and an appropriate cross-linking agent such as silane are used. What is necessary is just to make it couple
  • the crosslinking agent include N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) and derivatives thereof, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester and derivatives thereof, and the like.
  • the carboxyl group of the fluorescent dye is converted into water-soluble carbodiimide (WSC) (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)) and N-hydroxysuccinimide ( NHS) and then esterifying the carboxyl group and the amino group of the antibody protein by dehydration using water-soluble carbodiimide; immobilizing the antibody protein and fluorescence having an isothiocyanate and amino group, respectively.
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a method in which a dye is reacted and immobilized a method in which an antibody having a sulfonyl halide and an amino group and a fluorescent dye are reacted and immobilized; a method in which an antibody having an iodoacetamide and a thiol group and a fluorescent dye are reacted and immobilized; Cited .
  • the desired fluorescent dye is converted into the primary antibody or the secondary antibody. What is necessary is just to couple
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer is a phenomenon in which a dye (referred to as “donor”) is excited by a light source in a system that detects molecules (donors and acceptor molecules) that interact in close proximity. Later, the energy is transferred to another dye (referred to as an “acceptor”). For energy transfer, the emission spectrum of the donor dye significantly overlaps with the excitation spectrum of the acceptor.
  • the extremely close parallel alignment of the two dyes is generally closer to 100 angstroms ( ⁇ ), preferably closer to 50 angstroms, more preferably closer to 10 angstroms (1 angstrom is 0.1 nanometer) equal.).
  • Essential for energy transfer between donor / acceptor pairs. FRET is usually based on the interaction between a donor dye and an acceptor dye, both fluorescent dyes.
  • the donor dye molecule In order to achieve resonance energy transfer as FRET, the donor dye molecule must absorb light and transfer it to the acceptor which is the second dye molecule through resonance of the excited electrons. In order to perform energy transfer, the wavelength of the donor's fluorescence emission must be lower than the excitation wavelength of the acceptor, ie the process must be energetically “downhill”.
  • fluorescent dyes used as donor molecules, acceptor molecules are fluorescein labels, for example 5- (and 6) -carboxyfluorescein, 5- or 6-carboxyfluorescein, 6- (fluorescein)- 5- (and 6) -carboxamide hexanoic acid and fluorescein isothiocyanate, Alexa Fluor dye, cyanine dye, eg Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, optionally substituted coumarin ), R-phycoerythrin, allophycoerythrin, Texas Red and Princeston Red, and R-phycoerythrin and complexes of, for example, Cy5 or Texas Red That. Further, it may be a lanthanide complex, for example, a chelate fluorescent material such as terbium or eurobium.
  • fluorescein labels for example 5- (and 6) -carboxyfluorescein, 5- or 6-carboxyfluorescein, 6- (fluorescein)- 5- (and 6) -carboxamide he
  • the donor molecule and acceptor molecule are a FRET pair.
  • Any FRET pair may be used as the FRET pair in the present invention.
  • Preferred FRET pairs include, for example, Alexa Fluor647 / Cy5.5, HiLyte Fluor647 / Cy5.5, fluorescein isothiocyanate (FITC) / tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), R-phycoerythrin (R-PE). ) / Allophycocyanin (APC) pair group.
  • the R-PE / APC pair is very promising because 90% FRET efficiency can be achieved despite the dimensions of R-PE and APC. Furthermore, this FRET pair can be easily detected utilizing two common lasers in structures emitting at 488 and 632 nm. However, the FRET pair in the present invention is not limited to these examples.
  • a LANCE assay combining time-resolved fluorescence technology with Wallac fluorescence lanthanide chelate and FRET technology is known.
  • the donor label Eurobium chelate
  • the acceptor label Allophycocyanin
  • the excited energy of the eurobium chelate transfers energy to the acceptor at a short distance by non-radiative resonance energy transfer. Since the lanthanide that is a fluorescent substance is in an excited state for a long time, nonspecific background due to short-lived fluorescence that can be generated by direct excitation of the acceptor by excitation light can be avoided.
  • the metal thin film included in the “plasmon excitation sensor” described below is formed of a metal including gold, 1,3-dicroro-9,9-dimethyl-acidine-2- One-7-yl phosphate (DDAO phosphate) (Molecular Probes) is preferred.
  • DDAO phosphate 1,3-dicroro-9,9-dimethyl-acidine-2- One-7-yl phosphate
  • the autofluorescence wavelength of the donor molecule the greater the difference between the autofluorescence wavelength and the fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent dye based on FRET, the easier it is to avoid the influence of the background signal, and as a result, highly accurate measurement is possible.
  • FRET fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent dye based on FRET
  • the formed immune complex is qualitatively or quantitatively measured by exciting the fluorescence of the primary antibody constituting it with SPFS and then measuring the fluorescence development of the acceptor molecule of the secondary antibody enhanced by FRET. Can be assayed.
  • the fluorescent dye obtained through the step (a) into contact with the thin film surface of the plasmon excitation sensor having at least the transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate, The donor molecule fluorescent dye bound to the antibody is excited.
  • a detection field is completely separated from the immune reaction field in a preferred embodiment.
  • the antigen-antibody reaction solution containing the formed immune complex is used as a thin film surface or spacer layer surface of the plasmon excitation sensor substrate. Or pass through. Accordingly, by appropriately providing a flow path system described later, it is possible to rapidly assay a large number of specimens including standard analytes of known concentrations, controls, and specimen specimens. Further, as a mode for high-throughput processing of the assay, ⁇ -TAS (Micro total analysis system) may be used.
  • SPFS Surface plasmon excitation fluorescence method
  • SPFS generates several dense waves (surface plasmons) on the metal thin film surface under the condition that the irradiated laser light undergoes total reflection attenuation (ATR) on the gold thin film surface, thereby doubling the photon amount of the irradiated laser light by several tens. Increased by several hundred times (electric field enhancement effect of surface plasmon), thereby enabling highly sensitive fluorescence measurement by efficiently exciting the fluorescent dye near the gold thin film.
  • the “plasmon excitation sensor” includes a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate, and further preferably has a spacer layer, and the spacer layer is the transparent flat plate of the metal thin film. It is desirable to form on the other surface which is not in contact with the substrate.
  • Such a plasmon excitation sensor has a substrate and a gold thin film, such as a sensor chip used in a Biacore system manufactured by GE Healthcare Biosciences, and further, a spacer layer is formed on the gold thin film. Also included.
  • the “transparent flat substrate” may be made of glass or plastic such as polycarbonate (PC) or cycloolefin polymer (COP), and preferably has a refractive index [n d ] of 1.40 to 2. And the thickness is preferably 0.01 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm, and the size (length ⁇ width) is not particularly limited.
  • PC polycarbonate
  • COP cycloolefin polymer
  • the glass transparent flat substrate is BK7 (refractive index [nd] 1.52) and LaSFN9 (refractive index [nd] 1.85) manufactured by SCHOTT AG, manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd.
  • K-PSFn3 reffractive index [nd] 1.84
  • K-LaSFn17 reffractive index [nd] 1.88
  • K-LaSFn22 reffractive index [nd] 1.90
  • -LAL10 reffractive index [nd] 1.72 or the like is preferable from the viewpoint of optical characteristics and detergency.
  • the transparent flat substrate is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming a metal thin film on the surface.
  • the cleaning treatment with acid it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
  • Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (PDC200 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
  • a plasma dry cleaner PDC200 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.
  • the “metal thin film” is formed on one surface of the above “transparent flat substrate”, preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably It is preferably made of gold and may be an alloy of these metals. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases. In addition, it is preferable that a group having affinity for gold as the surface metal thin film is bound to the primary antibody.
  • mercapto group (—SH), dithio group (—SS—), sulfo group (—SO 3 H), thiocarboxy group (—C (O) SH), dithiocarboxy group (—CSSH), amino group (—NH) 2 ) or a hydroxyl group (—OH).
  • a group having a particularly high affinity for gold is a mercapto group, a dithio group, a sulfo group, a thiocarboxy group, or a dithiocarboxy group, and particularly preferably a mercapto group.
  • the glass and the metal thin film can be bonded more firmly, so that a thin film of chromium, nickel chromium alloy or titanium is formed in advance. Is preferred.
  • Examples of methods for forming a metal thin film on a transparent flat substrate include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by sputtering or vapor deposition.
  • the thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm.
  • the thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.
  • gold 20-70 nm
  • silver 20-70 nm
  • aluminum 10-50 nm
  • copper 20-70 nm
  • platinum 20-70 nm
  • alloys thereof 10-70 nm
  • chromium The thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm.
  • the thickness of the metal thin film is within the above range because surface plasmons are easily generated. Moreover, if it is a metal thin film which has such thickness, a magnitude
  • the “spacer layer” is formed on the other surface of the metal thin film not in contact with the “transparent flat substrate” for the purpose of preventing metal quenching of the fluorescent dye by the “metal thin film”.
  • it may be a SAM (Self Assembled Monolayer) or a dielectric.
  • streptavidin may be bound to the spacer layer or a streptavidinized portion may be included. Biotin bound to the primary antibody and its streptavidin specifically interact with each other to achieve “immobilization of the primary antibody by capture”.
  • SAM single molecule contained in “SAM”, usually a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms (for example, available from Dojindo Laboratories Co., Ltd., Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), particularly preferably 10 -Carboxy-1-decanethiol is used.
  • Carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms has properties such as little optical influence of SAM formed using it, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. Therefore, it is preferable.
  • the SAM formation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a method of immersing a flat glass substrate having a metal thin film formed on an ethanol solution containing 10-carboxy-1-decanethiol (manufactured by Dojindo Laboratories).
  • the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to the metal and is immobilized, and self-assembles on the surface of the gold thin film to form a SAM.
  • dielectric various inorganic substances that are optically transparent, or natural or synthetic polymers can be used. From the viewpoint of chemical stability, production stability, and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2 ) Or titanium dioxide (TiO 2 ).
  • the thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and is preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. On the other hand, it is preferably 200 nm to 1 mm from the viewpoint of electric field enhancement, and more preferably 400 nm to 1,600 nm from the stability of the effect of electric field enhancement.
  • Examples of the method for forming the spacer layer made of a dielectric include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or a spin coater.
  • a solution containing the fluorescent dye is dropped.
  • Spraying, coating, and the like there may be mentioned a method in which the following flow path is formed on the plasmon excitation sensor and a solution containing the fluorescent dye is brought into contact with the surface of the plasmon excitation sensor.
  • the “flow channel” is a rectangular parallelepiped or a tube that can efficiently deliver a small amount of a chemical solution and can change the liquid feeding speed or circulate in order to promote the reaction.
  • the vicinity of the place where the plasmon excitation sensor is installed preferably has a rectangular parallelepiped structure, and the vicinity of the place where the drug solution is delivered preferably has a tubular shape.
  • the plasmon excitation sensor part consists of a homopolymer or copolymer, polyethylene, polyolefin, etc. containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material, and silicon rubber, Teflon (registered trademark), polyethylene, polypropylene, etc.
  • a polymer such as
  • the vertical and horizontal sections of the channel of the plasmon excitation sensor unit are independently about 100 nm to 1 mm.
  • a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path in a small-scale lot (laboratory level), first, on the surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, A dimethylsiloxane (PDMS) sheet is pressure-bonded so as to surround a portion where the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, and then the polydimethylsiloxane (PDMS) sheet and the plasmon excitation sensor are closed with a screw or the like.
  • a method of fixing with a tool is preferred.
  • a gold substrate is formed on a plastic integrally molded product, or a separately manufactured gold substrate is fixed, and the gold surface is fixed. Further, after the dielectric layer, the fluorescent dye layer, and the ligand are immobilized, it can be manufactured by covering with a plastic integrally formed product corresponding to the top plate of the flow path. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.
