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WO2009116592A1 - Ｈｐｖに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキット - Google Patents

Ｈｐｖに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキット Download PDF

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WO2009116592A1
WO2009116592A1 PCT/JP2009/055337 JP2009055337W WO2009116592A1 WO 2009116592 A1 WO2009116592 A1 WO 2009116592A1 JP 2009055337 W JP2009055337 W JP 2009055337W WO 2009116592 A1 WO2009116592 A1 WO 2009116592A1
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WO
WIPO (PCT)
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primer
nucleic acid
hpv
base sequence
region
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2009/055337
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智子 岡
昌裕 梶田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
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Priority to JP2010503910A priority patent/JP5777338B2/ja
Priority to EP09722563.5A priority patent/EP2280077B1/en
Priority to CN200980110191.4A priority patent/CN101978075B/zh
Publication of WO2009116592A1 publication Critical patent/WO2009116592A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cancer cells caused by HPV, a method for determining whether or not a tissue is a tissue at a stage of advanced dysplasia or higher, and a primer set and kit used therefor.
  • HPV Human papillomavirus
  • HPV DNA has been detected from lesions of cervical cancer and cervical dysplasia, and tissues of oral cancer and pharyngeal cancer. Therefore, HPV infection is regarded as one of risk factors for cervical cancer, oral cancer and pharyngeal cancer. In most cases, the mode of HPV infection is a transient infection in which HPV spontaneously disappears from cells after a certain period of time from the establishment of the infection. However, 5 to 10% of HPV infections may be persistent infections that cause cervical cancer without HPV disappearance.
  • cervical dysplasia is a three-stage dysplasia that is mild, moderate, or high, depending on the degree of appearance of atypical cells in the epithelium as a stage before cancer cells are generated. It is classified. Further worsening from severe dysplasia, cervical dysplasia lesions are the stage at which cancer cells appear in the epithelium. And cervical dysplasia is divided into "in-epithelial cancer” where cancer cells are confined in the epithelium, and "micro-invasive squamous cell carcinoma” and "invasive squamous cell carcinoma” where cancer cells infiltrate from the epithelium to the subcutaneous tissue. proceed.
  • cytosine 5-position may be methylated among the bases constituting DNA.
  • This DNA methylation in higher eukaryotes functions as a mechanism for suppressing the expression of genetic information.
  • Patent Document 1 describes that the presence of cervical cancer cells is more strongly indicated when the HPV E6 region and LCR contained in the cervical cells of a patient are not methylated. Yes.
  • unmethylated E6 regions and LCRs may be detected from cells other than cervical cancer cells. Therefore, it is difficult to detect cancer cells caused by HPV with high accuracy from cells in the cervix of the patient by confirming only the methylation state of the E6 region and LCR.
  • Non-Patent Document 1 describes that in cervical cancer, the L1 region of HPV-18 is strongly methylated, but the LCR and E6 regions are not methylated.
  • the nucleotide sequence of a nucleic acid after treatment with bisulfite corresponding to HPV-18 genomic DNA is determined, and the methylation state is confirmed.
  • confirmation of DNA methylation by determination of the base sequence is time consuming and complicated. Therefore, it is difficult to easily detect cancer cells caused by HPV from a sample collected from a subject. Tolga Turan et al., Virology 349 (2006) 175-183 JP 2006-522607 A
  • the present invention (1) (A) preparing a sample containing DNA from a subject's cells; (B) converting the unmethylated cytosine in the DNA contained in the sample obtained in the step (A) into another base to obtain a converted sample; (C) A base sequence obtained by converting cytosine other than the CpG site into another base in the base sequence having the CpG site in the L1 region or L2 region of HPV and the converted sample obtained in step (B) A first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising: a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV; And (D) performing the nucleic acid amplification reaction for amplifying a nucleic acid comprising a continuous base sequence from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes, and Detecting cancer cells caused by HPV
  • Step to do Including the detection method according to (1), (3)
  • the step (A) is performed between step (a) and step (b).
  • (A1) further comprising subjecting the mixture obtained in step (a) to physical treatment to release DNA from the cells;
  • step (A) preparing a sample containing DNA from the tissue of a subject; (B) converting the unmethylated cytosine in the DNA contained in the sample obtained in the step (A) into another base to obtain a converted sample; (C) A base sequence obtained by converting cytosine other than the CpG site into another base in the base sequence having the CpG site in the L1 region or L2 region of HPV and the converted sample obtained in step (B) A first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising: a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV; And (D) performing the nucleic acid amplification reaction for amplifying a nucleic acid comprising a continuous base sequence from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes, and Based on the result of the nucleic acid amplification reaction in
  • Step A method for determining whether or not a tissue containing is a tissue at a stage of advanced dysplasia or higher, (5) The determination method according to (4), wherein the tissue is a cervical tissue, (6) a first primer that hybridizes to a nucleic acid having a base sequence in which a cytosine existing other than the CpG site in the base sequence having a CpG site in the L1 region or L2 region of HPV is converted to another base; A base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV, and a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base; Of the nucleic acid consisting of the base sequence of HPV genomic DNA in which unmethylated cytosine is converted to other bases, a continuous base sequence from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes A primer set for amplifying a nucleic acid comprising a nucleic acid a
  • Primer set (9) The primer set according to (6), wherein the other base is uracil or thymine, (10) The primer set according to (6), wherein the first primer and the second primer are primers for amplifying a nucleic acid by a polymerase chain reaction method, a strand displacement reaction method, a ligase chain reaction method or a transcription amplification method.
  • the primer set according to (6) A diagnostic kit for cancer caused by HPV, comprising an unmethylated cytosine converting agent that converts unmethylated cytosine in a nucleic acid into another base; (12) The diagnostic kit according to (11), wherein the unmethylated cytosine converting agent is bisulfite, (13) The diagnostic kit according to (11) above, wherein the cancer caused by HPV is cervical cancer, oral cancer or pharyngeal cancer, and (14) the primer set according to (6) above, The present invention relates to a diagnostic kit for a dysplasia stage, comprising an unmethylated cytosine converting agent that converts unmethylated cytosine in a nucleic acid into another base.
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of amplification products after nucleic acid amplification using each of the primer sets of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, and each analytical sample prepared from a normal tissue test and a cancer tissue sample. is there. It is a schematic diagram showing methylated CpG sites and unmethylated CpG sites in HPV18 genomic DNA incorporated into C4-1 cells.
  • the primer set of the present invention is a base in which a cytosine existing outside the CpG site in the base sequence having a CpG site (also referred to as “first base sequence”) in the L1 region or L2 region of HPV is converted to another base.
  • a second primer that hybridizes to a nucleic acid consisting of a base sequence converted to another base also referred to as a “fourth base sequence”
  • unmethylated cytosine corresponding to HPV genomic DNA Of the nucleic acid consisting of the converted base sequence, from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes Nucleic acid consisting of contiguous nucleotide sequence of a primer set for amplification of the nucleic acid amplification reaction.
  • the second base sequence is the base sequence of the nucleic acid after the nucleic acid consisting of the first base sequence is converted, except that the cytosine present in other than the CpG site is converted to another base. It is a sequence corresponding to the base sequence of 1.
  • the fourth base sequence is the base sequence of the nucleic acid after the nucleic acid consisting of the third base sequence is converted.
  • the fourth base sequence is the third base sequence except that all cytosines are converted to other bases. Corresponding sequence.
  • the primer set of the present invention is a first hybrid that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which a cytosine existing other than the CpG site in the base sequence having a CpG site in the L1 region or L2 region of HPV is converted to another base.
  • a primer and a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in the base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV.
  • HPV genomic DNA contained in cancer cells caused by HPV has cytosine at the CpG site in the L2 region or L1 region methylated, and cytosine at the CpG site in the LCR or E6 region is not methylated. Therefore, if the primer set of the present invention is used in a nucleic acid amplification reaction, a nucleic acid consisting of a base sequence in which unmethylated cytosine corresponding to genomic DNA of HPV causing canceration is converted to another base is specifically amplified. can do. Thereby, according to the primer set of this invention, the cancer cell resulting from HPV can be detected with high precision and simply. Therefore, according to the primer set of the present invention, cervical cancer, oral cancer and pharyngeal cancer can also be diagnosed with high accuracy and ease.
  • the primer set of the present invention when used in a nucleic acid amplification reaction, it consists of a base sequence in which unmethylated cytosine corresponding to HPV genomic DNA present in a lesion at a stage of high dysplasia or higher is converted to another base. Nucleic acids can be specifically amplified. Therefore, according to the primer set of the present invention, the stage of dysplasia can be diagnosed with high accuracy and ease. In addition, according to the primer set of the present invention, it is possible to determine whether or not the tissue is a tissue at a stage higher than or equal to highly dysplasia with high accuracy and ease.
  • the cancer cell resulting from HPV refers to a cell that has become cancerous due to HPV infection and a cell that has a high risk of becoming cancerous. More specifically, the cancer cells resulting from HPV refer to HPV-infected cells, cervical cancer cells, oral cancer cells or pharyngeal cancer cells that cause the development of cervical cancer, oral cancer or pharyngeal cancer.
  • the “stage higher than advanced dysplasia” is “high grade dysplasia” or a more severe stage according to the classification based on the “Cervical Cancer Handling Regulations 1997” by the Japanese Society of Obstetrics and Gynecology. It refers to a stage classified as “intraepithelial carcinoma”, “microinvasive squamous cell carcinoma” or “invasive squamous cell carcinoma”. If the tissue lesion is determined to be a lesion of these stages, the subject will most likely require treatment such as surgery, so determine whether the lesion is a stage of advanced dysplasia or higher. This is very important clinically.
  • lesions that are milder than “high dysplasia” are classified into lesions at the stage of “no epithelial abnormality”, “mild dysplasia”, or “moderate dysplasia”. If the lesion is a lesion at these stages, the subject is often followed without special treatment.
  • abnormal cells refer to atypical cells and cancer cells.
  • “atypical cell” refers to a cell that is not a cancer cell, but has nuclear abnormalities such as nuclei enlargement, increased chromatin, and irregular karyotype.
  • HPV-derived cancer cells have an HPV genome in which cytosine at the CpG site in the L2 region or L1 region is methylated and cytosine at the CpG site in the LCR or E6 region is not methylated.
  • Has DNA When HPV genomic DNA contained in the cancer cells caused by HPV is treated with an unmethylated cytosine converting agent that converts unmethylated cytosine into another base, cytosine at the CpG site in the L2 region or L1 region is: Although not converted to other bases, cytosine at the CpG site in the LCR or E6 region is converted to other bases.
  • the HPV genomic DNA treated with the unmethylated cytosine converting agent remains the base sequence of the dinucleotide consisting of cytosine and guanine in the L2 region or the L1 region CpG site. Only the nucleic acid in which cytosine at the CpG site in the LCR or E6 region is converted to another base can be amplified by a nucleic acid amplification reaction.
  • the first primer consists of a base sequence having a CpG site in the HPV L1 region or L2 region in which cytosine existing other than the CpG site is converted to another base. Hybridizes to nucleic acid. Then, the second primer hybridizes to a nucleic acid having a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the HPR LCR or E6 region.
  • a continuous region containing at least part of the L2 region or L1 region and part of the LCR or E6 region in HPV genomic DNA that causes canceration of HPV-infected cells A nucleic acid treated with an unmethylated cytosine converting agent corresponding to the DNA of can be amplified by a single nucleic acid amplification reaction.
  • HPV is an approximately 8 kb circular DNA virus.
  • HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, HPV82 etc. are mentioned, for example.
  • the HPV genome encodes an open reading frame (E1, E2, E4, E5, E6, and E7 regions) of an early gene encoding a nonstructural protein and a capsid protein. It has an open reading frame (L1 region and L2 region) of the late gene and a gene region of LCR.
