WO2009100587A1

WO2009100587A1 - 一种防治缺血性脑卒中的药物组合物及其制备方法

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Publication number: WO2009100587A1
Application number: PCT/CN2008/000349
Authority: WO
Inventors: Huiwan Han; Liang JI; Yanda Li; Mingyu Ding
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2009-08-20
Anticipated expiration: 2010-08-14
Also published as: CN101677989B; CN101677989A

Description

一种防治缺血性脑卒中的药物组合物及其制备方法技术领域

本发明属于一种中药单体组合物，具体地说涉及一种防治缺血性脑卒中的药物组合物及其制备方法。

背景技术

脑卒中是中、老年人致死和致残的主要原因之一。近 80%的缺血性脑卒中病例是由于脑动脉栓塞或粥样硬化血栓形成所致。根据临床症状和持续时间可将脑缺血分为症状在 24小时内完全缓解的短暂性脑缺血发作（TIA)，症状持续达 6周时才缓解的可逆性缺血性神经功能缺失（RIND)以及症状持续性卒中。据 WHO公布的资料，在 57个国家中有 40个国家把脑血管病的死亡率列入了致死原因的前三位，在日本和中国则占首位。但是现有的药物防治效果不好，因此急需开发疗效更好的临床用药。

药用川芎是伞形科多年生草本植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort) 的根茎（英文名为 Rhizoma chuanxiong 川芎的主要化学成分为挥发油、生物碱、酚性成分、内酯类、阿魏酸等。其中进入体内并改善脑缺血的川芎有效部位的化学成分为川芎内酯类化合物。其中的内酯为瑟丹酸内酯（4， 5二氢- 3- 丁基苯肽， 4, 5-dihydro-3-butyl-phthalide ) (通式 ( I ) 和蒿本内酯 (4, 5 二氢- 3 -丁叉基苯肽， 4, 5-dihydro-3-buty 1 i dene-phthal ide ) (通式（11)。

(I) (II)

药用天麻 (Gastrodia elata Blume, 英文名为 Rhizoma Gastrodiae) 是多年生兰科高等食菌植物，天麻内含天麻素、香荚兰醛、琥珀酸、 β -谷醇、维生素 Α样物质、甙类、生物碱、粘液质和天麻多糖等。其中天麻素和天麻多糖是其主要成分。现已能人工合成天麻素（天麻甙）（周树舜等，中国医药工业杂志， 1985年 05期 )

天麻素（英文名称为 Gastrodin) ，其化学名称为 4-羟基苯 - β -D吡喃葡萄糖苷。分子式为： C13H1807。天麻具有多方面的药理作用。可恢复大脑皮质兴奋与抑制过程间的平衡失调，具有镇静、安眠和镇痛等中枢抑制作用。天麻素（天麻苷）的急性毒性很小。

我国自古就有用于活血化瘀、息风止痛的川芎和天麻的组方，例如大川芎丸等。除此以外，还有由川芎和天麻组成的其它中药方剂，例如"天芎注射液"，该药属于传统中药制剂，由川芎、天麻两味中药组成。其川芎的监测指标为阿魏酸（黄东萍等.中草药， 2004， 35 (4) ， 409-411)。 "天芎头痛宁胶囊"是以天麻为君药，由十几味中药组成的方剂（申玉华等. 中药新药与临床药理， 1995， 6 (3), 33-35)。 "天芎软胶囊"主要成份为天麻和大黄，其中天麻和大黄在处方中的比例为 3： 1 (郭增军等.中成药 2005， 27 (4)， 467-468) 。这些方剂多以治疗偏头痛为主，且制备过程中不以有效成分为指标。

除上述传统中药制剂外，现代也有一些以川芎和天麻为有效成分的药物。例如专利申请《包含天麻和川芎有效成份的药物组合物及制剂》（申请号： 200610020605. 2) 公开了以天麻和川芎为有效成份组成的药物组合物；专利申请《大川芎干粉制剂及制备方法和应用》（申请号： 200610046747. 6)公开了由天麻提取物和川芎提取物混合制成的干粉制剂。专利申请《治疗缺血性心脏病的川芎内酯及其制备方法》（申请号： 03146029. 1 ) 公开了川芎内酯，包括瑟丹酸内酯和蒿本内酯两种内酯成分。专利申请《一种治疗脑血管疾病的药物组合物及其制备方法》（申请号： 200510101971. 6)公开了蒿本内酯和洋川芎内酯组成的组合物以及《一种川芎内酯提取物及其制备方法和应用》（申请号： 200610130680. 4) 公开了涉及川芎内酯在治疗缺血性心血管病中的应用。专利《一种川芎挥发油软胶囊及其制备方法》（申请号： 200410037185. X)公开了一种采用二氧化碳超临界萃取方法制备川芎挥发油的方法。

上述现有技术存在以下缺点：（1 ) 药品成分纯度不高，不能制成化学成分明确的中药制剂，特别是无法制成化学成分明确且纯度很高的注射剂；（2) 在现有的以川芎提取物为主的防治脑卒中的中药制剂中均以化学性质不够稳定的蒿本内酯为监测指标，影响检测的准确性。

