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WO2009125626A1 - 中皮腫特異的プロモータおよびその用途 - Google Patents

中皮腫特異的プロモータおよびその用途 Download PDF

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WO2009125626A1
WO2009125626A1 PCT/JP2009/053256 JP2009053256W WO2009125626A1 WO 2009125626 A1 WO2009125626 A1 WO 2009125626A1 JP 2009053256 W JP2009053256 W JP 2009053256W WO 2009125626 A1 WO2009125626 A1 WO 2009125626A1
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WO
WIPO (PCT)
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mesothelioma
gene
promoter
cri1
vector
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2009/053256
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English (en)
French (fr)
Inventor
田中　紀章
順治 松岡
拓也 深澤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Okayama University NUC
Original Assignee
Okayama University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Okayama University NUC filed Critical Okayama University NUC
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Priority to EP09731254A priority patent/EP2281884A4/en
Priority to US12/933,892 priority patent/US20110065117A1/en
Publication of WO2009125626A1 publication Critical patent/WO2009125626A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a promoter that exhibits transcriptional activity specifically for mesothelioma and has low transcriptional activity in normal cells including other types of cancer cells and mesothelial cells. Furthermore, it is related with the use of this promoter, Specifically, It is related with the vector for gene therapy containing this promoter, and a mesothelioma therapeutic agent.
  • the organs such as the lungs and heart of the chest and the abdominal organs such as the gastrointestinal tract and the liver are encased in membranes such as the pleura, peritoneum and pericardium, respectively. It is the “mesothelial skin” that covers the surface of these membranes.
  • Mesothelioma is a general term for tumors derived from mesothelial cells and includes both malignant and benign. There are many pleura, and there are other peritoneum and pericardium, which are called pleural mesothelioma, peritoneal mesothelioma and pericardial mesothelioma.
  • Mesothelioma is often discussed in the context of asbestos, in which case mesothelioma mostly refers to malignant pleural mesothelioma.
  • Mesothelioma is characterized by a higher risk of exposure to asbestos and a longer exposure history, and a longer period of time from exposure to asbestos until mesothelioma occurs. It is said that it takes about 20 years on average and about 40 years on average. It has been pointed out that the incidence of lung cancer in people with both asbestos exposure and the risk of smoking increases several to 50 times, but it is said that there is little association between mesothelioma and smoking.
  • Diagnostic methods for mesothelioma include imaging findings, pleural effusion cytology, tissue biopsy, and tumor marker detection. In many cases, X-rays show extrapleural signs and pleural effusion. Usually unilateral. Similar findings can be obtained with chest CT. In FDG-PET, an integrated image is recognized. Tumor fluid cytology may show tumor cells. Tissue biopsy is extremely important and is the primary basis for a definitive diagnosis.
  • WT1 Wi-Patent Documents 1 to 3
  • Calretinin Non-Patent Documents 4 and 5
  • Mesothelin Non-Patent Document 5
  • CRI1 CREBBP / EP300 inhibitory protein 1
  • CRI1 CREBBP / EP300 inhibitory protein 1
  • the treatment method for mesothelioma varies depending on the stage, for example, localized pleural mesothelioma (stage I) or advanced pleural mesothelioma (stage II, III, IV).
  • stage I localized pleural mesothelioma
  • stage II, III, IV advanced pleural mesothelioma
  • the treatment involves surgery to remove a portion of the pleura and surrounding tissue. If the tumor is in a wider area of the pleura, treatment may be surgery to remove the pleura and nearby tissue to relieve symptoms, and sometimes radiation therapy or chemotherapy.
  • stage II, III, IV advanced pleural mesothelioma
  • stage II, III, IV advanced pleural mesothelioma
  • chest puncture to remove fluid from the chest surgery, radiation therapy, and chemotherapy are performed.
  • mesothelioma rarely causes organ metastases, it has already spread extensively at the time of diagnosis, and radical surgery is often impossible.
  • the prognosis is extremely poor, and it is said that the 1-year survival rate is 50% and the 2-year survival rate is 20%.
  • Ad vectors used as vectors for gene therapy are based on type 5 (or type 2) human Ad belonging to sub-group C.
  • the Ad vector is expected to be applied to various diseases as a gene therapy vector because of its excellent gene transfer characteristics. However, when an Ad vector is administered locally to a tumor, some Ad vectors may leak from the tumor into the systemic circulation. If the gene is expressed at a site other than the target disease site, there is a concern that undesirable side effects may occur. For example, when a gene that is toxic to gene-expressing cells is used, it may be toxic not only to tumors that are mesothelioma but also to tissues that are not tumors. If a desired gene can be expressed only in the target cell or tissue, it is considered that effective gene therapy can be performed without causing side effects. Differentiation, 65: 89-96, 1999 Cancer Research, 61: 921-925, 2001 J.
  • An object of the present invention is to provide a promoter exhibiting transcriptional activity specific to mesothelioma and having low transcriptional activity in normal cells including other types of cancer cells and mesothelial cells. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a gene therapy vector containing the promoter and a mesothelioma therapeutic agent, specifically regarding the use of the promoter.
  • the present inventors have focused on mesothelioma markers, are promoters related to mesothelioma markers, exhibit mesothelioma-specific transcriptional activity, The present inventors have succeeded in finding a promoter that does not exhibit transcriptional activity in normal cells including seed cancer cells and mesothelial cells, thereby completing the present invention.
  • this invention consists of the following. 1. A novel promoter derived from the CRI1 (CREBBP / EP300 inhibitory protein 1) gene, which exhibits transcriptional activity specifically for mesothelioma. 2. 2. The novel promoter according to item 1, wherein the promoter sequence derived from the CRI1 gene is a sequence selected from the region of ⁇ 2586 to +84 of the CRI1 gene. 3. 3. The novel promoter according to item 1 or 2, wherein the promoter sequence derived from the CRI1 gene is any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 in the sequence listing. 4). 4. A viral vector comprising the novel promoter according to any one of items 1 to 3 above. 5). 5.
  • 11. The viral vector according to item 10 above, wherein the marker gene is a fluorescent protein expression gene.
  • 12 A viral vector for mesothelioma testing, comprising the viral vector according to 10 or 11 above.
  • 13. 13 A method for examining mesothelioma by observing the presence or absence of marker expression using the viral vector for mesothelioma diagnosis described in 12 above.
  • the novel promoter of the present invention showed significant transcriptional activity in mesothelioma, and its activity in normal cells including other cancer cells and mesothelioma was low.
  • cell death or cell thawing action can be effectively induced specifically for mesothelioma by using a cell death inducing type or cell thawing inducing vector loaded with the promoter.
  • an antitumor effect was also confirmed in in vivo.
