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WO2009116633A1 - ゲル粒子測定装置 - Google Patents

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WO2009116633A1
WO2009116633A1 PCT/JP2009/055472 JP2009055472W WO2009116633A1 WO 2009116633 A1 WO2009116633 A1 WO 2009116633A1 JP 2009055472 W JP2009055472 W JP 2009055472W WO 2009116633 A1 WO2009116633 A1 WO 2009116633A1
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WO
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gel particle
light
sample
measuring apparatus
sample cell
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PCT/JP2009/055472
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French (fr)
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小幡　徹
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Individual
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Priority to JP2010503930A priority patent/JP4551980B2/ja
Priority to EP09721684A priority patent/EP2261642A4/en
Priority to US12/933,330 priority patent/US8462340B2/en
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    • G01N35/00584—Control arrangements for automatic analysers
    • G01N2035/0097—Control arrangements for automatic analysers monitoring reactions as a function of time

Definitions

  • the present invention relates to a gel particle measuring apparatus for measuring a target substance such as endotoxin or ⁇ -D-glucan in a sample to be measured by gelation reaction.
  • endotoxin is a fragment of bacterial cells that do not mainly stain Gram stain (Gram negative), and its component is a lipid polysaccharide called lipopolysaccharide, specifically lipid A (Lipid).
  • Lipid polysaccharide (LPS) in which a lipid called A) and a polysaccharide chain are linked via 2-keto-3-deoxyoctanoic acid (KDO), the lipid structure called Lipid A contained therein
  • LPS Lipid polysaccharide
  • KDO 2-keto-3-deoxyoctanoic acid
  • endotoxin is a substance that causes clinical symptoms with high fatality such as sepsis and bacteremia, it is clinically required to estimate endotoxin that has entered the body.
  • pharmaceuticals injections, etc.
  • medical devices vascular catheters, etc.
  • bacteria recombinant proteins, DNA used for gene therapy, etc.
  • the measurement method using the Limulus reagent is simply mixed with the patient's plasma as a sample, left standing, and then falls down after a certain period of time to confirm the presence or absence of gelation, causing gelation.
  • This is a so-called gelation method in which the endotoxin amount is estimated at the maximum dilution ratio.
  • a turbidimetric time analysis method that measures the endotoxin concentration by turbidity change associated with the gelation reaction using an optical measurement method is known. ing.
  • a chromogenic synthetic substrate method in which the gelation reaction in which coagulogen is converted to coagulin at the final stage of the reaction process using the Limulus reagent is replaced with a chromogenic reaction of a synthetic substrate is already known. This is because, by adding a chromogenic synthetic substrate (Boc-Leu-Bly-Arg-p-nitroarinide) instead of the coagulation precursor (Coagulogen) in the coagulation process, p-nitroaniline is liberated by its hydrolysis, The endotoxin concentration is measured by the yellow colorimetric color.
  • Patent Document 1 is not related to a gelation reaction measuring device, but measures the size and number of platelet aggregates in the process of platelet aggregation in blood and growing as a mass.
  • the sample is irradiated with irradiation light from a laser light source, and a part of the scattered light scattered 90 degrees laterally by platelets is detected by a photodetector, and the size of platelet aggregates is determined based on the detection result. The number is measured.
  • Patent Document 2 relates to a gelation reaction measuring apparatus using a turbidimetric time analysis method, and measures a temporal change in transmitted light intensity of a mixed liquid in which a specimen (sample) and a Limulus reagent are mixed, The endotoxin concentration of the specimen is measured from the amount of change in a predetermined time.
  • ⁇ -D-glucan is a polysaccharide (polysaccharide) that forms a cell membrane characteristic of fungi. By measuring this ⁇ -D-glucan, it is effective in screening for a wide range of fungal infections including not only common fungi such as Candida, Aspergillus and Cryptococcus but also rare fungi.
  • ⁇ -D-glucan In the measurement of ⁇ -D-glucan, it is also utilized that the blood cell extract component of horseshoe crab gels with ⁇ -D-glucan, and the gelation method, turbidimetric time analysis method, and chromogenic synthetic substrate method described above are used. Measured. Endotoxin and ⁇ -D-glucan measurement methods have similarities. For example, by using almost the same measurement hardware and removing the Factor G component from the blood cell extract components of horseshoe crab, A color reaction can be measured, and the endotoxin in the sample can be inactivated by pretreatment to measure a gelation reaction or a color reaction selective to ⁇ -D-glucan.
  • the conventional gelation method, turbidimetric time analysis method, and color synthesis substrate method have the following problems.
  • the gelation method and the turbidimetric time analysis method it takes a long time of about 90 minutes or more at a low concentration to form a gel. That is, the gelation time of the reaction solution is proportional to the concentration of the target substance in the sample to be measured, but neither the gelation method nor the turbidimetric time analysis method can detect the exact gelation start time from the point of sensitivity. Therefore, the amount of reaction is calculated from the time until the end of gelation, and the gelation time is used as a guide.
  • the turbidimetric time analysis method knows the first level at which the change begins and the level at which the change arrives, but it is difficult to understand the time at which each change begins and the end time. It was established as a quantitative method to replace the observation of the entire gelation by measuring a certain level of change (increase in turbidity) between the first and last levels. However, when the concentration of endotoxin is low, gelation of the entire system is prolonged, and the change in turbidity observed is slowed accordingly, making it difficult to measure, and the sensitivity is inevitably reduced accordingly.
  • the gelation method and the turbidimetric time analysis method are both suitable for urgent cases and for measuring a large number of specimens. Furthermore, in the turbidimetric time analysis method, nonspecific turbidity unrelated to endotoxin may occur, and there is a concern that measurement accuracy is lacking.
  • the measurement limit concentration of the gelation method is 3 pg / ml, and the measurement limit concentration of the turbidimetric time analysis method is about 1 pg / ml.
  • a turbidimetric time analysis method applied to the gelation reaction measuring apparatus even if the scattering photometry method shown in Patent Document 1 is applied, it is the above-described quantitative method instead of the change observation of the entire gelation.
  • the chromogenic synthetic substrate method has a measurement time of about 30 minutes as compared with the gelation method and turbidimetric time analysis method, but a false-positive reaction may occur and a measurement with high specificity should be performed.
  • the measurement preparation is complicated and the measurement limit concentration is 3 pg / ml, which is inferior to the turbidimetric time analysis method.
  • the formation state of gel particles that leads to the timing at which the mixed solution composed of the sample and the reagent solution transitions from the sol phase to the gel phase is measured with high sensitivity.
  • a gel particle measuring apparatus is provided.
  • the invention according to claim 1 is a gel particle measuring apparatus for measuring a target substance in a sample by particleizing by a gelation reaction, and has at least a transmission part through which light passes from one to the other and is a measurement object.
  • the sample cell containing the sample containing the target substance and the solution containing the reagent that causes gelation of the target substance and the entire mixed solution consisting of the sample and the reagent solution in the sample cell are prevented from gelling.
  • a stirring means for stirring the mixed solution, a coherent light source provided outside the transmission part of the sample cell and irradiating the mixed solution composed of the sample and the reagent solution in the sample cell with coherent light, and Provided on the opposite side of the coherent light source outside the transmission part of the sample cell, and detects light transmitted through the mixed solution consisting of the sample and the reagent solution in the sample cell.
  • a gel particle measuring apparatus comprising: a gel particle generation discriminating unit that discriminates at least a generation state of gel particles in the mixed solution that leads to a timing of phase transition to a gel phase.
  • the transmitted light detection means among the scattered light scattered by the gel particles is shifted in phase. It is a gel particle measuring apparatus characterized by including a scattered light removing means for removing a component toward it.
  • the gel particle generation discriminating means is configured such that the fluctuation displacement of the transmitted light is unstable from the stable state based on the measurement result of the transmitted light fluctuation measuring means
  • the gel particle measuring apparatus is characterized in that a change point that changes to a state is determined as the appearance timing of a gel particle.
  • the invention according to claim 4 is the gel particle measuring apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein the coherent light source is a laser light source.
  • the sample cell has a built-in stirring means capable of directly stirring the sample and the reagent solution in the cell container. It is the gel particle measuring device characterized.
  • a sixth aspect of the present invention is the gel particle measuring apparatus according to any one of the first to fifth aspects, wherein the sample cell is provided in a thermostatic bath.
  • a seventh aspect of the present invention is the gel particle measuring apparatus according to any one of the first to sixth aspects, further comprising display means for displaying a determination result by the gel particle generation determining means. It is.
  • the invention according to claim 8 is the gel particle measuring apparatus according to any one of claims 1 to 7, wherein the gel particle generation determination means quantifies the target substance in the sample based on the generation state of the gel particles. It is the gel particle measuring device characterized by these.
  • the invention according to claim 9 is a gel particle measuring apparatus for measuring by measuring the target substance in the sample by gelation reaction, including at least a transmission part through which light is transmitted and including the target substance to be measured
  • a sample cell containing a sample containing a solution containing a sample that causes gelation of the target substance, and the mixed solution so as to suppress gelation of the entire mixed solution comprising the sample and the reagent solution in the sample cell
  • a passing light detection means for detecting light passing through a mixed solution comprising a sample and
  • a gel particle measuring apparatus comprising: a gel particle generation determining unit configured to determine at least a generation state of the gel particles in the mixed solution leading to a timing to perform.
  • the gel particle generation discriminating means changes the passing displacement of the passing light from the stable state to the unstable state based on the measurement result of the passing light fluctuation measuring means.
  • a gel particle measuring apparatus characterized in that a changing point of change is discriminated as the appearance timing of a gel particle.
  • the invention according to claim 11 is the gel particle measuring apparatus according to claim 9, wherein the coherent light source irradiates the mixed solution with coherent light so as to pass near the center of the sample cell, and detects passing light.
  • the gel particle measuring apparatus is characterized in that the means detects scattered light out of the light from the coherent light source passing through the mixed solution in the sample cell.
  • the invention according to claim 12 is the gel particle measuring apparatus according to claim 9, wherein the coherent light source irradiates the mixed solution with coherent light so as to pass near the center of the sample cell, and detects passing light.
  • the gel particle measuring apparatus is characterized in that the means detects transmitted light and scattered light out of the light from the coherent light source passing through the mixed solution in the sample cell.
  • the invention according to claim 13 is the gel particle measuring apparatus according to any one of claims 1 to 12, wherein the target substance to be measured is endotoxin, and the reagent that gels it is a Limulus reagent. It is a gel particle measuring apparatus.
  • the mixed solution when measuring the target substance in the sample by the gelation reaction, the mixed solution is removed from the sol phase based on the fluctuation component of the transmitted light that passes through the mixed solution consisting of the sample and the reagent solution. It is possible to measure with high sensitivity the state of gel particle formation that leads to the timing of phase transition to the gel phase. According to the invention which concerns on Claim 2, the detection accuracy in a transmitted light detection means can be improved more, and the production
  • concentration of the target substance in a sample can be rapidly quantified by discriminating the appearance timing of a gel particle.
  • a coherent light source can be provided easily.
  • the mixed solution which consists of a sample and a reagent solution can be stirred more reliably, and the production
  • gelation reaction can be stably advanced under a constant temperature environment.
  • determination means can be visually observed.
  • the mixed solution is sol phase based on the fluctuation component of the passing light passing through the mixed solution consisting of the sample and the reagent solution. It is possible to measure with high sensitivity the formation state of gel particles that lead to the timing of phase transition from to the gel phase.
  • the appearance timing of a gel particle can be measured with high sensitivity.
  • the generation state of the gel particles that leads to the timing of the phase transition of the mixed solution from the sol phase to the gel phase is increased based on the fluctuation component of the scattered light passing through the mixed solution in the sample cell. Sensitivity can be measured.
  • the generation of gel particles that leads to the timing of the phase transition of the mixed solution from the sol phase to the gel phase based on the fluctuation components of the transmitted light and scattered light passing through the mixed solution in the sample cell. The state can be measured with high sensitivity.
  • the invention according to claim 13 can be applied to the determination of endotoxin as a target substance in a sample.
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of data analysis processing of the gel particle measuring apparatus according to Embodiment 1. It is explanatory drawing which shows an example of the gel particle measuring apparatus which concerns on Embodiment 2.