经检索，没有发现由瑟丹酸内酯、蒿本内酯和天麻素组成的药用组合物。发明内容本发明目的之一是提供一种防治缺血性脑卒中的药用组合物。

本发明的第二个目的是提供制备上述药物组合物的方法。

本发明的另一目的是提供上述药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种防治缺血性脑卒中的药物组合物，其组成成分及其重量百分比为：瑟丹酸内酯 19〜72%

蒿本内酯 17〜67%

天麻素 2〜29%

溶剂余量

上述药物组合物中所述的溶剂是指羧甲基纤维素钠，吐温- 80或植物油等。所述的植物油是指橄榄油、花生油、玉米油、大豆油、葵花籽油、麻油、蓖麻油、杏仁油或桃仁油等植物油中的一种或几种。

按照通常的方法，用上述药物组合物制备的剂型可以是一种药学上可接受的剂型，如可以是注射剂、喷雾剂、胶囊、滴丸、片剂、颗粒剂、乳剂、分散剂、缓释剂等。

上述药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

上述药物组合物中瑟丹酸内酯、蒿本内酯和天麻素均为纯品化合物，纯度都在 98%以上，天麻素可从市场上购买。

上述防治缺血性脑卒中的药物组合物的制备方法，按照比例取瑟丹酸内酯、蒿本内酯、天麻素和助溶剂，然后混合均匀即可。

上述瑟丹酸内酯的制备方法，包括如下步骤：

( 1 )将干燥的川芎根块粉碎至直径 l〜3mm的颗粒，然后置于萃取釜中；

(2 )将萃取釜的温度旋钮设定至 42〜58°C，加热；当萃取釜温度为 42〜 58^DC时，开启 C0₂进气泵； '

(3)萃取及分离， C0₂气流经萃取釜后进入分离釜 I，再进入分离釜 II；到达萃取釜压力为 18〜32Mpa;其中分离釜 I压力为 8〜14Mpa，温度为 45〜55^QC，萃取时间为 60〜120 min， C0₂流量为 220〜350kg/h;分离釜 II压力为 4〜8Mpa，温度为 35〜45⁰C，萃取时间为 60〜120 min;

(4)第一次萃取及分离完成后再次向萃取釜中投料同样粒径的川芎根块颗粒，重复步骤（2 ) 〜（3)，进行第二次萃取及分离；

)£正页 (细第 91条） (5)第二次萃取及分离后，分别从分离釜 I和分离釜 II的出料口一次性放出全部内容物；

(6 )将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层，分层后收集上层液体,分别得到川芎内酯的 I级分离产品（出自分离釜工）和 II级分离产品（出自分离釜 II );

(7)吸取步骤（6) 的川芎内酯的 I级分离产品或川芎内酯的 II级分离产品或者是这两种产品的混合物 3〜7ml加入石油醚：乙酸乙酯（95： 5 )的混合溶液至 8〜12ml，摇勾；进样至 Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱；其流动相为 A石油醚， B 乙酸乙酯；流速 50ml/min;检测波长 280nm;梯度洗脱， 0.01〜 12minA： B= 95： 5， 15〜30minA： B =85： 15;在 18〜25min之间收集洗脱液；

(8)重复步骤（7 )，依次将 I级和 /或 II级分离产品进样完毕，得洗脱

、―、

涖；

(9) 将步骤（ 8 ) 的洗脱液在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，即得瑟丹酸内酯初级纯化产品；

( 10)吸取步骤（9) 中的初级纯化产品 3〜7ml加入甲醇溶解至 Shimadzu LC-8A 反相制备液相系统进样；其中色谱柱为 Phenomenex Luna ΙΟμπι , 250mmx50mm I.D._; 流动相为水（A)和甲醇（B)，流速为 80ml/min，等度洗脱， A： B =40： 60；捡测波长为 280nm; 在 18〜26min之间收集洗脱液；

( 11 )将步骤（10)所得洗脱液在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去甲醇；将剩余物用乙酸乙酯萃取 3〜5次，得萃取液；

( 12)将上述萃取液在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，得瑟丹酸内酯。所述的蒿本内酯的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1 ) 〜（6) 同瑟丹酸内酯制备方法步骤（1 ) 〜（6) ；

(7) 同瑟丹酸内酯步骤（7)，收集 6〜12min之间的洗脱液；

(8)在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，所得产品即为蒿本内酯。上述制备方法步骤（1 ) 中所述的超临界二氧化碳萃取釜可以是

