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WO2010072969A1 - Procede de detection d'une infection par prion - Google Patents

Procede de detection d'une infection par prion Download PDF

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WO2010072969A1
WO2010072969A1 PCT/FR2009/052656 FR2009052656W WO2010072969A1 WO 2010072969 A1 WO2010072969 A1 WO 2010072969A1 FR 2009052656 W FR2009052656 W FR 2009052656W WO 2010072969 A1 WO2010072969 A1 WO 2010072969A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
atnc
protein
prpsc
pathological
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2009/052656
Other languages
English (en)
Inventor
Aude Arzel
Bruno You
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB Biotechnologies SAS filed Critical LFB Biotechnologies SAS
Priority to EP09806097A priority Critical patent/EP2368122A1/fr
Priority to US13/141,483 priority patent/US20110262935A1/en
Priority to JP2011542876A priority patent/JP5558487B2/ja
Publication of WO2010072969A1 publication Critical patent/WO2010072969A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to an optimized method for the detection of prion protein PrPsc by Western-blot, as well as its application, in particular for the evaluation and / or the in vitro control of the efficiency of a method for obtaining or treatment of a biological product or for the evaluation and / or in vitro control of a decontamination procedure and / or for the evaluation or screening of compounds likely to be endowed with an activity modulating infectivity to prion.
  • TSEs Transmissible spongiform encephalopathies
  • CNS Creutzfeldt-Jakob disease
  • TSE transspongiform encephalopathy
  • the etiologic agent of these diseases is classified as "unconventional transmissible agents" (NCTA).
  • NCTA conventional transmissible agents
  • PrP prion protein
  • PrPsc This abnormal pathological form of PrP, called PrPsc, is co-purified with infectivity and its accumulation precedes the appearance of histological lesions. It results from a modification of the conformation of the prion protein PrP. There was no evidence of modification of the expression of the gene encoding PrP, nor of alteration of its translation (Prusiner,
  • NCTAs prevents the use of inactivation processes conventionally used, such as the Tween-TNBP solvent / detergent treatment, which have proved their effectiveness in reducing the viral load of blood derivatives.
  • inactivation processes conventionally used such as the Tween-TNBP solvent / detergent treatment, which have proved their effectiveness in reducing the viral load of blood derivatives.
  • cryoprecipitable plasma proteins factor VIII, von
  • the method of titration of the infectivity associated with NCTAs conventionally used uses an in vivo titration method in animals, such as the golden hamster, by intracerebral injection of different dilutions of a test product loaded into NCTA. .
  • animals such as the golden hamster
  • intracerebral injection of different dilutions of a test product loaded into NCTA. Depending on the number of affected animals in the different groups corresponding to the dilutions made, one can calculate an infectious titer and establish the reduction factor of a given method from an untreated reference.
  • this method has the disadvantage of being long (about one year), expensive and not compatible with a development on an industrial scale which we want to quickly know the effectiveness vis-à-vis the elimination of the prion.
  • PrPsc by Western-Blot (Mac Gregor, Transfusion J. Medicine 2001; 11, 3-14) or by ELISA generally require prior digestion of the sample to be analyzed by Proteinase K, or denaturation by chaotropic agents to distinguish the pathological protein (PrPsc) from the normal protein (PrP).
  • PMCA Protein misfolding cyclic amplification
  • TCIA tissue culture infectivity assay
  • the invention now provides an optimization of the detection of PrPsc by Western blotting and consequently the quantification of PrPsc in a sample by Western blotting.
  • the inventors have indeed demonstrated that it is possible to concentrate PrPsc in a sample, before and after the step of digestion with proteinase K.
  • the invention relates to an in vitro method for detecting and / or titrating an unconventional transmissible agent (ATNC) or a pathological marker protein of the ATNC infectivity in a sample, comprising a concentration step of the sample before and after digestion with a protease.
  • ATNC unconventional transmissible agent
  • a pathological marker protein of the ATNC infectivity comprising a concentration step of the sample before and after digestion with a protease.
  • an object of the invention is an in vitro method for detecting and / or titrating an unconventional transmissible agent (ATNC) or a pathological marker protein of the ATNC infectivity in a sample. comprising the steps of: i) concentrating said ATNC agent or said infectious marker protein present in the sample, ii) subjecting the concentrated sample to digestion with a protease, preferably proteinase K. iii ) concentrating the digestate obtained in step (ii), iv) detecting and / or titrating said ATNC agent or said infectivity marker protein in the concentrated digestate obtained in step (iii).
  • a protease preferably proteinase K.
  • the pathological conformation protein is the prion protein PrPsc.
  • the concentration step (i) is carried out by centrifugation, preferably by ultracentrifugation.
  • the concentration step (i) comprises an ultracentrifugation of 100,000 g to 140,000 g, preferably 140,000 g, for 1 hour.
  • the concentration step (iii) is carried out by centrifugation.
  • step (iv) is carried out by immunochemistry, more particularly by a Western-Blot.
  • the method may preferably comprise an intermediate dilution step after the digestate concentration step (iii), and before the detection or titration step (iv).
  • the sample is preferably selected from the group consisting of blood products and their derivatives, foods, and cosmetics.
  • the concentration of PrPsc before the digestion step is obtained by ultracentrifugation of the sample to be titrated to preferably 140,000 xg for 1 hour at room temperature, with a sample volume of about 8.3ml introduced into a tube previously treated during the hour with 0.1% bovine serum albumin and with a free-swinging rotor. After this ultracentrifugation, the sedimented pellet is preferably taken up in a volume of water or other buffer preferably between 20 and 60 ⁇ l.
  • the pellet suspension is incubated in the presence of proteinase K and under optimal conditions for digestion.
  • the concentration of PrPsc is obtained by further centrifugation, preferably at 18,000 x g for 30 minutes of the digestion product.
  • the invention also provides an in vitro method for detecting and / or assaying the immunoreactivity of an unconventional transmissible agent (NCTA) whose marker is a pathological conformational protein in a sample.