  • the E1 region is a region involved in viral genome replication.
  • the E2 region is a region involved in the regulation of viral transcription.
  • the E5 region, E6 region, and E7 region are regions involved in canceration.
  • the E6 region is a region that encodes a protein that binds to p53, which is a tumor suppressor gene, and promotes the degradation of p53.
  • the E7 region is a region that encodes a protein that binds to Rb, which is a tumor suppressor gene, and inactivates Rb.
  • the L1 region and the L2 region are regions involved in capsid formation.
  • LCR Long control region
  • HPV genomic DNA is methylated at a predetermined CpG site among CpG sites in the genomic DNA by a DNA methylation mechanism in vivo.
  • cytosine at the CpG site in the L1 region and L2 region is methylated
  • cytosine at the CpG site in the LCR and E6 regions is methylated. It has not been.
  • Table 1 shows the state of methylation in the Lp region and L2 region of HPV genomic DNA contained in HPV-infected cells and the CpG sites of LCR and E6 regions.
  • HPV-infected cells 2 indicate cancer cells caused by HPV.
  • ⁇ indicates that cytosine at the CpG site is methylated
  • x indicates that cytosine at the CpG site is not methylated.
  • DNA methylation is detected at CpG sites in the L1 region and the L2 region in HPV in cervical cancer cells.
  • Table 1 methylation of DNA in the L1 region or L2 region may be observed even in HPV-infected cells that are not cancer cells caused by HPV. Therefore, in the detection of cancer cells caused by HPV, if only the methylation of L1 region or L2 region is used as an index, it may be difficult to differentiate between cancer cells caused by HPV and other HPV-infected cells. .
  • HPV infection Cell 1 may also be detected.
  • the CpG sites in the LCR and E6 regions are in an unmethylated state.
  • the CpG site in the LCR or E6 region may be in an unmethylated state. Therefore, when detecting cancer cells caused by HPV, if only the unmethylated state in the LCR or E6 region is used as an index, it may be difficult to differentiate cancer cells caused by HPV from other HPV-infected cells. .
  • HPV-infected cells 2 which are cancer cells caused by HPV shown in Table 1, but also HPV Infected cells 4 may also be detected.
  • the primer set of the present invention specifically amplifies a nucleic acid treated with an unmethylated cytosine converting agent corresponding to HPV genomic DNA contained in HPV-infected cells 2 shown in Table 1 by a nucleic acid amplification reaction. be able to. Therefore, by using the primer set of the present invention, it is possible to specifically detect HPV-infected cells 2 which are cancer cells caused by HPV among HPV-infected cells 1 to 4 shown in Table 1. An effect is produced.
  • primer hybridizes means that a primer hybridizes with a nucleic acid under stringent conditions.
  • the state where the primer is hybridized to the nucleic acid is a state where the primer is annealed with a complementary sequence in the nucleic acid in a state suitable for proceeding with the nucleic acid amplification reaction.
  • stringent conditions are those generally used by those skilled in the art when performing polynucleotide hybridization.
  • the stringent conditions are those under which the primer set of the present invention can hybridize with a nucleic acid having a desired base sequence in a nucleic acid treated with an unmethylated cytosine converting agent corresponding to HPV genomic DNA. If there is no particular limitation.
  • the stringency during hybridization is a function of temperature, salt concentration, primer chain length, GC content of the primer nucleotide sequence, and the concentration of chaotropic agent in the hybridization buffer.
  • the stringent conditions for example, the conditions described in Sambrook, J. et al.
  • other bases include uracil and thymine.
  • uracil when bisulfite is used as an unmethylated cytosine converting agent, unmethylated cytosine is converted to uracil. Moreover, this uracil is converted into thymine by a nucleic acid amplification reaction using the primer set of the present invention.
  • the first primer and the second primer are primers for amplifying a nucleic acid by a nucleic acid amplification method.
  • the first primer and the second primer are each preferably a primer for amplifying a nucleic acid by a polymerase chain reaction method, a strand displacement reaction method, a ligase chain reaction method or a transcription amplification method.
  • the polymerase chain reaction method can be performed by a conventional method.
  • the strand displacement reaction method include a LAMP method, an ICAN (registered trademark) method, and a SMAP method.
  • the transcription amplification method include the TAS method.
  • the primer set of the present invention can be prepared by a known method according to the type of nucleic acid amplification method to be used. More specifically, first, with respect to the base sequence of the L1 region or L2 region and the base sequence of the LCR or E6 region, a base sequence after treatment with an unmethylated cytosine converting agent is predicted. Then, from the predicted base sequence, using the commercially available primer design software, etc., design the base sequence of each primer of the primer set of the present invention and synthesize each primer to produce the primer set of the present invention can do.
  • Examples of software for designing each primer of a primer set used for real-time PCR which is a polymerase chain reaction method, include GENETYX and primer3.
  • examples of software for designing each primer of a primer set used in the LAMP method, which is a strand displacement reaction method include Primer Explorer.
  • the present invention also includes a diagnostic kit for cancer caused by HPV (hereinafter also referred to as “diagnostic kit 1”).
  • the diagnostic kit 1 of the present invention is a kit containing the primer set described above and an unmethylated cytosine converting agent that converts unmethylated cytosine in a nucleic acid into another base.
  • any non-methylated cytosine in a nucleic acid may be converted to another base, and examples thereof include bisulfite.
  • examples of the bisulfite include sodium bisulfite.
  • the primer set described above is provided by being dissolved in a solvent such as a buffer suitable for stably holding the nucleic acid and enclosed in a container suitable for stably holding the nucleic acid.
  • a solvent such as a buffer suitable for stably holding the nucleic acid
  • the unmethylated cytosine converting agent is provided by being dissolved in a solvent suitable for dissolving the unmethylated cytosine converting agent and sealed in an appropriate container or the like.
  • Examples of the cancer caused by HPV to which the diagnostic kit 1 of the present invention can be applied include cervical cancer, oral cancer, and pharyngeal cancer.
  • cancer cells caused by HPV can be detected as described above.
  • the present invention also includes a method for detecting cancer cells caused by HPV.
  • the method for detecting cancer cells of the present invention comprises: (A) preparing a sample containing DNA from a subject's cells; (B) converting the unmethylated cytosine in the DNA contained in the sample obtained in the step (A) into another base to obtain a converted sample; (C) A base sequence obtained by converting cytosine other than the CpG site into another base in the base sequence having the CpG site in the L1 region or L2 region of HPV and the converted sample obtained in step (B) A first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising: a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV; And (D) performing the nucleic acid amplification reaction for amplifying a nucleic acid comprising a continuous base sequence from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes, and Detecting
  • a sample containing DNA is prepared from a subject's cells [step (A)].
  • a sample containing DNA from the subject's cells may be prepared by a known method or the like. Preparation of the sample containing the DNA is, for example, (A) mixing a solution containing a surfactant and a subject's cells to obtain a mixture; (B) subjecting the mixture obtained in step (a) to centrifugation to precipitate insolubles and obtaining a supernatant; and (c) fractionating the supernatant obtained in step (b). Step to do, Can be performed.
  • step (A) by performing these steps (a) to (c), DNA can be extracted from the subject's cells and a sample containing DNA can be prepared.
  • the step (A) includes a step of (a1) performing physical treatment on the mixture obtained in the step (a) to liberate DNA from the cells between the steps (a) and (b). May further be included.
  • the product obtained in the step (a1) is subjected to centrifugation to precipitate insoluble matter, and a supernatant is obtained.
  • the surfactant examples include sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium tetradecyl sulfate, sodium dodecyl sulfonate, sodium tetradecyl sulfonate, sodium cholate (CHO), sodium deoxycholate (DOC), sodium taurocholate, taurocholate, Examples include sodium deoxycholate, and sodium dodecyl sulfate (SDS) is particularly preferable.
  • the physical treatment may be any known method that physically disrupts cells, such as a method of disrupting cells with a homogenizer or a method of disrupting cells by shaking with a mixer. .
  • a commercially available kit for extracting DNA may be used.
  • the extracted DNA can be dissolved in water or a buffer and used as a DNA solution.
  • the water or buffer for dissolving DNA is preferably one that can stably hold the dissolved DNA.
  • Examples of the water and buffer for dissolving the DNA include PCR-grade water not containing nuclease, TE solution (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA), and the like.
  • the subject's cells may be cells that are targets of HPV infection or cells that are targets of HPV incubation.
  • the subject cell is not particularly limited. Examples include mucosal cells, skin cells, and the like. Examples of the mucous membrane include the mucous membrane of the luminal surface of luminal organs such as the urogenital, digestive, and respiratory organs. More specific mucous membranes include the mucous membrane of the cervix and the mucous membrane of the oral throat. Among the cells of the subject, cervical cells and oropharyngeal cells are preferred.
  • cancer cells caused by HPV causing cervical cancer, oral cancer, or pharyngeal cancer can be detected by using cervical cells or oral pharyngeal cells as test subject cells.
  • the cervical cells are cells that can be collected from the cervix of the subject (for example, the mucous membrane of the cervix).
  • Oropharyngeal cells are cells that can be collected from the oral pharynx of the subject (for example, the mucous membrane of the oropharynx).
  • step (B) unmethylated cytosine in the DNA contained in the sample obtained in step (A) is converted to another base [step (B)].
  • the conversion of unmethylated cytosine to other bases can be performed with the above-mentioned unmethylated cytosine converting agent.
  • bisulfite used as the unmethylated cytosine conversion agent, as described above, methylated cytosine is not converted, and unmethylated cytosine is converted to uracil.
  • the bisulfite include sodium bisulfite. Conversion of unmethylated cytosine to another base is obtained by adding 10 M sodium bisulfite solution to a sample containing DNA when using sodium bisulfite, which is a bisulfite salt, as an unmethylated cytosine converting agent. Can be performed by incubating the obtained mixture under appropriate temperature conditions.
  • a first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising: a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV; Is used to carry out a nucleic acid amplification reaction for amplifying a nucleic acid comprising a continuous base sequence from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes [step (C)].
  • step (C) a nucleic acid amplification reaction is performed using the converted sample, the first primer, and the second primer, so that it corresponds to the genomic DNA of HPV that causes canceration.
  • Nucleic acids in which unmethylated cytosine is converted to other bases can be specifically amplified. Therefore, according to the detection method of the present invention, cancer cells caused by HPV can be detected with high accuracy.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed by the polymerase chain reaction method, the strand displacement reaction method, the ligase chain reaction method or the transcription amplification method.
  • the polymerase chain reaction method is preferable.
  • cytosine at the CpG site in the L2 region or L1 region is methylated in the sample containing DNA treated with the above-mentioned unmethylated cytosine converting agent, and LCR
  • an amplified product is obtained. That is, when the HPV genomic DNA shown in the HPV-infected cell 2 of Table 1 is present in the sample containing the DNA of the subject's cells, an amplification product is obtained.
  • an amplification product cannot be obtained.
  • step (D) cancer cells caused by HPV are detected [step (D)].
  • an amplification product is obtained by the nucleic acid amplification reaction, it is determined that the subject has cancer cells caused by HPV. That is, the presence of the amplification product can be an indicator that a subject has persistently infected HPV.
  • an amplification product is not obtained by the nucleic acid amplification reaction, it is determined that the subject does not have cancer cells caused by HPV. In this case, the absence of the amplification product can be an indicator that the subject is not infected with HPV or is a transient infection even if HPV is infected.
  • cancer cells caused by HPV can be easily detected by confirming the presence of amplification products.
  • an amplification product has been obtained by the nucleic acid amplification reaction can be confirmed by a known method.
  • Such methods include, for example, agarose gel electrophoresis, a method in which a labeled probe is hybridized to the amplification product, and detection, and fluorescence is detected using an intercalator that can bind to double-stranded DNA (for example, SYBRGreen). And a method for detecting turbidity of by-products generated by nucleic acid amplification.
