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WO2009118460A1 - Lapins transgeniques producteurs de facteur vii humain - Google Patents

Lapins transgeniques producteurs de facteur vii humain Download PDF

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WO2009118460A1
WO2009118460A1 PCT/FR2008/000396 FR2008000396W WO2009118460A1 WO 2009118460 A1 WO2009118460 A1 WO 2009118460A1 FR 2008000396 W FR2008000396 W FR 2008000396W WO 2009118460 A1 WO2009118460 A1 WO 2009118460A1
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WO
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factor vii
human factor
transgenic
milk
rabbits
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Ceased
Application number
PCT/FR2008/000396
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English (en)
Inventor
Pierre-Jean Ripoll
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Bioprotein Technologies SA
Original Assignee
Bioprotein Technologies SA
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Publication date
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Priority to EP08787842A priority patent/EP2271206A1/fr
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Priority to US12/934,124 priority patent/US20110059510A1/en
Priority to CA2719459A priority patent/CA2719459A1/fr
Priority to PCT/FR2008/000396 priority patent/WO2009118460A1/fr
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Definitions

  • the present invention relates to the production of recombinant human factor VII in the milk of transgenic rabbits.
  • Factor VII is a plasma protein involved in the process of blood coagulation, and in particular in the initiation of the extrinsic coagulation pathway.
  • Factor VII which is a vitamin K-dependent glycoprotein, is synthesized in the liver as a 466 amino acid precursor comprising a signal peptide (residues 1-20) and a propeptide (residues 21-60).
  • Factor VII circulating in blood plasma is a zymogen (or proenzyme) consisting of a peptide chain of 53 kDa containing 406 residues.
  • Factor VII is activated by factor VIIa by proteolytic cleavage between arginine at position 152 and isoleucine at position 153:
  • Factor VIIa is composed of a 152 amino acid light chain derived from the N-terminus of a molecular weight of about 20 kDa and a 254 amino acid heavy chain derived from the C-terminus of a molecular weight of about 30 kDa, which are covalently linked together by a disulfide bridge between the cysteines in position 135 and 262.
  • Circulating factor VII may complex with the tissue factor (TF) produced by subendothelial fibroblasts, when this is released during a breach in the vascular endothelium.
  • TF tissue factor
  • the formation of this complex is accompanied by the activation of factor VII factor VIIa.
  • the TF-VIIa complex activates factors IX and X, resulting in the formation of factors IXa and Xa, which in turn activate the conversion of prothrombin to thrombin, which allows the conversion of fibrinogen to fibrin, resulting in clot formation.
  • the factor VlI / VIIa has been used for many years to treat patients with different haemostasis disorders (for example hemophilia type A, which corresponds to a deficiency of factor VIII, haemophilia type B which corresponds to a deficiency in factor IX, or hereditary deficits in factor VlI / VIIa), as well as hemorrhagic accidents of various origins such as cerebrovascular accidents, or hemorrhagic traumas.
  • haemostasis disorders for example hemophilia type A, which corresponds to a deficiency of factor VIII, haemophilia type B which corresponds to a deficiency in factor IX, or hereditary deficits in factor VlI / VIIa
  • hemorrhagic accidents of various origins such as cerebrovascular accidents, or hemorrhagic traumas.
  • the factor VII preparations used were obtained from human plasmas.
  • recombinant factor VII preparations produced by transformed mammalian cells are presently preferred. for expressing human factor VII, as described, for example, in Application EP 0 200 421.
  • An alternative to the production of proteins of therapeutic interest by transformed cell cultures is their production by transgenic animals, and in particular in milk of these. This approach theoretically has many advantages, including a higher yield, a lower production cost than cell culture production, and an increase in production more easily and more flexible at the industrial level.
  • these factors include the ability of the host species to produce in industrializable quantities, proteins with post-translational modifications similar to those of the native human protein. This factor is particularly critical if it is envisaged to produce in recombinant form in milk proteins such as factor VII, whose post-translational modifications are multiple and varied (cleavage of the signal peptide and the propeptide, ⁇ -carboxylation, ⁇ - hydroxylation, O-glycosylation and N-glycosylation), which are naturally produced in the liver. Indeed, the cells of the mammary gland have different post-translational modification capacities than those of the liver cells.
  • transgenic mice expressing human protein C in their mammary glands could not properly perform propeptide cleavage and gamma-carboxylation (Drohan et al., Transgenic Res., 355-64, 1994). . Similar observations have been made in transgenic pigs for both protein C and factor IX (Lee et al., J. Biochem., 118, 81-7, 1995, Van Cott et al, Genet Anal., 15, 155). -60, 1999).