  • the “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer for diluting the specimen, and examples thereof include phosphate buffered saline (PBS) and Tris buffered saline (TBS), but are not particularly limited. It is not something.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS Tris buffered saline
  • the temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. ⁇ 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. ⁇ 5 to 15 minutes.
  • the second half of this assay consists of the plasmon excitation sensor with the above-mentioned immune complex immobilized on the other surface of the substrate on which the thin film is not formed, and laser light via a prism. , And the amount of fluorescence emitted from the excited secondary antibody fluorescent dye is measured. From the measurement result obtained in the above step, the antigen amount of the analyte contained in the specimen is calculated.
  • the laser light irradiation by the surface plasmon excitation fluorescence method is performed by transmitting the laser light to the immune complex via a prism from the other transparent substrate surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is not formed. Irradiation is performed, and thereby the fluorescence amount of the acceptor molecule emitted by the fluorescence resonance energy transfer (FRET) phenomenon from the excited donor molecule fluorescent dye of the primary antibody is determined.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a calibration curve can be created by performing measurement with a target antigen at a known concentration, and the amount of target antigen in the sample can be calculated from the measured fluorescence amount based on the created calibration curve.
  • the surface plasmon is generated on the surface of the metal thin film by the laser light irradiation under the total reflection attenuation condition (ATR). Due to the electric field enhancement effect of surface plasmons, the fluorescent dye is excited by photons that are increased by several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. The increase in photons due to the electric field enhancement effect depends on the refractive index of the glass serving as the substrate, the metal species and the film thickness of the metal thin film, but is usually about 10 to 20 times the increase in gold.
  • the fluorescent dye In the fluorescent dye, the electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electronic excited state in a short time, and when returning from this state (level) to the ground state, the fluorescent dye has a wavelength corresponding to the energy difference. To emit.
  • an LD laser having a wavelength of 200 to 900 nm and 0.001 to 1,000 mW, or a semiconductor laser having a wavelength of 230 to 800 nm and 0.01 to 100 mW is preferable.
  • the “prism” is intended to allow the laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and the refractive index is preferably the same as that of the “transparent flat substrate”.
  • various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape.
  • a 60-degree dispersion prism may be used.
  • Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent flat substrate”.
  • optical filter examples include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
  • a neutral density (ND) filter is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.
  • the “polarizing filter” is used to convert the laser light into P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
  • “Cut filters” are external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor), autofluorescence of the donor fluorescent substrate, and examples thereof include interference filters and color filters. It is done.
  • the “condensing lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system.
  • a simple condensing system a commercially available objective lens (manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be diverted.
  • the magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
  • the “SPFS detector” is preferably a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics) from the viewpoint of ultra-high sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.
  • Table 1 shows plasmon excitation using Alexa Fluor (registered trademark) 647 (in Table 1, conditions 1 to 4) and HiLyte Fluor (registered trademark) 647 (in Table 1, conditions 5 to 6) as fluorescent dyes, respectively.
  • Alexa Fluor registered trademark
  • HiLyte Fluor registered trademark
  • Table 2 also shows that the plasmon excitation sensor has a large ratio between “Signal” and “Noise”, and the value of “Signal” that changes depending on the amount of fluorescent dye is relatively large compared to “Noise”, and has high sensitivity. It is shown that it is possible to measure easily.
  • the signal value when observed from the CCD was “Noise” (plasmon scattering noise), and 10 nM Alexa Fluor (registered trademark) 647 aqueous solution was sent.
  • the numerical value of the fluorescence signal when observed from the CCD is “Signal”.
  • the plasmon excitation sensor 1 in Table 2 is manufactured as follows.
  • a glass transparent flat substrate (S-LAL 10 manufactured by OHARA INC.) Having a refractive index [nd] of 1.72 and a thickness of 1 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by sputtering. A gold thin film was further formed on the surface by sputtering.
  • the chromium thin film has a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film has a thickness of 44 to 52 nm.
  • the plasmon excitation sensor 2 is manufactured in the same manner as the plasmon excitation sensor 1 except that the resistance heating vapor deposition method is used instead of sputtering in the method of manufacturing the plasmon excitation sensor 1, and the plasmon excitation sensor 1 further increases plasmon scattering.
  • the plasmon excitation sensor 3 drops a salt concentration adjusting solution in which polystyrene fine particles (manufactured by Polysciences Inc.) having an average particle size of about 100 nm are dropped on the surface of the plasmon excitation sensor 2, and is allowed to stand for several minutes. The fine particles are adhered to the surface of the sensor by washing with MilliQ water.
  • the immunoassay of the present invention in a detection field by a plasmon excitation sensor, a fluorescent dye possessed by a free secondary antibody or a secondary antibody non-specifically bound to the primary antibody by fluorescence measurement using a plasmon enhancement field, Since FRET does not appear, it does not emit fluorescence or remains very weak (FIG. 2). Therefore, the fluorescence background noise is at a low level. Since only fluorescence derived from the formed immune complex can be detected, even a very small amount of immune complex can be detected with high sensitivity by enhanced fluorescence emission. In particular, when the reaction field that forms an immune complex and the detection field based on fluorescence emission are separated as described above, optimization of various conditions and suppression of noise and background levels can be achieved very effectively. In this sense, the mode 1 or mode 2 in the step (a) is preferable.
  • the system of the present invention is a set of apparatuses for performing the assay method of the present invention using the plasmon excitation sensor. That is, at least, A primary antibody bound to a fluorescent dye serving as a donor molecule, which is immobilized on a metal thin film substrate of a plasmon excitation sensor, A secondary antibody to which a fluorescent dye serving as an acceptor molecule is bound, A plasmon excitation sensor, a light source for surface plasmon excitation fluorescence method, and a fluorescence detector, and cause a sandwich-type antigen-antibody reaction between both the primary antibody and the secondary antibody and the antigen contained in the specimen.
  • the plasmon excitation sensor emits light by fluorescence resonance energy transfer from the fluorescent dye of the primary antibody excited by irradiating the immune complex immobilized on the metal thin film substrate with laser light by the surface plasmon excitation fluorescence method.
  • An immunoassay system characterized in that the amount of the antigen is measured by measuring the amount of fluorescence of the acceptor molecule.
  • the “device” of the system of the present invention includes at least a light source, various optical filters, a prism, a cut filter, a condensing lens, and an SPFS detector. It is preferable to have a liquid feeding system combined with a plasmon excitation sensor when handling a sample liquid, a washing liquid, a labeled antibody liquid, or the like.
  • a liquid feeding system for example, a microchannel device (for example, ⁇ -TAS) connected to a liquid feeding pump may be used.
  • a surface plasmon resonance (SPR) detection unit that is, a photodiode as a light receiving sensor dedicated to SPR, an angle variable unit for adjusting the optimum angle of SPR and SPFS (to determine total reflection attenuation (ATR) conditions with a servomotor)
  • the photodiode and the light source can be synchronized with each other so that the angle can be changed by 45 to 85 °.
  • the resolution is preferably 0.01 ° or more.
  • Data processing for processing the information input to the SPFS detector A computer may also be included.
  • Preferred modes of the light source, the optical filter, the cut filter, the condensing lens, and the SPFS detection unit are the same as those described above.
  • liquid feed pump for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feed, a syringe pump with high feed accuracy and low pulsation, which is preferable but cannot be circulated, a simple and excellent handleability but a small amount of liquid feed
  • a tube pump may be difficult.
  • the kit of the present invention is characterized in that it is used for the immunoassay of the present invention, and in addition to the primary antibody and the secondary antibody, all the necessary antibodies are required for carrying out the assay of the present invention. It is preferable to include.
  • kits Including at least a plasmon excitation sensor, a primary antibody bound to a fluorescent dye serving as a donor molecule, which is an antibody immobilized on the surface of the metal thin film substrate, and a secondary antibody bound to a fluorescent dye serving as an acceptor molecule,
  • a kit used for carrying out the step of forming an immune complex by causing a sandwich-type antigen-antibody reaction between the primary antibody, the antigen in the specimen, and the secondary antibody is shown. It is.
  • the metal thin film that is a member of the plasmon excitation sensor is formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum.
  • a more preferable metal thin film is a gold thin film.
  • the plasmon excitation sensor is composed of the metal thin film and the transparent flat substrate, and further has a spacer layer, and the spacer layer is formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate.
  • the embodiment is preferred.
  • the configuration, installation method, significance, and the like of such a spacer layer are as described above.
  • Such a spacer layer is preferably a SAM (Self Assembled Monolayer).
  • kits As a component of the “kit” of the present invention, specifically, in addition to a plasmon excitation sensor in which a metal thin film is formed on one surface of a transparent flat substrate, a lysis solution or dilution solution for dissolving or diluting a specimen; antibody Various reaction reagents and washing reagents for reacting the analyte with the analyte, and various equipment or materials required for carrying out the assay method of the present invention can also be included. Further, as a kit element, a standard material for preparing a calibration curve, a manual, a necessary set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneously processing a large number of samples may be included.
  • the FRET technique is applied by labeling two types of antibodies (primary and secondary antibodies that are binding partners) with fluorescent dyes that form a FRET donor-acceptor pair.
  • primary and secondary antibodies that are binding partners
  • fluorescent dyes that form a FRET donor-acceptor pair.
  • an immune complex is formed between the antigen and the antibody in the specimen. If the binding partner and the analyte are relatively small in such an immune complex, the fluorophores may come close to each other, resulting in the desired measurable FRET signal. Be expected.
  • a short distance (1-10 nm) between the donor molecule and the acceptor molecule is required as described above.
  • the distance between the donor molecule and the acceptor molecule present in the formed immune complex is further set to about 10 nm.
  • the fluorescent dyes of the two antibodies need to be oriented (or juxtaposed) with each other so that they are suitable for FRET. A device for realizing such precise molecular orientation is required.
  • a complete antibody is a large Y-type protein molecule, and due to its length (30-40 nm) and the flexibility of the antibody hinge region, antibody molecules will be conjugated at relatively large intervals.
  • Antibody flexibility may reduce the possibility of energy transfer between a pair of dyes bound to side-by-side antibodies.
  • the size of the antibody or fluorescent dye may interfere with energy transfer through the negative steric effect exerted.
  • the fluorescent dye moiety can be attached to a different part of the antibody molecule. Depending on such sites, the spatial orientation of the dye in the antibody molecule can be advantageous or inconvenient with respect to energy transfer efficiency.
  • the parallel May not necessarily be sufficient to achieve effective energy transfer between the dyes attached to the prepared antibody, eg, between the fluorescent dye-conjugated antibodies.
  • the donor and acceptor molecules must be in close proximity, typically 0.2 to 10 nm.
  • the following measures can be taken as a measure for obtaining the FRET signal as a desired intensity.
  • the antibody is fragmented (Fab) and the molecular size is reduced to reduce the fluctuation of the molecular structure, thereby reducing FRET inhibition.
  • the distance between the labeled fluorescent dyes can be shortened.
  • the antibody is reduced, and fluorescent labeling is performed using the SH group appearing in the Fc part of the antibody.
  • the labeling rate per molecule may be lower than the method using amino groups, but since the position of the SH group is fixed, the labeling position can be determined (if there is another free SH) This is also labeled).
  • the fluorescent dye can be labeled near the center of the antibody molecule, the distance between the dyes can be shortened.
  • Such a binding reactive group makes it possible to adjust the alignment between the antibodies so as to increase the possibility of energy transfer between the dyes.
  • Use of such an antibody set may dramatically increase the probability of energy transfer compared to the use of an antibody set without a binding reactive group.
  • Spatial structure here refers not only to the spacing between the dyes but also to their relative orientation.
  • Modulating the spatial structure between antibodies includes modulating and stabilizing the spatial structure of the dye.
  • the conjugating reactive groups can bring the dyes into an interval within 10 nm of each other, more preferably within an interval of within 5 nm, and most preferably within an interval of within 2 nm of each other.