  • the present invention also includes a diagnostic kit at the stage of dysplasia (hereinafter also referred to as “diagnostic kit 2”).
  • the diagnostic kit 2 of the present invention is a kit containing the primer set described above and the unmethylated cytosine converting agent.
  • the primer set and the unmethylated cytosine converting agent described above are provided in the same form as the diagnostic kit 1 described above.
  • the tissue of a subject to which the diagnostic kit 2 of the present invention can be applied may be a tissue containing cells that are targets of HPV infection or cells that are targets of HPV incubation.
  • tissues collected from the cervix or the oropharyngeal region can be mentioned, and it is particularly preferable to apply to diagnose dysplasia of the tissue collected from the cervix.
  • the present invention also includes a method for determining whether or not a tissue is a tissue at a stage higher than advanced dysplasia.
  • the determination method of the present invention includes: (A) preparing a sample containing DNA from the tissue of a subject; (B) converting the unmethylated cytosine in the DNA contained in the sample obtained in the step (A) into another base to obtain a converted sample; (C) A base sequence obtained by converting cytosine other than the CpG site into another base in the base sequence having the CpG site in the L1 region or L2 region of HPV and the converted sample obtained in step (B) A first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising: a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV; And (D) performing the nucleic acid amplification reaction for amplifying a nucleic acid comprising a continuous base sequence from the site where the first primer hybridizes to the site where the second primer hybridizes, and Based on the result of the nu
  • a sample containing DNA is prepared from the tissue of a subject [step (A)].
  • a sample containing DNA from the subject's tissue may be prepared by a known method or the like.
  • the sample containing DNA from the tissue of the subject may be prepared by the same operation as the preparation of the sample containing DNA from the subject's cells in step (A) in the above-described method for detecting cancer cells caused by HPV. it can.
  • the tissue of the subject may be any tissue that includes cells that are targets of HPV infection or cells that are targets of HPV incubation.
  • Specific tissues of the subject include tissues collected from the subject's cervix and oral throat.
  • Step (B) and step (C) in the determination method of the present invention can be performed by the same operation as step (B) and step (C) in the above-described method for detecting cancer cells caused by HPV.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed using the converted sample obtained in step (B), the first primer, and the second primer. It is possible to specifically amplify a nucleic acid in which unmethylated cytosine corresponding to HPV genomic DNA present in the lesion at this stage is converted to another base. Therefore, according to the determination method of the present invention, it is possible to determine with high accuracy whether or not the tissue is a tissue at a stage higher than advanced dysplasia.
  • step (D) based on the result of the nucleic acid amplification reaction in the nucleic acid amplification step, it is determined whether or not the tissue is a tissue at a stage of advanced dysplasia or higher [step (D)].
  • an amplification product is obtained by the nucleic acid amplification reaction, it is determined that the tissue of the subject is a tissue at a stage of higher dysplasia or higher.
  • an amplification product is not obtained by the nucleic acid amplification reaction, it is determined that the tissue of the subject is not a tissue at a stage higher than that of advanced dysplasia.
  • the determination method of the present invention by confirming the presence or absence of an amplification product, it is easily determined whether or not the tissue is a tissue at a stage of advanced dysplasia or not, using the presence or absence of this amplification product as an index. can do.
  • Example 1 300 ⁇ L of 0.3 M sodium hydroxide solution was added to 1 ⁇ g of genomic DNA of SiHa cells, a cervical cancer-derived cell line in which the HPV16 genome was integrated into the chromosome, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 300 ⁇ L of 10 M bisulfite solution (10 M sodium bisulfite aqueous solution) was added and incubated at 80 ° C. for 40 minutes, whereby the genomic DNA was treated with bisulfite. DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a DNA purification kit [manufactured by Qiagen, trade name: Qiaquick PCR purification kit.
  • Sodium hydroxide was added to the purified DNA to a final concentration of 0.3 M and incubated at room temperature for 5 minutes. Thereafter, the obtained product was purified with a spin column for nucleic acid purification (manufactured by GE Healthcare, trade name: MicroSpin S-300 HR Columns) to obtain a sample for analysis.
  • a reagent for 2 ⁇ L of the sample for analysis, 2.5 ⁇ L of a reagent ( ⁇ 10 buffer) contained in a PCR reagent [manufactured by Takara Bio Inc., trade name: TaKaRa EX Taq (registered trademark) Hot Start Version], DNA polymerase [ Product name: TaKaRa Ex Taq HS (5 U / ⁇ L)] 0.125 ⁇ L and 2.5 mM dNTP mixture 2 ⁇ L, forward primer aqueous solution (10 ⁇ M) 1 ⁇ L, reverse primer aqueous solution (10 ⁇ M) 1 ⁇ L and water 16.38 ⁇ L are added. Thus, a reaction solution for PCR was prepared.
  • Table 2 shows the primer set consisting of the forward primer and reverse primer used and the PCR thermal profile.
  • PCR thermal profile (1) shows the conditions under which 40 cycles of reaction are performed with 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 40 seconds after incubation at 95 ° C. for 4.5 minutes. is there.
  • PCR thermal profile (2) performs a reaction of 40 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 53 ° C. for 15 seconds and 72 ° C. for 30 seconds after incubation at 95 ° C. for 4.5 minutes. It is a condition.
  • PCR was performed using the PCR reaction solution under PCR conditions according to the type of primer set.
  • the amplified product after PCR was incorporated into a vector contained in a TA cloning kit (manufactured by Invitrogen Corporation, trade name: TA cloning kit).
  • the resulting construct was used to transform E. coli (TOP10).
  • the transformed E. coli was treated with LB agar medium [composition: 1% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 1% (w / v) sodium chloride, 1.5% (w / v v) Agar] and cultured overnight at 37 ° C.
  • the obtained colonies of Escherichia coli were inoculated on an LB liquid medium and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the plasmid was purified using a plasmid extraction kit (manufactured by Sigma-Aldrich, trade name: GenElute Plasmid Miniprep Kit).
  • the base sequence of the amplification product incorporated in the obtained plasmid was determined by the BigDye terminator cycle sequencing method using a gene analysis system [manufactured by Applied Biosystems, trade name: ABI Prism 3100].
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing methylated CpG sites and unmethylated CpG sites in HPV16 genomic DNA incorporated into SiHa cells.
  • Test Example 1 Of the tissues of the cervix that have been confirmed to be infected with HPV16, normal tissues in which pathological dysplasia has not occurred and cancer tissues are sliced into thicknesses of 20 ⁇ m to obtain normal tissue samples and cancer tissue samples. Got. To each obtained tissue sample, 500 ⁇ L of a solution containing 1% (w / v) SDS and 0.1 M sodium hydroxide was added. The resulting mixture was incubated at 100 ° C. for 20 minutes. The mixture after incubation was centrifuged at 4 ° C., and the supernatant was collected.
  • nucleic acid purification kit [Qiagen, trade name: QIAquick PCR purification kit. Sodium hydroxide was added to the resulting nucleic acid so that the final concentration was 0.3M. The resulting mixture was then incubated for 5 minutes at room temperature. Thereafter, the obtained product was purified with a spin column for nucleic acid purification (manufactured by GE Healthcare, trade name: MicroSpin S-300 HR Columns) to obtain a sample for analysis.
  • a spin column for nucleic acid purification manufactured by GE Healthcare, trade name: MicroSpin S-300 HR Columns
  • a reagent (trade name: ⁇ 10 buffer) contained in a PCR reagent (Roche, trade name: FastStart Taq DNA polymerase), DNA polymerase [trade name: FastStart Taq DNA polymerase (5 U) 0.16 ⁇ L and 2.5 mM dNTP mixture 1.6 ⁇ L, forward primer aqueous solution (10 ⁇ M) 0.8 ⁇ L, reverse primer aqueous solution (10 ⁇ M) 0.8 ⁇ L, and water 10.64 ⁇ L, A reaction solution for PCR was prepared.
  • Table 3 shows the primer set consisting of the forward primer and reverse primer used and the PCR thermal profile.
  • the primer set of Example 1 consists of 16L1 / LCR-F which is a forward primer and 16L1 / LCR-R which is a reverse primer.
  • the 16L1 / LCR-F hybridizes with a portion corresponding to a L1 region containing a predetermined methylated CpG site in a bisulfite-treated nucleic acid corresponding to the genomic DNA of HPV16.
  • the 16L1 / LCR-R hybridizes with a portion corresponding to an LCR containing a predetermined unmethylated CpG site in a bisulfite-treated nucleic acid corresponding to the genomic DNA of HPV16.
  • nucleic acid obtained by treating bisulfite with HPV16 genomic DNA in which the cytosine at the CpG site in the L1 region is methylated and the cytosine at the CpG site in LCR is not methylated in the analysis sample When PCR is carried out using the primer set of Example 1, an amplification product is generated.
  • the primer set of Comparative Example 1 consists of 16L1Me1-F which is a forward primer and 16L1Me1-R which is a reverse primer.
  • the 16L1Me1-F and 16L1Me1-R hybridize with a portion corresponding to the L1 region containing a predetermined methylated CpG site in a bisulfite-treated nucleic acid corresponding to the genomic DNA of HPV16. That is, when the analysis sample contains a nucleic acid obtained by treating bisulfite with HPV16 genomic DNA in which cytosine at the CpG site in the L1 region is methylated, the primer set of Comparative Example 1 is used. When PCR is performed, an amplification product is generated.
  • the primer set of Comparative Example 2 consists of 16LCRUnMe1-F which is a forward primer and 16LCRUnMe1-R which is a reverse primer.
  • the 16LCRUnMe1-F and 16LCRUnMe1-R each hybridize with a portion corresponding to an LCR containing a predetermined unmethylated CpG site in a bisulfite-treated nucleic acid corresponding to HPV16 genomic DNA. That is, when the analytical sample contains a nucleic acid obtained by treating bisulfite with HPV16 genomic DNA in which cytosine at the CpG site of LCR is not methylated, PCR using the primer set of Comparative Example 2 As a result, an amplification product is generated.
  • PCR thermal profile (3) performs 45 cycles of reaction at 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 15 seconds and 72 ° C. for 30 seconds after incubation at 95 ° C. for 4.5 minutes. It is a condition.
  • PCR thermal profile (4) is a condition under which 45 cycles of reaction are carried out with 95 ° C. for 30 seconds, 63 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds after incubation at 95 ° C. for 4.5 minutes.
  • PCR thermal profile (5) is a condition under which 45 cycles of reaction are performed with 95 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds, after incubation at 95 ° C. for 4.5 minutes.
  • FIG. 3 shows the results of amplification products after nucleic acid amplification using each of the primer sets of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, and samples for analysis prepared from normal tissue samples and cancer tissue samples. It is an electropherogram.
  • panels (a) to (c) lane 1 shows an amplification product in the case of a nucleic acid obtained from a normal tissue sample
  • lane 2 shows an amplification product in the case of a nucleic acid obtained from a cancer tissue sample.
  • Panel (d) to (f) schematically show the methylated / unmethylated states of the gene region in the HPV16 genomic DNA corresponding to the nucleic acid to be amplified.
  • black circles schematically indicate the presence of methylated cytosine
  • white circles indicate the presence of unmethylated cytosine.
  • the nucleic acid corresponding to the continuous region up to the site where the primer in the nucleic acid hybridizes is the amplification target. Therefore, according to the primer set of Example 1, after bisulfite treatment corresponding to a continuous nucleic acid containing a predetermined L1 region and LCR in the genomic DNA of HPV16 contained in HPV-infected cells 2 shown in Table 1 above Only nucleic acids are amplified. As a result, according to the primer set of Example 1, it is possible to distinguish between a normal tissue sample and a cervical cancer tissue sample.