HA221-40-48或 HA421- 40- 963. 13-3. 43。

所述的天麻素可直接从市场上购买，如昆明制药集团股份有限公司生产的天麻素或乙酰天麻素。

用本发明方法提取、纯化的有效成分瑟丹酸内酯和蒿本内酯，纯度均在 98%以上。市售天麻素（或乙酰天麻素）纯度在 98%以上。更正页 (细 ⁴则第 91条）本发明优点和有益效果：（1 ) 药效高，可有效减轻缺血性脑卒中的病理变化和行为障碍，药效明显好于现有临床用药；（2 ) 本发明药物组合物药效确切，用量小，作用强；（3 ) 纯度高，本发明药物组合物各组分均为纯品，纯度都在 98%以上，可以制成包括注射剂在内的制剂；（4 ) 稳定性好，本发明工艺达到制备标准品水平；（ 5 )本发明指出瑟丹酸内酯的化学性质比蒿本内酯稳定，更适合作为川芎油产品质量的监测指标。

附图说明

图 1 为从超临界萃取液分离的蒿本内酯和瑟丹酸内酯产品的制备谱图（正向 HPLC法）（其中 QHNP- 1为蒿本内酯； QHNP- 2为瑟丹酸内酯）

图 2 为蒿本内酯的检测谱图（反向 HPLC检测）

图 3 为瑟丹酸内酯初级纯化产品的制备谱图（反向 HPLC法）

图 4 为瑟丹酸内酯最终纯化产品的检测谱图（反向 HPLC检测）图 5 为瑟丹酸内酯的红外鉴定谱图

图 6 为蒿本内酯的红外鉴定谱图

图 7 为瑟丹酸内酯的紫外鉴定谱图

图 8 为蒿本内酯的紫外鉴定谱图

图 9 为瑟丹酸内酯的质谱鉴定谱图

图 10 为蒿本内酯的质谱鉴定谱图

图 11 为瑟丹酸内酯的核磁共振鉴定谱图（氢谱）

图 12 为蒿本内酯的核磁共振鉴定谱图（氢谱）

图 13 为瑟丹酸内酯的核磁共振鉴定谱图（碳谱）

图 14 为蒿本内酯的核磁共振鉴定谱图（碳谱）

具体实施方式

实施例 1

瑟丹酸内酯的制备

( 1 ) 称取川芎的干燥根块 30kg 粉碎至直径 2. 5讓的颗粒，置于 HA221-40-48萃取釜中；

(2 ) 旋转萃取釜温度设定旋钮至 50° (：，当温度达到 50^QC时，开启 C0₂ 进气泵；

( 3) 启动设备，进行第一次萃取及分离； C0₂气流经萃取釜后进入分

条）离釜 I、再进入分离釜 II; 萃取釜压力 25Mpa，分离釜 I压力 llMpa，分离釜 I温度 50°C，萃取时间 90 min， C0₂流量 250kg/h，分离釜 II压力 6Mpa，分离釜 II温度 40°C;

(4)再投料 30kg，按步骤（1 ) 〜（3)进行第二次萃取及分离；

(5)分别从分离釜 I和分离釜 II的出料口一次性放出全部内容物；

(6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层。分层后收集上层液体，分别得到川芎内酯的 I级分离产品（出自分离釜 I)和 II级分离产品（出自分离釜 11 )。

(7)吸取步骤 (6)中的川芎内酯 II级分离产品 5ml，加入石油醚和乙酸乙酯的混合溶液（石油醚：乙酸乙酯为 95: 5)至 10ml，摇匀；进样至 Biotage 40+M 正相液相色谱硅胶柱；其流动相为 A石油醚， B 乙酸乙酯；流速 50ml/min; 检测波长 280nm; 梯度洗脱， 0.01〜12min A： B= 95： 5， 15〜30min A： B =85

： 15；在 19.6〜23.2min之间收集洗脱液 (见图 1QH P-2);

(8)重复步骤 (7)，将川芎内酯 II级分离产品进样完毕，得洗脱液；

(9)将步骤（ 8 )所收集的洗脱液在 35°C水浴中旋转蒸发除去溶剂后即得到瑟丹酸内酯初级纯化产品；

( 10) 从步骤（9) 的产品中吸取 5ml加入甲醇溶解至 Shimadzu LC-8A反相制备液相系统进样；其中色谱柱为 Phenomenex Luna ΙΟμηι, 250mmx50mm I.D.，流动相为 A水 B 甲醇，流速为 80ml/min，等度洗脱， A： B =40： 60，检测波长为 280nm; 在 20.3〜24.5min之间收集洗脱液 (见图 3);

( 11 )在步骤（10)所得洗脱液在 35°C水浴中旋转蒸发除去甲醇，将剩余物用乙酸乙酯萃取 3次，得萃取液；

( 12) 将步骤（11 )所得萃取液在 35Ό水浴中旋转蒸发除去溶剂，得到最终产品 347.3g。

( 13 )按照《中国药典》 2005年版一部附录 VI D "高效液相色谱法"所述的检测方法对所得到的最终产品进行检测，得到其纯度为 99.17% (见图 4)。经红外、紫外、质谱以及核磁共振（包括氢谱和碳谱两种方法）四大光谱学认证得知该产品为瑟丹酸内酯（见图 5、图 7、图 9、图 11和图 13)。