  • FIG. FIG. 6 is an explanatory diagram illustrating an example of a gel particle measuring apparatus according to a third embodiment. It is explanatory drawing which shows an example of the gel particle measuring apparatus which concerns on Embodiment 4. It is a graph which shows the result of having measured the transmitted luminous intensity for every reaction time about various endotoxin density
  • (A) is the graph which shows the result of having measured the turbidity corresponding to the transmitted luminous intensity for every reaction time about the predetermined endotoxin density
  • (b) is a figure. It is a graph which shows the result of having measured twice the scattering degree corresponding to the scattered light intensity for every reaction time about the predetermined
  • (A) is the graph which shows the result of having measured the turbidity corresponding to the transmitted luminous intensity for every reaction time about various endotoxin concentration (ETX density
  • FIG. 1 is an explanatory view showing an outline of a gel particle measuring apparatus according to an embodiment to which the present invention is applied.
  • the gel particle measuring apparatus measures the particle by measuring the target substance in the sample S by gelation reaction, and has at least a transmission part through which light passes from one to the other, and is a measurement object.
  • the sample cell 1 containing the sample S containing the target substance and the solution containing the reagent R that causes gelation of the target substance, and the entire mixed solution W composed of the sample S and reagent R solutions in the sample cell 1 are gelled.
  • Stirring means 2 that stirs the mixed solution W so as to suppress the formation, and a mixed solution W that is provided outside the permeation portion of the sample cell 1 and includes the sample S and reagent R solutions in the sample cell 1.
  • a coherent light source 3 that emits coherent light Bm, and a sample S and a reagent R in the sample cell 1 that are provided outside the transmission part of the sample cell 1 and on the opposite side of the coherent light source 3.
  • Transmitted light detecting means 4 for detecting the light Bm transmitted through the mixed solution W made of liquid
  • transmitted light fluctuation measuring means 5 for measuring the fluctuation component of the transmitted light based on the detection output of the transmitted light detecting means 4, and Based on the measurement result of the transmitted light fluctuation measuring means 5, the gel particle generation determining means for determining at least the generation state of the gel particles in the mixed solution W leading to the timing of the phase transition of the mixed solution W from the sol phase to the gel phase. 6.
  • the target substance of the present case includes a wide range of substances as long as they undergo a gelation reaction with a predetermined reagent to generate gel particles. Examples thereof include endotoxin and ⁇ -D-glucan.
  • the predetermined reagent includes a Limulus reagent.
  • the sample cell 1 may be entirely composed of a transmissive member, but is not limited thereto, and it is sufficient that the sample cell 1 has at least a transmissive portion in a portion through which the light Bm is transmitted. Further, from the viewpoint of keeping the measurement conditions constant, it is preferable that the sample cell 1 is provided in the thermostat 8.
  • the stirring means 2 a wide range of stirring means 2 can be used as long as it gives a stirring action to the mixed solution W composed of the sample S and the reagent R solution. It may be selected appropriately such as giving an action or giving a stirring action by shaking.
  • the degree of agitation of the agitation means 2 needs to suppress the entire mixed solution W composed of the sample S and the reagent R solution in the sample cell 1 from being gelled.
  • the sample cell 1 includes the stirring means 2 in which the mixed solution W composed of the sample S and the reagent R solution can be directly stirred in the cell container.
  • the coherent light source 3 is not limited to the laser light from the laser light source as long as it emits coherent light.
  • the coherent light source 3 can be produced by passing monochromatic light such as sodium lamp light through a pinhole.
  • the transmitted light detecting means 4 may be any means that mainly detects transmitted light that passes through the sample S and the reagent R solution out of the light from the coherent light source 3. In this case, a part of the scattered light scattered by the gel particles may be detected by the transmitted light detection means 4 as stray light. However, since most of the detection output is a transmitted light component, the stray light component is partially From the viewpoint of avoiding the influence of the stray light component, a method for removing the stray light component may be adopted, or the transmitted light fluctuation measuring unit 5 may correct the method. .
  • a component directed to the transmitted light detecting means 4 is removed between the transmitted light detecting means 4 and the sample cell 1 out of the scattered light scattered by the gel particles.
  • the aspect provided with the scattered light removal means 7 to be used is preferable.
  • the scattered light removing means 7 include a polarizing filter that cuts the scattered light component and allows only the transmitted light component to pass therethrough.
  • the transmitted light fluctuation measuring means 5 may be any means as long as it can measure the fluctuation component of the transmitted light based on the detection output of the transmitted light detecting means 4. For example, a method of averaging or smoothing and filtering the detected output.
  • the gel particle generation discriminating means 6 broadly includes one that at least discriminates the generation state of the gel particles in the mixed solution W that leads to the timing of the phase transition of the mixed solution W from the sol phase to the gel phase.
  • “determining the generation state of the gel particles” means not only directly determining the information on the generation state of the gel particles, but also information that can be determined based on the generation state of the gel particles (for example, quantitative information of the target substance) It also includes discriminating.
  • the generation state of the gel particles widely includes the generation start (appearance) time of the gel particles, the change in the generation process, the generation end time, the generation amount, and the like.
  • the mixed solution W is from the sol phase.
  • Other matters may be included as long as at least the timing of phase transition to the gel phase is included.
  • the change point at which the fluctuation displacement of the transmitted light changes from the stable state to the unstable state based on the measurement result of the transmitted light fluctuation measuring means 5 is used as the appearance timing of the gel particles. What is necessary is just to distinguish.
  • a display means 9 for displaying the measurement result by the transmitted light fluctuation measuring means 5.
  • the gelation reaction is schematically shown in FIG.
  • the target substance St when there is a reagent R that specifically reacts with the target substance St of the sample S, the target substance St specifically binds to the reagent R at a ratio depending on the concentration of the target substance St in the sample S.
  • a reaction occurs.
  • the reagent R receives a stimulus from the target substance St, activates a predetermined factor, and at the timing when a predetermined enzyme is activated due to this, for example, a water-soluble protein is decomposed by the enzyme. It is converted into an insoluble protein, leading to the appearance of gel particles G.
  • the endotoxin gelation reaction process is schematically shown in FIG.
  • the endotoxin stimulation shown in (1) is transmitted to the Limulus reagent, first, as shown in (2), factor C (Factor C) is activated to become activated factor C (Activated Factor C), Next, by the action of the activation factor C, as shown in (3), factor B (Factor B) is activated to become activated factor B. Thereafter, due to the action of activating factor B, Pro-Clotting enzyme becomes Clotting enzyme as shown in (4), and this Clotting enzyme degrades Coagulogen (water-soluble protein) as shown in (5). To produce Coagulin (insoluble protein).
  • This Coagulin appears as gel particles G when the entire gelation is inhibited by stirring, and polymerizes and gels as shown in (6) when allowed to stand. That is, when the target substance St of the sample S is endotoxin, by giving a constant stirring state to the mixed solution W, the gelation of the entire mixed solution W is inhibited, and in this state, in the Limulus reagent R When the stimulation of endotoxin is transmitted, it is possible to produce Coagulin (insoluble protein) gel particles G around the Clotting enzyme. After Coagulin (insoluble protein) is generated as gel particles G, the gel particles G are sequentially formed. It is understood that it undergoes a reaction process that is generated.
  • the rate at which endotoxin stimulation is transmitted to the Limulus reagent R depends on the endotoxin concentration. The higher the endotoxin concentration, the faster the Limulus reaction rate, and the appearance timing of the gel particles G composed of Coagulin (insoluble protein). Was found to be fast. Therefore, if the change in transmitted light is detected with high accuracy, it is possible to grasp the appearance timing of the gel particle G made of the Coagulin (insoluble protein) as the generation start point of the gel particle G. This is the basis of the measurement principle of the gel particle measuring apparatus according to the above.
  • the measurement principle of such a gel particle measuring apparatus is, for example, the measurement principle of the conventional gelation method or turbidimetric time analysis method (in the reaction process with Limulus reagent R, the effect of the enzyme activated under stationary conditions). Finally, it is gelled, which is completely different from the embodiment in which this gelled state is measured by turbidity.
  • the measurement principle of the gel particle measuring apparatus is schematically shown in FIG.
  • Step I of FIG. 2B when the mixed solution W of the sample S and the reagent R solution has no gel particles (when the mixed solution W is a sol phase). 2), the transmitted light Bm 1 from a coherent light source (not shown) is not blocked by the gel particles, so that the transmitted light intensity of the transmitted light Bm 1 is kept substantially constant (step I in FIG. 2C). see P 1).
  • gel particles G start to be generated in the mixed solution W of the sample S and the reagent R solution (the mixed solution W undergoes a phase transition from the sol phase to the gel phase).
  • transmitted light Bm 2 is produced from a coherent light source (not shown) and is produced from Coagulin (insoluble protein). Because the partially blocked by the presence of G, the transmitted light intensity of the transmitted light Bm 2 tries to change the damping trend from a substantially constant level (see FIG. 2 (c) II step P 2). Thereafter, as shown in Step III of FIG. 2B, when the generation of the gel particles G gradually proceeds in the mixed solution W of the sample S and the reagent R solution, the transmitted light is transmitted from a coherent light source (not shown). Since Bm 3 is blocked by the presence of many gel particles G that are sequentially generated, the transmitted light intensity of the transmitted light Bm 3 is sequentially attenuated at the attenuation change point P 2 (FIG. 2 (c) III process P 3 ).
  • the gel particle measuring apparatus is a gel particle measuring apparatus that measures and measures the target substance in the sample S by gelation reaction, and transmits light.
  • a sample cell 1 having at least a transmission part and containing a target substance to be measured and a solution containing a reagent R that causes gelation of the target substance, the sample S in the sample cell 1 and Stirring means 2 for stirring the mixed solution W so as to suppress the entire mixed solution W composed of the reagent R solution from gelling, and provided outside the permeation part of the sample cell 1,
  • a coherent light source 3 for irradiating coherent light to the mixed solution W composed of the sample S and the reagent R solution; and a coherent light source 3 provided outside the transmission portion of the sample cell 1 and different from the coherent light source 3.
  • Passing light detection means for detecting light that has passed through the mixed solution W composed of the sample S and reagent R solution in the sample cell 1, and fluctuation of the passing light based on the detection output of the passing light detection means
  • a passing light fluctuation measuring means (not shown) for measuring the component, and the mixed solution W in the mixed solution W leading to the timing of the phase transition from the sol phase to the gel phase based on the measurement result of the passing light fluctuation measuring means.
  • a gel particle generation discriminating means 6 for discriminating at least the generation state of the gel particles.
  • the passing light that is the detection target by the passing light detection means is not limited to the transmitted light, but also includes scattered light.
  • the change point at which the fluctuation displacement of the passing light starts changing from the stable state based on the measurement result of the passing light fluctuation measuring means is the appearance timing of the gel particles.
  • the passing light detection means detects the scattered light as the passing light
  • the coherent light source 3 irradiates the mixed solution W with coherent light so as to pass near the center of the sample cell 1.
  • the passing light detection means may detect the scattered light out of the light from the coherent light source 3 that passes through the mixed solution W in the sample cell 1.
  • the passing light detection means may be installed at any position as long as it is a position for detecting scattered light.
  • the sample cell can be sufficiently secured.
  • 1 is preferably installed in a region opposite to the coherent light source 3 with 1 in between.
  • the passing light detection means detects the transmitted light and the scattered light as the passing light
  • the coherent light source 3 is coherent to the mixed solution W so as to pass near the center of the sample cell 1.
  • the passing light detection means may detect the transmitted light and the scattered light out of the light from the coherent light source 3 passing through the mixed solution W in the sample cell 1 by irradiating light.
  • the passing light detection means may be installed at any position as long as it is a position for detecting transmitted light and scattered light, but it is possible to sufficiently secure the scattered light intensity and considering the ease of installation.
  • a mode in which the sample cell 1 is placed with the transmitted light detection means 4 in a region opposite to the coherent light source 3 is preferable.
  • Embodiment 1 As shown in FIGS. 4A and 4B, the gel particle measuring apparatus according to Embodiment 1 measures, for example, the concentration of endotoxin as a target substance of sample S by a gelation reaction using a Limulus reagent.
  • reference numeral 10 denotes a sample cell integrally formed of, for example, a transparent resin material or a glass material, and contains a mixed solution W composed of a sample S containing endotoxin and a Limulus reagent R.
  • the sample cell 10 is formed of, for example, a cylindrical body having an open top and a circular cross section, and opens and closes the top opening by opening and closing an opening / closing lid (not shown) of the measurement stage, for example. It is like that.
  • the sample cell 10 is placed in the thermostat 15 and the mixed solution W composed of the sample S and the reagent R solution is placed in a constant thermostatic environment (for example, 37 ° C.), and the measurement conditions are constant. It is supposed to be.
