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WO2009107170A1 - 抗ｃｒｐ抗体及びその利用 - Google Patents

抗ｃｒｐ抗体及びその利用 Download PDF

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Publication number
WO2009107170A1
WO2009107170A1 PCT/JP2008/002376 JP2008002376W WO2009107170A1 WO 2009107170 A1 WO2009107170 A1 WO 2009107170A1 JP 2008002376 W JP2008002376 W JP 2008002376W WO 2009107170 A1 WO2009107170 A1 WO 2009107170A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
crp
antibody
amino acid
acid sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2008/002376
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英毅 神野
茉甫 菊地
友絵 小森谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nihon University
Original Assignee
Nihon University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nihon University filed Critical Nihon University
Priority to US12/920,192 priority Critical patent/US20110076700A1/en
Priority to JP2010500454A priority patent/JPWO2009107170A1/ja
Publication of WO2009107170A1 publication Critical patent/WO2009107170A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4737—C-reactive protein

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CRP antibody and use thereof, and more specifically, using a Epitope analysis method, a reaction site on the CRP recognized by the anti-CRP antibody is specified, and an antibody prepared using the reaction site is used.
  • the present invention relates to a method for specifically and highly sensitively measuring CRP by performing an immunoassay.
  • CRP C-reactive protein
  • S. pneumoniae C-reactive protein
  • CRP is a serum protein that shows a precipitation reaction with C polysaccharide of S. pneumoniae, and is usually present in a small amount (average 580 ng / ml) in normal human serum.
  • CRP is characterized by rapidly increasing in the blood when inflammatory diseases and tissue degeneration / necrosis occur, and rapidly decreasing with the recovery of the disease state. Therefore, measurement of blood CRP concentration is widely used clinically for diagnosis of inflammation and tissue destructive diseases such as rheumatoid arthritis, bacterial infection, viral hepatitis, pneumonia, urinary tract infection (non-patented). Reference 1). Since the conventional CRP measurement has measured a significant increase in concentration from the normal time during acute inflammation, a highly sensitive measurement method has not been required.
  • Non-Patent Document 2 discloses a prognostic marker for ischemic heart disease (myocardial infarction), neonatal infection, etc.
  • ischemic heart disease myocardial infarction
  • neonatal infection etc.
  • its measurement requires high precision and high sensitivity.
  • CRP cardiac infarction
  • various diseases such as periodontal disease
  • the clinical significance of trace amounts (low concentration) of CRP is extremely high (see Non-Patent Document 2).
  • anti-CRP antibodies used for CRP measurement are mainly produced using natural proteins as antigens. Therefore, non-specific reactions are likely to occur, and there are many problems such as ethical problems and lot differences in products when obtaining purified proteins from human serum. Then, although the method of producing an antibody using recombinant human CRP (rCRP) is also proposed, it cannot be said that binding specificity is enough. Yoshio Fukuoka et al., Clinical Immunology, Publication of Medical Dentistry, 1997 Hashio Takahashi, “Diagnosis usefulness of high-sensitivity CRP measurement method”, Clinical Pathology, 2002, Vol. 50, p30-39
  • An object of the present invention is to provide means for specifically recognizing CRP in a test sample and measuring it with high sensitivity.
  • the present invention provides an anti-CRP antibody that reacts with CRP and recognizes an epitope present in the region 147 to 172 of the amino acid sequence of CRP shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a hybridoma CRP8 that produces the antibody.
  • this invention provides the CRP measuring reagent containing the said antibody.
  • the present invention provides a method for measuring CRP, characterized in that an immunoassay is performed by bringing the antibody into contact with a test sample.
  • CRP in a test sample can be detected with a very high sensitivity by a specific reaction, so that it can be used to capture extremely small inflammation in the body, such as local inflammation and small lesions. It is extremely useful for the discovery of various diseases and the severity, prognosis, and determination of therapeutic effects in clinical tests. Moreover, the cost reduction of a CRP measuring reagent can be expected by using a gene recombinant for antibody production.
  • Human CRP is a protein having a molecular weight of 105,000 Da consisting of five subunits. Its amino acid sequence is known, for example J. Biol. Chem. 260, 13377-13383, 1985.
  • the anti-CRP antibody of the present invention is reactive to human CRP and recognizes an epitope present in the region 147 to 172 of the amino acid sequence of CRP shown in SEQ ID NO: 1.
  • the antibodies include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, but particularly preferred are those produced from hybridoma CRP8 deposited under the accession number FERM ABP-11001, and the amino acid sequence of CRP 147 to 172 shown in SEQ ID NO: 1. Mention may be made of monoclonal antibodies that recognize epitopes present in the region.
  • Such an anti-CRP antibody that recognizes a specific region as an epitope can be obtained by a known method, for example, by preparing an antibody using a peptide containing the amino acid sequence of the region as an immunizing antigen. It can also be obtained by preparing an antibody by a conventional method, determining an epitope recognized by the obtained antibody, and selecting an antibody that recognizes the target epitope.
  • the epitope of the antibody can be determined by ELISA, Western blot or the like.
  • natural human CRP genetically modified CRP (rCRP), a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the like
  • rCRP genetically modified CRP
  • a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of obtaining an antibody with high titer and specificity.
  • the production of antibodies using natural human CRP is a well-known method, but there are many non-specific reactions in immunoassays, and when purified proteins are obtained from human serum, There are many problems such as product lot difference.
  • the method using the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is free from problems derived from the raw materials, and can be easily obtained in a facility having protein expression and peptide synthesis facilities, and is accurate and accurate.
  • the degree of specificity is high and extremely useful.
  • the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be produced by genetic engineering techniques, known peptide synthesis methods, or by cleaving CRP with an appropriate peptidase.
  • the peptide may be synthesized by, for example, either solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method.
  • the genetic engineering method is preferable, and the recombinant peptide is a known method, for example, a polypeptide encoding a peptide containing the 147 to 172 region of the amino acid sequence of CRP (including a peptide having substantially the same activity as this).
  • the nucleotide is cloned into an expression vector, then the resulting recombinant plasmid is introduced into an appropriate host cell such as E. coli, cultured under conditions capable of expression from the resulting transformant, and the desired peptide is obtained from the culture.
  • an appropriate host cell such as E. coli
  • E. coli E. coli
  • the desired peptide is obtained from the culture.
  • Can be prepared by separation and purification. Whether or not the target protein has been obtained can be confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like.
