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WO2010041401A1 - プロテインホスファターゼ阻害剤 - Google Patents

プロテインホスファターゼ阻害剤 Download PDF

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Publication number
WO2010041401A1
WO2010041401A1 PCT/JP2009/005128 JP2009005128W WO2010041401A1 WO 2010041401 A1 WO2010041401 A1 WO 2010041401A1 JP 2009005128 W JP2009005128 W JP 2009005128W WO 2010041401 A1 WO2010041401 A1 WO 2010041401A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
compound
carbon atoms
added
mmol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/005128
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和靖 坂口
圭持 谷野
吉郎 中馬
文彦 吉村
寛陽 八木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokkaido University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokkaido University NUC filed Critical Hokkaido University NUC
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Priority to JP2010532795A priority patent/JP5451628B2/ja
Priority to US13/123,166 priority patent/US8759323B2/en
Priority to EP09818941A priority patent/EP2351571A4/en
Publication of WO2010041401A1 publication Critical patent/WO2010041401A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/695—Silicon compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/18—Compounds having one or more C—Si linkages as well as one or more C—O—Si linkages
    • C07F7/1804—Compounds having Si-O-C linkages

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein phosphatase inhibitor and a medicine containing the same.
  • Protein phosphatase is an enzyme that dephosphorylates phosphorylated proteins. In vivo, glucose metabolism, smooth muscle contraction, cell cycle, DNA replication, transcription, translation, cell adhesion, cell activation / differentiation, etc., biological immunity It is said to act on the maintenance of the nervous system and nervous system. Therefore, protein phosphatase inhibitors are widely searched because they have potential to become various drugs.
  • protein phosphatases serine / threonine phosphatases (Ser / Thr phosphatases) are classified into four types of PP1, PP2A, PP2B and PP2C (PPM1) families based on chemical properties and gene structures. Since the PPM1 family is particularly involved in the control of cell functions such as DNA repair mechanism, stress response, signal transduction, and cell proliferation, the development of its inhibitor has attracted particular attention.
  • PPM1D Protein Phosphatase Magnesium-Dependent 1, Delta
  • PPM1D is a phosphatase that increases in the cell by receiving a tumor suppressor protein p53-dependent induction when DNA is damaged by ultraviolet rays or electromagnetic radiation.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • PPM1D is constitutively expressed in vivo, and studies using knockout mice suggest that PPM1D is involved not only in carcinogenesis but also in spermatogenesis, aging, and immune response.
  • An object of the present invention is to provide a new protein phosphatase inhibitor.
  • the present inventor considered low oral compounds and evaluated protein phosphatase inhibitory activity in consideration of the possibility of oral administration, immunogenicity, etc. when administered as a pharmaceutical.
  • the silicon compound represented has excellent protein phosphatase inhibitory activity, particularly PPM1D inhibitory activity, and the inhibitory activity is higher in PPM1D selectivity than the inhibitory activity against PPM1A (p38-dependent phosphatase) which is a similar phosphatase.
  • PPM1D inhibitory activity protein phosphatase inhibitory activity
  • PPM1A p38-dependent phosphatase
  • the present invention has the general formula (1)
  • R 1 , R 2 and R 3 are the same or different and each represents a hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms; X represents an optionally substituted hydrocarbon group having 3 to 36 carbon atoms) Or a heterocyclic group which may have a substituent; n represents a number of 0 or 1)
  • the protein phosphatase inhibitor which uses the silicon compound represented by these, or its salt as an active ingredient is provided.
  • the present invention also provides a medicine containing the compound represented by the above general formula (1) or a salt thereof.
  • the present invention also provides use of the compound represented by the general formula (1) or a salt thereof for producing a protein phosphatase inhibitor.
  • the present invention also provides use of the compound represented by the above general formula (1) or a salt thereof for the production of a medicament.
  • this invention provides the protein phosphatase inhibition method which administers the compound represented by the said General formula (1), or its salt.
  • the present invention also provides a method for treating a malignant tumor, comprising administering a compound represented by the above general formula (1) or a salt thereof.
  • the compound represented by the general formula (1) of the present invention (hereinafter also referred to as the present compound (1)) or a salt thereof selectively inhibits PPM1D, which is a p53-dependent phosphatase that is a tumor suppressor gene. Therefore, it is useful as a pharmaceutical represented by a therapeutic agent for malignant tumors.
  • the compound (1) of the present invention or a salt thereof is a low molecular compound, there is no problem such as immunogenicity, and the administration route is not limited, so that it is useful as a medicine.
  • R 1 , R 2 and R 3 are the same or different and include hydrocarbon groups having 1 to 12 carbon atoms.
  • the hydrocarbon group include linear, branched or cyclic saturated or unsaturated hydrocarbon groups, and further linear, branched or cyclic alkyl groups, aralkyl groups, or aromatic hydrocarbon groups. Is preferred. Further, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an aromatic hydrocarbon group having 6 to 14 carbon atoms, or a C 6-10 aryl-C 1-6 alkyl group is preferable.
  • alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, and tert-butyl group are preferable.
  • aryl groups having 6 to 10 carbon atoms such as a phenyl group and a naphthyl group are preferable.
  • phenyl-C 1-4 alkyl groups such as benzyl group and phenethyl group are preferred.
  • the substituents R 1 , R 2 and R 3 on these silyl groups may be the same or different.
  • (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si— include trimethylsilyl group, triethylsilyl group, tri (n-propyl) silyl group, triisopropylsilyl group, tri (n-butyl) silyl group, Examples include tri (sec-butyl) silyl group, triisobutylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl group, dimethylphenylsilyl group, methyldiphenylsilyl group, triphenylsilyl group, tert-butyldiphenylsilyl group, and the like.
  • X represents a hydrocarbon group having 3 to 36 carbon atoms which may have a substituent or a heterocyclic group which may have a substituent.
  • the hydrocarbon group having 3 to 36 carbon atoms may be any of linear, branched or cyclic hydrocarbons, and may be saturated or unsaturated. More preferably, it is a linear, branched or cyclic hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms.
  • hydrocarbon group examples include a C 3 -C 24 alkyl group, a C 3-24 alkenyl group, a C 3-24 alkynyl group, and a saturated or unsaturated hydrocarbon group having a C 3 -C 24 cyclic structure.
  • C 3 -C 24 alkyl groups include C 3 -C 6 alkyl such as n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, n-pentyl, n-hexyl, etc. Groups are preferred.
  • Examples of the C 3-24 alkenyl group include 1-propen-1-yl group, 2-propen-1-yl group, isopropenyl group, 1-buten-1-yl group, 2-buten-1-yl group, 3 C 3 -C 8 alkenyl groups such as -buten-1-yl group, 1-buten-2-yl group, 2-buten-2-yl group and 3-buten-2-yl group are preferred.
  • the C 3-24 alkynyl group is preferably a C 3 -C 8 alkynyl group such as propynyl group, pentynyl group, hexynyl group, octynyl group and the like.
  • saturated or unsaturated hydrocarbon group having a C 3 -C 24 cyclic structure examples include a hydrocarbon group having a cyclic structure having 1 to 3 5- or 6-membered cyclic saturated or unsaturated hydrocarbons. .
  • hydrocarbon groups are selected from a hydroxy group, a nitrile group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, a cyano group, an alkoxy group, an alkylthio group, a substituted sulfonyl group, a halogen atom, a trisubstituted silyl group, and a trisubstituted silyloxy group. It may have up to 4 substituents.
  • the alkoxy group and the alkylthio group preferably have 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkoxycarbonyl group preferably has 2 to 7 carbon atoms.
  • the tri-substituted silyl group or tri-substituted silyloxy group is preferably the above-described (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si— (O) n — group.
  • the substituted sulfonyl group include a C 1-4 alkanesulfonyl group such as a methanesulfonyl group, a benzenesulfonyl group, and a toluenesulfonyl group. These substituents may have 1 to 4 substituents.
  • heterocyclic group represented by X examples include a 5- or 6-membered heterocyclic group containing a nitrogen atom or an oxygen atom, and specifically include a pyrrolyl group, a pyrrolidinyl group, a pyridyl group, a furanyl group, and a tetrahydrofuranyl group. Group, pyranyl group, tetrahydropyranyl group and the like.
  • the heterocycle may have 1 to 5 substituents selected from an aryl group, an aralkyl group, an alkyl group, an amino group, an alkylamino group, an alkenylamino group, an acyloxy group, and an aralkyloxy group.
  • substituents selected from an aryl group, an aralkyl group, an alkyl group, an amino group, an alkylamino group, an alkenylamino group, an acyloxy group, and an aralkyloxy group.
  • the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group.
  • Examples of the aralkyl group include a benzyl group and a phenethyl group.
  • alkyl group include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as a methyl group and an ethyl group.
  • alkylamino group examples include alkylamino groups having 1 to 6 carbon atoms such as methylamino group and ethylamino group.
  • alkenylamino group examples include a propenylamino group and a 2-methylene-propylamino group.
  • acyloxy group examples include an acetoxy group and a propionyloxy group. A benzyloxy group etc. are mentioned as an aralkyloxy group.
  • Preferred examples of the compound (1) of the present invention include those represented by the following formulas (2) to (8).
  • R 4 and R 5 are the same or different and each represents a hydrogen atom or (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si—, at least one of which is (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si-;
  • R 6 represents a hydrogen atom, or may combine with the hydroxy group of R 8 to form —O— (ether bond);
  • R 7 represents a hydrogen atom, R 8 represents a hydroxy group, or R 7 and R 8 may be combined to form an oxo group ( ⁇ O).
  • the compound (2) of the present invention has a plurality of asymmetric carbon atoms, it can exist in a state of a plurality of optically active substances or a mixture thereof.
  • a preferable steric structure of the compound (2) of the present invention is as follows.
  • R 9 represents a hydroxymethyl group, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group, and R 1 , R 2 and R 3 are the same as above
  • Ar represents an aryl group (for example, a phenyl group), and R 1 , R 2 and R 3 are the same as above)
  • the compound (1) of the present invention may form a salt.
  • acids or bases forming the salt include mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid; organic acids such as acetic acid, succinic acid and citric acid; sodium and potassium And alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • the compound (1) of the present invention may be in the form of a hydrate or the like.
  • the compound (1) of the present invention is characterized by having (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si (O) n-in the structure, and the compound without this structure has a protein phosphatase inhibitory effect. In particular, there is almost no PPM1D inhibitory effect.
  • the compound (1) of the present invention can be produced, for example, according to the following reaction formula.
  • a silicon compound having a leaving group Z ((R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si—Z) is reacted with alcohol or phenol (HO—X) in the presence of a base, and (R 1 ) (R 2 ) Obtain (R 3 ) Si-OX.