  • the O-glycosylation and the N-glycosylation of the proteins can vary, qualitatively and quantitatively depending on the mammalian species concerned.
  • the human proteins do not comprise a galactose-galactose ⁇ (1-3) galactose unit (Gal ⁇ 1-3Gal motif), since the gene coding for alpha-1,3-galactosyltransferase, responsible for the synthesis of this motif, is inactivated in humans and Old World monkeys (Europe, Asia) while present in other mammals.
  • This motif (also called ⁇ -Gal epitope) is consequently highly immunogenic in humans (GALILI et al, Blood, 82 (8): 2485-2493, 1993).
  • a glycosylated human protein produced in recombinant form in mammals possessing an active alpha 1,3 galactosyltransferase is therefore likely to carry a large amount of Gal ⁇ 1-3Gal motifs and may cause significant undesirable immune reactions.
  • transgenic rabbits expressing in their mammary glands a sequence coding for human factor VII produced in their milk a correctly cleaved recombinant factor VII, and furthermore not containing or containing only very few Gal ⁇ l-3Gal patterns.
  • the present invention therefore relates to a transgenic rabbit expressing a human factor VII in its milk.
  • a transgenic rabbit according to the invention contains in its genome one or more copies of a transgene comprising a polynucleotide encoding a human factor VII, placed under the transcriptional control of a promoter allowing its specific expression in the mammary gland cells of said rabbit. .
  • transgene is meant a nucleic acid construct stably inserted into the genome of a host organism, which is transmitted to its offspring from generation to generation.
  • the transgene allows expression of a protein of interest (factor VII) in the transgenic host animal milk.
  • Promoters for the specific expression in mammary gland cells of the rabbit are known per se.
  • they may be promoters of casein genes or milk serum proteins: mention will be made in particular of the ⁇ , ⁇ , or K casein promoters, the ⁇ -lactoglobin promoter, the P-lactalbumin promoter and the WAP (whey acidic protein) promoter; , or that of lactoferrin.
  • It may be a promoter from the rabbit, such as the WAP promoter described in Application EP0527063, or a promoter from another mammalian species.
  • the polynucleotide encoding human factor VII is preferably a cDNA, or the coding portion (ORF) thereof. It can be the natural cDNA of factor VII, the sequence of which is known per se, and available on the databases, for example under accession number Ml 3232, or a sequence coding for a modified human factor VII variant in particular to increase its activity and / or to eliminate its undesirable effects; by way of examples, mention may be made of the variants described in Application 2008/0010693 or that described in the publication by Sorensen et al. (Br. J. HaematoL, 137 (2): 158-65, 2007). It is advantageous to use a DNA sequence optimized for expression in the mammary glands of rabbits.
  • Such a sequence can be obtained in silico by techniques well known to those skilled in the art, in order to eliminate cryptic splice sites, A / T rich sequences, destabilizing mRNAs, polyadenylation sites as well as that potentially parasitic TATA boxes, and CpG islands, and optimize the codons to reflect the preferences of the mammary gland cells of rabbits to produce milk proteins.
  • the transgene contains, besides the promoter and the coding sequence for factor VII, other elements intended to optimize the transcription and / or the translation of the recombinant protein.
  • elements are known in themselves to those skilled in the art (see, for example, Houdebine et ah, in: Cari A. Pinkert (ed), Vector Design for Transgene Transgenic Expression Animal Technology, 2nd edn, New York Academy Press, 419-458, 2002).
  • a strong isolator placed at 5 'of the promoter, guaranteeing a level of expression of the protein dependent on the number of transgene copies integrated and independent of the site of integration of the transgene into the genome of the animal: for example the 5 ⁇ S4 region of the chicken beta-globin gene (Taboit-Dameron et al., Transgenic Res., 8: 223-235, 1999; Rival-Gervier et al., Transgenic Res., 12: 723). - 730, 2003).
  • exon / intron pairs which may contain one or more transcription or translation enhancers: by way of examples, mention may be made of: the introns of the late and early genomes of the SV40 virus genome, the first intron of a beta-globin gene, EF1 alpha gene introns, Palpha-sl casein introns, WAP gene introns, human and bovine growth hormone genes introns; the "enhancer” sequences can in particular be chosen from those present in the LTR sequences of the HTLV virus, or the MMTV virus (murine mammary tumor virus), the "enhancer” sequence of the immunoglobin gene, the “enhancer” sequence of the gene alpha-1 casein, the "enhancer” sequence of beta-globin.