  • the polynucleotide encoding the region 147 to 172 of the CRP amino acid sequence can be obtained by a method commonly used in the field of genetic engineering, for example, PCR using an appropriate primer prepared based on the information on the amino acid sequence of CRP. Can be prepared by a method of amplifying the target gene.
  • proteins derived from mammals such as albumin and globulin; proteins such as keyhole limpet hemocyanin; microorganisms such as inactivated Mycobacterium tuberculosis; carriers such as polyamino acids such as polylysine and polyasparagine It is desirable to immunize in combination with.
  • the monoclonal antibody of the present invention is produced by a hybridoma obtained by fusing a mammalian antibody-producing cell immunized with an antigen and a mammalian myeloma cell according to a known method of a monoclonal antibody.
  • a sensitizing antigen is injected or orally administered into the abdominal cavity, subcutaneous, intravascular, muscle, or spleen of a mammal, and immunized.
  • the mammal to be immunized is not particularly limited, and is preferably selected in consideration of compatibility with the myeloma cell used for cell fusion in the subsequent operation, and specific examples include mice and rats.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS ((Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc., and then mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified. Administer to mammals several times every 4-21 days.
  • myeloma cells mammalian myeloma cells
  • myeloma cells those having appropriate markers such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (HGPRT ⁇ ) and thymidine kinase deficiency (TK ⁇ ) are preferable.
  • HGPRT ⁇ hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK ⁇ thymidine kinase deficiency
  • Fusion can be performed according to a known method.
  • polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), etc. can be used as a fusion promoter.
  • the mixing ratio of spleen cells and myeloma cells is preferably 1: 1 to 10: 1.
  • cell fusion can be performed by electrofusion or the like.
  • hybridomas can be selectively obtained by culturing in a normal selection medium. When the colonies become sufficiently large, search for strains that produce the desired antibody and single cloning. Do.
  • the hybridoma is cultured in, for example, a microplate, and the reactivity of the culture supernatant of a well in which growth has been observed to the antigen used for immunization of a mammal is generally used for detection of an antibody.
  • an enzyme immunoassay examples include ELISA and RIA.
  • the hybridoma producing the antibody of the present invention can be efficiently selected.
  • a limiting dilution method or a soft agar method can be used.
  • mouse thymocytes, peritoneal macrophages, or known additives having the same effect as the feeder as the feeder is preferable to use.
  • the hybridoma may be cultured in an appropriate medium or cultured in the peritoneal cavity of a mouse or the like.
  • the medium used here is not particularly limited as long as it is a medium suitable for hybridoma culture.
  • RPMI 1640 medium containing fetal bovine serum, L-glutamine, L-pyruvic acid and antibiotics (penicillin G and streptomycin) is used. Etc. are suitable.
  • the above-mentioned hybridoma is preferably added to the medium at a concentration of 10 4 to 10 5 cells / ml, and the culture is preferably performed for 2 to 4 days under conditions of 5% carbon dioxide gas and 37 ° C.
  • the antibody of the present invention can be obtained by centrifuging the supernatant obtained by this culture.
  • the intraperitoneal culture may be performed by administering the hybridoma into the abdominal cavity of the mouse and collecting the ascites.
  • the monoclonal antibody of the present invention in the culture supernatant can be used as it is, but may be used after purification by, for example, fractionation by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, protein A binding carrier, anti-IgG antibody column, etc. Good.
  • the polyclonal antibody of the present invention is prepared according to a known method of polyclonal antibody. That is, it can be obtained by immunizing a mammal similar to the above with a peptide containing the 147 to 172 region of the CRP amino acid sequence as an antigen, and collecting serum containing an antibody reactive to human CRP to be produced. it can.
  • Polyclonal antibodies can be used as they are, but may be purified and used in the same manner as described above.
  • the specificity of the anti-CRP antibody of the present invention can be confirmed, for example, by Western blotting, ELISA or the like.
  • the purity of the antibody is not particularly limited, and may be, for example, a globulin fraction or an affinity purified fraction.
  • the anti-CRP antibody of the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and may be a fragment of an antibody or a modified product thereof as long as it binds to CRP, and includes both a bivalent antibody and a monovalent antibody.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fv, Fab / c having one Fab and a complete Fc, or a single chain in which Fv of H chain or L chain is linked by an appropriate linker. Examples include chain Fv (scFv).
  • the anti-CRP antibody of the present invention thus obtained is useful for immunological measurement of human CRP in a test sample.
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain CRP. Specific examples include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, and the like.
  • a sample obtained from a test sample such as a culture solution of cells collected from the body of an organism is also included in the test sample of the present invention.
  • the immunological measurement method is not particularly limited, and for example, an octalony method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, an enzyme immunoassay method, a latex immunoassay method, a radioimmunoassay, a phloreumnoassay, etc. can be used. .
  • a latex agglutination method using an agglutination reaction typified by ELISA and LPIA is preferable.
  • the measurement includes quantitative or non-quantitative measurement.
  • the degree of the generated aggregate is visually determined as negative ( ⁇ ) or positive (+).
  • Qualitative methods can be used, and examples of quantitative measurement include measurement of CRP concentration and measurement of the amount of CRP.
  • the anti-CRP antibody of the present invention can be used after being labeled with a labeling substance, if necessary.
  • labeling substances include enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, and glucose oxidase; radioisotopes such as 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, and 131 I; fluorescence such as fluorescein isothiocyanate and rhodamine Substances: Chemical substances such as biotin, adipine and digokeshigenin.
  • the labeling substance is an enzyme
  • a substrate and, if necessary, a color former are used to measure the activity.
  • peroxidase hydrogen peroxide is used as a substrate, o-phenylenediamine, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine, 2,2′-azinodi- [3- Ethyl benzthiazoline sulfonic acid] ammonium salt, etc .; when alkaline phosphatase is used as the enzyme, p-nitrophenyl phosphate, 3- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2′-tricyclo) is used as a substrate.
  • ⁇ -D-galactosidase when ⁇ -D-galactosidase is used as the enzyme, ⁇ -D-galactopyrano as the substrate Sid, 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside, etc .; using glucose oxidase as enzyme
  • beta-D-glucose as a substrate in the presence of peroxidase, beta-D-glucose, may be used peroxidase color former as a color-developing agent.
  • the enzyme-labeled antibody to be used can be prepared by a known method, for example, the method of Nakane et al. (Nakane P. K et al, J. Histochem Cytochem, 22, 1084-1089, 1974) or the method of Ishikawa et al. : In accordance with “Enzyme Immunoassay 3rd Edition”, or the like, the unfragmented immunoglobulin molecule is left as it is, or the antibody is limitedly digested with an appropriate protease as necessary, F (ab ′) 2 , or After Fab ′, it can be labeled with an enzyme.