  • Reference numeral 20 denotes a stirring device that stirs the mixed solution W in the sample cell 10. For example, a constant stirring state is given to the mixed solution W to suppress the entire mixed solution W from gelling. ing.
  • the stirring device 20 includes a stirring bar (stirrer bar) 21 made of a magnetic material built in the bottom wall in the sample cell 10, and the stirring bar 21 provided outside the bottom wall of the sample cell 10.
  • a stirring drive source (magnetic stirrer) 22 for applying a stirring force by magnetic force.
  • Reference numeral 30 denotes a laser light source that is provided on one side of the side wall of the sample cell 10 and emits coherent light.
  • Reference numeral 40 denotes a laser light source 30 that is provided on the opposite side of the laser light source 30 across the sample cell 10.
  • This is a transmitted light detector that detects transmitted light B from.
  • the transmitted light detector 40 for example, optical components such as photodiodes can be widely used.
  • the coherent light Bm from the laser light source 30 is irradiated along a path that crosses the substantially diameter portion of the sample cell 10, and the light diameter is generated.
  • a sufficiently large value for example, about 1 mm
  • the gel particle diameter for example, about 0.5 to 20 ⁇ m).
  • the transmitted light detector 40 has a detection surface capable of detecting the light flux region of the transmitted light Bm from the laser light source 30, and the detection accuracy of the transmitted light detector 40 exists within the passage area of the transmitted light Bm. Or it is set to such an extent that a change in the amount of transmitted light due to the presence or absence of several gel particles can be detected.
  • a polarizing filter 50 is disposed between the sample cell 10 and the transmitted light detector 40. This polarizing filter 50 removes the stray light of the component which goes to the transmitted light detector 40 with the scattered light scattered by the gel particle G produced
  • the principle of stray light removal by the polarizing filter 50 is based on the fact that when the coherent light Bm from the laser light source 30 is scattered by the gel particles G, the phase of the scattered light is shifted, and stray light having a phase component other than the phase of the transmitted light Bm.
  • the ingredients are cut.
  • optical components such as a condensing lens and a mirror may be arranged between the laser light source 30 and the transmitted light detector 40 and the sample cell 10 as necessary in determining the optical path and the irradiation light diameter. Of course.
  • Reference numeral 60 denotes a data analysis device that takes in the detection output from the transmitted light detector 40 and executes the data analysis processing shown in FIG. 5, for example.
  • Reference numeral 70 denotes a display that displays the analysis result analyzed by the data analysis device 60.
  • This data analysis device 60 is constituted by a computer system including a CPU, ROM, RAM, I / O interface, etc.
  • the data analysis processing program shown in FIG. The data analysis processing program is executed by the CPU based on the detection output from the device 40.
  • the detection output from the transmitted light detector 40 is, for example, converted from current to voltage by an amplifier (not shown), then AD converted by an AD converter, and taken into the data analyzer 60.
  • the operation of the gel particle measuring apparatus will be described.
  • the open / close lid (not shown) of the measurement stage was closed.
  • a start switch (not shown) is turned on, and a measurement sequence by the gel particle measuring apparatus is started.
  • the mixed solution W composed of the sample S and the Limulus reagent R in the sample cell 10 is stirred by the stirring device 20. For this reason, it is suppressed that the mixed solution W whole gelatinizes.
  • light Bm is emitted from the laser light source 30, and the transmitted light Bm that has passed through the mixed solution W in the sample cell 10 is detected by the transmitted light detector 40, and the detection output of the transmitted light detector 40 is detected. Is taken into the data analysis device 60.
  • the stimulation of endotoxin is transmitted to the Limulus reagent R, the Limulus reaction as shown in FIG. 3 occurs, and gel particles G are sequentially generated in a state where gelation of the entire mixed solution W is suppressed.
  • the timing at which one gel particle G is generated within the passage area of the light Bm from the laser light source 30 is grasped as the generation start point of the gel particle G, and the attenuation change point of the transmitted light is determined. It will be timing.
  • the data analysis device 60 reads the detection output from the transmitted light detector 40 as transmitted light amount data (digital data), for example, as shown in FIG.
  • the fluctuation component of the transmitted light amount data is measured. Then, based on the fluctuation component of the transmitted light amount data is extracted the attenuation change point of the transmitted light (corresponding to P 2 in Figure 2), endotoxin (ETX concentration of the sample S by referring to the calibration curve that has been defined in advance ) Is determined and displayed on the display 70.
  • the calibration curve shows the relationship between the endotoxin concentration (ETX concentration) and the time threshold until reaching the attenuation change point of transmitted light, and the correlation between the time of the attenuation change point of transmitted light and the calibration curve. Based on this, the endotoxin concentration (ETX concentration) is determined.
  • the display 70 switches and displays data such as time series data of transmitted light amount data and time series measurement data of fluctuation components of the transmitted light amount data.
  • data such as time series data of transmitted light amount data and time series measurement data of fluctuation components of the transmitted light amount data.
  • the gel particle measuring apparatus is a gel composed of Coagulin particles produced in the mixed solution W by stirring the mixed solution W composed of the sample S and the Limulus reagent R in a predetermined constant temperature environment. It detects that the transmitted light is partially blocked by the appearance of the particle G and diminishes, and tries to catch the start time of gelation.
  • a coherent and strong light such as a laser beam is used, and in order to detect a minute change, particularly in a change at a low concentration.
  • the stray light component is removed by the polarizing filter 50 using the fact that the scattered stray light hits the gel particle G made of Coagulin particles and the phase is shifted, only the transmitted light component from the laser light source 30 is included in the transmitted light detector 40. Is incident, and the change in transmitted light is accurately detected accordingly.
  • the sample cell 10 is configured to open and close the upper opening with, for example, an open / close lid of the measurement stage.
  • the present invention is not limited to this.
  • the sample cell 10 is stirred in the cell container.
  • the rod 21 and the Limulus reagent R may be accommodated in advance, and the upper opening may be sealed with a sealing member (not shown).
  • a sample cell 10 may be supplied to the user as an accessory or a measurement kit of the gel particle measuring apparatus.
  • a method for introducing the sample S into the sample cell 10 of this embodiment for example, a method in which the sealing member is perforated with a punch such as an injection needle and the sample S is injected through the perforation.
  • the sealing specification of the sealing member may be set so that the inside of the sample cell 10 maintains a predetermined negative pressure level with respect to the atmospheric pressure.
  • the gel particle measuring apparatus for the sample cell 10 for one specimen (sample S) is shown.
  • a plurality of sample cells is used. Is prepared, and a laser light source 30 and a transmitted light detector 40 are arranged corresponding to each sample cell so that a plurality of specimens (samples) can be measured simultaneously.
  • the substance to be measured is disclosed as endotoxin, but the present invention is not limited to this.
  • the same measurement hardware and the same or similar limulus reagent is used.
  • the substance to be measured can be ⁇ -D-glucan. It is also possible to measure the reaction of particles or substances that cause polymerization of particles by the reaction.
  • Embodiment 2 6 (a) and 6 (b) show the main part of the gel particle measuring apparatus according to the second embodiment.
  • the gel particle measuring apparatus according to the second embodiment accommodates a sample S containing endotoxin and a Limulus reagent R in a sample cell 10, and mixes these mixed solutions W with a stirring device 20 (stirring rod 21, stirring drive). While stirring at the source 22), the mixed solution W is irradiated with the light Bm ′ from the laser light source 30, and a part of the scattered light scattered sideways by the gel particles G generated by the Limulus reaction is scattered.
  • the detection is performed by the photodetector 140, the detection output of the scattered light detector 140 is taken into the data analysis device 60, and the production time of the gel particles G is calculated.
  • the scattered light originally has a smaller proportion than the transmitted light, and only a part of the scattered light can be measured. Therefore, it is necessary to suppress the attenuation of the scattered light as much as possible. Therefore, in the second embodiment, a strict optical circuit is required in order to prevent the scattered light from being attenuated.
  • the surface of the mixed solution W in the sample cell 10 is perpendicular to the surface.
  • the sample cell 10 It is necessary to install the laser light source 30 and the scattered light detector 140 so as to obtain the incident and scattered reflection angles that are in a positional relationship and to measure the scattered light. For this reason, it is necessary to take care that the sample cell 10 also adopts a special container structure with a small container thickness k with little attenuation, and that the installation accuracy of the laser light source 30 and the scattered light detector 140 is set extremely high. It is.
  • the laser light source 30 and the transmitted light detector 40 may be installed on the sample cell 10 so as to face each other in a straight line in the direction of the diameter of the sample cell 10. It can be rough to some extent.
  • Embodiment 3 7 (a) and 7 (b) show the main part of the gel particle measuring apparatus according to the third embodiment.
  • the gel particle measuring apparatus according to the third embodiment accommodates a sample S containing endotoxin and a Limulus reagent R in a sample cell 10, and mixes these mixed solutions W with a stirring device 20 (stirring bar 21, stirring drive).
  • a part of the scattered light transmitted and scattered toward the opposite side of the laser light source 30 with the sample cell 10 sandwiched by G is detected by the scattered light detector 140, and the detection output of this scattered light detector 140 is a data analysis device. 60, and the production time of the gel particle G is calculated.
  • the scattered light detector 140 is scattered by being scattered by the presence of the gel particles G.
  • a part of light (precisely, light scattered in a direction different from the traveling direction of transmitted light) is detected.
  • the scattered light is not generated when the gel particles are not generated, and is generated when the gel particles are generated.
  • the scattered light output detected by the scattered light detector 140 is taken into the data analysis device 60, the rising change point of the scattered light output is determined based on the fluctuation component of the scattered light, and the rising change point time is determined as the gel particle. It is calculated as the production time of G.
  • at least one scattered light detector 140 may be provided, but a plurality of scattered light detectors 140 may be installed to average the detection output, or one of the plurality of scattered light detectors 140 may be used to determine the production time of the gel particles G. It may be used as appropriate for selection, and other scattered light detectors 140 may be used as appropriate for determining the generation state of another gel particle G.
  • the scattered light detector 140 is installed on the opposite side of the laser light source 30 with the sample cell 10 interposed therebetween as shown by the solid line in FIG. 7B. ),
  • a scattered light detector 140 ′ is installed at a position displaced about 90 degrees with respect to the position of the laser light source 30 in the periphery of the sample cell 10, and the irradiation light Bm from the laser light source 30 is provided.
  • Scattered light scattered laterally by the gel particles G in the mixed solution W may be detected by the scattered light detector 140 ′.
  • the side scattered light component is shown in FIG. It is preferable to further increase the sensitivity of the scattered light detector 140 ′ compared to the scattered light detector 140 because it is less than the transmitted scattered light component indicated by the solid line.
  • FIGS. 8A and 8B show the main part of the gel particle measuring apparatus according to the fourth embodiment.
  • the gel particle measuring apparatus according to the fourth embodiment accommodates a sample S containing endotoxin and a Limulus reagent R in a sample cell 10, and mixes these mixed solutions W with a stirring device 20 (stirring rod 21, stirring drive).
  • a part of transmitted light that passes through the gel particle G is detected by the transmitted light detector 40 out of the transmitted light directed to the opposite side of the laser light source 30 with the sample cell 10 sandwiched by G, and separately from the transmitted light.
  • a part of the scattered light transmitted and scattered by the gel particle G is detected by the scattered light detector 140, the detection output of each of the light detectors 40 and 140 is taken into the data analysis device 60, and the production time of the gel particle G is calculated. Process It is intended.
  • the data analysis device 60 may calculate the detection output from each of the light detectors 40 and 140 with time, or at least one of the detection outputs is based on transmitted light intensity or scattered light intensity. It may be calculated by converting into a changing parameter (for example, turbidity).
  • the number of the laser light sources 30 may be one, and at least one of the photodetectors 40 and 140 may be installed. However, if necessary, a plurality of the photodetectors 40 and 140 may be provided. You may make it install.
  • the transmitted light detector 40 detects the fluctuation component of the transmitted light
  • the scattered light detector 140 detects the fluctuation component of the scattered light.
  • the data analysis device 60 can determine the production time of the gel particles G in the mixed solution W of the sample cell 10 based on the fluctuation components of the transmitted light or scattered light from the photodetectors 40 and 140. Thus, the production time of the gel particles G can be determined more accurately.
  • Example 1 This example is a realization of the gel particle measuring apparatus according to the first embodiment.
  • the conditions of Example 1 are as follows.