  • the "enhancer” sequence may also be the distal region upstream (up to 140 kbp) of the WAP gene or the downstream distal region (at least 10 kbp) of the WAP gene, as described by Rival-Gervier and al. (Mol Reprod Develop, 63: 161-167, 2002), in Application EP 1 217 071
  • terminators of the SV40 early or late genes those of the beta-globin genes, WAP genes, human or bovine growth.
  • Transgenesis can be carried out by conventional methods known per se.
  • the transgene is introduced by micro-injection into the pronuclei of fertilized embryos which are then reimplanted in carrier females.
  • transgenic animals is also possible by cloning by nuclear transfer followed by embryo transfer in recipient females.
  • the subject of the present invention is also the milk produced by the transgenic rabbits in accordance with the invention, and the use of this milk as a raw material for the purification of recombinant human factor VII.
  • Recombinant human factor VII can be purified from this milk by methods known per se, for example as described in US Pat. No. 6,268,487.
  • the transgenesis vector used for cloning is derived from the plasmid pPolylII, having an ampicillin resistance gene as well as the bacterial origin of replication Col El.
  • This transgenesis vector contains an expression cassette comprising: a dimer of the sequence of the 5 ⁇ S4 isolator of the chicken beta-globin gene (Genbank U78775) (Recillas-Targa et al, Proc Natl Acad ScL 5 : 6883-6888, 2002) upstream of the WAP promoter (whey acidic protein; Genbank X52564) of 6.3 kbp rabbit (Rival-Gervier et al, Transgenic Res., 6: 723-730, 2003), the first intron of the rabbit beta-globin gene (Genbank V00882) containing a transcription enhancer ; a second transcription amplifier (SUR 1.2.3) containing the 5 'UTR sequence of the SV40 early genes fused with the R region and the beginning of the U5 region of HT
  • the FVII encoding DNA insert recovered by MlullNhel digestion from the intermediate vector, was inserted between the MwI and NheI sites of the expression cassette.
  • the resulting transgenesis vector is shown in Figure 1. It contains an insert which is constituted in its 5 'to 3' orientation by i) the dimer of the 5 ⁇ S4 isolator sequence of the chicken beta-globin gene, ii) the 6.3 kbp rabbit WAP (whey acidic protein) promoter, iii) the intron containing the first transcription enhancer, iv) the second transcription enhancer, v) the human factor VII cDNA, vi) the third transcriptional amplifier; and vii) the transcription terminator.
  • the colonies containing the recombinant vector are selected on the basis of their resistance to ampicillin, and then the presence of the insert is monitored by restriction fragment analysis, followed by sequencing.
  • Transgenic rabbits were obtained by the conventional microinjection technique (Brinster et al, Proc Natl Acad Soi 82: 4438-4442, 1985).
  • transgenesis vector containing the recombinant factor VII coding sequence was digested with the NotI restriction enzyme and the insert containing the transgene was isolated on agarose gel and then purified on ElutipD (Schleicher-Schuell,
  • Microinjection of oocytes taken and implantation On the 4th day, 18-19h after the mating, the embryos are taken from the donor rabbits to carry out microinjection of DNA: the microinjection of DNA takes place just after samples (15-25 h after mating).
  • the one-cell stage embryos are placed in a micro-drop of medium under an inverted microscope equipped with Normarsky objectives and micro-manipulators. Individual embryos are positioned and secured using a pipette.
  • Intact unicellular embryos are then reimplanted under general anesthesia into the lumen of the oviducts of the synchronized recipient rabbits (10 embryos in each oviduct), using a surgical procedure (the oviducts are externalised by laparotomy). Parturition may occur naturally 29-31 days after embryo transfer. If necessary, oxytocin injection is initiated on the 31st day. The number of rabbits born in relation to the number of reimplanted embryos is of the order of 5 to 20%. EXAMPLE 3 SELECTION AND CHARACTERIZATION OF TRANSGENIC RABBITS
  • the microinjected recombinant DNA integrates the genome randomly. Newborn rabbits (10 days) are tested for the presence of the transgene by an ear biopsy. The genomic DNA is extracted and PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis is performed using primers specific for the recombinant insert.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the lineages of the FO founders were further characterized by i) analyzing the number of transgene copies integrated into their genome, and ii) determining the number of integration sites.
  • the number of copies of the transgene integrated into the genome of each FO founder line was determined by quantitative PCR and Southern blotting. This number varies, depending on the line, from 1 copy per cell to more than 200 copies per cell.
  • the number of integration sites has also been determined by Southern blotting. This number varies, depending on the line, from 1 to more than 5 sites per genome.