  • the anti-CRP antibody of the present invention can be immobilized on an insoluble carrier and used as an immobilized enzyme.
  • an insoluble carrier various synthetic polymers such as polystyrene, polyethylene, and polypropylene, glass, silicon, insoluble polysaccharides (cross-linked dextran, polysaccharides) and the like are preferable. These carriers are in the shape of a sphere, rod, fine particle, or a test tube. It can be used in the form of a microplate.
  • the conditions for preparing the insolubilized antibody were as follows: in the form of a sphere, rod, test tube, microplate, and in the form of fine particles, the antibody concentrations were 1 to 10 ⁇ g / ml and 1 to 10 mg / ml, and the buffer solution was phosphorous. It is preferable to prepare an acid buffer solution, glycine buffer solution, carbonate buffer solution, Tris buffer solution, etc., at a pH of 7 to 10 neutral to alkaline at room temperature or 4 ° C. for 1 to 72 hours.
  • the binding between the anti-CRP antibody and CRP is usually performed in a buffer solution.
  • the buffer is not particularly limited as long as it can cause an antigen-antibody reaction, but phosphate buffer, glycine buffer, Tris-HCl buffer, Good buffer, and the like are preferable.
  • the pH in the reaction is preferably in the range of pH 7-9.
  • water-soluble polymers such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone and pullulan; stabilizers such as bovine serum albumin and sucrose; antiseptics such as sodium azide, etc.
  • Additives such as sodium chloride may be added as appropriate.
  • the CRP measurement reagent of the present invention may be a one-component reagent in which an anti-CRP antibody is dispersed and dissolved, and may be used as a two-component or three-component reagent.
  • the reagent also includes a kit, and the kit may appropriately include a blocking solution, a reaction solution, a reagent for treating the sample, and the like.
  • the concentration of the antibody against CRP in the CRP measurement reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration capable of measuring CRP in a test sample, but is preferably 50 to 400 ⁇ g / mL, particularly 100 to 200 ⁇ g / mL. It is preferable to use mL. If it is less than 50 ⁇ g / mL, the sensitivity is low, so that accurate quantification in a low concentration range is difficult, and if it exceeds 400 ⁇ g / mL, a nonspecific reaction tends to occur.
  • the conventional CRP quantification method using LPIA has a sensitivity of about 500 ng / mL and cannot catch local inflammation or small-site lesions.
  • the sensitivity is 3 to 5 ng / mL. It is extremely high and can capture even the smallest inflammation in the body. Therefore, the CRP measurement reagent of the present invention is suitably used for diagnosis of various infectious diseases, inflammatory diseases, and diseases that cause tissue destruction, observation of treatment progress, and the like. Examples of such diseases include rheumatism, bacterial infections, viral hepatitis, pneumonia, macular degeneration, urinary tract infections, tissue destruction diseases, ischemic heart diseases, neonatal infections, periodontal diseases Disease, worsening inflammation of the palatine tonsils.
  • Example 1 Preparation of anti-CRP antibody [Preparation of rCRP] (1) Preparation of CRP gene DNA was extracted from leukocyte components in human blood. DNA was extracted by adding 3 times the amount of EDTA solution to whole blood. Using this DNA as a template, 6 types of gene fragments were amplified by PCR using 7 types of primers constructed based on the CRP gene sequence (J. Biol. Chem., 260, 13377-13383, 1985).
  • Primers are forward of MK01 (SEQ ID NO: 2), MK02 (SEQ ID NO: 3), MK03 (SEQ ID NO: 4), MK04 (SEQ ID NO: 5), MK05 (SEQ ID NO: 6) or MK06 (SEQ ID NO: 7) described in Table 1.
  • a primer and a reverse primer were used.
  • FIG. 1 Six types of DNA fragments (FIG. 1) amplified by PCR were purified using crystal violet gel by a conventional method. (2) Next, genetic recombination was performed using E. coli for the host cells. The DNA fragments obtained as described above were subcloned into pET-100 / D-TOPOvector (Invitrogen), transfected into Top10 as an E. coli host on ice, plated on an LB Ampicline plate, and incubated at 37 ° C. for 15 hours. A single colony was formed.
  • pET-100 / D-TOPOvector Invitrogen
  • colony PCR was performed using the insert gene primer, and only the colonies whose bands were confirmed were subcultured to an LB Ampicline plate and incubated at 37 ° C. for 15 hours. The culture was stirred (200 rpm).
  • the Escherichia coli cell pellets collected above were dissolved in a lysis buffer, the cells were disrupted by freezing and thawing using liquid nitrogen, and centrifuged. The resulting supernatant and the protein in the pellet were confirmed by SDS-PAGE electrophoresis. As a result, bands could be detected in 6 types of expressed proteins.
  • the band of the expressed protein is the molecular weight of the His tag protein (4774 Da) bound to MK01 26.7 kDa, MK02 26.3 kDa, MK03 19.9 kDa, MK04 11.7 kDa, MK05 6.8 kDa, MK06 4.0 kDa. And the molecular weights of the bands were consistent.
  • Balb / C mice were immunized with the rCRP prepared above.
  • an immune protein prepared to 100 ⁇ g / animal and emulsified using FCA (Freund's complete adjuvant (H37 Ra), Difco (3113-60), Becton Dickinson (cat # 231113)) is used. It was administered subcutaneously.
  • an immune protein prepared to 50 ⁇ g / animal after 2 weeks and emulsified with FIA (Freund's incomplete adjuvant, Difco (0639-60), Becton Dickinson (cat # 263910)) was administered subcutaneously did. Thereafter, booster immunization was performed 5 times in total at 1-week intervals.
  • the final immunization was diluted in PBS to 50 ⁇ g / mouse and administered into the tail vein. After confirming that the antibody titer in the serum against CRP is saturated by ELISA using an immunoplate, mouse myeloma cells P3U1 and mouse spleen cells are mixed, and PEG1500 (Roche Diagnostics, cat # 783 641) is used. Cell fusion was performed. After seeding in a 96-well culture plate, the culture supernatant was screened by ELISA after selection on HAT medium from the next day. Positive clones were monocloned by the limiting dilution method, expanded, and the culture supernatant was collected. The screening by ELISA was performed using the binding activity with CRP as an index, and an anti-CRP monoclonal antibody having strong binding ability was obtained.
