WO2010068129A1 - Method for processing and infiltrating histological and biological samples - Google Patents
Method for processing and infiltrating histological and biological samples Download PDFInfo
- Publication number
- WO2010068129A1 WO2010068129A1 PCT/RU2008/000769 RU2008000769W WO2010068129A1 WO 2010068129 A1 WO2010068129 A1 WO 2010068129A1 RU 2008000769 W RU2008000769 W RU 2008000769W WO 2010068129 A1 WO2010068129 A1 WO 2010068129A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- samples
- processing
- paraffin
- impregnation
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Definitions
- the technical field The invention relates to research methods, and in particular to methods for preparing histological and biological samples for microscopic examination.
- the samples taken for research before they can be microtomized must be fixed, for example, with an aqueous or aqueous-alcoholic solution of formaldehyde, then dehydrated with a liquid miscible with water, then clarified with an organic liquid that mixes well with dehydrating liquid and paraffin (or other wax) then waxed.
- a waxed sample is suitable for microtomation.
- Fixation is a necessary procedure in histological studies, since tissues isolated from the body undergo changes very soon. Fixation allows you to fix (fix) cells and formed elements of tissues in a form that corresponds to intravital. Not fully fixed tissue continues to change [B.Romeis. Microscopic technique. M. IL, 1953, Ch. IY].
- the duration of each stage depends on many parameters, the most important of which are the volume of the sample, the diffusion rate of the replacement fluid deep into the sample and replaced from its surface, processing temperature, etc.
- the most common is the method of processing and impregnating histological and biological samples, in which the samples are sequentially incubated in at least two portions of a fixing aqueous or water-alcohol solution of formaldehyde, in three portions of a dehydrating liquid containing water, in three portions of a completely anhydrous dehydrating liquid, in two servings antireflection liquid and in two portions of paraffin melt [R. Lilly. Pathological technique and practical histochemistry. M., Mir, 1969, ch. IY].
- the specified method allows you to replace the water contained in the cells and tissues of histological and biological samples, with paraffin without disturbing the tissue and cell structure. This method is widely used in laboratories, but it is very long-lasting and requires a large number of processing fluids.
- a known method of processing and impregnation of histological and biological samples by successively immersing a container (basket) with samples in a fixing aqueous solution of formaldehyde, then in a dehydrating liquid (ethyl alcohol), then in a bleaching liquid (xylene), then in two portions of paraffin, only 12 liquids in which the placed sample basket remains stationary [EP 0269316, M.cl. 4 GOlN 1/28, 1988].
- the disadvantage of this method is its duration.
- the residence time in each fluid is from 15 minutes (endoscopic biopsies) to 2 hours (large pieces, for example, surgical material) and may be longer if samples of large volume are processed.
- the liquids are mixed when a container with samples is lowered into them by rotating the container; in addition, by rotating the container outside the liquid, the remaining liquid in the container is removed before dipping it in the next liquid.
- Periodic dipping and mixing of the processing fluids accelerates the processing, and the removal of residues of the previous fluid before immersion in the next helps to reduce the contamination of the processing fluids of the previous ones.
- this method also requires a large number of shifts of processing reagents.
- the disadvantage of the described method is that it does not provide for the removal of vapors from the tissue processing zone. As a result of this, with intense evaporation, the vapor pressure in the confined space increases, the steam becomes saturated and further evaporation, and hence the removal of the polluting liquid, ceases.
- a known method of processing and impregnation of histological and biological samples including fixing the samples in a fixing liquid containing formaldehyde, dehydrating the samples with ethanol, xylene clarification and paraffin impregnation, all stages are carried out with stirring, excess treatment fluid is removed before impregnation, and the paraffin impregnation stage is carried out under a vacuum.
- all processing steps are carried out under microwave irradiation and mixing.
- the specified method can be used for processing samples with a thickness of 5 mm or more and at the same time a large number of them (210 samples).
- the basis of the invention is the task of reducing the consumption of paraffin used for the impregnation of histological and biological samples.
- the basis of the invention is also the task of reducing processing time by reducing the residence time in the melt of paraffin.
- the claimed invention is also directed to reducing energy consumption for impregnation with molten paraffin at elevated temperatures.
- paraffin impregnation in a method for processing and impregnating histological and biological samples, including fixing the samples in a fixing liquid, dehydrating them, bleaching and paraffin impregnation with stirring, paraffin impregnation is carried out under conditions of forced condensation of vapors of volatile treatment fluids with the removal of condensate from the treatment zone.
- Vapors are condensed at a temperature 10 to 75 ° C below the treatment temperature
- liquids miscible with water and with a paraffin melt can be used as a dehydrating liquid.
- liquids miscible with paraffin melt and water include isopropanol, n-butanol, 2-butanol, isobutanol (methylpropanol-1), l-methoxy-2-propanol, isopropylacetone.
- the boiling point (at atmospheric pressure) of isopropanol is 78 ° C, 2-butanol 99.5 ° C, isobutanol 108 ° C, n-butanol 117 ° C, isopropyl acetone 118 ° C, l-methoxy-2-propanol 120 0 C.
- Mixing in the inventive method is carried out by constant periodic immersion of samples in dehydrating and impregnating liquids and removing from them with a frequency of 6-10 times per minute; when extracting samples from a dehydrating or impregnating liquid, these liquids flow down, which helps to accelerate the diffusion of the medium being replaced from the surface of the sample.