  • NCTA unconventional transmissible agent
  • Another subject of the invention is an in vitro method of evaluation and / or control of a process for obtaining or treating a biological product or material likely to be contaminated by an NCTA, method wherein to said biological or material product, (A) upstream and (B) downstream of said process, a titration method as defined above, and that the two values (A) and (B) title obtained.
  • the invention also relates to an in vitro method for evaluating and / or controlling a procedure for decontaminating a biological product or a material, in which method it is applied to said biological or material product, (A) upstream and (B) downstream of said procedure, a titration method as defined above, and that the two obtained values (A) and (B) of title are compared.
  • Yet another subject of the invention is an in vitro method for evaluating a compound capable of affecting the immunoreactivity of an infectious biological product, in which method is applied to said infectious biological product, (A) in the presence and (B) in the absence of said compound to be evaluated, a titration method as defined above, and in that the two obtained values (A) and (B) of title are compared.
  • Yet another subject of the invention is an in vitro method for diagnosing a transmissible spongiform encephalopathy in a human or non-human animal, comprising detecting the presence in a biological sample of said subject of a non-transmissible transmissible agent.
  • conventional (ATNC) which is a pathological conformational protein, by the method as defined above.
  • a "Prion Prion Protein” is usually a plasma membrane-anchored sialoglycoprotein by a phosphatidyl glycolipid (GPI), naturally occurring in cells and involved in their normal functioning.
  • the normal form of the protein i.e. non-pathological, is generally called PrPc. It is involved in the development of the nervous system in the embryo. In adults, it is expressed primarily in the brain and spinal cord (neurons and glia). It is involved in the processes of cell differentiation and adhesion. It would also have an antioxidant protective role and vis-à-vis programmed cell death (apoptosis). This protein also has a role in the folding of other proteins.
  • the "pathological" form, PrPsc, of PrP generally refers to an isoform of the non-pathological protein.
  • the pathological prion protein thus acquires self-aggregating abilities and can thus form deposits, especially in the brain, causing neuronal death.
  • the agent responsible for the replication or propagation of the pathological prion protein would be the pathological prion protein itself as able to "propagate or multiply" in an "exponential” manner, by deforming the healthy prion proteins into pathological prion proteins.
  • the so-called "pathological" form of PrP is therefore the form of the protein whose conformation is correlated with the appearance of an EST in the infected human or non-human animal.
  • the "titre”, expressed as a Western-blot unit, is an arbitrary quantity determined by the limiting dilution of the sample from which no more immunoreactivity is observed by western-blot.
  • the term "ATNC” represents any unconventional transmissible agent, such as those responsible in humans for familial or sporadic CJD, Kuru disease or variant CJD, or those natural TSE animals, such as ovine scrapie, bovine or feline spongiform encephalopathy, chronic cervid dieback or spongiform encephalopathy of mink, or finally EST strains experimentally adapted to laboratory.
  • the ATNC is also referred to as "infectious agent”.
  • Sample means any source of material likely to be contaminated by a
  • Such a source of material may for example be a liquid, a food product, a beverage, a cosmetic product or a product resulting from genetic engineering, a molecule capable of modulating the infectivity of an NCTA, this list not being limiting.
  • a biological sample for example a biological fluid or tissue or tissue extract.
  • tissue may be a tissue of the brain, vertebral column, or tonscillary tissue, this list not being limiting.
  • the sample may also be a composition derived from a human or animal source, such as growth hormones or cell extracts, such as pituitary extracts.
  • Such a composition can indeed be contaminated by an NCTA.
  • a biological fluid it may be blood, lymph, urine or milk, this list not being limiting.
  • the sample is a blood product or a derivative, for example a plasma derivative or a plasma protein concentrate.
  • the concentration of PrPsc protein can be achieved by a first ultracentrifugation step preferably at 140,000xg for 1 hour at room temperature.
  • This treatment consists in neutralizing the electrostatic forces of the material (polymer) of the tube which can fix on the walls of the tube, the PrPsc present in the sample to be analyzed.
  • This treatment is achieved by filling the ultracentrifuge tube with the BSA solution and allowing it to incubate as described above.
  • the supernatant is removed and the pellet taken up with a volume of preferably 50 ⁇ l of water or of any other buffer.
  • the elimination of the non-pathological form (PrPc) in the sample can be carried out on the basis of biochemical properties of PrPsc that distinguish it from non-pathological proteins, in particular the fact that PrPsc is relatively more resistant to treatment. based on proteases and is less soluble or insoluble even in the presence of detergents.
  • a protease treatment for example proteinase K
  • a digestion with proteinase K is carried out which leads to digestion mainly PrPc and little or no PrPsc. It is indeed a property of the PrPsc to be more resistant to PK compared to the PrPc. The subsequent detection step therefore no longer detects the non-pathological form of the protein because it has been digested by the protease.
  • the pathological Prion protein, "resistant" to proteinase treatment can be concentrated by centrifugation preferably at 18,000 xg for 30 minutes at room temperature.
  • the supernatant is removed and the pellet taken up in a volume of loading buffer corresponding to the maximum volume of a comb well for the gel deposition.
  • electrophoresis typically 10 to 15 ⁇ l or 25 ⁇ l if a loading buffer dilution range and preferably at a step of 3 is provided.
  • the PrPsc detection step in the digested and concentrated sample as described above can be carried out using the following methods: immunochemicals such as the Western blot or the ELISA, the immunoblot, or the radioactivity test, electron microscopy, turbidimetry to detect aggregates, and structural tests including NMR (nuclear magnetic resonance), circular dichroism, Raman spectroscopy, UV absorption, this list is not exhaustive.
  • immunochemicals such as the Western blot or the ELISA, the immunoblot, or the radioactivity test, electron microscopy, turbidimetry to detect aggregates, and structural tests including NMR (nuclear magnetic resonance), circular dichroism, Raman spectroscopy, UV absorption, this list is not exhaustive.