  • a silicon compound having a leaving group Z ((R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) Si—Z) and an organometallic compound (MX) are reacted, and (R 1 ) (R 2 ) ( R 3 ) Si-X is obtained.
  • the leaving group Z is not particularly limited, and examples thereof include a chloro group, a bromo group, an iodo group, a sulfonic acid group, an alkylsulfonic acid group, an arylsulfonic acid group, and a perchloric acid group.
  • the base include trialkylamine, dialkylarylamine, sodium hydride, methyllithium, and n-butyllithium.
  • M represents a metal ion, preferably an alkali metal or alkaline earth metal such as lithium, sodium, potassium, or magnesium.
  • the compound (1) of the present invention or a salt thereof obtained as described above has a cancer cell proliferation inhibitory activity and protein phosphatase inhibitory activity, particularly strong PPM1D inhibitory activity. Furthermore, the inhibitory activity also acts on PPM1D in cells (particularly in cancer cells). PPM1D is known to undergo induction dependent on p53, which is a tumor suppressor gene. On the other hand, PPM1A is the same Ser / Thr phosphatase as PPM1D, but is said to be p38-dependent.
  • the compound (1) of the present invention has a feature that it hardly inhibits PPM1A and specifically inhibits PPM1D. Therefore, this invention compound (1) or its salt is useful as a malignant tumor therapeutic agent. Furthermore, since the compound (1) of the present invention is a low molecular weight compound, it is not immunogenic and can be administered orally. Therefore, it is useful as a pharmaceutical for mammals including humans in terms of safety and compliance. It is.
  • the compound of the present invention (1) or a salt thereof is contained in a pharmaceutical composition, it can be blended with a pharmaceutically acceptable carrier as necessary, and various administration forms can be adopted depending on the purpose of prevention or treatment.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include oral preparations, injections, suppositories, ointments, patches, and the like, and oral preparations are preferable.
  • Each of these dosage forms can be produced by a conventional formulation method known to those skilled in the art.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants in solid formulations; solvents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers in liquid formulations. Agents, soothing agents, etc. are used. Moreover, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, stabilizers and the like can be used as necessary.
  • a tablet is prepared by a conventional method. Coated tablets, granules, powders, capsules and the like can be produced.
  • an oral solution, syrup, elixir and the like can be produced by adding a flavoring agent, a buffer, a stabilizer, a flavoring agent and the like to the compound of the present invention by conventional methods.
  • a pH adjuster, buffer, stabilizer, isotonic agent, local anesthetic, etc. are added to the compound of the present invention, and subcutaneous, intramuscular and intravenous injections are prepared by conventional methods. Can be manufactured.
  • a suppository When preparing a suppository, it can be produced by a conventional method after adding a pharmaceutical carrier known in the art, for example, polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglyceride and the like, to the compound of the present invention.
  • a pharmaceutical carrier known in the art, for example, polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglyceride and the like, to the compound of the present invention.
  • bases, stabilizers, wetting agents, preservatives and the like that are usually used for the compound of the present invention are blended as necessary, and mixed and formulated by a conventional method.
  • the ointment, cream, gel, paste or the like may be applied to a normal support by a conventional method.
  • the content of the compound of the present invention in each of the above preparations is not constant depending on the symptoms of the patient, its dosage form, etc., but generally about 0.05 to 1000 mg for oral preparations, about 0.01 to 500 mg for injections, The dosage is about 1-1000 mg.
  • the daily dose of these preparations varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., but cannot be determined unconditionally, but is usually about 0.05 to 5000 mg per day for an adult (body weight 60 kg).
  • the dose is preferably 0.1 to 1000 mg, and is preferably administered once a day or divided into 2 to 3 times a day.
  • Diseases that can be treated by administering a pharmaceutical containing the compound of the present invention include malignant tumors, such as head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder / bile duct cancer, pancreas Cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular tumor, bone / soft tissue sarcoma, leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma, skin cancer, brain tumor, etc. Can be mentioned.
  • malignant tumors such as head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder / bile duct cancer, pancreas Cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular tumor, bone / soft tissue sarcoma, leukemia, malignant lymph
  • PPM1D430 As shown in Examples below, the present inventor has identified the presence of an alternative splicing variant PPM1D430 consisting of 430 residues in human PPM1D at the mRNA and protein levels, and PPM1D430 is specifically expressed in leukocytes and testis.
  • Figure 1 PPM1D605 is conventionally displayed as PPM1D, and is displayed here as PPM1D605 in order to avoid confusion with PPM1D430, which is a new isoform.
  • PPM1D-deficient mice attenuation of the immune response of B cells and T cells to antigen stimulation is observed (Non-patent Document 2).
  • PPM1D inhibitors are useful as immunosuppressants, and the compounds of the present invention are useful in organ transplantation and the like. It is also useful as an immunosuppressant. Furthermore, since it is known that PPM1D activates estrogen receptor, progesterone receptor and the like (J. Biol. Chem., 281, 7089-7101, (2005)), the compound of the present invention is used as an antihormonal agent. Is also useful.
  • Lactone (1.0 g, 1.88 mmol) (Miyashita, M. et al. Science 2004, 305, 495.) was placed in a 100 mL two-necked eggplant-shaped flask, purged with argon, and then dry toluene (18 mL) was added. After cooling to -78 ° C, diisobutylaluminum hydride (1.01 M toluene solution, 1.86 mL, 1.88 mmol) was added, and the mixture was stirred at -78 ° C for 2 hr. Ethyl acetate was slowly added at -78 ° C to stop the reaction.
  • Lactone (6.3 mg, 11.7 ⁇ mol) (Miyashita, M. et al. Science 2004, 305, 495.) was placed in a 5 mL test tube, purged with argon, dissolved in dry tetrahydrofuran (0.1 mL), and cooled to 0 ° C.
  • Tetrabutylammonium fluoride (1.0 M tetrahydrofuran solution, 23.5 ⁇ L, 23.5 ⁇ mol) was added and stirred at room temperature for 2 hours.
  • Tetrabutylammonium fluoride (1.0 M tetrahydrofuran solution, 8 ⁇ L, 8 ⁇ mol) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 1.5 hours.
  • solution A a tetrahydrofuran solution (16 mL) of ethyl diethylphosphonoacetate (6.3 mL, 31.7 mmol) at 0 ° C. and stirred (hereinafter referred to as solution A).
  • Solution A was added to a tetrahydrofuran solution of the obtained aldehyde (10.6 mmol) at 0 ° C.
  • a saturated aqueous ammonium chloride solution was added to stop the reaction.
  • the obtained mesylate (6.36 mmol) was dissolved in a mixed solvent of dichloromethane (30 mL) -phosphate buffer solution (pH 7, 10 mL), and then 2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone (5.11 g, 22.5 mmol) was added. added. After stirring at room temperature for 3 hours, the reaction was stopped by adding saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and the mixture was extracted with ethyl acetate. It was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. The crude product alcohol was used as such in the next reaction.
  • solution A a tetrahydrofuran solution (10 mL) of ethyl diethylphosphonoacetate (3.8 mL, 19.1 mmol) at 0 ° C. and stirred (hereinafter referred to as solution A).
  • Solution A was added to a tetrahydrofuran solution of the obtained aldehyde (4.78 mmol) at 0 ° C.
  • a saturated aqueous ammonium chloride solution was added to stop the reaction.
  • the organic layer was washed with saturated brine and then with water, dried over magnesium sulfate, and then the solvent was removed under reduced pressure. Recrystallization from hexane-ethanol gave compound 8A. Yield 56%.
  • the obtained compound 8A contained about 5% raw material and about 5% dimethylated product.
  • the obtained cyclized product (21.8 mmol) was placed in a flask, purged with argon, and then dissolved in dry tetrahydrofuran (33 mL). After cooling to 0 ° C., 70% hydrogen fluoride-pyridine (4.4 mL) was added. After stirring at room temperature for 3 hours, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to stop the reaction. After extraction with ethyl acetate, the organic layer was washed with water and saturated brine. The solvent was removed after drying over anhydrous magnesium sulfate.
  • the crude product was recrystallized from hexane-ethyl acetate to obtain an exo form (4.4 g, 51% for 2steps) as colorless crystals.
  • the mother liquor was concentrated and recrystallized from hexane-ethyl acetate to obtain Compound 9 as colorless crystals.
  • Test example 1 The PPM1D inhibitory activity of the compound (1) of the present invention was measured.
  • PPM1D protein (Protein ID: O15297 / cDNA ID: U70385) was obtained by introducing cDNA encoding the catalytic domain (positions 1 to 420) into a pColdI vector (TaKaRa) and expressing it using Escherichia coli as a His tag fusion protein. . Purification was performed by metal affinity chromatography using BD-TALON resin (CLONTECH), and elution buffer (150 mM imidazole, PBS (pH 7.5), 500 mM NaCl, 10% glycerol, 0.2% ethanol, 1 mM 2-mercaptoethanol). ) was used to elute the target protein.
  • the eluted PPM1D protein was dialyzed against dialysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EGTA, 0.02% 2-mercaptoethanol) for 16 hours, and then 50% glycerol stock (enzyme concentration: 1 ⁇ M). ) At ⁇ 80 ° C.
  • the enzyme expressed and purified by the above method was used.
  • a substrate a peptide containing 15-position phosphorylated Ser of p53 chemically synthesized by Fmoc solid phase method (Ac-Val-Glu-Pro-Pro-Leu-Ser (P) -Gln-Glu-Thr-Phe-Ser-- Asp-Leu-Trp-NH 2 : Ser (P) indicates phosphorylated Ser).
  • the purified p53 phosphopeptide was dissolved in H 2 O to prepare a 400 ⁇ M substrate stock solution.
  • test compound (inhibitor) of Example 1 was previously dissolved in ethanol (EtOH) at a concentration of 40 mM, and then diluted with dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a 4 mM inhibitor stock solution.
  • Other inhibitors were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and adjusted to a 4 mM inhibitor stock solution.
  • 30 ⁇ L of inhibitor / substrate mixed solution (66.7 ⁇ M phosphorylated peptide substrate, 66.7 ⁇ M inhibitor, 1.7% DMSO (1.5% DMSO, 0.2% EtOH in Example 1), 13 mM Tris -HCl (pH 8.0)) was kept at 30 ° C., and 20 ⁇ L of a mixture of enzyme and metal ions at 4 ° C.
  • Test example 2 The PPM1D inhibitory activity was measured, and the selectivity of the PPM1D inhibitory activity of the compound (1) of the present invention was examined.
  • Table 2 shows the results of the compound [Compound 1] of Example 1
  • Table 3 shows the results of the compound [Compound 1] of Example 1 and the compound [Compound 2] of Example 5.