- Such mixing may be carried out, for example, in a drum-type device, such as that described in RU 2 150 197, or in any other device where continuous immersion of samples in a medium and their extraction into the gas phase can be performed. In this case, the evaporation of volatile liquids occurs not only from the mirror of the liquid surface, but also from the surface of the samples. Subsequent immersion does not allow samples to dry.
- a refrigerator on the surface of which water vapor and dehydrating liquids condense, can be placed inside the chamber in which the treatment takes place; In this case, there should be a tray under the refrigerator - a condensate collector. Condensation is discharged from the camera. However, the refrigerator can be placed in an additional chamber, in which free or forced access of vapors is made.
- the temperature of the paraffin melt is maintained at a level exceeding the melting temperature of paraffin by at least 2 0 C.
- the dehydration fluid remaining in the samples evaporates and condenses, and the paraffin remains unpolluted with the processing fluids. Since the contamination of paraffin with processing fluids in the inventive method is minimized, it becomes possible to reduce the number of stations with paraffin from four to two, to reduce the total time of impregnation of the samples and, consequently, the time of exposure to high temperature fabrics, and to reduce energy consumption.
- liquids used in the claimed method miscible with both water and paraffin melt, make it possible to exclude the use of antireflection liquids and a separate stage of enlightenment.
- Example 1 Example 1
- the processing fluid battery includes 10 containers of 3 l each, respectively containing:
- the residence time of the fixing solutions in the device is 10 hours (2 hours the first solution and 8 hours the second).
- the residence time in the device of each portion of isopropanol is 30 minutes
- a pressure of 500 mmHg is set in the device.
- the cooling liquid entering the refrigerator in the form of a coil located under the lid of the chamber was cooled to room temperature (20 ° C). Under these conditions, the samples are incubated for 45 min in two portions of paraffin melt.
- 65 ml of isopropanol containing less than 1% water is condensed; condensate is discharged from the device.
- the experiment is carried out as in example 3, but at the stage of impregnation, the pressure h was maintained at 350 mmHg, the temperature in the chamber was 65 ° C (the boiling point of isopropanol at 350 mmHg was 60 ° C), and the coolant received in the refrigerator, cooled to - 10 ° C.
- the processing time in each change of paraffin melt is 25 minutes.
- paraffin returned after impregnation to the 9th container contains a trace amount of isopropanol, and the paraffin returned to the 10th container does not contain isopropanol.
- the processing fluid battery includes 10 containers of 3 l each, respectively containing:
- the processing time in each portion of isobutanol is 30 minutes, the temperature in the working chamber is 50 ° C.
- coolant is supplied to the refrigerator at room temperature (25 ° C) and the vacuum pump is turned on to create a pressure of 500 mmHg in the device.
- the processing time in each portion of paraffin is 45 minutes at a temperature of 65 ° C and a pressure of 500 mm Hg, coolant is supplied to the refrigerator at room temperature (25 ° C).
- the paraffin returned to the 6th container contains a trace amount of isobutanol, and the paraffin returned to the 7th container does not contain isobutanol.
- Example 4 The experiment was carried out as in example 3, but at the stage of impregnation the pressure was maintained at the level of 100 mmHg, the temperature in the chamber was 65 ° C (the boiling point of isobutanol at 100 mmHg was 60 ° C), and the coolant entering the refrigerator was cooled to -10 ° C.
- the processing time in each change of paraffin melt is 25 minutes.
- Isobutanol returned to the 5th container does not contain water.
- the paraffin returned to the 6th container contains a trace amount of isobutanol, and the paraffin returned to the 7th container does not contain isobutanol.
- the inventive method of processing and impregnation of histological and biological samples can be used in laboratories specializing in histological (pathological and anatomical) and cytological studies, as well as in any other biological and medical institutions involved in microscopic studies of tissues and cells.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Description
Способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов. The method of processing and impregnation of histological and biological samples.
Область техники Изобретение относится к методам исследования, а именно к способам подготовки гистологических и биологических образцов для микроскопического исследования.The technical field The invention relates to research methods, and in particular to methods for preparing histological and biological samples for microscopic examination.
Взятые для исследования образцы, прежде чем их можно микротомировать, должны быть зафиксированы, например, водным или водно-спиртовым раствором формальдегида, затем обезвожены жидкостью, смешивающейся с водой, затем просветлены органической жидкостью, хорошо смешивающейся с обезвоживающей жидкостью и парафином (или другим воском), затем парафинированы. Парафинированный образец пригоден для микротомирования. Фиксация является необходимой процедурой в гистологических исследованиях, поскольку ткани, изолированные из организма, очень скоро претерпевают изменения. Фиксация позволяет закрепить (зафиксировать) клетки и форменные элементы тканей в форме, которая соответствует прижизненной. Не полностью зафиксированная ткань продолжает изменяться [Б.Ромейс. Микроскопическая техника. M. ИЛ, 1953, гл. IY].The samples taken for research before they can be microtomized must be fixed, for example, with an aqueous or aqueous-alcoholic solution of formaldehyde, then dehydrated with a liquid miscible with water, then clarified with an organic liquid that mixes well with dehydrating liquid and paraffin (or other wax) then waxed. A waxed sample is suitable for microtomation. Fixation is a necessary procedure in histological studies, since tissues isolated from the body undergo changes very soon. Fixation allows you to fix (fix) cells and formed elements of tissues in a form that corresponds to intravital. Not fully fixed tissue continues to change [B.Romeis. Microscopic technique. M. IL, 1953, Ch. IY].