  • Titration of TNC A The detection of the pathological form of PrP may be associated with a determination of the amount of PrPsc present in the sample.
  • the digested and concentrated sample suspension is diluted in loading buffer in a geometric progression also known as no dilution.
  • the latter is preferably 3.
  • Each dilution point is then subjected to a protein detection assay of the ATNC as described above.
  • PrPsc Western-blot is defined as the reciprocal of the first negative dilution not exhibiting a PrPsc specific signal (PrPsc quench signal) in the undiluted sample volume and used for the detection test.
  • the method of the invention makes it possible to quantify the immunoreactivity related to the ATNCs over a theoretically infinite range.
  • the method has made it possible to quantify the immunoreactivity related to the scrapie strain over a range of about 7.5 log, that is to say about 31,000,000 units. western blotting. This may, for example, make it possible to satisfy the criteria for validating the efficiency of the processes for obtaining biological products with respect to the elimination of NCTAs.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a method of evaluation and / or in vitro control of a process for obtaining or treating a biological product likely to be contaminated. by an NCTA.
  • This evaluation and / or control method is characterized in that a titration method according to the invention, as described above, is applied to the biological product, upstream and downstream of said process, and in that the we compare the two title values obtained. By comparison between the two measurements, the degree of elimination or the reduction factor of the NCTA is determined.
  • the titration method according to the invention has the capacity to be easily applicable to any type of process for obtaining or purifying biological products, in particular blood products, such as blood plasma derivatives, using for example, chromatography or nanofiltration.
  • the implementation of the method of the invention makes it possible to evaluate and / or control the efficiency of a process (or a part of a process) for obtaining or treating, or even purifying of any biological product likely to be contaminated by an NCTA, in the elimination of this NCTA, by means of a titration using the titration method according to the invention.
  • the amounts of NCTA are measured upstream and downstream of the process (or part of the process) whose performance with respect to the NCTA is to be assessed. By comparing the two measurements, the degree of elimination of the pathogen is determined.
  • the implementation of the present method can be carried out during a process for obtaining a biological product or in the context of an elimination treatment of the NCTA according to obtaining the biological product.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a method of evaluation and / or in vitro control of a procedure for decontaminating a material.
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined using the titration method of the invention.
  • This infected biological product is then contacted with the material to be decontaminated and the decontamination procedure is applied to this material.
  • the title of the biological product having undergone the decontamination procedure is again determined.
  • the two titration measurements performed upstream and downstream of the decontamination procedure are compared to evaluate the effectiveness of the decontamination procedure.
  • the material may, for example, be a purification material, in particular a chromato graphie column, or be the sanitization of a chromatography column using sodium hydroxide.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a selection procedure and / or method for evaluating a compound making it possible to reduce the titre of the infectious material.
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined using the titration method of the invention.
  • This infected biological product is then brought into contact with the test compound and the title of the biological product having undergone the decontamination procedure is again determined.
  • the two titration measurements made upstream and downstream of the contacting of the sample with the test compound are compared.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a selection procedure and / or evaluation method of a compound capable of modulating the infectivity of an ATNC.
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined, in the presence and then in the absence of the compound to be evaluated, by means of the titration method according to the invention.
  • the methods for bringing the compound into contact are determined according to whether the action of the compound prevents the initiation of an infectious cycle or blocks an infectious cycle already initiated.
  • the title of the biological product is determined with and without treatment with the product to be tested.
  • the two titration measurements performed are compared to evaluate the modulatory activity of the NCTA infectivity of the compound.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a method of identifying a compound for modulating the transformation of the non-pathological form into the pathological form of the ATNC, for example the transformation of PrP into PrP sc .
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined using the titration method of the invention.
  • This infected biological product is then contacted with the test compound and the titration method of the invention is applied to again determine the title of the biological product.
  • the two titration measurements made upstream and downstream of the contact with the compound are compared to evaluate the effectiveness of the test compound.
  • Lot LN-6246 consisted of a 10% PBS microsomal fraction prepared from a hamster brain infected with the 263K strain. 3 Aliquots named LN-6246-1, LN-6246-2 and LN-6246-3 were made from lot LN-6246. Batches LN-6246-A, LN-6246-B and LN-6246-C were from a dilution of sample LN-6246. This dilution was performed by diluting an aliquot of LN-6246 in PBS 10-fold. The stock characteristics of the 263K strain-infected hamstring mills used in the study are summarized in Table I below.
  • Step of the Dilution Range For each sample, a range of 3-fold dilution in loading buffer was prepared by cascade dilution with initially 10 ⁇ l of digestate supplemented with 20 ⁇ l of loading buffer. The digestate obtained was diluted to say / 3rd. This dilution was reproduced digestate diluted l / 3rd added loading buffer 20 ⁇ l. The digestate obtained then corresponded to the dilution / 9th. This dilution operation was reproduced in cascade to the dilution of digestate in the / 177181 th.
  • Proteins migrated in the gel were transferred to a PVDF membrane by electro-transfer.
  • the PrPsc present on the membranes was detected by incubation with the antibody 3F4 and then a secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (goat antibody "anti-mouse antibody”).
  • the labeled membranes were revealed by chemiluminescence.
  • One sample was considered positive if the electrophoretic profile with the three forms of glycosylated PrPsc was visible on autoradiograms. Nevertheless, in the case of very low charges, only the majority band corresponding to the diglycosylated form with a molecular weight of approximately 29 kDa was observed.
  • VEq The Initial Equivalent Volume, ie 4.35 ⁇ l PrPsc assay of samples LN-6246-A, LN-6246-B and LN-6246-C by "optimized” Western blotting according to the invention:
  • 3 tubes for ultracentrifugation (Beckman ref: 361623) were filled with a solution of 0.1% serum bovine albumin and incubated at + 4 ° C overnight (about 16 hours). At the end of the incubation, these tubes were emptied and filled with 8.3 ml of sample LN-6246-A, LN-6246-B and LN-6246-C. These 3 tubes were ultracentrifuged with a free rotor (swinging rotor Beckman ref SW41) at 140,000 xg for 1 hour at room temperature. At the end of the ultracentrifugation, the supernatant was evacuated and the pellets were taken individually in 50 ⁇ l of water.