  • the first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosines other than the CpG site are converted to other bases
  • the CpG of HPV LCR It is suggested that cancer cells caused by HPV can be detected by using a primer set consisting of a second primer that hybridizes to a nucleic acid consisting of a base sequence in which cytosine is converted to another base in the base sequence having a site. It was.
  • Example 2 By analyzing the methylated CpG site and unmethylated CpG site in the HPV18 genome using the C4-1 cell, which is a cervical cancer-derived cell line in which the HPV18 genome is integrated into the chromosome, by the same operation as in Experimental Example 1. I did it. Specifically, C4-1 cell genomic DNA is used in place of SiHa cell genomic DNA, and the primer set and PCR thermal profile shown in Table 4 are used instead of the primer set and PCR thermal profile shown in Table 2. Except that the PCR reaction was carried out using profile (6), the same procedure as in Experimental Example 1 was performed to determine the base sequence of the amplified product.
  • PCR thermal profile (6) shows the conditions under which 40 cycles of reaction are performed with 95 ° C. for 30 seconds, 54 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 40 seconds after incubation at 95 ° C. for 4.5 minutes. is there.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing methylated CpG sites and unmethylated CpG sites in the genomic DNA of HPV18 incorporated into C4-1 cells.
  • black circles indicate methylated CpG sites
  • white circles indicate unmethylated CpG sites.
  • part in the figure shows the genome position in GenBank NC_001357 (sequence number: 16).
  • HPV18 integrated HPV18 integrated into the genomic DNA of C4-1 cells is similar to HPV16 (integrated HPV16) integrated into the genomic DNA of SiHa cells. It can be seen that the cytosine in the CpG site in the L1 region is methylated, and the cytosine in each of the CpG site in the LCR and the CpG site in the E6 region is not methylated. This result suggests that the use of the primer set of the present invention can detect an embedded HPV that causes cervical cancer regardless of the type of HPV.
  • tissue samples 14 types of paraffin blocks (hereinafter referred to as “surgical excision samples”) of cervical tissues that have been surgically removed from the subject and confirmed to be infected with HPV16, and scratched under colposcopy observation from the subject's cervix, Each of the seven types of paraffin blocks (hereinafter referred to as “biopsy samples”) of the cervical tissue confirmed to be infected with HPV16 was sliced to a thickness of 10 ⁇ m to obtain a tissue sample.
  • both the surgically-extracted sample and the biopsy sample include tissues that have been diagnosed as having a stage of dysplasia or higher by conventional histological diagnosis.
  • one sample for mild dysplasia CIN1
  • four samples for moderate dysplasia CIN2
  • four samples for severe dysplasia CIN3
  • cancer SCC
  • the biopsy samples there are two types of mild dysplasia (CIN1) samples, two types of severe dysplasia (CIN3) samples, and three types of cancer (SCC) samples.
  • a PCR reaction solution was prepared by performing the same operation as in Test Example 1 except that an analytical sample derived from a surgically removed sample was used as the analytical sample.
  • an analysis sample derived from a biopsy sample was used as an analysis sample, and a PCR reaction solution was prepared in the same manner as in Test Example 1 except that the amount of the analysis sample was 2 ⁇ L.
  • the primer set for the PCR reaction solution the primer set of Example 1 consisting of a primer consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 was used.
  • PCR conditions in the case of using the PCR reaction solution containing the analytical sample derived from the surgically removed sample are the same as the PCR thermal profile (3) in Table 3.
  • PCR conditions when a PCR reaction solution containing a sample for analysis derived from a biopsy sample is used are 95 ° C. for 4.5 minutes, 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. This is a condition for carrying out the reaction in 40 cycles.
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of amplification products after nucleic acid amplification using the primer set of Example 1 and each analytical sample prepared from a surgically-extracted sample and a biopsy sample.
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of amplification products after nucleic acid amplification using the primer set of Example 1 and each analytical sample prepared from a surgically-extracted sample and a biopsy sample.
  • lane 1 is a result of using a surgically-extracted sample of CIN3
  • lane 2 is a result of using a surgically-extracted sample of CIN2
  • lane 3 is a result of using a surgically-extracted sample of CIN1
  • lane 4 is As a result of using a surgically-extracted sample of CIN3, lane 5 was a result of using a surgically-extracted sample of CIN3, lane 6 was a result of using a surgically-extracted sample of SCC, and lane 7 was a surgically-extracted sample of SCC.
  • lane 8 is a result of using a surgically-extracted sample of SCC
  • lane 9 is a result of using a surgically-extracted sample of SCC
  • lane 10 is a result of using a surgically-extracted sample of CIN2
  • lane 11 is a result of using CIN2
  • lane 12 is a result of using a surgically-extracted sample of CIN2
  • lane 13 is a result of using a surgically-extracted sample of CIN3
  • lane 14 is a normal surgically-extracted sample.
  • lane 15 is a result of using a biopsy sample of CIN1
  • lane 16 is a result of using a biopsy sample of CIN1
  • lane 17 is a result of using a biopsy sample of CIN3
  • lane 18 is a result of using CIN3
  • lane 19 is the result of using the biopsy sample of SCC
  • Lane 20 is the result of using the biopsy sample of SCC
  • Lane 21 is the result of using the biopsy sample of SCC.
  • PC shows the result of using a nucleic acid obtained by treating bisulfite with genomic DNA of SiHa cells as an analysis sample
  • NC shows the result of using distilled water as an analysis sample.
  • Table 5 shows the results of analyzing the results of FIG. 5 based on the stage of dysplasia.
  • “L1-LCR positive” indicates a sample in which an amplification product was detected.
  • the ratio (%) of the number of L1-LCR positive samples to the total number of samples is shown in parentheses.
  • an analysis sample prepared from a tissue determined to be a tissue at a stage higher than advanced dysplasia (CIN3) by histological diagnosis When used, an amplification product is obtained at a high rate, but when an analytical sample prepared from a tissue determined to be a tissue at a stage of moderate dysplasia (CIN2) or less by histological examination is used, amplification is performed. It can be seen that the product yield is low. From this result, it can be seen that according to the primer set of Example 1, it is possible to determine whether or not the tissue obtained as a clinical specimen such as a surgically-extracted sample or a biopsy sample is a tissue at a stage of advanced dysplasia or higher.
  • Test Example 4 A paraffin block of cancerous tissue that was surgically removed from the subject and confirmed to be infected with HPV18, and a cervical region that was surgically removed from the subject and confirmed to be infected with HPV58 and was diagnosed to be CIN3 stage tissue. Paraffin block of tissue (surgically removed sample), as well as cervix from a patient who has been scratched under colposcopy from a subject's cervix, confirmed to be infected with HPV58, and diagnosed as CIN3 stage tissue Each sample for analysis was obtained by performing the same operation as in Test Example 2 using the paraffin block (biopsy sample) of the tissue.
  • a reagent for 2 ⁇ L of analysis sample, 1.5 ⁇ L of a reagent ( ⁇ 10 buffer) contained in a PCR reagent [manufactured by Takara Bio Inc., trade name: TaKaRa EX Taq (registered trademark) Hot Start Version], DNA polymerase [ Product name: TaKaRa Ex Taq HS (5 U / ⁇ L)] 0.075 ⁇ L and 2.5 mM dNTP mixture 1.2 ⁇ L, forward primer aqueous solution (10 ⁇ M) 0.6 ⁇ L, reverse primer aqueous solution (10 ⁇ M) 0.6 ⁇ L and water 9 0.025 ⁇ L was added to prepare a PCR reaction solution.
  • Table 6 shows a primer set composed of a forward primer and a reverse primer used for an analytical sample derived from a sample containing HPV18.
  • Table 7 shows a primer set composed of a forward primer and a reverse primer used for an analysis sample derived from a sample containing HPV58.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing methylated CpG sites and unmethylated CpG sites in the genomic DNA of HPV18 derived from a surgically removed sample.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing methylated CpG sites and unmethylated CpG sites in the genomic DNA of HPV58 derived from a surgically removed sample.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing methylated CpG sites and unmethylated CpG sites in HPV58 genomic DNA derived from a biopsy sample.
  • black circles indicate methylated CpG sites
  • white circles indicate unmethylated CpG sites.
  • the numerical value in the CpG site column indicates the genomic position in GenBank NC_001357 (SEQ ID NO: 16).
  • the numerical value in the CpG site column indicates the genomic position in GenBank NC_001443 (SEQ ID NO: 37).
  • HPV58 derived from cervical tissue derived from a patient diagnosed with CIN3 was confirmed to be cytosine at the CpG site in the L1 region. Is frequently methylated, and it can be seen that cytosine at the CpG site of LCR is hardly methylated.
  • a first primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which a cytosine existing other than the CpG site is converted to another base
  • a primer set comprising a second primer that hybridizes to a nucleic acid comprising a base sequence in which cytosine is converted to another base in a base sequence having a CpG site in the LCR or E6 region of HPV
  • the type of HPV it is suggested that HPV that causes the development of cervical cancer can be detected.
  • the primer set can determine whether or not the tissue obtained as a clinical specimen such as a surgically-extracted sample or a biopsy sample is a tissue at a stage of advanced dysplasia or higher.
  • Kits were prepared for the diagnosis of cancer caused by HPV or at the stage of dysplasia. An example is shown below.
  • Such a kit is composed of a nuclease-free container containing an aqueous solution of each primer of the following primer set and a nuclease-free container containing a bisulfite solution (10 M sodium bisulfite aqueous solution) that is an unmethylated cytosine converting agent.
  • Container 1 Forward primer aqueous solution (aqueous solution obtained by dissolving primer 16L1 / LCR-F consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in nuclease-free water)
  • Container 2 Reverse primer aqueous solution (aqueous solution obtained by dissolving primer 16L1 / LCR-F consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in nuclease-free water)
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 2 is the primer sequence.
  • SEQ ID NO: 3 is the primer sequence.
  • SEQ ID NO: 4 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 5 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 6 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 7 is the primer sequence.
  • SEQ ID NO: 8 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 10 is a primer sequence.
  • SEQ ID NO: 11 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 12 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 13 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 14 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 15 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 17 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 18 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 19 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 20 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 21 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 22 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 23 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 24 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 25 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 26 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 27 is the primer sequence.
  • SEQ ID NO: 28 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 29 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 30 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 31 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 32 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 33 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 34 is the sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 35 is the sequence of a primer.
  • SEQ ID NO: 36 is the sequence of a primer.

