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WO2010072327A2 - Pharmazeutische zusammensetzung auf basis von peptid aus kamelmilch - Google Patents

Pharmazeutische zusammensetzung auf basis von peptid aus kamelmilch Download PDF

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WO2010072327A2
WO2010072327A2 PCT/EP2009/008768 EP2009008768W WO2010072327A2 WO 2010072327 A2 WO2010072327 A2 WO 2010072327A2 EP 2009008768 W EP2009008768 W EP 2009008768W WO 2010072327 A2 WO2010072327 A2 WO 2010072327A2
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WO
WIPO (PCT)
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seq
peptide
amino acid
dpp4
acid sequence
Prior art date
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PCT/EP2009/008768
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Khaled Al Zuobi
Karen Depta
Marwan Al Falah
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KAMAMED GmbH
Original Assignee
KAMAMED GmbH
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Publication date
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Publication of WO2010072327A3 publication Critical patent/WO2010072327A3/de
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • composition based on peptide of camel milk
  • the invention relates to peptides which, for example in camel milk can be isolated, and can be used as active ingredient in pharmaceutical compositions, particularly for use in medical indications that are treated by inhibition of human DPP4, CD26, zAAP and / or DPP8 and / or DPP9 may, in particular type 2 diabetes mellitus, obesity, and / or cardiac 0 cardiovascular diseases as well as diseases caused by T-cells, or treatable by manipulation of T-cells, and in particular by inhibition of DPP4 and whose cell-bound form CD26 and / or APN and / or zAAP can be treated, for example autoimmune diseases.
  • human DPP4, CD26, zAAP and / or DPP8 and / or DPP9 may, in particular type 2 diabetes mellitus, obesity, and / or cardiac 0 cardiovascular diseases as well as diseases caused by T-cells, or treatable by manipulation of T-cells, and in particular by inhibition of DPP4 and whose cell-bound form CD26 and / or APN
  • the invention relates to pharmaceutical compositions for use in neuronal 5 len diseases treatable by inhibition of DPP4 and from CD26 and / or inhibition of APN and / or zAAP and / or neuronal diseases, by inhibiting DPP8 and / or DPP9 are.
  • the invention also relates to the preparation of pharmaceutical compositions containing at least one of the active ingredient peptides in pharmaceutically acceptable formulations, the use of the peptides for the preparation of pharmaceutical compositions, and methods of preparing the peptides for pharmaceutical use.
  • the invention relates to the use of the compounds with inhibiting
  • Action against DPP4 for the preparation of pharmaceutical compositions against medical indications which can be influenced by inhibition and / or inactivation of the DPP4 and / or the membrane-bound form of DPP4, CD26. This applies not only to diabetes and obesity in particular immunological indicators Q functions such.
  • chemokines in particular the group RANTES (regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted), in particular from the group of RANTES, the SDF-l ⁇ (stromal cell-derived factor 1) ( Proost et al., 1998, Shioda et al., 1998), eotaxin (Struyf et al., 1999), LD78 ⁇ (Proost et al., 2000), MIP-1 ⁇ (macrophagel linflammatory protein-lss) (Guan et al.
  • chemokines in particular the group RANTES (regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted), in particular from the group of RANTES, the SDF-l ⁇ (stromal cell-derived factor 1) ( Proost et al., 1998, Shioda et al., 1998), eotaxin (Struyf et al., 1999), LD78 ⁇ (Proost et al., 2000), MIP-1 ⁇ (macropha
  • sitagliptin is used as a drug in type 2 diabetes mellitus.
  • the mechanism of action of sitagliptin is based on the inhibition of human dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), the glucagon-like peptide 1 (GLPL) that promotes insulin secretion by beta islet cells, and the glucose-dependent insulinotrophic
  • GIP Polypeptide
  • lactophorin was not glycosylated and showed sequence similarities to glycosylation-dependent cell adhesion molecule -1 (GIyCAM-1) proteins.
  • the amino acid sequences of lactophorin A and B are deposited under accession number AJI 31714 at EMBL or GenBank.
  • Deacon (Diabetes, 2181-2189 (2004)) describes that inhibition of DPP4 may have antidiabetic activity due to the decreased proteolysis of GLP.
  • Inhibitors of DPP4 are valine pyrrolidide and isoleucine thiazolidide. As the DPP4 inhibitor valine pyrrolidide also in mouse mutants without
  • GLP receptor improved glucose tolerance, it is believed that inhibition of DPP4 also reduces proteolysis of exogenous GIPs.
  • DPP4 inhibitors Isoleucine thiazolidide on Vancouver sugar diabetic fat rats, besides improving glucose tolerance and the improved response of ⁇ cells, also observed a reduction in total body weight.
  • EP 0995440 describes pharmaceutical compositions containing an inhibitor of DPP4 for increasing blood sugar levels.
  • Inhibitors of DPP4 are generally called inhibitors, substrates, pseudo substrates, expression inhibitors, binding proteins and antibodies, in particular alanylpyrrolidide and isoleucyl-thiazolidide, N-valyl-prolyl and O-benzoylhydroxylamine, especially as fumarate.
  • WO 99/67278 describes precursors of isoleucyl thiazolidide for use as inhibitor of DPP4.
  • WO 99/38501 describes the use of dipeptides, namely Pro-Pro,
  • WO 01/68603 describes inhibitors of DPP4 which have a pyrroliding group with a bound cyclopropyl radical.
  • WO 01/40180 describes compounds having a pyrrolidine radical substituted with a nitrile group for use as inhibitor of DPP4.
  • an object of the invention to provide an alternative inhibitor of human DPP4, as well as pharmaceutical compositions containing the inhibitor against DPP4 or CD26 and / or DPP4-like or CD26-like enzymes as an active ingredient.
  • a preferred object is to provide an inhibitor of human DPP4 for use in the preparation of pharmaceutical compositions for medical use in diabetes, particularly diabetes mellitus (type 2 diabetes), as well as for use in other indications more humane by inhibiting the proteolytic activity DPP4 and DPP4-free enzymes and / or
  • a particularly preferred object is to provide a drug for use in the preparation of pharmaceutical compositions which inhibits both human DPP4 and human aminopeptidase N (APN, CD13 aminopeptidase) and / or human zAAP and / or human DPP 8 and / or DPP9 inhibited.
  • the invention achieves the aforementioned object by means of pharmaceutical compositions comprising peptides which are isolatable from camel's milk and have an N-terminal amino acid sequence selected from the group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK or consisting of a peptide having one of the sequences selected from the group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK, or peptides having an N-terminal amino acid sequence after proteolytic cleavage
  • VPQ, KPQ, QPT or EPK or a peptide having one of the sequences VPQ, KPQ, QPT or EPK, for medical use for inhibiting the DPP4 and DPP4 analog peptidases, preferably in combination with the inhibition of APN, zAAP and / or DPP8 and DPP9, especially in the medical indication diabetes mellitus, obesity and / or cardiovascular
  • the invention relates to the use of peptides which have an amino acid sequence N-terminal, which is selected from the group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK or consists of one of the sequences selected from the group consisting of VPQ, KPQ, QPT and EPK, or peptides having, after proteolytic cleavage, an N-terminal amino acid sequence which is or consists of VPQ, KPQ, QPT or EPK for the preparation of pharmaceutical compositions, in particular for use in the aforementioned medical indications.
  • DPP4-like enzymes and peptidases or, equivalently, DPP4-analogous enzymes and peptidases are referred to in particular peptidases having regulatory function, which preferably have a DPP4-like amino acid sequence, for example, comprise at least 80 to 90% identical sequence or consist of it.
  • DPP4-analogue peptidases preferably act in vivo on the same substrates as DPP4, and in particular, such peptide which cleave in vivo GLP-I, GLP-2 and / or GIP and / or NPY and / or PYY.
  • Particularly preferred DPP4-analogue peptidases are those in which the inhibition of their proteolytic activity positively influences one of the medical indications according to the invention.
  • lactophorin A and / or lactophorin B isolated therefrom as well as peptides derived therefrom with specific amino acid sequence inhibitory activity against the human DPP4 and DPP4 analog peptidases, and preferably also against the human aminopeptidase N (APN) and / or against the human cytosolic alanyl aminopeptidase (zAAP) and / or against human dipeptide peptidase 8 (DPP8) and / or dipeptide peptidase 9 (DPP9).
  • APN human aminopeptidase N
  • zAAP human cytosolic alanyl aminopeptidase
  • DPP8 dipeptide peptidase 8
  • DPP9 dipeptide peptidase 9
  • lactophorin A and lactophorin B from camel milk and peptides derived therefrom in particular those which have an amino acid sequence from the group comprising VPQ, KPQ, QPT and EPK at the N-terminus, could be tested in animals for the indications diabetes mellitus type 2, as well as for the indications of obesity and cardiovascular diseases, especially those associated with diabetes mellitus and / or
  • the peptides of the invention also have a significant inhibitory activity against one or more of the group comprising human APN, human zAAP, human DPP8 and / or DPP9 such that enhancing the pharmaceutical effect of the peptides
  • the peptides according to the invention are also resistant to the build up of storage fat tissue, e.g. are effective against obesity.