  • the vector is an E1-deficient Ad
  • the gene that encodes the E1 region is incorporated as a transgene together with the promoter of the present invention, whereby Ad grows specifically in mesothelioma. And mesothelioma can disappear.
  • an effective therapeutic agent for mesothelioma can be provided.
  • Example 1 It is a figure which shows the expression construct which took out the part of the promoter area
  • Example 1 It is a figure which shows the transcriptional activity in the mesothelioma of a various mesothelioma marker gene origin promoter, or a lung cancer cell.
  • Example 1 It is a figure which shows the transcriptional activity in the normal cell of various mesothelioma marker gene origin promoters.
  • Example 1 It is a figure which takes out the part of the promoter region of CRI1 gene, and shows the expression construct couple
  • Example 2 It is a figure which shows the transcriptional activity in various cells of each promoter derived from CRI1 gene.
  • Example 2 It is a figure which shows the schema of Ad vector carrying the promoter of this invention, and each transgene.
  • Example 3) It is a figure which shows the flow cytometry pattern when various cells are infected with the Ad vector of this invention.
  • Example 1 It is a figure which shows the viable cell count measurement result when various cells are infected with the Ad vector of this invention.
  • Example 2 It is a figure which shows the volume of the tumor cell when the Ad vector of this invention is administered to the tumor model mouse.
  • Example 3 It is a figure which shows the transcriptional activity in various cells of each promoter derived from CRI1 gene.
  • Example 2 It is a figure which shows the schema of Ad vector carrying the promoter of this invention, and each transgene.
  • Example 3 It is a figure which shows the flow cytometry pattern when various cells are infected with the Ad vector of this invention.
  • Example 1 It is
  • CRI1 (CREBBP / EP300 inhibitory protein 1) of the present invention is the one reported in Non-Patent Documents 6 and 7 (GenBank Accession No. NM_014335) as shown in the background art, but derived from the CRI1 gene of the present invention.
  • This promoter is selected from the nucleotide sequence shown in chromosome 15q21 (Chromosome 15 q21, Genbank Accession No. NW — 925884.1).
  • the promoter is selected from -296 to +84 (SEQ ID NO: 9), and most preferably a promoter consisting of the base sequence (SEQ ID NO: 10) represented by -138 to +84.
  • a promoter having a base sequence represented by -74 to +84 (SEQ ID NO: 11).
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is CRI1 ⁇ 2586 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 is CRI1 ⁇ 1849 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 is CRI1 ⁇ 1674.
  • SEQ ID NO: 4 consisting of the sequence shown in the promoter of CRI1 -1587 / + 84
  • SEQ ID NO: 5 in the promoter consisting of the sequence shown CRI1 -1,083 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 6 CRI1 - 766 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7 is CRI1 ⁇ 567 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 8 is CRI1 ⁇ 366 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 9 is CRI1 -296 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 10 can be expressed as CRI1 -138 / + 84
  • a promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 11 can be expressed as CRI1 -74
  • the novel promoter of the present invention is characterized by exhibiting transcriptional activity specifically for mesothelioma.
  • the promoter of the present invention shows significant transcriptional activity in malignant pleural mesothelioma cell lines such as 211H cells and H2452 cells, but lung cancer-derived cell lines such as human squamous lung cancer-derived A549 cells, human bronchioloalveolar epithelial cancer The transcriptional activity is hardly observed in the derived H322 cells, or is clearly lower than that in the mesothelioma-derived cell line.
  • the promoter of the present invention shows little transcriptional activity in normal human lung fibroblasts (NormaluHuman Lung Fibroblasts) -derived NHLF cells and normal mesothelial cells, or compared with the transcriptional activity in mesothelioma-derived cell lines. Obviously low.
  • the vector carrying the novel promoter of the present invention can be appropriately selected according to the purpose of use, but a viral vector is preferably used.
  • an adenovirus (Ad) vector is preferably used as the virus vector.
  • the Ad that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can achieve a function as a vehicle for introducing a nucleic acid sequence such as DNA or RNA into various types of cells in vivo or in vitro.
  • a nucleic acid sequence such as DNA or RNA into various types of cells in vivo or in vitro.
  • each of type 2, type 5, type 11 and type 35 Ad that has a human host, monkey Ad, chimpanzee Ad, mouse Ad, dog Ad, sheep Ad, and bird Ad that have a non-human host. Can be mentioned.
  • Ad may be one that grows only in specific cells, for example, E1-deficient Ad or restricted growth Ad.
  • E1-deficient Ad can propagate only in 293 cells (having E1 in the cell), and restricted growth type Ad can grow only in specific cancer cells, for example.
  • the promoter of the present invention can be incorporated and mounted in a vector that can be expressed together with a gene that is to be expressed specifically in mesothelioma.
  • the promoter base sequence can be selected from the base sequences shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 11, for example.
  • the number of promoters to be incorporated is not particularly limited as long as it can be incorporated into a vector, and a plurality of promoters may be incorporated.
  • a gene that can be mounted on a vector and that is specifically expressed in a mesothelioma is referred to as a transgene.
  • a gene that damages mesothelioma cells is preferable, and examples thereof include a cell death inducing gene and a cell thawing inducing gene.
  • Examples of cell death-inducing genes include apoptosis promotion-related genes.
  • Substances that inhibit apoptosis include Bcl-2 and Bcl-XL, which are Bcl-2 family proteins that partially block the release of cytochrome c from mitochondria to inhibit apoptosis. Among them, it binds and inactivates proteins that inhibit apoptosis, and promotes activation and apoptosis of procaspases.
  • Bax and Bak are stimulating factors that promote cytochrome c release from mitochondria and promote apoptosis. Bax and Bak are activated by Bcl-2 family pro-apoptotic factors such as Bid. Therefore, specifically, the Bid gene can be exemplified as an example of the cell death inducing gene. For example, by incorporating a cell death-inducing gene or a cell thawing-inducing gene into a vector together with the promoter of the present invention, cell death and cell thawing can be induced specifically in mesothelioma, affecting normal cells. And can be used effectively for mesothelioma treatment.
  • the gene encoding the E1 region can be used as a transgene and introduced together with the promoter of the present invention.
  • mesothelioma cells can be extinguished by Ad infection of mesothelioma cells because Ad grows specifically in mesothelioma.
  • the recognition sequence of one or a plurality of restriction enzymes is each digested with restriction enzymes in the production process, and the transgene is introduced by in vitro ligation via the shuttle vector or without the shuttle vector. can do.
  • the vector of the present invention can be produced by a production method including the following steps. 1) constructing an expression construct comprising the promoter sequence of the present invention in the untranslated region of the transgene; 2) constructing a shuttle vector containing the expression construct of 1) above; 3) preparing an Ad genome; 4) A step of cleaving the Ad genome with a restriction enzyme and ligating the gene expression shuttle vector prepared in 2) to the Ad genome.