实施例 2

瑟丹酸内酯的制备

( 1 ) 称取川芎的干燥根块 30kg 粉碎至直径 1醒的颗粒，置于 HA221-40-48萃取釜中；

(2)旋转萃取釜温度设定旋钮至 58°C，当温度达到 58°C时，开启 C0₂ 进气泵；

(3) 启动设备，进行第一次萃取及分离， C0₂气流经萃取釜后进入分离釜 I、再进入分离釜 II，萃取釜压力 32Mpa，分离釜 I压力 14Mpa，分离釜 I温度 55°C，萃取时间 120min， C0₂流量 280kg/h; 分离釜 II压力 8Mpa，分离釜 II温度 45°C;

(4)再投料川芎颗粒 30kg于 HA221- 40- 48萃取釜中，重复步骤（ 2 )〜（3) 进行第二次萃取及分离；

(6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层；分层后收集上层液体，分别得到川芎内酯的 I级分离产品（出自分离釜 I)和 II级分离产品（出自分离釜 II ) ；

(7)将上述两种川芎内酯产品充分混合；

(8)从步骤（7) 的产品中吸取 5ml加入石油醚和乙酸乙酯的混合溶液（石油醚：乙酸乙酯为 95: 5)至 10ml，摇匀；进样至 Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱；其流动相为石油醚 (A)和乙酸乙酯（B);流速 50ml/min_; 检测波长 280nm; 梯度洗脱，从 0.01〜12min A: B= 95： 5， 15〜30minA: B =85: 15；在 18〜25min之间收集洗脱液；

(9) 将所收集的洗脱液在 30°C水浴中旋转蒸发除去溶剂后即得到瑟丹酸内酯初级纯化产品；

( 10) 从步骤（9) 的产品中吸取 5ml加入甲醇溶解至 Shimadzu LC-8A反相制备液相系统进样；其中色谱柱为 Phenomenex Luna ΙΟμηι, 250mm 50mm I.D., 流动相为 A水 B 甲醇，流速为 80ml/min，等度洗脱， A： B =40： 60，检测波长为 280nm; 在 18〜26min之间收集洗脱液；

( 11 ) 30°C水浴中旋转蒸发除去甲醇，然后将剩余物用乙酸乙酯萃取 5次，得萃取液；

( 12) 将萃取液在 30°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，得瑟丹酸内酯 309g。实施例 3

蒿本内酯的制备，包括如下步骤- ( 1 ) 称取干燥的川芎根块 30kg，粉碎至直径 3醒的颗粒，置于 HA221-40-48萃取釜中；

(2)萃取釜温度 42°C, 当温度达到设定值时，开启 C0₂进气泵；

(3)萃取釜压力 18Mpa，分离釜 I压力 8Mpa，分离釜 I温度 45°C，萃取时间 60 min, C02流量 220kg/h，分离釜 II压力 5Mpa，分离釜 II温度 40°C，进行第一次萃取及分离；

步骤（4) 〜（7) 同实施例 2的步骤（4) 〜（7) ；

(8) 从步骤（7) 的产品中吸取 5ml进样至 Biotage40+M正相液相色谱硅胶柱；色谱条件同实施例 2; 在 7〜10.6min之间收集洗脱液，得到晕终产品 498.2g (见图 1中的 QH P- 1)。

(9)按照《中 i [药典》 2005年版一部附录 VI D "高效液相色谱法"所述的检测方法对所得到的最终产品进行检测，得到其纯度为 98.32%%。经红外、紫外、质谱以及核磁共振（包括氢谱和碳谱两种方法）四大光谱学认证得知该产品为藁本内酯（见图 6、图 8、图 10、图 12和图 14)。

实施例 4 '

分别取实施例 1〜3制备的（后同）瑟丹酸内酯（比重 0.95，后同） 4.2g、藁本内酯 l.Og (比重 0.95，后同），和天麻素 0.6g，加入到 20g纯橄榄油中，超声混合均匀，得本发明组合物 A 25.8_g。

实施例 5 ' 分别取瑟丹酸内酯 0.6g、藁本内酯 1.8g，和天麻素 0.75g ，加入到 20g 大豆油中，超声混合均匀，得本发明组合物 B 23.15g。

实施例 6

分别取瑟丹酸内酯 3.6g、藁本内酯 3.3g，和天麻素 2.9g ，加入纯花生油至 20ml，超声混合均匀，得本发明组合物 C 29.8g。

实施例 7 - 分别称取瑟丹酸内酯 2.8g，蒿本内酯 1.2g，天麻素 0.08 g，研匀，加 0.5% 羧甲基纤维素钠至 21.6ml，得本发明组合物 D 25.68g。分别取瑟丹酸内酯 1.4g、藁本内酯 3.0g，和天麻素 0. l_g，加入到 2%羧甲基纤维素钠至 20ml，超声混合均匀，得本发明组合物 E 25.5g。按照高效液相色谱法测定（见中国药典 2005年版一部附录 VI D)。