  • NPY neuropeptide Y
  • PYY peptide YY
  • DPP4 and their membrane-bound forms are less degraded or longer available.
  • a saturation gene generated by NPY and / or PYY is feel stronger or stay longer.
  • the effectiveness of peptides according to the invention against neuronal diseases is based, to the present state of knowledge, on the fact that the inhibition of DPP8 and / or DPP9 alleviates diseases caused or enhanced by the activity of DPP8 and / or DPP9.
  • These neuronal disorders include anxiety, depression and Alzheimer's.
  • the peptides of the invention may be administered by oral administration or by administration by injection, e.g. in the. or IV, of fusion peptides, in particular in a pharmaceutically acceptable formulation, wherein fusion peptides comprise or consist of at least one amino acid sequence or a tripeptide VPQ, KPQ, QPT and EPK at the N-terminus, or the fusion peptides have an amino acid sequence selected from proteolytic Cleavage is generated at least one peptide, the N-terminal amino acid sequence or one of the tripeptides
  • proteolytic cleavage of the fusion peptides after their oral administration may be e.g. done by natural digestive enzymes.
  • a preferred fusion peptide whose proteolytic cleavage by digestive enzymes produces peptides of the invention having an inhibitory effect against at least DPP4 is lactophorin A or lactophorin B, e.g. produced by heterologous expression in microorganisms or eukaryotic cells, or isolated from camel milk.
  • the use of the compounds of the invention for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of HIV infection is due to the inhibition of cell-bound DPP4, which forms CD26 of T lymphocytes. This is because CD26 or DPP4 interacts with the HIV 1 transactivator protein Tat and the HIV1 envelope protein GP 120.
  • the compounds according to the invention can also be used for the preparation of pharmaceutical compositions or as an active ingredient for the treatment of diseases caused by
  • Influencing the T-cell-mediated immune response can be influenced, for example against autoimmune diseases, especially psoriasis, as well as asthma.
  • the effect of peptides according to the invention in medical indications which can be treated by reduction of T cells is based on the current state of knowledge on the influence of CD26 and / or zAAP of T cells.
  • This effect on T cells, as well as the inhibition of the proteolytic activity of DPP4, DPP4-like peptideases, APN, zAAP and / or DPP8 or DPP9 in vivo, is limited in time, eg with a half-life in vivo of up to about 4h, so that negative side effects of the peptides of the invention are also limited in time and therefore do not occur or not significant, in particular the possible increase in metastasis are limited, or not or not significantly occurs.
  • the peptides of the invention are advantageous over known inhibitors of DPP4 because their effect in the organism after administration is of limited duration, e.g. to a main duration of action of about 1 to 4 hours.
  • This limited or compared to e.g. Sitaglipentine phosphate significantly shorter main action time or half-life leads to the fact that the unwanted reduction of the natural cell-cell adhesion is significantly lower or reduced.
  • the time-limited main duration of action of the peptides of the invention as inhibitors of DPP4 is currently considered to be the reason that the side effect of the peptides according to the invention for the generation of neoplasms and in particular the side effect of enhancing the metastasis of existing tumors is significantly lower than in known DPP4 inhibitors.
  • the use of the peptides according to the invention for the preparation of pharmaceutical compositions or as an active ingredient in pharmaceutical compositions for diabetes mellitus, obesity and related cardiovascular diseases, neuronal diseases and / or diseases by HIV therefore has the advantage of low side effects, especially one lower risk of neoplastic neoplasms and / or in particular a lower risk of metastasis of existing neoplasms, eg in endometrial adenocarcinoma, melanoma, prostate carcinoma, hematological tumors, eg acute lymphoblastic leukemia and Hogdekin syndrome, gastrointestinal carcinoma, human hepatocellular carcinoma, lung adenocarcinoma, thyroid carcinoma, papillary and follicular thyroid carcinoma and ovarian cancer.
  • the reason for the low effect of the peptides according to the invention for the amplification or metastasis of at least these neoplasms is currently believed to be that the reduced expression of DPP4 / CD26 on neoplastic cells is favorably influenced by the presence of an inhibitor of DPP4.
  • the presence of peptides according to the invention leads to a reduction in the activity for migration and invasion, or the malignancy of neoplastic cells in comparison to the action of, for example, sigiptipin phosphate, since the reduction in cell-cell adhesion by inhibiting DPP4 is reduced or impaired by peptides according to the invention Temporary occurs.
  • the temporary effect of the peptides of the invention is currently attributed to the fact that the active ingredients have no synthetic derivatizations and can be degraded by the organism. Therefore, undesirable side-effects are also present when administering the compounds for medical purposes
  • the peptides according to the invention and fusion peptides whose proteolytic cleavage products contain peptides according to the invention can be processed by conventional synthesis or isolated from natural sources, in particular from camel milk.
  • Peptides which do not comprise the complete sequence of lactophorin A or lactophorin B may be e.g. by proteolytic cleavage of lactophorin A or lactophorin B, optionally with subsequent purification.
  • chemical peptide syntheses can be used, or the heterologous expression of the peptides from a DNA sequence encoding them, e.g. is derived from the amino acid sequence and is operably interposed between a promoter and a terminator as an expression cassette and expressed in a host organism.
  • compositions containing a peptide of the invention as an active ingredient are formulated for oral administration, especially as an enteric formulation.
  • Amino acid sequences of peptides are in this application from the N-terminus to
  • the basis of the present invention is that the human GPP4 is inhibited in vitro and in vivo by peptides containing one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3), KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (Seq. ID No. 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) at the N-terminus or consist thereof.
  • Preferred fusion peptides which contain one of the tripeptides and are converted by proteolytic cleavage to peptides containing one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 3). 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) at the N- Contain or consist of the amino acid sequence of lactophore A MKFFAVLLLASLAATSLASLNEPKDEIYMESQPTDTSAQ-
  • Further fusion peptides according to the invention which are obtained by proteolytic cleavage
  • Peptides which contain one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3), KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) ) at the N-terminus or consist of, for example N-terminal and / or C-terminal on at least one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (Seq. ID No. 6) have peptide-bound amino acid sequences, in particular with the formation of an amino acid sequence which is recognized by peptidases, eg Digestive enzymes, in particular trypsin, chymotrypsin or pepsin.
  • peptidases eg Digestive enzymes, in particular trypsin, chymotrypsin or pepsin.
  • Peptides according to the invention therefore comprise not only lactophorin A and / or lactophorin B but also fusion proteins of natural or artificial amino acid sequence which, without reaction or after proteolytic cleavage, comprise at least one of the tripeptides VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4) , QPT (SEQ ID NO: 5) or EPK (SEQ ID NO: 6) at its N-terminus to assume such a three-dimensional structure as to significantly inhibit the proteolytic activity of DPP4.
  • VPQ SEQ ID NO: 3
  • KPQ SEQ ID NO: 4
  • QPT SEQ ID NO: 5
  • EPK SEQ ID NO: 6
  • Tripeptide EPK shows in vitro and in vivo an inhibitory activity against APN. Accordingly, compositions of the invention preferably have a peptide with N-terminal tripeptide EPK (SEQ ID NO: 6), eg, SEQ ID NO: 4, in combination with a peptide containing the tripeptide VPQ (SEQ ID NO: 6) 3) contains or consists of N-terminal.
  • the peptides according to the invention also include those variants and modifications of their amino acid sequences which do not significantly impair the inhibitory activity against DPP4 or CD26. In particular, variants have one or more exchanges, deletions or insertions of amino acids, in particular conservative exchanges.
  • FIG. 1 shows a graphic representation of the in vitro inhibition of DPP4 by peptide according to the invention
  • FIG. 2 shows a graphic representation of the in vitro inhibition of DPP4 by peptide according to the invention
  • FIG. 3 shows the relative inhibition of APN1 by the peptide according to the invention
  • FIG. 4 shows a graphic representation of the in vitro inhibition of DPP4 by peptide according to the invention and of actinonin as comparison substance
  • Figure 5 is a graphic representation of in vitro inhibition of DPP8 and
  • FIG. 6 shows a graphic representation of the in vitro inhibition of zAAP by peptide according to the invention
  • Figure 7 shows a graphic representation of the effect of the peptide of the invention on mitochondrial activity
  • Figure 8 shows the inhibition of DPP4 by peptide of the invention in vivo
  • Figure 9 shows the effect of peptides of the invention on the reduction of the increase in the total weight in mice as experimental animals.