  • the linking reactive group is small, for example smaller than 10 kilodalton (kDa), preferably smaller than 5 kDa, more preferably smaller than 2 kDa, or most preferably smaller than 1 kDa (US Pat. ).
  • Biotin- (strept) avidin system is preferable as an example of the above-mentioned binding reactive group added to an antibody and adjusting the spatial arrangement of fluorescent dyes. This conjugation reactive group is advantageous to achieve close spacing between the fluorescent dye pairs.
  • Biotin can bind proteins with small molecules having a molecular weight of only 244 daltons (Da).
  • Da daltons
  • DNA or polynucleotide of an appropriate size may be introduced as a binding reaction group as described below, and hybridization thereof may be used.
  • Method 1 using DNA A primary antibody is labeled with a DNA-donor dye, and a secondary antibody is labeled with a complementary strand DNA-acceptor molecule. 2) Immobilize the primary antibody on the substrate. 3) The primary antibody is reacted with an antigen and then a secondary antibody to form an immune complex, which is immobilized on the substrate via the primary antibody. Alternatively, the immune complex may be immobilized by bringing a reaction solution of the secondary antibody and the specimen (a reaction solution containing a complex of the antigen and the secondary antibody) into contact with the substrate.
  • conditions conditions such as salt concentration and temperature
  • conditions that “immune complexes are formed but DNA hybridization does not occur” are set. For example, when the salt concentration is low, hybridization does not occur.
  • 4) Remove unreacted secondary antibody with wash buffer.
  • conditions for example, salt concentration, temperature
  • the salt concentration is preferably about 150 mM.
  • Hybridization occurs between the primary antibody DNA-donor dye and the secondary antibody complementary-strand DNA-acceptor dye, and FRET is expressed between the donor dye and the acceptor dye.
  • DNA-complementary strand DNA hybridization need not be specific (for example, as in SNP analysis), and may be within a certain distance from the nearby one.
  • 1) and 2) are the same, but the steps after 3) may be changed as follows.
  • the primary antibody is reacted with an antigen and then a secondary antibody to form an immune complex, which is immobilized on the substrate via the primary antibody.
  • the immune complex may be immobilized by bringing a reaction solution of the secondary antibody and the specimen (a reaction solution containing a complex of the antigen and the secondary antibody) into contact with the substrate.
  • the DNA and the complementary strand DNA hybridize regardless of the presence or absence of immune complex formation.
  • Set conditions for example, salt concentration, temperature
  • Unreacted secondary antibody not forming an immune complex is removed with a washing buffer. At this time, the hybridization between the DNA forming the immune complex and the complementary strand DNA is once dissociated. 5) Set conditions (for example, salt concentration, temperature) for “maintaining immune complexes and allowing DNA to hybridize”, and apply the conditions. 6) The DNA and the complementary strand DNA hybridize with the nearest neighbors.
  • the primary antibody and the DNA labeled with the secondary antibody that are closer to each other due to the formation of an immune complex preferentially hybridize, and FRET is expressed between the donor dye and the acceptor dye.
  • the above 1) to 4) are the same, but the steps after 5) are as follows.
  • a buffer solution containing a protein denaturant (such as urea) and having a high salt concentration is developed on the substrate.
  • a protein denaturant such as urea
  • the DNA on the substrate and the complementary strand DNA are not affected by the three-dimensional structure and hybridize with high probability.
  • the primary antibody does not come off if it is immobilized on the substrate by a covalent bond. Also, DNA is not detached from the substrate even under denaturing conditions as long as it is covalently bound to the antibody molecule. In contrast, the secondary antibody may be released.
  • the complementary strand DNA that has been bound to the secondary antibody may be removed from the antibody molecule.
  • the primary antibody DNA-donor dye immobilized on the substrate and the secondary antibody-derived complementary DNA-acceptor dye are hybridized, and FRET is expressed between the donor dye and the acceptor dye.
  • the primary antibody, specimen and secondary antibody are reacted in advance, and the formed immune complex is then contacted with a (plasmon excitation sensor) metal thin film substrate to bind the primary antibody of the immune complex onto the substrate.
  • a (plasmon excitation sensor) metal thin film substrate to bind the primary antibody of the immune complex onto the substrate.
  • conditions for example, salt concentration, temperature
  • DNA is hybridized after the immobilization. do it.
  • a preferred form of the assay of the present invention is an embodiment in which an immune reaction field and a fluorescence detection field are separated. That is, in the immune reaction field, the primary antibody labeled with the donor molecule recognizes and binds to the target antigen contained in the specimen, and the secondary antibody labeled with the acceptor molecule also recognizes another epitope of the antigen. Binding, resulting in the formation of a sandwich-type immune complex.
  • the reaction product of these antigens and both antibodies is then applied to a plasmon excitation sensor.
  • the binding group of the primary antibody Fc base is captured by the tethering binding group provided on the surface of the metal thin film substrate, and the sandwich-type immune complex is immobilized on the metal thin film substrate (the above step (a )).
  • a washing operation with a washing buffer may be performed.
  • the detection field of the assay includes a glass transparent flat substrate, a metal thin film formed on one surface of the substrate, and a spacer layer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate.
  • the sandwich-type immune complex that is immobilized in contact with the surface on the spacer layer side is irradiated with a laser beam via a prism from the other surface of the substrate on which the thin film is not formed.
  • Primary antibody donor molecules emit light when excited by surface plasmons.
  • a fluorescent dye (acceptor molecule) bound to the secondary antibody by FRET expression is excited to emit light. Since only the immune complex thus formed emits enhanced fluorescence, this is detected and the amount of fluorescence is measured (step (b) above).
  • the substrate thus obtained is immersed in an ethanol solution containing 1 mM 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (Self Assembled Monolayer) on one side of the gold thin film. did.
  • the substrate was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm is provided on the surface of the SAM, and the substrate is arranged so that the SAM surface is inside the flow path (however, the silicon rubber spacer is used for liquid feeding).
  • the pressure-sensitive adhesive sheet was pressed from the outside of the flow path, and the flow path sheet and the plasmon excitation sensor were fixed with screws.
  • the obtained biotinylated anti-AFP monoclonal antibody solution and the streptavidin-labeled Alexa Fluor (registered trademark) 647 (Molecular Probes) solution are mixed and reacted by stirring at 4 ° C. for 60 minutes. It was. Subsequently, the unreacted antibody and the unreacted enzyme were purified using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore) to obtain an Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-AFP monoclonal antibody solution. The obtained antibody solution was stored at 4 ° C. after the protein amount was quantified.
  • the Cy5.5 (registered trademark) -labeled anti-AFP monoclonal antibody solution was obtained by purifying the unreacted antibody and the unreacted enzyme using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore). The obtained antibody solution was stored at 4 ° C. after protein quantification.
  • Example 1 (Production of plasmon excitation sensor) A plasmon excitation sensor is prepared in the same manner as in [Preparation Example 1], and the primary antibody is immobilized.
  • ultrapure water was circulated with a peristaltic pump at room temperature and a flow rate of 500 ⁇ L / min for 10 minutes, followed by PBS for 20 minutes.
  • 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM water-soluble carbodiimide (WSC) was fed and circulated for 20 minutes, and then the method of [Preparation Example 2]
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • a non-specific adsorption prevention treatment is performed by circulating the solution for 30 minutes in PBS buffered saline containing 1% bovine serum albumin (BSA), and a plasma excitation sensor is prepared using SPFS. The assay was performed.
  • BSA bovine serum albumin
  • Washing step Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 20 minutes.
  • blank fluorescence is used, LD laser is used as a light source, laser light having a wavelength of 635 nm is adjusted with an optical filter: (Sigma Kogyo Co., Ltd.), and the amount of photons is adjusted.
  • a cut filter (Sigma Kogyo Co., Ltd.), a 20 ⁇ objective lens as a condenser lens It was detected by a CCD image sensor (manufactured by Texas Instruments) using Nikon Corporation.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • Example 2 (Production of plasmon excitation sensor) It was produced in the same manner as in Example 1.
  • Washing step Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 20 minutes.
  • blank fluorescence is used, LD laser is used as a light source, laser light having a wavelength of 635 nm is adjusted with an optical filter: (Sigma Kogyo Co., Ltd.), and the amount of photons is adjusted.
  • a cut filter (Sigma Kogyo Co., Ltd.), a 20 ⁇ objective lens as a condenser lens It was detected by a CCD image sensor (manufactured by Texas Instruments) using Nikon Corporation.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • Washing step Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.
  • ultrapure water was circulated with a peristaltic pump at room temperature and a flow rate of 500 ⁇ L / min for 10 minutes followed by PBS for 20 minutes.
  • 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM water-soluble carbodiimide (WSC) was fed and circulated for 20 minutes, followed by anti- ⁇ -fetoprotein (AFP) monoclonal.
  • the primary antibody was solid-phased on the SAM by circulating 2.5 mL of an antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Clinical Laboratory Laboratories) solution for 30 minutes.
  • a non-specific adsorption prevention treatment is performed by circulating the solution for 30 minutes in PBS buffered saline containing 1% bovine serum albumin (BSA), and a plasma excitation sensor is prepared using SPFS. The assay was performed.
  • BSA bovine serum albumin
  • Washing step Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 20 minutes.
  • blank fluorescence is used, LD laser is used as a light source, laser light having a wavelength of 635 nm is adjusted with an optical filter: (Sigma Kogyo Co., Ltd.), and the amount of photons is adjusted.
  • a cut filter (Sigma Kogyo Co., Ltd.), a 20 ⁇ objective lens as a condenser lens It was detected by a CCD image sensor (manufactured by Texas Instruments) using Nikon Corporation.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • Washing step Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.
  • Example 2 was obtained by adding a washing operation to the assay process of Example 1, but the assay signal was slightly lower than that of Example 1 due to the addition of the washing operation. However, since the assay signal noise hardly changes, it is considered that there is almost no increase in the assay signal due to nonspecific adsorption in Example 1. From this, it is considered that the decrease in the assay signal originates from the fact that the equilibrium state of the immune complex changes due to the replacement of the reaction solution by the washing operation, and the secondary antibody gradually dissociates. .
  • the assay signal is reduced by about 20% compared to the assay signal of the fluorescence labeled SPFS measurement shown in Comparative Example 1. This is considered to be the effect of insufficient FRET efficiency, and further improvement can be expected by optimizing the FRET efficiency.
  • the assay method of the present invention is a method capable of detecting a target antigen with high sensitivity and high accuracy, for example, even a trace amount of tumor marker contained in blood can be detected, From this result, the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.