  • Detection was performed by chemiluminescence (Amersham Biosciences) to determine the human factor VII concentration for each of the milks obtained. An expression level of factor VII varying between 90 ⁇ g / ml and 11 mg / ml was observed. The influence of the number of copies of the transgene on the level of expression has also been sought. The results are illustrated in Figure 2, and show a correlation between the transgene copy number and the expression level of factor VII in the milk of transgenic animals.

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Abstract

L'invention est relative à des lapins transgéniques, produisant du facteur VII humain dans leurs glandes mammaires. Le lait de ces lapins transgéniques est utilisable comme matière première pour la production de facteur VII humain recombinant.

Description

LAPINS TRANSGENIQUES PRODUCTEURS DE FACTEUR VII HUMAIN
La présente invention se rapporte à la production de facteur VII humain recombinant dans le lait de lapines transgéniques.
Le facteur VII est une protéine plasmatique impliquée dans le processus de la coagulation sanguine, et notamment dans l'initiation de la voie extrinsèque de coagulation. Le facteur VII, qui est une glycoprotéine vitamine K-dépendante, est synthétisé dans le foie sous forme d'un précurseur de 466 acides aminés comprenant un peptide signal (résidus 1-20) et un propeptide (résidus 21-60). Le facteur VII circulant dans le plasma sanguin est un zymogène (ou proenzyme) constitué d'une chaîne peptidique de 53kDa contenant 406 résidus. Il résulte de plusieurs modifications post-traductionnelles : le clivage du peptide signal et du propeptide, la gamma-carboxylation des dix premiers acides glutamiques N-terminaux en position 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 et 35, la β- hydroxylation partielle de l'acide aspartique en position 63, la O-glycosylation des serines en position 52 et 60, respectivement par un motif glucose(xylose)o-2 et par un motif fucose, et la N-glycosylation des asparagines en position 145 et 322 par des structures complexes, majoritairement bi-antennées et sialylées. Le facteur VII est activé en facteur VIIa par clivage protéolytique entre l'arginine en position 152 et l'isoleucine en position 153 : le facteur VIIa est composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés dérivée de l'extrémité N-terminale d'une masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés dérivée de l'extrémité C-terminale d'une masse moléculaire d'environ 30 kDa, qui sont liées entre elles de manière covalente par un pont disulfure entre les cystéines en position 135 et 262.
Le facteur VII circulant peut se complexer avec le facteur tissulaire (FT) produit par les fibroblastes sous-endothéliaux, lorsque celui-ci est libéré à l'occasion d'une brèche dans l'endothélium vasculaire. La formation de ce complexe s'accompagne de l'activation du facteur VII en facteur VIIa. Le complexe TF-VIIa active les facteurs IX et X, entraînant la formation des facteurs IXa et Xa, qui activent à leur tour la conversion de la prothrombine en thrombine, qui permet la conversion du fibrinogène en fibrine, aboutissant à la formation du caillot. Le facteur VlI/VIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour traiter des patients présentant différents troubles de l'hémostase (à titre d'exemple on citera l'hémophilie de type A qui correspond à un déficit en facteur VIII, l'hémophilie de type B qui correspond à un déficit en facteur IX, ou des déficits héréditaires en facteur VlI/VIIa), ainsi que des accidents hémorragiques d'origines diverses comme par exemple les accidents vasculaires cérébraux, ou les traumatismes hémorragiques.