  • lactophorin A and B were found to have an inhibitory effect on human DPP4.
  • a first in vitro experiment in which purified human recombinant DPP4 prepared and isolated by Korom (Transplantation 63, 1495-1500 (1997)) by expression in cell culture shows that Lactophorin A was 100ng / mL (Konzl), 200ng / mL (conc2), 500ng / mL (conc3), l ⁇ g / mL (conc4) and 10 ⁇ g / mL (conc5) which inhibits DPP4.
  • the result is shown in FIG. 1 and shows that lactophorin in the concentrations used significantly inhibits the proteolytic activity of DPP4.
  • the activity of DPP4 is absent without the addition of a tids in an otherwise identical experiment.
  • the proteolytic activity was determined as a reaction of one of the substrates GlyPro-AMC (Gly-Pro-Aminomethylcourmarin) or Ala-Pro-Rhodaminl 10 (Rl 10).
  • peptides of the invention were stored in purified form in HEPES buffer (100 mM HEPES, pH 7.5), preferably at -2O 0 C, which also the storage stability of the peptides in solution at temperatures below 0 0 C, preferably at -5 to -70 0 C shows. Tests were performed at 37 ° C. The hydrolysis of added substrate was measured after incubation of the substrate for 2 min at 37 ° C with enzyme and inhibitor.
  • the K value was calculated to be 1.235 ⁇ 10 -3 mg / mL, and similar values could be determined for Lactophorin B.
  • FIG. 2 A comparison of the inhibitory effect of lactophorin A on isolated recombinant human DPP4 in the in vitro experiment is shown in FIG. 2 in comparison with the known DPP4 inhibitor Lys-Z (nitro) -pyrrolidide.
  • the hydrolysis of subsequently added Ala-Pro-Rhodaminl 10 (Rl 10) was determined by incubation with Lactophorin A or Lys-Z (nitro) pyrrolidide over 2 h fluorimetrically.
  • the results are shown in Figure 2 and demonstrate that Lactophorin A inhibits human DPP4.
  • the Lactophorin A IC50 was determined to be 1.77 ⁇ M for GlyPro-AMC and 0.143 ⁇ M for Lys-Z (nitro) pyrrolidide.
  • Peptides obtained by proteolytic fragmentation of lactophorin A and lactophorin B were also analyzed for inhibition of DPP4. It was found that the inhibitory effect of lactophorin is essentially exerted by peptides having N-terminal one of the amino acid sequences VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 4), QPT (SEQ ID NO: 3) 5) or EPK (SEQ ID NO: 6). These peptides can be produced as proteolytic cleavage products from fusion peptides having one of the amino acid sequences VPQ (SEQ ID NO: 3) KPQ (SEQ ID NO: 3).
  • QPT SEQ ID NO: 4
  • EPK SEQ ID NO: 6
  • VPQ (SEQ ID NO: 3) and the natural proteolytic cleavage product of lactophorin A with N-terminal SEQ ID NO: 6, namely SEQ ID NO: 7.
  • APN was detected in the in vitro test.
  • Human recombinant APN which according to Lendecke et al. (BioChem 384 (2003)) was prepared and isolated in the buffer of Example 1 with Lactophorin A at 10 ⁇ g / mL (2 in Figure 3), 5 ⁇ g / mL (3 in Figure 3) or 100 ⁇ g / mL (4 in FIG 3) incubated.
  • Lactophorin A 10 ⁇ g / mL (2 in Figure 3), 5 ⁇ g / mL (3 in Figure 3) or 100 ⁇ g / mL (4 in FIG 3) incubated.
  • the activity of APN is shown without additive (1 in Figure 3).
  • the activity of APN was determined spectrophotometrically as conversion of the substrate AMC to 0 min and 90 min, the results are given below
  • Example 3 Inhibition of DPP8 / DPP9 by Lactophorin A DPP8 / DPP9 was partially purified from livers of CD26-KO mice (Black ⁇ , according to Marguet et al., PNAS (2000)) solubilized in PBS with 1% Triton X100. The mixture of DPP8 / DPP9 was incubated in HEPES buffer with lactophorin A at 37 ° C for 2 h.
  • the substrate Gly-Pro-AMC was added and as control the DPP4-specific inhibitor 3 and the DPP8 / DPP9 specific inhibitor 4, as described by Lankas et al. (Diabetes 54 (10), 2988-2994 (2005)).
  • DPP8 and / or DPP9 inhibited.
  • an IC50 of 21 ⁇ M was determined for lactophorin A, an IC50 of 0.009 ⁇ M for the DPP8 / DPP9 inhibitor and an IC50> 31.25 ⁇ M for the DPP4 inhibitor.
  • DPP8 / DPP9 could also be demonstrated for the peptides of SEQ ID NOS: 3 to 6 and fusion peptides according to the invention, whose amino acid sequence is N-terminal to a sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.
  • Example 4 Inhibition of zAAP by Lactophorin A zAAP was purified from cultured Jurkat cells. zAAP was incubated in HEPES buffer with 0.25 mM DTT with lactophorin A at 37 0 C for 2 h. Subsequently, the substrate Ala-Rhodaminl 10 (Rl 10) was added and the hydrolysis determined by spectrometry after 60 min.
  • Rl 10 substrate Ala-Rhodaminl 10
  • the inhibition of zAAP could also be demonstrated for the peptides of SEQ ID Nos. 3 to 6 and fusion peptides according to the invention, whose amino acid sequence is N-terminal in a sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, Seq. ID No. 5 or SEQ ID NO: 6.
  • Example 6 Inhibitory effect of peptides on DPP4 in vivo
  • the inhibitory effect of peptides according to the invention against DPP4 was measured in blood plasma of a rat to which a peptide according to the invention had previously been administered by hydrolysis of a substrate of DPP4.
  • lactophorin A was used in saline (0.154 M, 0.1% BSA (bovine serum albumin)). Blood plasma was injected from a catheterized rat after fasting overnight (time 0). At the times indicated in FIG. 8, blood samples were taken and heparinized.
  • For the analysis of the activity of DPP4 100 ul heparinized blood with 10 .mu.l 1 M citrate buffer, pH 3.0 was added, centrifuged and refrigerated, or stored for analysis at -20 0 C.
  • lactophorin A 25 mg was dissolved in 5 mL 0.1% BSA in saline and frozen to aliquots of 500 ⁇ L at -20 ° C. From this solution of Lactophorin A, 10 ⁇ L (0.05 mg) was added to the plasma samples (approximately 50 ⁇ L). For the test, 20 ⁇ L of the Lactophorin A-added plasma was mixed with 80 ⁇ L HEPES buffer and the substrate Gly-Pro-pNA and spectrophotometrically measured after incubation for 2 min at 30 ° C for 1 min at 30 ° C. The result of this test is shown in FIG.
  • the inhibitory effect of peptides according to the invention could be demonstrated in the plasma of a healthy rat using the example of lactophore A, if plasma stabilized with citrate buffer contains lactophorin A and substrate for the DPP4.
  • blood samples were taken from a healthy catheterized rat to which no peptide of the invention had been administered.
  • Plasma was prepared from the samples as described above and stabilized with citrate buffer.
  • Gly-Pro-pNA was used in HEPES buffer.
  • lactophorin A was added to individual serum samples 0.05 mg lactophorin A was added. It could be shown that lactophorin A in the serum inhibited the activity of DPP4 from about 11.4 mU / mL to 3.51 mU / mL.
  • lactophorin A which contained 6 of 12 mice (Balb6) an initial weight of 20g orally with the feed.
  • the mice were fed standard diet and water ad libitum. Weight control of the mice before and after 3 weeks showed that oral administration of the peptide of the invention reduced body weight and especially body fat.
  • 6 animals were mixed with 0.5 mg / kg lactophosphin A per day into the feed, 6 control animals received no further additives to the feed.
  • FIG. 9 demonstrates that administration of the peptide according to the invention under otherwise identical feeding and movement conditions leads to a significantly reduced weight gain, in this case the example of lactophorin A.
  • mice treated with the peptide according to the invention had a significantly reduced amount of storage fat, whereas, moreover, no significant anatomical or histological changes were found in comparison with untreated mice.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Peptide, die z.B. aus Kamelmilch isolierbar sind, und als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere zur Verwendung bei medizinischen Indikationen, die durch Hemmung der humanen DPP4, CD26, zAAP und/oder DPP8 und/oder DPP9 therapiert werden können, insbesondere Diabetes mellitus Typ 2, Fettleibigkeit und/oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, sowie Erkrankungen, die durch T-Zellen verursacht sind, bzw. die durch Beeinflussung von T-Zellen behandelbar sind, und insbesondere durch Hemmung von DPP4 bzw. dessen zellgebundener Form CD26 und/oder APN und/oder zAAP behandelbar sind, z.B. Autoimmunerkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei neuronalen Erkrankungen, die durch Hemmung der DPP4 bzw. von CD26 und/oder Hemmung von APN und/oder zAAP und/oder bei neuronalen Erkrankungen, durch Hemmung der DPP 8 und/oder DPP9 behandelbar sind.