色谱条件与系统适应性试验：选用岛津 LC-2010高效液相色谱柱。以十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂 (Diamonsil C18, 4.6x150mm, 5 u m)_; 以乙腈一水（42: 58) 为流动相；柱温 35°C ; 检测波长 280nm， 230nm_; 流速 lml/min。理论板数按瑟丹酸内酯峰计算不低于 16000。

标准品溶液的制备：取实施例 1所制备的瑟丹酸内酯，精密称定，加甲醇制成每 1ml分别含瑟丹酸内酯 0.08mg的溶液，即得纯度大于 99%的标准品溶液。

供试品溶液的制备：取实施例 1得到的瑟丹酸内酯适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每 1ml中含 0.08mg的溶液，作为瑟丹酸内酯供试品溶液。

测定方法：精密吸取瑟丹酸内酯标准品与供试品溶液各 10ul，注入液相色谱仪，按照实施例 1步骤（13)所述方法测定即可。

表 1 瑟丹酸内酯稳定性实验结果（归一化纯度测定％， 280nm)

结果（见表 1 )本发明瑟丹酸内酯的稳定性主要受高温、光照和氧的影响。在 30天内充氮避光的储存条件下，无论是室温、冷藏或冷冻，对瑟丹酸内酯的稳定性基本无影响（含量的相对标准偏差<2%)。说明瑟丹酸内酯性质较稳定，只要充氮避光保存，纯度在 30天内不会下降，可以作为标准品使用。

实施例 10

藁本内酯稳定性实验

按照《中国药典》 2005年版一部附录 VI D所示的高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适应性试验：选用岛津 LC-2010高效液相色谱柱。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Diamonsil C18, 4.6 <150mm， 5 n m); 以乙腈一水（42: 58) 为流动相；柱温 35°C ; 检测波长 280nm， 230nm_; 流速 lml/min。标准品溶液的制备：取实施例 3所制备的藁本内酯，精密称定，加甲醇制成每 1ml含藁本内酯 0.4mg的溶液，即得纯度大于 99%的标准品溶液。

供试品溶液的制备：取实施例 3所得藁本内酯适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每 1ml中含 0.4mg的溶液，作为藁本内酯供试品溶液。

测定方法：吸取标准品与供试品溶液各 10ul，注入液相色谱仪按照实施例 3步骤（9)所述方法进行测定。

结果（见表 2 )。本发明藁本内酯稳定性主要受光照、温度和氧化影响；室温条件下放置 10天后纯度从 98%下降到 95%以下。表明藁本内酯标准品必须在充氮、避光、冷藏或冷冻条件下储存。必须新鲜配制。每次制备量不超过 5 天使用量。

表 2藁本内酯稳定性实验结果（归一化纯度测定％， 280nm)

实施例 11

本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型的影响

(一)、试验方法按照如下方法进行：

( 1 ) .分组与给药：选用 150只体重在 240〜250g的健康雄性 SPF/VAF级 Wistar大鼠进行试验。（北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号: SCXK京 2002-0003)。随机分为 9组，即空白对照组、模型对照组、脉络宁阳性对照组 6ml/kg、组合物 A、 B、 C各两个剂量（6mg/kg以及 12/kg) 组。组合物 A、 B、 C的配制方法见实施例 4〜 6 手术前 1小时及再灌注之后 2小时腹腔注射一种组合物或生理盐水或阳性药物。阳性药选取临床治疗缺血性脑卒中的常用西药脉络宁注射液（lOrnl/支，金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂生产，批号： 200503011)。空白对照组和模型对照组腹腔注射等体积生理盐水。

(2) .线栓制备：选用日本产的直径为 0. 23mm的尼龙丝线塑成直线形并剪成 5cm的线段，前端用细砂纸打磨、蘸胶使之平滑，在距离前端 1. 6cin、 1. 8cm, 2. 0cm处作标记备用，临用时将尼龙丝前端蘸取肝素。

(3) .模型复制： 400mg/kg腹腔注射 10%水合氯醛麻醉；颈部正中切开，暴露左恻颈总动脉（简称 CCA)、颈外动脉（简称 ECA)、颈内动脉（简称 ICA); 结扎 CCA近端、 ECA根部；在 CCA结扎处远端剪一斜口，插入尼龙丝，经 CCA 分叉处通过 ICA入颅至大脑前动脉（ACA)，阻断 MCA的血流；尼龙丝平均插入深度为 18. 5±0. 5腿，结扎 ICA。缝合皮肤，暴露尼龙丝末端；于缺血 2小时后将尼龙丝拔出，观察再灌注后不同时程的变化；假手术组不插尼龙丝。