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Abstract

　ＨＰＶに起因する癌細胞の検出や組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を、高い精度で、かつ簡便に行なうことができるプライマーセット、方法、そのキットを提供する。プライマーセットとして、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外のシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを含むプライマーセットを用いる。

Description

ＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキット
　本発明は、ＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキットに関する。
　ヒトパピローマウイルス（以下、「ＨＰＶ」という）は、環状二本鎖ＤＮＡをゲノムとするウイルスであり、増殖性病変を誘発する。ＨＰＶは、１００種以上のサブタイプに分類されている。また、ＨＰＶのサブタイプは、共通する領域として、非構造タンパク質をコードするＥ１領域、Ｅ２領域、Ｅ４領域、Ｅ５領域、Ｅ６領域及びＥ７領域、キャプシドタンパク質をコードするＬ１領域及びＬ２領域、並びにＬＣＲを有していることが知られている。
　ＨＰＶのＤＮＡは、子宮頸癌や子宮頸部異形成の病変部、及び口腔癌や咽頭癌の組織から検出されている。そのため、ＨＰＶの感染は、子宮頸癌、口腔癌及び咽頭癌のリスクファクターの１つとされている。ＨＰＶの感染の様式は、ほとんどの場合、感染成立から一定期間後に細胞からＨＰＶが自然消失する一過性感染である。しかしながら、ＨＰＶの感染のうち５～１０％の感染は、ＨＰＶが消失せず、子宮頸癌を引き起こす持続感染となる場合がある。
　なお、子宮頸部の組織診では、子宮頸部異形成は、癌細胞が発生する前段階として、上皮内における異型細胞の出現の程度により、軽度、中等度又は高度の３段階の異形成に分類されている。高度異形成からさらに悪化すると、子宮頸部異形成の病変は、上皮内に癌細胞が出現する段階となる。そして、子宮頸部異形成は、癌細胞が上皮内に限局する「上皮内癌」、並びに癌細胞が上皮から皮下組織に浸潤する「微小浸潤扁平上皮癌」及び「浸潤扁平上皮癌」へと進行する。
　軽度異形成又は中等度異形成の病変は、特に治療を行なわずに経過観察されることがほとんどである。しかしながら、高度異形成の前駆病変を治療せずに放置すると、病変が浸潤癌に進行する可能性が高いので、高度異形成と判断された被験者には、手術等の治療を施すことが多い。よって、被験者の病変が高度異形成又はそれより重篤な段階であるか否かを判断することは、被験者に対する治療方法を決定するために、重要である。
　高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちシトシンの５位がメチル化されていることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。近年、ＨＰＶのゲノムＤＮＡにおけるメチル化の有無が、癌の発症に強く関係していることを示す報告がなされている。
　例えば、特許文献１には、患者の子宮頸部の細胞に含まれるＨＰＶのＥ６領域及びＬＣＲが、メチル化されていない場合、子宮頸癌の細胞の存在がより強く示されることが記載されている。しかしながら、メチル化されていないＥ６領域及びＬＣＲは、子宮頸癌細胞以外の細胞から検出される場合がある。そのため、Ｅ６領域及びＬＣＲのメチル化の状態のみを確認することで、患者の子宮頸部の細胞から、高い精度でＨＰＶに起因する癌細胞を検出することは困難である。
　また、非特許文献１には、子宮頸癌において、ＨＰＶ－１８のＬ１領域は、強くメチル化されているが、ＬＣＲ及びＥ６領域はメチル化されていないことが記載されている。ここで、非特許文献１では、ＨＰＶ－１８のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩で処理した後の核酸の塩基配列を決定し、そのメチル化の状態を確認している。しかしながら、塩基配列の決定によるＤＮＡのメチル化の確認は、時間がかかり、かつ操作が煩雑である。そのため、被験者から採取された試料から、簡便にＨＰＶに起因する癌細胞を検出することは困難である。
Tolga Turan et al., Virology 349 (2006) 175-183 特表２００６－５２２６０７号公報
　本発明は、高い精度で、かつ簡便に、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、ＨＰＶに起因する癌細胞の検出や組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を行なうことができるプライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、ＨＰＶに起因する癌を診断することができるキットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、異形成の段階を診断することができるキットを提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）　被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含むＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法、
（２）前記ステップ（Ａ）が、
（ａ）界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
を含む、前記（１）に記載の検出方法、
（３）前記ステップ（Ａ）が、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、
（ａ１）ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップ
をさらに含み、
　前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る、前記（２）に記載の検出方法、
（４）（Ａ）被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法、
（５）組織が、子宮頸部の組織である、前記（４）に記載の判定方法、
（６）ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、
　ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーと
を含み、
　非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたＨＰＶのゲノムＤＮＡの塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセット、
（７）第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（８）第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（９）他の塩基が、ウラシル又はチミンである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（１０）第１プライマー及び第２プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（１１）前記（６）に記載のプライマーセットと、
　核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有する、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット、
（１２）非メチル化シトシン変換剤が、亜硫酸水素塩である、前記（１１）に記載の診断用キット、
（１３）ＨＰＶに起因する癌が、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌である、前記（１１）に記載の診断用キット、並びに
（１４）前記（６）に記載のプライマーセットと、
　核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有する、異形成の段階の診断用キット
に関する。
ＨＰＶの遺伝子構造の概略説明図である。 ＳｉＨａ細胞に組み込まれているＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。 実施例１、比較例１及び比較例２のプライマーセットそれぞれと、正常組織試及び癌組織試料から調製された各分析用試料とを用いた核酸増幅後の増幅産物の結果を示す電気泳動図である。 Ｃ４－１細胞に組み込まれているＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。 実施例１のプライマーセットと、手術摘出試料及び生検試料から調製された各分析用試料とを用いた核酸増幅後の増幅産物の結果を示す電気泳動図である。 手術摘出試料由来のＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。 手術摘出試料由来のＨＰＶ５８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。 生検試料由来のＨＰＶ５８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。
　本発明のプライマーセットは、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列（「第１塩基配列」ともいう）における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列（「第２塩基配列」ともいう）からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列（「第３塩基配列」ともいう）における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列（「第４塩基配列」ともいう）からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを含み、ＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を、核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセットである。なお、前記第２塩基配列は、第１塩基配列からなる核酸を変換した後の核酸の塩基配列であり、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換されている点を除いて、第１の塩基配列に対応する配列である。また、前記第４塩基配列は、第３塩基配列からなる核酸を変換した後の核酸の塩基配列であり、全てのシトシンが他の塩基に変換されている点を除いて第３の塩基配列に対応する配列である。
　本発明のプライマーセットは、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを含有している点に１つの大きな特徴がある。
　ＨＰＶに起因する癌細胞に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡは、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない。そのため、本発明のプライマーセットを核酸増幅反応に用いれば、癌化の原因となるＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸を特異的に増幅することができる。これにより、本発明のプライマーセットによれば、ＨＰＶに起因する癌細胞を、高い精度で、かつ簡便に検出することができる。したがって、本発明のプライマーセットによれば、高い精度で、かつ簡便に、子宮頸癌、口腔癌及び咽頭癌の診断も行なうことができる。
　また、高度異形成以上の段階の病変部に存在するＨＰＶのゲノムＤＮＡは、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない。そのため、本発明のプライマーセットを核酸増幅反応に用いれば、高度異形成以上の段階の病変部に存在するＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸を特異的に増幅することができる。したがって、本発明のプライマーセットによれば、高い精度で、かつ簡便に、異形成の段階を診断することができる。また、本発明のプライマーセットによれば、高い精度で、かつ簡便に、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる。
　なお、本明細書において、ＨＰＶに起因する癌細胞とは、ＨＰＶの感染により、癌化した細胞及び癌化するリスクの高い細胞をいう。より具体的には、ＨＰＶに起因する癌細胞とは、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌の発症を引き起こすＨＰＶ感染細胞、子宮頸癌細胞、口腔癌細胞又は咽頭癌細胞をいう。
　本明細書において、「高度異形成以上の段階」とは、日本産婦人科学会による「子宮頸癌取り扱い規約1997」に基づく分類により、「高度異形成」又はそれより重篤な段階である「上皮内癌」、「微小浸潤扁平上皮癌」若しくは「浸潤扁平上皮癌」に分類される段階をいう。組織の病変が、これらの段階の病変であると判断されると、被験者は、ほとんどの場合、手術等の治療を必要とするので、高度異形成以上の段階の病変であるか否かを判断することは、臨床上、非常に重要である。一方、「高度異形成」より軽症の病変は、「上皮異常なし」、「軽度異形成」又は「中等度異形成」の段階の病変に分類される。病変が、これらの段階の病変である場合、被験者は、特別の治療を施さずに、経過観察されることがほとんどである。
　本明細書において、「異常細胞」とは、異型細胞及び癌細胞をいう。ここで、「異型細胞」とは、癌細胞ではないが、核腫大、クロマチン増量、核形不整等の核の異常が認められる細胞をいう。
　上述のように、ＨＰＶに起因する癌細胞は、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶのゲノムＤＮＡを有している。前記ＨＰＶに起因する癌細胞に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡを、非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤で処理した場合、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンは、他の塩基に変換されないが、ＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンは、他の塩基に変換される。したがって、本発明のプライマーセットを用いれば、非メチル化シトシン変換剤によって処理されたＨＰＶのゲノムＤＮＡのうち、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位がシトシンとグアニンとからなるジヌクレオチドの塩基配列のままであり、ＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンが他の塩基に変換された核酸のみを核酸増幅反応により増幅することができる。
　また、本発明のプライマーセットでは、第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。そして、第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。そのため、本発明のプライマーセットによれば、ＨＰＶ感染細胞の癌化の原因となるＨＰＶのゲノムＤＮＡ中の少なくともＬ２領域若しくはＬ１領域の一部とＬＣＲ若しくはＥ６領域の一部とを含む連続した領域のＤＮＡに対応する非メチル化シトシン変換剤で処理された核酸を、１回の核酸増幅反応で増幅することができる。
　ＨＰＶは、約８ｋｂの環状ＤＮＡウイルスである。ＨＰＶとしては、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ８２等が挙げられる。
　ＨＰＶゲノムは、図１に示されるように、非構造タンパク質をコードする初期遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ４領域、Ｅ５領域、Ｅ６領域及びＥ７領域）と、キャプシドタンパク質をコードする後期遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｌ１領域及びＬ２領域）と、ＬＣＲの遺伝子領域とを有している。Ｅ１領域は、ウイルスゲノムの複製に関与する領域である。Ｅ２領域は、ウイルスの転写の調節に関与する領域である。Ｅ５領域、Ｅ６領域及びＥ７領域は、がん化に関与する領域である。Ｅ６領域は、がん抑制遺伝子であるｐ５３と結合し、ｐ５３の分解を促進するタンパク質をコードする領域である。Ｅ７領域は、がん抑制遺伝子であるＲｂと結合し、Ｒｂを不活化するタンパク質をコードする領域である。Ｌ１領域及びＬ２領域は、キャプシド形成に関与する領域である。ＬＣＲ（Long control region)は、ウイルス遺伝子の発現調節に関与する領域である。
　一般的に、ＨＰＶが細胞に感染し、侵入すると、ＨＰＶのゲノムＤＮＡは、生体内におけるＤＮＡのメチル化機構により、ゲノムＤＮＡ内のＣｐＧ部位のうち、所定のＣｐＧ部位におけるシトシンがメチル化される。なかでも、子宮頸癌細胞中のＨＰＶでは、図２に示されるように、Ｌ１領域及びＬ２領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、ＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない。
　表１は、ＨＰＶ感染細胞に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡのＬ１領域及びＬ２領域並びにＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位におけるメチル化の状態を示す。ここで、表１で示されるＨＰＶ感染細胞のうち、ＨＰＶ感染細胞２は、ＨＰＶに起因する癌細胞を示している。なお、表１中、「○」は、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることを示し、「×」は、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上述のように、子宮頸癌細胞内のＨＰＶでは、Ｌ１領域及びＬ２領域中のＣｐＧ部位に、ＤＮＡのメチル化が検出される。ところが、表１に示されるように、ＨＰＶに起因する癌細胞ではないＨＰＶ感染細胞においても、Ｌ１領域又はＬ２領域のＤＮＡのメチル化が見られる場合がある。そのため、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、Ｌ１領域又はＬ２領域のメチル化のみを指標とすると、ＨＰＶに起因する癌細胞と、他のＨＰＶ感染細胞との区別化が困難な場合がある。すなわち、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、Ｌ１領域又はＬ２領域のメチル化のみを指標とすると、表１に示されるＨＰＶに起因する癌細胞であるＨＰＶ感染細胞２のみではなく、ＨＰＶ感染細胞１も検出されることがある。