Продолжительность каждой стадии (фиксации, обезвоживания, просветления, парафинирования) зависит от многих параметров, из которых главнейшими являются объем образца, скорость диффузии заменяющей жидкости вглубь образца и заменяемой от его поверхности, температура обработки и др.The duration of each stage (fixation, dehydration, bleaching, waxing) depends on many parameters, the most important of which are the volume of the sample, the diffusion rate of the replacement fluid deep into the sample and replaced from its surface, processing temperature, etc.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Наиболее распространенным является способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов, при котором образцы последовательно выдерживают по крайней мере в двух порциях фиксирующего водного или вво дно-спиртового раствора формальдегида, в трех порциях обезвоживающей жидкости, содержащей воду, в трех порциях полностью безводной обезвоживающей жидкости, в двух порциях просветляющей жидкости и в двух порциях расплава парафина [Р.Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. M., «Mиp», 1969, гл. IY]. Указанный способ позволяет заменить воду, содержащуюся в клетках и тканях гистологических и биологических образцов, на парафин без нарушения тканевой и клеточной структуры. Этот способ широко применяется в лабораториях, но он очень продолжителен и требует большого количества обрабатывающих жидкостей.The most common is the method of processing and impregnating histological and biological samples, in which the samples are sequentially incubated in at least two portions of a fixing aqueous or water-alcohol solution of formaldehyde, in three portions of a dehydrating liquid containing water, in three portions of a completely anhydrous dehydrating liquid, in two servings antireflection liquid and in two portions of paraffin melt [R. Lilly. Pathological technique and practical histochemistry. M., Mir, 1969, ch. IY]. The specified method allows you to replace the water contained in the cells and tissues of histological and biological samples, with paraffin without disturbing the tissue and cell structure. This method is widely used in laboratories, but it is very long-lasting and requires a large number of processing fluids.
Известен способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов путем последовательного погружения контейнера (корзины) с образцами в фиксирующий водный раствор формальдегида, затем в дегидратирующую жидкость (этиловый спирт), затем в просветляющую жидкость (ксилол), затем в две порции парафина, всего в 12 жидкостей, в которых помещенная корзина с образцами остается неподвижной [EP 0269316, М.кл.4 GOlN 1/28, 1988]. Недостатком указанного способа также является его продолжительность. Поскольку скорость процесса обработки каждой последующей жидкостью определяется в основном скоростью диффузии вытесняемой жидкости от поверхности образца, пребывание в каждой жидкости составляет от 15 мин (эндоскопические биопсии) до 2-х часов (крупные кусочки, например, операционный материал) и может быть более продолжительным, если обрабатываются образцы большого объема.A known method of processing and impregnation of histological and biological samples by successively immersing a container (basket) with samples in a fixing aqueous solution of formaldehyde, then in a dehydrating liquid (ethyl alcohol), then in a bleaching liquid (xylene), then in two portions of paraffin, only 12 liquids in which the placed sample basket remains stationary [EP 0269316, M.cl. 4 GOlN 1/28, 1988]. The disadvantage of this method is its duration. Since the speed of the treatment with each subsequent fluid is determined mainly by the diffusion rate of the displaced fluid from the surface of the sample, the residence time in each fluid is from 15 minutes (endoscopic biopsies) to 2 hours (large pieces, for example, surgical material) and may be longer if samples of large volume are processed.
Для ускорения процесса, описанного в EP 0269316, было предложено периодически поднимать контейнер с образцами и вновь окунать его в обрабатывающие и пропитывающие жидкости, для чего фирма-заявитель EP 0269316 Shапdоп разработала устройство Сitаdеl. Известен способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов, включающий периодическое окунание образцов в обрабатывающие и пропитывающие жидкости и периодический подъем образцов выше уровня указанных жидкостей [US Раtепt Аррliсаtiоп 20040029284, М.кл.7 B05C 3/00, GOlN 1/00, 2004]. Согласно этому способу для ускорения процесса жидкости перемешивают, когда в них опущен контейнер с образцами, вращением контейнера; кроме того, вращением контейнера вне жидкости оставшуюся в контейнере жидкость удаляют перед окунанием его в следующую жидкость. Периодическое окунание и перемешивание обрабатывающих жидкостей ускоряет процесс обработки, а удаление остатков предшествующей жидкости перед погружением в следующую способствует уменьшению загрязнения обрабатывающих жидкостей предшествующими. Однако указанный способ также требует большого количества смен обрабатывающих реактивов.To speed up the process described in EP 0269316, it was proposed to periodically lift the sample container and dip it again into the processing and impregnating liquids, for which purpose the applicant company EP 0269316 Chapdop developed a Citadel device. A known method of processing and impregnation of histological and biological samples, including periodic dipping of samples in the processing and impregnating liquids and the periodic rise of samples above the level of these liquids [US Patt Arrlistiop 20040029284, M.cl. 7 B05C 3/00, GOlN 1/00, 2004]. According to this method, to speed up the process, the liquids are mixed when a container with samples is lowered into them by rotating the container; in addition, by rotating the container outside the liquid, the remaining liquid in the container is removed before dipping it in the next liquid. Periodic dipping and mixing of the processing fluids accelerates the processing, and the removal of residues of the previous fluid before immersion in the next helps to reduce the contamination of the processing fluids of the previous ones. However, this method also requires a large number of shifts of processing reagents.