Description

Pharmazeutische Zusammensetzung auf Basis von Peptid aus Kamelmilch
5 Die Erfindung betrifft Peptide, die z.B. aus Kamelmilch isolierbar sind, und als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, insbesondere zur Verwendung bei medizinischen Indikationen, die durch Hemmung der humanen DPP4, CD26, zAAP und/oder DPP8 und/oder DPP9 therapiert werden können, insbesondere Diabetes mellitus Typ 2, Fettleibigkeit und/oder Herz-0 Kreislauf-Erkrankungen, sowie Erkrankungen, die durch T-Zellen verursacht sind, bzw. die durch Beeinflussung von T-Zellen behandelbar sind, und insbesondere durch Hemmung von DPP4 bzw. dessen zellgebundener Form CD26 und/oder APN und/oder zAAP behandelbar sind, z.B. Autoimmuήerkrankungen. Weiterhin betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei neurona-5 len Erkrankungen, die durch Hemmung der DPP4 bzw. von CD26 und/oder Hemmung von APN und/oder zAAP und/oder bei neuronalen Erkrankungen, durch Hemmung der DPP8 und/oder DPP9 behandelbar sind.
Neben den Wirkstoffen betrifft die Erfindung auch die Herstellung pharmazeutischer o Zusammensetzungen mit einem Gehalt an zumindest einem der Peptide als aktivem Inhaltsstoff in pharmazeutisch akzeptablen Formulierungen, die Verwendung der Peptide zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, sowie Verfahren zur Herstellung der Peptide für die pharmazeutische Verwendung.
5 Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen mit hemmender
Wirkung gegenüber DPP4 zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen gegen medizinische Indikationen, die durch Hemmung und/oder Inaktivierung der DPP4 und/oder der membrangebunden Form von DPP4, CD26, beeinflussbar sind. Dies betrifft neben Diabetes und Fettleibigkeit insbesondere immunologische Indika- Q tionen, z. B. solche, die durch Chemokine, insbesondere der Gruppe RANTES (regu- lated on activation, normal T-cell expressed and secreted) beeinflusst werden, insbesondere aus der Gruppe von RANTES, die SDF- lα (stromal cell-derived factor 1) (Proost et al., 1998; Shioda et al.,1998), Eotaxin (Struyf et al., 1999), LD78ß (Proost et al., 2000), MIP-lß (macrophagel linflammatory protein-lß) (Guan et al., 2004), 5 MCP-2 (monocyte chemotactic protein-2), IP-10 (Interferon-Inducible Protein 10) und MDC (macrophage-derived chemokine) (De Meester et al., 1999; Lambeir et al., 2001) umfasst. Denn die Aktivität von RANTES wird durch proteolytische Prozessierung beeinflusst, und die Hemmung dieser proteolytischen Prozessierung durch Inhibierung von DPP4 bzw. von CD26 ermöglicht die Verwendung der Verbindungen mit inhibierender Wirkung auf die proteolytische Aktivität von DPP4 und/oder inhibierender Wirkung auf die proteolytische Aktivität von DPP4-ähnlichen regulatorischen Peptidasen als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Stand der Technik
Drucker et al. (Nature Reviews 109-1 10 (2007)) beschreiben die Wirkung von Si- tagliptinphosphat, das als Medikament bei Typ 2 Diabetes mellitus eingesetzt wird. Der Wirkungsmechanismus von Sitagliptin beruht auf der Inhibition von menschlicher Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), die das die Insulinsekretion von beta-Inselzellen fördernde Glukagon-like Peptid 1 (GLPl) und das Glucose-abhängige insulinotrophe
Polypeptid (GIP) durch Proteolyse inaktiviert. Die Hemmung der proteolytischen Aktivität von DPP4 führt daher zu einer länger anhaltenden Aktivität der endogenen glucoregulatorischen Inkretine GIP und GLPl.
Traditionelle Heilverfahren im arabischen Raum und Afrika setzen Kamelmilch als
Nahrungsmittel zur Bekämpfung von Herz-Kreislauf-Krankheiten und Diabetes ein.
Kappeier et al. (J. Dairy Science 2084-2093 (1999)) beschreiben die Klonierung und Aminosäuresequenzierung von Lactophorin A und dessen Variante Lactophorin B aus Kamelmilch. Für Lactophorin wurden gute emulgierende Eigenschaften und die
Inhibition der spontanen Lipolyse durch Lipoproteinlipase gefunden. Das Lactophorin war nicht glykosyliert und zeigte Sequenzähnlichkeiten zu Glykosylierungs- abhängigen Zeiladhäsionsmolekül -1 -Proteinen (GIyCAM- 1). Die Aminosäuresequenzen von Lactophorin A und B sind unter der Zugangsnummer AJl 31714 bei EMBL bzw. GenBank hinterlegt.
Deacon (Diabetes, 2181-2189 (2004)) beschreibt, dass die Inhibierung von DPP4 aufgrund der verminderten Proteolyse von GLPl antidiabetische Wirkung haben kann. Als Inhibitoren von DPP4 werden Valin-pyrrolidid und Isoleucin-thiazolidid genannt. Da der DPP4 - Inhibitor Valin-pyrrolidid auch in Mausmutanten ohne
GLPl -Rezeptor die Glucosetoleranz verbesserte, wird vermutet, dass die Inhibierung von DPP4 auch die Proteolyse exogenen GIPs vermindert. Bei Verabreichung des DPP4 - Inhibitors Isoleucin-thiazolidid an Vancouver-Zucker-diabetische fette Ratten wird neben der Verbesserung der Glucosetoleranz und der verbesserten Reaktion von ß-Zellen auch eine Verminderung des gesamten Körpergewichts beobachtet.
Die EP 0995440 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Hemmstoff der DPP4 enthalten, zur Erhöhung des Blutzuckerspiegels. Als Hemmstoff der DPP4 werden allgemein Inhibitoren, Substrate, Pseudosubstrate, Expressionsinhibitoren, Bindeproteine und Antikörper genannt, insbesondere Alanyl-pyrrolidid und Isoleucyl-thiazolidid, N-Valyl-Prolyl sowie O-Benzoylhydroxylamin, insbesondere als Fumarat.
Die WO 99/67278 beschreibt Vorläufersubstanzen von Isoleucylthiazolidid zur Verwendung als Inhibitor der DPP4.
Die WO 99/38501 beschreibt die Verwendung von Dipeptiden, nämlich von Pro-Pro,
Ala-Pro und D-AIa -L-AIa, als Hemmstoff der DPP4 oder von GLPl .
Die WO 01/68603 beschreibt Inhibitoren der DPP4, die eine Pyrrolidingruppe mit einem gebundenen Cyclopropylrest aufweisen.
WO 01/40180 beschreibt Verbindungen, die einen mit einer Nitrilgruppe substituierten Pyrrolidinrest aufweisen, zu Verwendung als Inhibitor der DPP4.
Aufgabe der Erfindung
Gegenüber dem vorgenannten Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, einen alternativen Hemmstoff für die humane DPP4 bereitzustellen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die den Hemmstoff gegen DPP4 bzw. CD26 und/oder DPP4-ähnliche bzw. CD26-ähnliche Enzyme als Wirkstoff enthalten. Eine bevorzugte Aufgabe liegt in der Bereitstellung eines Hemmstoffs der humanen DPP4 zur Verwendung bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die medizinische Anwendung bei Diabetes, insbesondere Diabetes mellitus (Typ 2 Diabetes), sowie zur Verwendung bei weiteren Indikationen, die durch Hemmung der proteolytischen Aktivität humaner DPP4 und DPP4-ählnicher Enzyme und/oder
Hemmung der humanen APN behandelbar sind. Eine besonders bevorzugte Aufgabe liegt in der Bereitstellung eines Wirkstoffs zur Verwendung für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, der sowohl die humane DPP4 inhibiert, als auch die humane Aminopeptidase N (APN, CD 13- Aminopeptidase) und/oder die humane zAAP und/oder die humane DPP 8 und/oder DPP9 inhibiert.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die vorgenannte Aufgabe durch pharmazeutische Zusammensetzungen mit Peptiden, die aus Kamelmilch isolierbar sind und N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst oder aus einem Peptid mit einer der Sequenzen besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst, oder Peptiden, die nach proteolytischer Spaltung eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen, die
VPQ, KPQ, QPT oder EPK umfasst oder einem Peptid mit einer der Sequenzen VPQ, KPQ, QPT oder EPK besteht, zur medizinischen Verwendung zur Inhibierung der DPP4 und DPP4-analoger Peptidasen, vorzugsweise in Kombination mit der Inhibierung von APN, zAAP und/oder DPP8 und DPP9, insbesondere bei der medizi- nischen Indikation Diabetes mellitus, Fettleibigkeit und/oder Herz-Kreislauf-
Erkrankungen, sowie medizinische Indikationen, die durch Beeinflussung von T- Zellen behandelbar sind, insbesondere Indikationen, die durch Hemmung von CD26 und/oder von zAAP von T-Zellen behandelbar sind. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Peptiden, die N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst oder aus einer der Sequenzen besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst, oder Peptiden, die nach proteolytischer Spaltung eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen, die VPQ, KPQ, QPT oder EPK ist oder daraus besteht, zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere zur Verwendung bei den vorgenannten medizinischen Indikationen.