Initialement, les préparations de facteur VII utilisées ont été obtenues à partir de plasmas humains. Cependant, du fait des difficultés de purification, des risques sanitaires associés à l'utilisation de produits dérivés du sang, et de la limitation des approvisionnements en plasma humain on leur préfère actuellement des préparations de facteur VII recombinant, produit par des cellules de mammifères transformées pour exprimer le facteur VII humain, comme décrit par exemple dans la Demande EP 0 200 421. Une alternative à la production de protéines d'intérêt thérapeutique par des cultures de cellules transformées, est leur production par des animaux transgéniques, et notamment dans le lait de ceux-ci. Cette approche présente théoriquement de nombreux avantages, et notamment un rendement plus élevé, un coût de production plus faible que la production en cultures de cellules, et une montée en puissance de la production plus aisée et plus flexible au niveau industriel. Cependant, bien que la possibilité de produire dans du lait de souris transgénique une protéine recombinante, l'inhibiteur de plasminogène (tPA), possédant des propriétés biologiques similaires à celles de la protéine humaine native ait été démontrée il y a de nombreuses années (Gordon et al. Bio Technol, 5, 1183-7, 1987), le nombre de protéines qui ont pu être produites avec succès dans le lait d'animaux transgéniques dans des conditions compatibles avec le développement et la production industrielle d'un médicament à usage humain demeure encore très limité. En effet, de nombreux facteurs, propres d'une part à la protéine d'intérêt à exprimer, et d'autre part à l'espèce hôte chez laquelle on souhaite l'exprimer, peuvent conditionner le succès ou l'échec pour une combinaison protéine d'intérêt/espèce hôte déterminée. Parmi ces facteurs figure notamment la capacité de l'espèce hôte à produire en quantité industrialisable, des protéines présentant des modifications post- traductionnelles similaires à celles de la protéine humaine native. Ce facteur est particulièrement critique si l'on envisage de produire sous forme recombinante dans le lait des protéines comme le facteur VII, dont les modifications post-traductionnelles sont multiples et variées (clivage du peptide signal et du propeptide, γ-carboxylation, β- hydroxylation, O-glycosylation et N-glycosylation), et qui sont naturellement produites dans le foie. En effet, les cellules de la glande mammaire ont des capacités de modifications post-traductionnelles différentes de celles des cellules hépatiques. II a par exemple été observé que des souris transgéniques exprimant la protéine C humaine dans leurs glandes mammaires ne pouvaient pas effectuer correctement le clivage du propeptide et la γ-carboxylation (Drohan et al.., Transgenic Res., 355-64, 1994). Des observations similaires ont été effectués chez des porcs transgéniques, pour la protéine C et pour le facteur IX (Lee et al., J Biochem., 118, 81-7, 1995 ; Van Cott et al, Genêt Anal., 15, 155-60, 1999).
D'autre part, la O-glycosylation et la N-glycosylation des protéines peut varier, qualitativement et quantitativement selon l'espèce de mammifères concernée. Ainsi, les protéines humaines ne comportent pas de motif galactosyl galactose α(l-3) galactose (motif Galαl-3Gal), du fait que le gène codant pour l'alpha 1,3 galactosyltransférase, responsable de la synthèse de ce motif, est inactivé chez l'homme et les singes de l'Ancien Monde (Europe, Asie) alors qu'il est présent chez les autres mammifères.
Ce motif (également dénommé épitope α-Gal) est en conséquence très immunogène chez l'homme (GALILI et al, Blood, 82(8) : 2485-2493, 1993). Une protéine humaine glycosylée produite sous forme recombinante chez des mammifères possédant une alpha 1,3 galactosyltransférase active est donc susceptible de porter une quantité importante de motifs Galαl-3Gal et risque d'entrainer d'importantes réactions immunitaires indésirables.
Or, les Inventeurs ont maintenant trouvé que, de façon surprenante, des lapines transgéniques exprimant dans leurs glandes mammaires une séquence codant pour du facteur VII humain produisaient dans leur lait un facteur VII recombinant correctement clivé, et en outre ne contenant pas ou ne contenant que très peu de motifs Galαl-3Gal.
La présente invention a en conséquence pour objet un lapin transgénique exprimant un facteur VII humain dans son lait. Un lapin transgénique conforme à l'invention contient dans son génome une ou plusieurs copies d'un transgène comprenant un polynucléotide codant pour un facteur VII humain, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur permettant son expression spécifique dans les cellules des glandes mammaires dudit lapin.
On entend par « transgène » une construction d'acide nucléique insérée de façon stable dans le génome d'un organisme hôte, qui se transmet à sa descendance de génération en génération. Dans le cas présent, le transgène permet l'expression d'une protéine d'intérêt (le facteur VII) dans le lait de ranimai-hôte transgénique.
Des promoteurs permettant l'expression spécifique dans les cellules de la glande mammaire du lapin sont connus en eux-mêmes. Il peut s'agir par exemple des promoteurs de gènes de caséines ou de protéines sériques du lait : on citera notamment les promoteurs des caséines α, β, ou K, le promoteur de la β-lactoglobine, le promoteur de Pa- lactalbumine, celui de la WAP (whey acidic protein), ou celui de la lactoferrine. Il peut s'agir d'un promoteur provenant du lapin, comme par exemple le promoteur de la WAP décrit dans la Demande EP0527063, ou d'un promoteur provenant d'une autre espèce de mammifère.