  • the suspensions were designated respectively LN-6246-A, LN-6246-B and LN-6246-C for the pellets taken from the tubes respectively LN-6246-A, -B and -C.
  • the theoretical maximum concentration factor was therefore 8300/50, ie 166 times.
  • a range of 3-fold dilution in loading buffer was prepared by cascade dilution with initially 10 ⁇ l of digestate supplemented with 20 ⁇ l of loading buffer. The digestate obtained was diluted to say / 3rd.
  • the optimized method increased the initial Equivalent volume by: 4980 / 4.32, or a ratio of 1152 times, or 3.061ogio.
  • the proteins were separated by electrophoresis and analyzed as described previously in step III.
  • NT Not tested
  • ND Not detectable
  • NA Not Applicable
  • LoD Limit of detection.
  • the title of these samples could be determined. It was 1, 21, 0.73 and 1.21 log 10 uWB / ml in samples LN-6246-A, LN-6246-B and LN-6246-C respectively. The average titre of these samples was 1.05 log uWB / ml. The lack of detection of PrPsc in samples LN-6246-A, LN-6246-B and LN-6246-C with the standard method was confirmed by the titer of these samples which was below the detection limit of standard method. This level of title could only be determined with the optimized method according to the invention.
  • the optimized Western-blot assay method according to the invention makes it possible to significantly lower the detection limit of the Western-blot method.
  • the concentration steps of the PrPsc implemented in the optimized method indeed induce an initial equivalent volume much higher than that measured with the standard method.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant une étape de concentration de l'échantillon avant et après digestion par une protéase.

Description

Procédé de détection d'une infection par prion
La présente invention concerne une méthode optimisée pour la détection de la protéine prion PrPsc par Western-blot, ainsi que son application, notamment pour l'évaluation et/ou le contrôle in vitro de l'efficacité d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou pour l'évaluation et/ou le contrôle in vitro d'une procédure de décontamination et/ou pour l'évaluation ou le screening de composés susceptibles d'être dotés d'une activité modulatrice de l'infectiosité à prion.
Etat de la technique :
Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble de maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du système nerveux central
(SNC). La forme la plus fréquente chez l'homme est la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ), mais il existe également des EST chez de nombreux mammifères (notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine). L'agent étiologique de ces maladies est classé dans la catégorie des "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). La signature de la maladie est la présence d'une protéine extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de la maladie en une forme insoluble, résistante aux protéases telles que la protéinase K, et qui s'accumule dans le système nerveux central. Cette forme anormale pathologique de la PrP, appelée PrPsc, est co-purifiée avec l'infectiosité et son accumulation précède l'apparition des lésions histologiques. Elle résulte d'une modification de la conformation de la protéine prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour la PrP, ni d'altération de sa traduction (Prusiner,
Biochemistry 1992 ; 31 : 12277-88 ).
Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que l'agent transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans les dérivés sanguins (Brown et al, 2001, Semin Hematol.;38(4 Suppl 9):2-6).
Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant, d'une part, de la probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très longue période d'incubation cliniquement silencieuse caractéristique de ces maladies, qui précède l'apparition des signes cliniques.
En outre, l'exceptionnelle résistance des ATNC empêche le recours à des procédés d'inactivation classiquement mis en œuvre, tels que le traitement solvant/détergent Tween- TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale des dérivés sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII, facteur von
Willebrand, etc.). Etant donné que l'obtention ou le traitement de produits biologiques, tels que les protéines plasmatiques de la coagulation, doit incorporer des étapes d'élimination/inactivation virales en vue d'un usage thérapeutique, l'industrie pharmaceutique des médicaments dérivés du sang cherche aujourd'hui à évaluer le risque théorique de transmission du variant de la MCJ par les produits dérivés du sang.
Actuellement, la méthode de titrage de l'infectiosité liée aux ATNC classiquement mise en œuvre utilise une méthode de titrage in vivo chez l'animal, tel que le hamster doré, par injection intracérébrale de différentes dilutions d'un produit à tester chargé en ATNC. Selon le nombre d'animaux atteints dans les différents groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre infectieux et établir le facteur de réduction d'un procédé donné à partir d'une référence non traitée. Cependant, cette méthode présente l'inconvénient d'être longue (environ un an), coûteuse et peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle dont on veut connaître rapidement l'efficacité vis-à-vis de l'élimination du prion.
En outre, il est souvent nécessaire d'introduire une étape de concentration de l'agent infectieux de façon à augmenter la sensibilité des méthodes de titrage. Toutes les procédures de concentration d'agents infectieux responsables de l'EST passent aujourd'hui par une purification de la PrPsc.
D'autres méthodes ont été proposées pour le titrage in vitro des agents infectieux des EST.
Les techniques de détection de la PrPsc par Western-Blot (Mac Gregor, Transfusion J. Médecine 2001 ; 11 , 3-14) ou par ELISA nécessitent généralement une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP).
Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP (Korth et al, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7).
Le brevet US 6,150,583 décrit quant à lui la production d'animaux transgéniques exprimant une PrP marquée par un épitope hétérologue exposé ou non à la surface de la protéine prion, selon la conformation de cette dernière.
Le procédé appelé « PMCA » (Protein misfolding cyclic amplification), décrit dans le document Saborio et al. (Nature ; 2001, 411, 810-3) prévoit la mise en contact de formes pathologiques provenant d'un tissu ou d'un fluide issu d'un animal contaminé avec une forme non pathologique de la protéine d'ATNC, afin de convertir cette dernière en une forme pathologique. La méthode de la PMCA, bien qu'encore en développement, s'avère au moins aussi sensible que le bioessai. Néanmoins elle ne fournit aucune preuve sur l'infectiosité de la PrPsc détectée et s'avère difficile à mettre en oeuvre avec des matrices plasmatiques. En outre il a été rapporté une reproductibilité incertaine et des résultats faussement positifs.