  • the substrate for PPM1A is a p38 phosphorylated peptide analog (Ac-Asp-Asp-Glu-Nle-Thr (P) -Gly-Tyr (P) -Val-Ala-Thr-Arg-NH 2 : Thr (P) is phosphorylated) Thr and Tyr (P) were phosphorylated Tyr, and Nle was Norleucine).
  • PP2A Protein ID: P67775 / cDNA ID: X12649
  • PP2A was purchased from Promega.
  • the substrate for PP2A is a p38 phosphorylated peptide analog (Ac-Thr-Asp-Asp-Glu-Met-Thr (P) -Gly-Tyr-Val-Ala-Thr-NH 2 : Thr (P) represents phosphorylated Thr ) was used.
  • the inhibitory activity of PPM1A, PP2A and PPM1D at each inhibitor final concentration (0, 0.1, 0.2, 0.4, 1, 2, 4, 10, 40 ⁇ M) was measured three times for each concentration, The inhibitor concentration (IC 50 value) that inhibits enzyme activity by 50% was determined.
  • the inhibitor solution was diluted with a solvent (DMSO, (90% DMSO, 10% EtOH when the test compound of Example 1 was used)) to prepare inhibitor solutions of various concentrations. Other conditions in the enzyme activity measurement are the same as in Test Example 1.
  • the inhibition constant (Ki) and inhibition mode of the inhibitor were measured as follows.
  • an enzyme expressed and purified by the method shown in Test Example 1 was used.
  • a 15-phosphorylated peptide analog of p53 (Ac-Val-Glu-Pro-Pro-Leu-Ser (P) -Gln-Glu-Thr-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-NH 2 : Ser (P) indicates phosphorylated Ser).
  • the PPM1D activity at each phosphorylated peptide substrate concentration and inhibitory concentration was measured with 4, 1, 2 ⁇ M (the compound of Example 5 [compound 2]), and 50 ⁇ L of BIOMOL GREEN reagent (Biomol) was added to the reaction solution. The reaction was stopped, and phosphoric acid released by PPM1D was detected by measuring the absorbance at 620 nm after 30 minutes. From these results, Ki ( ⁇ M) was calculated.
  • Test example 3 The tumor suppressor protein p53 is activated and stabilized by DNA damage, and induces the expression of many proteins involved in cell cycle arrest and apoptosis, thereby preventing the canceration of cells. It has been reported that p53 is activated by phosphorylation, and in particular, phosphorylation of Ser at position 15 plays an important role in the activation and stabilization of p53. PPM1D is known to dephosphorylate the phosphorylated Ser at position 15 of p53.
  • Example 1 Compound 1
  • Compound 2 Compound 2
  • MCF7 cells breast cancer-derived cells, PPM1D overexpression
  • Method 1 MCF7 cells were stimulated with ADR (Adriamycin: aka Doxorubicin), the compound of Example 1 [Compound 1] (10 ⁇ M) was added, and the phosphorylation of Ser. 15 of p53 after 12 h was observed. PPM1D inhibitory activity was measured.
  • a test without ADR stimulation was carried out in the same manner as ( ⁇ ).
  • P53 was concentrated with IP using FL393, an anti-p53 polyclonal antibody, and p53 15-position phosphorylated Ser was detected by Western blotting.
  • Method 2 MCF7 cells were irradiated with UV (15 J / m 2 ), the compound of Example 1 [Compound 1] or the compound of Example 5 [Compound 2] (10 ⁇ M) was added, and phosphorylation of Ser. By observing, the PPM1D inhibitory activity of the compound of Example 1 [Compound 1] or the compound of Example 5 [Compound 2] was measured. Changes in the amount of phosphorylated Ser at p53 of p53 were detected by Western blotting. An anti-phosphorylated p53 (Ser15) mouse monoclonal antibody 16-G8 (Cell Signaling) was used as the primary antibody, and an anti-mouse IgG-HRP antibody (GE Healthcare Bioscience) was used as the secondary antibody. As a control, a sample without UV stimulation was used in the same manner as ( ⁇ ). p53 15-position phosphorylated Ser was detected in the same manner as in Method 1 above.
  • Test example 4 The effect of the compound (1) of the present invention on cancer cells was confirmed.
  • the cells were washed twice with 5 ml of PBS (8.1 mM Na 2 HPO 4 , 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 137 mM NaCl, pH 7.5), and a 0.25% Trypsin / EDTA solution ( Cells were collected using GIBCO), and after adding trypan blue, the number of cells was measured using a hemocytometer.
  • PBS 8.1 mM Na 2 HPO 4 , 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 137 mM NaCl, pH 7.5
  • Trypsin / EDTA solution Cells were collected using GIBCO

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Abstract

　新規なプロテインホスファターゼ阻害剤の提供。 　下記一般式（１）（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、炭素数１～１２の炭化水素基を示し；Ｘは置換基を有していてもよい炭素数３～３６の炭化水素基又は置換基を有していてもよい複素環式基を示し；ｎは０又は１の数を示す） で表されるケイ素化合物又はその塩を有効成分とするプロテインホスファターゼ阻害剤。

Description

プロテインホスファターゼ阻害剤
　本発明は、新規なプロテインホスファターゼ阻害剤及びこれを含有する医薬に関する。
　プロテインホスファターゼはリン酸化タンパク質を脱リン酸化する酵素であり、生体内で糖代謝、平滑筋収縮、細胞周期、ＤＮＡ複製、転写、翻訳、細胞接着、細胞活性化・分化などの制御、生体の免疫系や神経系の維持に作用しているといわれている。従って、プロテインホスファターゼ阻害剤は種々の医薬になる可能性があることから広く探索されている。プロテインホスファターゼの中でもセリン／スレオニンホスファターゼ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼ）は、化学的性質及び遺伝子構造よりＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ（ＰＰＭ１）ファミリーの４種に分類されている。このＰＰＭ１ファミリーは、特にＤＮＡ修復機構、ストレス応答、シグナル伝達、細胞増殖などの細胞機能の制御に関与していることから、特にその阻害剤の開発は注目されている。
　ＰＰＭ１ファミリーに属するＰＰＭ１Ｄ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ‐Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ １、 Ｄｅｌｔａ）は、紫外線や電磁線などによりＤＮＡにダメージを受けると、がん抑制タンパク質ｐ５３依存的な誘導を受け、細胞内で増加するホスファターゼである。ＰＰＭ１Ｄは、乳がんを含めた複数のがん細胞で過剰発現していることが報告されており（非特許文献１）、発がんとＰＰＭ１Ｄの関係が注目されている。一方、ＰＰＭ１Ｄは生体内において恒常的に発現していること、また、ノックアウトマウスを用いた研究からＰＰＭ１Ｄが発がんのみならず精子形成や老化、免疫応答にも関与していることが示唆されている（非特許文献２）。
　このように、プロテインホスファターゼの一部、例えばＰＰＭ１Ｄは発がんその他において重要な役割をしているにもかかわらず、その機能や阻害剤についてはほとんど明らかにされていない。
Ｎａｔ. Ｇｅｎｅｔ., ３１, ２１０－２１５, ２００２ Ｍｏｌ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ., ２２, １０９４－１１０５, ２００２
　本発明の目的は、新たなプロテインホスファターゼ阻害剤を提供することにある。
　そこで本発明者は、医薬として投与する際の経口投与可能性、免疫原性等の点を考慮し、低分子化合物を合成してプロテインホスファターゼ阻害活性を評価したところ、下記一般式（１）で表されるケイ素化合物が、優れたプロテインホスファターゼ阻害活性、特にＰＰＭ１Ｄ阻害活性を有し、その阻害活性は類似のホスファターゼであるＰＰＭ１Ａ（ｐ３８依存的なホスファターゼ）に対する阻害活性に比べてＰＰＭ１Ｄ選択性が高く、かつ癌細胞内で阻害効果を発揮し、また優れたがん細胞増殖抑制効果を発揮することから、悪性腫瘍治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、炭素数１～１２の炭化水素基を示し；Ｘは置換基を有していてもよい炭素数３～３６の炭化水素基又は置換基を有していてもよい複素環式基を示し；ｎは０又は１の数を示す）
で表されるケイ素化合物又はその塩を有効成分とするプロテインホスファターゼ阻害剤を提供するものである。
　また、本発明は、上記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有する医薬を提供するものである。
　また、本願発明は、上記一般式（１）で表される化合物又はその塩の、プロテインホスファターゼ阻害剤製造のための使用を提供するものである。
　また、本願発明は、上記一般式（１）で表される化合物又はその塩の、医薬の製造のための使用を提供するものである。
　また、本願発明は、上記一般式（１）で表される化合物又はその塩を投与する、プロテインホスファターゼ阻害方法を提供するものである。
　また、本願発明は、上記一般式（１）で表される化合物又はその塩を投与する、悪性腫瘍の治療方法を提供するものである。
　本発明の一般式（１）で表される化合物（以下、本発明化合物（１）ともいう）又はその塩は、がん抑制遺伝子であるｐ５３依存的なホスファターゼであるＰＰＭ１Ｄを選択的に阻害すること及びがん細胞の増殖を抑制することから、悪性腫瘍治療薬に代表される医薬として有用である。また本発明化合物（１）又はその塩は低分子化合物であることから、免疫原性等の問題がなく、かつ投与ルートも制限されないため、医薬として有用である。
２種のＰＰＭ１ＤアイソフォームＰＰＭ１Ｄ６０５とＰＰＭ１Ｄ４３０の種々の臓器における発現量を示す図である。 ＡＤＲ（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）刺激（＋）後の、乳がん由来ＭＣＦ７細胞に対する実施例１の化合物（化合物（１））の効果を示す図である。（－）はＡＤＲ刺激していないもの。（上段：ｐ５３の１５位Ｓｅｒのリン酸化、下段：ｐ５３総タンパク量、＊バーは４７．５ｋＤａのマーカー。） ＵＶ（１５Ｊ／ｍ２）刺激（＋）後の、乳がん由来ＭＣＦ７細胞における実施例１の化合物（化合物１）及び実施例５の化合物（化合物２）の効果を示す図である。（－）はＵＶ刺激していないもの。（上段：ｐ５３の１５位Ｓｅｒのリン酸化、下段：actinによるタンパク質量の比較） 乳がん由来ＭＣＦ７細胞に対して実施例１の化合物（化合物１）を添加後３日経過したときの効果を顕微鏡で観察した図である。右側は左黒枠の拡大図である。 乳がん由来ＭＣＦ７細胞の細胞増殖における実施例１の化合物（化合物１）の効果を示す図である。化合物添加後1日および３日経過したときの細胞数を計測した。