　また、子宮頸癌細胞内のＨＰＶでは、ＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位は、非メチル化状態となっている。ところが、ＨＰＶに起因する癌細胞ではないＨＰＶ感染細胞等においても、ＬＣＲ又はＥ６領域のＣｐＧ部位が非メチル化状態となっている場合がある。そのため、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、ＬＣＲ又はＥ６領域における非メチル化状態のみを指標とすると、ＨＰＶに起因する癌細胞と、他のＨＰＶ感染細胞の区別化が困難な場合がある。すなわち、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、ＬＣＲ又はＥ６領域における非メチル化状態のみを指標とすると、表１に示されるＨＰＶに起因する癌細胞であるＨＰＶ感染細胞２のみではなく、ＨＰＶ感染細胞４も検出されることがある。
　しかしながら、本発明のプライマーセットは、表１に示されるＨＰＶ感染細胞２に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシン変換剤で処理された核酸を、特異的に核酸増幅反応で増幅することができる。そのため、本発明のプライマーセットを用いれば、表１に示されるＨＰＶ感染細胞１～４のなかから、ＨＰＶに起因する癌細胞であるＨＰＶ感染細胞２を特異的に検出することができるという優れた効果が奏される。
　一方、高度異形成以上の段階の組織内のＨＰＶにおいても、Ｌ１領域及びＬ２領域中のＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されており、ＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されていない。したがって、本発明のプライマーセットを用いれば、高度異形成以上の段階の組織のＨＰＶのＤＮＡを特異的に検出することができるという優れた効果が奏される。
　なお、本明細書において、「プライマーがハイブリダイズする」とは、プライマーが、核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることをいう。プライマーが核酸にハイブリダイズした状態は、核酸増幅反応を進行させるに適した状態で核酸中の相補的な配列とアニーリングした状態となる。ここで、ストリンジェントな条件とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行なう際に当業者が一般的に用いる条件である。前記ストリンジェントな条件は、本発明のプライマーセットが、ＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシン変換剤で処理された核酸中における目的の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), ColdSpringHarborLaboratory Press, New Yorkに記載された条件等を用いることができる。
　なお、「他の塩基」としては、ウラシル、チミンが挙げられる。例えば、非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いた場合、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換される。また、本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、このウラシルは、チミンに変換されることとなる。
　第１プライマー及び第２プライマーは、核酸増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである。具体的には、第１プライマー及び第２プライマーは、それぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーであることが好ましい。これにより、非メチル化シトシン変換剤で処理された、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行えば、増幅反応の結果から簡便に、ＨＰＶに起因する癌細胞を有する被験者や高度異形成以上の段階の組織を確認することができる。
　ポリメラーゼ連鎖反応法は、慣用の手法により実施することができる。鎖置換反応法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法、ＳＭＡＰ法等が挙げられる。転写増幅法としては、例えば、ＴＡＳ法等が挙げられる。
　本発明のプライマーセットは、使用する核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法で作製することができる。より具体的には、まず、Ｌ１領域又はＬ２領域の塩基配列とＬＣＲ又はＥ６領域の塩基配列に関して、非メチル化シトシン変換剤による処理後の塩基配列を予測する。その後、予測した塩基配列から、市販のプライマー設計用ソフトウエア等を用いて、本発明のプライマーセットの各プライマーの塩基配列を設計し、各プライマーを合成することにより、本発明のプライマーセットを作製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応法であるリアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットの各プライマーを設計するためのソフトウエアとしては、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸやｐｒｉｍｅｒ３等が挙げられる。また、鎖置換反応法であるＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットの各プライマーを設計するためのソフトウエアとしては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ等が挙げられる。
　本発明のプライマーセットによれば、前記のように、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出することができるため、ＨＰＶに起因する癌を診断することができる。したがって、本発明には、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット（以下、「診断用キット１」ともいう）も包含される。
　本発明の診断用キット１は、前述したプライマーセットと、核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤とを含有するキットである。
　非メチル化シトシン変換剤としては、核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換するのであればよく、例えば、亜硫酸水素塩等が挙げられる。前記亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
　本発明の診断用キット１では、前述したプライマーセットは、核酸を安定に保持するに適した緩衝液等の溶媒に溶解させ、核酸を安定に保持するに適した容器等に封入されて提供される。また、非メチル化シトシン変換剤は、この非メチル化シトシン変換剤を溶解させるに適した溶媒に溶解され、適切な容器等に封入されて提供される。
　本発明の診断用キット１を適用することができるＨＰＶに起因する癌としては、例えば、子宮頸癌、口腔癌、咽頭癌等が挙げられる。
　前述した本発明のプライマーセットによれば、前記のように、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出することができる。本発明には、ＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法も包含される。
　本発明の癌細胞の検出方法は、
（Ａ）被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含む方法である。本発明の癌細胞の検出方法は、例えば、前述したＨＰＶに起因する癌の診断用キットを用いることにより、簡便に行なうことができる。
　本発明の癌細胞の検出方法では、まず、被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製する〔ステップ（Ａ）〕。
　前記ステップ（Ａ）では、被験者の細胞からのＤＮＡを含有する試料の調製は、公知の方法等により行なえばよい。前記ＤＮＡを含有する試料の調製は、例えば、
（ａ）界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
により行なうことができる。前記ステップ（Ａ）において、これらのステップ（ａ）～（ｃ）を行なうことにより、被験者の細胞からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを含有する試料を調製することができる。
　また、前記ステップ（Ａ）は、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、（ａ１）ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップをさらに含んでもよい。この場合、前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る。
　界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム（ＣＨＯ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられ、特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。また、物理的処理を行なう方法としては、物理的に細胞を破砕する公知の方法であればよく、例えば、ホモジナイザーにより細胞を破砕する方法やミキサーにより細胞を振盪して破砕する方法等が挙げられる。ＤＮＡを含有する試料の調製には、市販のＤＮＡを抽出するためのキットを用いてもよい。
　抽出したＤＮＡは、水や緩衝液に溶解してＤＮＡ溶液として用いることができる。ＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、溶解したＤＮＡを安定に保持することができるものが好ましい。前記ＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、例えば、ヌクレアーゼを含まないＰＣＲグレードの水や、ＴＥ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）等が挙げられる。
　被験者の細胞としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞であればよい。被験者の細胞としては、特に限定されない。例えば、粘膜の細胞、皮膚の細胞等が挙げられる。粘膜としては、例えば、泌尿生殖器、消化器、呼吸器等の管腔臓器の内腔面の粘膜が挙げられる。より具体的な粘膜としては、子宮頸部の粘膜、口腔咽喉部の粘膜等が挙げられる。被験者の細胞の中では、子宮頸部の細胞及び口腔咽頭部の細胞が好ましい。本発明の検出方法では、被験者の細胞として、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞を用いることにより、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌の発症を引き起こすＨＰＶに起因する癌細胞を検出できる。子宮頸部の細胞は、被験者の子宮頸部（例えば、子宮頸部の粘膜等）から採取することができる細胞である。また、口腔咽頭部の細胞は、被験者の口腔咽頭部（例えば、口腔咽頭部の粘膜等）から採取することができる細胞である。
　つぎに、前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する〔ステップ（Ｂ）〕。
　他の塩基への非メチル化シトシンの変換は、前記非メチル化シトシン変換剤により行なうことができる。非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いる場合、前述のように、メチル化シトシンは、変換されず、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換されることとなる。前記亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。他の塩基への非メチル化シトシンの変換は、非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩である亜硫酸水素ナトリウムを用いる場合、ＤＮＡを含有する試料に１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液を添加し、得られた混合物を適切な温度条件下にインキュベーションすることにより行なうことができる。
　つぎに、前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なう〔ステップ（Ｃ）〕。本発明の検出方法では、ステップ（Ｃ）において、前記変換試料と、前記第１プライマー及び第２プライマーとを用いて核酸増幅反応を行なうため、癌化の原因となるＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された核酸を、特異的に増幅することができる。したがって、本発明の検出方法によれば、高い精度でＨＰＶに起因する癌細胞を検出することができる。
　核酸増幅反応は、前記ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により行なわれる。これらのなかでは、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応法である。
　前記プライマーセットを用いた核酸増幅反応では、上述の非メチル化シトシン変換剤により処理されたＤＮＡを含有する試料中に、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶのゲノムＤＮＡが存在している場合、増幅産物が得られることとなる。すなわち、被験者の細胞のＤＮＡを含有する試料中に、表１のＨＰＶ感染細胞２に示されるＨＰＶのゲノムＤＮＡが存在する場合、増幅産物が得られることとなる。一方、被験者の細胞のＤＮＡを含有する試料中に、表１に示されるＨＰＶ感染細胞１、３、及び４に示されるＨＰＶのゲノムＤＮＡしか存在ない場合、増幅産物が得られないこととなる。
　その後、ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出する〔ステップ（Ｄ）〕。核酸増幅反応により増幅産物が得られた場合、被験者が、ＨＰＶに起因する癌細胞を有すると判断される。すなわち、前記増幅産物の存在は、被験者が持続感染したＨＰＶを有することの指標となり得る。一方、核酸増幅反応により増幅産物が得られない場合、被験者がＨＰＶに起因する癌細胞を有していないと判定される。この場合、前記増幅産物が存在しないことは、被験者が、ＨＰＶに感染していないか、ＨＰＶに感染していたとしても一過性感染の感染であることの指標となり得る。このように、本発明の検出方法では、増幅産物の存在を確認することにより、ＨＰＶに起因する癌細胞を、簡便に検出することができる。
　なお、核酸増幅反応により増幅産物が得られたか否かは、公知の方法によって確認することができる。かかる方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、標識プローブを増幅産物にハイブリダイズさせて検出する方法、二本鎖ＤＮＡに結合可能なインターカレータ（例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ等）を用いて蛍光を検出する方法及び核酸増幅で生じる副生成物の濁りを検出する方法等が挙げられる。
　また、本発明のプライマーセットによれば、被験者から得られた組織が、高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができ、異形成の段階を診断することもできる。したがって、本発明には、異形成の段階の診断用キット（以下、「診断用キット２」ともいう）も包含される。
　本発明の診断用キット２は、前述したプライマーセットと、前記非メチル化シトシン変換剤とを含有するキットである。本発明の診断用キット２では、前述したプライマーセット及び非メチル化シトシン変換剤は、前述した診断用キット１と同様の形態で提供される。
　本発明の診断用キット２を適用することができる被験者の組織としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞を含む組織であればよい。例えば、子宮頸部や口腔咽喉部から採取した組織が挙げられ、特に、子宮頸部から採取した組織の異形成を診断するのに適用することが好ましい。
　さらに、本発明のプライマーセットによれば、前記のように、被験者の組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる。本発明には、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法も包含される。
　本発明の判定方法は、
（Ａ）被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む方法である。
　本発明の判定方法では、まず、被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製する〔ステップ（Ａ）〕。
　本判定方法のステップ（Ａ）では、被験者の組織からのＤＮＡを含有する試料の調製は、公知の方法等により行なえばよい。また、前述のＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法におけるステップ（Ａ）の被験者の細胞からのＤＮＡを含有する試料の調製と同じ操作で、被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製することもできる。
　被験者の組織としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞を含む組織であればよい。具体的な被験者の組織としては、被験者の子宮頸部及び口腔咽喉部から採取された組織が挙げられる。
　本発明の判定方法におけるステップ（Ｂ）及びステップ（Ｃ）は、前述のＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法におけるステップ（Ｂ）及びステップ（Ｃ）と同じ操作で行なうことができる。本発明の判定方法では、前記ステップ（Ｃ）において、前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、前記第１プライマー及び第２プライマーとを用いて核酸増幅反応を行なうため、高度異形成以上の段階の病変部に存在するＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された核酸を、特異的に増幅することができる。したがって、本発明の判定方法によれば、高い精度で、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる。
　その後、本発明の判定方法では、核酸増幅ステップにおける核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織か否かを判定する〔ステップ（Ｄ）〕。核酸増幅反応により増幅産物が得られた場合、被験者の組織が、高度異形成以上の段階の組織であると判定される。逆に、核酸増幅反応により増幅産物が得られない場合、被験者の組織が、高度異形成以上の段階の組織ではないと判定される。このように、本発明の判定方法では、増幅産物の有無を確認することにより、この増幅産物の有無を指標として、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを、簡便に判定することができる。
　以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
（実験例１）