Le document WO 2005/022148 décrit une méthode de titrage in vitro, appelée « TCIA » ("tissue culture infectivity assay"), d'un ATNC dans un produit biologique, au moyen de la mise en contact de cellules transgéniques supportant la réplication dudit ATNC avec le produit biologique, puis la culture de ces cellules pendant un ou plusieurs passages pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans le produit biologique par réplication de l'ATNC.
Résumé de l'invention :
L'invention fournit maintenant une optimisation de la détection de la PrPsc par Western-blot et par voie de conséquence de la quantification de la PrPsc dans un échantillon par Western- blot.
Les inventeurs ont en effet mis en évidence qu'il est possible de concentrer la PrPsc dans un échantillon, avant et après l'étape de digestion par la protéinase K.
Plus généralement, l'invention concerne une méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant une étape de concentration de l'échantillon avant et après digestion par une protéase.
Ainsi un objet de l'invention est une méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant les étapes consistant à: i) concentrer ledit agent ATNC ou ladite protéine marqueur de l'infectiosité présent(e) dans l'échantillon, ii) soumettre l'échantillon concentré à une digestion par une protéase, de préférence la protéinase K. iii) concentrer le digestat obtenu à l'étape (ii), iv) détecter et/ou titrer ledit agent ATNC ou ladite protéine marqueur de l'infectiosité dans le digestat concentré obtenu à l'étape (iii).
De préférence la protéine de conformation pathologique, marqueur de l'ATNC, est la protéine prion PrPsc.
De manière avantageuse, l'étape de concentration (i) est réalisée par centrifugation, de préférence par ultracentrifugation. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape de concentration (i) comprend une ultracentrifugation de 100 000 g à 140 000g, de préférence à 140 000 g, pendant 1 heure. De manière avantageuse, l'étape de concentration (iii) est réalisée par centrifugation. De préférence, l'étape (iv) est réalisée par immunochimie, plus particulièrement par un Western-Blot.
La méthode peut comprendre de préférence une étape intermédiaire de dilution après l'étape (iii) de concentration du digestat, et avant l'étape (iv) de détection ou titrage.
L'échantillon est choisi de préférence dans le groupe constitué par les produits sanguins et leurs dérivés, les aliments, et les produits cosmétiques.
Selon un mode de réalisation particulier, la concentration de la PrPsc avant l'étape de digestion est obtenue par ultracentrifugation de l'échantillon à titrer à de préférence à 140.000 xg pendant 1 heure à température ambiante, avec un volume d'échantillon d'environ 8.3ml introduit dans un tube préalablement traité pendant lheure à l'albumine sérique bovine à 0.1% et avec un rotor à angle libre (swinging rotor). Au terme de cette ultracentrifugation, le culot sédimenté est repris de préférence dans un volume d'eau ou autre tampon de préférence entre 20 et 60μl.
La suspension de culot est incubée en présence de protéinase K et aux conditions optimales pour la digestion. Au terme de l'étape de digestion, la concentration de la PrPsc est obtenue par nouvelle centrifugation, de préférence à 18 000 x g pendant 30 minutes du produit de la digestion.
L'invention vise également une méthode in vitro de détection et/ou titrage de l'immuno- réactivité d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) dont le marqueur est une protéine de conformation pathologique, dans un échantillon.
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues. L'invention vise également une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation d'un composé susceptible d'affecter l'immunoréactivité d'un produit biologique infectieux, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique infectieux, (A) en présence et (B) en absence dudit composé à évaluer, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) qui est une protéine de conformation pathologique , par la méthode telle que définie ci-dessus.
Description détaillée de l'invention :
Définitions
Une « protéine prion PrP » est généralement une sialoglycoprotéine ancrée à la membrane plasmique par un phosphatidyl glycolipide (GPI), présente à l'état naturel dans les cellules et impliquée dans leur fonctionnement normal. La forme normale de la protéine, c'est-à-dire non pathologique, est généralement appelée PrPc. Elle est impliquée dans le développement du système nerveux chez l'embryon. Chez l'adulte, elle est exprimée essentiellement dans le cerveau et la moelle épinière (neurones et glie). Elle est impliquée dans les processus de différenciation et d'adhésion des cellules. Elle aurait aussi un rôle protecteur antioxydant et vis-à-vis de la mort cellulaire programmée (apoptose). Cette protéine aurait également un rôle dans le repliement d'autres protéines. La forme « pathologique », PrPsc, de la PrP désigne généralement un isoforme de la protéine non pathologique. Elle représente le marqueur des maladies à prions. Cette structure tridimensionnelle modifiée confère des propriétés physico-chimiques atypiques à la protéine prion, qui se traduisent par une plus grande résistance aux moyens de désinfection et de stérilisation habituels (chaleur, produits chimiques, enzymes, etc). La protéine prion pathologique acquiert ainsi des capacités d'auto-agrégation et peut ainsi former des dépôts, notamment dans le cerveau, provoquant la mort neuronale. L'agent responsable de la réplication ou propagation de la protéine prion pathologique serait la protéine prion pathologique elle-même car capable de se « propager ou multiplier » de façon « exponentielle », en déformant les protéines prion saines en protéines prion pathologique. La forme dite « pathologique » de la PrP, est donc la forme de la protéine dont la conformation est corrélée à l'apparition d'une EST chez l'animal humain ou non-humain infecté.
Le «titre», exprimé en unité Western-blot, est une grandeur arbitraire déterminée par la dilution limite de l'échantillon à partir de laquelle plus aucune immunoréactivité n'est observée par western-blot.
Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout agent transmissible non conventionnel, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ, ou bien encore ceux responsables chez les animaux d'EST naturelles, telles que la tremblante ovine, l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline, le dépérissement chronique des cervidés ou l'encéphalopathie spongiforme du vison, ou enfin de souches d'EST expérimentalement adaptées à l'animal de laboratoire. Dans le contexte de l'invention, l'ATNC est également désigné par le terme «agent infectieux ».
Par « échantillon», on désigne toute source de matière susceptible d'être contaminée par un
ATNC. Une telle source de matière peut par exemple être un liquide, un produit alimentaire, une boisson, un produit cosmétique ou un produit issu du génie génétique, une molécule susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC, cette liste n'étant pas limitative. De préférence il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple un liquide biologique ou un tissu ou extrait de tissu. Un tel tissu peut être un tissu du cerveau, de colonne vertébrale, ou tissu tonscillaire, cette liste n'étant pas limitative. L'échantillon peut également être une composition dérivée d'une source humaine ou animale, comme les hormones de croissance ou les extraits cellulaires, comme les extraits pituitaires. Une telle composition peut en effet être contaminée par un ATNC. Dans le cas d'un liquide biologique, celui-ci peut être le sang, la lymphe, l'urine ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De manière préférentielle, l'échantillon est un produit sanguin ou un dérivé, par exemple un dérivé plasmatique ou un concentré de protéine plasmatique.
Concentration des protéines :
La concentration de la protéine PrPsc peut être réalisée par une première étape d'ultracentrifugation de préférence à 140.000xg pendant 1 heure à température ambiante. De manière avantageuse elle est obtenue en utilisant un tube préalablement traité à l'albumine sérique bovine à 0.1% pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à température de +4°C. Ce traitement consiste à neutraliser les forces électrostatiques du matériau (polymère) du tube susceptibles de fixer sur les parois du tube, la PrPsc présente dans l'échantillon à analyser. Ce traitement est obtenu en remplissant le tube d'ultracentrifugation avec la solution de BSA et en le laissant incuber comme décrit ci-dessus.
Au terme de l'ultracentrifugation, le surnageant est évacué et le culot repris par un volume de préférence de 50μl d'eau ou de tout autre tampon.
Elimination de la protéine prion non pathologique (forme PrPc):
L'élimination de la forme non pathologique (PrPc) dans l'échantillon peut être réalisée sur la base de propriétés biochimiques de la PrPsc qui permettent de la distinguer des protéines non pathologiques, en particulier le fait que la PrPsc est relativement plus résistante aux traitements à base de protéases et est moins soluble voire insoluble même en présence de détergents. Ainsi, on utilise par exemple un traitement par protéase, par exemple la protéinase K, pour éliminer les formes sensibles (PrPc) des formes moins sensibles à la digestion (PrPsc). Dans un mode de réalisation particulier, on conduit une digestion à la protéinase K qui conduit à la digestion principalement la PrPc et pas ou peu de la PrPsc. C'est en effet une propriété de la PrPsc que d'être davantage résistante à la PK comparativement à la PrPc. L'étape de détection ultérieure ne détecte donc plus la forme non pathologique de la protéine car celle-ci a été digérée par la protéase.
Concentration de la forme PrPsc digérée :
La protéine Prion pathologique dite « résistante » au traitement par la protéinase, peut être concentrée par centrifugation de préférence à 18.000 xg pendant 30 minutes à température ambiante. Au terme de l'étape de centrifugation de l'échantillon digéré par la protéinase K, le surnageant est évacué et le culot repris dans un volume de tampon de charge correspondant au volume maximum d'un puits de peigne pour le dépôt sur gel d'électrophorèse (typiquement 10 à 15μl) ou 25 μl si une gamme de dilution en tampon de charge et de préférence au pas de 3 est prévue.
La nature du tampon de charge est déterminée par la méthode de détection de la PrPsc utilisée par la suite (voir paragraphe suivant). Ainsi pour une détection de la PrPsc par Western-blot le tampon de charge est préférentiellement du tampon de Laemmli (typiquement : Tris-HCl 0.15M pH = 6,8, SDS 2 à 10%, DTT 0.06M, bleu de bromophénol à 0.3%, glycérol 11.5%).
Détection des protéines de I 'ATNC :
L'étape de détection de la PrPsc dans l'échantillon digéré et concentré comme décrit précédemment peut être effectuée à l'aide des méthodes suivantes : immunochimiques comme le Western-blot ou l'ELISA, l'immunoblot, ou le test de radioactivité, la microscopie électronique, le test de turbidimétrie pour détecter les agrégats, ainsi que des tests structurels incluant la RMN (résonance magnétique nucléaire), le dichroïsme circulaire, la spectroscopie de Raman, l'absorption UV, cette liste n'étant pas limitative.
Titrage des A TNC : La détection de la forme pathologique de la PrP peut être associée à une détermination de la quantité de PrPsc présent dans l'échantillon.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la suspension d'échantillon digéré et concentré est diluée dans du tampon de charge selon une progression géométrique dit aussi pas de dilution. Ce dernier est de préférence de 3. Chaque point de dilution est alors soumis à un test de détection des protéines de l'ATNC comme décrit ci-dessus.
De manière arbitraire, l'unité Western-blot de PrPsc se définit comme l'inverse de la première dilution négative ne présentant pas de signal spécifique de la PrPsc (signal d'extinction de la PrPsc) dans le volume d'échantillon non dilué et utilisé pour le test de détection.
La méthode de l'invention permet de quantifier l'immunoréactivité liée aux ATNC sur une gamme théoriquement infinie. Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode a permis de quantifier l'immunoréactivité liée à la souche de scrapie sur une gamme d'environ 7,5 logio, c'est-à-dire d'environ 31.000.000 unités western-blot. Ceci peut, par exemple, permettre de satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des procédés d'obtention de produits biologiques vis-à-vis de l'élimination des ATNC.