Известен способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов путем последовательного погружения образцов в обрабатывающие и пропитывающие жидкости, причем обработку и пропитку проводят в условиях микроволнового облучения [US 6 586 713, М.кл.7 GOlNA known method of processing and impregnation of histological and biological samples by sequentially immersing the samples in processing and impregnating liquids, and the processing and impregnation is carried out under microwave irradiation [US 6 586 713, M. Cl. 7 GOlN
1/28, 2003; US 6 793 890, М.кл.7 GOlN 1/28, 2004]. Согласно указанному способу образцы толщиной не более 3 мм, лучше не более 2 мм и еще лучше 11/28, 2003; US 6,793,890 M.C. 7 GOlN 1/28, 2004]. According to the specified method, samples with a thickness of not more than 3 mm, better not more than 2 mm, and even better 1
- 1,5 мм погружают в фиксирующе-обезвоживающую жидкость, затем в обезвоживающую, обезвоживающее-просветляющую и просветляющую жидкости, после чего образцы пропитывают парафином.- 1.5 mm is immersed in a fixing-dehydrating liquid, then in a dehydrating, dehydrating-clarifying and anti-clarifying liquid, after which the samples are impregnated with paraffin.
Все процедуры проводят при микроволновом облучении и нагреве, причем на стадиях обработки растворы нагреты до 45 - 60°C, на стадии пропитки парафин нагрет до 75°C. Процесс обработки и пропитки протекает быстро - не долее 2-х часов - что естественно при обработке достаточно горячими жидкостями тонких образцов; кроме того, одновременно обрабатывают не более 60 - 70 образцов.All procedures are carried out under microwave irradiation and heating; moreover, at the processing stages, the solutions are heated to 45-60 ° C, and at the impregnation stage, paraffin is heated to 75 ° C. The processing and impregnation process proceeds quickly - no more than 2 hours - which is natural when processing thin samples with sufficiently hot liquids; in addition, no more than 60 to 70 samples are simultaneously processed.
Недостатком указанного способа является его чувствительность к размеру обрабатываемых образцов и необходимость дополнительной их резки, что трудозатратно, а для свежего (не фиксированного) материала требует специального оборудования.The disadvantage of this method is its sensitivity to the size of the processed samples and the need for additional cutting, which is labor intensive, and for fresh (not fixed) material requires special equipment.
Известен способ по US 20080248560, м.кл. GOlN 1/31, 2008, согласно которому в процессе гистологической обработки тканей задаются такие давление и температура обрабатывающих жидкостей, чтобы загрязняющая жидкость испарялась, причем давление в процессе обработки изменяется таким образом, что испарение загрязняющей жидкости происходит в контролируемых условиях.The known method according to US 20080248560, mcl GOlN 1/31, 2008, according to which during the histological treatment of tissues, the pressure and temperature of the processing fluids are set so that the contaminating fluid evaporates, and the pressure during processing changes so that the evaporation of the contaminant occurs under controlled conditions.
Недостатком описанного способа является то, что не предусматривается удаление паров из зоны обработки тканей. В результате этого при интенсивном испарении давление паров в замкнутом пространстве нарастает, пар становится насыщенным и дальнейшее испарение, а значит и удаление загрязняющей жидкости, прекращается.The disadvantage of the described method is that it does not provide for the removal of vapors from the tissue processing zone. As a result of this, with intense evaporation, the vapor pressure in the confined space increases, the steam becomes saturated and further evaporation, and hence the removal of the polluting liquid, ceases.
Известен способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов, включающий фиксацию образцов в фиксирующей жидкости, содержащей формальдегид, обезвоживание образцов этанолом, просветление ксилолом и пропитку парафином, причем все стадии проводятся при перемешивании, перед пропиткой удаляют избыток обрабатывающей жидкости, а стадию пропитки парафином проводят под вакуумом. [US 7 075 045, М.кл.7 H05B 6/64, 2006]. Согласно указанному способу, все стадии обработки проводят в условиях микроволнового облучения и перемешиванияA known method of processing and impregnation of histological and biological samples, including fixing the samples in a fixing liquid containing formaldehyde, dehydrating the samples with ethanol, xylene clarification and paraffin impregnation, all stages are carried out with stirring, excess treatment fluid is removed before impregnation, and the paraffin impregnation stage is carried out under a vacuum. [US 7,075,045, M.C. 7 H05B 6/64, 2006]. According to the specified method, all processing steps are carried out under microwave irradiation and mixing.
«для поддержания равномерности тeмпepaтypы» обрабатывающих жидкостей."To maintain temperature uniformity" of the processing fluids.
Перемешивание производится с помощью магнитной мешалки. Перед стадией пропитки образцы подсушивают под вакуумом, но при условии, что полного высушивания образцов не происходит. Указанный способ может использоваться для обработки образцов толщиной в 5 мм и более и одновременно большого их количества (210 образцов).Mixing is carried out using a magnetic stirrer. Before the impregnation step, the samples are dried under vacuum, but provided that the samples do not completely dry. The specified method can be used for processing samples with a thickness of 5 mm or more and at the same time a large number of them (210 samples).
Недостатком указанного способа является стадия вакуумного подсушивания образцов, которую трудно контролировать так, чтобы избежать полного высушивания. Высушенные или пересушенные перед пропиткой образцы плохо пропитываются парафином или другим воском, что приводит к непригодности их для дальнейшего исследования.The disadvantage of this method is the stage of vacuum drying of the samples, which is difficult to control so as to avoid complete drying. Samples dried or dried before impregnation are poorly impregnated with paraffin or other wax, which makes them unsuitable for further research.
Кроме того, всем способам, проводящимся в условиях микроволнового облучения, свойствен общий недостаток - необходимость защиты обслуживающего персонала от микроволнового излучения, что утяжеляет и усложняет аппаратуру.In addition, all methods carried out under microwave irradiation have a common drawback - the need to protect service personnel from microwave radiation, which complicates and complicates the equipment.