  • -Laser light source 30 Red light or green light-Transmitted light detector 40: Photodiode-Rotation speed of stirring bar (stirrer bar) 21: 1000 rpm ⁇
  • Constant temperature condition 37 °C
  • the change in transmitted light intensity was examined with a gel particle measuring device with respect to the Limulus reagent when samples with various endotoxin concentrations (10 ⁇ 1 ⁇ 0.1 pg / ml) were added.
  • the attenuation change point of the transmitted light intensity corresponds to the gel particle generation start point (gelation start time), and is assumed to mean light attenuation at the start of gelation.
  • gelation start time the gel particle generation start point
  • a calibration curve is created using the values of the gelation start times t 1 (10), t 2 (10), t (1), and t (0.1) obtained from the graph of FIG. I made it.
  • the X-axis is the ETX concentration (log conversion), which is the endotoxin concentration
  • the Y-axis is the gelation start time (log conversion)
  • a linear relationship is obtained, and the correlation coefficient is ⁇ 0.9804.
  • a high correlation is shown, demonstrating the usefulness of this calibration curve.
  • Example 2 This example embodies the gel particle measuring apparatus according to the fourth embodiment.
  • the conditions of Example 2 are as follows.
  • changes in transmitted light intensity and scattered light intensity were examined twice with respect to the Limulus reagent when a sample having a predetermined endotoxin concentration (10 pg / ml) was added.
  • FIG. 11 (a) is a plot of turbidity corresponding to transmitted light intensity over time when a sample with an endotoxin concentration of 10 pg / ml was added to the Limulus reagent.
  • FIG. 11 (b) is a plot of the scattering intensity corresponding to the scattered light intensity over time when a sample having an endotoxin concentration of 10 pg / ml is added to the Limulus reagent. According to FIG.
  • the change in turbidity corresponding to the transmitted light intensity shows a tendency to attenuate and decrease at a certain time when there is a portion that maintains a substantially constant level.
  • the turbidity attenuation change point corresponding to the transmitted light intensity corresponds to the gel particle generation start point (gelation start time), and is assumed to mean a decrease in turbidity due to light reduction at the start of gelation.
  • the degree of scattering corresponding to the intensity of scattered light shows a tendency to increase and increase over time when there is a portion that maintains a substantially constant level.
  • This increasing change point of the scattering degree corresponds to the gel particle generation start point (gelation start time), and is assumed to mean an increase in scattering degree due to scattering at the start of gelation. It should be noted that the scattering change point corresponding to the scattered light intensity shown in FIG. 11B is slightly delayed from the turbidity attenuation changing point corresponding to the transmitted light intensity shown in FIG. Is presumed to be due to the arrival time difference of transmitted light or scattered light reaching the light detector 40 or 140.
  • Example 3 In the present example, like the example 2, the gel particle measuring apparatus according to the fourth embodiment is embodied.
  • the conditions of the third embodiment are substantially the same as those of the second embodiment, but a blue diode having a laser light source 30 of 40 mW is used.
  • the turbidity corresponding to the transmitted light intensity with the gel particle measuring apparatus was compared with the Limulus reagent when samples with various endotoxin concentrations (10, 1, 0.1, 0.001 pg / ml) were added. The change of the scattering degree corresponding to the scattered light intensity is examined.
  • FIG. 12A is a plot of the degree of scattering corresponding to the transmitted light intensity over time when samples with various endotoxin concentrations were added to the Limulus reagent.
  • FIG. 12B is a plot of turbidity corresponding to the scattered light intensity over time when samples with various endotoxin concentrations were added to the Limulus reagent.
  • the change in turbidity corresponding to the transmitted light intensity for each endotoxin concentration sample shows a tendency to attenuate and decrease over a period of time when a portion maintaining a substantially constant level is present. Yes.
  • the turbidity decay change point corresponding to the transmitted light intensity corresponds to the gel particle generation start point (gelation start time), and is assumed to mean a decrease in turbidity due to light reduction at the start of gelation. It is understood that the turbidity decay change point (gel particle generation start point) corresponding to each transmitted light intensity is faster as the endotoxin concentration is higher.
  • the scattering degree corresponding to the scattered light intensity for each endotoxin concentration sample shows a tendency to increase and increase over a period of time in which there is a portion that maintains a substantially constant level.
  • This increasing change point of the scattering degree corresponds to the start point of gel particle generation (gelation start time) and is assumed to mean an increase in scattering degree due to scattering at the start of gelation. It is understood that the change point (starting point of gel particle generation) is earlier as the endotoxin concentration is higher. From these results, it is possible to create a calibration curve using the gelation start time which is the gelation start point in substantially the same manner as shown in Example 1. In this case, if the gelation start point is determined in consideration of both the transmitted light and scattered light fluctuation components, it is possible to eliminate disturbance due to noise and the like, and accordingly, the gelation start point is determined accordingly. Is made more accurately.
  • Example 4 the gel particle measuring apparatus according to the fourth embodiment is embodied as in Example 3, but unlike Example 3, a red diode having a laser light source of 40 mW is used.
  • the conditions in this example are substantially the same as those in Example 3.
  • the gel particle measuring device permeated the Limulus reagent when samples with various endotoxin concentrations (10 ⁇ 1 ⁇ 0.1 ⁇ 0.001 pg / ml) were added.
  • the turbidity corresponding to the luminous intensity and the change in the scattering degree corresponding to the scattered luminous intensity are examined. The results are shown in FIGS. 13 (a) and 13 (b).
  • FIG. 13 (a) and 13 (b) The results are shown in FIGS. 13 (a) and 13 (b).
  • FIG. 13 (a) is a plot of turbidity corresponding to transmitted light intensity over time when samples with various endotoxin concentrations were added to the Limulus reagent.
  • FIG. 12 (b) plots the degree of scattering corresponding to the scattered light intensity over time when samples with various endotoxin concentrations were added to the Limulus reagent. According to these, although there is a difference in the laser light source 30, substantially the same result as in Example 3 was obtained, and it was confirmed that the laser light source 30 can be used for creating the above-described calibration curve and the like.
  • Example 5 The present embodiment more specifically embodies the gel particle measuring apparatus (an embodiment using the scattered light detector 140 ′) according to the third embodiment.