(二)、观察指标：

( 1 ) . 神经行为学评分：采用五级评分法（0-4分）。于再灌注终末期进行动物的行为学观察。提鼠尾离幵地面约 1尺，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察其行走情况。分数越高，表明其神经行为损伤越严重。（按最高分计）

a.行为完全正常为 0分；

b.提起鼠尾离开地面，手术对侧前肢内旋、内收者，为 1分；

c.大鼠至地面，用手挤压两侧检査其抗力，手术对侧抗力下降者，为 2 分；

d.大鼠至地面，观察其行走，围绕手术对侧转圈者，为 3分；

e.损伤极其严重，已无法自主活动者，为 4分。

(2) .脑梗塞面积测试： 24小时后断头取脑，将左侧大脑切为 2画厚共 5片、 4mm厚共 1片。经 4%红四氮唑（ TTC) 37°C避光染色 30分钟；其间每隔 5分钟翻动一次。经 TTC染色后，正常组织深染呈红色，梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存。应用图象分析系统软件（SPOT 3.5软件）处理并统计。计算每片的梗塞面积并最终叠加换算成梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率表示。计算公式如下：

脑梗塞体积（％) = (手术对侧半球的体积一手术侧半球未梗塞部分的体积） I手术对侧半球的体积 X 100%

(3) .脑含水量测定：

再灌注 24小时后，即刻断头取脑，去除嗅束、小脑和低位脑干，分开手术侧和正常侧半球，分别称重（湿重）。置于烤箱中 95°C烘烤 24小时至恒重后，再次称取脑重（干重）。脑含水量按下述公式计算：

脑含水量（％) = (湿重一干重） /湿重 X 100 %

实验数据用 ± SZ)表示，经 t检验比较组间差异。

表 3 . 本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型治疗试验结果

注：与空白对照组相比较 ΔΔΡ<0. 01 ΔΔΡ<0. 05；

与模型对照组相比较 **Ρ〈0· 01 *Ρ<0. 05；

结果（见表 3 ) 本发明 A、 B、 C三组药用组合物及阳性药组均可改善大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血梗塞面积。其中以组合物 B大剂量（12mg/kg体重）效果最好，药效好于常用临床用药脉络宁注射液。说明本发明药用组合物可用于治疗缺血性脑卒中，减轻脑梗塞面积。

实施例 12

本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型的影响

(一）、试验按照如下方法进行：

( 1 )分组与给药： 20 0〜220_g的健康雄性 SD大鼠 78只，随机分成 6组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照药川芎嗪组及本发明实施例 4〜 6的组合物 A、 B、 C组。阳性对照药川芎嗪组选自磷酸川芎嗪片， 50mg/片， 100片 / 瓶，北京市燕京制药厂生产，批号： 040603。预先灌胃给药 7天，每日一次，每次给药剂量 50mg/kg。断头取脑前 2 h再给药一次。正常对照组及模型组灌胃等量生理盐水。

(2) 实验方法： 4%水合氯醛（350mg/kg， ip)麻醉。将大鼠仰卧位固定，沿颈正中切开，分离右侧颈总动脉并穿 2根缝线备用，再分离颈外动脉，近心端结扎。颈外动脉下方分离出颈内动脉及其旁边一根分支（翼突腭动脉），在分支下穿一根缝线，于近心端分叉处结扎。在已分离的颈总动脉近心端用缝线结扎，远心端用动脉夹阻断血流，在此之间，剪一小口，将一端加热成圆珠状（直径 <0.3mm) 的尼龙线（4一 0)插入小口，去掉动脉夹，将尼龙线缓缓推入至前脑动脉（约 20mm)，再往回拉约 2mm即至大脑中动脉口，长约 17mm (自颈内外动脉分叉处算起），用缝线结扎固定尼龙线棒。缝合肌肉和皮肤。手术过程中，视野温度保持 37°C。术后 24h进行行为学评分，评分后，处死大鼠，断头取脑。对照组不插线，术后 24h进行行为学评分后处死，断头取脑。以下操作及计算方法等同实施例 11中有关部分内容。

(二）、观察指标：同实施例 11观察指标（2)

结果（见表 4 )本发明 A、 B、 C三组药用组合物口服剂及阳性药组预防给药 7天均可改善大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血梗塞面积；本发明 A、 B、 C三组药用组合物药效明显好于常用临床用药磷酸川芎嗪片。说明本发明药用组合物可以防治缺血性脑卒中，减轻脑梗塞面积。药效明显好于常用临床用药磷酸川芎嗪片（P<0.01)。

表 4 本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型试验结果

注： *与模型对照组相比较 P〈0. 05 ，**与模型对照组相比较 P<0. 01 实施例 13

本发明药用组合物对三氯化铁法脑缺血模型的影响

(一）、实验按如下方法进行：

( 1 )分组与给药：将 110只体重在 180〜200g的健康雄性 SD大鼠按体重随机分为 9组。空白对照组、模型对照组、磷酸川芎嗪 120mg/ml组（药品来源同实施例 12)、各组合物组分为 80mg/ml、 40mg/ml两个剂量组，每组 12只。每天口服给药一次，连续 30天，空白组、模型对照组服用等体积食用油。

(2)实验方法：于末次给药 1小时后，按 350mg/ml腹腔注射 12%的水合氯醛溶液将大鼠麻醉，侧卧位固定，在手术显微镜下进行操作。眼眦与外耳道连线中点作一长约 lcm的垂直切口，暴露并剥离顳肌，在卵圆孔侧前上方 1皿处用牙钻钻一直径约 2mm的小孔，用细针刺破脑膜，暴露大脑中动脉（MCA)，将蘸有 50%三氯化铁溶液的滤纸条敷于大脑中动脉上， 30min后取出，此时大脑中动脉变成黑色或白色。缝合切口。 24h后断头取脑。以下操作及计算方法等见实施例 11中有关部分内容。