  • the antibody was purified using Hi Trap ProteinG HP (Amersham CAT # 17-0404-01). The hybridoma culture supernatant was directly charged onto the column, washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)), and then eluted with an elution buffer (0.1 M glycine-HCl (pH 2.7)). Elution was performed in a tube to which neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)) was added, and neutralized immediately. The antibody fractions were pooled and dialyzed against 0.05% Tween20 / PBS for 24 hours to replace the buffer. After adding NaN 3 so that the purified antibody was 0.02%, it was stored at 4 ° C.
  • the hybridoma producing 050921 was named CRP8, and was dated August 28, 2008, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Address: 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) (Receipt number: FERM ABP-11001).
  • the isotyping of the anti-CRP monoclonal antibody was performed using ImmunoPure Monoclonal Antibody Isolation Kit II (PIERCE CAT # 37502), and the method was in accordance with the attached manual. The results of isotyping were all IgG1 type.
  • anti-CRP monoclonal antibody Lot. 050921, Lot. 030700 and Lot. CP80105 was used for the following experiments.
  • Example 2 [Confirmation of antibody recognition site by sandwich ELISA] The epitope analysis of the anti-CRP monoclonal antibody prepared in Example 1 was performed using the expressed protein (MK01 to MK06). 50 ⁇ L of capture antibody (anti-CRP IgG rabbit serum) diluted to 10 ⁇ g / ml with sodium carbonate Buffer was added to a 96-well plate and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. The antibody solution was removed, 100 ⁇ l of 6% blocking buffer was added per well, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBS-T, 50 ⁇ l of expressed protein (antigen) diluted with Lysis Buffer was added per well, and allowed to stand at 37 ° C.
  • a primary antibody (anti-CRP monoclonal antibody) diluted to 0.5 mg / ml with PBS was added and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • a secondary antibody (anti-mouse IgG goat serum HRP-labeled antibody) diluted to 0.1 ⁇ g / ml with PBS was added and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • 50 ⁇ L of color developing solution was added per well, and the mixture was allowed to stand for 20 minutes in the dark.
  • Example 3 [Confirmation of specificity of anti-CRP antibody by Western blotting]
  • the expressed protein obtained above was electrophoresed using a 12.5% polyacrylamide gel, transferred to a PVDF filter, and blocked for 1 h. After washing with PBS-T, anti-CRP monoclonal antibody diluted to 1.0 ⁇ g / ml with PBS-T was reacted for 1 hour, washed with PBS-T, and diluted to 0.2 ⁇ g / ml with PBS-T IgG goat serum HRP-labeled antibody was reacted for 1 hour. After washing with PBS-T, it was exposed to a chemiluminescence detection reagent. As a result, as apparent from Table 3, Lot.
  • Test Example 1 Evaluation of Anti-CRP Antibody (1) Preparation Method of Latex Reagent Suspension of 1% carboxyl group-modified latex particles (“Immutex” manufactured by JSR Corporation) in a suspension of 2.0 mg and 50 mg of 20 mg / mL WSC solution 0.23 mL of NHS solution / mL concentration was sequentially added with stirring to activate the carboxyl group on the latex surface. After activation, the mixture was centrifuged (16000 rpm, 4 ° C., 20 min), divided into a supernatant and a precipitate, and the precipitate was washed with the MES buffer. 0.5 mg of an anti-CRP monoclonal antibody (Lot.
  • Example 2 (2) Evaluation of Latex Reagent
  • the rCRP obtained in Example 1 was detected using the Latex reagent prepared in (1) above.
  • LPIA-500 manufactured by Mitsubishi Chemical Yatron Corporation
  • the aggregation rate was measured at a wavelength of 800 nm.
  • the measurement was performed with the antigen concentration set to 0 to 100 mg / ml.
  • CRP quantification and detection limit measurement were performed based on a calibration curve prepared from the average reaction rate of the latex reagent.
  • FIG. 050921-sensitized Latex reagent showed highly sensitive and stable measurement values from 3 ng / ml to 0.0596 mg / ml.
  • Lot. CP80105 sensitized Latex reagent is 0.0002 to 0.0313 mg / ml, lot.
  • the 030700-sensitized Latex reagent was 0.0002 to 0.005 mg / ml.
  • Test Example 2 CRP Measurement in Human Serum Using the Latex reagents (Lot. 050921 and CP80105) prepared above, the CRP concentration in 30 mL of serum obtained by collecting blood from patients with liver diseases was measured. The measurement result of each anti-CRP monoclonal sensitized Latex reagent was compared with the measurement result of the anti-CRP polyclonal antibody-sensitized Latex reagent (anti-CRP PoAb sensitized Latex reagent). As a result, as shown in FIG. In the 050921 anti-CRP monoclonal antibody sensitized Latex reagent, the measured value of the same sample is about half that of the anti-CRP PoAb sensitized Latex reagent.
  • the anti-CRP PoAb-sensitized Latex reagent has a large number of epitopes and may show non-specific reactions with other substances, whereas the antibody of the present invention reacts specifically with only one epitope. It is thought that it originates in showing. In addition, Lot. It can be seen that the reactivity is high even when compared with the CP80105 anti-CRP monoclonal antibody-sensitized Latex reagent.