Als DPP4-ähnliche Enzyme und Peptidasen oder, gleichbedeutend verwendet, DPP4- analoge Enzyme und Peptidasen, werden vorliegend insbesondere Peptidasen mit regulatorischer Funktion bezeichnet, die vorzugsweise eine mit der DPP4 ähnliche Aminosäuresequenz aufweisen, z.B. eine zu mindestens 80 bis 90% identische Sequenz umfassen oder daraus bestehen. DPP4-analoge Peptidasen wirken vorzugsweise in vivo auf die selben Substrate wie DPP4, und sind insbesondere solche Peptid- asen, die in vivo GLP-I, GLP-2 und/oder GIP und/oder NPY und/oder PYY spalten. Besonders bevorzugt sind DPP4-analoge Peptidasen solche, bei denen die Hemmung ihrer proteolytischen Aktivität eine der erfindungsgemäßen medizinischen Indikationen positiv beeinflusst.
Die Analyse und Identifikation einzelner Substanzen aus Kamelmilch hat überraschenderweise gezeigt, dass daraus isoliertes Lactophorin A und/oder Lactophorin B, sowie daraus abgeleitete Peptide mit bestimmter Aminosäuresequenz inhibitorische Wirkung gegen die humane DPP4 und DPP4-analoge Peptidasen, und vorzugsweise auch gegen die humane Aminopeptidase N (APN) und/oder gegen die humane zyto- solische Alanylaminopeptidase (zAAP) und/oder gegen humane Dipeptidpeptidase 8 (DPP8) und/oder Dipeptidpeptidase 9 (DPP9) haben. Diese inhibitorische Wirkung gegenüber den vorgenannten Peptidasen, insbesondere gegenüber DPP4, wurde sowohl in in vitro Tests und in vitro in Zellkultur nachgewiesen, als auch im Ver- suchstier. Die pharmazeutische Wirksamkeit von Lactophorin A und Lactophorin B aus Kamelmilch und daraus abgeleiteten Peptiden, insbesondere solchen, die am N- Terminus eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe aufweisen, die VPQ, KPQ, QPT und EPK umfasst, konnte im Tierversuch für die Indikationen Diabetes mellitus Typ 2 gezeigt werden, sowie für die Indikationen Fettleibigkeit und Herz-Kreislauf- Erkrankungen, insbesondere solchen, die gemeinsam mit Diabetes mellitus und/oder
Fettleibigkeit auftreten, sowie bei Indikationen, die durch T-Zellen verursacht werden. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Peptide neben der Wirkung gegen DPP4 auch eine signifikante inhibitorische Wirkung gegen eine oder mehrere aus der Gruppe, die humane APN, humane zAAP, humane DPP8 und/oder DPP9 umfasst, so dass eine Verstärkung der pharmazeutischen Wirkung der Peptide durch deren
Hemmung von mindestens zwei Peptidasen aus der vorgenannten Gruppe erzielt wird.
Insbesondere konnte im Tierversuch gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide auch bei oraler Verabreichung gegen den Aufbau von Speicherfettgewebe, z.B. gegen Fettleibigkeit wirksam sind.
Es wird vermutet, dass die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Peptide gegen Fettleibigkeit neben der Reduktion der Proteolyse von Insulin auch darauf beruht, dass Neuropeptid Y (NPY) und/oder Peptid YY (PYY) bei Hemmung der Aktivität von
DPP4 und deren membrangebundener Formen weniger stark abgebaut werden bzw. länger vorliegen. Als Folge ist ein durch NPY und/oder PYY erzeugtes Sättigungsge- fühl stärker oder bleibt länger erhalten.
Die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Peptide gegen neuronale Erkrankungen beruht nach derzeitigem Kenntnisstand darauf, dass die Hemmung von DPP8 und/oder DPP9 Erkrankungen lindert, die durch die Aktivität von DPP8 und/oder DPP9 verursacht oder verstärkt werden. Zu diesen neuronalen Erkrankungen zählen insbesondere Angstzustände, Depressionen und Alzheimer.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch orale Verabreichung oder durch Ver- abreichung per Injektion, z.B. i.m. oder i.V., von Fusionspeptiden, insbesondere in pharmazeutisch akzeptabler Formulierung appliziert werden, wobei Fusionspeptide zumindest eine Aminosäuresequenz bzw. ein Tripeptid VPQ, KPQ, QPT und EPK am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen, oder die Fusionspeptide eine Aminosäuresequenz aufweisen, aus der durch proteolytische Spaltung zumindest ein Pep- tid erzeugt wird, das N-terminal eine Aminosäuresequenz bzw. eines der Tripeptide
VPQ, KPQ, QPT und EPK aufweist oder daraus besteht. Die proteolytische Spaltung der Fusionspeptide nach deren oraler Verabreichung kann z.B. durch natürliche Verdauungsenzyme erfolgen. Ein bevorzugtes Fusionspeptid, dessen proteolytische Spaltung durch Verdauungsenzyme erfindungsgemäße Peptide mit inhibitorischer Wirkung zumindest gegen DPP4 erzeugt, ist Lactophorin A oder Lactophorin B, das z.B. durch heterologe Expression in Mikroorganismen oder eukaryotischen Zellen hergestellt ist, oder aus Kamelmilch isoliert ist.
Auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung phar- mazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung von Infektionen durch HIV beruhen auf der Hemmung der zellgebundenen DPP4, CD26 von T- Lymphozyten bildet. Denn CD26 bzw. DPP4 interagiert mit dem HIV 1 - Transaktivatorprotein Tat und dem HIVl - Hüllprotein GP 120. Entsprechend können die erfindungs gemäßen Verbindungen auch zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, bzw. als Wirkstoff zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch
Beeinflussung der T-Zell-vermittelten Immunantwort beeinflusst werden, z.B. gegen Autoimmunerkrankungen, insbesondere Psoriasis, sowie auch Asthma. Die Wirkung erfindungsgemäßer Peptide bei medizinischen Indikationen, die durch Reduktion von T-Zellen behandelbar sind, beruht nach derzeitigem Kenntnisstand auf der Beeinflus- sung von CD26 und/oder zAAP von T-Zellen. Diese Wirkung auf T-Zellen ist ebenso wie die Hemmung der proteolytischen Aktivität von DPP4, DPP4-ähnlichen Pep- tidasen, APN, zAAP und/oder DPP8 bzw. DPP9 in vivo zeitlich begrenzt, z.B. mit einer Halbwertszeit in vivo von bis zu ca. 4h, so dass negative Nebenwirkungen der erfindungsgemäßen Peptide ebenfalls zeitlich begrenzt sind und daher nicht oder nicht signifikant auftreten, insbesondere die mögliche Steigerung der Metastasierung begrenzt sind, bzw. nicht oder nicht signifikant auftritt.