  • the present invention also Oyobi the vector incorporating promoter, and the promoter and specifically extends to recombinant vectors comprising mounting the introduced gene downstream of the promoter.
  • the transgene is preferably a gene that damages mesothelioma cells, and examples thereof include a cell death inducing gene and a cell thawing inducing gene.
  • Examples of cell death-inducing genes include apoptosis promotion-related genes.
  • Substances that inhibit apoptosis include Bcl-2 and Bcl-XL, which are Bcl-2 family proteins that partially block the release of cytochrome c from mitochondria and inhibit apoptosis.
  • Bax and Bak are stimulating factors that promote cytochrome c release from mitochondria and promote apoptosis.
  • Bax and Bak are activated by Bcl-2 family pro-apoptotic factors such as Bid. Therefore, specifically, the Bid gene can be exemplified as an example of the cell death inducing gene.
  • a vector carrying the transgene downstream of the promoter of the present invention can be used as a mesothelioma therapeutic agent.
  • the present invention also extends to a mesothelioma therapeutic agent comprising a recombinant vector incorporating the transgene as an active ingredient.
  • the vector incorporating the promoter of the present invention can also be used in the examination of mesothelioma. Specifically, by using a viral vector carrying a marker gene downstream of the promoter. Since the promoter of the present invention has a significant transcriptional activity in mesothelioma, the marker gene is expressed by the presence of mesothelioma, and mesothelioma can be examined.
  • the marker gene is not particularly limited as long as it can express a protein that can be used for testing, and examples thereof include fluorescent proteins, and more specifically, GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the present invention extends to a viral vector for mesothelioma examination that can express a marker gene due to the presence of mesothelioma, and the mesothelioma obtained by observing the presence or absence of marker expression using the viral vector for mesothelioma examination It extends to the examination method of the tumor.
  • Example 1 Confirmation of transcriptional activity of various promoters in various cells 1) Construction of expression constructs containing promoters derived from various mesothelioma marker genes CRI1, Calretinin, WT1 (Wilms' tumor susceptibility gene 1) and mesothelioma markers For Mesothelin, the promoter region of each marker gene was extracted, and an expression construct linked to a firefly luciferase gene was constructed.
  • the schema of the expression construct containing each promoter is shown in FIG.
  • the Calretinin gene-derived promoter is chromosome 16q21.1 (Chromosome 16 q21.1, GenBank Accession No.
  • NT_010498.15 WT1 gene-derived promoter
  • the WT1 gene-derived promoter is chromosome 11p3 (Chromosome 11 p3, GenBank Accession No. NT_079237.17).
  • the promoter derived from the Mesothelin gene is selected from each sequence of chromosome 16 (Chromosome 16, GenBank Accession No. NT_037887.4).
  • the sequence of each promoter region when the transcription start point of each marker gene is +1 is represented by SEQ ID NO: 2 or 12 to 14 in the sequence listing, and is specifically shown below.
  • CRI1 gene promoter -2586 / + 84 (SEQ ID NO: 2) Calretinin gene promoter: -2179 / + 70 (SEQ ID NO: 12) WT1 gene promoter: -1887 / + 39 (SEQ ID NO: 13) Mesothelin gene promoter: -2310 / + 44 (SEQ ID NO: 14)
  • Each cell of 4 malignant pleural mesothelioma cell lines (H2452, 211H, H2052, H28) and 2 types of lung cancer cell lines (A549, H322) were placed in a 6-well plate and 3 ⁇ 10 6 cell count drug After seeding and confirming the engraftment of each cell, 2 ⁇ g of each expression construct was transduced into each cell using the transduction reagent Lipofectin (R) (Invitrogen). After 24 hours, the luciferase luminescence was measured by luciferase assay in each cell, and the transcription activity of each promoter was confirmed.
  • R transduction reagent Lipofectin
  • the promoters derived from the marker genes tended to show transcriptional activity specifically for mesothelioma cells and low transcriptional activity for lung cancer cells.
  • CRI1 gene promoter -2586 / + 84
  • mesothelioma cell-specific transcriptional activity was observed compared to other promoters, and lung cancer cells had only low transcriptional activity (FIG. 2).
  • Each expression construct was prepared by inserting each promoter region into a pGL3 luciferase reporter vector (Promega) in the same manner as in 2) above.
  • Normal mesothelial cells, normal pleural cells (4 / 4RM-4 cells derived from rat pleura) and normal human lung fibroblasts (Normal Human Lung Fibroblasts) -derived NHLF cells were cultured in the same manner as in 2) above.
  • 2 ⁇ g of each expression construct was transduced into each cell. After 24 hours, the luciferase luminescence was measured by luciferase assay in each cell, and the transcription activity of each promoter was confirmed.
  • CRI1 gene promoter -2586 / + 84 (CRI1 -2586 / + 84 )
  • the transcription activity was low with respect to normal cells.
  • promoters derived from other markers were also transcribed in normal cells. Activity was recognized (FIG. 3).
  • CRI1 -2586 / + 84 showed low transcriptional activity for normal cells and lung cancer cells, but high transcriptional activity for mesothelioma, and transcription specific to mesothelioma. It was confirmed that the activity was exhibited.
  • Example 2 Confirmation of transcriptional activity of CRI1 gene-derived promoter in various cells
  • Construction of expression construct containing CRI1 gene-derived promoter For each region of the promoter region of CRI1 gene, regions having different lengths were taken out, and firefly luciferase gene An expression construct linked to was constructed.
  • the schema of the expression construct containing each promoter is shown in FIG.
  • Each promoter when the transcription start point of CRI1 gene is set to +1 consists of a base sequence shown in SEQ ID NO: CRI1 -2586 / + 84 (SEQ ID NO: 1) CRI1 -1849 / + 84 (SEQ ID NO: 2) CRI1 -1674 / + 84 (SEQ ID NO: 3) CRI1 -1587 / + 84 (SEQ ID NO: 4) CRI1 -1083 / + 84 (SEQ ID NO: 5) CRI1 -766 / + 84 (SEQ ID NO: 6) CRI1 -567 / + 84 (SEQ ID NO: 7) CRI1 -366 / + 84 (SEQ ID NO: 8) CRI1 -296 / + 84 (SEQ ID NO: 9) CRI1 -138 / + 84 (SEQ ID NO: 10) CRI1 -74 / + 84 (SEQ ID NO: 11)
  • Each expression construct was prepared by inserting the CRI1 gene-derived promoter into the pGL3 luciferase reporter vector (Promega) in the same manner as in Example 1 above.