神经行为学测试分别在手术 6h和 24h后进行。评分标准及方法同实施例 11观察指标（1)。

(二）、观察指标：同实施例 11观察指标（1 )、（2)

结果（见表 5 )各组药用组合物口服剂及阳性药组连续预防给药 30天与模型组相比均可明显改善大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血梗塞面积。其中本发明组合物 A药效明显好于常用临床用药磷酸川芎嗪片（P<0. 05)。由于同等剂量的阳性药组无法体现药效，只好加大剂量。而本发明组合物组剂量的 1/3〜2/3即可显现类似药效。说明本发明药用组合物口服剂长期给药可以防治缺血性脑卒中，减轻脑梗塞面积。药效好于或不低于常用临床用药磷酸川芎嗪片。

表 5 .本发明药物组合物预防给药 30天对脑缺血模型试验结果

空白对照 11 1 0.73±0.65 0.45±0.52 0 模型对照 10 1 5.00±1.15Δ 3.80±1.40ΔΔ 5.17±2.36ΔΔ 川芎嗪阳性药组 10 120 3.58±1.44* 3·08±1.56 4.41±0.72 组合物 A 10 80 3.58 ±1.44* 3.67±1.50 3·83±0·91 组合物 A 9 40 4.00±1.58 3.67±1.80 3.23±0.85* 组合物 D 11 80 3.36±1.57* 3.55±1.92 4.98±1.15 组合物 D 11 40 3.92±1.24* 3.83±1.53 3.92±1.14 组合物 E 10 80 3.70±1.34* 3.30±1.16 3.99±2.06 组合物 E 9 40 4.33±1.61 3.83±1.27 4.34±0.85

注：与空白对照组相比较 ΔΔ Ρ<0.01

与模型对照组相比较 * Ρ<0.05

实施例 14

本发明药物组合物的小鼠急性毒性试验

(一）实验和计算方法：

采用 SPF级昆明种小白鼠，一次性口服给药。以预试验结果为试验剂量，剂距为 1:0.90。

药液配制方法如下：准确称取瑟丹酸内酯 2.501g、蒿本内酯 2.502g，以及天麻素 0.7502_g，混匀后加适量 2%羧甲基纤维素钠助溶，充分研匀后制成浓度为 0.0575g/g的溶液；各组剂量分别按表 7所示剂量用 2%羧甲基纤维素钠的水溶液）稀释，每 20g体重口服给药 0.8ml; 连续观察 48小时。

将动物按禁食 16小时后的体重随机分为 9组，每组 20只，雌雄各半；组间剂距 1:0.9; 分别将上述不同浓度的受试物按 0.8ml/20g灌胃，即刻观察给予受试物后各组动物出现的毒性反应，连续观察 48小时。记录动物的毒性反应及死亡情况。用 Bilss法计算小鼠口服 LD₅。剂量和 95%可信限。

计算公式如下：画数:

半数致死量: LD₅。=antl。g[X +丄 (5-？） ] l。gLD₅。标准误： S 。=

LD₅。的 95%平均可信限： L₉₅=LD_5Q±4.5 LD₅₀ - J

b ~∑M) LD₅。的 99%平均可信限： L₉₉=LD₅。±5.9 LD₅₀ · "

b^n∑w

结果（见表 6 )显示本发明药物组合物的小鼠口服 LD₅。值为 0.7276g/k_g; LD₅。的 95%平均可信限为 0, 7276±0.0470g/k_g (范围: 0.6806-0.7746 g/kg); LD₅。的 99%平均可信限为 0.7276±0.0616g/kg (范围: 0.6660-0· 7892g/kg)。组间剂距 1:0.9。

本试验为为化学级纯品的急性毒性试验。结果表明本发明药物组合物安全性好，为临床用药剂量提供了有价值的参考数据。

表 6小鼠口服 LD₅。剂量和 95%可信限实验结果

i=log (1/0.9) =0.0458

b = 12.3675

LD₅₀=0.6326g · kg"¹

L₉₅=0.6326±0.0274g · kg—¹ (范围: 0.6052-0.6600 g · kg—¹)

L₉₉=0.6326±0.0359g · kg— ¹ (范围: 0.5967-0.6685g - kg"¹)

S¾₀=0.0096

Claims

权利要求书

1、一种防治缺血性脑卒中的药物组合物，其组成成分及其重量百分比为：瑟丹酸内酯 19〜72%

蒿本内酯 17〜67%

天麻素 2〜29%

溶剂余量

2、按照权利要求 1所述的药物组合物，其特征在于所述的溶剂是指羧甲基纤维素钠、吐温- 80或植物油等。

3、按照权利要求 2所述的药物组合物，其特征在于所述的植物油是指橄榄油、 '花生油、玉米油、大豆油、葵花籽油、麻油、蓖麻油、杏仁油或桃仁油等植物油中的一种或几种。