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Abstract

　被検試料中のＣＲＰを特異的に認識し、高い感度で測定できる手段の提供。 　Ｃ－反応性タンパク質（以下、ＣＲＰという）に反応し、配列番号１に示すＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域に存在するエピトープを認識する抗ＣＲＰ抗体。

Description

抗ＣＲＰ抗体及びその利用
　本発明は、抗ＣＲＰ抗体及びその利用に関し、より詳細にはＥｐｉｔｏｐｅ解析法を利用して抗ＣＲＰ抗体が認識するＣＲＰ上の反応部位を特定し、当該反応部位を利用して作製した抗体を用いてイムノアッセイを行うことによりＣＲＰを特異的且つ高感度に測定する方法に関する。
　Ｃ－反応性タンパク（ＣＲＰ）は、肺炎双球菌のＣ多糖体と沈降反応を示す血清タンパク質で、通常正常ヒト血清中に微量（平均５８０ｎｇ／ｍｌ）に存在する。ＣＲＰは、炎症性疾患や組織の変性・壊死が生じると急速に血中に増加し、病状の回復に伴い速やかに減少する特徴をもつ。従って、血中ＣＲＰ濃度の測定は、関節リウマチ、細菌性感染症、ウイルス性肝炎、肺炎、尿路感染症などの炎症、組織破壊性疾患の診断に広く臨床的に利用されている（非特許文献１参照）。
　従来のＣＲＰ測定は、急性炎症時における通常時からの大幅な濃度上昇を測定していたため、感度に優れた測定法はあまり必要とされていなかった。しかし、近年、虚血性心疾患（心筋梗塞）や新生児感染症等の予知マーカーとしての有用性が確認され、その測定には精密性と高感度性が要求されている。また、ＣＲＰと歯周病等の様々な疾患との関連性も指摘され、微量（低濃度）のＣＲＰ測定値の臨床的意義は極めて高い（非特許文献２参照）。
　一方、ＣＲＰ測定に使用される抗ＣＲＰ抗体は、主に天然タンパク質を抗原として作製されている。そのため、非特異的反応が起こり易く、また精製タンパク質をヒト血清から得る場合は、倫理的な問題や製造物にロット差があるなど多くの問題がある。
　そこで、遺伝子組換えヒトＣＲＰ（ｒＣＲＰ）を用いて抗体を作製する方法も提案されているが、結合特異性において十分とはいえない。
福岡良男ら、臨床免疫学、医歯薬出版、１９９７年 高橋伯夫、「高感度ＣＲＰ測定法の病態診断的有用性」、臨床病理、２００２年、第５０巻、ｐ３０－３９
　本発明は、被検試料中のＣＲＰを特異的に認識し、高い感度で測定できる手段を提供することを目的とする。
　抗ＣＲＰ抗体がＣＲＰ上のどの領域を認識して結合するかは従来知られておらず、ＣＲＰの特定部位を認識することが明らかな抗ＣＲＰ抗体は得られていない。そこで、本発明者は、Ｅｐｉｔｏｐｅ解析法を利用して抗ＣＲＰ抗体が認識するＣＲＰ上の反応部位の解析を行ったところ、ＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域に抗原特異性を有する抗体を見出した。そして、当該領域を認識する抗体を用いてイムノアッセイを行えば、極めて特異的に且つ高感度で被検試料中のＣＲＰを測定できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、ＣＲＰに反応し、配列番号１に示すＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域に存在するエピトープを認識する抗ＣＲＰ抗体を提供するものである。
　また、本発明は、上記抗体を産生するハイブリドーマＣＲＰ８を提供するものである。
　また、本発明は、上記抗体を含有するＣＲＰ測定試薬を提供するものである。
　さらに、本発明は、被検試料に上記抗体を接触させて免疫測定を行うことを特徴とするＣＲＰの測定方法を提供するものである。
　本発明によれば、特異的反応によって被検試料中のＣＲＰを極めて高感度に検出できるため、これを用いれば、局所的炎症や小部位の病変等、体内の極小さい炎症も捉えることができ、臨床検査において様々な疾患の発見や重症度、予後、あるいは治療効果の判定などに極めて有用である。また、抗体作製に遺伝子組換え体を利用することで、ＣＲＰ測定試薬のコストダウンが期待できる。
ＰＣＲで増幅したＣＲＰ遺伝子を示す図である。 抗ＣＲＰモノクローナル抗体感作Ｌａｔｅｘ試薬の反応性の結果を示す図である。 肝疾患検体中のＣＲＰ濃度を測定した結果を示す図である。
　ヒトＣＲＰは、５つのサブユニットからなる分子量１０５，０００Ｄａのタンパク質である。そのアミノ酸配列は公知であり、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１３３７７－１３３８３，１９８５に記載されている。
　本発明の抗ＣＲＰ抗体は、ヒトＣＲＰに対して反応性を有し、配列番号１に示すＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域に存在するエピトープを認識する。抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれをも含むが、特に好ましいものとして、受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１００１として寄託されたハイブリドーマＣＲＰ８より産生され、配列番号１に示すＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体を挙げることができる。
　このような特定の領域をエピトープとして認識する抗ＣＲＰ抗体は、公知の方法により得ることができ、例えば前記領域のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫抗原として抗体を作製することにより得ることができる。また、常法により抗体を作製した後、得られた抗体が認識するエピトープを決定し、目的のエピトープを認識する抗体を選択することにより得ることもできる。ここで、抗体のエピトープは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどにより決定することができる。
　本発明において、免疫抗原としては、天然型ヒトＣＲＰや遺伝子組換え型ＣＲＰ（ｒＣＲＰ）、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドなどを使用することができる。特に、力価及び特異性の高い抗体を得る点から、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドを用いるのが好ましい。上述したように、天然型ヒトＣＲＰを用いる抗体の生産は良く知られた方法であるが、イムノアッセイにおいて非特異的な反応が多く、また精製タンパク質をヒト血清から得る場合は、倫理的な問題や製造物のロット差の問題など多くの問題がある。これに対し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドを利用する方法は、原料に由来する問題がなく、またタンパク発現やペプチド合成設備を有する施設で容易に入手可能であり、測定精度や正確度においても特異性が高く、極めて有用である。
　配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいはＣＲＰを適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
　なかでも、遺伝子工学的手法が好ましく、組換えペプチドは、公知の方法、例えばＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域を含むペプチド（これと実質的に同じ活性を有するペプチドも含む）をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、次いで得られた組換えプラスミドを大腸菌などの適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、その培養物から所望のペプチドを分離及び精製することによって調製することができる。目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動などにより確認することができる。
　ここで、ＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えばＣＲＰのアミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なプライマーを用いてＰＣＲにより目的の遺伝子を増幅する方法などにより調製することができる。
　ペプチドを免疫抗原として用いる場合には、アルブミン、グロブリンなどの哺乳動物由来タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニンなどのタンパク質；不活性化した結核菌などの微生物；ポリリジン、ポリアスパラギンなどのポリアミノ酸などの担体と結合させて免疫することが望ましい。
　本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の公知な方法に従って、抗原を免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生される。
　すなわち、先ず感作抗原を哺乳動物の腹腔内、皮下、血管内、筋肉、脾臓内などに注射、或いは経口的に投与し免疫する。ここで、免疫する哺乳動物は特に制限されず、後の操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットなどが具体例として挙げられる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。