　一般式（１）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって、炭素数１～１２の炭化水素基が挙げられる。当該炭化水素基としては、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられ、さらに直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基、アラルキル基、又は芳香族炭化水素基が好ましい。さらに、炭素数１～８の直鎖状又は分岐状のアルキル基、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基、あるいはＣ6-10アリール－Ｃ1-6アルキル基が好ましい。より詳細には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数１～６のアルキル基が好ましい。また、フェニル基、ナフチル基等の炭素数６～１０のアリール基が好ましい。さらに、ベンジル基、フェネチル基等のフェニル－Ｃ1-4アルキル基が好ましい。これらのシリル基上の置換基Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、同一でも異なっていてもよい。
　(R1)(R2)(R3)Si－の具体例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリ（n－プロピル）シリル基、トリイソプロピルシリル基、トリ（ｎ－ブチル）シリル基、トリ（ｓｅｃ－ブチル）シリル基、トリイソブチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ジメチルフェニルシリル基、メチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
　一般式（１）中、Ｘは置換基を有していてもよい炭素数３～３６の炭化水素基又は置換基を有していてもよい複素環式基を示す。ここで、炭素数３～３６の炭化水素基としては、直鎖、分岐鎖又は環状の炭化水素いずれでもよく、また飽和でも不飽和でもよい。より好ましくは、炭素数３～２４の直鎖、分岐鎖又は環状の炭化水素基である。
　当該炭化水素基の例としては、Ｃ3－Ｃ24アルキル基、Ｃ3-24アルケニル基、Ｃ3-24アルキニル基、Ｃ3－Ｃ24環状構造を有する飽和又は不飽和炭化水素基が挙げられる。Ｃ3－Ｃ24アルキル基の例としては、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基等のＣ3－Ｃ6アルキル基が好ましい。Ｃ3-24アルケニル基としては、１－プロペン－１－イル基、２－プロペン－１－イル基、イソプロペニル基、１－ブテン－１－イル基、２－ブテン－１－イル基、３－ブテン－１－イル基、１－ブテン－２－イル基、２－ブテン－２－イル基、３－ブテン－２－イル基等のＣ3－Ｃ8アルケニル基が好ましい。Ｃ3-24アルキニル基としては、プロピニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、オクチニル基等のＣ3－Ｃ8アルキニル基が好ましい。
　Ｃ3－Ｃ24環状構造を有する飽和又は不飽和炭化水素基としては、例えば、５又は６員環状の飽和又は不飽和の炭化水素を１～３個有する環状構造を有する炭化水素基が挙げられる。
　これらの炭化水素基には、ヒドロキシ基、ニトリル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、置換スルホニル基、ハロゲン原子、トリ置換シリル基及びトリ置換シリルオキシ基から選ばれる１～４個の置換基を有していてもよい。ここで、アルコキシ基及びアルキルチオ基の炭素数は１～６が好ましい。アルコキシカルボニル基の炭素数は２～７が好ましい。またトリ置換シリル基又はトリ置換シリルオキシ基としては、前記の(R1)(R2)(R3)Si-(O)n－基が好ましい。置換スルホニル基としては、メタンスルホニル基等のＣ1-4アルカンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基等が挙げられる。これらの置換基は１～４個有していてもよい。
　Ｘで表される複素環式基としては、窒素原子又は酸素原子を含む５又は６員の複素環式基が挙げられ、具体的にはピロリル基、ピロリジニル基、ピリジル基、フラニル基、テトラヒドロフラニル基、ピラニル基、テトラヒドロピラニル基等が挙げられる。
　当該複素環には、アリール基、アラルキル基、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アルケニルアミノ基、アシルオキシ基及びアラルキルオキシ基から選ばれる１～５個の置換基を有していてもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としてはベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。アルキル基としては、メチル基、エチル基等の炭素数１～６のアルキル基が挙げられる。アルキルアミノ基としてはメチルアミノ基、エチルアミノ基等の炭素数１～６のアルキルアミノ基が挙げられる。アルケニルアミノ基としては、プロペニルアミノ基、２－メチレン－プロピルアミノ基等が挙げられる。アシルオキシ基としてはアセトキシ基、プロピオニルオキシ基等が挙げられる。アラルキルオキシ基としてはベンジルオキシ基等が挙げられる。
　本発明化合物（１）の好ましい例を挙げれば、次の式（２）～（８）で表されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒ4及びＲ5は同一又は相異って水素原子又は(R1)(R2)(R3)Si－を示し、その少なくとも一方は(R1)(R2)(R3)Si－であり；
Ｒ6は水素原子を示すか、Ｒ8のヒドロキシ基と一緒になって－Ｏ－（エーテル結合）を形成してもよく；
Ｒ7は水素原子を示し、Ｒ8はヒドロキシ基を示すか、Ｒ7とＲ8が一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を形成してもよい。）
　本発明化合物（２）には不斉炭素原子が複数存在するため複数の光学活性体又はそれらの混合物の状態で存在し得る。好ましい本発明化合物（２）の立体構造を示せば、次のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8は前記と同じ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ9はヒドロキシメチル基、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基を示し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記と同じ）
　式（３）の化合物のうち、好ましい立体構造を示せば次のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ9は前記と同じ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ａｒはアリール基（例えばフェニル基）を示し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記と同じ）
　本発明化合物（１）は、塩を形成してもよく、その塩を形成する酸又は塩基としては、塩酸、硫酸などの鉱酸；酢酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属等が挙げられる。また、本発明化合物（１）は、水和物等の形態であってもよい。
　本発明化合物（１）は、構造中に(R1)(R2)(R3)Si(O)n－を有する点に特徴があり、この構造を有さない化合物にはプロテインホスファターゼ阻害効果、特にＰＰＭ１Ｄ阻害効果がほとんどない。
　本発明化合物（１）は、例えば次の反応式に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｚは脱離基を示し、Ｍは金属原子を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＸは前記と同じ）
　脱離基Ｚを有するケイ素化合物（(R1)(R2)(R3)Si-Ｚ）と、アルコール又はフェノール（ＨＯ-Ｘ）を塩基の共存下で反応させ、(R1)(R2)(R3)Si-ＯＸを得る。又は、脱離基Ｚを有するケイ素化合物（(R1)(R2)(R3)Si-Ｚ）と、有機金属化合物（Ｍ-Ｘ）を反応させ、(R1)(R2)(R3)Si-Ｘを得る。
　式中、脱離基Ｚとしては、特に制限されないが、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、スルホン酸基、アルキルスルホン酸基、アリールスルホン酸基又は過塩素酸基等が挙げられる。塩基としては、トリアルキルアミン、ジアルキルアリールアミン、水素化ナトリウム、メチルリチウム、又はｎ－ブチルリチウム等が挙げられる。Ｍは金属イオン、望ましくは、リチウム、ナトリウム、カリウム、又はマグネシウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属を示す。
　上記の如くして得られた本発明化合物（１）又はその塩は、がん細胞増殖抑制作用及びプロテインホスファターゼ阻害活性、特に強いＰＰＭ１Ｄ阻害活性を有する。さらにその阻害活性は、細胞内（特に癌細胞内）のＰＰＭ１Ｄに対しても作用する。また、ＰＰＭ１Ｄはがん抑制遺伝子であるｐ５３依存的な誘導を受けることが知られている。一方、ＰＰＭ１Ａは、ＰＰＭ１Ｄと同じＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼであるが、ｐ３８依存的であるといわれている。本発明化合物（１）は、ＰＰＭ１Ａに対してほとんど作用せず、ＰＰＭ１Ｄ特異的に阻害するという特徴を有する。従って、本発明化合物（１）又はその塩は、悪性腫瘍治療薬として有用である。
　さらにまた、本発明化合物（１）は、低分子化合物であることから、免疫原性がなく、かつ経口投与も可能であることから、安全性及びコンプライアンス上も、ヒトを含む哺乳類に対する医薬として有用である。
　本発明化合物（１）又はその塩を医薬組成物に含有せしめる場合、必要に応じて薬学的に許容される担体と配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられるが、経口剤が好ましい。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
　薬学的に許容される担体としては、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が用いられる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
　経口用固形製剤を調製する場合は、本発明化合物に賦形剤、必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
　経口用液体製剤を調製する場合は、本発明化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
　注射剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
　坐剤を調製する場合は、本発明化合物に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等を加えた後、常法により製造することができる。
　軟膏剤を調製する場合は、本発明化合物に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。
　貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すればよい。
　前記の各製剤中の本発明化合物の含有量は、患者の症状、その剤形等により一定ではないが、一般に経口剤では約０．０５～１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１～５００ｍｇ、坐剤では約１～１０００ｍｇ程度である。
　また、これらの製剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重６０ｋｇ）１日あたり約０．０５～５０００ｍｇ程度であり、０．１～１０００ｍｇが好ましく、これを１日１回又は２～３回程度に分けて投与するのが好ましい。
　本発明化合物を含有する医薬を投与することにより治療できる疾病としては、悪性腫瘍が挙げられ、例えば、頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。
　後記実施例に示すように、本発明者はヒトＰＰＭ１Ｄに４３０残基からなる選択的スプライシングバリアントＰＰＭ１Ｄ４３０が存在することをｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで同定し、ＰＰＭ１Ｄ４３０が白血球および精巣に特異的に発現していることを明らかにしている（図１）。
　なお、図１中、ＰＰＭ１Ｄ６０５は従来ＰＰＭ１Ｄと表示されていたものであり、新規アイソフォームであるＰＰＭ１Ｄ４３０との混同を避けるため、ここではＰＰＭ１Ｄ６０５と表示する。ＰＰＭ１Ｄ欠損マウスでは抗原刺激に対するＢ細胞及びＴ細胞の免疫応答の減衰が観察されることから（非特許文献２）、ＰＰＭ１Ｄ阻害剤は免疫抑制剤として有用であり、本発明化合物は臓器移植などにおける免疫抑制剤としても有用である。
　さらにＰＰＭ１Ｄはエストロゲン受容体やプロゲステロン受容体などを活性化することが知られていることから（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ., ２８１,７０８９－７１０１, (２００５)）、本発明化合物は抗ホルモン薬としても有用である。
　以下に実施例、試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　5mLの試験管に化合物1a(11.5mg, 21.3μmol)(Miyashita, M. et al. Science 2004, 305, 495.;Yoshimura, F. et al. Chem. Eur. J. 2009, 15, 6626)を入れアルゴンで置換した後、乾燥ジクロロメタン(0.21mL)に溶かした。0℃に冷却した後、水素化ジイソブチルアルミニウム(1.0Mヘキサン溶液, 107μL, 0.107mmol)を加えた。室温で2時間撹拌した後、水素化ジイソブチルアルミニウム(1.0Mヘキサン溶液, 107μL, 0.107mmol)を加え、さらに3.5時間撹拌した。酢酸エチル(0.1mL)をゆっくり加え反応を停止した。酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液と酒石酸ナトリムカリウム四水和物を加え、白色沈殿が消失するまで激しく撹拌した。酢酸エチルとジクロロメタンで抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。除媒後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/酢酸エチル=7/1-5/1)で精製すると、化合物1が無色結晶(10.5mg, 91%)で得られた。
化合物１:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.09(3H, s), 0.13(3H, s), 0.59(6H, q, J=7.5Hz), 0.92(9H, s), 0.96(9H, t, J=8.0Hz), 1.03(3H, s), 1.11(3H, d, J=6.9Hz), 1.32(3H, s), 1.25-1.42(4H, m), 1.45-1.68(6H, m), 1.77-1.83(1H, m), 1.95-2.08(3H, m), 3.72-3.76(1H, m), 3.72(1H, d, J=12.0Hz), 3.98(1H, d, J=11.5Hz), 4.10(1H, quintet, J=4.0Hz), 4.54(1H, brs).