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Abstract

［課題］ＦＲＥＴおよびＳＰＦＳを利用した免疫アッセイの提供。 ［解決手段］本発明は、ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体およびアクセプター分子となる蛍光色素を結合した二次抗体を用いて検体中の抗原量を測定する免疫アッセイ方法であって、少なくとも、工程（ａ）：検体中に含まれる抗原と上記の一次抗体および二次抗体の両抗体との間で抗原抗体反応を生じさせ、両抗体により該抗原がサンドイッチされた免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させる工程、工程（ｂ）：形成された前記免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法（ＳＰＦＳ）によりレーザ光を照射し、該一次抗体の励起されたドナー分子蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定する工程、を含む。さらに本免疫アッセイ用のシステムおよびアッセイキットも含まれる。

Description

表面プラズモンおよび蛍光共鳴エネルギー転移を利用した免疫アッセイ
　本発明は、表面プラズモンおよび蛍光共鳴エネルギー転移を利用した免疫アッセイ法、そのアッセイ用のシステムおよびキットに関する。さらに詳しくは、本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の原理に基づく表面プラズモンを利用し、蛍光検出にＦＲＥＴ技術を適用した免疫アッセイ法などに関する。
　表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍～数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させて、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
　このようなＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサまたはバイオチップに関する例として、特許文献１には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いた一次抗体固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で、抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が開示されている。しかしながら、極微量のアナライト(例えば標的抗原)の検出においては、アッセイで抗原に関係付けられる複合体中の蛍光色素量も極微量であり、このことが蛍光発生量のボトルネックとなるため、プラズモン電場増強を用いても蛍光シグナル量が増強されず、アッセイ感度の向上は難しい。
　特許文献２では、センサ基板上でアポ酵素、ホロ酵素による反応と免疫反応とを複雑に組み合わせ、シグナルの増幅および非特異反応の低減を検討している。このような測定系を成立させるために極めて精密な分子配向技術が前提となっており、免疫反応よりもアポ／ホロ酵素反応が優先的または支配的な場合には、測定系そのものが成立しない危険性が高い。
　他方、近接して相互作用する分子を蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）現象を利用して高感度で検出するための手法が知られ、蛍光プローブとして特異的な結合ペアを形成する２つの分子を用いるＦＲＥＴ技術が確立されている（特許文献３，４、蛍光共鳴エネルギー転移の詳細については、非特許文献１を参照されたい）。ＦＲＥＴでは、励起されたフルオロフォア（ドナー）からのエネルギーが、分子間の双極子-双極子カップリングを介してもう一つのフルオロフォア（アクセプター）へと移される。これは、ドナーとアクセプターの間の距離が短く（10～100Å）、ドナーのスペクトルとアクセプターの吸収スペクトルが部分的に重複する蛍光である場合にのみ可能となる。次いで、エネルギー転移は、蛍光の変化として検出される。
特許第３２９４６０５号公報 特開２００８－１３９２４５号公報 特表２００６－５０５７７５号公報 特表２００６－５０６６３４号公報
Szollosi, J. , Damjanovich, S., Matyus, L. (1998) Application of Fluorescence Resonance Energy Transfer in the Clinical Laboratory: Routine and Research. Communications in Clinical Cytometry, 34: 159-179.
　本発明者らは、従来のサンドイッチイムノアッセイ法（図１）が抱える問題、すなわち、極微量のアナライト（例えば抗原）を検出する場合、通常のサンドイッチイムノアッセイ法を行っても免疫複合体自体も必然的に極微量となるため、しばしばその検出能力に見合う蛍光プローブ量が存在せず、よって感度的に満足するものとはならないという問題を解決すべく鋭意研究した。その結果、従来のサンドイッチイムノアッセイ法（図１）における検出方法に代えて、抗原抗体反応により形成された免疫複合体を表面プラズモン励起増強蛍光分析法（ＳＰＦＳ）で検出する方式を採用するとともに、ＦＲＥＴ技術に基づく発光増強を実現することにより実質的に免疫複合体のみが発光する機構で構成する本発明のアッセイ方法（図２）を完成した。
　本発明は、免疫アッセイに必要不可欠である特異性に優れ、かつ、好ましくは免疫反応場と検出場とを独立させて、表面プラズモンおよび蛍光共鳴エネルギー転移を組み合わせることにより、高感度・高精度であるアッセイ方法、そのアッセイ用のシステムおよびキットを提供することを目的とする。
　極微量の標的抗原であってもその免疫複合体の蛍光のみを特異的に増強して測定できる高感度アッセイ方法である本発明は、次の構成を有する。すなわち、
　ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体およびアクセプター分子となる蛍光色素を結合した二次抗体を用いて検体中の抗原量を測定する免疫アッセイ方法であって、少なくとも、
　工程（ａ）：検体中に含まれる抗原と上記の一次抗体および二次抗体の両抗体との間で抗原抗体反応を生じさせ、両抗体により該抗原がサンドイッチされた免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させる工程、
　工程（ｂ）：形成された前記免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法によりレーザ光を照射し、該一次抗体の励起されたドナー分子蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定する工程、
を含むことを特徴としている。
　前記工程（ａ）において、検体と該二次抗体とを接触させ、次いで抗原を結合した該二次抗体を、該一次抗体を固定化した金属薄膜基板に接触させることにより、前記免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させることが望ましい。あるいは、前記工程（ａ）において、該一次抗体を固定化した金属薄膜基板と検体とを接触させ、次に該基板に二次抗体を適用することにより、前記免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させてもよい。または前記工程（ａ）において、該一次抗体および該二次抗体と検体とを接触させて、形成された免疫複合体を金属薄膜基板に接触させることにより、前記免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させてもよい。
　前記のドナー分子およびアクセプター分子はＦＲＥＴペアであることが望ましい。好ましくはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）のペア群から選ばれるＦＲＥＴペアである。
　また前記金属薄膜基板は、透明平面基板とその一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの基板である。
　前記工程（ｂ）において、表面プラズモン励起蛍光法によるレーザ光の照射とは、プラズモン励起センサの金属薄膜を形成していないもう一方の透明基板表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射することである。
　本発明の別の態様は上記アッセイのためのキットであり、少なくとも、プラズモン励起センサ、その金属薄膜基板の表面上に固定化される抗体であってドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体、アクセプター分子となる蛍光色素が結合した二次抗体を含み、上記の免疫アッセイ方法において、該一次抗体、検体中の抗原、該二次抗体の間でサンドイッチ形式の抗原抗体反応を生じさせることにより免疫複合体を形成させる工程を実施するために用いられるキットである。
　前記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることが望ましい。
　さらに前記プラズモン励起センサが上記金属薄膜および透明平面基板から構成され、さらにスペーサ層を有して、該スペーサ層が、上記金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されることが好ましい。
　上記スペーサ層は、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）であることが望ましい。
　さらに本発明には、少なくとも、
プラズモン励起センサの金属薄膜基板上に固定化される、ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体、
アクセプター分子となる蛍光色素が結合した二次抗体、
プラズモン励起センサ、表面プラズモン励起蛍光法用の光源および蛍光検出器
を含み、該一次抗体および該二次抗体の両抗体と検体中に含まれる抗原との間でサンドイッチ形式の抗原抗体反応を生じさせ、プラズモン励起センサ金属薄膜基板上に固定化された免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法によりレーザ光を照射して励起された該一次抗体の蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定することにより該抗原量を測定することを特徴とする免疫アッセイシステムも含まれる。
　極微量のアナライトを検出する際、従来のサンドイッチイムノアッセイ法では蛍光シグナル量が少なく相対的にバックグラウンドノイズが増えるために、Ｓ／Ｎ比が劣化していた。また検出システムにＳＰＦＳを導入しても、表面プラズモンの電場増強（電場増強フォトン量の例）と極微量アナライトの蛍光色素量（蛍光フォトン量の例）のミスマッチが起こり、感度の限界が生じる可能性があった。
　これに対して本発明の免疫アッセイ法では、プラズモン励起センサによる検出（ＳＰＦＳ）においてＦＲＥＴ技術に基づく発光増強を実現することによって実質的に免疫複合体のみが発光する機構を設けている。さらに免疫反応場と検出場とを独立させることが望ましい。これによって励起波長と蛍光波長との差が拡大して免疫複合体から発光する蛍光シグナルが多くなり、他方、免疫反応に関与していない二次抗体などの蛍光は検出されないためにバックグラウンドノイズが減少して、高Ｓ／Ｎ比のアッセイが可能となる。具体的には本発明のアッセイにおいて、１リットル当り１０-18モル（１ａｍｏｌ/Ｌ）～１０-12モル（１ｐｍｏｌ/Ｌ）レベルの濃度のアナライト（例えば、標的抗原）を含む検体から、高感度かつ高精度でそのアナライトを検出できる。
　ＦＲＥＴペアは互いに１０ｎｍ以上離れると、ＦＲＥＴは消失して二次抗体上のアクセプターの発光は著しく減衰する。したがってドナー／アクセプターのペアが適切な距離にある場合に発現するＦＲＥＴを介して、免疫複合体に由来する蛍光のみを実質的に検出することとなり、洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）は不要となる。
　本発明のアッセイは、免疫反応場と蛍光検出場との完全分離が可能であることから免疫反応条件および検出条件の最適化が別々にできて、散乱ノイズ、バックグラウンドノイズの影響を受けにくい。さらに、３つの感度増幅機構、すなわち免疫反応の最適化、化学的増幅および物理的増幅を有するため、極めて高感度・高精度のＳＰＦＳ／ＦＲＥＴ免疫アッセイ法を提供することができる。
図１は、従来のサンドイッチイムノアッセイを模式的に示した図である。蛍光色素（50）は二次抗体(40,41,42)のみに標識されている。この場合、励起(100)によって非特異的に結合した二次抗体(42)、遊離の二次抗体(41)の蛍光色素（50）も発光してしまうため、ノイズ(300)が増大する。このため洗浄操作が必要となる。 図２は、本発明のＳＰＦＳ/ＦＲＥＴ利用のサンドイッチイムノアッセイを模式的に示した図である。一次抗体(20)および二次抗体(40,41,42)はそれぞれ、ドナー分子となる蛍光色素（60）およびアクセプター分子となる蛍光色素（70）で標識されている。検出対象である免疫複合体(500)が形成されたときのみ、一次抗体(20)の励起(100)された蛍光色素（60）から、適切な距離で配向している二次抗体(40)の蛍光色素（70）にエネルギーが転移して蛍光を発する（ＦＲＥＴ(400)）。この蛍光を測定することにより免疫複合体(500)のみの検出(200)が可能となる。一方、遊離の二次抗体(41)および非特異結合の二次抗体(42)からは発光しない。また、ノイズ(300)となる、一次抗体(20)の蛍光色素（60）から発光された蛍光は、この場合フィルタにより分離することができる。
　本明細書で、「アナライト」とはアッセイ対象とする物質、すなわち被検物質であり、主に「抗原」とされる比較的大きな分子を指すが、他方、薬物、代謝物質、各種環境ハザード物質などの低分子量の化合物（ハプテン）も標的になり得る。また「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電場効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
　表面プラズモン励起増強蛍光分光法または表面プラズモン励起蛍光法（Surface Plasmon‐field enhanced Fluorescence Spectroscopy）をＳＰＦＳと、また蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence resonance energy transfer）をＦＲＥＴと言及することもある。
　＜免疫アッセイ法＞
　本発明の免疫アッセイ方法は、
　ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体およびアクセプター分子となる蛍光色素を結合した二次抗体を用いて検体中の抗原量を測定する免疫アッセイ方法であって、少なくとも、
　工程（ａ）：検体中に含まれる抗原と上記の一次抗体および二次抗体の両抗体との間で抗原抗体反応を生じさせ、両抗体により該抗原がサンドイッチされた免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させる工程、
　工程（ｂ）：形成された前記免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法によりレーザ光を照射し、該一次抗体の励起されたドナー分子蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定する工程、
を含むことを特徴としている。
　検体中の抗原、一次抗体および二次抗体との間で抗原抗体反応が生起すると、両抗体によって該抗原がサンドイッチされている特異的な免疫複合体が形成される。本アッセイの後半段階は、このように形成された免疫複合体を高感度で検出することである。すなわち、該免疫複合体が極微量であってもそれのみを特異的に検出することを目的としてＳＰＦＳによりドナー分子の蛍光色素を励起させる。該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を該免疫複合体に照射し、励起されたドナー分子の蛍光色素とアクセプター分子との間にＦＲＥＴ現象を発現させる。このＦＲＥＴにより励起された二次抗体のアクセプター分子の蛍光をプラズモン励起センサにより検出し、発光された蛍光量を求める。
　　抗原抗体反応