　ＨＰＶ１６ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡ１μｇに、３００μＬの０．３Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、１０Ｍ亜硫酸水素塩溶液（１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液）３００μＬを添加し、８０℃で４０分間インキュベートすることにより、前記ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれるＤＮＡをＤＮＡ精製キット〔キアジェン社製、商品名：Ｑｉａｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡに、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｓ－３００　ＨＲ　Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
　分析用試料２μＬに対して、ＰＣＲ用試薬〔タカラバイオ株式会社製、商品名：ＴａＫａＲａ　ＥＸ　Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ〕に含まれている試薬（×１０　ｂｕｆｆｅｒ）２．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ（５Ｕ／μＬ）〕０．１２５μＬ及び２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物　２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと水１６．３８μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
　用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中、ＰＣＲサーマルプロファイル（１）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６０℃３０秒間と７２℃４０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件である。また、表２中、ＰＣＲサーマルプロファイル（２）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と５３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件である。
　前記ＰＣＲ用反応液を用いて、プライマーセットの種類に応じたＰＣＲ条件で、ＰＣＲを行なった。
　ＰＣＲ後の増幅産物を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製、商品名：ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ）に含まれるベクターに組み込んだ。得られた構築物を用いて、大腸菌（ＴＯＰ１０）を形質転換した。形質転換した大腸菌を、ＬＢ寒天培地〔組成：１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）寒天〕を用いて、３７℃で、一晩培養した。得られた大腸菌のコロニーを、ＬＢ液体培地に播種して、３７℃、一晩培養した。得られた大腸菌から、プラスミド抽出キット（シグマ－アルドリッチ社製、商品名：ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ）を用いて、プラスミドを精製した。得られたプラスミドに組み込まれている前記増幅産物の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法により、遺伝子解析システム〔アプライドバイオシステムズ社製、商品名：ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３１００〕を用いて決定した。
　ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されている場合（メチル化ＣｐＧ部位）、前記ＣｐＧ部位は、決定された塩基配列では、「ＣＧ」として現れる。一方、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない場合（非メチル化ＣｐＧ部位）、前記ＣｐＧ部位は、決定された塩基配列では、「ＴＧ」として現れる。そこで、決定された増幅産物の塩基配列に基づき、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の局在を解析した。その結果を図２に示す。図２は、ＳｉＨａ細胞に組み込まれているＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図中、黒丸は、メチル化ＣｐＧ部位を示し、白丸は、非メチル化ＣｐＧ部位を示す。また、図中、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＣ＿００１５２６（配列番号：９）におけるゲノムポジションを示す。
　図２に示される結果から、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ１６（組込型ＨＰＶ１６）の塩基配列のうち、Ｌ１領域におけるＣｐＧ部位及びＬ２領域におけるＣｐＧ部位それぞれのシトシンは、メチル化されていることがわかる。それに対し、ＬＣＲにおけるＣｐＧ部位及びＥ６領域におけるＣｐＧ部位それぞれのシトシンは、ほとんどメチル化されていないことがわかる。したがって、図２に示される結果から、Ｌ１領域のＣｐＧ部位及びＬ２領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位及びＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡの有無により、子宮頸癌の発症を引き起こす組込型ＨＰＶ１６を検出できる可能性が示唆される。
（試験例１）
　ＨＰＶ１６の感染が確認された子宮頸部の組織のうち、病理学的に異形成が起こっていない正常組織と、癌組織それぞれを、厚さ２０μｍに薄切して、正常組織試料及び癌組織試料を得た。得られた各組織試料に、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液５００μＬを添加した。得られた混合物を、１００℃で２０分間保温した。保温後の混合物を、４℃で遠心分離し、上清を回収した。
　得られた上清に、上述の亜硫酸水素塩溶液５００μＬを添加した。その後、得られた混合物を８０℃で４０分間インキュベートすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれる核酸を核酸精製キット〔キアジェン社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加した。つぎに、得られた混合物を室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｓ－３００　ＨＲ　Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
　分析用試料４μＬに対して、ＰＣＲ用試薬（ロシュ社製、商品名：ＦａｓｔＳｔａｒｔ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に含まれる試薬（商品名：×１０　ｂｕｆｆｅｒ）　２μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＦａｓｔＳｔａｒｔ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）〕０．１６μＬ及び２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物１．６μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．８μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．８μＬと、水１０．６４μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
　用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３中、実施例１のプライマーセットは、フォワードプライマーである１６Ｌ１／ＬＣＲ－Ｆと、リバースプライマーである１６Ｌ１／ＬＣＲ－Ｒとからなる。前記１６Ｌ１／ＬＣＲ－Ｆは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、所定のメチル化されたＣｐＧ部位を含むＬ１領域に対応する部分とハイブリダイズする。前記１６Ｌ１／ＬＣＲ－Ｒは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、所定のメチル化されていないＣｐＧ部位を含むＬＣＲに対応する部分とハイブリダイズする。すなわち、分析用試料中に、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して得られた核酸が含まれる場合、実施例１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうと、増幅産物が生じることになる。
　表３中、比較例１のプライマーセットは、フォワードプライマーである１６Ｌ１Ｍｅ１－Ｆと、リバースプライマーである１６Ｌ１Ｍｅ１－Ｒとからなる。前記１６Ｌ１Ｍｅ１－Ｆ及び１６Ｌ１Ｍｅ１－Ｒは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、それぞれ所定のメチル化されたＣｐＧ部位を含むＬ１領域に対応する部分とハイブリダイズする。すなわち、分析用試料中に、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されているＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して得られた核酸が含まれる場合、比較例１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうと、増幅産物が生じることになる。
　表３中、比較例２のプライマーセットは、フォワードプライマーである１６ＬＣＲＵｎＭｅ１－Ｆと、リバースプライマーである１６ＬＣＲＵｎＭｅ１－Ｒとからなる。前記１６ＬＣＲＵｎＭｅ１－Ｆ及び１６ＬＣＲＵｎＭｅ１－Ｒは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、それぞれ所定のメチル化されていないＣｐＧ部位を含むＬＣＲに対応する部分とハイブリダイズする。すなわち、分析用試料中に、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して得られた核酸が含まれる場合、比較例２のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうと、増幅産物が生じることになる。
　また、表３中、ＰＣＲサーマルプロファイル（３）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６０℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４５サイクルの反応を行なう条件である。ＰＣＲサーマルプロファイル（４）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４５サイクルの反応を行なう条件である。ＰＣＲサーマルプロファイル（５）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と５６℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４５サイクルの反応を行なう条件である。
　前記ＰＣＲ用反応液を用いて、プライマーセットの種類に応じたＰＣＲ条件で、ＰＣＲを行ない、増幅産物の有無を確認した。その結果を図３に示す。図３は、実施例１、比較例１及び比較例２のプライマーセットそれぞれと、正常組織試及び癌組織試料から調製された各分析用試料とを用いた核酸増幅後の増幅産物の結果を示す電気泳動図である。図３のパネル（ａ）～（ｃ）のレーン１は、正常組織試料から得られた核酸の場合の増幅産物、レーン２は、癌組織試料から得られた核酸の場合の増幅産物を示す。また、図３のパネル（ａ）は、比較例１のプライマーセットを用いた場合の結果、パネル（ｂ）は、実施例１のプライマーセットを用いた場合の結果、パネル（ｃ）は、比較例２のプライマーセットを用いた場合の結果を示す。パネル（ｄ）～（ｆ）は、増幅対象の核酸に対応するＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおける遺伝子領域のメチル化・非メチル化の状態を模式化して示したものである。パネル（ｄ）～（ｆ）において黒丸はメチル化シトシンの存在、及び白丸は非メチル化シトシンの存在を、それぞれ模式的に示している。
　図３のパネル（ａ）に示される結果から明らかなように、比較例１のプライマーセットを用いた場合、レーン１及びレーン２において増幅産物が検出されている。すなわち、比較例１のプライマーセットでは、正常組織及び子宮頸癌組織から調製されたいずれの分析試料からも、増幅産物が得られてしまう。この結果から、メチル化されたＬ１領域（ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されたＬ１領域）を検出するだけでは、正常組織と子宮頸癌組織を識別できないことがわかる。
　また、図３のパネル（ｃ）に示される結果から明らかなように、比較例２のプライマーセットを用いた場合、レーン１及びレーン２において増幅産物が検出されている。すなわち、比較例２のプライマーセットでは、正常組織及び子宮頸癌組織から調製されたいずれの分析試料からも、増幅産物が得られてしまう。この結果から、メチル化されていないＬＣＲ（ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＬＣＲ）を検出するだけでは、正常組織と子宮頸癌組織を識別できないことがわかる。
　これに対して、図３のパネル（ｂ）に示される結果から明らかなように、実施例１のプライマーセットを用いた場合、レーン１では増幅産物は検出されず、レーン２では増幅産物が検出されている。すなわち、実施例１のプライマーセットでは、正常組織から調整された分析用試料では、増幅産物が得られず、子宮頸癌組織から調整された分析用試料では、増幅産物が得られることがわかる。実施例１のプライマーセットでは、図３のパネル（ｅ）に示されるように、メチル化されているＬ１領域に対応する核酸におけるプライマーがハイブリダイズする部位から、メチル化されていないＬＣＲに対応する核酸におけるプライマーがハイブリダイズする部位までの連続した領域に対応する核酸を増幅対象とする。したがって、実施例１のプライマーセットによれば、前記表１に示されるＨＰＶ感染細胞２に含まれるＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおける所定のＬ１領域及びＬＣＲを含む連続した核酸に対応する亜硫酸水素塩処理後の核酸のみが増幅される。その結果、実施例１のプライマーセットによれば、正常組織試料と子宮頸癌組織試料とを区別することが可能となる。
　以上の結果から、ＨＰＶのＬ１領域のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外のシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲのＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとからなるプライマーセットを用いることにより、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出できることが示唆された。
（実験例２）
　実験例１と同様の操作により、ＨＰＶ１８ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるＣ４－１細胞を用い、ＨＰＶ１８ゲノムにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の解析を行なった。具体的には、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに代えて、Ｃ４－１細胞のゲノムＤＮＡを用い、かつ表２に示されるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルに代えて、表４に示されるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイル（６）を用いてＰＣＲ反応を行なったことを除き、実験例１と同様の操作を行ない、増幅産物の塩基配列を決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４中、ＰＣＲサーマルプロファイル（６）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と５４℃３０秒間と７２℃４０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件である。
　そこで、決定された増幅産物の塩基配列に基づき、ＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の局在を解析した。その結果を図４に示す。図４は、Ｃ４－１細胞に組み込まれているＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図中、黒丸は、メチル化ＣｐＧ部位を示し、白丸は、非メチル化ＣｐＧ部位を示す。また、図中、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＣ＿００１３５７（配列番号：１６）におけるゲノムポジションを示す。
　図４に示される結果から、Ｃ４－１細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ１８（組込型ＨＰＶ１８）も、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ１６（組込型ＨＰＶ１６）と同様に、Ｌ１領域におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、ＬＣＲにおけるＣｐＧ部位及びＥ６領域のＣｐＧ部位それぞれのシトシンは、メチル化されていないことがわかる。この結果から、本発明のプライマーセットを用いれば、ＨＰＶの種類に関わらず、子宮頸癌の発症を引き起こす組込型ＨＰＶを検出できる可能性が示唆される。
（試験例３）
　被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ１６の感染が確認された１４種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（以下、「手術摘出試料」という）及び被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、ＨＰＶ１６の感染が確認された７種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（以下、「生検試料」という）のそれぞれを、厚さ１０μｍとなるように薄切し、組織試料を得た。
　なお、前記手術摘出試料及び生検試料は、いずれも、従来の組織診により異形成以上の段階の組織であることが診断された組織を含むものである。１４種類の手術摘出試料のうち、軽度異形成（ＣＩＮ１)の試料は１種類、中等度異形成（ＣＩＮ２)の試料は４種類、高度異形成（ＣＩＮ３)の試料は４種類、癌（ＳＣＣ）の試料は４種類、正常試料は１種類である。また、生検試料のうち、軽度異形成（ＣＩＮ１)の試料は２種類、高度異形成（ＣＩＮ３)の試料は２種類、癌（ＳＣＣ）の試料は３種類である。