  • the change in the side scattered light intensity was examined once with respect to the Limulus reagent when a sample having a predetermined endotoxin concentration (10 pg / ml) was added under the same conditions as in Example 2. It is a thing.
  • the results are shown in FIG.
  • FIG. 14 is a plot of the side scattered light intensity over time when a sample with an endotoxin concentration of 10 pg / ml was added to the Limulus reagent.
  • the side scattered light intensity also shows a tendency to increase and increase over time when there is a portion that maintains a substantially constant level. This increased change point of the scattered light intensity corresponds to the gel particle generation start point (gelation start time), and is assumed to mean an increase in light intensity due to scattering at the start of gelation.
  • the present invention includes a gel particle measuring apparatus for measuring endotoxin, ⁇ -D-glucan and the like using a Limulus reagent, and a reaction process in which a target substance capable of generating gel particles by gelation reaction or polymerization of existing particles occurs. It is widely applied to measuring devices that measure the above.

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Abstract

　ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、ゲル粒子の生成開始点を高感度に計測する。ゲル粒子測定装置は、試料Ｓ及び試薬Ｒが含まれる溶液を収容する試料セル１と、この試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗを撹拌する撹拌手段２と、試料セル１内の混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光Ｂを照射させるコヒーレント光源３と、試料セル１の外部でコヒーレント光源３の反対側に設けられ、試料セル１内の混合溶液Ｗ中を透過した光を検出する透過光検出手段４と、この透過光検出手段４の検出出力に基づいて透過光の変動成分を計測する透過光変動計測手段５と、この透過光変動計測手段５の計測結果に基づいて混合溶液Ｗがゾル相からゲル相に相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段６とを備える。

Description

ゲル粒子測定装置
　本発明は、ゲル化反応によって測定対象の試料中のエンドトキシンやβ－D－グルカンなどの目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定装置に関する。
　エンドトキシン（細胞内毒素）と呼ばれるものは、主としてグラム染色に染まらない（グラム陰性）細菌類の菌体の破片で、その成分はリポポリサッカライドと呼ばれる脂質多糖類具体的には、リピドＡ（Lipid Ａ）と呼ばれる脂質と多糖鎖が２－ケト－３－デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）を介して結合したリポ多糖（ＬＰＳ）であるが、そこに含まれるリピドＡ（Lipid Ａ）と呼ばれる脂質構造部分が、細胞の受容体と結合して炎症を引き起こし、多くの場合様々な重篤な臨床症状を引き起こす。このように、エンドトキシンは、敗血症や菌血症という致死率の高い臨床症状の原因となる物質であるため、体内に入ったエンドトキシンの推定をすることは臨床的に要求の高いことである。
　また、医薬品（注射剤等）や医療用具（血管カテーテル等）はエンドトキシンによる汚染がないこと（パイロジェンフリー）が重要であり、細菌を用いて調製した医薬品（組み換えタンパク質、遺伝子治療に用いるＤＮＡ等）ではエンドトキシンを完全に除去することが不可欠になっている。
　このエンドトキシンの除去確認、あるいは救急医学における計測は、測定試料数の多さばかりでなく、救命治療という目的にかなった迅速性が求められている。
　敗血症などの治療のため、エンドトキシン値を計ろうとする研究は古くよりなされ、カブトガニ（Limulus）のアメーバ状血球成分に含まれる因子群が、エンドトキシンに特異的に反応し、ゲル化することが発見されてから、このリムルスの水解物（Limulus Amebocyte Lysate；ＬＡＬ試薬又はリムルス試薬）を用いてエンドトキシンの定量をする試みがなされている。
　最初にリムルス試薬を使った測定法は、単に試料となる患者の血漿を混合して静置し、一定時間後に転倒してゲル化の有無を溶液が固まることで確認し、ゲル化を起こすための最大希釈率でエンドトキシン量を推定する所謂ゲル化法と呼ばれるものであった。
　その後、ゲル化反応の過程における濁度増加に着目し、光学的な計測方法を用いた濁度計で、ゲル化反応に伴う濁度変化によりエンドトキシン濃度を測定する比濁時間分析法が知られている。
　また、リムルス試薬による反応過程の最終段階でコアギュロゲン（Coagulogen）がコアグリン（Coagulin）に転換するゲル化反応を合成基質の発色反応に置き換えた発色合成基質法も既に知られている。これは、凝固過程における凝固前駆物質（コアギュロゲン：Coagulogen）の代わりに発色合成基質（Boc-Leu-Bly-Arg-p-ニトロアリニド）を加えることにより、その加水分解でp-ニトロアニリンが遊離され、その黄色発色の比色によりエンドトキシン濃度を測定するものである。
　更に、従来におけるゲル化反応測定装置若しくはこれに関連する測定装置としては、例えば特許文献１，２に示すものが挙げられる。
　特許文献１は、ゲル化反応測定装置に関するものではないが、血中の血小板が凝集して塊として成長する過程につき、血小板の凝集塊の大きさ、数を測定するものであり、試料セル内の試料に対してレーザ光源からの照射光を照射させ、血小板で９０度側方に散乱した散乱光の一部を光検出器にて検出し、この検出結果に基づいて血小板の凝集塊の大きさ、数を測定するものである。
　また、特許文献２は、比濁時間分析法を用いたゲル化反応測定装置に関するものであり、検体（試料）とリムルス試薬とを混合させた混合液の透過光強度の経時変化を測定し、所定時間における変化量から検体のエンドトキシン濃度を測定するものである。
　更に、ゲル化反応を利用した測定技術は、前述したエンドトキシンのみならず、β－D－グルカン（β－D－glucan）などの測定にも利用される。
　β－D－グルカン（β－D－glucan）は真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。このβ－D－グルカンを測定することにより、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、まれな真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどで有効である。
　このβ－D－グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ－D－グルカンによってゲル化することが利用されており、上述したゲル化法や比濁時間分析法、発色合成基質法によって測定される。
　エンドトキシンやβ－D－グルカンの測定手法には共通点があり、例えば略同様の測定ハードウェアを用い、カブトガニの血球抽出成分中からFactor G成分を除くことによりエンドトキシンに選択的なゲル化反応や発色反応が測定でき、また、試料中のエンドトキシンに前処理により不活性化することにより、β－D－グルカンに選択的なゲル化反応や発色反応を測定することが可能である。
特許第３１９９８５０号公報（実施例，図１） 特開２００４－９３５３６号公報（発明の実施の形態，図３）
　しかしながら、従来のゲル化法、比濁時間分析法及び発色合成基質法にあっては、次のような不具合がある。
　ゲル化法及び比濁時間分析法は、いずれもゲルが生成するのに低濃度では約９０分以上という長時間を要する。すなわち、反応溶液のゲル化時間は、測定対象の試料中の目的物質の濃度に比例するが、ゲル化法及び比濁時間分析法は共に感度の点から正確なゲル化開始時間などが検出できないため、ゲル化終了までの時間から反応量を算出してゲル化時間を目安としている。
　例えば比濁時間分析法を例に挙げると、比濁時間分析法は、変化の始まる最初のレベルと変化の行き着くレベルとについては分かるが、夫々の変化の始まる時間や終わりの時間が分かり難く、最初と最後のレベルの間の一定レベルの変化（濁度の増加）を測ることで、ゲル化全体の変化観察に換えるという定量法として確立されたものである。しかし、低濃度のエンドトキシンになると、系全体のゲル化が遷延し、それにつれて観測する濁度変化も遅くなることから測り難くなり、その分、感度が必然的に鈍くなってしまう。
　従って、ゲル化法及び比濁時間分析法は共に救急を要する場合や多数の検体を測定するのに適した方法とは言い難い。更に、比濁時間分析法ではエンドトキシンとは無関係の非特異的濁りが生ずることがあり、測定精度に欠ける懸念がある。また、ゲル化法の測定限界濃度は３pg/ml、比濁時間分析法の測定限界濃度は１pg/ml程度である。
　尚、ゲル化反応測定装置に適用される比濁時間分析法として、仮に特許文献１に示す散乱測光法を適用したとしても、ゲル化全体の変化観察に換えた定量法である以上、上述した問題は解決し得ない。
　一方、発色合成基質法はゲル化法及び比濁時間分析法に比べて測定時間が約３０分程度と短時間であるが、偽陽性反応が生ずる場合があり、特異度の高い測定を行うことが難しく、また、測定準備が煩雑であり、測定限界濃度も３pg/mlと比濁時間分析法に劣る。
　本発明は、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、試料及び試薬溶液からなる混合溶液がゾル相からゲル相に相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を高感度に計測するゲル粒子測定装置を提供するものである。
　請求項１に係る発明は、ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定装置であって、一方から他方にかけて光が透過する透過部を少なくとも有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、この試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を撹拌する撹拌手段と、前記試料セルの透過部の外部に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させるコヒーレント光源と、前記試料セルの透過部の外部で前記コヒーレント光源の反対側に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液中を透過した光を検出する透過光検出手段と、この透過光検出手段の検出出力に基づいて透過光の変動成分を計測する透過光変動計測手段と、この透過光変動計測手段の計測結果に基づいて前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段とを備えたことを特徴とするゲル粒子測定装置。
　請求項２に係る発明は、請求項１に係るゲル粒子測定装置において、透過光検出手段と試料セルとの間には、ゲル粒子で散乱した位相のずれた散乱光のうち透過光検出手段に向かう成分が除去される散乱光除去手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項３に係る発明は、請求項１又は２に係るゲル粒子測定装置において、ゲル粒子生成判別手段が、透過光変動計測手段の計測結果に基づいて透過光の変動変位が安定状態から不安定状態に変化する変化点をゲル粒子の出現タイミングとして判別するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項４に係る発明は、請求項１乃至３いずれかに係るゲル粒子測定装置において、コヒーレント光源がレーザ光源であることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項５に係る発明は、請求項１乃至４いずれかに係るゲル粒子測定装置において、試料セルが、セル容器内に試料及び試薬溶液が直接撹拌可能な撹拌手段を内蔵したものであることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項６に係る発明は、請求項１乃至５いずれかに係るゲル粒子測定装置において、試料セルが恒温槽内に設けられることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項７に係る発明は、請求項１乃至６いずれかに係るゲル粒子測定装置において、ゲル粒子生成判別手段による判別結果が表示される表示手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項８に係る発明は、請求項１乃至７いずれかに係るゲル粒子測定装置において、ゲル粒子生成判別手段が、ゲル粒子の生成状態に基づいて試料中の目的物質を定量するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項９に係る発明は、ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定装置であって、光が透過する透過部を少なくとも有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、この試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を撹拌する撹拌手段と、前記試料セルの透過部の外部に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させるコヒーレント光源と、前記試料セルの透過部の外部で前記コヒーレント光源とは異なる部位に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液中を通過した光を検出する通過光検出手段と、この通過光検出手段の検出出力に基づいて通過光の変動成分を計測する通過光変動計測手段と、この通過光変動計測手段の計測結果に基づいて前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段とを備えたことを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項１０に係る発明は、請求項９に係るゲル粒子測定装置において、ゲル粒子生成判別手段が、通過光変動計測手段の計測結果に基づいて通過光の変動変位が安定状態から不安定状態に変化する変化点をゲル粒子の出現タイミングとして判別するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項１１に係る発明は、請求項９に係るゲル粒子測定装置において、コヒーレント光源が、前記試料セルの中心寄りを通過するように前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射し、通過光検出手段が、試料セル内の前記混合溶液内を通過するコヒーレント光源からの光のうち散乱光を検出するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項１２に係る発明は、請求項９に係るゲル粒子測定装置において、コヒーレント光源が、前記試料セルの中心寄りを通過するように前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射し、通過光検出手段が、試料セル内の前記混合溶液内を通過するコヒーレント光源からの光のうち透過光及び散乱光を検出するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項１３に係る発明は、請求項１乃至１２いずれかに係るゲル粒子測定装置において、測定対象である目的物質がエンドトキシンであり、これをゲル化する試薬がリムルス試薬であることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