  • Two malignant pleural mesothelioma cell lines H2452, MSTO-211H
  • two lung cancer cell lines A549, H322
  • two normal cell lines normal mesothelial cells, NHLF
  • 2 ⁇ g of each expression construct was transduced into each cell. After 24 hours, the luciferase luminescence was measured by luciferase assay in each cell, and the transcription activity of each promoter was confirmed.
  • Ad vector carrying a transgene and a CRI1 gene promoter (CRI1 -138 / + 84 ) upstream thereof was produced.
  • Cell transduction genes (BID) or Ad early gene E1 were used as transgenes.
  • Ad vector An E1-deficient type 5 Ad genome is prepared, the Ad genome is cleaved with a restriction enzyme, and the gene expression shuttle vector prepared in 2) is subjected to homologous recombination according to the method of He et al.
  • Ad Ad-CRI1 -138 4x / HA-BID, Ad-CRI1 -138 4x / E1A loaded with the above various expression constructs was obtained.
  • the HA tag was bound to the BID expression construct to distinguish it from endogenous BID.
  • Ad-CRI1 -138 4x / HA-BID effect on mesothelioma cells Ad-CRI1 -138 4x / HA-BID obtained in Example 3 was examined for cell killing effect on mesothelioma cells. .
  • all Ad vectors are E1-deficient and non-proliferating in mesothelioma cells, but differ in that they contain a cell death inducing gene (BID) or a non-toxic GFP gene.
  • malignant pleural mesothelioma cell lines 2 H2452, 211H
  • 2 lung cancer cell lines H322, A549
  • 2 normal cell lines normal mesothelial cells, NHLF
  • other than lung cancer 2 cancer cell lines liver cancer cells: Hep3B, breast cancer cells: MCF7.
  • Cell death in each cell after Ad infection was quantified by flow cytometry after propidium iodide (PI) staining.
  • PI propidium iodide
  • Ad vectors were introduced into two malignant pleural mesothelioma cell lines (H2452, MSTO-211H) and two normal cell lines (normal mesothelial cells, NHLF), and the number of viable cells was measured. Viable cells were measured using the MTS assay (MTS * [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulphophenyl) -2H-tetrazolium in living cells). , Inner salt]) was converted into formazan by an assay for measuring water-soluble formazan released into the culture at 490 nm.
  • the infection with Ad-CRI1 -138 4x / E1A clearly reduces the number of mesothelioma cells compared to the case of Ad-CRI1 -138 4x / GFP infection or PBS alone. Although confirmed, there was no difference in normal cells compared to Ad-CRI1 -138 4x / GFP infection or PBS. From the above results, it was confirmed that Ad-CRI1 -138 4x / E1A also has a cell killing effect specifically for mesothelioma cells.
  • Ad-CRI1 -138 4x / HA-BID Effect on Ad-CRI1 -138 4x / HA-BID or Ad-CRI1 -138 4x / E1A Mesothelioma (in vivo)
  • Ad-CRI1 -138 4x / HA-BID obtained in Example 3
  • Ad-CRI1 -138 4x / E1A was examined for its cytocidal effect on mesothelioma cells in vivo.
  • As a control vector in the same manner as in Experimental Example 1 and 2 was used incorporating a gene expressing GFP Ad-CRI1 -138 4x / GFP .
  • an Ad vector containing a cell death-inducing gene (BID) or a non-toxic GFP gene is E1-deficient, and is non-proliferating in mesothelioma cells.
  • An Ad vector containing the Ad early gene E1 can be propagated in mesothelioma cells.
  • a mesothelioma model mouse was prepared by inoculating 2.5 ⁇ 10 6 211H cells subcutaneously into a 6-week-old female BALB / c nude mouse.
  • the mesothelioma model mice on day 8 after inoculation with 211H cells were treated with 5 ⁇ 10 5 PBS, Ad-CRI1 ⁇ 138 4x / GFP, Ad-CRI1 ⁇ 138 4x / HA-BID or Ad-CRI1 ⁇ 138 4x / E1A.
  • 7 pfu plaque forming unit
  • was locally administered for 3 consecutive days, and the tumor size was observed for 56 days after inoculation (n 8 for each condition).
  • the novel promoter of the present invention has transcriptional activity specifically for mesothelioma. It was also confirmed that by introducing a vector carrying the novel promoter and cell death-inducing gene into cells, an effect of apoptosis was observed specifically for mesothelioma and a cell killing effect was confirmed. Antitumor effects were also confirmed in vivo. From these results, the vector containing the novel promoter of the present invention can be used when it is desired to have some action specific to mesothelioma, for example, together with the cell death-inducing gene and the cell thawing-inducing gene as described above.
  • the cell By introducing into a cell, the cell can be specifically damaged by mesothelioma. From these results, the vector containing the novel promoter of the present invention can be an effective therapeutic agent for mesothelioma. Furthermore, the vector containing the novel promoter and marker gene of the present invention can also be used in the examination of mesothelioma.