　本発明の免疫アッセイ方法は、上記のとおり形成された免疫複合体をＳＰＦＳ/ＦＲＥＴにより高感度で検出する方式をとるが、ＦＲＥＴ発現のためにドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体およびアクセプター分子となる蛍光色素を結合した二次抗体を用いる。
　本発明のアッセイに使用される一次抗体は、検体中に含有されるアナライト（例えば標的とする抗原）を認識して結合し得る抗体である。同時にその一次抗体は、上記ＦＲＥＴドナー分子となる蛍光色素を結合している。さらに該一次抗体はプラズモン励起センサを構成する金属薄膜基板の表面、好ましくはスペーサ層、例えばＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）に固定化されているか、あるいは蛍光検出時に基板に固定化される（図２）。
　本発明において二次抗体は、一次抗体と同じ標的抗原に対する特異的な抗体であり、上記ＦＲＥＴアクセプター分子となる蛍光色素を結合している。二次抗体は同じ標的抗原のエピトープ（ただし、上記一次抗体とは異なるエピトープ）を認識して結合する。このように同一抗原の異なる部位に一次抗体と二次抗体がそれぞれ特異的に結合してサンドイッチ型免疫複合体を形成させ、このものをプラズモン励起センサを構成する金属薄膜基板の表面に固定化することが、本免疫アッセイの前半の工程である。二次抗体が、標的抗原ではなく一次抗体に非特異的に結合することもあるが、この場合ＦＲＥＴが発現しないようにする必要がある。
　本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。例えば抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９－９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
　二次抗体は、プラズモン励起センサに固定化される一次抗体がポリクローナル抗体である場合、二次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。該一次抗体がモノクローナル抗体である場合、二次抗体は、該一次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。例えば、プラズモン励起センサに固定化される一次抗体が、ＡＦＰモノクローナル抗体である場合、それと結合する二次抗体としては、検体中に含有されるＡＦＰに競合する抗原を認識し結合することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を必要とする。
　好適な例として、各１対のＨ鎖及びＬ鎖からなる免疫グロブリン（抗体）、そのＦａｂ（抗原結合性フラグメント）、またはこれらに準ずる、有効なエピトープ親和性を示すタンパク質フラグメントを挙げることができる。
　なお、アナライトが抗原の異なるエピトープとして認識されることが困難な低分子量の物質（ハプテンなど）である場合、抗体に代わってその断片であるＦａｂ、ｓｃＦｖなどを結合パートナーとして用いることが望ましい。そのような非競合的免疫アッセイ法の詳細は、特許文献４に開示されている。
　「検体」は、生体試料、環境試料などを本アッセイに必要とされる前処理したものをいう。試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望する溶媒、緩衝液などによって適宜希釈して用いてもよい。これらの試料のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独でも、２種併用してもよい。
　上記検体中に含有される抗原は、二次抗体および上記基板表面に固定化された（または固定化される）一次抗体により特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片である。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）など、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖など）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）といったがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
　本発明の免疫アッセイ方法における抗原抗体反応は、まず上記検体と抗体とを接触させて抗原抗体反応を生起せしめる。この場合、反応物をインキュベートする場合の条件として、温度は、通常４～５０℃、好ましくは１０～４０℃、時間としては、通常０．５～１８０分間、好ましくは５～６０分間である。なお検体が多数の場合、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも同時に実施する場合には、マルチウエルプレート上で行うのが好都合である。
　・免疫複合体の形成
　形成された免疫複合体をプラズモン励起センサ金属薄膜基板上に固定化させる工程（ａ）において、抗原抗体反応を生起せしめるためには次に述べる３通りの態様がある。まず、予め免疫複合体を生成させておく２つの態様として、
　前記工程（ａ）において、検体と該二次抗体とを接触させ、次いで抗原を結合した該二次抗体を、該一次抗体を固定化した（プラズモン励起センサの）金属薄膜基板に接触させることにより、前記免疫複合体を（プラズモン励起センサの）金属薄膜基板上に固定化させる方式と、
　前記工程（ａ）において、該一次抗体および該二次抗体と検体とを接触させて、形成された免疫複合体を（プラズモン励起センサの）金属薄膜基板に接触させることにより、前記免疫複合体を（プラズモン励起センサの）金属薄膜基板上に固定化させる方式である。この二番目の方式では形成された免疫複合体は、該一次抗体と（プラズモン励起センサの）金属薄膜基板上またはスペーサ層上にある結合パートナーとの間に起こる何らかの相互作用によって固定化される。その相互作用とは、例えば金－Ｓ結合、ビオチン－（ストレプト）アビジン、該一次抗体に対する抗体であってもよい。
　上記の「接触」とは、プラズモン励起センサの一次抗体が固定化されている面が適用もしくは送液された液体（反応液）中に浸漬されている状態であり、具体的には、この該液体中に含まれる免疫複合体をこのプラズモン励起センサの金属薄膜基板またはスペーサ層と接触させることをいう。その具体的な方法は、下記「プラズモン励起センサ」の項で詳しく述べる。工程（ｂ）では、上記反応液とプラズモン励起センサとの「接触」は、例えば流路中に循環する送液に形成された免疫複合体が含まれ、プラズモン励起センサの一次抗体が固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと工程（ａ）の反応液とを接触させる態様が好ましい。これはプラズモン励起センサを流路に固定させてその一次抗体が固定化されている面が流路の一部となるように構成することにより容易に実現される。
　一番目の方式は、上記一次抗体を安定的に基板表面に固定化する必要がある場合に採用されるべきである。二番目の方式は、二次抗体と免疫複合体を形成している一次抗体を基板表面が容易に結合させ得る性状にあるか、後記のスペーサを設置してそのような状態にある場合には採用できる。一次抗体、二次抗体および抗原が、溶液中でそれぞれ遊離状態にあって抗原抗体反応を起こすため、立体障害などの妨害はないという特徴がある。
　またこれら両方式では、免疫反応場と形成された免疫複合体の検出場がそれぞれ独立しているという特徴がある。したがってＢ/Ｆ（結合／遊離）分離を目的とする洗浄操作が不要になる利点がある。それは蛍光のバックグランドノイズの減少に大いに貢献する。
　残るもう一つの方式は、従来のサンドイッチイムノアッセイの方式に類似しており、この場合、上記の一次抗体は固相抗体であって、
　該一次抗体を固定化した金属薄膜基板と検体とを接触させ、次に該基板に二次抗体を適用することにより、前記免疫複合体をプラズモン励起センサの金属薄膜基板上に固定化させる方式である。上記アクセプター分子の蛍光色素を結合させた二次抗体は、検体を接触させた上記プラズモン励起センサ金属薄膜基板に適用される。「該一次抗体を固定化した金属薄膜基板と検体とを接触させ、次に該基板に二次抗体を適用する」場合の「接触」は、上記した通りであり、「適用」とは、該基板に二次抗体を含む液を送液などによって接触させることである。
　検体液を上記基板（またはスペーサ層）に適用し、該基板を洗浄用緩衝液で洗浄してから、二次抗体溶液を、所定量、一次抗体が固定化されている該基板表面に添加して、一定時間、インキュベートすることが望ましい。検体中に含まれる抗原を結合した一次抗体と二次抗体の両抗体との間で抗原抗体反応が生じる。洗浄操作は、一次抗体を有する基板表面に検体を適用した後に該表面を洗浄する操作である。したがってその洗浄操作は、二次抗体の適用前および／または後に含まれることが好ましい。使用される洗浄液としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１～１重量％含有するものが望ましい。
　この態様は、上記一次抗体を安定的に基板表面に固定化する必要があり、さらに先に一次抗体と抗原とを結合させる方が好ましい場合に採用されるべきである。
　一次抗体がその表面に固定化された基板と検体とを接触させる条件として、温度は、通常４～５０℃、好ましくは１０～４０℃、時間としては、通常０．５～１８０分間、好ましくは５～６０分間である。
　形成された免疫複合体をプラズモン励起センサ金属薄膜基板上に固定化させる工程（ａ）において、その免疫複合体は、該金属薄膜基板の金属薄膜表面上に固定化される。後記のようにスペーサ層が設置されている場合には、そのスペーサ層表面に固定化されてもよい。上記プラズモン励起センサは金属薄膜および透明平面基板から構成されているが、さらにスペーサ層を、上記金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されることもある。
　所望の蛍光色素を一次抗体または二次抗体に結合させること、ならびに該一次抗体を基板上に固定化するためには種々の従来技術を利用すればよい。基板表面への一次抗体の固定化方法としては、基板表面にある末端官能基に応じた最適な架橋方法を選択することができる。また、基板表面の性状によっては、その表面に直接物理的に吸着させる方法も有効な手段として挙げられる。
　抗体への蛍光色素の標識は、従来から使用されているタンパク質の蛍光標識方法（例えば特開平６－１０９７３２号公報を参照のこと）を用いるが、蛍光色素分子と適当な架橋剤、例えば、シランカップリング剤などを反応させ、さらにこれを活性化させた抗体分子に結合させればよい。架橋剤の例としては、Ｎ－サクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネ－ト（ＳＰＤＰ）やその誘導体、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホサクシンイミドエステルやその誘導体などが挙げられる。
　具体的には蛍光色素が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と抗体タンパク質が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する抗体タンパク質および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法などが挙げられる。
　例えば一次抗体および二次抗体として免疫グロブリンを用い、そのＦｃ領域に対する結合能力を有する部位と標識の蛍光色素とを同時に有する上記の架橋物質を利用して、所望の蛍光色素を一次抗体または二次抗体に結合させればよい。
　　ＦＲＥＴ
　蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence resonance energy transfer）現象とは、近接して相互作用する分子（ドナー及びアクセプター分子）を検出する系において、色素（「ドナー」と称される。）が光源により励起された後に、そのエネルギーを別の色素（「アクセプター」と呼ばれる。）に転移する。エネルギー転移は、ドナー色素の放出スペクトルは、アクセプターの励起スペクトルと著しく重複する。２つの色素の著しく近接した並列は、一般的には、１００オングストローム（Å）よりも近く、好ましくは５０オングストロームよりも近く、さらに好ましくは１０オングストロームよりも近い（１オングストロームは０．１ナノメートルに等しい。）。ドナー／アクセプターペア間のエネルギー転移に不可欠である。ＦＲＥＴは、通常、ともに蛍光色素であるドナー色素およびアクセプター色素間の相互作用に基づく。
　ＦＲＥＴとして共鳴エネルギー転移を達成するためには、ドナー色素分子は光を吸収して、それを励起された電子の共鳴を通じて、第２の色素分子であるアクセプターに転移しなければならない。エネルギー転移を実行するために、ドナーの蛍光発光の波長は、アクセプターの励起波長よりも低くなければならず、すなわち、そのプロセスは、エネルギー的に「下り坂」でなければならない。
　ドナー分子、アクセプター分子として用いられる適切な蛍光色素の例は、フルオレセインラベルであり、たとえば、５－(および６)－カルボキシフルオレセイン(carboxyfluorescein)、５－または６－カルボキシフルオレセイン、６－(フルオレセイン)－５－(および６)－カルボキサミド（carboxamide）ヘキサン酸(hexanoic acid)およびフルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素、シアニン色素、たとえばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、任意に置換されたクマリン(coumarin)、Ｒ－フィコエリトリン(R-phycoerythrin)、アロフィコエリトリン(allophycoerythrin)、テキサスレッド(Texas Red)およびプリンストンレッド（Princeston Red）、ならびにＲ－フィコエリトリンおよびたとえばＣｙ５またはテキサスレッドの複合体である。さらにランタニド系錯体、例えばテルビウム、ユーロビウムなどのキレートの蛍光物質であってもよい。
　前記のドナー分子およびアクセプター分子はＦＲＥＴペアであることが望ましい。本発明におけるＦＲＥＴペアとしていずれのＦＲＥＴペアを用いてもよい。好ましいＦＲＥＴペア（ドナー分子／アクセプター分子）として、例えばＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）のペア群から選ばれる。Ｒ－ＰＥ／ＡＰＣペアは、９０％のＦＲＥＴ効率が、Ｒ－ＰＥおよびＡＰＣの寸法にもかかわらず達成され得るので、非常に期待できる。さらに、このＦＲＥＴペアは、４８８および６３２ｎｍで放射する構造において２つの一般的なレーザを利用して容易に検出され得る。しかし、本発明におけるＦＲＥＴペアはこれらの例に限定されるものではない。
　Wallac蛍光ランタニドキレートによる時間分解蛍光技術とＦＲＥＴ技術とを組み合わせたLANCEアッセイが知られている。時間分解蛍光イムノアッセイ技術とを応用したLANCE TR-FRETでは、ドナー標識（ユーロビウムキレート）とアクセプター標識（アロフィコシアニン、Allophycocyanin）とが相互に近接することに基づく。ユーロビウムキレートの励起されたエネルギーは非放射的な共鳴エネルギー転移によって、近距離にあるアクセプターにエネルギー転移をする。蛍光物質であるランタニドは長時間の励起状態にあるため、励起光によるアクセプターの直接励起により発生しうる短寿命の蛍光による非特異的バックグラウンドを回避することができる。
　下記「プラズモン励起センサ」が含む金属薄膜が、金を含む金属から形成されている場合、金の透過率や励起波長の観点から、１，３－ｄｉｃｌｏｒｏ－９，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｃｒｉｄｉｎｅ－２－ｏｎｅ－７－ｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＤＡＯ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）が好ましい。
　ドナー分子の自家蛍光波長は、その自家蛍光波長とＦＲＥＴに基づくアクセプター蛍光色素の蛍光波長との差が大きいほどバックグラウンドシグナルの影響を回避しやすく、結果的に高精度な測定が可能となるが、特に制限されるものではない。
　　工程（ｂ）：ＳＰＦＳ/ＦＲＥＴ
　形成された前記免疫複合体は、それを構成する一次抗体の蛍光をＳＰＦＳにより励起させ、次いでＦＲＥＴにより増強された二次抗体のアクセプター分子の蛍光発色を測定することにより定性的にまたは定量的にアッセイすることができる。