　次に、免疫動物から採取した脾臓細胞を、マウスなど哺乳動物の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と融合させる。骨髄腫細胞としては、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ－）やチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ－）等の適切なマーカーを有するものが好ましい。具体的には、マウスＰ３／ＮＳ１／１－Ａｑ４－１、などが挙げられる。融合は、公知の手法に準じて行うことができる。また、融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を用いることができる。脾臓細胞と骨髄腫細胞との混合比は１：１～１０：１が好ましい。場合によっては、電気融合法等により細胞融合を行うこともできる。
　細胞融合した後、通常の選択用培地で培養することによりハイブリドーマを選択的に得ることができ、そのコロニーが充分に大きくなったところで目的とする抗体を産生する株の検索及び単一クローン化を行う。
　ハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロプレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の哺乳動物の免疫感作に用いた抗原に対する反応性を、一般に抗体の検出に用いられている方法、例えば酵素免疫測定法により測定することにより行うことができる。酵素免疫測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどが挙げられる。ここで、ヒトＣＲＰに加え、上記１４７～１７２領域のアミノ酸配列との反応性を評価することにより、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを効率的に選択できる。
　選択されたハイブリドーマを単クローン化するには、例えば限界希釈法や軟寒天法により行うことができる。この際、フィーダーとしてマウス胸腺細胞や腹腔マクロファージ、あるいはこれらと同様の効果を有する公知の添加剤を用いることが好ましい。
　得られた単クローン化ハイブリドーマを用いて本発明の抗体を製造するには、当該ハイブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス等の腹腔内で培養すればよい。ここで用いられる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれば特に制限されず、例えば牛胎児血清、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地等が好適である。培養は、例えば上記ハイブリドーマを１０４～１０５個／ｍｌ濃度で培地に加え、５％炭酸ガス濃度、３７℃の条件下で２～４日間程度行うのが好ましい。この培養により得られた上清を遠心分離等すれば、本発明の抗体を得ることができる。一方、腹腔内培養は、ハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水を回収すればよい。
　培養上清中の本発明のモノクローナル抗体はこのままでも使用可能であるが、例えば硫安沈澱による分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗ＩｇＧ抗体カラム等によって精製して用いてもよい。
　本発明のポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体の公知な方法に従って調製される。すなわち、上記と同様な哺乳動物に、ＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域を含むペプチドを抗原として免疫し、製造されるヒトＣＲＰに反応性を有する抗体を含む血清を採取することにより得ることができる。ポリクローナル抗体はそのまま使用できるが、上記と同様に精製して用いてもよい。
　本発明の抗ＣＲＰ抗体の特異性は、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡなどにより確認できる。
　抗体の純度としては特に限定されず、例えばグロブリン画分であってもアフィニティ精製画分であってもよい。また、本発明の抗ＣＲＰ抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＣＲＰに結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
　このようにして得られる本発明の抗ＣＲＰ抗体は、被検試料中のヒトＣＲＰの免疫学的測定に有用である。ここで、被検試料としては、ＣＲＰが含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的な例としては、例えば血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができる。また、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
　免疫学的測定法としては、特に制限されず、例えばオクタロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フロロイムノアッセイなどを利用することができる。これらのうち、ＥＬＩＳＡ及びＬＰＩＡ法に代表される凝集反応を利用したラテックス凝集法が好ましい。ここで、測定とは、定量的又は非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、生成した凝集物の度合いを目視で陰性（－）か陽性（＋）かを判定する定性法が挙げられ、定量的な測定としては、ＣＲＰの濃度の測定、ＣＲＰの量の測定などを挙げることができる。
　本発明の抗ＣＲＰ抗体は、必要に応じて標識物質で標識して用いることができる。標識物質としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素；３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなどのラジオアイソトープ；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンなどの蛍光物質；ビオチン、アジピン、ジゴケシゲニンなどの化学物質などが挙げられる。
　標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、及び必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ－フェニレンジアミン、３，３′，５，５′－テトラメチルベンチジン、２，２′－アジノジ－〔３－エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アンモニウム塩等；酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基質として、ｐ－ニトロフェニルフォスフェート、３－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－トリシクロ－〔３．３．１．１３，７〕デカン｝－４－イル）フェニルフォスフェート：ＡＭＰＰＤ等；酵素としてβ－Ｄ－ガラクトシダーゼを用いる場合には、基質として、β－Ｄ－ガラクトピラノシド、４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等；酵素としてグルコースオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼの共存下で基質として、β－Ｄ－グルコース、発色剤としてペルオキシダーゼの発色剤を用いることができる。
　使用する酵素標識抗体は公知の方法によって作成することができ、例えば中根らの方法（Ｎａｋａｎｅ　Ｐ．Ｋ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４－１０８９，１９７４）あるいは石川らの方法（マレイミド法：「酵素免疫測定法　第３版」医学書院）などに従い、断片化していない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ（ａｂ’）２、又はＦａｂ’とした後、酵素で標識することができる。
　また、本発明の抗ＣＲＰ抗体は、不溶性担体に固定化し、固定化酵素として用いることもできる。不溶性担体としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの各種合成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架橋デキストラン、ポリサッカライド）などが好ましく、これらの担体は球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは試験管、マイクロプレートなどの形態で用いることができる。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒状、試験管、マイクロプレートの形態の場合及び微粒子の形態の場合、抗体濃度は各々１～１０μｇ／ｍｌ及び１～１０ｍｇ／ｍｌ、緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などのｐＨ７～１０の中性からアルカリ性、室温又は４℃で１時間～７２時間で調製することが好ましい。