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Abstract

本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータを提供することを課題とする。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤を提供することを課題とする。中皮腫マーカーの一種であるＣＲＩ１の遺伝子由来プロモータによる。導入遺伝子として、細胞死誘導遺伝子、細胞融解誘導遺伝子を含み、導入遺伝子の上流にＣＲＩ１遺伝子由来プロモータを搭載するベクターを用いることで、中皮腫特異的に細胞死または細胞融解作用を誘導することができる。つまり、遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤は、ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータを搭載するウイルスベクターによる。

Description

中皮腫特異的プロモータおよびその用途
　本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータに関する。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００８－１０４０７０号優先権を請求する。
　胸部の肺あるいは心臓などの臓器や胃腸・肝臓などの腹部臓器は、それぞれ、胸膜・腹膜・心膜などという膜に包まれている。これらの膜の表面をおおっているのが「中皮」である。中皮腫とは、中皮細胞由来の腫瘍の総称をいい、悪性および良性の双方がある。発生場所は胸膜が多く、他に腹膜や心膜などがあり、それぞれ胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫という。中皮腫はアスベスト（石綿）との関連で論じられることが多いが、この場合の中皮腫は、ほとんどが悪性胸膜中皮腫のことをいう。
　中皮腫は、アスベストの曝露が多いほど、また曝露歴が長いほど、リスクが高くなり、アスベストに曝露してから中皮腫が発生するまでの期間が長いのが特徴である。発生までに、早い場合で２０年前後、平均で約４０年程度の時間がかかるといわれている。アスベスト暴露と喫煙のリスクを併せ持つ人の肺癌の罹患率が数倍～５０倍になることが指摘されているが、中皮種と喫煙の関連はほとんどないといわれている。
　中皮腫の診断方法としては、画像所見、胸水の細胞診、組織生検および腫瘍マーカーの検出などが挙げられる。画像所見では多くの場合、Ｘ線では胸膜外徴候 (extrapleural sign)や胸水貯留を認める。通常は片側性である。胸部ＣＴでも同様の所見を得ることができる。またFDG-PETでは、集積像を認める。胸水の細胞診では腫瘍細胞を認める場合がある。組織生検はきわめて重要で確定診断をする最大の根拠となる。中皮腫のマーカーとして、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)（非特許文献１～３）、Calretinin（非特許文献４、５）、Mesothelin（非特許文献５）、ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)（非特許文献６）の発現が認められることが報告されている。 なお、ＣＲＩ１は、CarimらのEST cluster解析によりC15ORF13として同定されたことが報告され（非特許文献７）、Gordonらの解析により中皮腫に有意に発現することが報告されている（非特許文献６）が、病原性に関する報告はない。ＣＲＩ１をコードする遺伝子の配列は、GenBank Accession No. NM_014335に登録されており、別名EP300 interacting inhibitor of differentiation 1（ＥＩＤ１）ともいう。
　中皮腫の治療方法は、病期、例えば限局型胸膜中皮腫（I期）または進展型胸膜中皮腫（II、III、IV期）によっても異なる。例えば限局型胸膜中皮腫（I期）の場合には、治療は胸膜の１部とその周囲の組織を除去する外科療法が行われる。腫瘍が胸膜のより広い範囲にあれば、治療は症状を軽減するために胸膜とその近傍の組織を取り除く外科療法を行い、場合によっては放射線療法や化学療法を行う場合もある。進展型胸膜中皮腫（II 、III、IV期）の場合は、その病期によっても異なるが、例えば胸部から液体を除去する胸腔穿刺や、外科療法、放射線療法、化学療法が行われる。中皮腫は、臓器転移を起こすことはほとんどないものの、診断時にすでに広範囲に進展し、根治手術が不可能であることが多い。予後はきわめて不良で、１年生存率が５０％、２年生存率が２０％であるといわれている。
　近年、疾患に対する治療方法の一つとして、遺伝子治療の試みが多くなされている。このような遺伝子治療のために使用可能なベクターについても各種報告があり、抗腫瘍剤として応用されることが期待されている（特許文献１、２）。遺伝子治療に用いられるベクターの１種として、アデノウイルスベクター（「Ａｄベクター」ともいう。）が挙げられる。現在、遺伝子治療用ベクターとして用いられるＡｄベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトＡｄを基盤としている。
　Ａｄベクターは、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。しかしながら、Ａｄベクターを腫瘍局所へ投与した場合、一部のＡｄベクターは腫瘍から全身循環に漏出する場合がある。目的とする疾患部位以外で遺伝子が発現すると、好ましくない副作用が生じることが懸念される。例えば、遺伝子発現細胞に対して毒性を示すような遺伝子を用いる場合は、中皮腫である腫瘍のみならず腫瘍ではない組織に対しても毒性を示してしまう場合がある。目的とする細胞や組織のみで所望の遺伝子を発現させることができれば、副作用を伴うことなく、効果的な遺伝子治療が行うことができると考えられる。
Differentiation, 65: 89-96, 1999 Cancer Research, 61: 921-925, 2001 J. Pathol., 199: 479-487, 2003 Human Pathology, 34: 994-1000, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 136-140, 1996 Am. J. Pathol., 166: 1827-1840, 2005 Cytogenet. Cell Genet., 88: 330-332, 2000 特開２００７－２０９３２８号公報 特開２００７－１９００２２号公報
　本発明は、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞および中皮を含む正常細胞では転写活性の低いプロモータを提供することを課題とする。さらには、該プロモータの用途に関し、具体的には該プロモータを含む遺伝子治療用ベクターおよび中皮腫治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中皮腫マーカーに着目し、中皮腫マーカーに関するプロモータであって、中皮腫特異的に転写活性を示し、他種癌細胞や中皮を含む正常細胞では転写活性を示さないプロモータを見出すことに成功し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
１．ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする新規プロモータ。
２．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、ＣＲＩ１遺伝子の-2586～+84の領域から選択される配列である、前項１に記載の新規プロモータ。
３．ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、配列表の配列番号１～１１に記載のいずれかである、前項１または２に記載の新規プロモータ。
４．前項１～３のいずれか１に記載の新規プロモータを搭載してなるウイルスベクター。
５．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである前項４に記載のウイルスベクター。
６．アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである前項５に記載のウイルスベクター。
７．さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４～６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
８．前項４～７のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
９．前項８に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
１０．さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる前項４～６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
１１．マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である前項１０に記載のウイルスベクター。
１２．前項１０または１１に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
１３．前項１２に記載の中皮腫診断用ウイルスベクターを用い、マーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法。
　本発明の新規プロモータは、中皮腫に有意な転写活性を示し、他種癌細胞および中皮腫を含む正常細胞での活性は低値であった。このことより、当該プロモータを搭載した細胞死誘導型または細胞融解誘導型ベクターを利用することで、効果的に中皮腫特異的に細胞死または細胞融解作用を誘導することができる。また、また、in vivoにおいても、抗腫瘍効果が確認された。in vitroおよびin vivoでの確認の結果、ベクターがＥ１欠損型Ａｄの場合に、本発明のプロモータとともに、Ｅ１領域をコードする遺伝子を導入遺伝子として組み込むことで、中皮腫特異的にＡｄが増殖し、中皮腫を消滅させることができる。上記により、中皮腫にとって効果的な治療剤を提供することができる。