Die erfindungsgemäßen Peptide, die deren Fusionspeptide einschließen können, sind gegenüber bekannten Inhibitoren der DPP4 deshalb vorteilhaft, weil ihre Wirkung im Organismus nach Verabreichung von begrenzter Dauer ist, z.B. auf eine Hauptwirkungsdauer von ca. 1 bis 4 h. Diese begrenzte bzw. im Vergleich zu z.B. Sitaglip- tinphosphat signifikant kürzere Hauptwirkungsdauer bzw. Halbwertszeit fuhrt dazu, dass die unerwünschte Reduktion der natürlichen Zell-Zell-Adhäsion signifikant geringer bzw. vermindert ist. Daher wird die zeitlich begrenzte Hauptwirkungsdauer der erfindungsgemäßen Peptide als Inhibitoren der DPP4 derzeit als Grund dafür angesehen, dass die Nebenwirkung der erfindungsgemäßen Peptide zur Erzeugung von Neoplasmen und insbesondere die Nebenwirkung einer Verstärkung der Metastasierung bestehender Tumore signifikant geringer ist, als bei bekannten DPP4- Inhibitoren.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Herstellung von pharmazeuti- sehen Zusammensetzungen bzw. als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen gegen Diabetes mellitus, Fettleibigkeit und damit zusammenhängende Herz- Kreislauf-Erkrankungen, neuronale Erkrankungen und/oder Erkrankungen durch HIV hat daher den Vorteil geringer Nebenwirkungen, insbesondere ein geringeres Risiko neoplastischer Neuerkrankungen und/oder insbesondere ein geringeres Risiko der Metastasierung bestehender Neoplasmen, z.B. bei endometrialem Adenokarzinom, Melanomen, Prostatakarzinom, hämatologischen Tumoren, z.B. akute lymphatischer Leukämie und Hogdekin-Syndrom, gastrointestinalem Karzinom, humanem hepatozellulären Karzinom, Lungen-Adenokarzinom, Schilddrüsenkarzinom, papillärem und follikulärem Schilddrüsenkarzinom und Ovarialkarzinom. Als Ursache für die geringe Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide zur Verstärkung bzw. Metastasierung von zumindest diesen Neoplasmen wird derzeit angenommen, dass die verminderte Expression von DPP4 / CD26 auf neoplastischen Zellen durch Anwesenheit eines Inhibitors der DPP4 günstig beeinflusst wird. So führt z.B. die Anwesenheit erfindungsgemäßer Peptide zur Minderung der Aktivität zur Migration und Invasion, bzw. der Malignität neoplastischer Zellen im Vergleich zur Wirkung von z.B. Si- tagliptinphosphat, da die Minderung der Zell-Zell-Adhäsion durch Inhibition der DPP4 durch erfindungsgemäße Peptide reduziert bzw. zeitlich begrenzt auftritt. Die zeitlich begrenzte Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide wird derzeit darauf zurückgeführt, dass die Wirkstoffe keine synthetischen Derivatisierungen aufweisen und vom Organismus abgebaut werden können. Daher sind unerwünschte Nebenwir- klingen bei Verabreichung der Verbindungen zu medizinischen Zwecken auch an
Menschen im wesentlichen nicht zu beobachten bzw. im Vergleich mit bekannten Hemmstoffen der DPP4 signifikant reduziert.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Fusionspeptide, deren proteolytische Spaltpro- dukte erfindungsgemäße Peptide enthalten, können durch übliche Synthese verfahren oder aus natürlichen Quellen, insbesondere aus Kamelmilch isoliert werden. Peptide, die nicht die vollständige Sequenz von Lactophorin A oder Lactophorin B umfassen, können z.B. durch proteolytische Spaltung von Lactophorin A oder Lactophorin B, optional mit anschließender Aufreinigung hergestellt werden. Als Syntheseverfahren können chemische Peptidsynthesen verwendet werden, oder die heterologe Expression der Peptide von einer diese kodierenden DNA-Sequenz, die z.B. aus der Aminosäuresequenz abgeleitet ist und funktional zwischen einem Promotor und einem Terminator als Expressionskassette angeordnet ist und in einem Wirtsorganismus exprimiert wird.
Vorzugsweise sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Peptid als Wirkstoff enthalten, zur oralen Verabreichung formuliert, insbesondere als magensaftresistente Formulierung.
Aminosäuresequenzen von Peptiden sind in dieser Anmeldung vom N-Terminus zum
C-Terminus angegeben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Grundlage der vorliegenden Erfindung ist, dass die menschliche GPP4 in vitro und in vivo durch Peptide gehemmt wird, die eines der Tripeptide VPQ (Seq. -ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen.
Bevorzugte Fusionspeptide, die eines der Tripeptide enthalten und durch proteolytische Spaltung zu Peptiden umgesetzt werden, die eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N- Terminus aufweisen oder daraus bestehen, weisen die Aminosäuresequenz von Lac- tophorin A MKFFAVLLLASLAATSLASLNEPKDEIYMESQPTDTSAQ-
VIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLVSKDDVVIK- SARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAATT- LEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ (SEQ.-ID NR. 1 ) oder die Aminosäuresequenz von Lactophorin B MKFFAVLLLASLAATSLASL-
NAAQVIMSNHQVSSEDLSMEPSISREDLVSKDDVVIK- SARRHQNQNPKLLHPVPQESSFRNTATQSEETKELTPGAATT- LEGKLVELTHKIIKNLENTMRETMDFLKSLFPHASEVVKPQ (SEQ.-ID NR. 2) auf. Weitere erfindungsgemäße Fusionspeptide, die durch proteolytische Spaltung zu
Peptiden umgesetzt werden, die eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) am N-Terminus aufweisen oder daraus bestehen, können z.B. N-terminal und/oder C-terminal an zumindest eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) peptidisch gebundene Aminosäuresequenzen aufweisen, insbesondere unter Ausbildung einer Aminosäuresequenz, die von Peptid- asen erkannt wird, z.B. Verdauungsenzymen, insbesondere von Trypsin, Chy- motrypsin oder Pepsin.
Erfindungsgemäße Peptide umfassen daher neben Lactophorin A und/oder Lactophorin B auch Fusionsproteine natürlicher oder künstlicher Aminosäuresequenz, die ohne Umsetzung oder nach proteolytischer Spaltung zumindest eines der Tripeptide VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) an ihrem N-Terminus aufweisen, um eine solche dreidimensionale Struktur anzunehmen, dass sie die proteolytische Aktivität von DPP4 signifikant inhibieren.
Für das proteolytische Spaltprodukt von Lactophorin A wurde ebenfalls bei oraler Verabreichung eine inhibitorische Wirkung auf DPP4 gefunden. Dieses Spaltprodukt, das die Aminosäuresequenz EPKDEIYMESQPTDTS (Seq.-ID Nr. 7) hat und ein Abschnitt der Aminosäuresequenz von Lactophorin A mit dem N-terminalen
Tripeptid EPK (Seq.-ID Nr. 6) ist, zeigt in vitro und in vivo eine inhibierende Wirkung gegenüber APN. Entsprechen weisen erfindungsgemäße Zusammensetzungen vorzugsweise ein Peptid mit N-terminalem Tripeptid EPK (Seq.-ID Nr. 6), z.B. die Seq.-ID Nr. 4, in Kombination mit einem Peptid auf, das das Tripeptid VPQ (Seq.-ID Nr. 3) N-terminal enthält oder daraus besteht. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen auch solche Varianten und Abwandlungen ihrer Aminosäuresequenzen, die die inhibitorische Wirkung gegen DPP4 bzw. CD26 nicht signifikant beeinträchtigen. Insbesondere haben Varianten eine oder mehrere Austäusche, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren, insbesondere konserva- tive Austäusche.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren näher erläutert, bei denen
Figur 1 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt, - Figur 2 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
Figur 3 die relative Hemmung von APNl durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
Figur 4 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid und von Actinonin als Vergleichssubstanz zeigt,
Figur 5 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von DPP8 und
DPP9 durch erfindungsgemäßes Peptid und des DPP4-Inhibitors Actinonin als Vergleichssubstanz zeigt,
Figur 6 eine grafische Darstellung der in vitro Inhibierung von zAAP durch erfindungsgemäßes Peptid zeigt,
Figur 7 eine grafische Darstellung der Wirkung erfindungsgemäßen Peptids auf die mitochondriale Aktivität zeigt,
Figur 8 die Hemmung der DPP4 durch erfindungsgemäßes Peptid in vivo zeigt, und - Figur 9 die Wirkung erfindungsgemäßer Peptide auf die Reduktion der Zunahme des Gesamtgewichts bei Mäusen als Versuchstieren zeigt.
Beispiel 1 : Hemmung der DPP4 durch Fusionspeptid
Bei der Fraktionierung von Peptiden aus Kamelmilch wurde für Lactophorin A und B gefunden, dass sie eine inhibitorische Wirkung auf die humane DPP4 haben. Ein erster in vitro Versuch, bei dem aufgereinigte humane rekombinante DPP4, die nach Korom (Transplantation 63, 1495-1500 (1997)) durch Expression in Zellkultur hergestellt und isoliert wurde, zeigt, dass Lactophorin A bei lOOng/mL (Konzl), 200ng/mL (Konz2), 500ng/mL (Konz3), lμg/mL (Konz4) und lOμg/mL (Konz5) die DPP4 inhibiert. Das Ergebnis ist in Figur 1 dargestellt und zeigt, dass Lactophorin in den eingesetzten Konzentrationen die proteolytische Aktivität von DPP4 signifikant inhibiert. Zum Vergleich (control) ist die Aktivität von DPP4 ohne Zusatz eines Pep- tids im ansonsten identischen Versuch gezeigt. Die proteolytische Aktivität wurde als Umsetzung eines der Substrate GlyPro-AMC (Gly-Pro-Aminomethylcourmarin) oder Ala-Pro-Rhodaminl 10 (Rl 10) bestimmt.