　抗ＣＲＰ抗体とＣＲＰとの結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、抗原抗体反応が起こり得る溶液であれば特に制限されないが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。反応におけるｐＨは、ｐＨ７～９の範囲が好ましい。また、上記反応液に、感度向上、反応促進又は安定化を目的に、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プルラン等の水溶性高分子；ウシ血清アルブミン、ショ糖等の安定剤；アジ化ナトリウム等の防腐剤；塩化ナトリウム等の添加剤等を適宜添加してもよい。
　本発明のＣＲＰ測定試薬には、抗ＣＲＰ抗体の他に、非特異性反応の防止、保存安定性の点から、ウシ血清アルブミン、ショ糖等を適宜溶解させてもよく、また塩濃度調整のために塩化ナトリウム等を溶解させてもよい。
　さらに、本発明のＣＲＰ測定試薬は、抗ＣＲＰ抗体を分散及び溶解させた１液型試薬であってもよく、２液型又は３液型試薬として使用してもよい。また、試薬には、キットも含まれ、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
　本発明のＣＲＰ測定試薬中のＣＲＰに対する抗体の濃度としては、被検試料中のＣＲＰを測定できる濃度であれば特に制限されないが、５０～４００μｇ／ｍＬとするのが好ましく、特に１００～２００μｇ／ｍＬとするのが好ましい。５０μｇ／ｍＬ未満であると、感度が低いため、低濃度域での正確な定量ができにくく、他方４００μｇ／ｍＬを超えると、非特異的な反応を生じ易い。
　従来のＬＰＩＡを利用したＣＲＰ定量法は、感度が５００ｎｇ／ｍＬ程度であり、局所的炎症や小部位の病変を捉えることはできなかったが、本発明においては、感度が３～５ｎｇ／ｍＬと極めて高く、体内の極小さい炎症までも捉えることが可能である。従って、本発明のＣＲＰ測定試薬は、各種の感染症、炎症性疾患及び組織破壊をきたす疾患の診断や治療経過観察等に好適に用いられる。
　そのような疾患の例としては、リウマチ、細菌性感染症、ウィルス性肝炎、肺炎、黄斑変性症、尿路感染症などの炎症、組織破壊性疾患、虚血性心疾患、新生児感染症、歯周病、口蓋扁桃腺の炎症悪化などが挙げられる。
　以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
実施例１　抗ＣＲＰ抗体の作製
［ｒＣＲＰの調製］
（１）ＣＲＰ遺伝子の調製
　ヒト血液中の白血球成分からＤＮＡの抽出を行った。全血に３倍量のＥＤＴＡ溶液を加えてＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型とし、ＣＲＰの遺伝子配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１３３７７－１３３８３，１９８５）をもとに構築した７種類のプライマーにより６種類の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。プライマーは、表１記載のＭＫ０１（配列番号２）、ＭＫ０２（配列番号３）、ＭＫ０３（配列番号４）、ＭＫ０４（配列番号５）、ＭＫ０５（配列番号６）又はＭＫ０６（配列番号７）のフォワードプライマー及びリバースプライマー（配列番号８）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＰＣＲにより増幅された６種類のＤＮＡ断片（図１）を常法によりクリスタルバイオレットゲルを用いて精製した。
（２）次に宿主細胞に大腸菌を用いた遺伝子組換えを行った。上記により得られたＤＮＡ断片を、ｐＥＴ－１００／Ｄ－ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれサブクローニングし、氷上で大腸菌宿主であるＴｏｐ１０にトランスフェクションしてＬＢ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅプレートに全量を撒き、３７℃で１５時間インキュベートしてシングルコロニーを形成させた。生じたコロニーに目的のプラスミドが存在しているかどうかを調べるためにインサート遺伝子のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、バンドが確認できたコロニーのみをＬＢ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅプレートに継代し、３７℃で１５時間攪拌（２００ｒｐｍ）培養した。
（３）上記の操作によって得たプラスミドを大腸菌宿主であるＢＬ２１にトランスフェクションしてＬＢ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅプレートに全量を撒き、３７℃で１５時間インキュベート（２００ｒｐｍ）してシングルコロニーを形成させた。コロニーを回収し、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ入りのＬＢ培地に継代し、ＯＤ６００＝０．５になった時点で培養液を２つに分けた。一方の培養液にのみ最終濃度が１．０ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、部分組換えヒトＣＲＰの発現を誘導した。その後１時間おきに培養液を採取した（０～５時間）。採取した培養液を１６，０００×ｇ、１分で遠心した後得られたペレットを凍結した。
（４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる発現タンパク質の確認
　上記で回収した大腸菌菌体ペレットをＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒでタンパク質を溶解して液体窒素を用いた凍結融解で菌体を破砕し、遠心分離を行った。得られた上清とペレット中のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で確認した。
　その結果、６種類の発現タンパクにおいてバンドを検出できた。発現タンパク質のバンドはＭＫ０１　２６．７ｋＤａ，ＭＫ０２　２６．３ｋＤａ，ＭＫ０３　１９．９ｋＤａ，ＭＫ０４　１１．７ｋＤａ，ＭＫ０５　６．８ｋＤａ，ＭＫ０６　４．０ｋＤａにＨｉｓ　ｔａｇタンパク質（４７７４Ｄａ）が結合した分子量であり、この分子量とバンドの分子量はいずれも一致した。
［抗体の作製］
　上記で調製したｒＣＲＰをＢａｌｂ／Ｃマウス（ＣＲＬ）に免疫した。初回免疫には免疫タンパク質を１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７　Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３－６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ♯２３１１３１））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。さらに、２週間後に免疫タンパク質を５０μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９－６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ♯２６３９１０））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行った。最終免疫については、５０μｇ／匹となるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。イムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＣＲＰに対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３　６４１）により細胞融合を行った。９６穴培養プレートに播種し、翌日よりＨＡＴ培地で選択後培養上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。
　陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養を行い培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、ＣＲＰとの結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗ＣＲＰモノクローナル抗体を得た。
　抗体の精製はＨｉ　Ｔｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＧ　ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＣＡＴ♯１７－０４０４－０１）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（２０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ　グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出は中和バッファー（１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに行い直ちに中和した。抗体画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。