各種中皮腫マーカー遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを示す図である。（実施例１） 各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの中皮腫または肺癌細胞における転写活性を示す図である。（実施例１） 各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの正常細胞における転写活性を示す図である。（実施例１） ＣＲＩ１遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを示す図である。（実施例２） ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータの各種細胞における転写活性を示す図である。（実施例２） 本発明のプロモータおよび各導入遺伝子を搭載したＡｄベクターのシェーマを示す図である。（実施例３） 本発明のＡｄベクターを各種細胞に感染させたときのフローサイトメトリーパターンを示す図である。（実験例１） 本発明のＡｄベクターを各種細胞に感染させたときの生細胞数測定結果を示す図である。（実験例２） 本発明のＡｄベクターを、腫瘍モデルマウスに投与したときの腫瘍細胞の体積を示す図である。（実験例３）
　本発明のＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)は、背景技術の欄に示すとおり、非特許文献６および７に報告されたもの (GenBank Accession No. NM_014335)であるが、本発明のＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータは、染色体１５ｑ２１(Chromosome 15 q21, GenBank Accession No. NW_925884.1）に示す塩基配列より選択される。
　具体的には、配列表のGenBank Accession No. NW_925884.1に示す塩基配列のうち、ＣＲＩ１遺伝子の上流部分であり、ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1とした場合に、-2586～+84（配列番号１）の領域より選択される。より詳しくは、-1849～+84（配列番号２）より選択され、さらには-1674～+84（配列番号３）より選択され、-1587～+84（配列番号４）より選択され、-1083～+84（配列番号５）より選択され、-766～+84（配列番号６）より選択され、-567～+84（配列番号７）より選択され、-366～+84（配列番号８）より選択され、-296～+84（配列番号９）より選択され、最も好ましくは、-138～+84で示される塩基配列（配列番号１０）からなるプロモータである。また、-74～+84（配列番号１１）で示される塩基配列からなるプロモータであってもよい。配列表の配列番号１に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-2586/+84、配列番号２に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1849/+84、配列番号３に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1674/+84、配列番号４に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1587/+84、配列番号５に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-1083/+84、配列番号６に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-766/+84、配列番号７に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-567/+84、配列番号８に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-366/+84、配列番号９に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-296/+84、配列番号１０に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-138/+84、配列番号１１に示す配列からなるプロモータをＣＲＩ１-74/+84、と表すことができる。
　本発明の新規プロモータは、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする。本発明のプロモータは、悪性胸膜中皮腫細胞株、例えば２１１Ｈ細胞やＨ２４５２細胞では有意に転写活性を認めるが、肺癌由来細胞株、例えばヒト扁平上皮肺癌由来Ａ５４９細胞、ヒト細気管支肺胞上皮癌由来Ｈ３２２細胞では殆ど転写活性を認めないか、あるいは中皮腫由来細胞株における転写活性に比べて明らかに低いものである。また本発明のプロモータは、正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞や正常中皮細胞においても殆ど転写活性を認めないか、あるいは中皮腫由来細胞株における転写活性に比べて明らかに低いものである。
　本発明の新規プロモータを搭載してなるベクターは、使用の目的に応じて適宜選択することができるが、ウイルスベクターが好適に用いられる。また、ウイルスベクターとしては、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターが好適に用いられる。本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、チンパンジーＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。Ａｄは、特定の細胞でのみ増殖するもの、例えば、Ｅ１欠損型Ａｄや制限増殖型Ａｄであってもよい。Ｅ１欠損型Ａｄは、２９３細胞（細胞内にＥ１を有する）でのみ繁殖することができ、制限増殖型Ａｄは、例えば特定の癌細胞でのみ増殖することができる。
　本発明のプロモータを、中皮腫特異的に発現させたい遺伝子とともに発現可能なベクターに組み込み、搭載することができる。プロモータの塩基配列は、例えば配列番号１～１１のいずれかに示す塩基配列からなるもの選択することができる。組み込むプロモータの数は、ベクターに組み込み可能な長さであればよく、特に制限されず、複数個のプロモータを組み込んでも良い。また、本発明において、ベクターに搭載しうる中皮腫特異的に発現させたい遺伝子を、導入遺伝子という。
　本発明における導入遺伝子として、中皮腫細胞に対して損傷を与える遺伝子が好適であり、例えば、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子が挙げられる。細胞死誘導遺伝子の例として、例えばアポトーシス促進関連遺伝子が挙げられる。アポトーシスを阻害する物質として、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を部分的に阻止してアポトーシスを阻害するＢｃｌ－２ファミリータンパク質であるＢｃｌ－２やＢｃｌ－ＸＬがあるが、逆にＢａｄは、ファミリーの内、アポトーシスを阻害するタンパク質と結合して不活性化させ、プロカスパーゼの活性化とアポトーシスを促進する。また、ＢａｘやＢａｋは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を促進する刺激因子であり、アポトーシスを促進する。ＢａｘとＢａｋは、ＢｉｄなどのＢｃｌ－２ファミリーのアポトーシス促進因子によって活性化される。従って、細胞死誘導遺伝子の例として、具体的にはＢｉｄ遺伝子を例示することができる。例えば、本発明のプロモータとともに、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子をベクターに組み込むことで、中皮腫特異的に細胞死や細胞融解を誘導させることができ、正常細胞には影響を及ぼすことなく、効果的に中皮腫治療に使用することができる。
　また、ベクターがＥ１欠損型Ａｄの場合には、Ｅ１領域をコードする遺伝子を導入遺伝子とし、本発明のプロモータとともに導入することができる。これにより、中皮腫特異的にＡｄが増殖することで、中皮腫細胞のＡｄ感染により中皮腫細胞を消滅させることができる。
　本発明のベクターの作製は、作製工程において１または複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、導入遺伝子を、シャトルベクターを介して、またはシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。
　本発明のベクター、例えばＡｄベクターは以下の工程を含む製造方法により作製することができる。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築する工程；
３）Ａｄゲノムを準備する工程；
４）Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターをＡｄゲノムにライゲーションする工程。
　本発明は、プロモータを組み込んだベクターにも及び、具体的には該プロモータと、該プロモータの下流に導入遺伝子を搭載してなる組換えベクターにも及ぶ。導入遺伝子とは具体的には、中皮腫細胞に対して損傷を与える遺伝子が好適であり、例えば、細胞死誘導遺伝子や細胞融解誘導遺伝子が挙げられる。細胞死誘導遺伝子の例として、例えばアポトーシス促進関連遺伝子が挙げられる。アポトーシスを阻害する物質として、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を部分的に阻止してアポトーシスを阻害するＢｃｌ－２ファミリータンパク質であるＢｃｌ－２やＢｃｌ－ＸＬがあるが、逆にＢａｄは、ファミリーの内、アポトーシスを阻害するタンパク質と結合して不活性化させ、プロカスパーゼの活性化とアポトーシスを促進する。また、ＢａｘやＢａｋは、ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を促進する刺激因子であり、アポトーシスを促進する。ＢａｘとＢａｋは、ＢｉｄなどのＢｃｌ－２ファミリーのアポトーシス促進因子によって活性化される。従って、細胞死誘導遺伝子の例として、具体的にはＢｉｄ遺伝子を例示することができる。