実施例２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　100mLの二口ナス型フラスコにラクトン(1.0g, 1.88mmol)(Miyashita, M. et al.Science 2004, 305, 495.)を入れ、アルゴンで置換した後、乾燥トルエン(18mL)を加えた。-78℃に冷却した後、水素化ジイソブチルアルミニウム(1.01Mトルエン溶液, 1.86mL, 1.88mmol)を加えた後、-78℃で2時間撹拌した。酢酸エチルを-78℃でゆっくり加え反応を停止した。水と酒石酸ナトリムカリウム四水和物を加え、白色沈殿が消失するまで室温で激しく撹拌した。酢酸エチルで抽出した後、飽和食塩水で洗浄して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。除媒後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/酢酸エチル=9/1-4/1-3/1)で精製すると、化合物1aが無色油状物(608.5mg, 60%)として得られ、原料のラクトンが313.7mg(0.584mmol, 31%)回収された。回収したラクトンに対して同様の操作を2回繰り返すと、化合物1aがさらに250.9 mg(25%)得られた。
実施例３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　5mLの試験管に化合物1(4.0mg, 7.4μmol)を入れテトラヒドロフラン(0.15mL)に溶かした。炭酸カリウム(2.0mg, 15μmol), 塩化テトラブチルアンモニウム(4.1mg, 15μmol), 七モリブデン酸六アンモニウム四水和物(9.1mg, 7.4μmol)及び過酸化水素水(35%, 37μL)を順に加えた。室温で1分間撹拌した後、50℃で2.5時間撹拌した。室温に冷却した後、水で希釈した。酢酸エチルとジクロロメタンで抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。除媒後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/酢酸エチル=3/1)で精製すると、化合物1bが無色油状物(3.8mg, 95%)として得られた。
化合物1b:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.13(3H, s), 0.17(3H, s), 0.55-0.63(6H, m), 0.94(9H, s), 0.97(9H, t, J=8.0Hz), 1.12(3H, s), 1.12(3H, d, J=7.5Hz), 1.17(3H, s), 1.27-1.42(2H, m), 1.50-1.71(7H, m), 1.97-2.07(1H, m), 2.04(1H, d, J=14.9Hz), 2.12(1H, d, J=13.8Hz), 2.40(1H, d, J=14.9Hz), 2.64(1H, d, J=14.3Hz), 3.54(1H, d, J=12.0Hz), 3.58(1H, d, J=12.0Hz), 3.75-3.80(1H, m), 4.48(1H, d, J=1.8Hz).
実施例４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　5mLの試験管にラクトン(6.3mg, 11.7μmol)(Miyashita, M. et al. Science 2004, 305, 495.)を入れアルゴン置換した後、乾燥テトラヒドロフラン(0.1mL)で溶かし0℃に冷却した。フッ化テトラブチルアンモニウム(1.0Mテトラヒロドフラン溶液, 23.5μL, 23.5μmol)を加え、室温で2時間撹拌した。フッ化テトラブチルアンモニウム(1.0Mテトラヒロドフラン溶液, 8μL, 8μmol)を加え、室温でさらに1.5時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液で反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、除媒した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/酢酸エチル=8/1-2/1)で精製すると、アルコールAが無色油状物(5.5mg)として得られた。得られたアルコールA(5.5mg)を5mLの試験管に入れアルゴン置換した後、乾燥ジエチルエーテル(0.12mL)に溶かし0℃に冷却した。水素化ジイソブチルアルミニウム(1.02Mヘキサン溶液, 57μL, 58.5μmol)を加えた後、室温で2.5時間撹拌した。酢酸エチル(30μL)を0℃でゆっくり加え反応を停止した。酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液と酒石酸ナトリムカリウム四水和物を加え、白色沈殿が消失するまで激しく撹拌した。酢酸エチルで抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。除媒後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/酢酸エチル=1/2)で精製すると、化合物1dが無色結晶(3.8mg, 76% for 2steps)で得られた。
化合物1d:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 0.11(3H, s), 0.13(3H, s), 0.92(9H, s), 1.02(3H, s), 1.15(3H, d, J=7.5 Hz), 1.19(1H, s), 1.23-1.29(1H, m), 1.35(3H, s), 1.36-1.41(3H, m), 1.50-1.55(1H, m), 1.65-1.85(7H, m), 2.03-2.10(2H, m), 3.69(1H, d, J=11.5Hz), 3.79(1H, brs), 4.04(1H, d, J=11.5Hz), 4.11(1H, quintet, J=4.0Hz), 4.57(1H, brs).
実施例５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
化合物2bの合成：既知化合物2a(2.91g, 17.6mmol)とジヨードメタン(3.0mL, 37.8mL)をテトラヒドロフラン(80mL)に溶かし、-78℃に冷却した。メチルリチウム(1.04Mジエチルエーテル溶液, 42.3mL, 44.0mmol)を加えた後、-78℃で20分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=8:1)で精製すると、化合物2c(2.12g, 59%)が得られた。
化合物2cの合成：ジイソプロピルアミン(2.9mL, 28.0mmol)とブチルリチウム(1.59Mヘキサン溶液, 14.6mL, 23.2mmol)から調整したリチウムジイソプロピルアミドのテトラヒドロフラン溶液(22mL)を-78℃に冷却した後、化合物2b(2.08g, 11.6mmol)のテトラヒドロフラン(36mL)-ヘキサメチルホスホラミド(16mL, 93.0mmol)混合溶液を加えた。0℃で2時間撹拌した後、クロロトリイソプロピルシラン(6.2mL, 29.0mmol)を加えた。室温で30分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。ヘキサンで抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=50:1)で精製すると、化合物2c(3.51g, 89%)が得られた。
化合物2の合成：化合物2c(3.60g, 10.6mmol)をジクロロメタン(53mL)に溶かし、-78℃で水素化ジイソブチルアルミニウム(0.98Mヘキサン溶液, 21.6mL, 21.2mmol)を加えた。室温で2時間撹拌した後、テトラヒドロフランと10%酒石酸水溶液を加えて反応を停止した。40℃で20分間撹拌した後、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。粗生成物のアルデヒドはそのまま次の反応に用いた。ジエチルホスホノ酢酸エチル(6.3mL, 31.7mmol)のテトラヒドロフラン溶液(16mL)に0℃で水素化ナトリウム(936.6mg, 21.2mmol)を加え撹拌した（以下溶液Aとする）。得られたアルデヒド(10.6mmol)のテトラヒドロフラン溶液に、溶液Aを0℃で加えた。室温で20分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。ヘキサンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=18:1)で精製すると、化合物2(3.93g, 71% for 2steps)が得られた。
化合物2:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 6.96(1H, d, J=16.0Hz), 5.86(1H, d, J=16.0Hz), 4.18(2H, m), 3.53(2H, d, J=6.3Hz), 2.27(1H, t, J=6.3Hz), 1.72(2H, m), 1.60-1.50(2H, m), 1.43(1H, m), 1.27(3H, t, J=9.8Hz), 1.10-1.04(24H, m), 0.94(3H, s), 0.74(3H, s).
実施例６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
化合物3bの合成：α-スタニルエーテル38g(7.09g, 16.0mmol)のテトラヒドロフラン溶液(20mL)にブチルリチウム(2.64Mヘキサン溶液, 5.7mL, 15.0mmol)を-78℃で加えた。-78℃で20分間撹拌した後、-100℃に冷却した。この溶液に、既知化合物3a(1.66g, 10mmol)のテトラヒドロフラン溶液(30mL)を-100℃で加えた。混合物を1時間かけて-78℃に昇温した後、-78℃でさらに1時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮した後、粗生成物をヘキサン-酢酸エチルから再結晶すると、化合物3b(2.02g, 63%)が得られた。
化合物3cの合成：化合物3b(2.02g, 6.36mmol)をピリジン(12.7mL)に溶かした後、0℃に冷却した。塩化メタンスルホニル(5.7mL, 15mL)を加えた後、室温で2時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。粗生成物のメシラートはそのまま次の反応に用いた。得られたメシラート(6.36mmol)をジクロロメタン(30mL)-リン酸緩衝溶液(pH7, 10mL)混合溶媒に溶かした後、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノベンゾキノン(5.11g, 22.5mmol)を加えた。室温で3時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。粗生成物のアルコールはそのまま次の反応に用いた。得られたアルコール(6.36mmol)をメタノール(32mL)に溶かし、炭酸カリウム(4.41g, 31.9mmol)を加えた。室温で2時間撹拌した後、水素化ホウ素ナトリウム(123.3mg, 3.26mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。混合物にアセトンを加えた後、濾過した。濃縮した後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=10:1)で精製すると、化合物3c(1.00g, 88% for 3steps)が得られた。
化合物3dの合成：ジイソプロピルアミン(1.8mL, 12.8mmol)とブチルリチウム(2.6Mヘキサン溶液, 4.2mL, 10.7mmol)から調整したリチウムジイソプロピルアミドのテトラヒドロフラン溶液(10mL)を-78℃に冷却した後、化合物3c(959.9mg, 5.35mmol)のテトラヒドロフラン(17mL)-ヘキサメチルホスホラミド(7.5mL, 42.8mmol)混合溶液を加えた。室温で14時間撹拌した後、クロロトリイソプロピルシラン(2.9mL, 13.5mmol)を加えた。室温で30分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した。ヘキサンで抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=30:1)で精製すると、化合物3d(915.5mg, 92%)が得られた。
化合物3fの合成：化合物3d(1.60g, 4.78mmol)をジクロロメタン(24mL)に溶かし、-78℃で水素化ジイソブチルアルミニウム(0.97Mヘキサン溶液, 9.9mL, 9.56mmol)を加えた。0℃で2時間撹拌した後、テトラヒドロフランと10%酒石酸水溶液を加えて反応を停止した。室温で1.5時間撹拌した後、ヘキサンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。粗生成物のアルデヒドはそのまま次の反応に用いた。ジエチルホスホノ酢酸エチル(3.8mL, 19.1mmol)のテトラヒドロフラン溶液(10mL)に0℃で水素化ナトリウム(661.7mg, 27.6mmol)を加え撹拌した（以下溶液Aとする）。得られたアルデヒド(4.78mmol)のテトラヒドロフラン溶液に、溶液Aを0℃で加えた。室温で45分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。ヘキサンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=50:1)で精製すると、化合物3f(1.39g, 76% for 2steps)が得られた。
化合物3の合成：化合物3f(1.35g, 3.30mmol)のジクロロメタン(16.5mL)溶液に水素化ジイソブチルアルミニウム(0.97Mヘキサン溶液, 10.2mL, 9.90mmol)を-78℃で加えた。混合物を1.5時間かけて室温に昇温した後、室温で10分間撹拌した。飽和酒石酸ナトリムカリウム水溶液を加えて反応を停止した。ヘキサンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=30:1)で精製すると、化合物3(1.02g, 85%)が得られた。
化合物3:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 5.73(2H, ｍ), 4.13(2H, t, J=5.7Hz), 3.94(1H, dd, J=10.3, 4.6Hz), 3.86(1H, dd, J=10.3, 4.0Hz), 1.71-1.61(2H, m), 1.54(2H, m), 1.28(2H, m), 1.11-1.01(21H, m), 0.92(3H, s), 0.89(3H, s), 0.66(3H, s).