　請求項１に係る発明によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、試料及び試薬溶液からなる混合溶液を透過する透過光の変動成分に基づいて前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を高感度に計測することができる。
　請求項２に係る発明によれば、透過光検出手段での検出精度をより向上させることができ、その分、混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するゲル粒子の生成状態を高感度に計測することができる。
　請求項３に係る発明によれば、ゲル粒子の出現タイミングを判別することで、試料中の目的物質の濃度を迅速に定量することができる。
　請求項４に係る発明によれば、コヒーレント光源を簡単に提供することができる。
　請求項５に係る発明によれば、試料及び試薬溶液からなる混合溶液をより確実に撹拌することができ、ゲル粒子の生成条件を揃えることができる。
　請求項６に係る発明によれば、恒温環境下でゲル化反応を安定的に進行させることができる。
　請求項７に係る発明によれば、ゲル粒子生成判別手段の判別結果を目視することができる。
　請求項８に係る発明によれば、試料中の目的物質発生を直接的に定量することができる。
　請求項９に係る発明によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、試料及び試薬溶液からなる混合溶液を通過する通過光の変動成分に基づいて、前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を高感度に測定することができる。
　請求項１０に係る発明によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、ゲル粒子の出現タイミングを高感度に計測することができる。
　請求項１１に係る発明によれば、試料セル内の混合溶液を通過する散乱光の変動成分に基づいて、混合溶液がゾル相からゲル相に相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を高感度に計測することができる。
　請求項１２に係る発明によれば、試料セル内の混合溶液を通過する透過光及び散乱光の変動成分に基づいて、混合溶液がゾル相からゲル相に相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を高感度に計測することができる。
　請求項１３に係る発明によれば、試料中の目的物質としてのエンドトキシンの定量に適用することができる。
本発明が適用されるゲル粒子測定装置の実施の形態の概要を示す説明図である。 （ａ）はゲル化反応を模式的に示す説明図、（ｂ）はゲル化反応の進行工程Ｉ～IIIを示す説明図、（ｃ）はゲル化反応の進行工程における反応時間と透過光度との関係を示す説明図である。 リムルス試薬を用いた際のエンドトキシンのゲル化反応過程を模式的に示す説明図である。 （ａ）は実施の形態１に係るゲル粒子測定装置の正面説明図、（ｂ）はその平面説明図である。 実施の形態１に係るゲル粒子測定装置のデータ解析処理の一例を示すフローチャートである。 実施の形態２に係るゲル粒子測定装置の一例を示す説明図である。 実施の形態３に係るゲル粒子測定装置の一例を示す説明図である。 実施の形態４に係るゲル粒子測定装置の一例を示す説明図である。 実施例１に係るゲル粒子測定装置を用いて様々なエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）について反応時間毎の透過光度を測定した結果を示すグラフ図である。 図９に示すグラフ図を用いた検量線作成例を示す説明図である。 （ａ）は実施例２に係るゲル粒子装置を用いて所定のエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）について反応時間毎の透過光度に対応する濁度を２回測定した結果を示すグラフ図、（ｂ）は同装置を用いて所定のＥＴＸ濃度について反応時間毎の散乱光度に対応する散乱度を２回測定した結果を示すグラフ図である。 （ａ）は実施例３に係るゲル粒子測定装置を用いて様々なエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）について反応時間毎の透過光度に対応する濁度を測定した結果を示すグラフ図、（ｂ）は同装置を用いて様々なＥＴＸ濃度について反応時間毎の散乱光度に対応する散乱度を測定した結果を示すグラフ図である。 （ａ）は実施例４に係るゲル粒子測定装置を用いて様々なエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）について反応時間毎の透過光度に対応する濁度を測定した結果を示すグラフ図、（ｂ）は同装置を用いて様々なＥＴＸ濃度について反応時間毎の散乱光度に対応する散乱度を測定した結果を示すグラフ図である。 実施例５に係るゲル粒子装置を用いて所定のエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）について反応時間毎の散乱光度を１回測定した結果を示すグラフ図である。
符号の説明
　１…試料セル，２…撹拌手段，３…コヒーレント光源，４…透過光検出手段，５…透過光変動計測手段，６…ゲル粒子生成判別手段，７…散乱光除去手段，８…恒温槽，９…表示手段，Ｓ…試料，Ｒ…試薬，Ｗ…混合溶液，Ｂｍ…光
◎実施の形態の概要
　図１は本発明が適用された実施の形態に係るゲル粒子測定装置の概要を示す説明図である。
　同図において、ゲル粒子測定装置は、ゲル化反応によって試料Ｓ中の目的物質を粒子化して測定するものであって、一方から他方にかけて光が透過する透過部を少なくとも有し、測定対象である目的物質が含まれる試料Ｓ及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬Ｒが含まれる溶液を収容する試料セル１と、この試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液Ｗを撹拌する撹拌手段２と、前記試料セル１の透過部の外部に設けられ、前記試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光Ｂｍを照射させるコヒーレント光源３と、前記試料セル１の透過部の外部で前記コヒーレント光源３の反対側に設けられ、前記試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ中を透過した光Ｂｍを検出する透過光検出手段４と、この透過光検出手段４の検出出力に基づいて透過光の変動成分を計測する透過光変動計測手段５と、この透過光変動計測手段５の計測結果に基づいて前記混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液Ｗ内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段６とを備えたものである。
　このような技術的手段において、本件の目的物質は、所定の試薬との間でゲル化反応し、ゲル粒子が生成されるものであれば広く含む。例えばエンドトキシンやβ－D－グルカンが挙げられ、この場合の所定の試薬としてはリムルス試薬が挙げられる。
　また、試料セル１は、全てが透過性部材で構成されていてもよいが、これに限られるものではなく、光Ｂｍが透過する部分に少なくとも透過部を有していればよい。
　また、測定条件を一定に保つという観点からすれば、この試料セル１は恒温槽８内に設けられる態様が好ましい。
　更に、撹拌手段２としては、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗに対して撹拌作用を与えるものであれば広く含み、内蔵して直接的に撹拌する態様は勿論のこと、エアによる撹拌作用を与えたり、振盪による撹拌作用を与えるなど適宜選定して差し支えない。
　ここで、撹拌手段２の撹拌の程度は、試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するものであることを要する。
　特に、撹拌手段２による撹拌動作を確実に行うという観点からすれば、試料セル１は、セル容器内に試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗが直接撹拌可能な撹拌手段２を内蔵したものであることが好ましい。
　更にまた、コヒーレント光源３はコヒーレントな光を照射するものであればレーザ光源によるレーザ光に限られず、例えばナトリウムランプの光のような単色光をピンホールに通すことによっても作成可能である。
　また、透過光検出手段４としては、コヒーレント光源３からの光のうち試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液中を透過する透過光を主として検出するものであればよい。この場合、ゲル粒子で散乱した散乱光の一部が迷光として透過光検出手段４に検出される可能性があるが、検出出力の大部分が透過光成分であることから、迷光成分が一部に含まれていてもよいし、迷光成分による影響を回避するという観点からすれば、迷光成分について除去する手法を採用したり、あるいは、透過光変動計測手段５にて補正する等してもよい。
　ここで、迷光成分について除去する手法としては、透過光検出手段４と試料セル１との間には、ゲル粒子で散乱した位相のずれた散乱光のうち透過光検出手段４に向かう成分が除去される散乱光除去手段７を備えている態様が好ましい。この散乱光除去手段７としては、散乱光成分をカットして透過光成分のみを通過させる偏光フィルタが挙げられる。
　更に、透過光変動計測手段５としては、透過光検出手段４の検出出力に基づいて透過光の変動成分を計測するものであればよく、例えば検出出力を平均化又はスムージングすると共にフィルタリング化する手法が挙げられる。
　更にまた、ゲル粒子生成判別手段６としては、前記混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液Ｗ内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するものを広く含む。
　そして、「ゲル粒子の生成状態を判別する」とは、ゲル粒子の生成状態に関する情報を直接判別することは勿論、ゲル粒子の生成状態に基づいて判別可能な情報（例えば目的物質の定量情報）を判別することも含むものである。
　ここで、ゲル粒子の生成状態とは、ゲル粒子の生成開始（出現）時点、生成過程の変化、生成終了時点、生成量などを広く含むものであるため、本件では、前記混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相転移するタイミングが少なくとも含まれていれば、他の事項を含んでいても差し支えない。
　特に、ゲル粒子の生成開始時点を判別するには、透過光変動計測手段５の計測結果に基づいて透過光の変動変位が安定状態から不安定状態に変化する変化点をゲル粒子の出現タイミングとして判別するようにすればよい。
　更にまた、透過光変動計測手段５による計測結果を目視するという観点からすれば、透過光変動計測手段５による計測結果が表示される表示手段９を備えていることが好ましい。
　次に、図１に示すゲル粒子測定装置の作動について説明する。
　先ず、ゲル化反応を図２（ａ）に模式的に示す。
　同図において、試料Ｓの目的物質Ｓｔに対し特異的に反応する試薬Ｒが存在すると、試料Ｓ中の目的物質Ｓｔの濃度に依存した割合にて、その目的物質Ｓｔが試薬Ｒと特異的に反応する現象が起こる。この反応過程において、試薬Ｒは、目的物質Ｓｔの刺激を受けて所定の因子が活性化し、これに起因して所定の酵素が活性化するタイミングで例えば水溶性のタンパク質が酵素による分解反応にて不溶性のタンパク質に転換し、ゲル粒子Ｇの出現に至ることが起こる。
　より具体的には、エンドトキシンを例に挙げて、エンドトキシンのゲル化反応過程を模式的に示すと、図３の通りである。
　同図において、（１）に示すエンドトキシンの刺激がリムルス試薬に伝わると、先ず（２）に示すように、因子Ｃ（Factor C）が活性化されて活性化因子Ｃ（Activated Factor C）となり、次いで、活性化因子Ｃの作用により、（３）に示すように、因子Ｂ（Factor B）が活性化されて活性化因子Ｂ（Activated Factor B）になる。この後、活性化因子Ｂの作用により、（４）に示すように、Pro-Clotting酵素がClotting酵素になり、（５）に示すように、このClotting酵素がCoagulogen（水溶性タンパク質）を分解してCoagulin（不溶性タンパク質）に生成する。このCoagulin（不溶性タンパク質）は撹拌により全体のゲル化が阻害されるとゲル粒子Ｇとして出現し、静置すると（６）に示すように、重合化・ゲル化する。
　つまり、試料Ｓの目的物質Ｓｔがエンドトキシンである場合には、混合溶液Ｗに対して一定の撹拌状態を与えることで混合溶液Ｗ全体のゲル化を阻害しつつ、この状態で、リムルス試薬Ｒにエンドトキシンの刺激が伝わると、Clotting酵素の周りにCoagulin（不溶性タンパク質）のゲル粒子Ｇを産出させることが可能であり、Coagulin（不溶性タンパク質）がゲル粒子Ｇとして生成された後に、ゲル粒子Ｇが順次生成される反応過程を経ることが理解される。
　また、リムルス試薬Ｒにエンドトキシンの刺激が伝わる速度（リムルス反応速度）はエンドトキシン濃度に依存的であり、エンドトキシン濃度が高い程リムルス反応速度が速く、Coagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの出現タイミングが早いことが見出された。
　よって、透過光変化を精度良く検出するようにすれば、ゲル粒子Ｇの生成開始点として前記Coagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの出現タイミングを把握することは可能であり、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置の測定原理の基本である。
　このようなゲル粒子測定装置の測定原理は、例えば従前のゲル化法や比濁時間分析法の測定原理（リムルス試薬Ｒによる反応過程において、静置した条件下、活性化された酵素の影響で最終的にゲル化するに至り、このゲル化した状態を濁度により測定する態様）とは全く相違するものである。
　ここで、ゲル粒子測定装置の測定原理を図２（ｂ）に模式的に示す。
　本実施の形態のゲル粒子測定装置では、図２（ｂ）の工程Ｉに示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子がない場合（混合溶液Ｗがゾル相である場合に相当）には、図示外のコヒーレント光源から透過光Ｂｍ１はゲル粒子によって遮られることがないため、その透過光Ｂｍ１の透過光度は略一定に保たれる（図２（ｃ）Ｉ工程Ｐ１参照）。
　そして、図２（ｂ）の工程IIに示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇが生成開始し始めた場合（混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相転移し始めた場合に相当）、例えばエンドトキシンの場合のCoagulin（不溶性タンパク質）のゲル粒子Ｇが産出し始めると、図示外のコヒーレント光源から透過光Ｂｍ２は産出されたCoagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの存在によって一部遮られるため、その透過光Ｂｍ２の透過光度は略一定のレベルから減衰傾向に変化しようとする（図２（ｃ）II工程Ｐ２参照）。
　この後、図２（ｂ）の工程IIIに示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇの生成が次第に進行していく場合には、図示外のコヒーレント光源から透過光Ｂｍ３は順次生成される多くのゲル粒子Ｇの存在によって遮られるため、その透過光Ｂｍ３の透過光度は減衰変化点Ｐ２を境に順次減衰していく（図２（ｃ）III工程Ｐ３参照）。
　上述した実施の形態では、混合溶液Ｗを透過する透過光の変動成分に基づいて、混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながるゲル粒子の生成状態を少なくとも判別する態様が示されている。
　しかしながら、上述した作用は混合溶液Ｗの透過光において顕著に生ずるが、透過光以外の散乱光によっても生ずることが判明した。