　１．５ｍＬチューブに、同じパラフィンブロックから得られた組織試料３枚と、キシレン１ｍＬとを添加した。得られた混合物を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除き、ペレットに１００体積％エタノール１ｍＬを添加して懸濁し、得られた懸濁物を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除き、再度ペレットに１００体積％エタノールを添加して懸濁し、得られた懸濁物を再度１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除き、ペレットを乾燥させた。得られたペレットを、以下、「乾燥ペレット」という。
　１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液７００μＬを、手術摘出試料から得られた乾燥ペレットに添加した。また、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液５００μＬを、生検試料から得られた乾燥ペレットに添加した。得られた各混合物を、１００℃で２０分間保温した。保温後の各混合物を、４℃で１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供し、上清を回収した。
　前記亜硫酸水素塩溶液７００μＬを、手術摘出試料から得られた上清に添加し、混合した。また、前記亜硫酸水素塩溶液５００μＬを、生検試料から得られた上清に添加し、混合した。その後、得られた各混合物を８０℃で４０分間インキュベートすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれる核酸を核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加した。つぎに、得られた混合物を室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｓ－３００　ＨＲ　Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
　分析用試料として、手術摘出試料由来の分析用試料を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行なって、ＰＣＲ用反応液を調製した。また、分析用試料として、生検試料由来の分析用試料を用い、分析用試料の量を２μＬとしたことを除き、試験例１と同様の操作を行なって、ＰＣＲ用反応液を調製した。ＰＣＲ用反応液のプライマーセットとして、配列番号：１０で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１１で示される塩基配列からなるプライマーとからなる実施例１のプライマーセットを用いた。
　なお、手術摘出試料由来の分析用試料を含むＰＣＲ用反応液を用いた場合のＰＣＲ条件は、表３中のＰＣＲサーマルプロファイル（３）と同じ条件である。生検試料由来の分析用試料を含むＰＣＲ用反応液を用いた場合のＰＣＲ条件は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６０℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルで反応を行なう条件である。
　前記ＰＣＲ用反応液を用いて、プライマーセットの種類に応じたＰＣＲ条件で、ＰＣＲを行ない、増幅産物の有無を確認した。その結果を図５に示す。図５は、実施例１のプライマーセットと、手術摘出試料及び生検試料から調製された各分析用試料とを用いた核酸増幅後の増幅産物の結果を示す電気泳動図である。図５中、レーン１は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン２は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン３は、ＣＩＮ１の手術摘出試料を用いた結果、レーン４は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン５は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン６は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン７は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン８は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン９は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン１０は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン１１は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン１２は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン１３は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン１４は、正常の手術摘出試料を用いた結果、レーン１５は、ＣＩＮ１の生検試料を用いた結果、レーン１６は、ＣＩＮ１の生検試料を用いた結果、レーン１７は、ＣＩＮ３の生検試料を用いた結果、レーン１８は、ＣＩＮ３の生検試料を用いた結果、レーン１９は、ＳＣＣの生検試料を用いた結果、レーン２０は、ＳＣＣの生検試料を用いた結果、レーン２１は、ＳＣＣの生検試料を用いた結果を示す。図５中、ＰＣは、分析用試料として、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した核酸を用いた結果、ＮＣは、分析用試料として、蒸留水を用いた結果を示す。さらに、図５の結果について、異形成の段階に基づいて分析した結果を表５に示す。表５中、「Ｌ１－ＬＣＲ陽性」は、増幅産物が検出された試料を示す。また、表５において、全試料数に対するＬ１－ＬＣＲ陽性の試料数の割合（％）を、括弧内に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図５及び表５に示される結果から、実施例１のプライマーセットによれば、組織診により高度異形成（ＣＩＮ３）以上の段階の組織であると判定された組織から調製された分析用試料を用いた場合、高い割合で、増幅産物が得られるが、組織診により中度異形成（ＣＩＮ２）以下の段階の組織であると判定された組織から調製された分析用試料を用いた場合、増幅産物が得られる割合が低いことがわかる。この結果から、実施例１のプライマーセットによれば、手術摘出試料、生検試料等の臨床検体として得られた組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定できることがわかる。
（試験例４）
　被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ１８の感染が確認された癌組織のパラフィンブロック及び被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３の段階の組織であると診断された子宮頸部の組織のパラフィンブロック（手術摘出試料）、並びに被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３の段階の組織であると診断された患者由来の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（生検試料）を用い、試験例２と同様の操作を行なうことにより、それぞれの分析用試料を得た。
　分析用試料２μＬに対して、ＰＣＲ用試薬〔タカラバイオ株式会社製、商品名：ＴａＫａＲａ　ＥＸ　Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ〕に含まれている試薬（×１０　ｂｕｆｆｅｒ）１．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ（５Ｕ／μＬ）〕０．０７５μＬ及び２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物　１．２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと水９．０２５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
　ＨＰＶ１８を含む試料由来の分析用試料に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを表６に示す。ＨＰＶ５８を含む試料由来の分析用試料に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　なお、ＰＣＲ条件として、実験例２で用いたＰＣＲサーマルプロファイル（６）及び手術摘出試料由来の分析用試料及び生検試料由来の分析用試料それぞれを用い、実験例１と同様の操作を行ない、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ５８それぞれのゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を解析した。これらの結果を図６～８に示す。
　図６は、手術摘出試料由来のＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図７は、手術摘出試料由来のＨＰＶ５８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図８は、生検試料由来のＨＰＶ５８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図中、黒丸は、メチル化ＣｐＧ部位を示し、白丸は、非メチル化ＣｐＧ部位を示す。また、図６において、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＣ＿００１３５７（配列番号：１６）におけるゲノムポジションを示す。また、図７及び８において、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＣ＿００１４４３（配列番号：３７）におけるゲノムポジションを示す。
　図６に示される結果から、ＨＰＶ１８の感染が確認された癌組織由来のＨＰＶ１８では、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンが高頻度でメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンがほとんどメチル化されておらず、かつＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンはメチル化されていないことがわかる。また、図７に示される結果から、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３と診断された子宮頸部の組織由来のＨＰＶ５８では、Ｌ１領域及びＬ２領域のＣｐＧ部位のシトシンは、高頻度でメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されていないことがわかる。さらに、図８に示される結果から、コルポスコピー観察下で得られたＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３と診断された患者由来の子宮頸部の組織由来のＨＰＶ５８は、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンは、高頻度でメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンは、ほとんどメチル化されていないことがわかる。
　これらの結果から、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとからなるプライマーセットによれば、ＨＰＶの種類に関わらず、子宮頸癌の発症を引き起こすＨＰＶを検出できることが示唆される。また、前記プライマーセットによれば、手術摘出試料や生検試料等の臨床検体として得られた組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定できることが示唆された。
（調製例１）
　ＨＰＶに起因する癌の診断用又は異形成の段階の診断用のキットを調製した。その一例を、以下に示す。かかるキットは、下記プライマーセットの各プライマーの水溶液が入ったヌクレアーゼフリーの容器と非メチル化シトシン変換剤である亜硫酸水素塩溶液（１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液）が入ったヌクレアーゼフリーの容器とからなる。
ＨＰＶに起因する癌の診断用又は異形成の段階の診断用のキットの内容：
容器１
　フォワードプライマー水溶液（配列番号：１０に示される塩基配列からなるプライマー１６Ｌ１／ＬＣＲ－Ｆをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液）
容器２
　リバースプライマー水溶液（配列番号：１０に示される塩基配列からなるプライマー１６Ｌ１／ＬＣＲ－Ｆをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液）
容器３
　１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液
　かかるキットを用いて、前記試験例１と同様の操作を行なうことにより、ＨＰＶに起因する癌を、高い精度で、かつ簡便に診断することができる。また、本キットを用いて、前記試験例３と同様の操作を行なうことにより、異形成の段階を、高い精度で、かつ簡便に診断することができる。
　配列番号：１は、プライマーの配列である。
　配列番号：２は、プライマーの配列である。
　配列番号：３は、プライマーの配列である。
　配列番号：４は、プライマーの配列である。
　配列番号：５は、プライマーの配列である。
　配列番号：６は、プライマーの配列である。
　配列番号：７は、プライマーの配列である。
　配列番号：８は、プライマーの配列である。
　配列番号：１０は、プライマーの配列である。
　配列番号：１１は、プライマーの配列である。
　配列番号：１２は、プライマーの配列である。
　配列番号：１３は、プライマーの配列である。
　配列番号：１４は、プライマーの配列である。
　配列番号：１５は、プライマーの配列である。
　配列番号：１７は、プライマーの配列である。
　配列番号：１８は、プライマーの配列である。
　配列番号：１９は、プライマーの配列である。
　配列番号：２０は、プライマーの配列である。
　配列番号：２１は、プライマーの配列である。
　配列番号：２２は、プライマーの配列である。
　配列番号：２３は、プライマーの配列である。
　配列番号：２４は、プライマーの配列である。
　配列番号：２５は、プライマーの配列である。
　配列番号：２６は、プライマーの配列である。
　配列番号：２７は、プライマーの配列である。
　配列番号：２８は、プライマーの配列である。
　配列番号：２９は、プライマーの配列である。
　配列番号：３０は、プライマーの配列である。
　配列番号：３１は、プライマーの配列である。
　配列番号：３２は、プライマーの配列である。
　配列番号：３３は、プライマーの配列である。
　配列番号：３４は、プライマーの配列である。
　配列番号：３５は、プライマーの配列である。
　配列番号：３６は、プライマーの配列である。

Claims (14)

  1. 　（Ａ）　被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
    （Ｂ）　前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
    （Ｃ）　前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
    （Ｄ）　前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
    を含むＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法。
  2. 　前記ステップ（Ａ）が、
    （ａ）　界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
    （ｂ）　前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
    （ｃ）　前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
    を含む、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記ステップ（Ａ）が、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、
    （ａ１）　ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップ
    をさらに含み、
    　前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る、請求項２に記載の検出方法。
  4. 　（Ａ）　被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
    （Ｂ）　前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
    （Ｃ）　前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
    （Ｄ）　前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
    を含む組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法。
  5. 　組織が、子宮頸部の組織である、請求項４に記載の判定方法。
  6. 　ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、
    　ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーと
    を含み、
    　非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたＨＰＶのゲノムＤＮＡの塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセット。
  7. 　第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、請求項６に記載のプライマーセット。
  8. 　第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、請求項６に記載のプライマーセット。
  9. 　他の塩基が、ウラシル又はチミンである、請求項６に記載のプライマーセット。
  10. 　第１プライマー及び第２プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである、請求項６に記載のプライマーセット。
  11. 　請求項６に記載のプライマーセットと、
    　核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
    を含有してなる、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット。
  12. 　非メチル化シトシン変換剤が、亜硫酸水素塩である、請求項１１に記載の診断用キット。
  13. 　ＨＰＶに起因する癌が、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌である、請求項１１に記載の診断用キット。
  14. 　請求項６に記載のプライマーセットと、
    　核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
    を含有してなる、異形成の段階の診断用キット。
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