実施例７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　化合物4(62mg, 0.20mmol)をトルエン(10mL)に溶かし、0℃に冷却した。水素化ジイソブチルアルミニウム(1.0Mトルエン溶液, 0.40mL, 0.40mmol)を加えた後、0℃で15分間撹拌した。メタノール(1.0mL)を加えて反応を停止した後、空気中100℃で3時間撹拌した。反応溶液に、シリカゲル(2.5g)-水(0.8mL)から調整したスラリー状シリカゲルを加えた後、混合物を室温で45分間撹拌した。次いで無水硫酸マグネシウム(33mg)と炭酸カリウム(33mg)を加えた後、混合物を室温で90分間撹拌した。セライトを用いて濾過した後、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/酢酸エチル=98.5:1.5)で精製すると、化合物5(51mg, 82%)が得られた。
化合物5:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.77(s, 1H), 8.04(dt, J=8.0, 1.7Hz, 2H), 7.85(dd, J=8.0, 1.7Hz, 1H), 7.73(d, J=8.0Hz, 1H), 7.48(td, J=8.0, 1.7Hz, 2H), 7.42(tt, J=8.0, 1.7Hz, 1H), 1.45(sept, J=7.4Hz, 3H), 1.11(d, J=7.4 Hz, 18H).
実施例８
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
化合物4Bの合成：ブチルリチウム(2.77Mヘキサン溶液, 78mL, 217mmol)と1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン(49mL, 234mmol)から調整したリチウムヘキサメチルジシラジドのテトラヒドロフラン溶液(125mL)に3-メトキシアクリロニトリル(E/Z=5:1, 17mL, 200mmol)を-78℃でゆっくり加えた。その後、トリフルオロメタンスルホン酸トリイソプロピルシリル(45mL, 167mmol)のテトラヒドロフラン溶液(84mL)を、カニュラーを用いてゆっくり加えた。-78℃で1時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した。ジエチルエーテルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=9/1)で精製すると、化合物4B(32.0g, 80% based on TIPSOTf)がE/Z=24:76の分離不可能な混合物で得られた。得られた化合物4BのE/Z=24:76の混合物(32.0g, 134mmol)をヘキサンに溶かし、空気中室温で4時間32Wの低圧水銀ランプを照射した。濃縮した後、残渣を-30℃でヘキサンから再結晶すると、化合物4B(E-only, 16.6g, 42%)が単一の異性体として得られた。
化合物5Cの合成：アルゴン雰囲気下、撹拌しながら、切削片状マグネシウム(4.38g, 180mmol)のジエチルエーテル溶液(25mL)にクロロメチルトリメチルシラン(21mL, 150mmol)のジエチルエーテル溶液(100mL)を穏やかな還流を保ちつつゆっくりと滴下した。この溶液にトルエン(125mL)を加えた後、90℃に加熱してジエチルエーテルを除媒した。2時間加熱後室温に冷却した（以下、溶液Aとする）。アルゴン雰囲気下、化合物4B(E-体, 16.3g, 68mmol)をトルエン(272mL)に溶かし、溶液Aを室温で加えた後、90℃に加熱した。90℃で15.5時間撹拌した後、室温に冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。ヘキサンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=97/3)で精製すると、化合物4C(16.0g, 74%)が得られた。
化合物4の合成：化合物4C(709.6mg, 2.4mmol)をジエチルエーテル(6.0mL)に溶かし、-30℃に冷却した。ブチルリチウム(1.63Mヘキサン溶液, 1.41mL, 2.3mmol)を加えた後、-30℃で1時間撹拌した。混合物を-78℃に冷却した後、ベンズアルデヒド(0.203mL, 2.0mmol)のジエチルエーテル溶液(4.0mL)を加えた。-78℃で1時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。ジエチルエーテルで抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、粗生成物を-30℃でヘキサンから再結晶すると、化合物4(233.4mg, 37%)が単一の異性体として得られた。
化合物4:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.54-7.53(m, 2H), 7.41-7.32(m, 4H), 7.08(d, J=10.9Hz, 1H), 6.91(d, J=15.5Hz, 1H), 1.34(sept, J=7.4Hz, 3H), 1.14(d, J=7.4Hz, 18H).
実施例９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　試験管にアルデヒド(0.1mmol)と(S)-(Z)-アリルシラン(33.1mg, 0.15mmol)を入れアルゴン置換した後、乾燥プロピオニトリル(0.5mL)に溶かし0℃で撹拌した。この溶液にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(0.36mg, 0.2mmol)をゆっくり加えた後、0℃で20分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、除媒した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)で精製すると、化合物6が66%の収率で得られた。
化合物6:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.54-7.21(10H, m), 5.02(1H, dd, J=6.3, 4.0Hz), 4.95(1H, dd, J=6.9, 4.0Hz), 4.78(1H, d, J=8.6Hz), 4.47(1H, d, J=12.0Hz), 4.42(1H, d, J=12.0 Hz), 4.10(1H, ddd, J=12.6, 8.6, 4.0Hz), 3.93(1H, dd, J=11.5, 4.6Hz), 3.37-3.18(4H, m), 2.45(1H, d, J=6.9Hz), 2.19-2.07(1H, m), 2.07-1.89(2H, m), 2.02(3H, s), 1.99(3H, s), 1.72(1H, dq, J=14.9, 7.4Hz), 1.66(1H, dq, J=14.9, 7.4Hz), 1.47(1H, ddd, J=12.6, 12.6, 4.6Hz), 0.96(3H, d, J=6.9Hz), 0.94(6H, d, J=6.9Hz), 0.87(3H, d, J=6.9Hz), 0.78(3H, d, J=7.4Hz), 0.73(3H, d, J=6.9Hz), 0.34(3H, s), 0.21(3H, s).
実施例１０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
化合物7:後記の実施例11の化合物8Ａから化合物8の合成法と同様にして、市販の1-ペンチン-5-オールから得た5-(トリイソプロピルシリル)-1-ペンチンを、文献法(J. R. Granja et al. Journal of Organic Chemistry, 2005, 70, 8281-8290)により化合物7に変換した。
無色油状物:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 1.00-1.15(21H, m), 1.68-1.81(2H, m), 2.28-2.40(2H, m), 3.73-3.78(2H, m), 4.24(2H, dt, J=5.2, 2.3Hz).
実施例１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
化合物8Aの合成：市販のメチルチオメチルp-トリルスルホン(11.3g, 52.1mmol)をテトラヒドロフラン(350mL)に溶解させ、-78℃でブチルリチウム(2.64Mヘキサン溶液、21mL, 55.4mmol)を加えた。1.5時間攪拌した後、ヨウ化メチル(6.5mL, 104mmol)を加えた。0℃で30分間攪拌した後、塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水、次いで水で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した後減圧下で除媒した。ヘキサン-エタノールで再結晶を行うと、化合物8Aを得た。収率56%。得られた化合物8Aには約5%の原料と約5%のジメチル化体が含まれていた。
化合物8Bの合成：化合物8A(1.93g, 8.37mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(8.4mL)に溶解させ、パラホルムアルデヒド(756mg, 25.2mmol)、炭酸セシウム(140mg, 0.43mmol)を加え、50℃で30分間加熱した。塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後減圧下で除媒した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン＝30％～50％)で精製し、化合物8Bを得た。収率80%。
化合物8の合成：化合物8B(1.75g, 6.71mmol)のジクロロメタン溶液(34mL)にトリエチルアミン(3.5mL, 20mmol)を加え、0℃に冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸トリイソプロピルシリル(2.7mL, 10mmol)を1分間かけて滴下した後、0℃で3時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後減圧下で除媒した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン＝2％～10％)で精製し化合物8を得た。得られた化合物8はTIPSOHとの混合物で、モル比は約55:45であった。
化合物8:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.83(d, J=8.6Hz, 3H), 7.32(d, J=8.6Hz, 3H), 4.10(s, 3H), 2.45(s, 3H), 2.28(s, 3H), 1.56(s, 3H), 1.07-1.00(m, 21H).
参考例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　ポリプロピレン製の5mL試験管に化合物1(5.5mg, 10.2μmol)を入れアルゴンで置換した後、乾燥テトラヒドロフラン(0.3mL)に溶かし、0℃に冷却した。フッ化水素-ピリジン(0.15mL)をポリプロピレン製のシリンジを用いて加えた後、室温で1.5時間撹拌した。0℃でメトキシトリメチルシラン(約1.5mL)を反応溶液のpHが7になるまで1時間かけてゆっくり加えた。反応溶液を濃縮した後、高減圧下乾燥した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, クロロホルム/メタノール=9/1)で精製すると、化合物1cが無色結晶(3.2mg, >99%)で得られた。
化合物1c:1H-NMR(500MHz, CD3OD) δ 1.10(3H, s), 1.18(3H, d, J=7.5Hz), 1.37(3H, s), 1.31-1.48(5H, m), 1.55-1.82(7H, m), 1.88-1.95(1H, m), 2.00-2.09(1H, m), 3.22(1H, d, J=12.1Hz), 3.79(brd, J=2.3Hz), 4.08(1H, quintet, J=4.0Hz), 4.41(1H, s), 4.64(1H, d, J=12.0Hz).