　この点を加味すると、図１に示す実施の形態に係るゲル粒子測定装置としては、ゲル化反応によって試料Ｓ中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定装置であって、光が透過する透過部を少なくとも有し、測定対象である目的物質が含まれる試料Ｓ及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬Ｒが含まれる溶液を収容する試料セル１と、この試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液Ｗを撹拌する撹拌手段２と、前記試料セル１の透過部の外部に設けられ、前記試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光を照射させるコヒーレント光源３と、前記試料セル１の透過部の外部で前記コヒーレント光源３とは異なる部位に設けられ、前記試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗ中を通過した光を検出する通過光検出手段（図示せず）と、この通過光検出手段の検出出力に基づいて通過光の変動成分を計測する通過光変動計測手段（図示せず）と、この通過光変動計測手段の計測結果に基づいて前記混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液Ｗ内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段６とを備えたものが挙げられる。
　本態様においては、試料セル１内の混合溶液Ｗ中を通過する通過光のうち、通過光検出手段による検出対象となる通過光は、透過光に限らず、散乱光をも含む。
　また、本態様において、ゲル粒子生成判別手段６の代表的態様としては、通過光変動計測手段の計測結果に基づいて通過光の変動変位が安定状態から変化し始める変化点をゲル粒子の出現タイミングとして判別するものが挙げられる。
　更に、通過光検出手段が通過光として散乱光を検出する態様で好ましい態様としては、コヒーレント光源３は、試料セル１の中心寄りを通過するように混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光を照射し、通過光検出手段は、試料セル１内の混合溶液Ｗ内を通過するコヒーレント光源３からの光のうち散乱光を検出するようにすればよい。
　ここで、通過光検出手段としては、散乱光を検出する位置であれば任意の位置に設置して差し支えないが、散乱光度を十分に確保でき、かつ、設置の容易性を考慮すると、試料セル１を挟んでコヒーレント光源３の反対側領域に設置する態様が好ましい。
　更にまた、通過光検出手段が通過光として透過光及び散乱光を検出する態様で好ましい態様としては、コヒーレント光源３は、試料セル１の中心寄りを通過するように混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光を照射し、通過光検出手段は、試料セル１内の混合溶液Ｗ内を通過するコヒーレント光源３からの光のうち透過光及び散乱光を検出するようにすればよい。
　ここで、通過光検出手段としては、透過光及び散乱光を検出する位置であれば任意の位置に設置して差し支えないが、散乱光度を十分に確保でき、かつ、設置の容易性を考慮すると、試料セル１を挟んでコヒーレント光源３の反対側領域に透過光検出手段４と共に設置する態様が好ましい。
　以下、添付図面に示す実施の形態に基づいてこの発明をより詳細に説明する。
◎実施の形態１
　本実施の形態１に係るゲル粒子測定装置は、図４（ａ）（ｂ）に示すように、例えば試料Ｓの目的物質としてのエンドトキシンの濃度をリムルス試薬を用いたゲル化反応にて測定するものである。
　同図において、符号１０は例えば透明性樹脂材料又はガラス材料にて一体的に成形された試料セルであり、エンドトキシンを含む試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを収容するものである。
　ここで、本実施の形態では、試料セル１０は例えば上部が開口し且つ横断面円形の有底の筒体からなり、例えば測定ステージの開閉蓋（図示外）の開閉動作によって上部開口を開閉するようになっている。
　また、本実施の形態では、試料セル１０は、恒温槽１５内に配置されて試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液からなる混合溶液Ｗを一定の恒温環境（例えば３７℃）下におき、測定条件を一定にするようになっている。
　また、符号２０は試料セル１０内の混合溶液Ｗを撹拌する撹拌装置であり、例えば混合溶液Ｗに対して一定の撹拌状態を与え、混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するようになっている。
　特に、本例では、撹拌装置２０は、試料セル１０内の底壁に内蔵された磁性体からなる撹拌棒（スターラーバー）２１と、試料セル１０の底壁外部に設けられ且つ前記撹拌棒２１に対して磁力による撹拌力を作用させる撹拌駆動源（マグネチックスターラー）２２とを備えている。
　更に、符号３０は試料セル１０の側周壁の一方側に設けられ且つコヒーレントな光を照射するレーザ光源であり、４０は試料セル１０を挟んでレーザ光源３０の反対側に設けられてレーザ光源３０からの透過光Ｂを検出する透過光検出器である。この透過光検出器４０としては例えばフォトダイオードなどの光学部品を広く用いることができる。
　本実施の形態では、レーザ光源３０からのコヒーレントな光Ｂｍは、図４（ｂ）に示すように、試料セル１０の略直径部分を横切る経路に沿って照射されており、その光径は生成されるゲル粒子径（例えば０.５～２０μｍ程度）に対して十分に大きい値（例えば１ｍｍ程度）に設定される。
　一方、透過光検出器４０はレーザ光源３０からの透過光Ｂｍの光束領域を検出可能な検出面を有し、透過光検出器４０の検出精度は、透過光Ｂｍの通過面積内に存在する１ないし数個のゲル粒子の有無による透過光量変化を検出可能な程度に設定される。
　更に、本実施の形態では、試料セル１０と透過光検出器４０との間に偏光フィルタ５０が配設されている。この偏光フィルタ５０は、レーザ光源３０からの光Ｂｍのうち混合溶液Ｗ内にて生成されたゲル粒子Ｇによって散乱した散乱光で透過光検出器４０に向かう成分の迷光を除去するものである。この偏光フィルタ５０による迷光除去原理は、レーザ光源３０からのコヒーレントな光Ｂｍがゲル粒子Ｇで散乱すると、その散乱光の位相がずれることを利用し、透過光Ｂｍの位相以外の位相成分の迷光成分をカットするようにしたものである。
　尚、レーザ光源３０、透過光検出器４０と試料セル１０との間には光路や照射光径を決定する上で必要に応じて集光レンズ、ミラー等の光学部品を配置してもよいことは勿論である。
　符号６０は透過光検出器４０からの検出出力を取り込み、例えば図５に示すデータ解析処理を実行するデータ解析装置、７０はデータ解析装置６０で解析された解析結果を表示するディスプレイである。
　このデータ解析装置６０はＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、Ｉ／Ｏインターフェースなどを含むコンピュータシステムにて構成されており、例えばＲＯＭ内に図５に示すデータ解析処理プログラムを予め格納しておき、透過光検出器４０からの検出出力に基づいてＣＰＵにてデータ解析処理プログラムを実行するものである。
　尚、透過光検出器４０からの検出出力は例えば図示外の増幅器により電流電圧変換された後、ＡＤ変換器によりＡＤ変換され、データ解析装置６０に取り込まれる。
　次に、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置の作動について説明する。
　本実施の形態において、図４（ａ）（ｂ）に示すゲル粒子測定装置の試料セル１０にエンドトキシンを含む試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒを投入した後、測定ステージの図示外の開閉蓋を閉じた後に図示外のスタートスイッチをオン操作し、ゲル粒子測定装置による測定シーケンスが開始される。
　この測定シーケンスは、撹拌装置２０にて試料セル１０内の試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを撹拌する。このため、混合溶液Ｗ全体としてはゲル化することが抑制される。
　更に、測定シーケンスは、レーザ光源３０から光Ｂｍを照射し、試料セル１０内の混合溶液Ｗを通過した透過光Ｂｍを透過光検出器４０にて検出すると共に、透過光検出器４０の検出出力をデータ解析装置６０に取り込む。
　一方、試料セル１０内では、リムルス試薬Ｒにエンドトキシンの刺激が伝わり、図３に示すようなリムルス反応が起こり、混合溶液Ｗ全体のゲル化が抑制された状態で、ゲル粒子Ｇが順次生成されていく。
　本実施の形態では、レーザ光源３０からの光Ｂｍの通過面積内にゲル粒子Ｇが例えば１個生成されたタイミングがゲル粒子Ｇの生成開始点として把握されており、透過光の減衰変化点のタイミングになるものである。
　このような反応過程において、データ解析装置６０は、例えば図５に示すように、透過光検出器４０からの検出出力を透過光量データ（デジタルデータ）として読み込んだ後、平均化・フィルタリング化処理を行って透過光量データの変動成分を計測する。
　次いで、透過光量データの変動成分に基づいて透過光の減衰変化点（図２のＰ２に相当）を抽出し、予め規定されている検量線を参照することによって試料Ｓのエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）を決定し、ディスプレイ７０に表示する。
　本例では、検量線は、エンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）と透過光の減衰変化点に至るまでの時間閾値との関係を示すものであり、透過光の減衰変化点の時間と検量線との相関に基づいてエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）が決定される。また、ディスプレイ７０にはエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）以外に、透過光量データの時系列データ、透過光量データの変動成分の時系列計測データなどのデータが切り換え表示されるようになっている。
　尚、検量線の作成法については後述する実施例にて具体例を示す。
　このように、本実施の形態においては、ゲル粒子測定装置は、試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを所定の恒温環境下で撹拌し、混合溶液Ｗ中に産生するCoagulin粒子からなるゲル粒子Ｇの出現によって透過光が一部遮られて減光することを検出し、ゲル化の開始時期を捉えようとするものである。
　特に、本例では、透過光検出器４０の検出精度を高感度にするため、レーザ光というコヒーレントで強い光を利用し、また、微細な変化を検出するために、低濃度での変化では特に散乱した迷光がCoagulin粒子からなるゲル粒子Ｇに当たって位相がずれることを利用し、偏光フィルタ５０にて迷光成分が除去されることから、透過光検出器４０にはレーザ光源３０からの透過光成分だけが入射することになり、その分、透過光変化が正確に検出される。
◎変形形態
　本実施の形態では、試料セル１０は例えば測定ステージの開閉蓋にて上部開口を開閉するようにしているが、これに限られるものではなく、例えば試料セル１０のセル容器内に撹拌棒２１及びリムルス試薬Ｒを予め収容し、上部開口を図示外の密閉部材で密閉するようにしてもよい。このような試料セル１０は、ゲル粒子測定装置の付属品や測定キットとしてユーザーに供給するようにすればよい。
　また、本態様の試料セル１０への試料Ｓの導入法としては、例えば密閉部材に注射針のような穿孔具にて穿孔し、この穿孔を通じて試料Ｓを注入するようにしたものが挙げられる。更に、試料Ｓの導入を容易に行うため、試料セル１０内が大気圧に対して所定の負圧レベルを保つように密閉部材の密閉仕様を設定してもよい。
　また、本実施の形態では、一検体（試料Ｓ）分の試料セル１０に対するゲル粒子測定装置を示しているが、複数の検体（試料）を同時に処理するという要請下では、例えば複数の試料セルを一体化したマルチ試料セルを用意し、各試料セルに対応して夫々レーザ光源３０、透過光検出器４０を配置し、複数の検体（試料）を同時に測定できるようにすればよい。
　更に、実施の形態１では、測定対象の物質をエンドトキシンとするものが開示されているが、これに限られるものではなく、例えば同じ測定ハードウェアで、かつ、同様ないしは類似のリムルス試薬を用い、測定対象の物質をβ－D－グルカンとすることも可能である。
　また、反応により粒子あるいは粒子の重合が生じる物質の反応を、鋭敏に測定する事も可能である。
◎実施の形態２
　図６（ａ）（ｂ）は実施の形態２に係るゲル粒子測定装置の要部を示す。
　同図において、実施の形態２に係るゲル粒子測定装置は、試料セル１０内にエンドトキシンを含む試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒを収容し、これらの混合溶液Ｗを撹拌装置２０（撹拌棒２１，撹拌駆動源２２）にて撹拌すると共に、レーザ光源３０からの光Ｂｍ’を混合溶液Ｗ内に照射し、リムルス反応にて生成されるゲル粒子Ｇにて側方に散乱した散乱光の一部を散乱光検出器１４０にて検出し、この散乱光検出器１４０の検出出力をデータ解析装置６０に取り込み、ゲル粒子Ｇの産生時期を演算処理するものである。
　この実施の形態２に係るゲル粒子測定装置によれば、もともと散乱光は透過光に比べて割合が少なく、その一部しか計測できないため、出来る限り散乱光の減衰を抑えることが必要になる。そこで、この実施の形態２にあっては、散乱光の減衰を防ぐために、厳密な光学回路が必要で、図６（ｂ）に示すように、試料セル１０の混合溶液Ｗの表面で直角な位置関係となる入射、散乱反射角度を得るようにレーザ光源３０及び散乱光検出器１４０を設置し、散乱光を計測することが必要である。このため、試料セル１０も減衰の少ない容器厚ｋの薄い特殊な容器構造を採用したり、また、レーザ光源３０、散乱光検出器１４０の設置精度を極めて高く設定するように留意することが必要である。
　この点、実施の形態１では、透過光成分は多くもともと確保することができるばかりか、試料セル１０の容器構造として特に特殊な構造を施さずに、容器厚の厚い丈夫なものを使用することができ、また、試料セル１０に対するレーザ光源３０、透過光検出器４０の設置も試料セル１０の略直径方向に向けて直線上に対向させればよく、試料セル１０の交換に伴う設置精度をある程度ラフにすることも可能である。
◎実施の形態３
　図７（ａ）（ｂ）は実施の形態３に係るゲル粒子測定装置の要部を示す。
　同図において、実施の形態３に係るゲル粒子測定装置は、試料セル１０内にエンドトキシンを含む試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒを収容し、これらの混合溶液Ｗを撹拌装置２０（撹拌棒２１，撹拌駆動源２２）にて撹拌すると共に、試料セル１０の中心寄りを通過するようにレーザ光源３０からのレーザ光源３０からの光Ｂｍを混合溶液Ｗ内に照射し、リムルス反応にて生成されるゲル粒子Ｇにて試料セル１０を挟んでレーザ光源３０の反対側に向かって透過散乱した散乱光の一部を散乱光検出器１４０にて検出し、この散乱光検出器１４０の検出出力をデータ解析装置６０に取り込み、ゲル粒子Ｇの産生時期を演算処理するものである。
　本態様においては、試料セル１０の混合溶液Ｗがゾル相からゲル相に相転移する際にゲル粒子Ｇが生成されたとすると、散乱光検出器１４０にはゲル粒子Ｇの存在によって透過散乱した散乱光（正確には、透過光の進行方向とは異なる方向に散乱した光）の一部が検出される。ここで、散乱光検出器１４０の感度としては、散乱光は、ゲル粒子が生成されない場合には生じないもので、ゲル粒子が生成されることによって生ずるものであることから、ゲル粒子が生じ始めたときの散乱光レベルを感知できるものを選定しておけばよい。
　そして、散乱光検出器１４０にて検出された散乱光出力はデータ解析装置６０に取り込まれ、散乱光の変動成分に基づいて散乱光出力の立ち上がり変化点を判別し、立ち上がり変化点時期をゲル粒子Ｇの産生時期として演算するものである。
　また、本態様において、散乱光検出器１４０は少なくとも一つあればよいが、複数設置して検出出力を平均化したり、複数の散乱光検出器１４０のうち一つをゲル粒子Ｇの産生時期を判別するために使用し、他の散乱光検出器１４０を別のゲル粒子Ｇの生成状態判別のために使用するようにする等適宜選定して差し支えない。
　尚、本実施の形態では、散乱光検出器１４０は、図７（ｂ）に実線で示すように、試料セル１０を挟んでレーザ光源３０と反対側に設置されているが、図７（ｂ）に仮想線で示すように、例えば試料セル１０の周囲のうちレーザ光源３０位置に対して約９０度程度変位した部位に散乱光検出器１４０’を設置し、レーザ光源３０からの照射光Ｂｍのうち混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇにて側方に散乱した散乱光を散乱光検出器１４０’にて検出するようにしてもよいが、この側方散乱光成分は図７（ｂ）に実線で示す透過散乱光成分に比べてより少ないことから、散乱光検出器１４０に比べて散乱光検出器１４０’の感度をより高めることが好ましい。
◎実施の形態４
　図８（ａ）（ｂ）は実施の形態４に係るゲル粒子測定装置の要部を示す。
　同図において、実施の形態４に係るゲル粒子測定装置は、試料セル１０内にエンドトキシンを含む試料Ｓ及びリムルス試薬Ｒを収容し、これらの混合溶液Ｗを撹拌装置２０（撹拌棒２１，撹拌駆動源２２）にて撹拌すると共に、試料セル１０の中心寄りを通過するようにレーザ光源３０からのレーザ光源３０からの光Ｂｍを混合溶液Ｗ内に照射し、リムルス反応にて生成されるゲル粒子Ｇにて試料セル１０を挟んでレーザ光源３０の反対側に向かう通過光のうち、ゲル粒子Ｇを透過する透過光の一部を透過光検出器４０にて検出すると共に、透過光とは別にゲル粒子Ｇにて透過散乱した散乱光の一部を散乱光検出器１４０にて検出し、各光検出器４０，１４０の検出出力をデータ解析装置６０に取り込み、ゲル粒子Ｇの産生時期を演算処理するものである。