Le polynucléotide codant pour le facteur VII humain est de préférence un ADNc, ou la portion codante (ORF) de celui-ci. Il peut s'agir de l'ADNc naturel du facteur VII, dont la séquence est connue en elle-même, et disponible sur les bases de données, par exemple sous le numéro d'accès Ml 3232, ou d'une séquence codant pour un variant de facteur VII humain modifié notamment pour augmenter son activité et/ou supprimer ses effets indésirables ; à titre d'exemples on peut citer les variants décrits dans la Demande 2008/0010693 ou celui décrit dans la publication de Sorensen et al. (Br. J. HaematoL, 137(2) : 158-65, 2007). On peut avantageusement utiliser une séquence d'ADN optimisée pour l'expression dans les glandes mammaires de lapines. Une telle séquence peut être obtenue in silico par des techniques bien connues par l'homme de l'art, afin d'éliminer les sites cryptiques d'épissage, les séquences riches en A/T, déstabilisatrices des ARNm, les sites de polyadenylation ainsi que les boites TATA potentiellement parasites, et les ilôts CpG, et d'optimiser les codons pour refléter les préférences des cellules de la glande mammaire des lapines pour produire les protéines du lait.
Avantageusement le transgène contient, outre le promoteur et la séquence codant pour le facteur VII, d'autres éléments destinés à optimiser la transcription et/ou la traduction de la protéine recombinante. De tels éléments sont connus en eux-mêmes de l'homme de l'art (cf. par exemple Houdebine et ah, in: Cari A. Pinkert (ed), Vector Design for Transgene Expression Transgenic Animal Technology, 2nd edn, New York: Académie Press., 419-458, 2002).
Il peut s'agir notamment :
- d'un isolateur fort, placé en 5' du promoteur, garantissant un niveau d'expression de la protéine dépendant du nombre de copies de transgène intégrées et indépendant du site d'intégration du transgène dans le génome de l'animal : on citera par exemple la région 5ΗS4 du gène de la béta-globine de poulet (Taboit-Dameron et al., Transgenic. Res., 8 : 223-235, 1999; Rival-Gervier et al., Transgenic. Res., 12 : 723- 730, 2003). - d'un ou plusieurs couples exon/intron pouvant contenir un /ou plusieurs amplificateurs (enhancer) de transcription ou de traduction : à titre d'exemples on peut citer : les introns des gènes tardif et précoce du génome du virus SV40, le premier intron d'un gène de beta-globine, les introns du gène EFl alpha, les introns du gène de Palpha-sl caséine, les introns du gène WAP, les introns des gènes de l'hormone de croissance humaine et bovine ; les séquences « enhancer » peuvent notamment être choisies parmi celles présentes dans les séquences LTR du virus HTLV, ou du virus MMTV (virus de la tumeur mammaire murine), la séquence « enhancer » du gène des immunoglobines, la séquence « enhancer » du gène de l'alpha s-1 caséine, la séquence « enhancer » de la béta- globine. La séquence « enhancer » peut également être la région distale en amont (jusqu'à 140 kpb) du gène WAP ou la région distale en aval (au moins 10 kpb) du gène WAP, telles qu'elles sont décrites par Rival-Gervier et al. (Mol. Reprod. Develop., 63 : 161-167, 2002), dans la Demande EP 1 217 071
- un terminateur fort garantissant une terminaison efficace de la transcription : à titre d'exemples, on citera les terminateurs des gènes précoce ou tardif du virus SV40, ceux des gènes de béta-globine, des gènes WAP, des gènes de l'hormone de croissance humaine ou bovine.
La transgénèse peut s'effectuer par les méthodes classiques connues en elles-mêmes. Avantageusement, le transgène est introduit par micro injection dans les pronucléi d'embryons fécondés qui sont ensuite réimplantés chez des femelles porteuses.
L'obtention des animaux transgéniques est également possible par clonage par transfert de noyau suivi par transfert d'embryon dans des femelles receveuses.
La présente invention a également pour objet le lait produit par les lapines transgéniques conformes à l'invention, et l'utilisation de ce lait en tant que matière première pour la purification de facteur VII humain recombinant.
Le facteur VII humain recombinant peut être purifié à partir de ce lait par des méthodes connues en elles-mêmes, par exemple comme décrit dans le Brevet US 6268487.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples non-limitatifs décrivant l'obtention de lapines transgéniques exprimant le facteur VII dans leur lait.
EXEMPLE 1: CONSTRUCTION D'UN VECTEUR DE TRANSGENESE CONTENANT LA SEQUENCE CODANT POUR LE FACTEUR VII HUMAIN. Clonage de l'ADNc du facteur VII par PCR dans un vecteur intermédiaire
Une séquence d'ADN codant pour le facteur VII humain, bordée des sites de restrictions uniques Mlul en position 5' et Nhel en position 3', a été synthétisée et clonée dans un vecteur plasmidique dérivé du plasmide pUc, contenant le gène de résistance à Pampicilline ainsi que l'origine de réplication bactérienne Col El .