Анализ предшествующего уровня техники показывает, что всем известным способам обработки и пропитки свойствен высокий удельный расход обрабатывающих веществ, в том числе восков (парафина). Раскрытие изобретенияAnalysis of the prior art shows that all known methods of processing and impregnation are characterized by a high specific consumption of processing substances, including waxes (paraffin). Disclosure of invention
В основу изобретения поставлена задача снижения расхода парафина, используемого для пропитки гистологических и биологических образцов. В основу изобретения также поставлена задача сокращения времени обработки за счет уменьшения времени пребывания в расплаве парафина.The basis of the invention is the task of reducing the consumption of paraffin used for the impregnation of histological and biological samples. The basis of the invention is also the task of reducing processing time by reducing the residence time in the melt of paraffin.
Заявляемое изобретение направлено также на снижение энергозатрат на пропитку расплавленным парафином при повышенной температуре. Согласно изобретению в способе обработки и пропитки гистологических и биологических образцов, включающем фиксацию образцов в фиксирующей жидкости, их обезвоживание, просветление и пропитку парафином при перемешивании, пропитку парафином проводят в условиях принудительной конденсации паров летучих обрабатывающих жидкостей с удалением конденсата из зоны обработки.The claimed invention is also directed to reducing energy consumption for impregnation with molten paraffin at elevated temperatures. According to the invention, in a method for processing and impregnating histological and biological samples, including fixing the samples in a fixing liquid, dehydrating them, bleaching and paraffin impregnation with stirring, paraffin impregnation is carried out under conditions of forced condensation of vapors of volatile treatment fluids with the removal of condensate from the treatment zone.
Конденсация паров производится при температуре, на 10 - 75 °C ниже температуры обработки,Vapors are condensed at a temperature 10 to 75 ° C below the treatment temperature,
В качестве обезвоживающей жидкости могут использоваться жидкости, смешивающиеся с водой и с расплавом парафина. В качестве примеров жидкостей, смешивающихся с расплавом парафина и водой, можно назвать изопропанол, н-бутанол, 2-бyтaнoл, изобутанол (мeтилпpoпaнoл-1), l-мeтoкcи-2-пpoпaнoл, изопропилацетон.As a dehydrating liquid, liquids miscible with water and with a paraffin melt can be used. Examples of liquids miscible with paraffin melt and water include isopropanol, n-butanol, 2-butanol, isobutanol (methylpropanol-1), l-methoxy-2-propanol, isopropylacetone.
Температура кипения (при атмосферном давлении) изопропанола составляет 78°C, 2-бyтaнoлa 99,5°C, изобутанола 108°C, н-бутанола 117°C, изопропилацетона 118°C, l-мeтoкcи-2-пpoпaнoлa 1200C.The boiling point (at atmospheric pressure) of isopropanol is 78 ° C, 2-butanol 99.5 ° C, isobutanol 108 ° C, n-butanol 117 ° C, isopropyl acetone 118 ° C, l-methoxy-2-propanol 120 0 C.
При использовании обезвоживающей жидкости, температура кипения которой выше температуры кипения воды, принудительную конденсацию паров обрабатывающих жидкостей с удалением их из зоны обработки можно применять и на стадии обезвоживания, так как в этом случае в первую очередь будет испаряться и выводиться вода, ускоряя тем самым процесс обезвоживания и уменьшая степень разбавления обезвоживающей жидкости. При этом можно сократить количество станций обезвоживания.When using a dehydrating liquid, the boiling point of which is higher than the boiling point of water, forced condensation of the processing fluid vapors with their removal from the treatment zone can also be applied at the dehydration stage, since in this case water will be evaporated and removed first, thereby accelerating the dehydration process and reducing the degree of dilution of the dehydration fluid. At the same time, the number of dehydration stations can be reduced.
Перемешивание в заявляемом способе осуществляется постоянным периодическим погружением образцов в обезвоживающие и пропитывающие жидкости и извлечением из них с частотой 6-10 раз в минуту; при извлечении образцов из обезвоживающей или пропитывающей жидкости эти жидкости стекают вниз, что способствует ускорению диффузии заменяемой среды от поверхности образца. Такое перемешивание может осуществляться, например, в устройстве барабанного типа, такого, какое описано в RU 2 150 197, или в любом другом, где может выполняться постоянное погружение образцов в среду и извлечение их в газовую фазу. При этом испарение летучих жидкостей происходит не только с зеркала поверхности жидкости, но и с поверхности образцов. Последующее погружение не позволяет образцам высохнуть.Mixing in the inventive method is carried out by constant periodic immersion of samples in dehydrating and impregnating liquids and removing from them with a frequency of 6-10 times per minute; when extracting samples from a dehydrating or impregnating liquid, these liquids flow down, which helps to accelerate the diffusion of the medium being replaced from the surface of the sample. Such mixing may be carried out, for example, in a drum-type device, such as that described in RU 2 150 197, or in any other device where continuous immersion of samples in a medium and their extraction into the gas phase can be performed. In this case, the evaporation of volatile liquids occurs not only from the mirror of the liquid surface, but also from the surface of the samples. Subsequent immersion does not allow samples to dry.