　上記透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該薄膜表面に、該工程（ａ）を経て得られた蛍光色素を接触させることにより、一次抗体に結合させたドナー分子蛍光色素を励起させる。かかる検出場は、好ましい態様では免疫反応場と完全に分離されている。これは上記抗原抗体反応において、１番目の方式と２番目の方式が該当するが、具体的には形成された免疫複合体を含む抗原抗体反応溶液をプラズモン励起センサ基板の薄膜表面またはスペーサ層表面に流すか、通過させる。したがって後記する流路系を適宜設けることにより、既知濃度の標準アナライト、コントロール、試料検体を含む多数の検体を迅速にアッセイすることも可能となる。またアッセイのハイスループット処理用態様として、μ－ＴＡＳ（Micro total Analysis System）形態をとってもよい。
　・表面プラズモン励起蛍光法（ＳＰＦＳ）
　ＳＰＦＳは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍～数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、高感度の蛍光測定を可能とする。
　「プラズモン励起センサ」とは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを有し、さらにスペーサ層を有することが好ましく、該スペーサ層が該金属薄膜の、該透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されることが望ましい。
　このようなプラズモン励起センサは、例えば、ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス（株）製のＢｉａｃｏｒｅシステムに用いられるセンサーチップなどのように基板と金薄膜とを有するもの、さらに該金薄膜にスペーサ層を形成したものも包含する。
　「透明平面基板」としては、ガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０～２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１～１０ｍｍ、より好ましくは０．５～５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
　なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ　ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎｄ〕1.８５）、（株）住田光学ガラス製のＫ－ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、Ｋ－ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）およびＫ－ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
　透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
　酸による洗浄処理としては、０．００１～１Ｎの塩酸中に、１～３時間浸漬することが好ましい。
　プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１～３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
　「金属薄膜」は、上記「透明平面基板」の一方の表面に形成され、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。また、表面金属薄膜としての金に親和性を有する基を一次抗体に結合させることが好ましい。例えばメルカプト基（-ＳＨ）、ジチオ基（-ＳＳ-）、スルホ基（-ＳＯ3Ｈ）、チオカルボキシ基（-Ｃ（Ｏ）ＳＨ）、ジチオカルボキシ基（-ＣＳＳＨ）、アミノ基（-ＮＨ2）またはヒドロキシル基（-ＯＨ）などが挙げられる。金に特に親和性が高い基は、メルカプト基、ジチオ基、スルホ基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基であり、特に好ましくはメルカプト基である。
　なお、上記「透明平面基板」としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
　透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。
　金属薄膜の厚さとしては、金：５～５００ｎｍ、銀：５～５００ｎｍ、アルミニウム：５～５００ｎｍ、銅：５～５００ｎｍ、白金：５～５００ｎｍ、およびそれらの合金：５～５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１～２０ｎｍが好ましい。
　電場増強効果の観点から、金：２０～７０ｎｍ、銀：２０～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０～７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１～３ｎｍがより好ましい。
　金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
　「スペーサ層」は、上記「金属薄膜」による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、該金属薄膜の、上記「透明平面基板」と接していないもう一方の表面に形成したものであって、例えば、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）、誘電体からなるものなどであってもよい。さらに、複合体を構成する一次抗体を介してプラズモン励起センサ表面に該免疫複合体を捕捉するために、スペーサ層にストレプトアビジンを結合するか、ストレプトアビジン化された部分を含めてもよい。上記一次抗体に結合させたビオチンとそのストレプトアビジンとが特異的に相互作用することにより、「捕捉による該一次抗体の固定化」が達成される。
　「ＳＡＭ」が含む単分子としては、通常、炭素原子数４～２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ　アルドリッチ　ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０－カルボキシ－１－デカンチオールが用いられる。炭素原子数４～２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
　ＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製平面基板を、１０－カルボキシ－１－デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０－カルボキシ－１－デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
　「誘電体」としては、光学的に透明な、各種の無機物、または天然もしくは合成ポリマーを用いることもでき、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ～１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０～２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ～１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ～１，６００ｎｍがより好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
　このような「プラズモン励起センサ」の金属薄膜基板の表面もしくはスペーサ層側表面に、上記工程（ａ）を経て得られた免疫複合体を接触させる方法としては、該蛍光色素を含有した溶液の滴下、吹付、塗布などの方法が挙げられる。また、プラズモン励起センサ上に下記のような流路を構成し、該蛍光色素を含有した溶液をプラズモン励起センサ表面に接触させるような方法も挙げられる。
　「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所の近傍は管状を有することが好ましい。
　その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体、ポリエチレン、ポリオレフィン等からなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン(登録商標)、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリマーを用いる。
　プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ～１ｍｍ程度が好ましい。
　流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビスなどの閉め具により固定する方法が好ましい。
　工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、または別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
　「送液」としては、検体を希釈する溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
　送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０～４０℃×１～６０分間、好ましくは３７℃×５～１５分間である。
　・蛍光量測定
　本アッセイの後半の工程は、上記免疫複合体が固定化されたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された二次抗体蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。上記工程で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライトの抗原量を算出する。
　より具体的には、表面プラズモン励起蛍光法によるレーザ光の照射は、プラズモン励起センサの金属薄膜を形成していないもう一方の透明基板表面から、プリズムを経由してレーザ光を上記免疫複合体に照射し、これにより該一次抗体の励起されたドナー分子蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）現象によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を求める。既知濃度の標的抗原での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて検体中の標的抗原の量を測定された蛍光量から算出することができる。
　レーザ光は、光学フィルタおよび偏光フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
　レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十～数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、基板となるガラスの屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０～２０倍の増加量となる。
　蛍光色素は光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
　「レーザ光」としては、波長２００～９００ｎｍ、０．００１～１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０～８００ｎｍ、０．０１～１００ｍＷの半導体レーザが好ましい。
　「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記「透明平面基板」と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
　「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
　「減光（ＮＤ）フィルタ」は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
　「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
　「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、ドナー蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
　「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（（株）ニコン製またはオリンパス（株）製）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０～１００倍が好ましい。
　「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
　表１に、蛍光色素として、それぞれＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（表１中、条件１～４）およびＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（表１中、条件５～６）を用いて、プラズモン励起センサによるＳＰＦＳ蛍光シグナルを示す。
　表１中でプラズモン励起センサに、それぞれ濃度調整した蛍光色素溶液を送液した条件におけるＣＣＤ観察時の蛍光シグナル値と、ＭｉｌｌｉＱ水を送液した条件におけるＣＣＤ観察時の蛍光シグナル値との差を、各濃度に調整した蛍光色素のＳＰＦＳシグナルとする。
　表１から、蛍光色素が極微量である溶液においても高感度な測定が実施できていることがわかる。この結果は、少なくとも蛍光色素が表１の程度に極微量存在する条件においても、測定が可能であることを示している。すなわち、本発明の免疫アッセイ法において、形成された免疫複合体の測定を通じて高感度な測定が可能であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、表２は、プラズモン励起センサが、「Ｓｉｇｎａｌ」と「Ｎｏｉｓｅ」との比が大きく、蛍光色素量により変化する「Ｓｉｇｎａｌ」の数値が「Ｎｏｉｓｅ」と比較して相対的に大きく、高感度な測定が可能となることを示している。
　なお、プラズモン励起センサに対して、ＭｉｌｌｉＱ水を送液した時に、ＣＣＤから観察したときのシグナル値を「Ｎｏｉｓｅ」（プラズモン散乱ノイズ）とし、１０ｎＭ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７水溶液を送液した時に、ＣＣＤから観察したときの蛍光シグナルの数値を「Ｓｉｇｎａｌ」とする。
　表２中のプラズモン励起センサ１は、以下のように作製するものである。
　屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ　１０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。なお、クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍである。
　プラズモン励起センサ２は、プラズモン励起センサ１の作製方法において、スパッタリングの代わりに抵抗加熱蒸着法を用いる以外はプラズモン励起センサ１と同様にして作製したものであって、プラズモン散乱をより増加させたものであり、プラズモン励起センサ３は、プラズモン励起センサ２の表面に、平均粒径約１００ｎｍのポリスチレン微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．社製）を分散させた塩濃度調整液を滴下し、数分間静置後、ＭｉｌｌｉＱ水にて洗浄することで、センサ表面に該微粒子を表面に付着させたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から、ＳｉｇｎａｌとＮｏｉｓｅの比（Ｓ／Ｎ比）は、Ｎｏｉｓｅの増加に伴い低下していることがわかる。すなわち、高感度な測定を実現するためには、プラズモン散乱ノイズができる限り小さなプラズモン励起センサが適していることが明らかである。
　また、プラズモン励起センサ３では金属箔膜状に固定化された粒子によってＮｏｉｓｅが大幅に上昇している。すなわち、プラズモン増強場を用いた蛍光測定においては、センサ表面に微粒子などが存在するとノイズが上昇してしまうことで、高感度な測定の実現が困難となることが明らかである。よって、プラズモン増強場を用いた蛍光測定において、免疫反応場と検出場の完全分離が高感度測定実現のための１つの解決策となる。