Vecteur de transgénèse
Le vecteur de transgénèse utilisé pour le clonage est dérivé du plasmide pPolylII, possédant un gène de résistance à Pampicilline ainsi que l'origine de réplication bactérienne Col El. Ce vecteur de transgénèse contient une cassette d'expression comprenant : un dimère de la séquence de l'isolateur 5ΗS4 du gène de la béta-globine de poulet (Genbank U78775) (Recillas-Targa et al, Proc. Natl. Acad. ScL5 10 : 6883-6888, 2002) en amont du promoteur WAP (whey acidic protein ; Genbank X52564) de lapin de 6,3 kpb (Rival-Gervier et al, Transgenic Res., 6 :723-730, 2003), le premier intron du gène de beta-globine de lapin (Genbank V00882) contenant un amplificateur de transcription ; un second amplificateur de transcription (SUR 1.2.3) contenant la séquence 5'UTR des gènes précoces de SV40 fusionnée avec la région R et le début de la région U5 de HTLV-I (Attal et al.. FEBS Lett. , 392, 220-224, 1996); un troisième amplificateur de transcription (Igμ2), dérivé de la région mu de la chaine lourde d'IgG de souris (Genbank J00440) (Gillies et al.. CeIl 33, 717-728, 1983) et le terminateur de transcription de l'hormone de croissance humaine (Genbank M13438). Cette cassette contient un site MwI et un site NAeI localisés entre le second et le troisième amplificateur de transcription ; elle est flanquée de part et d'autres de sites Notl permettant l'excision des séquences du plasmide pPolylII.
L'insert d'ADN codant pour le facteur VII, récupéré par digestion MlullNhel à partir du vecteur intermédiaire a été inséré entre les sites MwI et Nhel de la cassette d'expression.
Le vecteur de transgénèse résultant est représenté sur la Figure 1. Il contient un insert qui est constitué dans son orientation 5' vers 3' par i) le dimère de la séquence de l'isolateur 5ΗS4 du gène de la béta-globine de poulet, ii) le promoteur WAP (whey acidic protein) de lapin de 6,3 kpb, iii) l'intron contenant le premier amplificateur de transcription, iv) le second amplificateur de transcription, v) l'ADNc du facteur VII humain, vi) le troisième amplificateur de transcription, et vii) le terminateur de transcription. Comme précédemment, les colonies contenant le vecteur recombinant sont sélectionnées sur la base de leur résistance à l'ampicilline, puis la présence de l' insert est contrôlée par analyse des fragments de restrictions, puis par séquençage.
EXEMPLE 2: PRODUCTION DE LAPINES TRANSGENIQUES EXPRIMANT LE FACTEUR VII HUMAIN DANS LEURS GLANDES MAMMAIRES
Les lapines transgéniques ont été obtenues par la technique classique de micro-injection (Brinster et al, Proc. Natl. Acad. Soi., 82 : 4438-4442, 1985).
Préparation des inserts pour la transgenèse
Le vecteur de transgènese contenant la séquence codant pour le facteur VII recombinant a été digéré par l'enzyme de restriction Notl et l' insert contenant le transgène a été isolé sur gel d'agarose puis purifié sur ElutipD (Schleicher-Schuell,
Ecquevilly, France) conformément aux instructions du fabricant, précipité à l'éthanol puis repris dans un tampon 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4.
Préparation des lapines donneuses et receveuses Des lapines Néo-zélandaises donneuses d'embryons, âgées de 16-30 semaines, sont traitées de manière sous-cutanée pendant 3 jours par de la FSH porcine (Follicular Stimulating Hormone) pour stimuler le développement folliculaire. Au troisième jour, les lapines reçoivent une injection intraveineuse d'hormone hCG (human Choroidic Hormone), puis les femelles sont accouplées. Les lapines receveuses sont âgées de 18-20 semaines. Une pseudogestation synchronisée est induite soit en gardant les femelles une semaine en cycle de jours longs (16 h de lumière) avant de les accoupler avec des mâles vasectomisés, soit par un traitement hormonal (superovulation FSH/LH).