　本発明のプロモータの下流に上記導入遺伝子を搭載したベクターを中皮腫治療剤として利用することができる。本発明は、該導入遺伝子を組み込みこんだ組換えベクターを有効成分とする中皮腫治療剤にも及ぶ。
　さらに、本発明のプロモータを組み込んだベクターは、中皮腫の検査においても使用することができる。具体的には、マーカー遺伝子を該プロモータの下流に搭載してなるウイルスベクターを用いることによる。本発明のプロモータは中皮腫に有意な転写活性を有することから、中皮腫の存在によりマーカー遺伝子が発現し、中皮腫を検査することができる。マーカー遺伝子としては、検査に使用可能なタンパク質を発現しうるものであれば良く、特に限定されないが、例えば蛍光タンパク質が挙げられ、より具体的にはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）が挙げられる。本発明は、中皮腫の存在によりマーカー遺伝子が発現しうる中皮腫検査用ウイルスベクターにも及び、該中皮腫検査用ウイルスベクターを用いてマーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法にも及ぶ。
　以下に、本発明のプロモータおよび該プロモータを組み込んだ組換えベクターについて、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではないことは明らかである。
（実施例１）各種プロモータの各種細胞における転写活性の確認
１）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
　中皮腫マーカーとしてＣＲＩ１、Calretinin、ＷＴ１(Wilms' tumor susceptibility gene 1)およびMesothelinについて、各マーカー遺伝子のプロモータ領域の部分を取り出し、ホタルルシフェラーゼ(Luciferase)遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図１に示した。ここで、Calretinin遺伝子由来プロモータは、染色体１６ｑ２１．１(Chromosome 16 q21.1, GenBank Accession No. NT_010498.15）、ＷＴ１遺伝子由来プロモータは、染色体１１ｐ３(Chromosome 11 p3, GenBank Accession No. NT_079237.17）、Mesothelin遺伝子由来プロモータは、染色体１６(Chromosome 16, GenBank Accession No. NT_037887.4）の各配列から選択される。各マーカー遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータ領域の配列は、配列表の配列番号２または１２～１４のいずれかで表され、具体的には以下に示される。
　ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84　　（配列番号２）
　Calretinin遺伝子プロモータ：-2179/+70　（配列番号１２）
　ＷＴ１遺伝子プロモータ：-1887/+39　　　（配列番号１３）
　Mesothelin遺伝子プロモータ：-2310/+44　（配列番号１４）
２）各プロモータの中皮腫または肺癌細胞における転写活性の確認
　ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、上記各プロモータを挿入した発現コンストラクトを作製した(pGL3 Luciferase Reporter Vectors, Promega社, Technical Manual No.033参照）。悪性胸膜中皮腫細胞株４株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ、Ｈ２０５２、Ｈ２８）および肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）の各細胞を、６ウェルプレートに、細胞数薬４×１０６を３ウェルずつ播種し、各細胞について生着を確認後、形質導入試薬Lipofectin(R)（Invitrogen社）を用いて、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
　その結果、各マーカー遺伝子由来のプロモータは、中皮腫細胞特異的に転写活性を示し、肺癌細胞には低い転写活性を示す傾向であった。特に、ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84の場合は、他のプロモータに比べて、中皮腫細胞特異的に転写活性を認め、肺癌細胞では低い転写活性しか認めなかった（図２）。
３）各種中皮腫マーカー遺伝子由来プロモータの正常細胞における転写活性の確認
　上記２）と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に各プロモータ領域を挿入した各発現コンストラクトを作製した。正常中皮細胞、正常胸膜細胞（ラット胸膜由来の4/4RM-4細胞）および正常ヒト肺線維芽細胞（Normal Human Lung Fibroblasts）由来ＮＨＬＦ細胞の各細胞を上記２）と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
　その結果、ＣＲＩ１遺伝子プロモータ：-2586/+84（ＣＲＩ１-2586/+84）の場合は、正常細胞に対して低い転写活性であったが、その他の各マーカー由来のプロモータは、正常細胞でも転写活性を認めた（図３）。
　以上の結果により、ＣＲＩ１-2586/+84は、正常細胞および肺癌細胞に対しては低い転写活性であったが、中皮腫に対しては高い転写活性を認め、中皮腫特異的に転写活性を発揮することが確認された。
（実施例２）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータの各種細胞における転写活性の確認
１）ＣＲＩ１遺伝子由来プロモータを含む発現コンストラクトの構築
　ＣＲＩ１遺伝子のプロモータ領域の部分について、長さの異なる各領域を取り出し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と結合した発現コンストラクトを構築した。各プロモータを含む発現コンストラクトのシェーマを図４に示した。
　ＣＲＩ１遺伝子の転写開始点を+1としたときの各プロモータは、以下に示す配列番号に示す塩基配列よりなる。
　ＣＲＩ１-2586/+84（配列番号１）
　ＣＲＩ１-1849/+84（配列番号２）
　ＣＲＩ１-1674/+84（配列番号３）
　ＣＲＩ１-1587/+84（配列番号４）
　ＣＲＩ１-1083/+84（配列番号５）
　ＣＲＩ１-766/+84（配列番号６）
　ＣＲＩ１-567/+84（配列番号７）
　ＣＲＩ１-366/+84（配列番号８）
　ＣＲＩ１-296/+84（配列番号９）
　ＣＲＩ１-138/+84（配列番号１０）
　ＣＲＩ１-74/+84（配列番号１１）
２）各プロモータの各細胞における転写活性の確認
　上記実施例１と同手法によりｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Promega 社）に、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータを挿入した各発現コンストラクトを作製した。悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ａ５４９、Ｈ３２２）および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）を実施例１と同様に培養し、各細胞について生着を確認後、各発現コンストラクト２μｇを各細胞に形質導入した。２４時間後に各細胞でのルシフェラーゼアッセイによりルシフェラーゼの発光を測定し、各プロモータの転写活性を確認した。
　その結果、ＣＲＩ１遺伝子由来各プロモータは、全てについて悪性胸膜中皮腫細胞で強い転写活性を認めたのに対し、肺癌細胞および正常細胞では、低い転写活性であった。特に、ＣＲＩ１-296/+84、ＣＲＩ１-138/+84、ＣＲＩ１-74/+84の各プロモータを用いた場合に、より中皮腫特異性が認められ、特にはＣＲＩ１-138/+84において最も中皮腫特異性が認められた（図５）。
（実施例３）治療型遺伝子組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの作製
　導入遺伝子およびその上流にＣＲＩ１遺伝子プロモータ（ＣＲＩ１-138/+84）を搭載したＡｄベクターを作製した。導入遺伝子として、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）またはＡｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に本発明のプロモータ配列を含む発現コンストラクトの構築
　導入遺伝子として、（Ａ）細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子配列を結合したもの、と（Ｂ）Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を用いた。（Ａ）または（Ｂ）の上流領域に、ＣＲＩ１-138/+84を直列で４つ連結したものを結合し、各発現コンストラクトを作製した。
２）上記１）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターの構築
　上記１）で構築した発現コンストラクトを含むシャトルベクターをTong-Chuan Heら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2509-2514, 1998に記載の方法にしたがって構築した。
３）Ａｄベクターの作製