4、按照权利要求 1或 2所述的药物组合物，其特征在于其剂型可以是注射剂、喷雾剂、胶囊、滴丸、片剂、颗粒剂、乳剂、分散剂、缓释剂等。

5、权利要求 1〜 4任一所述的药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

6、权利要求 1所述的药物组合物的制备方法，按照比例取瑟丹酸内酯、蒿本内酯、天麻素和溶剂，然后混合均匀即可。

7、按照权利要求 6所述的制备方法，其特征在于所述的瑟丹酸内酯的制备方法，包括如下步骤：

( 1 )将干燥的川芎根块粉碎至直径：！〜 3画的颗粒，然后置于萃取釜中；

(2)将萃取釜的温度旋钮设定至 42〜58^QC，加热；当萃取釜温度为 42〜 58^flC时，开启 C0₂进气泵；

(3)萃取及分离， C0₂气流经萃取釜后进入分离釜 I，再进入分离釜 II；到达萃取釜压力为 18〜32Mpa;其中分离釜 I压力为 8〜14Mpa，温度为 45〜55^DC，萃取时间为 60〜120 min， C0₂流量为 220〜350kg/h;分离釜 Π压力为 4〜8Mpa，温度为 35〜45°C，萃取时间为 60〜： 120 min_;

(4)第一次萃取及分离完成后再次向萃取釜中投料同样粒径的川芎根块颗粒，重复步骤（ 2 ) 〜（3)，进行第二次萃取及分离；

(5)第二次萃取及分离后，分别从分离釜 I和分离釜 II的出料口一次性放出全部内容物；更正页 ( 则第 91条〉 (6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层，分层后收集上层液体，分别得到川芎内酯的 I级分离产品（出自分离釜 I)和 II级分离产品（出自分离釜 II );

(7)吸取步骤（6) 的川芎内酯的 I级分离产品或川芎内酯的 II级分离产品或者是两种产品的混合物 3〜7ml加入石油醚：乙酸乙酯（95： 5)的混合溶液至 8〜12ml，摇匀；进样至 Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱；其流动相为 A石油醚， B 乙酸乙酯；流速 50ml/min;检测波长 280nm;梯度洗脱， 0.01〜 12minA： B= 95： 5， 15〜30minA： B =85： 15;在 18〜25min之间收集洗脱液；

、―、―

y仪；

(9)将步骤（ 8 ) 的洗脱液在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，即得瑟丹酸内酯初级纯化产品；

( 10)吸取步骤（9) 中的初级纯化产品 3〜7ml加入甲醇溶解至 Shimadzu LC-8A 反相制备液相系统进样；其中色谱柱为 Phenomenex Luna ΙΟμηι , 250mmx50mm I.D._; 流动相为水（A)和甲醇（B)，流速为 80ml/min，等度洗脱， A： B =40： 60；检测波长为 280nm_;.在 18〜26min之间收集洗脱液；

( 11 )将步骤（10) 所得洗脱液在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去甲醇；将剩余物用乙酸乙酯萃取 3〜5次，得萃取液；

( 12)将上述萃取液在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，得瑟丹酸内酯。 8、按照权利要求 6所述的制备方法，其特征在于所述的蒿本内酯的制备方法，包括如下步骤：

(2)将萃取釜的温度旋钮设定至 42〜58°C，加热；当萃取釜温度为 42〜 58°C时，开启（0₂进气泵；

(3)萃取及分离， C0₂气流经萃取釜后进入分离釜 I，再进入分离釜 II；到达萃取釜压力为 18〜32Mpa;其中分离釜 I压力为 8〜14M_Pa，温度为 45〜55°C，萃取时间为 60〜120 min， C0₂流量为 220〜350kg/h;分离釜 II压力为 4〜8Mpa，温度为 35〜45°C，萃取时间为 60〜120 min;

18

更正页 (细则筹 ⁹1条) (5)第二次萃取及分离后，分别从分离釜 I和分离釜 Π的出料口一次性放出全部内容物；

(6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层，分层后收集上层液体，分别得到川芎内酯的 I级分离产品（出自分离釜 I)和 II级分离产品（出自分离釜 II );

(7) 吸取步骤（6) 的川芎内酯的 I级分离产品或川芎内酯的 II级分离产品或者是这两种产品的混合物 3〜7ml加入石油醚：乙酸乙酯 (95： 5)的混合溶液至 8〜12ml，摇匀；进样至 Biot_age 40+M正相液相色谱硅胶柱；其流动相为 A石油醚， B 乙酸乙酯；流速 50ml/min;检测波长 280nm;梯度洗脱， 0.01〜 12minA： B= 95： 5， 15〜30minA： B =85： 15; 收集 6〜12min之间的洗脱液；

(8)在 30〜40°C水浴中旋转蒸发除去溶剂，所得产品即为蒿本内酯。