Micro-injection des oocytes prélevés et implantation Au 4ème jour, 18-19h après l'accouplement, les embryons sont prélevés sur les lapines donneuses pour procéder à la micro-injection d'ADN : la micro-injection d'ADN se déroule juste après les prélèvements (15-25 h après l'accouplement). Les embryons au stade une cellule sont placés dans une micro-goutte de milieu sous un microscope inversé équipé d'objectifs Normarsky et de micro-manipulateurs. Des embryons individuels sont positionnés et sécurisés en utilisant une pipette. Le transgène dilué à une concentration pouvant varier de lng/μl à 6ng/μl, dans du tampon 10 mM Tris- HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 est micro-injecté préférentiellement dans le pronucléus mâle de l'embryon à l'aide d'une pipette d'injection. Suite à la micro-injection, les embryons sont maintenus en culture in vitro pendant 1 à 5 h (35 à 400C, 3 à 7% CO2 dans l'air). La qualité des embryons microinjectés est alors rapidement évaluée sous stéréomicroscope. Les embryons unicellulaires intacts sont alors réimplantés sous anesthésie générale dans le lumen des oviductes des lapines receveuses synchronisées (10 embryons dans chaque oviducte), en utilisant une procédure chirurgicale (les oviductes sont extériorisés par laparotomie). La parturition peut intervenir naturellement 29-31 jours après le transfert d'embryons. Si nécessaire, on procède au déclenchement par injection d'ocytocine le 31ème jour. Le nombre de lapereaux nés par rapport au nombre d'embryons réimplantés est de l'ordre 5 à 20%. EXEMPLE 3: SELECTION ET CARACTERISATION DES LAPINS TRANSGENIQUES
Pendant le processus d'embryogenèse, l'ADN recombinant micro-injecté intègre le génome de manière aléatoire. Les lapins nouveau-nés (10 jours) sont testés pour la présence du transgène par une biopsie de l'oreille. L'ADN génomique est extrait et une analyse PCR (Polymerase Chain Reaction) est réalisée en utilisant des amorces spécifiques de l'insert recombinant.
Les lapins pour lesquels le transgène a été mis en évidence sont appelés "Fondateurs FO".
Les lignées des fondateurs FO ont été en outre caractérisées par i) analyse du nombre de copies de transgène intégrées dans leur génome, et ii) détermination du nombre de sites d'intégration.
Le nombre de copies du transgène intégrées dans le génome de chaque lignée de fondateur FO a été déterminé par PCR quantitative et par transfert de Southern. Ce nombre varie, selon la lignée, de 1 copie par cellule à plus de 200 copies par cellule Le nombre de sites d'intégration a également été déterminé par transfert de Southern. Ce nombre varie, selon la lignée, de 1 à plus de 5 sites par génome.
EXEMPLE 4: EVALUATION DE L'EXPRESSION DE FACTEUR VII HUMAIN RECOMBINANT DANS LE LAIT DES LAPINES TRANSGENIQUES
Les lapins FO matures sexuellement (4 mois pour les femelles, 5 mois pour les mâles) ont été croisés avec des animaux non-transgéniques par insémination artificielle afin d'obtenir des descendants Fl hémizygotes, et le niveau d'expression du facteur VII humain dans le lait a été évalué pour différentes lignées de fondateurs FO et de descendants Fl. Pour ce faire, un échantillon de lait provenant de chacune des femelles FO et Fl sélectionnées a été centrifugé à 5000 x g pendant 20 minutes à 4°C afin de séparer les composés du lait des matières grasses. Un échantillon de lait écrémé a été dilué dans un tampon Laemmli, porté à ébullition pendant 5 minutes, puis séparé par électrophorèse en gel SDS-PAGE. Les protéines ont alors été transférées sur membranes PVDF3 puis une analyse par Western blot a été réalisée en utilisant un anticorps anti-facteur VII humain. La détection a été effectuée par chimioluminescence (Amersham Biosciences) afin de déterminer la concentration en facteur VII humain pour chacun des laits obtenus. Un niveau d'expression du facteur VII variant entre 90 μg/ml et 11 mg/ml a été observé. L'influence du nombre de copies du transgène sur le niveau d'expression a également été recherchée. Les résultats sont illustrés par la Figure 2, et montrent une corrélation entre le nombre de copies de transgène et le niveau d'expression du facteur VII dans le lait des animaux transgéniques

Claims

REVENDICATIONS
1) Lapin transgénique, caractérisé en ce qu'il contient dans son génome une ou plusieurs copies d'un transgène comprenant un polynucléotide codant pour le facteur VII humain, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur permettant son expression spécifique dans les cellules des glandes mammaires dudit lapin.
2) Lait d'un lapin transgénique selon la revendication 1.
3) Utilisation de lait de lapin transgénique selon la revendication 2 comme matière première pour la production de facteur VII humain recombinant.
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