参考例２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　アルゴン置換したフラスコに乾燥1,2,4-トリクロロベンゼン(22mL)を入れ、240℃に加熱した。これにジエン(10.7g, 21.8mmol)(Miyashita, M. et al. Science 2004, 305, 495.)の1,2,4-トリクロロベンゼン溶液(22mL)を1時間かけてゆっくり滴下した。240℃で0.5時間撹拌した後、室温に冷却した。反応溶液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル=9/1-3/1）で精製し、環化体を得た。
　得られた環化体(21.8mmol)をフラスコに入れ、アルゴン置換した後乾燥テトラヒドロフラン(33mL)に溶かした。0℃に冷却した後、70%フッ化水素-ピリジン(4.4mL)を加えた。室温で3時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した後、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、除媒した。粗生成物をヘキサン-酢酸エチルから再結晶するとエキソ体(4.4g, 51% for 2steps)が無色結晶で得られた。母液を濃縮した後、ヘキサン-酢酸エチルから再結晶すると化合物9が無色結晶で得られた。
化合物9:1H-NMR(270MHz, CDCl3) δ 1.13(d, J=7.4Hz, 3H), 1.20(dd, J=12.7, 4.6Hz, 1H), 1.28(s, 3H), 1.38(s, 3H), 1.61-2.25(m, 8H), 2.11(s, 3H), 2.23(d, J=3.8, 11.7Hz, 1H), 2.50(d, J=14.7Hz, 1H), 2.59(bt, J=12.6Hz, 1H), 3.18(s, 1H), 3.24(d, J=14.7Hz, 1H), 3.65(s, 3H), 4.94-4.95(m, 1H).
参考例３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　室温で、化合物10(3.9g, 9.5mmol)にフッ化テトラブチルアンモニウム(1.0Mテトラヒドロフラン溶液, 14mL, 14.0mmol)を加えた。室温で1時間撹拌後、水を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、除媒した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=18:1)で精製すると、化合物11(2.15g, 90%)が得られた。
化合物11:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 6.97(1H, d, J=16.0Hz), 5.82(1H, d, J=16.0Hz), 4.17(2H, q, J=7.4Hz), 3.50(2H, d , J=6.3Hz), 2.27(1H, t, J=6.3Hz), 1.72(2H, m), 1.60-1.50(2H, m), 1.46(1H, m), 1.29(3H, t, J=7.4Hz), 1.06(3H, s), 0.97(3H, s), 0.74(3H, s).
参考例４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
化合物12(506.4mg, 2.0mmol)とセレノシアン酸2-ニトロフェニル(727.2mg, 3.2mmol)のテトラヒドロフラン溶液(10mL)に0℃でブチルホスフィン(0.75mL, 3.0mmol)を加えた。室温で2時間撹拌した後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル=18:1）で濾過した。粗生成物のセレニドはそのまま次の反応に用いた。得られたセレニド(2.0mmol)のジクロロメタン溶液(10mL)にm-クロロ過安息香酸(75%, 599.7mg, 2.6mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。2-メチル-2-ブテン(0.22mL, 2.0mmol)を加えた後、室温で10分間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とジエチルエーテルを加えた。濃縮した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。粗生成物のセレノキシドはそのまま次の反応に用いた。得られたセレノキシド(2.0mmol)のトルエン溶液(13mL)に炭酸カルシウム(1.25g, 12.5mmol)を加えた後、80℃で1時間撹拌した。ヘキサンを加えた後、セライトで濾過した。濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=30:1)で精製すると、オレフィン(273.2mg, 58% for 3steps)が得られた。得られたオレフィン(484.6mg, 2.07mmol)をテトラヒドロフラン(7mL)に溶かし、-78℃で水素化ジイソブチルアルミニウム(6mL, 6.2mmol)を加えた。-78℃で30分間撹拌した後、飽和酒石酸水溶液を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=15:1)で精製すると、化合物13(353.6mg, 89%)が得られた。
化合物12:1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ 5.74(2H, m), 4.36(2H, d, J=7.4Hz), 4.16(2H, m), 1.77(1H, m), 1.63(2H, m), 1.55(1H, m), 1.29(1H, brs), 0.97(3H, s), 0.95(3H, s), 0.76(3H, s).
試験例１
　本発明化合物（１）のＰＰＭ１Ｄ阻害活性を測定した。
（方法）
　ＰＰＭ１Ｄタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：Ｏ１５２９７／ｃＤＮＡ　ＩＤ：Ｕ７０３８５）は触媒ドメイン（１位から４２０位）をコードしたｃＤＮＡをｐＣｏｌｄＩ ベクター（ＴａＫａＲａ社）に導入し、Ｈｉｓタグ融合タンパク質として大腸菌を用いて発現させた。精製はＢＤ－ＴＡＬＯＮ樹脂（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた金属アフィニティークロマトグラフィーによって行い、溶出バッファー（１５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ, ＰＢＳ（ｐＨ７．５）, ５００ｍＭ ＮａＣｌ, １０% ｇｌｙｃｅｒｏｌ, ０．２% ｅｔｈａｎｏｌ, １ｍＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いて目的タンパク質の溶出を行った。溶出されたＰＰＭ１Ｄタンパク質は透析バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）, ０．１ｍＭ ＥＧＴＡ, ０．０２% ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）に対して１６時間透析した後、５０%グリセロールストック（酵素濃度１ μＭ）として－８０℃で保存した。
　ＰＰＭ１Ｄに対する化合物の阻害効果について解析する際、上記の方法で発現・精製した酵素を用いた。また、基質にはＦｍｏｃ固相法によって化学合成したｐ５３の１５位リン酸化Ｓｅｒ含有ペプチド（Ａｃ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（Ｐ）－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－ＮＨ２：Ｓｅｒ（Ｐ）はリン酸化Ｓｅｒを示す）を用いた。精製したｐ５３リン酸化ペプチドをＨ２Ｏに溶解させ４００μＭの基質原溶液を調整した。実施例１の被験化合物（阻害剤）は予めエタノール（ＥｔＯＨ）で４０ｍＭの濃度で溶解させ、続いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、濃度４ｍＭの阻害剤原溶液を調節した。他の阻害剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、濃度４ ｍＭの阻害剤原溶液を調節した。阻害剤と基質の混合溶液３０μＬ（６６．７μＭ リン酸化ペプチド基質、６６．７μＭ阻害剤、１．７%ＤＭＳＯ（実施例１の場合は１．５% ＤＭＳＯ、０．２% ＥｔＯＨ）、１３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を３０℃で保温し、４℃の酵素と金属イオンの混合液２０μＬ（１０ｎＭ ＰＰＭ１Ｄ, １２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）, ０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ, ０．０５% ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ, ７５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を加え、３０℃で１０分間インキュベートすることによりＰＰＭ１Ｄに対する阻害活性を測定した。ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ試薬（Ｂｉｏｍｏｌ社）１００μＬを反応液に加えることにより酵素反応を停止し、３０分後に６２０ｎｍの吸光度を測定することでＰＰＭ１Ｄによって遊離したリン酸を検出した。ＰＰＭ１Ｄにおける阻害効果は、阻害剤を含まないＤＭＳＯ添加時の遊離リン酸量に対して、阻害剤添加による遊離リン酸の減少量を６２０ｎｍの吸光度を測定することにより解析した。
（結果）
　得られた結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
試験例２
　ＰＰＭ１Ｄ阻害活性を測定し、本発明化合物（１）のＰＰＭ１Ｄ阻害活性の選択性を検討した。表２に実施例１の化合物〔化合物１〕の結果、表３に実施例１の化合物〔化合物１〕及び実施例５の化合物〔化合物２〕の結果を示す。
（方法）
　阻害剤の酵素選択性を解析するため、ＰＰＭ１Ｄと同じＰＰＭ１ファミリーに属するＰＰＭ１Ａへの阻害効果を解析し、ＰＰＭ１Ｄに対する阻害効果と比較した。ＰＰＭ１Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：Ｐ３５８１３／ｃＤＮＡ　ＩＤ：Ｓ８７７５９）の全長（３８２残基）をコードしたｃＤＮＡをｐＣｏｌｄＩベクターに導入し、ＰＰＭ１Ｄと同様にして大腸菌の系を用いて発現・精製した。精製したＰＰＭ１Ａ １６ ｎＭに対して阻害活性測定を行った。ＰＰＭ１Ａに対する基質はｐ３８リン酸化ペプチドアナログ（Ａｃ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｎｌｅ－Ｔｈｒ（Ｐ）－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ（Ｐ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ＮＨ２：Ｔｈｒ（Ｐ）はリン酸化Ｔｈｒ、Ｔｙｒ（Ｐ）はリン酸化Ｔｙｒ、ＮｌｅはＮｏｒｌｅｕｃｉｎｅを示す）を用いた。
　阻害剤と基質の混合溶液３０μＬ（６６．７μＭ リン酸化ペプチド基質、各濃度阻害剤、１．７% ＤＭＳＯ（実施例１の被験化合物の場合は１．５% ＤＭＳＯ、０．２% ＥｔＯＨ）、１３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を３０℃で保温し、４℃の酵素と金属イオンの混合液２０μＬ（４０ｎＭ ＰＰＭ１Ａ, １２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）, ０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ, ０．０５% ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ, ２５ｍＭ ＭｎＣｌ２）を加え、３０℃で１０分間インキュベートすることによりＰＰＭ１Ａに対する阻害活性を測定した。
　また、Ｓｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼファミリー間における阻害剤の酵素選択性を解析するため、ＰＰＰファミリーに属するＰＰ２Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：Ｐ６７７７５／ｃＤＮＡ　ＩＤ：Ｘ１２６４９）への阻害効果を解析した。ＰＰ２ＡはＰｒｏｍｅｇａ社より購入した。ＰＰ２Ａに対する基質はｐ３８リン酸化ペプチドアナログ（Ａｃ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ－Ｔｈｒ（Ｐ）－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－ＮＨ２：Ｔｈｒ（Ｐ）はリン酸化Ｔｈｒを示す）を用いた。阻害剤と基質の混合溶液３０μＬ（３３３．３μＭ リン酸化ペプチド基質、各濃度阻害剤、１．７%ＤＭＳＯ（実施例１の場合は１．５% ＤＭＳＯ、０．２% ＥｔＯＨ）、１３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を３０℃で保温し、４℃の酵素と金属イオンの混合液２０μＬ（２５ｍＵ ＰＰ２Ａ, １２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）, ０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ, ０．０５% ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ, ７５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を加え、３０℃で１０分間インキュベートすることによりＰＰ２Ａに対する阻害活性を測定した。