　本態様において、データ解析装置６０は、各光検出器４０，１４０からの検出出力を時間経過と共に演算してもよいし、あるいは、少なくともいずれかの検出出力については透過光度又は散乱光度に基づいて変化するパラメータ（例えば濁度）などに変換して演算してもよい。
　また、本態様においては、レーザ光源３０は一つでよく、各光検出器４０，１４０は少なくとも一つずつ設置されていればよいが、必要に応じて、各光検出器４０，１４０を複数設置するようにしてもよい。
　このような態様のゲル粒子測定装置によれば、透過光検出器４０からは透過光の変動成分が検出され、一方、散乱光検出器１４０からは散乱光の変動成分が検出されることから、データ解析装置６０は、各光検出器４０，１４０からの透過光又は散乱光の変動成分に基づいて試料セル１０の混合溶液Ｗ内におけるゲル粒子Ｇの産生時期を判別することができるが、両者のデータを加味することによりゲル粒子Ｇの産生時期をより正確に判別可能である。
　尚、本態様にあっては、両方の光検出器４０，１４０を用いてゲル粒子Ｇの産生時期を判別する態様に限られるものではなく、いずれか一方の光検出器４０又は１４０を用いてゲル粒子Ｇの産生時期を判別し、他方の光検出器１４０又は４０を用いてゲル粒子Ｇの産生時期以外のゲル粒子Ｇの生成状態を判別するようにしてもよい。また、散乱光を検出する散乱光検出器１４０については、実施の形態３と同様に、側方に散乱した散乱光を検出する散乱光検出器１４０’を用いるようにしてもよいことは勿論である。
◎実施例１
　本実施例は、実施の形態１に係るゲル粒子測定装置をより具現化したものである。
　ここで、実施例１の条件は以下の通りである。
・レーザ光源３０：赤色光又は緑色光
・透過光検出器４０：フォトダイオード
・撹拌棒（スターラーバー）２１の回転数：１０００rpm
・恒温条件：３７℃
　本実施例では、様々なエンドトキシン濃度（１０・１・０．１pg/ml）の試料を添加したときのリムルス試薬に対して、ゲル粒子測定装置で透過光度の変化を調べたものである。
　図７は、１０pg/mlは２回、１pg/ml、０．１pg/mlの夫々の時間経過を追った透過光度をプロットしたものである。
　同図において、各条件の透過光度の変化は、いずれも略一定のレベルを維持する部分がある時間になって減衰低下する傾向を示している。この透過光度の減衰変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による減光を意味するものと想定される。
　このゲル化開始時を求めるため、本実施例では、図７のグラフにおいて、マニュアルで、一定透過光度の部分を近似した直線と透過光度が減衰傾斜していく変化部分を近似した直線との交点を求め、夫々ゲル化開始時間（反応時間）ｔ１(10)、ｔ２(10)、ｔ(1)、ｔ(0.1)を求めた。
　本例では、１０pg/ml：ｔ１(10)＝１６（min.）
　　　　　　　　　　　 ｔ２(10)＝１９（min.）
　　　　　　　１pg/ml：ｔ(1)＝２８（min.）
　　　　　０．１pg/ml：ｔ(0.1)＝７０（min.）
であった。
　ちなみに、和光純薬工業株式会社製の比濁時間分析法を採用したエンドトキシンキット（ゲル化反応測定装置）を用い、エンドトキシン濃度とゲル化時間とを調べたところ、以下のような結果が得られた。
　エンドトキシン濃度（pg/ml）　　　　　 ゲル化時間（min.）
　　　　０．１　　　　　　　　　　　　　　１２３．７
　　　　０．５　　　　　　　　　　　　　　　５６．３
　　　　１．０　　　　　　　　　　　　　　　４１．８
　　　１０．０　　　　　　　　　　　　　　　１８．０
　更に、本実施例では、図７のグラフから求めたゲル化開始時間ｔ１(10)、ｔ２(10)、ｔ(1)、ｔ(0.1)の値を用いて検量線を作成するようにした。
　本実施例の検量線は、Ｘ軸をエンドトキシン濃度であるＥＴＸ濃度（log変換）、Ｙ軸をゲル化開始時間（log変換）とすると、直線関係が得られ、相関係数－０．９８０４という高い相関が示され、この検量線の有用性が証明される。
◎実施例２
　本実施例は、実施の形態４に係るゲル粒子測定装置を具現化したものである。
　ここで、実施例２の条件は以下の通りである。
・レーザ光源３０：青色，２０ｍＷ
・透過光検出器４０：フォトダイオード
・散乱光検出器１４０：フォトダイオード
・撹拌棒（スターラーバー）２１の回転数：１０００rpm
・恒温条件：３７℃
　本実施例は、所定のエンドトキシン濃度（１０pg/ml）の試料を添加したときのリムルス試薬に対して、透過光度及び散乱光度の変化を２回調べたものである。尚、本実施例では、透過光度については、透過光度に対応するパラメータとして濁度による演算結果が表示されるようになっており、散乱光度については、散乱光度に対応するパラメータとして散乱度による演算結果が表示されるようになっている。
　図１１（ａ）は、エンドトキシン濃度１０pg/mlの試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った透過光度に対応する濁度をプロットしたものである。
　図１１（ｂ）は、エンドトキシン濃度１０pg/mlの試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った散乱光度に対応する散乱度をプロットしたものである。
　図１１（ａ）によれば、透過光度に対応する濁度の変化は、略一定のレベルを維持する部分がある時間になって減衰低下する傾向を示している。この透過光度に対応する濁度の減衰変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による減光に伴う濁度低下を意味するものと想定される。
　一方、図１１（ｂ）によれば、散乱光度に対応する散乱度は、略一定レベルを維持する部分がある時間になって増加上昇する傾向を示している。この散乱度の増加変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による散乱に伴う散乱度増加を意味するものと想定される。
　尚、図１１（ｂ）に示す散乱光度に対応する散乱度の増加変化点は、図１１（ａ）に示す透過光度に対応する濁度の減衰変化点よりも若干遅れが見られるが、これは光検知器４０又は１４０に到達する透過光又は散乱光の到達時間差によるものと推測される。
◎実施例３
　本実施例は、実施例２と同様に、実施の形態４に係るゲル粒子測定装置を具現化したものである。
　ここで、実施例３の条件は実施例２と略同様であるが、レーザ光源３０が４０ｍＷの青色ダイオードが用いられている。
　本実施例では、様々なエンドトキシン濃度（１０・１・０．１・０．００１pg/ml）の試料を添加したときのリムルス試薬に対して、ゲル粒子測定装置で透過光度に対応する濁度及び散乱光度に対応する散乱度の変化を調べたものである。
　図１２（ａ）は、様々なエンドトキシン濃度の試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った透過光度に対応する散乱度をプロットしたものである。
　図１２（ｂ）は、様々なエンドトキシン濃度の試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った散乱光度に対応する濁度をプロットしたものである。
　ここで、図１２（ａ）によれば、各エンドトキシン濃度の試料について透過光度に対応する濁度の変化は、略一定のレベルを維持する部分がある時間になって減衰低下する傾向を示している。この透過光度に対応する濁度の減衰変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による減光に伴う濁度低下を意味するものと想定されるが、各透過光度に対応する濁度の減衰変化点（ゲル粒子の生成開始点）は、エンドトキシン濃度が高い程早いことが理解される。
　一方、図１１（ｂ）によれば、各エンドトキシン濃度の試料について散乱光度に対応する散乱度は、略一定レベルを維持する部分がある時間になって増加上昇する傾向を示している。この散乱度の増加変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による散乱に伴う散乱度増加を意味するものと想定されるが、各散乱度の増加変化点（ゲル粒子の生成開始点）は、エンドトキシン濃度が高い程早いことが理解される。
　そして、これらの結果から、実施例１で示したのと略同様にしてゲル化開始点であるゲル化開始時間を用いて検量線を作成することが可能である。この場合、透過光、散乱光の変動成分を両方考慮してゲル化開始点を判別するようにすれば、ノイズ等による外乱を排除することが可能になり、その分、ゲル化開始点の判別がより正確に為される。
◎実施例４
　本実施例は、実施例３と同様に、実施の形態４に係るゲル粒子測定装置を具現化したものであるが、実施例３と異なり、レーザ光源が４０ｍＷの赤色ダイオードが用いられている。尚、本実施例の条件は実施例３と略同様である。
　本実施例では、実施例３と同様に、様々なエンドトキシン濃度（１０・１・０．１・０．００１pg/ml）の試料を添加したときのリムルス試薬に対して、ゲル粒子測定装置で透過光度に対応する濁度及び散乱光度に対応する散乱度の変化を調べたものである。
　結果を図１３（ａ）（ｂ）に示す。
　図１３（ａ）は、様々なエンドトキシン濃度の試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った透過光度に対応する濁度をプロットしたものである。
　一方、図１２（ｂ）は、様々なエンドトキシン濃度の試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った散乱光度に対応する散乱度をプロットしたものである。
　これらによれば、レーザ光源３０の差異はあるものの、実施例３と略同様な結果が得られ、上述した検量線などの作成に利用可能であることが確認された。
◎実施例５
　本実施例は、実施の形態３に係るゲル粒子測定装置（散乱光検出器１４０’を使用した態様）をより具現化したものである。
　本実施例は、実施例２の条件と略同様な条件を用い、所定のエンドトキシン濃度（１０pg/ml）の試料を添加したときのリムルス試薬に対して、側方散乱光度の変化を１回調べたものである。
　結果を図１４に示す。
　図１４は、エンドトキシン濃度１０pg/mlの試料をリムルス試薬に添加したときの時間経過を追った側方散乱光度をプロットしたものである。
　同図によれば、側方散乱光度も、略一定レベルを維持する部分がある時間になって増加上昇する傾向を示している。この散乱光度の増加変化点はゲル粒子の生成開始点（ゲル化開始時間）に相当し、ゲル化開始時による散乱に伴う光度増加を意味するものと想定される。
　本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシンやβ－D－グルカンなどを測定対象とするゲル粒子測定装置を始め、ゲル化反応によってゲル粒子が生成可能な目的物質又は既存粒子の重合が生ずる反応過程を測定対象とする測定装置に広く適用される。

Claims (13)

  1. 　ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定装置であって、
    　一方から他方にかけて光が透過する透過部を少なくとも有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、
    　この試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を撹拌する撹拌手段と、
    　前記試料セルの透過部の外部に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させるコヒーレント光源と、
    　前記試料セルの透過部の外部で前記コヒーレント光源の反対側に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液中を透過した光を検出する透過光検出手段と、
    　この透過光検出手段の検出出力に基づいて透過光の変動成分を計測する透過光変動計測手段と、
    　この透過光変動計測手段の計測結果に基づいて前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段とを備えたことを特徴とするゲル粒子測定装置。
  2. 　請求項１記載のゲル粒子測定装置において、
    　透過光検出手段と試料セルとの間には、ゲル粒子で散乱した位相のずれた散乱光のうち透過光検出手段に向かう成分が除去される散乱光除去手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  3. 　請求項１又は２記載のゲル粒子測定装置において、
    　ゲル粒子生成判別手段は、透過光変動計測手段の計測結果に基づいて透過光の変動変位が安定状態から不安定状態に変化する変化点をゲル粒子の出現タイミングとして判別するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  4. 　請求項１乃至３いずれかに記載のゲル粒子測定装置において、
    　コヒーレント光源はレーザ光源であることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  5. 　請求項１乃至４いずれかに記載のゲル粒子測定装置において、
    　試料セルは、セル容器内に試料及び試薬溶液が直接撹拌可能な撹拌手段を内蔵したものであることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  6. 　請求項１乃至５いずれかに記載のゲル粒子測定装置において、
    　試料セルは恒温槽内に設けられることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  7. 　請求項１乃至６いずれかに記載のゲル粒子測定装置において、
    　ゲル粒子生成判別手段による判別結果が表示される表示手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  8. 　請求項１乃至７いずれかに記載のゲル粒子測定装置において、
    　ゲル粒子生成判別手段は、ゲル粒子の生成状態に基づいて試料中の目的物質を定量するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  9. 　ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化して測定するゲル粒子測定装置であって、
    　光が透過する透過部を少なくとも有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、
    　この試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を撹拌する撹拌手段と、
    　前記試料セルの透過部の外部に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させるコヒーレント光源と、
    　前記試料セルの透過部の外部で前記コヒーレント光源とは異なる部位に設けられ、前記試料セル内の試料及び試薬溶液からなる混合溶液中を通過した光を検出する通過光検出手段と、
    　この通過光検出手段の検出出力に基づいて通過光の変動成分を計測する通過光変動計測手段と、
    　この通過光変動計測手段の計測結果に基づいて前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段とを備えたことを特徴とするゲル粒子測定装置。
  10. 　請求項９記載のゲル粒子測定装置において、
    　ゲル粒子生成判別手段は、通過光変動計測手段の計測結果に基づいて通過光の変動変位が安定状態から不安定状態に変化する変化点をゲル粒子の出現タイミングとして判別するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  11. 　請求項９記載のゲル粒子測定装置において、
    　コヒーレント光源は、前記試料セルの中心寄りを通過するように前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射し、
    　通過光検出手段は、試料セル内の前記混合溶液内を通過するコヒーレント光源からの光のうち散乱光を検出するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  12. 　請求項９記載のゲル粒子測定装置において、
    　コヒーレント光源は、前記試料セルの中心寄りを通過するように前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射し、
    　通過光検出手段は、試料セル内の前記混合溶液内を通過するコヒーレント光源からの光のうち透過光及び散乱光を検出するものであることを特徴とするゲル粒子測定装置。
  13. 　請求項１乃至１２いずれかに記載のゲル粒子測定装置において、
    　測定対象である目的物質がエンドトキシンであり、これをゲル化する試薬がリムルス試薬であることを特徴とするゲル粒子測定装置。
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