Applications de la méthode de détection ou titrage de l'immuno-réactivité liée aux ATNC :
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC. Cette méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée en ce qu'on applique au produit biologique, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'invention, telle que décrite précédemment, et en ce que l'on compare les deux valeurs de titre obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction de l'ATNC.
En particulier, la méthode de titrage selon l'invention a la capacité d'être aisément applicable à tout type de procédé d'obtention ou de purification de produits biologiques, en particulier de produits sanguins, tels que les dérivés de plasma sanguins, utilisant par exemple les chromatographies ou la nanofiltration. Ainsi, la mise en œuvre de la méthode de l'invention permet d'évaluer et/ou de contrôler l'efficacité d'un procédé (ou d'une partie d'un procédé) d'obtention ou de traitement, voire de purification, de tout produit biologique, susceptible d'être contaminé par un ATNC, dans l'élimination de cet ATNC, grâce à un titrage utilisant la méthode de titrage selon l'invention. On mesure les quantités d'ATNC en amont et en aval du procédé (ou de la partie du procédé) dont on veut apprécier l'efficacité à l'égard de l'ATNC. Par comparaison des deux mesures, on détermine le degré d'élimination de l'agent pathogène. Ainsi, la mise en œuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de l'ATNC suivant l'obtention du produit biologique.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le matériel à décontaminer puis on applique la procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la procédure de décontamination sont comparées pour évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromato graphie, ou encore être la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé permettant de réduire le titre du matériel infectieux. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact de l'échantillon avec le composé à tester sont comparées. L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC, en présence puis en absence du composé à évaluer, au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. Les modalités de la mise en présence du composé sont déterminées selon que l'action du composé prévient l'initiation d'un cycle infectieux ou bloque un cycle infectieux déjà initié. Dans tous les cas, on détermine le titre du produit biologique avec et sans traitement avec le produit à tester. Les deux mesures de titre effectuées sont comparées pour évaluer l'activité modulatrice de l'infectiosité d'un ATNC du composé.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'identification d'un composé permettant de moduler la transformation de la forme non-pathologique en la forme pathologique de l'ATNC, par exemple la transformation de PrP en PrPsc. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on applique la méthode de titrage de l'invention afin de déterminer à nouveau le titre du produit biologique. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact avec le composé sont comparées pour évaluer l'efficacité du composé à tester.
La méthode de l'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui ne limite pas la portée de l'invention.
EXEMPLES :
Matériels et Méthodes
Stock de broyats de cerveaux de hamster infectés
Le lot LN-6246 était constitué de fraction microsomale à 10% en PBS préparée à partir d'un cerveau de hamster infecté par la souche 263K. 3 Aliquotes dénommées LN-6246-1, LN- 6246-2 et LN-6246-3 étaient constitués à partir du lot LN-6246. Les lots LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C provenaient d'une dilution de l'échantillon LN-6246. Cette dilution était réalisée en diluant 10 fois un aliquote de LN-6246 dans du PBS. Les caractéristiques des stocks de broyats de cerveaux de hamsters infectés par la souche 263K utilisés lors de l'étude sont résumées dans le tableau I ci-dessous.
Tableau I : Caractéristiques des stocks d'homogénats de cerveaux infectés par la souche 263K
Figure imgf000014_0001
Dosage de la PrPsc des échantillons LN-6246 par Western-blot « Standard »
(I) Etape de digestion à la Protéinase K :
20μl de chacun des échantillons (LN-6246-1 , LN-6246-2 et LN-6246-3) étaient mis en présence d'un mix constitué de 2μl de tampon de digestion et 2μl d'enzyme protéinase K. La suspension obtenue était incubée à 480C pendant 40 minutes.
Au terme de cette incubation étaient apportés pour chaque échantillon successivement 2μl d'un tampon bloquant pour stopper l'action de la protéinase K puis 20μl de tampon de charge
(Tampon de Laemmli). Le volume réactionnel total, appelé « digestat » était alors de : 46μl.
(II) Etape de la Gamme de dilution : Pour chaque échantillon, une gamme de dilution au pas de 3 dans du tampon de charge était préparée par dilution en cascade avec au départ lOμl de digestat additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu était dit dilué au l/3eme. Cette dilution était reproduite avec le digestat dilué au l/3eme additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu correspondait alors à la dilution l/9eme. Cette opération de dilution était reproduite en cascade jusqu'à la dilution du digestat au l/177181eme.
(III) Etape du Western-blot :
Pour chacun des points de gamme de dilution de chacun des digestats obtenus, une étape de dénaturation à 96°C pendant 5 minutes était réalisée. Les échantillons dénaturés étaient alors déposés à raison de lOμl sur un gel d'électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Dans les lOμl de digestat non dilué déposé sur la piste du gel, il y avait l'équivalent de :
(20μl / 46μl ) x lOμl = 4,35μl de l'échantillon. Ce volume était appelé « Volume Equivalent initial » (VEq)
Les protéines ayant migrées dans le gel étaient transférées sur une membrane PVDF par électro-transfert. La PrPsc présente sur les membranes était détectée par incubation avec l'anticorps 3F4 puis un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (anticorps de chèvre « anti-anticorps de souris »).
Les membranes marquées étaient révélées par chemi-luminescence. Un échantillon était considéré comme positif si le profil électrophorétique avec les trois formes de PrPsc glycosylée était visible sur les autoradiogrammes. Néanmoins en cas de charges très faibles, seule la bande majoritaire correspondant à la forme diglycosylée d'un poids moléculaire d'environ 29kDa était observée.
Le titre des échantillons LN-6246-1, LN-6246-2 et LN-6246-3 était calculé comme suit : T = (1/DL) x (1000/VEq) Avec :
DL : la dilution limite, c'est-à-dire la première dilution ne présentant plus de signal spécifique de la PrPsc sur l' autoradiogramme.