　各阻害剤最終濃度（０, ０．１, ０．２, ０．４, １, ２, ４, １０, ４０μＭ）におけるＰＰＭ１Ａ、ＰＰ２Ａ、ＰＰＭ１Ｄの阻害活性を各濃度に対して３回測定し、酵素活性を５０％阻害する阻害剤濃度（ＩＣ５０値）を決定した。
　阻害剤原溶液は溶媒（ＤＭＳＯ、（実施例１の被験化合物を用いた場合は９０% ＤＭＳＯ、１０% ＥｔＯＨ））で希釈し、各濃度の阻害剤溶液を調製した。
　酵素活性測定における他の条件は試験例１と同様である。
　ＰＰＭ１ＤおよびＰＰＭ１Ａ、ＰＰ２Ａに対する阻害剤のＩＣ５０値を比較することにより阻害剤の酵素選択性を解析した。
　また、阻害剤の阻害定数（Ｋｉ）および阻害形式の測定については以下のように行った。
　ＰＰＭ１Ｄに対する化合物の阻害定数および阻害形式について解析する際、試験例１に示す方法で発現・精製した酵素を用いた。また、基質にはｐ５３の１５位リン酸化ペプチドアナログ（Ａｃ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（Ｐ）－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－ＮＨ２：Ｓｅｒ（Ｐ）はリン酸化Ｓｅｒを示す）を用いた。阻害剤と基質の混合溶液３０ μＬ（各濃度リン酸化ペプチド基質、各濃度阻害剤、１．７% ＤＭＳＯ（実施例１の場合は１．５% ＤＭＳＯ、０．２% ＥｔＯＨ）、１３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を３０℃で保温し、４℃の酵素と金属イオンの混合液２０μＬ（１０ｎＭ ＰＰＭ１Ｄ, １２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）, ０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ, ０．０５% ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ, ７５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を加え、３０℃で１０分間インキュベートすることによりＰＰＭ１Ｄに対する阻害活性を測定した。
　各リン酸化ペプチド基質濃度（５, １０, ２０, ４０μＭ）、各阻害剤最終濃度（０, ０．３, ０．４, ０．６μＭ（実施例１の化合物〔化合物１〕）または０, ０．４, １, ２μＭ（実施例５の化合物〔化合物２〕）で各リン酸化ペプチド基質濃度、阻害濃度におけるＰＰＭ１Ｄ活性を測定した。ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ試薬（Ｂｉｏｍｏｌ社）５０μＬを反応液に加えることにより酵素反応を停止し、３０分後に６２０ ｎｍの吸光度を測定することでＰＰＭ１Ｄによって遊離したリン酸を検出した。
　これらの結果から、Ｋｉ（μＭ）を算出した。
（結果）
　本発明化合物のＰＰＭ１Ｄ選択性評価について、実施例１の化合物〔化合物１〕を用いて行った結果、ＰＰＭ１Ｄに対するＩＣ５０値：０．４３±０．０４μＭ、ＰＰＭ１Ａに対するＩＣ５０値：２１±１．７μＭであった。
　更に、実施例１の化合物〔化合物１〕及び実施例５の化合物〔化合物２〕を用いて行った結果を表２に示す。
　このように、本発明化合物のＰＰＭ１Ｄ阻害活性は、極めて選択性が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例３
　癌抑制タンパク質ｐ５３はＤＮＡダメージによって活性化、安定化し、細胞周期停止やアポトーシスに関与する多数のタンパク質の発現を誘導することで、細胞の癌化を防いでいる。ｐ５３はリン酸化によって活性化し、特に１５位Ｓｅｒのリン酸化はｐ５３の活性化、安定化に重要な役割を果たしていることが報告されている。
　ＰＰＭ１Ｄはｐ５３の１５位リン酸化Ｓｅｒを脱リン酸化することが知られており、スクリーニングの結果得られたＰＰＭ１Ｄ阻害剤の中で、実施例１の化合物〔化合物１〕又は実施例５の化合物〔化合物２〕を、ＭＣＦ７細胞（乳癌由来の細胞、ＰＰＭ１Ｄ過剰発現）に添加し、細胞内における阻害剤の効果を測定した。
（方法１）
　ＭＣＦ７細胞をＡＤＲ（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ：別名Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）刺激し、実施例１の化合物〔化合物１〕（１０μＭ）を加え、１２ｈ後のｐ５３の１５位Ｓｅｒのリン酸化を観察することで、細胞内における化合物１のＰＰＭ１Ｄ阻害活性を測定した。なお、コントロールとしてＡＤＲ刺激をしないものを（－）として同様に行った。
　抗ｐ５３ポリクローナル抗体であるＦＬ３９３を用いたＩＰでｐ５３の濃縮を行い、ｐ５３　１５位リン酸化ＳｅｒをＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した。
　（方法２）
　ＭＣＦ７細胞にＵＶ照射し（１５Ｊ／ｍ２）、実施例１の化合物〔化合物１〕又は実施例５の化合物〔化合物２〕（１０μＭ）を加え、２４ｈ後のｐ５３の１５位Ｓｅｒのリン酸化を観察することで、細胞内における実施例１の化合物〔化合物１〕又は実施例５の化合物〔化合物２〕のＰＰＭ１Ｄ阻害活性を測定した。ｐ５３の１５位リン酸化Ｓｅｒ量の変化はＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した。１次抗体として抗リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５）マウスモノクノーナル抗体１６－Ｇ８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用い、２次抗体として抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）を用いた。なお、コントロールとしてＵＶ刺激をしないものを（－）として同様に行った。ｐ５３　１５位リン酸化Ｓｅｒを上記方法１と同様にして検出した。
（結果）
　本発明化合物（１）を加えることでリン酸化ｐ５３の大きな増加が見られ、ｐ５３の活性化が示された（図２及び３）。
　試験例４
　本発明化合物（１）のがん細胞に対する効果を確認した。
（方法）
　１．１×１０５個の乳がん由来ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣから購入）を、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ， ２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ， １００ｎＭ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、５％ ＣＯ２，３７℃条件下で１０ｃｍ ｄｉｓｈにて１８時間培養した後に、ＰＰＭ１Ｄ阻害剤（化合物１：４０μＭ，０．０６％ ＤＭＳＯ，０．１２％ ＥｔＯＨ／Ｍｏｃｋ：０．０６％ ＤＭＳＯ，０．１２％ ＥｔＯＨ）を添加した。阻害剤添加７２時間後にＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ－８０００（キーエンス社）を用いて細胞の透過像を観察した。その後、５ｍｌのＰＢＳ（８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，２．６８ｍＭ ＫＣｌ，１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で２回細胞を洗い、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ社）を用いて細胞を回収し、トリパンブルーを加えた後にヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定した。
（結果）
　本発明化合物（１）は、がん細胞の増殖抑制作用を有することが示された（図４及び５）。

Claims (15)

  1. 　一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     （式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、炭素数１～１２の炭化水素基を示し；Ｘは置換基を有していてもよい炭素数３～３６の炭化水素基又は置換基を有していてもよい複素環式基を示し；ｎは０又は１の数を示す）
    で表されるケイ素化合物又はその塩を有効成分とするプロテインホスファターゼ阻害剤。
  2. 　Ｘが、炭素数３～２４の直鎖、分岐鎖もしくは環状の炭化水素基（当該炭化水素基には、ヒドロキシ基、ニトリル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、置換スルホニル基、ハロゲン原子、トリ置換シリル基及びトリ置換シリルオキシ基から選ばれる１～４個の置換基を有していてもよい）、又は窒素原子もしくは又は酸素原子を含む５もしくは６員の複素環式基（当該複素環には、アリール基、アラルキル基、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アルケニルアミノ基、アシルオキシ基及びアラルキルオキシ基から選ばれる１～５個の置換基を有していてもよい）である請求項１記載のプロテインホスファターゼ阻害剤。
  3. 　ＰＰＭ１Ｄ阻害剤である請求項１記載のプロテインホスファターゼ阻害剤。
  4. 　式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     （式中、Ｒ４及びＲ５は同一又は相異って水素原子又は（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ－を示し、その少なくとも一方は（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｓｉ－であり；
    Ｒ６は水素原子を示すか、Ｒ８のヒドロキシ基と一緒になって－Ｏ－（エーテル結合）を形成してもよく；
    Ｒ7は水素原子を示し、Ｒ8はヒドロキシ基を示すか、Ｒ7とＲ8が一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を形成してもよい。）
    で表されるケイ素化合物又はその塩。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項記載のケイ素化合物又はその塩を含有する医薬。
  6. 　悪性腫瘍治療薬である請求項５記載の医薬。
  7. 　一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     （式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、炭素数１～１２の炭化水素基を示し；Ｘは置換基を有していてもよい炭素数３～３６の炭化水素基又は置換基を有していてもよい複素環式基を示し；ｎは０又は１の数を示す）
    で表されるケイ素化合物又はその塩の、プロテインホスファターゼ阻害剤製造のための使用。
  8. 　Ｘが、炭素数３～２４の直鎖、分岐鎖もしくは環状の炭化水素基（当該炭化水素基には、ヒドロキシ基、ニトリル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、置換スルホニル基、ハロゲン原子、トリ置換シリル基及びトリ置換シリルオキシ基から選ばれる１～４個の置換基を有していてもよい）、又は窒素原子もしくは又は酸素原子を含む５もしくは６員の複素環式基（当該複素環には、アリール基、アラルキル基、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アルケニルアミノ基、アシルオキシ基及びアラルキルオキシ基から選ばれる１～５個の置換基を有していてもよい）である請求項７記載の使用。
  9. 　ＰＰＭ１Ｄ阻害剤である請求項７記載の使用。
  10. 　請求項４、７及び８のいずれか１項記載のケイ素化合物又はその塩の、医薬製造のための使用。
  11. 　悪性腫瘍治療薬である請求項９記載の使用。
  12. 　一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     （式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、炭素数１～１２の炭化水素基を示し；Ｘは置換基を有していてもよい炭素数３～３６の炭化水素基又は置換基を有していてもよい複素環式基を示し；ｎは０又は１の数を示す）
    で表されるケイ素化合物又はその塩を投与する、プロテインホスファターゼ阻害方法。
  13. 　Ｘが、炭素数３～２４の直鎖、分岐鎖もしくは環状の炭化水素基（当該炭化水素基には、ヒドロキシ基、ニトリル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、置換スルホニル基、ハロゲン原子、トリ置換シリル基及びトリ置換シリルオキシ基から選ばれる１～４個の置換基を有していてもよい）、又は窒素原子もしくは又は酸素原子を含む５もしくは６員の複素環式基（当該複素環には、アリール基、アラルキル基、アルキル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アルケニルアミノ基、アシルオキシ基及びアラルキルオキシ基から選ばれる１～５個の置換基を有していてもよい）である請求項１２記載の方法。
  14. 　ＰＰＭ１Ｄ阻害剤である請求項１２記載の方法。
  15. 　請求項４、１２及び１３のいずれか１項記載のケイ素化合物又はその塩を投与する、悪性腫瘍治療方法。
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