Generell wurden erfindungsgemäße Peptide in aufgereinigter Form in HEPES-Puffer ( 100 mM HEPES, pH 7,5) gelagert, vorzugsweise bei -2O0C, was auch die Lagerstabilität der Peptide in Lösung bei Temperaturen unterhalb von O0C, vorzugsweise bei -5 bis -700C zeigt. Tests wurden bei 37°C durchgeführt. Die Messung der Hydrolyse von zugesetztem Substrat erfolgte nach Inkubation zusetzten Substrats für 2 min bei 37°C mit Enzym und Hemmstoff.
Für Lactophorin A wurden für das Substrat GlyPro-AMC in vitro die folgenden Parameter bestimmt:
Figure imgf000012_0001
Der K|-Wert wurde zu 1,235 x 10"3 mg/mL berechnet. Ähnliche Werte konnten für Lactophorin B bestimmt werden.
Ein Vergleich der inhibitorischen Wirkung von Lactophorin A auf isolierte rekombi- nante humane DPP4 im in vitro Versuch ist in Figur 2 im Vergleich zum bekannten DPP4-Inhibitor Lys-Z(nitro)-Pyrrolidid gezeigt. Zur Messung der Aktivität wurde nach Inkubation mit Lactophorin A bzw. Lys-Z(nitro)-Pyrrolidid über 2h die Hydrolyse von anschließend zugesetztem Ala-Pro-Rhodaminl 10 (Rl 10) fluorimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt und machen deutlich, dass Lactophorin A die humane DPP4 inhibiert. Die IC50 für Lactophorin A wurde für GlyPro-AMC zu 1,77 μM bestimmt, für Lys-Z(nitro)-Pyrrolidid zu 0,143 μM.
Bei Messung der inhibitorischen Wirkung von Lactophorin A mit dem Hydrolysesubstrat Gly-Pro-Aminomethylcoumarin (GlyPro-AMC) wurde eine IC50 = 6,9μM für Lactophorin A gefunden, und von 0,39μM für den bekannten DPP4-Inhibitor Actinonin. Die Daten sind in Figur 4 gezeigt.
Durch proteolytische Fragmentierung von Lactophorin A und Lactophorin B erhaltene Peptide wurden ebenfalls auf die Inhibition von DPP4 analysiert. Dabei wurde gefunden, dass die inhibitorische Wirkung von Lactophorin im Wesentlichen durch Peptide ausgeübt wird, die N-terminal eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq. -ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) aufweisen. Diese Peptide können als proteolytische Spaltprodukte aus Fusionspeptiden ent- stehen, die eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr.
4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) enthalten.
Anhand der folgenden isolierten Peptide konnte gezeigt werden, dass Peptide, die eine der Aminosäuresequenzen VPQ (Seq.-ID Nr. 3), KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) oder EPK (Seq.-ID Nr. 6) N-terminal enthalten, die erfindungsgemäße inhibitorische Wirkung auf DPP4 und/oder Aminopeptidase N haben:
VPQ (Seq.-ID Nr. 3) und das natürliche proteolytische Spaltprodukt aus Lactophorin A mit N-terminaler Seq.-ID Nr. 6, nämlich Seq.-ID Nr. 7.
Beispiel 2: Inhibierung von APN durch Lactophorin A
Die Aktivität von Lactophorin A und B, sowie des Tripeptids der Seq.-ID Nr. 3 auf
APN konnte im in vitro Test nachgewiesen werden.
Humane rekombinante APN, die nach Lendecke et al. (BioChem. 384 (2003)) hergestellt und isoliert war, wurde im Puffer von Beispiel 1 mit Lactophorin A zu lOμg/mL (2 in Figur 3), 5μg/mL (3 in Figur 3) oder lOOng/mL (4 in Figur 3) inkubiert. Zum Vergleich ist die Aktivität von APN ohne Zusatz gezeigt (1 in Figur 3). Die Aktivität von APN wurde als Umsetzung des Substrats AMC spektrophoto- metrisch zu 0 min und 90 min bestimmt, die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle zusammengefasst:
Hemmung der APN durch Lactophorin A
Figure imgf000013_0001
Die Werte zeigen, dass Lactophorin A die Aktivität von APN mit zunehmender Konzentration zunehmend inhibiert. Als Positivkontrolle für die Inhibierung wurde Acti- nonin verwendet. Beispiel 3: Inhibierung von DPP8/DPP9 durch Lactophorin A DPP8/DPP9 wurde aus Lebern von CD26-K.O.-Mäusen (Blackό, nach Marguet et al., PNAS (2000)), solubilisiert in PBS mit 1% Triton X100 teilgereinigt. Die Mi- schung aus DPP8/DPP9 wurde in HEPES-Puffer mit Lactophorin A bei 37°C für 2h inkubiert. Anschließend wurde das Substrat Gly-Pro-AMC zugesetzt und als Kontrolle der DPP4-spezifische Inhibitor 3 und der für DPP8/DPP9 spezifische Inhibitor 4, wie von Lankas et al. (Diabetes 54 (10), 2988-2994 (2005)) beschrieben.
Die Ergebnisse sind in Figur 5 gezeigt und machen deutlich, dass Lactophorin A
DPP8 und/oder DPP9 inhibiert. Für DPP8/DPP9 wurde hier für Lactophorin A eine IC50 von 21μM bestimmt, für den DPP8/DPP9-Inhibitor eine IC50 von 0,009μM und für den DPP4-Inhibitor eine IC50 > 31,25 μM.
Die Hemmung von DPP8/DPP9 konnte auch für die Peptide der Seq.-ID Nrn. 3 bis 6 und erfindungsgemäße Fusionspeptide gezeigt werden, deren Aminosäuresequenz N- terminal eine Sequenz der Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 6 aufwies.
Beispiel 4: Inhibierung von zAAP durch Lactophorin A zAAP wurde aus kultivierten Jurkat-Zellen aufgereinigt. zAAP wurde in HEPES- Puffer mit 0,25 mM DTT mit Lactophorin A bei 370C für 2h inkubiert. Anschließend wurde das Substrat Ala-Rhodaminl 10 (Rl 10) zugesetzt und die Hydrolyse nach 60 min spektrometrisch bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt und machen deutlich, dass Lactophorin A zAAP inhibiert. Für Lactophorin A wurde unter diesen Versuchsbedingungen gegenüber zAAP eine IC50 von > 62,5 μM bestimmt.
Die Hemmung von zAAP konnte auch für die Peptide der Seq.-ID Nrn 3 bis 6 und erfindungsgemäße Fusionspeptide gezeigt werden, deren Aminosäuresequenz N- terminal eine Sequenz der Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 6 aufwies.
Beispiel 5 : Zytotoxizität von Peptiden
Zur Bestimmung der Zytotoxizität erfindungsgemäßer Peptide wurde stellvertretend Lactophorin A in der Lebendfarbung mit Trypanblau (Celltiter-Blue-Test) mit kulti- vierten U937-Zellen eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 7 A für Zellen ohne Zusatz gezeigt, für Zellen mit Zusatz von Lactophorin A oder zur Kontrolle mit Natri- umazid (Na-Azid) in Figur 7B, jeweils in log 2-Verdünnungsschritten. Das Ergebnis zeigt am Beispiel von Lactophorin A, dass erfindungsgemäße Peptide keine wesent- liehe zytotoxische Wirkung haben.
Beispiel 6: inhibitorische Wirkung der Peptide auf DPP4 in vivo Die inhibitorische Wirkung erfindungsgemäßer Peptide gegen DPP4 wurde in Blutplasma einer Ratte, der zuvor ein erfindungsgemäßes Peptid verabreicht worden war, anhand der Hydrolyse eines Substrats der DPP4 gemessen. Als Beispiel für erfindungsgemäße Peptide wurde Lactophorin A in Salzlösung (0,154 M, 0,1% RSA (Rinderserumalbumin)) verwendet. Blutplasma wurde aus einer katheterisierten Ratte nach Fasten über Nacht injiziert (Zeitpunkt 0). Zu den in Figur 8 angegebenen Zeitpunkten wurden Blutproben genommen und heparinisiert. Für die Analyse der Aktivität von DPP4 wurden 100 μL heparinisiertes Blut mit 10 μL 1 M Citratpuffer, pH 3,0 versetzt, zentrifugiert und gekühlt, oder bis zur Analyse bei -20 0C gelagert.