Холодильник, на поверхности которого пары воды и обезвоживающих жидкостей конденсируются, может быть размещен внутри камеры, в которой происходит обработка; в этом случае под холодильником должен находиться поддон - сборник конденсата. Конденсат выводится из камеры. Однако холодильник может быть размещен в дополнительной камере, в которую осуществлен свободный или принудительный доступ паров.A refrigerator, on the surface of which water vapor and dehydrating liquids condense, can be placed inside the chamber in which the treatment takes place; In this case, there should be a tray under the refrigerator - a condensate collector. Condensation is discharged from the camera. However, the refrigerator can be placed in an additional chamber, in which free or forced access of vapors is made.
На стадии пропитки температура расплава парафина поддерживается на уровне, превышающем температуру плавления парафина не менее, чем на 20C. В этих условиях испаряется и конденсируется оставшаяся в образцах обезвоживающая жидкость, а парафин остается незагрязненным обрабатывающими жидкостями. Поскольку загрязнение парафина обрабатывающими жидкостями в заявляемом способе минимизировано, становится возможным уменьшить количества станций с парафином с четырех до двух, снизить общее время пропитки образцов и, следовательно, время воздействия на ткани высокой температуры, и уменьшить энергозатраты.At the stage of impregnation, the temperature of the paraffin melt is maintained at a level exceeding the melting temperature of paraffin by at least 2 0 C. Under these conditions, the dehydration fluid remaining in the samples evaporates and condenses, and the paraffin remains unpolluted with the processing fluids. Since the contamination of paraffin with processing fluids in the inventive method is minimized, it becomes possible to reduce the number of stations with paraffin from four to two, to reduce the total time of impregnation of the samples and, consequently, the time of exposure to high temperature fabrics, and to reduce energy consumption.
Используемые в заявленном способе жидкости, смешивающиеся и с водой, и с расплавом парафина, позволяют исключить использование просветляющих жидкостей и отдельную стадию просветления.The liquids used in the claimed method, miscible with both water and paraffin melt, make it possible to exclude the use of antireflection liquids and a separate stage of enlightenment.
Далее заявляемый способ поясняется примерами, но не ограничен ими. Пример 1.Further, the claimed method is illustrated by examples, but is not limited to them. Example 1
В устройство для обработки гистологических и биологических образцов загружается 200 кассет, содержащих каждая по одному аутопсийному образцу объемом около 1 см3. Суммарный объем образцов составляет 200 см3. Батарея обрабатывающих жидкостей включает 10 контейнеров объемом по 3 л, содержащих соответственно:200 cassettes are loaded into the device for processing histological and biological samples, each containing one autopsy sample with a volume of about 1 cm 3 . The total volume of the samples is 200 cm 3 . The processing fluid battery includes 10 containers of 3 l each, respectively containing:
1. фиксирующее вещество - 4%-ный водный раствор формальдегида;1. fixing substance - 4% aqueous formaldehyde solution;
2. фиксирующее вещество - 4%-ный водный раствор формальдегида;2. fixing substance - 4% aqueous formaldehyde solution;
3. 100% изопропанол; 4. 100% изoпpoпaнoл;3.100% isopropanol; 4. 100% isopropanol;
5. 100% изопропанол;5.100% isopropanol;
6. 100% изопропанол;6. 100% isopropanol;
7. 100% изопропанол; 8. 100% изопропанол;7. 100% isopropanol; 8. 100% isopropanol;
9. расплав парафина;9. paraffin melt;
10. расплав парафина.10. melt paraffin.
Указанные жидкости подают в устройство, где они заполняют около половины объема. Кассеты с образцами опускаются в обрабатывающие жидкости и извлекаются из них с частотой 10 раз в минуту. Температура фиксирующего раствора и изопропанола 250C; температура расплава парафинаThese liquids are fed into the device, where they fill about half the volume. Cassettes with samples are lowered into the processing liquids and removed from them with a frequency of 10 times per minute. The temperature of the fixing solution and isopropanol 25 0 C; paraffin melt temperature
65 С. Время пребывания фиксирующих растворов в устройстве 10 часов (2 часа первый раствор и 8 часов второй). Время пребывания в устройстве каждой порции изопропанола 30 мин. После замены изопропанола на расплав парафина в устройстве устанавливают давление 500 мм рт.ст. Охлаждающая жидкость, поступающая в холодильник в форме змеевика, расположенного под крышкой камеры, охлаждалась до комнатной температуры (20°C). При этих условиях образцы выдерживают по 45 мин в двух порциях расплава парафина. На стадии пропитки конденсируется 65 мл изопропанола, содержащего менее 1% воды; конденсат выводится из устройства.65 C. The residence time of the fixing solutions in the device is 10 hours (2 hours the first solution and 8 hours the second). The residence time in the device of each portion of isopropanol is 30 minutes After replacing isopropanol with a paraffin melt, a pressure of 500 mmHg is set in the device. The cooling liquid entering the refrigerator in the form of a coil located under the lid of the chamber was cooled to room temperature (20 ° C). Under these conditions, the samples are incubated for 45 min in two portions of paraffin melt. In the impregnation step, 65 ml of isopropanol containing less than 1% water is condensed; condensate is discharged from the device.
Пример 2Example 2
Опыт проводят как в примере 3, но на стадии пропитки давление ч поддерживалось на уровне 350 мм рт.ст., температура в камере 65 С (температура кипения изопропанола при 350 мм рт.ст. составляет 60°C), а охлаждающая жидкость, поступающая в холодильник, охлаждалась до - 10°C. Время обработки в каждой смене расплава парафина составляет 25 мин.The experiment is carried out as in example 3, but at the stage of impregnation, the pressure h was maintained at 350 mmHg, the temperature in the chamber was 65 ° C (the boiling point of isopropanol at 350 mmHg was 60 ° C), and the coolant received in the refrigerator, cooled to - 10 ° C. The processing time in each change of paraffin melt is 25 minutes.