　Ｅ１欠損型の５型Ａｄゲノムを準備し、Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、２）で作製した遺伝子発現シャトルベクターを、He らの方法に従い相同組換え(homologous recombination) を行うことで、上記各種発現コンストラクトを搭載したＡｄ（Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤ、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ）を得た。本実施例においてＢＩＤ発現コンストラクトにＨＡタグを結合したのは、内在性のＢＩＤと識別するためである。
（実験例１）Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤの中皮腫細胞に対する効果
　実施例３で得たＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤについて中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照として、同手法にて作製したＧＦＰ(green fluorescent protein)を発現する遺伝子を組み込んだＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、いずれのＡｄベクターもＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型であるが、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）を含むか、非毒性のＧＦＰ遺伝子を含む点において相違する。
　得られた各Ａｄベクターを、悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ）、肺癌細胞株２種（Ｈ３２２、Ａ５４９）、正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）および肺癌以外の癌細胞株２株（肝癌細胞：Ｈｅｐ３Ｂ、乳癌細胞：ＭＣＦ７）に感染させた。Ａｄ感染後の各細胞における細胞死について、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）染色後のフローサイトメトリー法による定量を行った。
　その結果、図７に示すように、細胞死誘導遺伝子を含むＡｄを感染した悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、２１１Ｈ）では、細胞周期Ｇ１とＧ０の間にピークが出現するsubＧ０／Ｇ１ポピュレーションの増加を認め、アポトーシスが起こっていることが確認された。一方、肺癌細胞、正常細胞およびその他の癌細胞では、細胞死誘導遺伝子を含む場合と含まない場合で、フローサイトメトリーのパターンに違いは認められなかった。以上の結果より、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤは、中皮腫細胞特異的に発現することが確認された。
（実験例２）Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの中皮腫細胞に対する効果
　実施例３で得たＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、中皮腫細胞に及ぼす効果を調べた。実験例１と同様に対照としてＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここでは、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能であるが、ＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターは中皮腫細胞において非増殖型である点において相違する。
　得られた各Ａｄベクターを、悪性胸膜中皮腫細胞株２株（Ｈ２４５２、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ）、および正常細胞株２種（正常中皮細胞、ＮＨＬＦ）に導入し、生存細胞数を測定した。生存細胞の測定は、ＭＴＳアッセイ（生細胞内においてテトラゾリウム塩 (MTS* [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt]) がホルマザンへ変換される反応に基づき、培養液中に放出された水溶性ホルマザンを490 nmで測定するアッセイ）により行った。
　その結果、図８に示すようにＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの感染により、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳのみの場合に比べて中皮腫細胞は明らかに減少することが確認されたが、正常細胞ではＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳの場合と差が認められなかった。以上の結果より、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａによっても、中皮腫細胞特異的に殺細胞効果を有することが確認された。
（実験例３）Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤまたはＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの中皮腫(in vivo)に対する効果
　実施例３で得たＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤまたはＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａについて、in vivoでの中皮腫細胞に対する殺細胞効果を調べた。対照ベクターとして、実験例１および２と同様に、ＧＦＰを発現する遺伝子を組み込んだＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰを用いた。ここで、細胞死誘導遺伝子（ＢＩＤ）または非毒性のＧＦＰ遺伝子を含むＡｄベクターはＥ１欠損型であり、中皮腫細胞では非増殖型である。また、Ａｄ初期遺伝子Ｅ１を含むＡｄベクターは中皮腫細胞では増殖可能である。
　中皮腫モデルマウスは、週齢６週の雌BALB/c ヌードマウスの皮下に2.5×106個の２１１Ｈ細胞を接種して作製した。２１１Ｈ細胞接種後８日目の中皮腫モデルマウスに、ＰＢＳ、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰ、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤまたはＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａ を、5×107 pfu (plaque forming unit)ずつ３日連続局所投与し、接種後５６日間腫瘍の大きさを観察した（各条件についてｎ＝８）。
　その結果、図９に示すように、Ａｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＨＡ－ＢＩＤまたはＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/Ｅ１Ａの感染により、対照であるＡｄ－ＣＲＩ１-138 4x/ＧＦＰの感染やＰＢＳのみの場合に比べて、抗腫瘍効果が認められた。
　以上詳述したように、本発明の新規プロモータは、中皮腫特異的に転写活性を有することが確認された。また、該新規プロモータおよび細胞死誘導遺伝子などを搭載するベクターを細胞に導入することにより、中皮腫特異的にアポトーシスの作用が認められ、殺細胞作用を示すことが確認された。また、in vivoにおいても、抗腫瘍効果が確認された。これらの結果より、本発明の新規プロモータを含むベクターは、中皮腫特異的に何らかの作用をさせたい場合に利用することができ、例えば上述のような細胞死誘導遺伝子や、細胞融解誘導遺伝子とともに細胞に導入することで、中皮腫特異的に細胞に傷害を与えることができる。これらの結果より、本発明の新規プロモータを含むベクターは、効果的な中皮腫治療剤となりうる。さらに、本発明の新規プロモータおよびマーカー遺伝子を含むベクターは、中皮腫の検査においても使用することができる。

Claims (13)

  1. ＣＲＩ１(CREBBP/EP300 inhibitory protein 1)遺伝子由来のプロモータであり、中皮腫特異的に転写活性を示すことを特徴とする新規プロモータ。
  2. ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、ＣＲＩ１遺伝子の-2586～+84の領域から選択される配列である、請求項１に記載の新規プロモータ。
  3. ＣＲＩ１遺伝子由来のプロモータの配列が、配列表の配列番号１～１１に記載のいずれかである、請求項１または２に記載の新規プロモータ。
  4. 請求項１～３のいずれか１に記載の新規プロモータを搭載してなるウイルスベクター。
  5. ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである請求項４に記載のウイルスベクター。
  6. アデノウイルスが、制限増殖型アデノウイルスである請求項５に記載のウイルスベクター。
  7. さらに、細胞死誘導遺伝子および／または細胞融解誘導遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる請求項４～６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
  8. 請求項４～７のいずれか１に記載のウイルスベクターからなる遺伝子治療型中皮腫治療用ベクター。
  9. 請求項８に記載の遺伝子治療型中皮腫治療用ベクターを含む中皮腫治療剤。
  10. さらに、マーカー遺伝子をプロモータの下流に搭載してなる請求項４～６のいずれか１に記載のウイルスベクター。
  11. マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質発現遺伝子である請求項１０に記載のウイルスベクター。
  12. 請求項１０または１１に記載のウイルスベクターからなる中皮腫検査用ウイルスベクター。
  13. 請求項１２に記載の中皮腫診断用ウイルスベクターを用い、マーカーの発現の有無を観察することによる中皮腫の検査方法。
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