　得られたハイブリドーマのうち、モノクローナル抗体Ｌｏｔ．０５０９２１を産生するハイブリドーマをＣＲＰ８と命名し、平成２０年（２００８）年８月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に寄託した（受領番号：ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１００１）。
　抗ＣＲＰモノクローナル抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔ　ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ　ＣＡＴ♯　３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従った。アイソタイピングの結果全てＩｇＧ１タイプであった。
　得られた抗体のうち、抗ＣＲＰモノクローナル抗体Ｌｏｔ．０５０９２１、Ｌｏｔ．０３０７００及びＬｏｔ．ＣＰ８０１０５を以下の実験に用いた。
実施例２［サンドイッチＥＬＩＳＡによる抗体認識部位の確認］
　実施例１で作製した抗ＣＲＰモノクローナル抗体のエピトープ解析を発現タンパク質（ＭＫ０１～ＭＫ０６）を用いて行った。
　９６ｗｅｌｌプレートに炭酸ナトリウムＢｕｆｆｅｒで１０μｇ／ｍｌに希釈したキャプチャー抗体（抗ＣＲＰＩｇＧウサギ血清）を１ｗｅｌｌあたり５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。抗体溶液を除き、６％ブロッキングＢｕｆｆｅｒを１ｗｅｌｌあたり１００μｌ添加し、３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒで希釈した発現タンパク質（抗原）を１ｗｅｌｌあたり５０μｌ添加し、３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した１次抗体（抗ＣＲＰモノクローナル抗体）を添加し，３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳで０．１μｇ／ｍｌに希釈した２次抗体（抗マウスＩｇＧヤギ血清ＨＲＰ標識抗体）を添加し、３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、発色液を１ｗｅｌｌあたり５０μＬ添加し、遮光して２０分間静置した。発色を確認後、反応停止液（１Ｎ硫酸）５０μＬを発色液に加え，マイクロプレートリーダーで波長４９２ｎｍで吸光度を測定した。
　その結果、表２に示すように、Ｌｏｔ．０５０９２１はＭＫ０６に対して反応を示さなかったことから、エピトープは配列番号１に示すアミノ酸配列、すなわちＣＲＰのアミノ酸配列中１４７～１７２領域に存在することが判明した。また、Ｌｏｔ．０３０７００及びＬｏｔ．ＣＰ８０１０５のエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中１７３～２０６領域に存在することが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３［ウェスタンブロッティングによる抗ＣＲＰ抗体の特異性の確認］
　上記で得られた発現タンパクを１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＰＶＤＦフィルターに転写し、１ｈブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで１．０μｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＲＰモノクローナル抗体を１時間反応させ、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで０．２μｇ／ｍｌに希釈した抗マウスＩｇＧヤギ血清ＨＲＰ標識抗体を１時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、化学発光検出試薬で感光させた。
　その結果、表３から明らかなように、Ｌｏｔ．０５０９２１はＭＫ０６に対して反応を示さなかったことから、エピトープは配列番号１に示すアミノ酸配列、すなわちＣＲＰのアミノ酸配列中１４７～１７２領域に存在することが判明した。また、Ｌｏｔ．０３０７００及びＬｏｔ．ＣＰ８０１０５のエピトープは、配列番号１に示すアミノ酸配列中１７３～２０６領域に存在することが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
試験例１　抗ＣＲＰ抗体の評価
（１）Ｌａｔｅｘ試薬の作製法
　１％カルボキシル基修飾ラテックス粒子（「Ｉｍｍｕｔｅｘ」ＪＳＲ（株）社製）懸濁液に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度ＷＳＣ溶液２．０ｍＬと５０ｍｇ／ｍＬ濃度ＮＨＳ溶液０．２３ｍＬを攪拌しながら順に加え、ラテックス表面のカルボキシル基を活性化させた。活性化後、遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上澄みと沈殿に分け、沈殿物を上記ＭＥＳ緩衝液で洗浄した。これに０．５ｍｇの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（Ｌｏｔ．０５０９２１，０３０７００，ＣＰ８０１０５）を加え、３７℃で３０分間攪拌した。攪拌後遠心分離（１６０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ）し、上澄みと沈殿に分けた。上澄みは後の操作でラテックス粒子への抗ＣＲＰ抗体結合量の定量に使用した。
　沈殿を、上記ＭＥＳ緩衝液に懸濁し、変性ＢＳＡを１ｍＬ加え、２５℃で３０分間攪拌し、ラテックス粒子表面の抗ＣＲＰ抗体結合部位のブロッキングを行った。ブロッキング後、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２．０ｍＬに懸濁し、抗ＣＲＰモノクローナル抗体感作Ｌａｔｅｘ試薬とした。
（２）Ｌａｔｅｘ試薬の評価
　上記（１）で作製したＬａｔｅｘ試薬を用い、実施例１で得たｒＣＲＰの検出を行った。測定にはＬＰＩＡ－５００（三菱化学ヤトロン社製）を用い、波長８００ｎｍで凝集速度を測定した。この時、抗原濃度を０～１００ｍｇ／ｍｌに設定して測定を行った。ＣＲＰ定量と検出限界の測定は、ラテックス試薬の平均反応速度から検量線を作成し、それをもとに行った。
　その結果、図２に示すように、Ｌｏｔ．０５０９２１感作Ｌａｔｅｘ試薬は３ｎｇ／ｍｌから０．０５９６ｍｇ／ｍｌと、高感度で安定した測定値を示した。また、Ｌｏｔ．ＣＰ８０１０５感作Ｌａｔｅｘ試薬は０．０００２から０．０３１３ｍｇ／ｍｌであり、Ｌｏｔ．０３０７００感作Ｌａｔｅｘ試薬は０．０００２から０．００５ｍｇ／ｍｌであった。
試験例２　ヒト血清中ＣＲＰ測定
　上記で作製したＬａｔｅｘ試薬（Ｌｏｔ．０５０９２１及びＣＰ８０１０５）を用いて、肝疾患患者から採血して得られた血清３０ｍＬ中のＣＲＰ濃度を測定した。各抗ＣＲＰモノクローナル感作Ｌａｔｅｘ試薬の測定結果を、抗ＣＲＰポリクローナル抗体感作Ｌａｔｅｘ試薬（抗ＣＲＰ　ＰｏＡｂ感作Ｌａｔｅｘ試薬）での測定結果と比較した。
　その結果、図３に示すように、肝疾患検体におけるＬｏｔ．０５０９２１抗ＣＲＰモノクローナル抗体感作Ｌａｔｅｘ試薬では、同検体の測定値が抗ＣＲＰ　ＰｏＡｂ感作Ｌａｔｅｘ試薬の約半分ほどになっている。これは抗ＣＲＰ　ＰｏＡｂ感作Ｌａｔｅｘ試薬には多数のエピトープがあり他の物質と非特異的な反応を示す可能性があるのに対し、本発明の抗体は、１つのエピトープとのみ特異的な反応を示すことに起因していると考えられる。また、Ｌｏｔ．ＣＰ８０１０５抗ＣＲＰモノクローナル抗体感作Ｌａｔｅｘ試薬と比較しても反応性が高いことがわかる。

Claims (10)

  1. 　Ｃ－反応性タンパク質（以下、ＣＲＰという）に反応し、配列番号１に示すＣＲＰのアミノ酸配列の１４７～１７２領域に存在するエピトープを認識する抗ＣＲＰ抗体。
  2. 　モノクローナル抗体である請求項１記載の抗ＣＲＰ抗体。
  3. 　受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１００１として寄託されたハイブリドーマより産生されるものである請求項２記載の抗ＣＲＰ抗体。
  4. 　配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として得られたものである請求項１～３のいずれか１項記載の抗ＣＲＰ抗体。
  5. 　ペプチドが組換えペプチドである請求項４記載の抗ＣＲＰ抗体。
  6. 　ハイブリドーマＣＲＰ８（受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１００１）。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項記載の抗ＣＲＰ抗体を含有するＣＲＰ測定試薬。
  8. 　被検試料に請求項１～５のいずれか１項記載の抗ＣＲＰ抗体を接触させて免疫測定を行うことを特徴とするＣＲＰの測定方法。
  9. 　被検試料が、血液、血清又は血漿である請求項８記載の測定方法。
  10. 免疫測定の手段がＥＬＩＳＡ又はラッテクス凝集法である請求項８又は９記載の測定方法。
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