VEq : Le Volume Equivalent initial, soit 4,35μl Dosage de la PrPsc des échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C par Western- blot « optimisé » selon l'invention :
3 tubes pour ultracentrifugation (Beckman ref : 361623 ) étaient remplis d'une solution de d'albumine bovine sérique à 0.1% et incubés à +4°C pendant une nuit (environ 16heures). Au terme de l'incubation, ces tubes étaient vidés et remplis par 8,3 ml de l'échantillon LN-6246- A, LN-6246-B et LN-6246-C. Ces 3 tubes étaient ultracentrifugés avec un rotor libre (swinging rotor Beckman ref SW41) à 140.000 xg pendant 1 heure à température ambiante. Au terme de l 'ultracentrifugation le surnageant était évacué et les culots étaient repris individuellement dans 50μl d'eau. Les suspensions étaient dénommées respectivement LN- 6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C pour les culots repris des tubes respectivement LN-6246- A, -B et -C. Le facteur de concentration maximum théorique était donc de 8300 / 50 soit 166 fois.
50μl de chacune des suspensions LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C étaient mises en présence d'un mix constitué de 5μl de tampon de digestion et 5μl d'enzyme protéinase K. La suspension obtenue était incubée à 48°C pendant 40 min. Au terme de cette incubation était apporté successivement 5μl d'un tampon bloquant pour stopper l'action de la protéinase K. Le volume final du « digestat » était alors de : 65 μl.
Pour chacun des digestats obtenus une concentration était réalisée par centrifugation à 18.000 xg pendant 30 minutes à température ambiante. Au terme de la centrifugation le surnageant était retiré et le culot repris dans 25μl de tampon de charge (tampon de Laemmli).
Une gamme de dilution au pas de 3 dans du tampon de charge était préparée par dilution en cascade avec au départ lOμl de digestat additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu était dit dilué au l/3ème.
Cette dilution était reproduite avec le digestat dilué au l/3eme additionné de 20μl de tampon de charge. Le digestat obtenu correspondait alors à la dilution l/9eme. Cette opération de dilution était reproduite en cascade jusqu'à la dilution du digestat au l/729eme. Pour chacun des points de gamme de dilution du digestat obtenus, une étape de dénaturation à
96°C pendant 5 minutes était réalisée. Les échantillons dénaturés étaient alors déposés à raison de 15μl sur un gel d'électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes
(SDS-PAGE).
Dans ces conditions opératoire, le volume Equivalent initial était de :
(8300/50) x (50μl / 65μl ) x ( 65μl / 25μl) x 15μl = 4980 μl pour chacun des échantillons LN-
6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C.
Comparativement à la méthode de titrage par Western-blot « standard », la méthode optimisée permettait d'augmenter le volume Equivalent initial de : 4980/4,32 soit d'un rapport de 1152 fois, soit 3,061ogio.
Les protéines étaient séparées par électrophorèse et analysées comme décrit précédemment à l'étape III.
Résultats
Les résultats des titrages des échantillons sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous.
Figure imgf000017_0001
Légende : NT : Non testé, ND : Non détectable, NA : Non Applicable, LoD : Limite de détection.
Ces données montraient que le titre de l'échantillon LN-6246-1, LN-6246-2 et LN-6246-3 pouvait être déterminé avec la méthode standard, ce titre était respectivement de : 7,61, 7,13 et 7,131ogio uWB/ml. Le titre moyen était de 7,29 logio uWB/ml. Le titre des échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246-C ne pouvait pas être déterminé avec la méthode standard. Leur titre était inférieur à la limite de détection de cette méthode (Limite de détection théorique de 2.8 log10 uWB/ml).
Par contre, avec la méthode optimisée, le titre de ces échantillons pouvait être déterminé. Il était de 1 ,21 , 0,73 et 1 ,21 logio uWB/ml dans les échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN- 6246-C respectivement. Le titre moyen de ces échantillons était 1 ,05 logio uWB/ml. L'absence de détection de la PrPsc dans les échantillons LN-6246-A, LN-6246-B et LN-6246- C avec la méthode standard était confirmée par le titre de ces échantillons qui était inférieure à la limite de détection de la méthode standard. Ce niveau de titre ne pouvait être déterminé qu'avec la méthode optimisée selon l'invention.
Conclusions
La méthode de dosage par Western-blot optimisé, selon l'invention, permet d'abaisser signifîcativement la limite de détection de la méthode Western-blot. Les étapes de concentration de la PrPsc mises en œuvre dans la méthode optimisée induisent en effet un volume équivalent initial très supérieur à celui mesuré avec la méthode standard.

Claims

Revendications
1. Méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant une étape de concentration de l'échantillon avant et après digestion par une protéase.
2. Méthode selon la revendication 1, comportant les étapes consistant à : i. concentrer ledit agent ATNC ou ladite protéine marqueur de l'infectiosité présent(e) dans l'échantillon, ii. soumettre l'échantillon concentré à une digestion par une protéase, iii. concentrer le digestat obtenu à l'étape (ii), iv. détecter et/ou titrer ledit agent ATNC ou ladite protéine marqueur de l'infectiosité dans le digestat concentré obtenu à l'étape (iii).
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la protéine de conformation pathologique, marqueur de IATNC, est la protéine prion PrPsc.
4. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'étape de concentration avant digestion est réalisée par centrifugation, de préférence par ultracentrifugation.
5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle l'étape de concentration (i) comprend une ultracentrifugation à 140 000 g pendant 1 heure.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans laquelle l'étape de concentration (iii) est réalisée par centrifugation.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la protéase est la protéinase K.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle l'étape (iv) est réalisée par immunochimie.
9. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'étape (iv) est un Western-Blot.
10. Méthode selon l'une des revendications 2 à 9, comprenant une étape intermédiaire de dilution après l'étape (iii) de concentration du digestat, et avant l'étape (iv) de détection ou titrage.
PCT/FR2009/052656 2008-12-22 2009-12-22 Procede de detection d'une infection par prion Ceased WO2010072969A1 (fr)

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