На стадии пропитки конденсируется 85 мл изопропанола, содержащего менее 1% воды.In the impregnation step, 85 ml of isopropanol containing less than 1% water is condensed.
Микроскопическое исследование образцов примеров 1 и 2 показало, что все образцы обработаны качественно.Microscopic examination of the samples of examples 1 and 2 showed that all samples were processed efficiently.
Парафин, возвращенный после пропитки в 9 контейнер содержит следовое количество изопропанола, а парафин, возвращенный в 10 контейнер, не содержит изопропанола. Пример 3.The paraffin returned after impregnation to the 9th container contains a trace amount of isopropanol, and the paraffin returned to the 10th container does not contain isopropanol. Example 3
В устройство для обработки гистологических и биологических образцов загружается 200 кассет, содержащих каждая по одному аутопсийному образцу объемом около 1 см3. Суммарный объем образцов составляет 200 см3. Батарея обрабатывающих жидкостей включает 10 контейнеров объемом по 3 л, содержащих соответственно:200 cassettes are loaded into the device for processing histological and biological samples, each containing one autopsy sample with a volume of about 1 cm 3 . The total volume of the samples is 200 cm 3 . The processing fluid battery includes 10 containers of 3 l each, respectively containing:
1. фиксирующее вещество - 4%-ный водный раствор формальдегида;1. fixing substance - 4% aqueous formaldehyde solution;
2. фиксирующее вещество - 4%-ный водный раствор формальдегида;2. fixing substance - 4% aqueous formaldehyde solution;
3. 100% изобутанол; 4. 100% изобутанол;3.100% isobutanol; 4. 100% isobutanol;
5. 100% изобутанол;5.100% isobutanol;
6. расплав парафина;6. paraffin melt;
7. расплав парафина.7. paraffin melt.
Время обработки в каждой порции изобутанола составляет 30 мин, температура в рабочей камере 50°C. Во время обработки в холодильник подается охлаждающая жидкость при комнатной температуре (250C) и включается вакуум-насос для создания в устройстве давления 500 мм рт.ст. В этих условиях конденсируется около 300 мл смеси, содержащей около 70% изобутанола и 30% воды, которая выводится из устройства. На стадии пропитки парафином время обработки в каждой порции парафина составляет 45 мин при температуре 65°C и давлении 500 мм рт.ст., в холодильник подается охлаждающая жидкость при комнатной температуре (250C).The processing time in each portion of isobutanol is 30 minutes, the temperature in the working chamber is 50 ° C. During processing, coolant is supplied to the refrigerator at room temperature (25 ° C) and the vacuum pump is turned on to create a pressure of 500 mmHg in the device. Under these conditions, about 300 ml of a mixture containing about 70% isobutanol and 30% water, which is removed from the device, condenses. At the stage of paraffin impregnation, the processing time in each portion of paraffin is 45 minutes at a temperature of 65 ° C and a pressure of 500 mm Hg, coolant is supplied to the refrigerator at room temperature (25 ° C).
Удаляется 60 мл конденсата изобутанола, содержащего следовое (менее 0,1%) количество воды.60 ml of isobutanol condensate containing a trace (less than 0.1%) amount of water is removed.
Парафин, возвращенный в 6 контейнер, содержит следовое количество изобутанола, а парафин, возвращенный в 7 контейнер, не содержит изобутанола.The paraffin returned to the 6th container contains a trace amount of isobutanol, and the paraffin returned to the 7th container does not contain isobutanol.
Пример 4 Опыт проводят как в примере 3, но на стадии пропитки давление поддерживалось на уровне 100 мм рт.ст., температура в камере 650C (температура кипения изобутанола при 100 мм рт.ст. составляет 60°C), а охлаждающая жидкость, поступающая в холодильник, охлаждалась до - 10°C. Время обработки в каждой смене расплава парафина составляет 25 мин.Example 4 The experiment was carried out as in example 3, but at the stage of impregnation the pressure was maintained at the level of 100 mmHg, the temperature in the chamber was 65 ° C (the boiling point of isobutanol at 100 mmHg was 60 ° C), and the coolant entering the refrigerator was cooled to -10 ° C. The processing time in each change of paraffin melt is 25 minutes.
. На стадии пропитки конденсируется 75 мл изобутанола, содержащего следовое (менее 0,1%) количество воды. Микроскопическое исследование образцов примеров 3 и 4 показало, что все образцы обработаны качественно.. At the impregnation stage, 75 ml of isobutanol containing a trace (less than 0.1%) amount of water is condensed. Microscopic examination of the samples of examples 3 and 4 showed that all samples were processed efficiently.
Изобутанол, возвращенный в 5-й контейнер, не содержит воды. Парафин, возвращенный в 6 контейнер, содержит следовое количество изобутанола, а парафин, возвращенный в 7 контейнер, не содержит изобутанола.Isobutanol returned to the 5th container does not contain water. The paraffin returned to the 6th container contains a trace amount of isobutanol, and the paraffin returned to the 7th container does not contain isobutanol.