25 mg Lactophorin A wurden in 5 mL 0,1% RSA in der Salzlösung gelöst und zu Aliquots von 500 μL bei -20 °C eingefroren. Von dieser Lösung von Lactophorin A wurden 10 μL (0,05 mg) zu den Plasmaproben (ca. 50 μL) zugesetzt. Für den Test wurden 20 μL des mit Lactophorin A versetzten Plasmas mit 80 μL HEPES-Puffer und dem Substrat Gly-Pro-pNA versetzt und nach einer Inkubation von 2 min bei 30 °C über 1 min bei 30 °C spektrophotometrisch vermessen. Das Ergebnis dieses Tests ist in Figur 8 gezeigt. Es wird deutlich, dass ausgehend von der ursprünglichen Akti- vität von 12,28 mU/mL (-10 min und 0 min) DPP4 im Plasma der Ratte die Aktivität von DPP4 durch Injektion von Lactophorin A im Plasma auf 7,46 mU/mL bei 5 und 10 min nach der Injektion vermindert wurde, gefolgt von einem leichten Anstieg auf etwa 9 mU/mL. Die ursprüngliche Aktivität von DPP4 wurde in den 120 min der Beobachtung nicht wieder erreicht. Insgesamt zeigt daher dieses Experiment, dass Lactophorin A DPP4 im Serum um etwa 40% während der ersten 10 min nach der
Verabreichung der Injektion inhibierte, gefolgt von einer anschließenden Inhibierung um etwa 25% für die nächsten 110 min. Die Ergebnisse sind in Figur 8 dargestellt. Die Langzeituntersuchung ergab, dass ca. 4h nach Verabreichung des Peptids die ursprüngliche Aktivität der DPP4 wieder vorhanden war. Daher kann diesem Ver- such entnommen werden, dass zumindest in diesen Konzentrationen erfindungsgemäße Peptide die proteolytische Aktivität von DPP4 in vivo innerhalb kurzer Zeit nach Verabreichung, z.B. innerhalb von ca. 10 min hemmen, diese Hemmwirkung für mindestens ca. 110 min effektiv ist, und nach ca. 4h die Hemmwirkung auf DPP4 beendet ist. Dieses Ergebnis belegt den Vorteil der erfindungsgemäßen Peptide, dass die Hemmwirkung auf die proteolytische Aktivität zumindest von DPP4 zeitlich begrenzt bzw. im Säugerorganismus reversibel ist.
Die inhibitorische Wirkung erfindungsgemäßer Peptide konnte am Beispiel von Lac- tophorin A auch im Plasma eine gesunden Ratte nachgewiesen werden, wenn mit Citratpuffer stabilisiertem Plasma Lactophorin A und Substrat für die DPP4 zugesetzt wurde. Im Einzelnen wurden Blutproben von einer gesunden katheterisierten Ratte genommen, der noch kein erfindungsgemäßes Peptid verabreicht worden war. Aus den Proben wurde wie oben beschrieben Plasma hergestellt und mit Citratpuffer stabilisiert. Als Substrat für die DPP4- Aktivität wurde Gly-Pro-pNA in HEPES- Puffer eingesetzt. Zu einzelnen Serumproben wurde 0,05 mg Lactophorin A zugesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass Lactophorin A im Serum die Aktivität von DPP4 von etwa 11,4 mU/mL auf 3,51 mU/mL inhibierte.
Vergleichsversuche, bei denen nur Puffer zugesetzt wurde, oder Lactophorin A ohne Citratpuffer zeigten, dass die inhibierende Wirkung von Lactophorin A im Wesentlichen von den Puffersubstanzen unabhängig war.
In der nachfolgenden Tabelle sind die Versuchsansätze im Einzelnen gezeigt:
Figure imgf000016_0001
Dieser Versuch zeigt, dass erfindungsgemäße Peptide die Aktivität von DPP4 in
Plasma von Säugern, denen kein DPP4-Inhibitor verabreicht wurde, inhibiert.
Beispiel 7: Wirkung der Peptide gegen Fettleibigkeit bei Säugern
Die Wirkung von erfindungsgemäßen Peptiden gegen Fettleibigkeit von Säugern wurde am Beispiel von Lactophorin A gezeigt, das 6 von 12 Mäusen (Balb6) mit einem anfänglichen Gewicht von 20g oral mit dem Futter verabreicht wurde. Die Mäuse wurden mit Standardfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Eine Gewichtskontrolle der Mäuse vor dem Versuch und nach 3 Wochen zeigte, dass die orale Verabreichung von erfindungsgemäßem Peptid das Körpergewicht und vor allem den Teil an Körperfett reduzierte. Für den Versuch wurde 6 Tieren 0,5 mg/kg Lactopho- rin A pro Tag ins Futter gemischt, 6 Kontrolltiere erhielten keine weiteren Zusätze zum Futter.
Das Ergebnis ist in Figur 9 gezeigt und belegt, dass die Verabreichung von erfin- dungsgemäßem Peptid unter ansonsten gleichen Fütterungs- und Bewegungsbedingungen zu einer signifikant reduzierten Gewichtszunahme führt, hier am Beispiel von Lactophorin A. Bei den jeweils paarweise angeordneten Balken in Figur 9 steht der jeweils linke Balken für das Endgewicht der Mäuse, denen Lactophorin A verabreicht wurde, und der jeweils rechte Balken für unbehandelte Mäuse.
Die Verminderung der Gesamtgewichtszunahme bei mit erfindungsgemäßem Peptid behandelten Mäusen betrug im Vergleich zu unbehandelten Mäusen unter ansonsten gleichen Bedingungen betrug ca. jeweils 5 g. Anatomische Analysen zeigten, dass die mit erfindungsgemäßem Peptid behandelten Mäuse einen signifikant reduzierten Anteil an Speicherfett aufwiesen, während im übrigen keine wesentlichen anatomischen oder histologischen Veränderungen gegenüber unbehandelten Mäusen festzustellen waren.
Eine detaillierte histologische Analyse der Versuchstiere ergab, dass die Verabreichung des erfindungsgemäßen Peptids keine Gewebsanomalien, insbesondere keine Neoplasmen zur Folge hatte.

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Wirkstoff zur Inhibierung der proteolytischen Aktivität der humanen DPP4, dadurch gekenn- zeichnet, dass der Wirkstoff ein Peptid ist, das N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq. -ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch ge- kennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Peptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch ge- kennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Fusionspeptid ist, das durch Proteolyse durch ein natürliches Verdauungsenzym zu einem Peptid umgesetzt wird, das N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff die Seq.-ID Nr. 7 aufweist oder daraus besteht.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff die Aminosäuresequenz von Lactophorin A (Seq.-ID Nr. 1) oder die Aminosäuresequenz von Lactophorin B (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der voranstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie auch die Aktivität der humanen APN, der humanen zAAP und/oder der humanen DPP8 und/oder DPP9 hemmt.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der voranstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur oralen Verabreichung oder zur Injektion formuliert ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der voranstehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur Verwendung gegen eine medizinische Indikation formuliert ist, die ausgewählt ist unter Diabetes mellitus, Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und T-Zell-vermittelten Krankheiten einschließlich Autoimmunerkrankungen.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur Verwendung gegen neuronale Erkrankungen formuliert ist, die durch Hemmung der humanen DPP8 und/oder DPP9 behandelbar sind.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die neuronale Erkrankung ausgewählt ist aus Angstzuständen, Depressionen und Alzheimer.
11. Verwendung eines Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid N-terminal ,eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die Aktivität der humanen APN, der humanen zAAP und/oder DPP8 und/oder DPP9 hemmt.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus der Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2 oder Seq. -ID Nr. 3 besteht.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fusionspeptid ist, das durch Proteolyse durch ein natürliches Verdauungsenzym zu einem Peptid umgesetzt wird, das N-terminal eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.-ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst.
16. Verwendung nach Anspruch 13 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 7 aufweist oder daraus besteht.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die
Aminosäuresequenz von Lactophorin A (Seq.-ID Nr. 1) oder die Aminosäuresequenz von Lactophorin B (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zur oralen Verabreichung oder zur Injektion formuliert ist.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur Verwendung gegen eine medizinische Indikation formuliert ist, die ausgewählt ist unter Diabetes mellitus, Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf-
Erkrankungen, neuronalen Erkrankungen und T-Zell-vermittelten Krankheiten einschließlich Autoimmunerkrankungen.
20. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder für eine Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, gekennzeichnet durch Bereitstellen eines isolierten Peptids, das eine Aminosäuresequenz aufweist, deren N-Terminus aus der Gruppe ausgewählt ist, die VPQ (Seq.-ID Nr. 3) KPQ (Seq.-ID Nr. 4), QPT (Seq.- ID Nr. 5) und EPK (Seq.-ID Nr. 6) umfasst, Einmischen des Peptids in eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Peptid durch Expression in einem Wirtsorganismus und Isolierung aus dem Wirtsorganismus und/oder aus dessen Kultivierungsmedium hergestellt wird.
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