　本発明の免疫アッセイによるとプラズモン励起センサによる検出場において、プラズモン増強場を用いた蛍光測定により、遊離の二次抗体、または一次抗体に非特異的に結合した二次抗体が有する蛍光色素は、ＦＲＥＴが発現しないために蛍光を発しないか、極めて微弱の発光にとどまる（図２）。それゆえ、蛍光のバックグラウンドノイズが低いレベルである。形成された免疫複合体に由来する蛍光のみを検出することができるので、極微量の免疫複合体であっても増強された蛍光の発光により高感度で検出することを可能とする。特に、上記したように免疫複合体を形成する反応場と蛍光発光に基づく検出場とが分離していると、諸条件の最適化、ノイズおよびバックグラウンドのレベル抑制は極めて有効に達成できる。この意味で、工程（ａ）における上記方式１または方式２の態様が好適である。
　これに対して従来のサンドイッチ型免疫アッセイでは、二次抗体に蛍光色素を標識してそれを励起することにより検出をしている。本来、免疫複合体に由来する蛍光のみを検出したくとも、実際には非特異的に結合した、または遊離の二次抗体の蛍光色素も発光することは避けられないためにバックグラウンドのノイズが高くなる（図１）。そうしたノイズのレベルを充分に下げるためには、洗浄操作を行なってＢ/Ｆ分離することが必要となる。
　＜免疫アッセイシステム＞
　本発明のシステムは、本発明の装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するための装置一式である。すなわち、
　少なくとも、
プラズモン励起センサの金属薄膜基板上に固定化される、ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体、
アクセプター分子となる蛍光色素が結合した二次抗体、
プラズモン励起センサ、表面プラズモン励起蛍光法用の光源および蛍光検出器
を含み、該一次抗体および該二次抗体の両抗体と検体中に含まれる抗原との間でサンドイッチ形式の抗原抗体反応を生じさせ、プラズモン励起センサ金属薄膜基板上に固定化された免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法によりレーザ光を照射して励起された該一次抗体の蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定することにより該抗原量を測定することを特徴とする免疫アッセイシステムである。
　本発明システムの「装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合さった送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイス（例えばμ－ＴＡＳ）などでもよい。
　また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５～８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのデータ処理用コンピュータなども含んでもよい。
　光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上記したものと同様である。
　「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
　＜キット＞
　本発明のキットは、本発明の免疫アッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、一次抗体および二次抗体に加え、必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。好ましいキットとして、
　少なくとも、プラズモン励起センサ、その金属薄膜基板の表面上に固定化される抗体であってドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体、アクセプター分子となる蛍光色素が結合した二次抗体を含み、上記の免疫アッセイ方法において、該一次抗体、検体中の抗原、該二次抗体の間でサンドイッチ形式の抗原抗体反応を生じさせることにより免疫複合体を形成させる工程を実施するために用いられるキットが示される。
　プラズモン励起センサの部材である金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることが望ましい。より好ましい金属薄膜は金薄膜である。さらに上記プラズモン励起センサが、上記金属薄膜および透明平面基板から構成され、さらにスペーサ層を有して、該スペーサ層が、上記金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されている態様が好ましい。このようなスペーサ層の構成、設置する方法、意義などについては、上記したとおりである。そのような上記スペーサ層は、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）であることが望ましい。
　本発明の「キット」の構成要素として、具体的に、透明平面基板の一方の表面に金属薄膜を形成したプラズモン励起センサの他に、検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；抗体とアナライトとを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材などを含めることもできる。さらにキット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
　　ＦＲＥＴの問題点
　本発明においてＦＲＥＴ技術は、２種類の抗体（結合パートナーである一次、二次抗体）をＦＲＥＴドナー・アクセプターのペアを形成する蛍光色素でそれぞれ標識することによって適用される。検体を一次抗体、二次抗体と接触させることによって検体中の抗原と抗体間で免疫複合体が形成される。かかる免疫複合体において結合パートナーおよびアナライトが比較的小さい場合には、蛍光発色団（フルオロフォア）は互いに近傍まで接近して来て、その結果、所望の測定可能なＦＲＥＴシグナルが得られることが期待される。
　ドナー／アクセプターのペアが検出可能なＦＲＥＴ蛍光シグナルを誘導することを可能にするには、上記のようにドナー分子とアクセプター分子との間の距離（1～10ｎｍ）が短いことが要件とされる。しかしながら本発明が目的とする極微量のアナライトを極めて高感度で検出するためには、さらに、形成された免疫複合体に存在するドナー分子とアクセプター分子との間の距離を10ｎｍ前後と設定し、かつ２つの抗体の蛍光色素がＦＲＥＴに好適であるように互いに配向する（または並列する）必要がある。かかる精密な分子配向を実現するための工夫が必要とされる。
　・ＦＲＥＴ効果の最適化
　本発明のアッセイにおいては、上記のようにドナー／アクセプターのペアが測定可能なＦＲＥＴ蛍光シグナルを誘導することが免疫複合体を検出するための前提となる。
　完全な抗体は大きいＹ型タンパク質分子であって、その長さ（３０～４０ｎｍ）および抗体ヒンジ領域の柔軟性に起因して、抗体分子同士は、比較的大きい間隔でコンジュゲートするであろう。抗体の柔軟性は、並列している抗体に結合された色素のペア間でのエネルギー転移の可能性を減少させ得る。また、抗体または蛍光色素のサイズは、発揮する負の立体効果を介して、エネルギー転移に干渉するかも知れない。さらに抗体に蛍光色素を結合させる場合、一般的に複合化の部位を制御することは容易ではない。すなわち抗体複合体の場合において、蛍光色素部分は抗体分子の異なる部分に付着し得る。そのような部位次第で、抗体分子における色素の空間的配向は、エネルギー転移効率に関して、好都合にも不都合にもなり得る。したがって、ＦＲＥＴを誘導する分子どうしの近接した並列は、ドナー／アクセプターペア間のエネルギー転移のための要件である一方で、それは、相互作用する分子または複合体の部分である分子において、前記並列された抗体に付着された色素間、たとえば蛍光色素複合抗体間の有効なエネルギー転移を達成するためには必ずしも充分ではないかもしれない。
　ＦＲＥＴとしてのエネルギー転移が生じるための初期条件のうち、その１つはドナーおよびアクセプター分子が、極めて近接していなければならないことであり、典型的には０．２～１０ｎｍである。想定される上記問題点に鑑み、ＦＲＥＴシグナルを所望する強度として得られるようにする方策として、次の手段を採ることが可能である。
　１．抗体をフラグメント（Fab）化し、分子サイズを小さくすることで分子構造の揺らぎを減らしてＦＲＥＴ阻害を減らす。併せて、標識蛍光色素間の距離も短縮することができる。
　２．抗体を還元型にし、抗体のＦｃ部に現れるＳＨ基を利用して蛍光標識を行う。この場合、1分子当たりの標識率はアミノ基を利用する方法よりも下がる可能性があるが、SH基の位置は決まっているため、標識する位置を確定できる（他にフリーのSHがあれば、これも標識されるが）。さらに抗体分子の中央付近に蛍光色素を標識できるので、色素間の距離は短縮できる。
　３．上記エネルギー転移が生じる可能性の増加、および／またはエネルギー転移効率が増加するように、抗体分子においてＦＲＥＴの空間的構造を調節可能とする結合反応基を導入することにより抗体間の並列を安定化し、かつ／または高めることができる。
　そのような結合反応基は、色素間のエネルギー転移の可能性を高めるように、前記抗体間の並列を調節可能にする。このような抗体セットの使用は、結合反応基なしの抗体セットの使用と比較してエネルギー転移の確率を飛躍的に高めるかも知れない。ここでいう空間的構造とは、色素間の間隔のみならず、これらの相対的な配向の両方をいう。抗体間の空間的構造を調節することは、色素の空間的構造を調節かつ安定化させることを含む。結合反応基は、前記色素を、互いに１０ｎｍ以内の間隔に、より好ましくは５ｎｍ以内の間隔に、最も好ましくは互いに２ｎｍ以内の間隔に至らせることができる。したがって、好ましくは、結合反応基は、小さく、たとえば１０キロダルトン（ｋＤａ）よりも小さく、好ましくは５ｋＤａよりも小さく、より好ましくは２ｋＤａよりも小さく、または最も好ましくは１ｋＤａよりも小さい（特許文献３）。
　３－１．ビオチン－（ストレプト）アビジン系を用いる方法
　抗体中に付加され、蛍光色素の空間的配置を調節するための上記結合反応基の一例として、ビオチン－（ストレプト）アビジン系が好ましく、このような小さいサイズの結合反応基は、蛍光色素ペア間の近接した間隔を達成するのに好都合である。ビオチンは、僅か２４４ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する小分子でタンパク質と結合することができる。ビオチン複合体を調製するための種々の標準的な手順が、当業者に知られている。例えば、二次抗体にストレプトアビジンを結合させ、一次抗体にはビオチンを結合させると、共通の抗原を介する両抗体の複合体が形成される時に、これらの抗体の結合反応基であるビオチンとストレプトアビジンとが結合する。その結合形成に基づく空間的な再配置が起こる結果、両抗体の蛍光色素ペア間に近接配向を達成させる。さらに上記一次抗体のＦｃ基部にも、プラズモン励起センサの金属薄膜もしくはスペーサ層へ係留して固定化するための結合基を付けておくことも望ましい（この場合、該一次抗体は予め固定化されていてもよい）。
　あるいは、次のように結合反応基として適切な大きさのＤＮＡもしくはポリヌクレオチドを導入し、そのハイブリダイゼーションを利用してもよい。
　３－２．ＤＮＡを用いる方法
１）　一次抗体にＤＮＡ-ドナー色素、二次抗体に相補鎖ＤＮＡ-アクセプター分子を標識する。
２）　一次抗体を基板上に固定化する。
３）　前記一次抗体に抗原、次いで二次抗体を反応させて免疫複合体を形成させ、これを該一次抗体を介して基板に固定化させる。あるいは二次抗体と検体との反応液（抗原と二次抗体との複合体を含有する反応液）を前記基板に接触させて免疫複合体を固定化してもよい。
　このとき、通常の条件では免疫複合体形成の有無に拘らず、ＤＮＡと相補鎖ＤＮＡがハイブリダイズする可能性がある。そこで始めの条件として、『免疫複合体は形成するが、ＤＮＡのハイブリダイズは起こらない』条件（塩濃度、温度といった条件）を設定する。例えば塩濃度が低いとハイブリダイズは起こらない。
４）　洗浄緩衝液で未反応の二次抗体を除去する。
５）　次に、『免疫複合体を維持し、かつＤＮＡがハイブリダイズする』条件（例えば、塩濃度、温度）を設定してその条件を適用する。なお、塩濃度が高いとハイブリダイズは起こるが、高すぎると免疫反応を阻害する恐れがある。したがって塩濃度は、150mMまでぐらいが望ましい。
６）　一次抗体のＤＮＡ-ドナー色素、二次抗体の相補鎖ＤＮＡ-アクセプター色素がハイブリダイゼーションを起し、ドナー色素-アクセプター色素間でＦＲＥＴが発現する。
　この方法によってＳ／Ｎ向上が期待される。なぜならば、ＤＮＡの色素修飾率が高ければ、それだけシグナルの向上が期待できるからである。なお、ＤＮＡ-相補鎖ＤＮＡのハイブリダイズは、特異的（例えばSNP解析のような）である必要はなく、近傍にあるものと一定距離以内にあればよい。
　上記方法の改変例として、１）、２）は同じであるが、３）以降の段階を以下のように変えてもよい。
３）　前記一次抗体に抗原、次いで二次抗体を反応させて免疫複合体を形成させ、これを該一次抗体を介して基板に固定化させる。あるいは二次抗体と検体との反応液（抗原と二次抗体との複合体を含有する反応液）を前記基板に接触させて免疫複合体を固定化してもよい。その際、免疫複合体形成の有無に関わらず、ＤＮＡと相補鎖ＤＮＡがハイブリダイズする。
４）『免疫複合体を維持し、かつ二本鎖ＤＮＡが解離する』条件（例えば、塩濃度、温度）を設定してその条件を適用する。免疫複合体を形成していない未反応の二次抗体を洗浄緩衝液で除去する。このとき免疫複合体を形成しているＤＮＡと相補鎖ＤＮＡとのハイブリダイゼーションもいったん、解離する。
５）『免疫複合体を維持し、かつＤＮＡがハイブリダイズする』条件（例えば、塩濃度、温度）を設定し、その条件を適用する。
６）ＤＮＡと相補鎖ＤＮＡは最も近傍にあるもの同士でハイブリダイズする。
　すなわち、免疫複合体の形成により接近している一次抗体と二次抗体に標識されたＤＮＡが優先的にハイブリダイズし、ドナー色素-アクセプター色素間でＦＲＥＴが発現する。
　この場合は、Ｓ／Ｎ向上とともにB/F分離は必要とされない利点がある。
　また上記改変例の別の態様として、上記の１）～４）は同じであるが、５）以降の段階を次のとおりにする。
５）　タンパク質変性剤（尿素など）を含み、塩濃度の高い緩衝液を基板上に展開する。これにより、タンパク質は変性し、構造が崩れた状態で溶解する。基板上にあるＤＮＡと相補鎖ＤＮＡは、立体的構造の阻害を受けず、高確率でハイブリダイズする。一次抗体は共有結合で基板に固定化されていれば外れない。また、ＤＮＡも、抗体分子に共有結合的に結合されていれば、変性条件下でも基板からは外れない。これに対して、二次抗体は遊離してもよい。また、二次抗体に結合していた相補鎖ＤＮＡは抗体分子から外れてもよい。
６）　基板上に固定化された一次抗体のＤＮＡ-ドナー色素、二次抗体由来の相補鎖ＤＮＡ-アクセプター色素がハイブリダイゼーションを起し、ドナー色素-アクセプター色素間でＦＲＥＴが発現する。
　この場合、ＦＲＥＴ効率の向上が期待でき、しかも免疫反応のカイネティクスの影響を受けない。なおＤＮＡが安定であって、しかも相補鎖ＤＮＡとハイブリダイズするようなタンパク質変性条件を設定する必要がある。
　なお、一次抗体、検体および二次抗体を予め反応させ、形成された免疫複合体を次いで（プラズモン励起センサ）金属薄膜基板に接触させることにより、該免疫複合体の一次抗体を該基板上に結合させて最終的に基板上に固定化する方式では、固定化した後に『免疫複合体を維持し、かつＤＮＡがハイブリダイズする』条件（例えば、塩濃度、温度）を設定してその条件を適用すればよい。
　　好適な実施形態
　好ましい本発明アッセイの形態は、免疫反応場と蛍光検出場とを分離して実施する態様である。すなわち免疫反応場において、ドナー分子で標識された一次抗体が検体中に含有される標的抗原を認識してこれに結合し、またアクセプター分子で標識された二次抗体も該抗原の別エピトープを認識して結合し、その結果、サンドイッチ型免疫複合体が形成される。
　これらの抗原と両抗体との反応物は、次いでプラズモン励起センサに適用される。その金属薄膜基板表面に設けられた係留用の結合基により、上記一次抗体Ｆｃ基部の結合基が捕捉されて、サンドイッチ型免疫複合体が金属薄膜基板上に固定化される（上記の工程（ａ））。ここで必要であれば洗浄用緩衝液による洗浄操作を行ってもよい。
　アッセイの検出場は、ガラス製の透明平面基板と、該基板の一方側の表面に形成された金属薄膜と、さらに該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成したスペーサ層とを有するプラズモン励起センサである。その該スペーサ層側の表面に接触させて固定化された上記サンドイッチ型免疫複合体に対し、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射する。一次抗体ドナー分子が表面プラズモンによって励起されて発光する。ＦＲＥＴ発現により二次抗体に結合した蛍光色素（アクセプター分子）が、励起して発光する。このようにして形成された免疫複合体のみが増強された蛍光を発するので、これを検出して蛍光量を測定する（上記の工程（ｂ））。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、ここで使用している装置名、使用する材料、使用材料の濃度、使用量、ならびに処理時間、処理温度などの数値的条件、処理方法などは、本発明の範囲内の好適例にすぎない。
　［作製例１］(プラズモン励起センサの作製)
　屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ　１０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　このようにして得られた基板を、１０－カルボキシ－１－デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
　ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。
　［作製例２］（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識一次抗体の作製）
　一次抗体として抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）を、ビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
　次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、撹拌混合することで反応させた。次いで未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク質量の定量後、４℃で保存した。
　［作製例３］（Ｃｙ５．５標識二次抗体の作製）
　上記作製例２で得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ｃｙ５．５（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、撹拌混合することで反応させた。
　次に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ｃｙ５．５（登録商標）標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク質の定量後、４℃で保存した。
　［実施例１]
　(プラズモン励起センサの作製)
　[作製例1]と同様の方法でプラズモン励起センサを準備し、１次抗体の固相化を行う。
　まず、超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。続いて、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、[作製例２]の方法でαフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を標識したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識一次抗体溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。最後に重量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、プラズマ励起センサを作製し、ＳＰＦＳを用いてアッセイを行った。
　（アッセイ法の実施）
　工程（ｉ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを２．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
　洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてＬＤレーザを用いて、波長６３５ｎｍのレーザ光を、光学フィルタ：（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、プリズム：（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎ〕＝１．７２））を通して、流路に固定されているプラズモン励起センサに照射し、カットフィルタ（シグマ光機（株））、集光レンズとして２０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。
　工程（ｉｉ）：[作製例３]の方法でαフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を標識したＣｙ５．５標識二次抗体を１,０００ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。
　工程（ｉｉｉ）：送液開始から２０分後のＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをアッセイノイズシグナルとした。
　工程（ｉｖ）：本発明のプラズモン励起センサにおけるアッセイＳ／Ｎ比を以下の式で評価した。すなわち、抗原量に比例する蛍光色素量により変化する蛍光シグナルの数値が大きく、またアッセイノイズシグナルがアッセイ蛍光シグナルに対して数値的に充分小さいことがイムノアッセイ測定の信頼性が高いことに繋がる。
　アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）｜／｜（アッセイノイズシグナル）｜
　得られた結果を表３に示す。
　［実施例２]
　(プラズモン励起センサの作製)
　実施例１と同様に作製した。
　（アッセイ法の実施）
　工程（ｉ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを２．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
　洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてＬＤレーザを用いて、波長６３５ｎｍのレーザ光を、光学フィルタ：（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、プリズム：（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎ〕＝１．７２））を通して、流路に固定されているプラズモン励起センサに照射し、カットフィルタ（シグマ光機（株））、集光レンズとして２０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。
　工程（ｉｉ）：[作製例３］の方法でαフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を標識したＣｙ５．５標識二次抗体を１,０００ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。
　洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。
　工程（ｉｉｉ）：洗浄開始から１０分後のＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをアッセイノイズシグナルとした。
　工程（ｉｖ）：アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイＳ／Ｎ比を算出することで評価した。
　得られた結果を表３に示す。
　［比較例１］
　(プラズモン励起センサの作製)
　[作製例1]と同様の方法でプラズモン励起センサを準備し１次抗体の固相化を行った。
　まず、超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。続いて、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。最後に重量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、プラズマ励起センサを作製し、ＳＰＦＳを用いてアッセイを行った。
　（アッセイ法の実施）
　工程（ｉ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを２．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
　洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として２０分間循環させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてＬＤレーザを用いて、波長６３５ｎｍのレーザ光を、光学フィルタ：（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、プリズム：（（株）オハラ製のＳ－ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎ〕＝１．７２））を通して、流路に固定されているプラズモン励起センサに照射し、カットフィルタ（シグマ光機（株））、集光レンズとして２０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。
　工程（ｉｉ）：[作製例２]の方法でαフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を標識したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識二次抗体溶液を１,０００ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳを２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。
　洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。
工程（ｉｉｉ）：洗浄開始から１０分後のＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをアッセイノイズシグナルとした。
　工程（ｉｖ）：アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイＳ／Ｎ比を算出することで評価した。
　得られた結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から、本発明において、従来の蛍光標識ＳＰＦＳ測定と比べて非常に高いアッセイＳ／Ｎ比を達成しており、極めて高感度な測定方法可能であることがわかった。
　実施例１のアッセイ工程に洗浄操作を加えたものが実施例２であるが、洗浄操作を加えたことにより、実施例１よりもアッセイシグナルが僅かに低下している。しかし、アッセイシグナルノイズがほとんど変化していないことから、実施例１において、非特異的な吸着によるアッセイシグナルの底上げはほとんどないと考えられる。このことから、アッセイシグナルの低下は、洗浄操作によって反応液が置換されたことにより、免疫複合体の平衡状態が変化し、二次抗体が徐々に解離していることに由来するものと考えられる。
　また、比較例１に示した蛍光標識ＳＰＦＳ測定のアッセイシグナルに比べて、２０％程度アッセイシグナルが減少している。これは、ＦＲＥＴ効率が十分でないことの影響と考えられ、ＦＲＥＴ効率の最適化により、さらなる向上が期待できる。
　本発明のアッセイ法は、高感度かつ高精度に目的とする抗原を検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
１０・・・・・・金属薄膜基板
２０・・・・・・一次抗体
３０・・・・・・抗原
４０・・・・・・二次抗体
４１・・・・・・遊離の二次抗体
４２・・・・・・非特異結合の二次抗体
５０・・・・・・蛍光色素
６０・・・・・・ドナー分子となる蛍光色素
７０・・・・・・アクセプター分子となる蛍光色素
１００・・・・・励起
２００・・・・・検出
３００・・・・・ノイズ
４００・・・・・ＦＲＥＴ
５００・・・・・検出対象（免疫複合体）

Claims (10)

  1. 　ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体およびアクセプター分子となる蛍光色素を結合した二次抗体を用いて検体中の抗原量を測定する免疫アッセイ方法であって、少なくとも、
    　工程（ａ）：検体中に含まれる抗原と上記の一次抗体および二次抗体の両抗体との間で抗原抗体反応を生じさせ、両抗体により該抗原がサンドイッチされた免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させる工程、
    　工程（ｂ）：形成された前記免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法によりレーザ光を照射し、該一次抗体の励起されたドナー分子蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定する工程、
    を含むことを特徴とする免疫アッセイ方法。
  2. 　前記工程（ａ）において、検体と該二次抗体とを接触させ、次いで抗原を結合した該二次抗体を、該一次抗体を固定化した金属薄膜基板に接触させることにより、前記免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させる、請求項１に記載の免疫アッセイ方法。
  3. 　前記工程（ａ）において、該一次抗体を固定化した金属薄膜基板と検体とを接触させ、次に該基板に二次抗体を適用することにより、前記免疫複合体を金属薄膜基板上に固定化させる、請求項１に記載の免疫アッセイ方法。
  4. 　前記のドナー分子およびアクセプター分子がＦＲＥＴペアである、請求項１～３のいずれかに記載の免疫アッセイ方法。
  5. 　前記金属薄膜基板が、透明平面基板とその一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの基板である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫アッセイ方法。
  6. 　前記工程（ｂ）において、表面プラズモン励起蛍光法によるレーザ光の照射は、プラズモン励起センサの金属薄膜を形成していないもう一方の透明基板表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射することである、請求項1～５のいずれかに記載の免疫アッセイ方法。
  7. 　少なくとも、プラズモン励起センサ、その金属薄膜基板の表面上に固定化される抗体であってドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体、アクセプター分子となる蛍光色素が結合した二次抗体を含み、請求項１～６のいずれかに記載の免疫アッセイ方法において、該一次抗体、検体中の抗原、該二次抗体の間でサンドイッチ形式の抗原抗体反応を生じさせることにより免疫複合体を形成させる工程を実施するために用いられるキット。
  8. 　前記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成される請求項７に記載のキット。
  9. 　前記プラズモン励起センサが上記金属薄膜および透明平面基板から構成され、さらにスペーサ層を有して、該スペーサ層が、上記金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成される、請求項７または８に記載のキット。
  10. 　少なくとも、
    プラズモン励起センサの金属薄膜基板上に固定化される、ドナー分子となる蛍光色素を結合した一次抗体、
    アクセプター分子となる蛍光色素が結合した二次抗体、
    プラズモン励起センサ、表面プラズモン励起蛍光法用の光源および蛍光検出器
    を含み、該一次抗体および該二次抗体の両抗体と検体中に含まれる抗原との間でサンドイッチ形式の抗原抗体反応を生じさせ、プラズモン励起センサ金属薄膜基板上に固定化された免疫複合体に対して、表面プラズモン励起蛍光法によりレーザ光を照射して励起された該一次抗体の蛍光色素からの蛍光共鳴エネルギー転移によって発光した該アクセプター分子の蛍光量を測定することにより該抗原量を測定することを特徴とする免疫アッセイシステム。
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