Благодаря принудительной конденсации паров и выведению конденсата из рабочей камеры давление паров в рабочей камере всегда ниже давления насыщенного пара, поэтому испарение происходит непрерывно. Обработка может выполняться в щадящих условиях умеренного вакуума и в обычном температурном режиме.Due to forced condensation of vapors and the removal of condensate from the working chamber, the vapor pressure in the working chamber is always lower than the saturated vapor pressure, therefore, evaporation occurs continuously. Processing can be performed under gentle conditions of moderate vacuum and in normal temperature conditions.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Заявляемый способ обработки и пропитки гистологических и биологических образцов может использоваться в лабораториях, специализирующихся на гистологических (патолого-анатомических) и цитологических исследованиях, а также в любых других биологических и медицинских учреждениях, занимающихся микроскопическими исследованиями тканей и клеток. The inventive method of processing and impregnation of histological and biological samples can be used in laboratories specializing in histological (pathological and anatomical) and cytological studies, as well as in any other biological and medical institutions involved in microscopic studies of tissues and cells.
Claims
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2008/000769 WO2010068129A1 (en) | 2008-12-10 | 2008-12-10 | Method for processing and infiltrating histological and biological samples |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2008/000769 WO2010068129A1 (en) | 2008-12-10 | 2008-12-10 | Method for processing and infiltrating histological and biological samples |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2010068129A1 true WO2010068129A1 (en) | 2010-06-17 |
Family
ID=42242931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2008/000769 Ceased WO2010068129A1 (en) | 2008-12-10 | 2008-12-10 | Method for processing and infiltrating histological and biological samples |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2010068129A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110031279A (en) * | 2019-03-30 | 2019-07-19 | 吴淑华 | Sample fixed station |
| CN110823665A (en) * | 2019-11-27 | 2020-02-21 | 李雄 | Application of n-butanol in preparation of low-toxicity dehydrating agent for dehydrating biopsy tissue specimen and preparing transparent sheet |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1317307A1 (en) * | 1982-11-03 | 1987-06-15 | В.Я. Супоницкий | Method of preparing specimens of animals tissue for microscopic analysis |
| DE4404544A1 (en) * | 1994-02-12 | 1995-08-17 | Schubert Werner | Stabilising tissue samples for histology or cytology |
| RU2089871C1 (en) * | 1994-09-26 | 1997-09-10 | Извозчиков Илья Борисович | Method of preparing biological sample for histological examination |
| EP1533604A1 (en) * | 2003-11-18 | 2005-05-25 | Bio Optica-Milano S.p.A. | Preparation method of a histological sample for the diagnostic staining thereof |
-
2008
- 2008-12-10 WO PCT/RU2008/000769 patent/WO2010068129A1/en not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1317307A1 (en) * | 1982-11-03 | 1987-06-15 | В.Я. Супоницкий | Method of preparing specimens of animals tissue for microscopic analysis |
| DE4404544A1 (en) * | 1994-02-12 | 1995-08-17 | Schubert Werner | Stabilising tissue samples for histology or cytology |
| RU2089871C1 (en) * | 1994-09-26 | 1997-09-10 | Извозчиков Илья Борисович | Method of preparing biological sample for histological examination |
| EP1533604A1 (en) * | 2003-11-18 | 2005-05-25 | Bio Optica-Milano S.p.A. | Preparation method of a histological sample for the diagnostic staining thereof |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110031279A (en) * | 2019-03-30 | 2019-07-19 | 吴淑华 | Sample fixed station |
| CN110823665A (en) * | 2019-11-27 | 2020-02-21 | 李雄 | Application of n-butanol in preparation of low-toxicity dehydrating agent for dehydrating biopsy tissue specimen and preparing transparent sheet |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0822403A1 (en) | Process for processing organic specimens | |
| EP0229166B1 (en) | Method of preparing tissue samples | |
| US2393580A (en) | Method of preparing tissue | |
| US4099483A (en) | Tissue processing apparatus | |
| Boon et al. | Microwave‐stimulated diffusion for fast processing of tissue: reduced dehydrating, clearing, and impregnating times | |
| JP4519127B2 (en) | Tissue processing method | |
| US9366605B2 (en) | Histological specimen treatment apparatus and method | |
| AU2002220169A1 (en) | Removal of Embedding Media from Biological Samples and Cell Conditioning on Automated Staining Instruments | |
| AU2008216979A1 (en) | Histological tissue specimen treatment | |
| EP1377823A1 (en) | Automated immunohistochemical and in situ hybridzation assay formulations | |
| Kok et al. | Histoprocessing with the microwave oven: an update | |
| CN102483371B (en) | Apparatus and method for accelerated tissue infiltration by means of microwave excitation | |
| US11885723B2 (en) | Histological specimen treatment | |
| CN109738249A (en) | A kind of production method of paraffin section that observing Process of Flower Bud Differentiation | |
| JP2798430B2 (en) | Pathological tissue inspection method and fixed embedding device used therefor | |
| GB2471162A (en) | Method of automatically processing tissue samples in a tissue processor | |
| US11813555B2 (en) | Distillation apparatus and method for extraction of volatile components from biological material, especially from plants | |
| WO2010068129A1 (en) | Method for processing and infiltrating histological and biological samples | |
| RU2499242C2 (en) | Method for preparing biological tissue samples for histopathological examinations | |
| CN1672028A (en) | Composition for the preparation of histological, autopsical, cytological samples | |
| Giddings et al. | Preparing fission yeast for electron microscopy | |
| US8409871B2 (en) | Method of treatment of tissue processing fluid and apparatus therefor | |
| US8530808B2 (en) | Microwave-assisted heating and processing techniques | |
| JPH09250974A (en) | Apparatus for treating biological tissue | |
| SU1733118A1 (en) | Method for impregnation of fibrous material |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 08878779 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 08878779 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |