[go: up one dir, main page]

WO2009037369A1 - Manipulación en la función de atdbp1 para generar resistencia frente a potyvirus - Google Patents

Manipulación en la función de atdbp1 para generar resistencia frente a potyvirus Download PDF

Info

Publication number
WO2009037369A1
WO2009037369A1 PCT/ES2008/000595 ES2008000595W WO2009037369A1 WO 2009037369 A1 WO2009037369 A1 WO 2009037369A1 ES 2008000595 W ES2008000595 W ES 2008000595W WO 2009037369 A1 WO2009037369 A1 WO 2009037369A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
potyvirus
plant
atdbpi
gene
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2008/000595
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
José Luis CARRASCO JIMÉNEZ
María José CASTELLÓ LLOPIS
Pablo Vera Vera
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Politecnica de Valencia
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Politecnica de Valencia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC, Universidad Politecnica de Valencia filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority to EP08832492A priority Critical patent/EP2208788A4/en
Priority to US12/679,360 priority patent/US20100242133A1/en
Publication of WO2009037369A1 publication Critical patent/WO2009037369A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to the use of a mutation for the generation of virus-resistant mutant plants, specifically the use of the mutation 8.1 of the AtDBPI gene of Arabidopsis thaliana as a regulator of resistance in plants against potyvirus to modify the phenotype of Ia plant, as well as genetically modified plants whose resistance to infection against potyvirus is greater than in unmodified plants.
  • Plant viruses are classified into RNA viruses and DNA viruses according to the nature of their genetic material, with single-stranded and positive polarity RNAs being the most frequent (HuII, 2002. Matews ' Plant Virology, Academic Press).
  • the infection occurs through wounds caused by physical damage due to the environment or by the action of vectors such as insects, mites, nematodes and certain fungi that inhabit the soil.
  • the RNA virus disassembles, replicates, translates its messengers into proteins and mobilizes locally and systemically (Stange, Cien. Inv. Agr. VoI. 33, pp. 1-18, 2006). To reproduce, the virus uses energy and proteins from the host cell.
  • RNA silencing In plant organisms, at least three pathways for RNA silencing are known: cytoplasmic silencing by small interfering RNAs (siRNA), silencing of endogenous mRNAs by microRNA (miRNA) and silencing associated with DNA methylation and suppression of Ia transcription.
  • siRNA small interfering RNAs
  • miRNA microRNA
  • dsRNA double stranded RNA molecules
  • RNAs such as siRNA and miRNA.
  • HCPro helper component-protease
  • resistance genes of the plant or R. genes has been resorted to. These genes are responsible for the recognition of the invader by means of the direct or indirect interaction of the product of its expression with pathogen avirulence factors (Avr) . Such recognition triggers a program of cell death at the site of infection or hypersensitive reaction that blocks the dispersion of the pathogen and leads to the activation of the defensive response.
  • Resistance genes have been identified for certain viruses in different plant species, such as the tobacco N gene (Nicotiana tabacum), which confers resistance against tobacco mosaic virus (TMV), being a classic model in the study of plant-virus interactions (Whitham et al., CeII, VoI. 78, pp. 1101-1115, 1994; and. Proc.
  • recessive resistance In contrast to the resistance of dominant character mediated by R genes and RNA silencing, there are alternative resistance mechanisms that, due to their special characteristics, are referred to as recessive in nature.
  • the recessive resistance would be the result of a passive mechanism that makes a plant resistant due to the lack of a specific host factor required by the virus to complete its cycle, or due to the presence of a mutated version of this factor (Fraser, Annu. Rev. Phytopathol. VoI. 28, pp. 179-20, 1990; and Academic Press, pp. 1300-1307. San Diego, CA, 1999).
  • Potyviruses are approximately 30% of all known plant viruses and as a group they are very destructive in agriculture (Ward et al., 1991).
  • TOM1 and TOM2A are required for efficient multiplication of the tobacco mosaic virus in Arabidopsis protoplasts.
  • These are host transmembrane proteins that interact with each other and with viral replication proteins encoded by the virus being essential to form the tobamoviral replication complex (Hagiwara e ⁇ al., EMBO J. VoI 22, pp. 344-353, 2003 ; Ishikawa e ⁇ al. J. Virol. VoI. 67, pp. 5328-5338, 1991; Mol. Gen. Genet. VoI. 230, pp.
  • the cum1-1 and cum2-1 mutants have altered the elF4E and elF4G genes respectively (Yoshii e ⁇ al., J. Virol. VoI. 78, pp. 6102, 2004).
  • Most cases of recessive resistance have been described in cultivated species, but only genes involved in pepper and lettuce have been identified, in both cases being the factor of initiation of translation elF4E, and against potyvirus (Nicaise et al. Plant Physiol. VoI. 132, pp. 1272-1282, 2003; Ruffel et al. Plant J. VoI. 32, pp. 1067-1075, 2002). Therefore, although the information available on the responsible mechanisms is very scarce, there seems to be a close link between translation initiation factors and virus resistance (Robaglia and Ima, Trends Plant Sci. VoI. 11, pp. 40-45 , 2006).
  • Patent application WO 01/34823 A2 entitled: "Method for enhancing resistance in plants” refers to the induction of resistance in plants against a broad spectrum of pathogens, specifically, viruses, bacteria and fungi by means of viral expression of a polyprotein encoded by members of the potyvirus group.
  • Said method for the protection of plants against pathogens comprises: a) transforming a plant cell with a functional gene or other gene silencers suppressors, b) identifying the transformed cells of the plant, and c) regenerating a transformed plant from of the transformed cell.
  • WO 95/04825 A1 entitled “Improvements in or relating to disease resistance of plants” also describes the increase in resistance conferred to plants by means of a potyvirus protease. Specifically, it describes a DNA molecule that encodes a portion of the potyvirus replicase that, once introduced into the appropriate plant, is capable of increasing the resistance of said plant to viral diseases. It also describes transgenic plants that possess increased resistance against virus diseases.
  • the granted patent document ES 2 166 361 T3 whose title is "Production of virus-resistant plants through the introduction of positive sense intraducibie viral RNA” describes and claims a method for producing a plant with a reduced susceptibility to The viral infection, comprising: a) transforming plant cells with a DNA molecule that encodes intraducibie viral RNA molecules in a positive sense, wherein said RNA molecule is derived from the nucleotide sequence of a plant virus gene, and b ) regenerating a plant comprising the transformed plant cell.
  • the positive sense intraducibie viral RNA molecule can be derived from a potyvirus; and it can also contain at least one mutation that makes the RNA molecule intraduceptive, and the expression of said RNA molecule within the plant reduces the susceptibility of the plant to virus infection.
  • Patent application WO 2004/057941 A2 entitled: "Recessive plant viral resistance results from mutations in translation initiation factor elF4E” refers to a method for conferring virus resistance to plants, mainly potyvirus resistance. The method involves silencing the gene encoding the elF4E transcription initiation factor in the plant, under effective conditions to confer resistance to the plant against the virus.
  • This silencing comprises: providing a transgenic plant or plant seed transformed with heterologous nucleic acid molecules that silence the gene encoding the elF4E in the plant, and then growing the transgenic plant or the transgenic plant grown from the seed transformed into effective conditions to confer such resistance to the transgenic plant to the virus.
  • Said heterologous molecules can be complementary antisense or sense oligonucleotides (admitting varying degrees of complementarity in the sequence) to the mRNA encoding the elF4E factor.
  • Said nucleic acid may also be iRNA (RNA interfering)
  • Both the transgenic plant and the plant seed transformed with the heterologous molecules can be selected from a broad group that includes Arabidopsis thaliana.
  • this method comprises the overexpression of a nucleic acid molecule that encodes a heterologous transcription initiation factor, elF4E, as well as an expression system containing the gene construct and the host cell transformed with the gene construct.
  • WO 03/000898 A1 entitled: "Plant genes involved in defense against phatogens” presents the use of different genes via their repression (among other possibilities), to confer resistance against certain types of potyviruses (among other pathogens).
  • the invention describes 228 genes identified as useful for conferring resistance against more than one pathogen (bacteria, oomycetes and viruses). Likewise, it identifies genes that are overexpressed or whose expression is diminished in response to viral infections.
  • the invention provides both transgenic plants whose genome is augmented by a nucleic acid molecule of the invention and transgenic plants, in whose genome the corresponding gene is interrupted, resulting in loss, decrease or alteration in the function of the encoded product. by said gene (with respect to the wild plant), these plants acquiring the capacity of resistance or tolerance against certain viruses or other pathogens.
  • the pathogens can be bacteria, fungi or viruses. Different types of potyviruses are cited within possible viruses.
  • transgenic tobacco plants are constructed that have an antisense DBP1 construction in which the level of expression of the DBP1 gene is severely reduced. In these plants it is shown that, in absence of DBP1, the accumulation of CEVM is produced (suggesting the repressive role of this new regulator in the transcriptional control of target genes).
  • PP2C negative modulators of stress signaling pathways in plants (among others).
  • CEVM a gene related to defense, inducible as a consequence of viral infection and whose transcription is regulable by DBP1.
  • This article presents the interaction of both DBP1 and AtDBPI with their corresponding isoforms of 14-3-3, an interaction that positively regulates the induction of the CEVH gene.
  • DBP1 and AtDBPI construct mutants deleted in DBP1: 1 (which maintains N-terminal and therefore interacts with 14-3-3) and 2 (deleted in N-terminal and which does not join 14-3-3).
  • 14-3-3 ⁇ of Arabidopsis functional ortholog of 14-3-3 G of tobacco. They compare the interaction of AtDBPI with 14-3-3 ⁇ and verify that both proteins interact through the N-terminal region.
  • the object of the present invention relates to the use of the mutation 8.1 of the AtDBPI gene of Arabidopsis thaliana (Gen At2g25620; Gen Bank, accession number
  • NM_128120 to modify the phenotype of the plant so that the resulting plant exhibits an increase in resistance to infection by potyvirus compared to the wild-type plant.
  • Another object of the present invention relates to the use of the AtDBPI gene in species of agronomic and industrial interest as a regulator of the response against potyvirus in plants.
  • This use entails the loss of function of the AtDBPI gene leading to a lower accumulation of elF (iso) 4E, which would result in resistance or less susceptibility to potyvirus.
  • the gene As a regulator, the gene is understood, and therefore the protein encoded by it, which regulates the mechanism or part of the mechanism that underlies and is used by the viruses in question in the present study to penetrate, multiply and infect the plant.
  • Another object of the invention is the use of the mutation 8.1 of the AtDBPI gene of Arabidopsis thaliana to generate plants characterized by a resistance to the Plum Pox Virus (PPV) potyvirus greater than that of the wild-type plant. Said resistance is detected by RT-PCR analysis.
  • PSV Plum Pox Virus
  • Another object of the invention is the use of the mutation 8.1 of the AtDBPI gene of Arabidopsis thaliana to generate plants characterized by attenuated symptoms after infection by the Turnip Mosaic Virus (TuMV) potyvirus, which does not occur with the type plant wild.
  • TuMV Turnip Mosaic Virus
  • FIG. 1 Characterization of insertion mutant 8.1, carrier of a T-DNA insert in the AtDBPL A gene, Structure of the AtDBPL gene
  • the AtDBPI gene consists of 4 exons (indicated by black rectangles) separated by 3 introns.
  • Line 8.1 (SALK_005240) has a T-DNA insert that interrupts the coding sequence of the AtDBPI gene in the second exon.
  • B Analysis of the expression of the AtDBPI gene in the insertion line 8.1. Agarose gel electrophoresis of amplification products obtained by RT-PCR using primers specific for the AtDBPI gene compared to wild CoI-0 plants.
  • FIG. 1 Analysis of the expression of AtelF (iso) 4E in the insertion line of AtDBPI 8.1.
  • A Western blot of protein extracts obtained from leaves of wild CoI-O plants and two different batches of plants of the mutation line 8.1, 8.1 (1) and 8.1 (2). On the left, the migration of the marker proteins used according to their molecular size is indicated. As a load control, a detail of the staining of the niolcellulose membrane with Ponceau-S after the transfer is shown.
  • B Analysis of the accumulation of the AtelF messenger RNA (iso) 4E in CoI-O wild plains and in the insertion line 8.1 by RT-PCR.
  • FIG. 3 Analysis of the interaction between AtDBPI and AteIF (iso) 4E.
  • A Yeast double hybrid system: growth in the presence (left) and absence (right) of histidine from yeast strains that express different regions of the AtDBPI protein fused to the DNA binding domain of GAL4 and a fusion of AtelF (iso ) 4E to the transcriptional activation domain of the same factor.
  • the ability of yeast cells to grow in medium without histidine depends on the interaction between the 2 fusion proteins and the subsequent activation of the transcription of the HIS3 marker gene.
  • the medium without histidine is supplemented with 3-amino-triazole, an inhibitor of the HIS3 enzyme, in order to increase the selective pressure.
  • FIG. 4 Analysis of the accumulation and viral distribution in plants of the mutant line 8.1 and wild CoI-O plants after inoculation with the sharka virus (Plum Pox Virus or PPV) fused to the GFP reporter.
  • A Viral RNA accumulation: quantitative PCR amplification of cDNA obtained from non-inoculated leaves of CoI-O control plants and plants of insertion line 8.1 infected with a virus version that includes the coding sequence of the GFP green fluorescent protein ( PPV-GFP), 20 days after inoculation.
  • the white bars represent the amplification of the viral RNA using primers specific for GFP.
  • the ACTINA8 gene black bars is included as a control.
  • B Accumulation of viral protein: Western blot of leaf protein extracts obtained before inoculating CoI-O and 8.1 plants with PPV-GFP (t 0 ) and 20 days after inoculation (t 20 ), Immunodecorated with a polyclonal anti-GFP antibody. On the right, the migration of the molecular weight marker used is indicated.
  • C Analysis of the distribution of the virus in inoculated leaves (upper panels) and non-inoculated or systemic (lower panels) of CoI-O plants (left) and 8.1 (right), by fluorescence microscopy for the detection of GFP.
  • FIG. 1 Infection with turnip mosaic virus (Turnip Mosaic Virus or TuMV). Symptomatology observed in CoI-O plants (upper part) and 8.1 (lower part) after infection with TMV.
  • TuMV turnip mosaic virus
  • FIG. 1 Nucleotide sequence of the AtDBPI gene (At2g25620). The exons are indicated in bold and uppercase, and the 5 'and 3' untranslated introns and regions in lowercase.
  • FIG. 7 Nucleotide sequence of the AtDBPI gene (At2g25620) in mutant 8.1 (SALK_005240). Exons are indicated in bold and uppercase, in lowercase introns and regions 5'and 3'no translated, and underlined the sequence that would correspond to the T-DNA.
  • the potyvirus family represents a large number of viral pathogens of plants that can collectively infect most of the crop species. Potyvirus infection can induce a variety of symptoms including leaf mottling, the distortion of seeds and fruits, so it can seriously compromise the yield and / or the quality of the crop.
  • the family of potyvirus or Potyviridae includes the definitive species: Alstroemeria mosaic potyvirus, Amaranthus leaf motile potyvirus, Araujia mosaic potyvirus, Arracacha Y potyvirus, Artichoke latent potyvirus, Asparagus 1 potyvirus, Banana bract mosaic potyvirus, Bean commonsic bean, common bean Bean common mosaic potyvirus, Bean yellow mosaic potyvirus, Beet mosaic potyvirus, Bidens mosaic potyvirus, Bidens motile potyvirus, Cardamom mosaic potyvirus, Carnation vein motile potyvirus, Carrot thin leaf potyvirus, Cassava brown streak potyvirus, Cassia yellow spot potyvirus, Celery potlery busy, virus dwarf potyvirus, Chickpea distortion mosaic potyvirus, Clover yellow vein potyvirus, Commelina diffusa potyvirus, Commelina mosaic potyvirus, Cowpea green vein-banding potyvirus, Cowpeaixie aphid-borne mosaic potyvirus, Cow
  • potyvirus Sweet potato feathery motile potyvirus, Swe et potato G potyvirus, Swordbean distortion mosaic potyvirus, Tamarillo mosaic potyvirus, Telfairia mosaic potyvirus, Tobacco etch potyvirus, Tobacco vein-banding mosaic potyvirus, Tobacco vein mottling potyvirus, Tobacco wilt potyvirus, Tomato Peru potyvirus, Tradesinantum Zebra, Troypaeia virus , Tropaeolum 2 potyvirus, Tuberose potyvirus, Tulip band-breaking potyvirus, Tulip breaking potyvirus, Tulip chlorotic blotch potyvirus, Turnip mosaic potyvirus, Ullucus mosaic potyvirus, Vallota mosaic potyvirus, Manilla mosaic potyvirus, Vanilla necrosis and potyvirus distortion 1 potyvirus, Watermelon mosaic 2 potyvirus, WiId potato mosaic potyvirus, Wisteria vein mosaic potyvirus, Yam mosaic potyvirus, Zucchini yellow fleck potyvirus,
  • the viral genome of the potyviruses is a simple positive polar RNA molecule that encodes a large polyprotein, which is processed post-translationally into at least 10 mature proteins by three viral proteases.
  • This viral RNA is polyadenylated at its 3 'end; and at its 5 'end, unlike mRNAs, it does not have a CAP structure but is replaced by a protein encoded by the virus called VPg ("virus linked protein to the genome") which covalently binds to the 5' end (Murphy et al., Virology, VoI 178, pp. 285-288, 1990).
  • elF4E In mammals, three mechanisms are known for the regulation of the activity of elF4E. These include a regulation of the level of transcription of this gene; In this case, the proto-oncogen MYC binds to the promoter of this factor, inducing its expression levels. There is also a post-translational modification via phosphorylation through two kinases (Mnk1 and 2). This phosphorylation of elF4E seems to increase the translation, but the phosphorylated form has less affinity for the CAP structure; Therefore, it is proposed that phosphorylation could occur after the formation of the 43S pre-initiation complex, thus promoting the release of elF4E and subsequent "scanning" of the ribosome.
  • 4E-BPs 4E binding proteins
  • the binding of these proteins to elF4E does not alter the binding to the CAP structure but prevents the interaction of eIF4E with elF4G, thus suppressing the formation of the elF4F complex.
  • the interaction of 4E-BPs with elF4E is controlled by the specific phosphorylation of serine and threonine residues in 4E-BP.
  • the net effect of this phosphorylation of 4E-BP is the release of elF4E, allowing elF4E to actively bind to elF4G to form the elF4F complex and carry out the translation normally.
  • the present invention establishes the functional implication of AtDBPI, transcriptional regulator with protein-phosphatase activity of the DBP family, in plant-potyvirus interactions as a factor required by the virus for its efficient replication and / or propagation in the plant, and its use as modulator of the defensive response. Based on this, it is demonstrated that the inhibition or absence of the expression of the AtDBPI gene (Seq. Id. No. 9) and therefore the absence of the AtDBPI factor or protein allows to obtain plants with a greater resistance to potyvirus infections.
  • AtDBPI plants with loss of function of the AtDBPI gene were generated (Seq. Id. No. 9).
  • homozygous plants were selected from a T-DNA insertion line in the AtDBPI structural gene (SALK_005240; Seq. Id. No. 10) which carries an insertion in the AtDBPI gene that interrupts its coding sequence and therefore you must eliminate your expression.
  • SALK_005240 Seq. Id. No. 10
  • This homozygous line was called line 8.1.
  • the insertion of T-DNA is located in the second exon of the coding sequence of AtDBPI (Fig. 1A), interrupting the N-terminal region of the protein by the DNC motif, which is involved in the specific binding to DNA.
  • the resulting protein would not be functional since it would lack its phosphatase domain and its DNA binding capacity.
  • the accumulation of the corresponding mRNA in both CoI-O control plants and plants of line 8.1 was analyzed by RT-PCR. The result of said analyzes reveals the absence of mRNA corresponding to the AtDBPI gene in line 8.1 (Fig. 1 B).
  • AtDBPI The inhibition of the expression of AtDBPI triggers in the plant a lower accumulation of the elF (iso) 4E protein.
  • the 4E and iso4E factors are part of the 4F and ⁇ So4F complexes respectively, being esl ⁇ imos exclusive of pla ⁇ as (Browning, Plant Mol. Biol. VoI 32, pp. 107-144, 1996).
  • Complex esios, formed by the 4A, 4G, 4E / iso4E and PABP factors, are required June to start initiation fairs for the initiation of the induction of the proieins, allowing the binding of the mRNA to the pre-initiation complex.
  • the initiation factor of the 4E translation is the function of recognizing and joining the CAP structures present at the 5 'end of the mRNAs.
  • AtDBPI should affect the expression of elF (iso) 4E at the post-transcriptional level, which suggests a possible direct interaction between both proteins.
  • AtDBPI is capable of interacting with the F (iso) 4E
  • a double hybrid assay was carried out using translational fusions of both proteins to the DNA binding and transcriptional activation domains, respectively, of the GAL4 yeast activator.
  • the expression of AtDBPI together with elF (iso) 4E in yeast was able to induce the expression of the HIS3 marker gene, thus confirming the specific interaction between both proteins (Fig. 3A).
  • Fig. 3A A point mutation in the C-terminal domain of AtDBPI that reduces the protein-phosphatase activity thereof, significantly weakened the interaction, suggesting that the isoform of the translation initiation factor 4E could be a substrate susceptible to mediated dephosphorylation by AtDBPl
  • AtDBPI expression leads to a loss of susceptibility or increased resistance to potyvirus infection
  • CoI-O plants and plants of line 8.1 were inoculated with an infectious clone of Plum Pox Virus or sharka virus (PPV), a member of the potyvirus family.
  • the viral clone used was also a carrier of the GFP reporter gene, which allowed monitoring in vivo the degree of colonization of the viral infection.
  • the accumulation of viral RNA in non-inoculated systemic tissue was analyzed by quantitative RT-PCR using primers specific for the GFP marker gene.
  • Figure 4A fifteen days after inoculation (dpi) a marked decrease in the accumulation of the GFP mRNA in 8.1 plants versus CoI-O plants is observed.
  • TuMV Turnip Mosaic Virus
  • the symptomatology referred to in Figure 5 could be specified by visual analysis only in sheets, when generated in the plant wild and not in 8.1 because of its special resistance, an induction of chlorosis and subsequent necrosis that entails the collapse of the foliar tissue due to the infection of the tissue by the virus.
  • said chlorosis and necrosis if it is severe infections or large virus titre, extends to all leaf tissue and eventually leads to the general collapse of the plant; collapse and death of the plant that is characteristic of pathogenic infections as severe as the one we are studying in this case. Therefore, the manipulation of the AtDBPI function seems to trigger an increase in resistance or loss in the susceptibility to several members of the potyvirus family.
  • Plant growth and viral inoculation method Plant growth and viral inoculation method:
  • Arabidopsis thaliana (L.) Heynh plants of the CoI-O ecotype and of the mutant line 8.1 were used, also in a CoI-O genetic background, which corresponds to the T-DNA insertion line SALK_005240 of the SALK Institute (La JoIIa, USA).
  • the seeds of these plants were stratified for 3 days at 4 0 C after imbibition. Subsequently the plants were grown in Jiffy-7 compacted substrate (Clause-Tezier Iberica, Valencia, Spain) at 23 0 C with a photoperiod of 10 hours of light and 14 hours dark.
  • the inoculum used consisted of a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying an infectious clone of the PPV virus (Plum Pox Virus or sharka virus) with the GFP marker gene.
  • the bacterial culture was resuspended in 10 mM MES buffer pH 5.6, 10 mM Mg 2 CI, 150 ⁇ M acetosyringone, at an optical density at 600 nm of 0.5 and maintained for several hours at room temperature.
  • Five-week-old plants were inoculated with 20 ⁇ l of said inoculum, infiltrating the distal half of one leaf per plant by the underside of the leaf. Subsequently the inoculated plants were kept in the same light and temperature conditions to monitor the viral infection at different times.
  • TriZol (Invitrogen) was used for RNA extractions, following the manufacturer's recommendations. The quality and integrity of the extracted RNA was analyzed by spectrophotometry and agarose gel electrophoresis.
  • the semi-quantitative RT-PCR technique was used. From the total RNA the corresponding cDNA was obtained by reverse transcription with oligodT using the "Revertaid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit” kit (Fermentas). The cDNA obtained was used as a template in PCR reactions with specific primers for the gene of interest in a PTC-100 Peltier Thermal Cycler thermal cycler. The final products were separated by agarose gel electrophoresis. The primers used (Seq. Id. No. 1 to 6) are shown in Table 1:
  • the yeast double hybrid system was used. For this, translational fusions of AtDBPI were generated to the DNA binding domain of the GAL4 yeast activator and elF (iso) 4E to the transactivation domain of the same activator. The two fusion proteins were expressed in the yeast strain PJ69-4A and the expression of the HIS3 marker gene was analyzed, evaluating the growth of the transformed yeast strain with both constructs in medium without histidine and supplemented with 3-amino-triazole, a competitive inhibitor of the HIS3 enzyme, against control strains.
  • Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso) 4E is available for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. Plant J. 32, 927-934.
  • Resistance gene analogs are candidate markers for disease-resistance genes ⁇ n grape (Vitis spp.). Theor Appl. Genet 106, 163-172.
  • the VPg of Tobaceous Etch Virus RNA is the 49-kDa proteinase or the N-terminal 24-kDa part of the proteinase. Virology 178, 285-288.
  • a natural recessive resistance gene against Potato virus and in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E (elF4E). Plant J. 32, 1067-1075.
  • Arabidopsis tobamovirus multiplication (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interaets with TOM1.
  • TOM1 an Arabidopsis gene required for efficient multiplication of a tobamovirus, encodes a putative transmembrane protein. Proc. Nati Acad. Sci. USA 97, 10107-10112.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a la utilización de una mutación para Ia generación de plantas mutantes resistentes a virus, concretamente la utilización de la mutación 8.1 del gen AtDBP1 de la Arabidopsis thaliana para modificar el fenotipo de la planta como regulador de la resistencia en plantas frente a potyvirus, así como las plantas obtenidas genéticamente modificadas cuya resistencia a la infección frente al potyvirus es mayor que en las plantas sin modificar.

Description

MANIPULACIÓN EN LA FUNCIÓN DE AtDBPI PARA GENERAR RESISTENCIA FRENTE A POTYVIRUS
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a Ia utilización de una mutación para Ia generación de plantas mutantes resistentes a virus, concretamente Ia utilización de Ia mutación 8.1 del gen AtDBPI de Arabidopsis thaliana como regulador de Ia resistencia en plantas frente a potyvirus para modificar el fenotipo de Ia planta, así como las plantas obtenidas genéticamente modificadas cuya resistencia a Ia infección frente al potyvirus es mayor que en las plantas sin modificar.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En Ia naturaleza, todos los organismos vivos han de estar continuamente defendiéndose de su interacción con otros seres para su supervivencia. Las plantas coexisten con multitud de microorganismos patógenos como bacterias, virus, hongos, etc., sin embargo, en el mundo vegetal, Ia enfermedad constituye una excepción y ello se debe a los múltiples mecanismos de defensa que las plantas poseen frente a estos patógenos. Algunos de estos mecanismos son constitutivos, estando establecidos en Ia planta antes de Ia llegada del patógeno; mientras que otros se inducen tras Ia percepción del mismo y proporcionan protección no sólo en el sitio de infección sino sistémicamente a Io largo de toda Ia planta (Dempsey et al., Crít. Rev. Plan Sci. V. 18, pp.547-575, 1999J. El conocimiento de las rutas de señalización implicadas en Ia respuesta defensiva y los procesos que subyacen a Ia interacción entre Ia planta y el patógeno, representa un indudable interés tanto básico como aplicado. Esto facilitaría el diseño de estrategias encaminadas a Ia obtención de variedades vegetales de mayor resistencia a patógenos, así como también el control de las enfermedades en las especies cultivables para aumentar el rendimiento, Ia calidad y Ia seguridad de Ia cosecha ya que se estima que las pérdidas de rendimiento por causas debidas a patógenos representan alrededor del 10-20% (Kreps ef al., Plan Physiol. VoI. 130, pp. 2129-2141, 2002).
Las enfermedades que causan los virus en las plantas pueden dañar las hojas, los tallos, las raíces, los frutos, las semillas o las flores, y son responsables de un porcentaje considerable de las pérdidas económicas debidas a Ia reducción del rendimiento en las cosechas y en Ia calidad (Agrios, 1988. Plant Pathology, 3rd Ed., San Diego, CA, Academic Press, p. 655). Por esto, los virus de plantas se consideran Ia mayor amenaza para Ia agricultura moderna, provocando bajas en Ia productividad y productos imperfectos o de baja calidad en muchos cultivos y plantas ornamentales en todo el mundo. Dado el carácter generalizado y persistente de las enfermedades provocadas por estos patógenos, se hace necesario establecer métodos de control adecuados para prevenir infecciones, proteger los cultivos y minimizar así las pérdidas agrarias.
Los virus de plantas se clasifican en virus de RNA y virus de DNA según Ia naturaleza de su material genético, siendo los de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva los más frecuentes (HuII, 2002. Matews' Plant Virology, Academic Press). La infección se produce a través de heridas causadas por daños físicos debidos al medio ambiente o por Ia acción de vectores como insectos, ácaros, nemátodos y ciertos hongos habitantes del suelo. En el citoplasma, el virus de RNA se desensambla, se replica, traduce sus mensajeros a proteínas y se moviliza local y sistémicamente (Stange, Cien. Inv. Agr. VoI. 33, pp. 1-18, 2006). Para poder reproducirse, el virus utiliza energía y proteínas de Ia célula hospedadora. Durante cada etapa del ciclo viral se generan complejas interacciones entre Ia planta hospedadora y el virus, que están siendo objeto de intenso estudio en los últimos años. Por ejemplo ciertos componentes de Ia planta hospedadora como microtúbulos, filamentos de actina/miosina y calreticulina facilitan Ia infección y el movimiento del virus en Ia planta (Boevnik y Oparka, Plant Physiol. VoI. 138, pp. 1815-1821, 2005; Chen et al., Plant Physiol. VoI. 138, pp. 1866-1876, 2005). Sin embargo, aún se desconoce Ia identidad de todos los factores, inherentes al hospedador, involucrados en el ciclo viral. Sin duda su conocimiento es uno de los mayores desafíos que tiene planteado el campo de Ia virología con las miras puestas en generar resistencias a infecciones víricas en cultivos de interés económico y medioambiental. Frente a Ia lentitud y Ia complejidad de los programas de mejora genética clásica, se han desarrollado estrategias biotecnológicas basadas en Ia obtención de plantas transgénicas para generar resistencia a infecciones virales. En este sentido, el concepto de resistencia derivada del virus propuesto por Sanford y Johnston {J. Theor. Biol. Vo1 115, pp. 395-405, 1985) es el que se ha empleado con mayor éxito y se basa en Ia expresión en Ia planta de genes virales. Ello podría interferir con el ciclo viral o activar mecanismos de silenciamiento génico. El silenciamiento génico post- transcripcional (PTGS), también conocido como silenciamiento de RNA, es un mecanismo fundamental de defensa antiviral en plantas. Es un proceso de control de Ia expresión génica a nivel post-transcripcional que conduce a Ia supresión de elementos genéticos foráneos como virus y transposones a través de un mecanismo específico de degradación de RNA (Baulcombe, Nature, VoI. 431, pp. 356-363, 2004; y Trenes Biochem. Sc/. VoI. 30, pp. 290-293, 2005).
En los organismos vegetales se conocen al menos tres vías para el silenciamiento de RNA: el silenciamiento citoplasmático por RNAs pequeños interferentes (siRNA), el silenciamiento de mRNA endógenos por microRNA (miRNA) y el silenciamiento asociado a Ia metilación de DNA y supresión de Ia transcripción.
Todas estas vías implican Ia rotura de moléculas de RNA de doble cadena (dsRNA) en
RNAs pequeños tales como siRNA y miRNA. (Baulcombe, Natur, VoI. 431, pp. 356- 363, 2004). Entre las limitaciones que presentan las tecnologías basadas en el silenciamiento de RNA cabe destacar el requerimiento de una alta especificidad de secuencia para Ia degradación de RNA (Ritzenthaler, Curr. Opin. Biotechnol. VoI. 16, pp. 118-122, 2005). Además, los virus han desarrollado Ia capacidad de codificar supresores de este mecanismo de defensa antiviral innato. De entre las proteínas supresoras, Ia HCPro (helper component-protease) codificada por los potyvirus (y
Vaucheret, Science. VoI. 292, pp. 2277-2280, 2001) ha sido una de las más estudiadas. Por todo ello, Ia aplicación de estas estrategias podría ser limitada y poco eficaz en generar resistencia frente un amplio rango de virus.
En otros casos, se ha recurrido a Ia expresión de genes de resistencia de Ia planta o genes R. Estos genes son los responsables del reconocimiento del invasor mediante Ia interacción directa o indirecta del producto de su expresión con factores de avirulencia (Avr) del patógeno. Dicho reconocimiento desencadena un programa de muerte celular en el sitio de infección o reacción hipersensible que bloquea Ia dispersión del patógeno y conduce a Ia activación de Ia respuesta defensiva. Se han identificado genes de resistencia a determinados virus en diferentes especies vegetales, tal como el gen N de tabaco (Nicotiana tabacum), el cual confiere resistencia frente al virus del mosaico del tabaco (TMV), siendo un modelo clásico en el estudio de las interacciones planta-virus (Whitham et al., CeII, VoI. 78, pp. 1101- 1115, 1994; y. Proc. Nati. Acad. ScL USA, VoI. 93, pp. 8776-8781, 1996; Dineshkumar eí al., Proc. Nati. Acad. ScL USA, VoI 92, pp. 4175-4180, 1995.). También se han identificado genes con similitud estructural en especies de interés agronómico denominados análogos a genes de resistencia (RGA) (Shen et al. Mol. Plant Microbe Internet VoI. 11, pp. 815-823, 1998; Deng et al., Theor. Appl. Genet. VoI. 101, pp. 814- 822, 2000; Di Gaspero and Cipriani, Theor. Appl. Genet VoI. 106, pp. 163-172, 2002; Baldi et al., Theor. Appl. Genet. VoI. 109, pp. 231-239, 2004; Dondini et al., J. Horticul. Science and Biotech. VoI. 79, pp. 729-734, 2004; Soriano eí al., Theor. Appl. Genet. VoI. 110, pp. 980-989, 2005). Sin embargo, dado que los genes de resistencia normalmente reconocen específicamente determinadas estirpes del patógeno, su aplicabilidad general es muy limitada. Por otra parte, Ia rápida evolución de cepas virales capaces de eludir los mecanismos de resistencia de Ia planta demanda nuevos conceptos en el desarrollo de variedades vegetales resistentes a patógenos.
En contraste con Ia resistencia de carácter dominante mediada por genes R y el silenciamiento de RNA, existen mecanismos alternativos de resistencia que por sus especiales características son denominados como de naturaleza recesiva. La resistencia recesiva sería el resultado de un mecanismo pasivo que hace a una planta resistente debido a Ia falta de un factor del hospedador específico requerido por el virus para completar su ciclo, o debido a Ia presencia de una versión mutada de este factor (Fraser, Annu. Rev. Phytopathol. VoI. 28, pp. 179-20, 1990;y Academic Press, pp. 1300-1307. San Diego, CA, 1999). Los Potyvirus son aproximadamente un 30% de todos los virus de plantas conocidos y como grupo son muy destructivos en Ia agricultura (Ward et al., 1991).
La información disponible sobre interacciones incompatibles entre virus y plantas controlada en el hospedador por genes de resistencia recesivos es menor y más dispersa (Díaz- Pendón et al., 2004. Mol. Plant Pathol. VoI. 5, pp. 223-233, 2004). Los virus dependen de Ia maquinaria bioquímica del hospedador para completar su ciclo biológico. Así, Ia infección con éxito de una planta requiere una serie de interacciones compatibles entre factores del hospedador y factores virales a Io largo de un proceso complejo que incluye Ia expresión y replicación del genoma viral, el movimiento célula a célula y Ia translocación a larga distancia a través del sistema vascular de Ia planta (Carrington eí al., Plant CeII VoI. 8, pp. 1669-1681, 1996; Maule et al., Curr. Opin. Plant Biol. VoI. 5, pp. 279-284, 2002).
Algunos de estos factores del hospedador requeridos para Ia expresión génica del virus o replicación, se han identificado mediante el análisis de poblaciones mutagenizadas. Así, en Arabidopsis thaliana se ha demostrado que TOM1 y TOM2A se requieren para una eficiente multiplicación del virus del mosaico del tabaco en protoplastos de Arabidopsis. Se trata de proteínas transmembrana del hospedador que interaccionan entre ellas y con proteínas de Ia replicación viral codificadas por el virus siendo esenciales para formar el complejo de replicación tobamoviral (Hagiwara eí al., EMBO J. VoI 22, pp.344-353, 2003; Ishikawa eí al. J. Virol. VoI. 67, pp. 5328-5338, 1991 ; Mol. Gen. Genet. VoI. 230, pp. 33-38, 1993; Ohshima eí al., Virology VoI. 243, pp. 472-481, 1998; Tsujimoto eí al. EMBO J., VoI. 22, ppl 335-343, 2003; Yamanaka eí al., Proc. Nati. Acad. ScL USA VoI. 97, pp. 10107-10112, 2000; y J. Virol. VoI. 76, pp. 2491-2497, 2002). Con una aproximación similar, también se demostró que una de las isoformas del factor de inicio de Ia traducción eucariótico elF(iso)4E era necesaria para Ia multiplicación del potyvirus Turnip mosaic virus (TuMV) y del Tobacco etch virus (TEV) (Duprat et al., Plant J. VoI. 32, pp. 927-934, 2002; Lellis et al. Curr. Biol. VoI. 12, pp. 1046-1051, 2002; Whitham eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, VoI. 96, pp. 772- 777, 1999). Además, se han identificado varios mutantes de Arabidopsis en los cuales está restringido el movimiento viral, tales como cum1-1 y cum2-1, donde está afectada Ia propagación del virus Cucumber mosaic virus (CMV) (Yoshii eí al.,. Plant J. Vo. 13, pp. 211-219, 1998a) y Ia del CMV y Turnip crinkle virus (TCV) (Yoshii eí al., J. Virol. VoI. 72, pp. 8731-8737, 1998b), respectivamente; y vsm1 en el cual el movimiento sistémico de un tobamovirus está específicamente afectado (Larley eí al., Mol. Plant- Microbe Interact. VoI. 11, ppl 706-709, 1998). Los mutantes cum1-1 y cum2-1 tienen alterados los genes elF4E y elF4G respectivamente (Yoshii eí al., J. Virol. VoI. 78, pp. 6102, 2004). La mayoría de los casos de resistencia recesiva se han descrito en especies cultivadas, pero sólo se han identificado genes implicados en pimiento y lechuga, tratándose en ambos casos del factor de inicio de Ia traducción elF4E, y frente a potyvirus (Nicaise et al. Plant Physiol. VoI. 132, pp. 1272-1282, 2003; Ruffel et al. Plant J. VoI. 32, pp. 1067-1075, 2002). Por tanto, aunque Ia información disponible sobre los mecanismos responsables es muy escasa, parece existir un estrecho vínculo entre factores de inicio de Ia traducción y Ia resistencia a virus (Robaglia y Garanta, Trends Plant Sci. VoI. 11, pp. 40-45, 2006).
La solicitud de patente WO 01/34823 A2, con título: "Method for enhancing resistance in plants" se refiere a Ia inducción de resistencia en plantas contra un amplio espectro de patógenos, específicamente, virus, bacterias y hongos por medio de Ia expresión viral de una poliproteína codificada por miembros del grupo de los potyvirus. Dicho método para Ia protección de las plantas contra patógenos comprende: a) transformar una célula de Ia planta con un gen funcional u otros supresores de silenciadores de genes, b) identificar las células transformadas de Ia planta, y c) regenerar una planta transformada a partir de Ia célula transformada.
El documento US 5,986,175, cuyo título es "Virus resistant plants" describe y reivindica como conferir resistencia a plantas por medio de Ia expresión en Ia planta de una secuencia aislada de DNA que comprende nucleótidos que codifican una replicasa de potyvirus, y citan un gran número de potyvirus. Los mismos autores, en el documento de patente US 5,589,612 confieren resistencia a plantas frente a potyvirus utilizando una proteasa de potyvirus para el procedimiento.
En el documento WO 95/04825 A1 con título "Improvements in or relating to disease resistance of plants" también se describe el aumento de resistencia conferido a las plantas por medio de una proteasa de potyvirus. Concretamente, describe una molécula de DNA que codifica una porción de Ia replicasa de potyvirus que, una vez introducida en Ia planta apropiada, es capaz de aumentar Ia resistencia de dicha planta a las enfermedades virales. También describe las plantas transgénicas que poseen una resistencia aumentada contra las enfermedades de los virus.
En Ia solicitud de patente WO 94/16097 A1 , cuyo título es "Plantes transgeniques resistantes aux virus vegetaux et procede d'obtention" se describe y reivindica una planta resistente a potyvirus que contiene en su genoma uno o más fragmentos de ADN que expresa los transcriptos correspondientes a una proteína o parte de una proteína de un virus donante, excepto una proteína de Ia capsida y de Ia proteasa NIa del TMV (Tobacco Mosaic Virus) entera, obteniéndose dicha planta mediante Ia introducción de vectores obtenidos del virus donante.
El documento de patente concedida ES 2 166 361 T3, cuyo título es "Producción de plantas resistentes a los virus a través de Ia introducción de RNA viral intraducibie de sentido positivo" se describe y reivindica un método para producir una planta con una susceptibilidad reducida a Ia infección viral, que comprende: a) transformar células de planta con una molécula de DNA que codifica moléculas de RNA viral intraducibie de sentido positivo, en donde dicha molécula de RNA se deriva de Ia secuencia nucleótidica de un gen de virus de planta, y b) regenerar una planta que comprende Ia célula de planta transformada. La molécula de RNA viral intraducibie de sentido positivo puede derivarse de un potyvirus; y también puede contener al menos una mutación que hace intraducibie a Ia molécula de RNA, y Ia expresión de dicha molécula de RNA dentro de Ia planta reduce Ia susceptibilidad de Ia planta a Ia infección por virus.
La solicitud de patente WO 2004/057941 A2, con título: "Recessive plant viral resistance results from mutations in translation initiation factor elF4E" se refiere a un método para conferir a las plantas resistencia a virus, principalmente resistencia frente a potyvirus. El método implica el silenciamiento del gen que codifica el factor elF4E de iniciación de transcripción en Ia planta, en condiciones efectivas para conferir a Ia planta resistencia frente al virus.
Este silenciamiento comprende: proporcionar una planta transgénica o semilla de planta transformada con moléculas heterólogas de ácido nucleico que silencian el gen que codifica para el elF4E en Ia planta, y después crecer Ia planta transgénica o Ia planta transgénica crecida a partir de Ia semilla transformada en condiciones efectivas para conferir a dicha planta transgénica resistencia al virus. Dichas moléculas heterólogas pueden ser oligonucleótidos antisentido o sentido complementarios (admitiéndose distintos grados de complementariedad en Ia secuencia) al mRNA que codifica para el factor elF4E. Dicho ácido nucleico, puede ser también iRNA (RNA interferente). Tanto Ia planta transgénica como Ia semilla de planta transformada con las moléculas heterólogas pueden ser seleccionadas de un amplio grupo que incluye Arabidopsis thaliana.
En otro aspecto, este método comprende Ia sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico que codifique un factor heterólogo de iniciación de Ia trancripción, el elF4E, así como un sistema de expresión que contenga Ia construcción génica y Ia célula huésped transformada con Ia construcción génica.
El documento describe y reivindica las construcciones génicas, el sistema de expresión que comprende las construcciones génicas, Ia célula huésped transformada, las plantas transformadas, etc., que intervienen en el logro de Ia resistencia frente a potyvirus.
En resumen, el documento describe y reivindica Ia obtención de resistencia recesiva a potyvirus en plantas gracias a mutaciones en el factor de inicio de traducción elF4E.
El documento WO 03/000898 A1 , con título: "Plant genes involved in defense against phatogens" presenta el uso de diferentes genes vía su represión (entre otras posibilidades), para conferir resistencia frente a ciertos tipos de potyvirus (entre otros patógenos).
La invención describe 228 genes identificados como útiles para conferir resistencia frente a más de un patógeno (bacterias, oomycetes y virus). Así mismo, identifica genes que se sobreexpresan o cuya expresión se ve disminuida en respuesta a infecciones virales.
Por Io tanto, Ia invención proporciona tanto plantas transgénicas cuyo genoma es aumentado por una molécula de ácido nucleico de Ia invención como plantas transgénicas, en cuyo genoma el gen correspondiente es interrumpido, dando lugar a pérdida, disminución o alteración en Ia función del producto codificado por dicho gen (con respecto a Ia planta salvaje), adquiriendo estas plantas Ia capacidad de resistencia o tolerancia frente a determinados virus u otros patógenos. Los patógenos pueden ser bacterias, hongos o virus. Dentro de los posibles virus se citan distintos tipos de potyvirus.
El documento presenta Ia posibilidad de represión de genes de Arabidopsis así como de genes que codifican para proteínas de unión a DNA y fosfatasas. Sin embargo, ninguno de los genes presentados se corresponde con AtDBPL
En el artículo "A novel transcription factor involved in plant defense endowed with protein phosphatase activity", (Carrasco et al., The EMBO Journal, VoI. 22 No. 13 pp. 3376-3384, 2003), los mismos autores de Ia presente solicitud describen por primera vez Ia proteína DBP 1 de plantas de tabaco.
Este artículo se centra en el efecto represor del factor de Ia transcripción DBP1 sobre Ia transcripción del gen CEVM (que codifica para una proteína que se expresa en Ia respuesta frente a interacciones compatibles planta-virus). En dicho documento, mediante estudios in vitro, han demostrado que DBP1 se une de forma específica a secuencias del promotor del gen CEVIl
Además, para demostrar Ia relación entre DBP1 y Ia regulación transcripcional de CEVM , se construyen plantas transgénicas de tabaco que presentan una construcción DBP1 antisentido en las que el nivel de expresión del gen DBP1 se ve severamente reducida En estas plantas se demuestra que, en ausencia de DBP1 , se produce Ia acumulación de CEVM (sugiriendo el papel represivo de este nuevo regulador en el control transcripcional de genes diana).
En el trabajo desarrollado, hacen referencia a las PP2C como moduladores negativos de las rutas de señalización por estrés en plantas (entre otros). Así mismo, muestran a CEVM como gen relacionado con Ia defensa, inducible como consecuencia de infección viral y cuya transcripción es regulable por DBP1.
Se muestra especial atención a CEVM y a su papel en el control de Ia susceptibilidad a enfermedades en plantas, no haciendo ninguna alusión a Ia posibilidad de utilizar Ia represión de Ia expresión DBP1 como mecanismo para conferir resistencia a plantas frente a potyvirus, ni tampoco de una posible relación entre DBP1 y elF(iso)4E. En este artículo no se hace ninguna referencia a AtDBPI (es decir, a DBP1 de Arabidopsis thaliana) ni a posibles isoformas de DBP1.
En el artículo "A novel DNA-Binding Motif, Hallmark of a New Family of Plant
Transcription Factors", (Carrasco et al., Plant Physiology. VoI. 137, pp. 602-606, 2005) los autores de Ia presente solicitud describen una nueva familia de factores de transcripción específicos de plantas, Ia familia de factores de transcripción DBP1 entre los que se encuentra AtDBPI . Así, indica Ia conservación del dominio de unión a DNA de estos factores de Ia transcripción, como base para futuros estudios de las funciones reguladoras de dichos factores. Durante el estudio, crean dos versiones mutadas de DBP1 de tabaco: mut1 y mut2 en las que sustituyen ciertos aminoácidos de Ia región conservada en N-terminal por alanina, dando lugar a proteínas que pierden su habilidad de unión a DNA.
El artículo muestra que en Arabidopsis se han identificado 5 genes que codifican para proteínas relacionadas con DBP1. De todas ellas, Ia que mayor similitud a DBP1 presenta es AtDBPI (At2g25620; GenBak, accession number: NM_128120[GenBank]).
Por último, los autores de Ia presente solicitud de patente, en el artículo "14-3-3 Mediates Transcriptional Regulation by Modulating Nucleocytoplasmic Shuttling of Tobacco DNA-bindíng Protein Phosphatase-1" (Carrasco et al., J. Biol. Chem. VoI. 281, Issue 32, 22875-22881, 2006) identifican Ia isoforma G de Ia proteína de tabaco 14-3-3 como Ia primera proteína que interactúa con el factor DBP. Se sirven de dicha proteína para comprender el mecanismo que subyace bajo esta familia de reguladores transcripcionales.
Este artículo presenta Ia interacción tanto de DBP1 como de AtDBPI con sus isoformas correspondientes de 14-3-3, interacción que regula positivamente Ia inducción del gen CEVH . Para localizar Ia zona de unión entre DBP1 y 14-3-3, construyen mutantes deleccionados en DBP1 : del 1 (que mantiene N-terminal y por tanto interacciona con 14-3-3) y del 2 (deleccionado en N-terminal y que no se une a 14-3-3). Para determinar Ia posición exacta, hacen varias delecciones. Así, realizan pruebas con 14-3-3 λ de Arabidopsis (ortólogo funcional de 14-3-3 G de tabaco). Comparan Ia interacción de AtDBPI con 14-3-3 λ y comprueban que ambas proteínas interaccionan a través de Ia región N-terminal. Estos resultados refuerzan el significado biológico de Ia interacción DBP1 14-3-3G.
Resumiendo, concluyen que Ia isoforma 14-3-3G regula positivamente Ia inducción del gen CEVM de tabaco por interacción directa con DBP1.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de Ia presente invención se refiere a Ia utilización de Ia mutación 8.1 del gen AtDBPI de Arabidopsis thaliana (Gen At2g25620; Gen Bank, accesión number
NM_128120) para modificar el fenotipo de Ia planta de forma que Ia planta resultante presente un aumento de resistencia a Ia infección por potyvirus comparada con Ia planta de tipo salvaje.
Otro objeto de Ia presente invención se refiere al uso del gen AtDBPI en especies de interés agronómico e industrial como regulador de Ia respuesta frente a potyvirus en plantas. Ese uso conlleva Ia pérdida de función del gen AtDBPI conduciendo a una menor acumulación de elF(iso)4E, que daría lugar a resistencia o menos susceptibilidad a potyvirus.
Como regulador se entiende el gen, y por tanto Ia proteína por él codificada, que regula el mecanismo o parte del mecanismo que subyace y que es utilizado por los virus en cuestión en el presente estudio para penetrar, multiplicarse e infectar Ia planta.
En Ia descripción de Ia invención, se realizan estudios sobre Ia implicación del gen AtDBPI en Ia resistencia o disminución de susceptibilidad frente a potyvirus. Los experimentos se realizan con Ia línea mutante 8.1 de Arabidopsis thaliana, en Ia que el gen AtDBPI está interrumpido por inserción de T-DNA en el segundo exón de su secuencia codificante, interrumpiendo Ia región N-terminal de Ia proteína por el motivo DNC, de manera que Ia acumulación de su mRNA está inhibida. Es decir, una pérdida de función caracterizada por no expresión de m-RNA. Las plantas mutantes son expuestas a dos tipos diferentes de potyvirus, comprobándose que efectivamente su resistencia o falta de susceptibilidad a dichos potyvirus, se ve incrementada.
Otro objeto de Ia invención es Ia utilización de Ia mutación 8.1 del gen AtDBPI de Arabidopsis thaliana para generar plantas caracterizadas por presentar una resistencia al potyvirus Plum Pox Virus (PPV) mayor que Ia de Ia planta de tipo salvaje. Dicha resistencia se detecta mediante análisis por RT-PCR.
Y finalmente otro objeto de Ia invención es Ia utilización de Ia mutación 8.1 del gen AtDBPI de Arabidopsis thaliana para generar plantas caracterizadas por presentar síntomas atenuados tras Ia infección por el potyvirus Turnip Mosaic Virus (TuMV), Io cual no ocurre con Ia planta de tipo salvaje.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Caracterización del muíante de inserción 8.1, portador de una inserción de T-DNA en el gen AtDBPL A, Estructura del gen AtDBPL El gen AtDBPI consta de 4 exones (que aparecen indicados con rectángulos negros) separados por 3 intrones. La línea 8.1 (SALK_005240) posee una inserción de T-DNA que interrumpe Ia secuencia codificante del gen AtDBPI en el segundo exón. B, Análisis de Ia expresión del gen AtDBPI en Ia línea de inserción 8.1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación obtenidos mediante RT-PCR usando cebadores específicos para el gen AtDBPI en comparación con plantas silvestres CoI- 0.
Figura 2. Análisis de Ia expresión de AtelF(iso)4E en Ia línea de inserción de AtDBPI 8.1. A, Western-blot de extractos proteicos obtenidos a partir de hojas de plantas silvestres CoI-O y dos lotes diferentes de plantas de Ia línea muíante 8.1 , 8.1 (1) y 8.1 (2). A Ia izquierda se indica Ia migración de las proteínas marcadoras empleadas en función de su tamaño molecular. Como control de carga se muestra un detalle de Ia tinción de Ia membrana de niírocelulosa con Ponceau-S después de Ia íransferencia. B, Análisis de Ia acumulación del RNA mensajero de AtelF(iso)4E en plañías silvestres CoI-O y en Ia línea de inserción 8.1 mediante RT-PCR. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación obtenidos usando cebadores específicos para el gen AtelF(iso)4E (arriba) y para el gen AteEFIa, que se incluye como control (abajo), en comparación con plantas silvestres CoI-O. Bajo el detalle del gel se muestra Ia cuantificación relativa de cada producto de amplificación respecto al obtenido a partir de plantas CoI-O.
Figura 3. Análisis de Ia interacción entre AtDBPI y AteIF(iso)4E. A, Sistema de doble híbrido en levadura: crecimiento en presencia (izquierda) y ausencia (derecha) de histidina de cepas de levadura que expresan diferentes regiones de Ia proteína AtDBPI fusionadas al dominio de unión a DNA de GAL4 y una fusión de AtelF(iso)4E al dominio de activación transcripcional del mismo factor. La capacidad de las células de levadura para crecer en medio sin histidina depende de Ia interacción entre las 2 proteínas de fusión y Ia activación subsiguiente de Ia transcripción del gen marcador HIS3. El medio sin histidina se suplemento con 3-amino-triazol, un inhibidor del enzima HIS3, con objeto de aumentar Ia presión selectiva. B, Coinmunoprecipitación de AtDBPI y AtelF(iso)4E: Western-blot de las fracciones inmunoprecipitadas con anticuerpos frente el epítopo de hemaglutinina (HA) a partir de extractos proteicos de hoja obtenidos de plantas CoI-O (1) y plantas transgénicas que expresan AtDBPI fusionada a dicho epítopo (2). El Western-blot se reveló con anticuerpos anti- AtelF(iso)4E.
Figura 4. Análisis de Ia acumulación y distribución viral en plantas de Ia línea muíante 8.1 y plantas silvestres CoI-O tras Ia inoculación con el virus de Ia sharka (Plum Pox Virus o PPV) fusionado al reportador GFP. A, Acumulación del RNA viral: amplificación mediante PCR cuantitativa de cDNA obtenido de hojas no inoculadas de plantas control CoI-O y plantas de Ia línea de inserción 8.1 infectadas con una versión del virus que incluye Ia secuencia codificante de Ia proteína fluorescente verde GFP (PPV-GFP), 20 días después de Ia inoculación. Las barras blancas representan Ia amplificación del RNA viral usando cebadores específicos para GFP. Como control se incluye el gen ACTINA8 (barras negras). Los números que figuran sobre las barras indican Ia cuantificación de Ia diferencia observada entre CoI-O y 8.1 después de normalizar los resultados obtenidos con los del control respectivo. B, Acumulación de proteína viral: Western-blot de extractos proteicos de hoja obtenidos antes de inocular plantas CoI-O y 8.1 con PPV-GFP (t0) y 20 días después de Ia inoculación (t20), ¡nmunodecorado con un anticuerpo policlonal anti-GFP. A Ia derecha se indica Ia migración del marcador de peso molecular empleado. C, Análisis de Ia distribución del virus en hojas inoculadas (paneles superiores) y no inoculadas o sistémicas (paneles inferiores) de plantas CoI-O (izquierda) y 8.1 (derecha), mediante microscopía de fluorescencia para Ia detección de GFP.
Figura 5. Infección con el virus del mosaico del nabo (Turnip Mosaic Virus o TuMV). Sintomatología observada en plantas CoI-O (parte superior) y 8.1 (parte inferior) tras Ia infección con TMV.
Figura 6. Secuencia nucleotídica del gen AtDBPI (At2g25620). En negrita y mayúsculas se indican los exones, y en minúcula los intrones y regiones 5' y 3' no traducidas.
Figuras 7. Secuencia nucleotídica del gen AtDBPI (At2g25620) en el muíante 8.1 (SALK_005240). En negrita y mayúsculas se indican los exones, en minúsculas los intrones y regiones 5'y 3'no traducidas, y subrayada Ia secuencia que correspondería al T-DNA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La familia de los potyvirus representa un gran número de patógenos virales de plantas que colectivamente pueden infectar Ia mayoría de las especies de cultivo. La infección por potyvirus puede inducir una variedad de síntomas incluyendo el moteado foliar, Ia distorsión de semillas y los frutos, así puede comprometer gravemente el rendimiento y/o Ia calidad del cultivo. La familia de los potyvirus o Potyviridae incluye las especies definitivas: Alstroemería mosaic potyvirus, Amaranthus leaf motile potyvirus, Araujia mosaic potyvirus, Arracacha Y potyvirus , Artichoke latent potyvirus, Asparagus 1 potyvirus, Banana bract mosaic potyvirus, Bean common mosaic necrosis potyvirus, Bean common mosaic potyvirus, Bean yellow mosaic potyvirus, Beet mosaic potyvirus, Bidens mosaic potyvirus, Bidens motile potyvirus, Cardamom mosaic potyvirus, Carnation vein motile potyvirus, Carrot thin leaf potyvirus, Cassava brown streak potyvirus, Cassia yellow spot potyvirus, Celery mosaic potyvirus, Chickpea bushy dwarf potyvirus, Chickpea distortion mosaic potyvirus, Clover yellow vein potyvirus, Commelina diffusa potyvirus, Commelina mosaic potyvirus, Cowpea green vein- banding potyvirus, Cowpea Moroccan aphid-borne mosaic potyvirus, Cowpea rugóse mosaic potyvirus, Crinum mosaic potyvirus, Daphne Y potyvirus, Dasheen mosaic potyvirus, Datura Colombian potyvirus, Datura distortion mosaic potyvirus, Datura necrosis potyvirus, Datura shoestring potyvirus, Dendrobium mosaic potyvirus, Desmodium mosaic potyvirus, Dioscorea alata potyvirus, Dioscorea green banding mosaic potyvirus, Eggplant green mosaic potyvirus, Euphorbia ringspot potyvirus, Freesia mosaic potyvirus, Groundnut eyespot potyvirus, Guar symptomless potyvirus, Guinea grass mosaic potyvirus, Helenium Y potyvirus, Henbane mosaic potyvirus, Hippeastrum mosaic potyvirus, Hyacinth mosaic potyvirus, Iris fulva mosaic potyvirus, Iris mild mosaic potyvirus, Iris severe mosaic potyvirus, Johnsongrass mosaic potyvirus, Kennedya Y potyvirus, Leek yellow stripe potyvirus, Lettuce mosaic potyvirus, LiIy motile potyvirus, Maize dwarf mosaic potyvirus, Malva vein clearing potyvirus, Marigold motile potyvirus, Narcissus yellow stripe potyvirus, Nerine potyvirus, Onion yellow dwarf potyvirus, Ornithogalum mosaic potyvirus, Papaya ringspot potyvirus, Parsnip mosaic potyvirus, Passiflora ringspot potyvirus, Passiflora South African potyvirus, Passionfruit woodiness potyvirus, Patchouli mosaic potyvirus, Pea mosaic potyvirus, Pea seed-borne mosaic potyvirus, Peanut green mosaic potyvirus, Peanut motile potyvirus, Pepper Indian motile potyvirus, Pepper motile potyvirus, Pepper severe mosaic potyvirus, Pepper veinal motile potyvirus, Plum pox potyvirus, Pokeweed mosaic potyvirus, Potato A potyvirus, Potato V potyvirus, Potato Y potyvirus, Prímula mosaic potyvirus, Ranunculus motile potyvirus, Sorghum mosaic potyvirus, Soybean mosaic potyvirus, Statice Y potyvirus, Sugarcane mosaic potyvirus, Sweet potato feathery motile potyvirus, Sweet potato G potyvirus, Swordbean distortion mosaic potyvirus, Tamarillo mosaic potyvirus, Telfairia mosaic potyvirus, Tobacco etch potyvirus, Tobacco vein-banding mosaic potyvirus, Tobacco vein mottling potyvirus, Tobacco wilt potyvirus, Tomato Perú potyvirus, Tradescantia- Zebrina potyvirus, Tropaeolum 1 potyvirus, Tropaeolum 2 potyvirus, Tuberose potyvirus, Tulip band-breaking potyvirus, Tulip breaking potyvirus, Tulip chlorotic blotch potyvirus, Turnip mosaic potyvirus, Ullucus mosaic potyvirus, Vallota mosaic potyvirus, Manilla mosaic potyvirus, Vanilla necrosis potyvirus, Voandzeia distortion mosaic potyvirus, Watermelon mosaic 1 potyvirus, Watermelon mosaic 2 potyvirus, WiId potato mosaic potyvirus, Wisteria vein mosaic potyvirus, Yam mosaic potyvirus, Zucchini yellow fleck potyvirus, Zucchini yellow mosaic potyvirus, y las especies provisionales: Asystasia gangetica motile (?) potyvirus, Celery latent (?) potyvirus, Datura mosaic (?) potyvirus, Endive necrotic mosaic (?) potyvirus, Kalanchoe mosaic (?) potyvirus, Konjak mosaic (?) potyvirus, Nasturtium mosaic (?) potyvirus, Patchouli motile (?) potyvirus, Shallot yellow stripe (?) potyvirus, Sweet potato vein mosaic (?) potyvirus, Welsh onion yellow stripe (?) potyvirus).
El genoma viral de los potyvirus está constituido por una molécula simple de RNA de polaridad positiva que codifica una gran poliproteína, Ia cual es procesada postraduccionalmente en al menos 10 proteínas maduras por tres proteasas virales. Este RNA viral está poliadenilado en su extremo 3'; y en su extremo 5', a diferencia de los mRNAs, no presenta una estructura CAP sino que es sustituida por una proteína codificada por el virus denominada VPg ("virus protein linked to the genome") Ia cual se une covalentemente al extremo 5' (Murphy et al., Virology, VoI 178, pp. 285-288, 1990).
El hecho de que Ia falta de AtDBPI se traduzca en una disminución de Ia acumulación de dicho factor a nivel postranscripcional, parece indicar que AtDBPI podría estar ejerciendo un control sobre el factor de inicio de Ia traducción. Para ello se quiso comprobar si ambas proteínas eran capaces de interaccionar físicamente. En esta invención se demuestra dicha interacción, por Io que muy probablemente este factor se presente como un posible candidato para Ia desfosforilación mediada por AtDBPI , merced a su actividad protein fosfatasa del tipo "C que lleva asociada.
En mamíferos, se conocen tres mecanismos para Ia regulación de Ia actividad de elF4E. Entre estos cabe destacar una regulación del nivel de transcripción de este gen; en este caso el proto-oncogen MYC se une al promotor de este factor induciendo sus niveles de expresión. También existe una modificación post-traduccional vía fosforilación a través de dos quinasas (Mnk1 y 2). Esta fosforilación de elF4E parece aumentar Ia traducción, pero Ia forma fosforilada tiene menos afinidad por Ia estructura CAP; por ello se propone que Ia fosforilación podría darse después de Ia formación del complejo de preiniciación 43S promoviendo así Ia liberación de elF4E y el posterior "scanning" del ribosoma. Por último, el principal mecanismo para Ia regulación de Ia actividad de eIF4E es a través de su interacción con una familia de proteínas represoras llamadas 4E-BPs (proteínas de unión a 4E). La unión de estas proteínas a elF4E no altera Ia unión a Ia estructura CAP pero previene Ia interacción de eIF4E con elF4G, suprimiendo así Ia formación del complejo elF4F. La interacción de 4E-BPs con elF4E está controlada por Ia fosforilación específica de residuos de serina y treonina en 4E-BP. El efecto neto de esta fosforilación de 4E-BP es Ia liberación de elF4E, permitiendo que elF4E se una activamente a elF4G para formar el complejo elF4F y curse de manera normal Ia traducción.
La presente invención establece Ia implicación funcional de AtDBPI , regulador transcripcional con actividad protein-fosfatasa de Ia familia DBP, en interacciones planta-potyvirus como un factor requerido por el virus para su replicación y/o propagación eficiente en Ia planta, y su uso como modulador de Ia respuesta defensiva. En base a ello, se demuestra que Ia inhibición o ausencia de Ia expresión del gen AtDBPI (Seq. Id. No. 9) y por tanto Ia ausencia del factor o proteína AtDBPI permite obtener plantas con una mayor resistencia a infecciones por potyvirus.
Con el propósito de averiguar Ia función de AtDBPI , se generaron plantas con pérdida de función del gen AtDBPI (Seq. Id. No. 9). Para ello se seleccionaron plantas homocigotas a partir de una línea de inserción de T-DNA en el gen estructural AtDBPI (SALK_005240; Seq. Id. No. 10) Ia cual es portadora de una inserción en el gen AtDBPI que interrumpe su secuencia codificante y por tanto debe eliminar su expresión. A esta línea homocigota se Ia denominó línea 8.1. La inserción de T-DNA se encuentra ubicada en el segundo exón de Ia secuencia codificante de AtDBPI (Fig. 1A), interrumpiendo Ia región N-terminal de Ia proteína por el motivo DNC, el cual está implicado en Ia unión específica a DNA . Por tanto, en el caso de que hubiera expresión del gen AtDBPI en las plantas 8.1 , Ia proteína resultante no sería funcional pues carecería de su dominio fosfatasa y de su capacidad de unión a DNA. Para comprobar el grado en que Ia inserción de T-DNA afectaba a Ia expresión del gen AtDBPI, se analizó por RT-PCR Ia acumulación del mRNA correspondiente tanto en plantas control CoI-O como plantas de Ia línea 8.1. El resultado de dichos análisis revela Ia ausencia de mRNA correspondiente al gen AtDBPI en Ia línea 8.1 (Fig. 1 B). Estos resultados confirman por tanto que Ia expresión de AtDBPI en las plantas 8.1 está inhibida en comparación con los niveles de expresión observados para el gen AtDBPI en las plantas silvestres CoI-O.
La inhibición de Ia expresión de AtDBPI desencadena en Ia planta una menor acumulación de Ia proteína elF(iso)4E.
Como parte de Ia caracterización funcional, molecular y genética del homólogo funcional de DBP1 en Arabidopsis thaliana, y con objeto de identificar los genes diana de AtDBPI , se realizó un análisis comparativo del proteoma de las plántulas de Ia línea muíante 8.1 respecto a las plántulas de Ia línea salvaje CoI-O mediante electroforesis bidimensional. Según este análisis, de entre los spots diferenciales observados entre ambos genotipos se identificó un polipéptido, que tras un análisis por espectroscopia de masas de sus fragmentos de digestión con tripsina, se vio que correspondía a una de las isoformas del factor de inicio de Ia traducción 4E (elF(iso)4E), el cual presentaba una baja acumulación en las plántulas de Ia línea muíante 8.1.
Los factores 4E e iso4E forman parte de los complejos 4F e ¡so4F respectivamenfe, siendo esíos úlíimos exclusivos de plañías (Browning, Plant Mol. Biol. VoI 32, pp. 107-144, 1996). Esíos complejos, formados por los facíores 4A, 4G, 4E/iso4E y facíores PABP, son requeridos junio a oíros facíores de iniciación para el inicio de Ia íraducción de las proíeínas, permifiendo Ia unión del mRNA al complejo de preiniciación. En concreío, el factor de inicio de Ia traducción 4E íiene Ia función de reconocer y unirse a las esíructuras CAP presentes en el extremo 5' de los mRNA.
La baja represenlación del facíor elF(iso)4E en el muíaníe 8.1 parece indicar que AÍDBP1 coníribuye posiíivameníe a Ia acumulación de elF(iso)4E. Con objeío de comprobar si el conírol que ejerce AÍDBP1 sobre dicho facíor es a nivel íranscripcional o posí-íranscripcional se analizó Ia expresión de elF(iso)4E a nivel de mRNA medianíe RT-PCR y a nivel de proíeína medianíe Western-bloí usando un aníicuerpo policlonal específico. Los resultados obtenidos indican una menor acumulación de Ia proteína elF(iso)4E en Ia línea muíante 8.1 al comparar con plantas CoI-O (Fig. 2A) mientras que el nivel de mRNA, analizado por RT-PCR es similar en ambos genotipos (Fig. 2B). Por tanto, AtDBPI debe afectar a Ia expresión de elF(iso)4E a nivel post- transcripcional, Io que sugiere una posible interacción directa entre ambas proteínas.
AtDBPI y elF(iso)4E interaccionan in vivo
Para comprobar si AtDBPI es capaz de interaccionar con elF(iso)4E se llevó a cabo un ensayo de doble híbrido usando fusiones traduccionales de ambas proteínas a los dominios de unión a DNA y de activación transcripcional, respectivamente, del activador de levadura GAL4. La expresión de AtDBPI junto a elF(iso)4E en levadura fue capaz de inducir Ia expresión del gen marcador HIS3, confirmándose así Ia interacción especifica entre ambas proteínas (Fig. 3A). Una mutación puntual en el dominio C-terminal de AtDBPI que reduce Ia actividad proteín-fosfatasa de Ia misma, debilitó de forma significativa Ia interacción, sugiriendo que Ia isoforma del factor de inicio de Ia traducción 4E podría ser un sustrato susceptible a Ia desfosforilación mediada por AtDBPl
La interacción observada entre AtDBPI y elF(iso)4E se confirmó mediante coinmunoprecipitación. Utilizando un anticuerpo específico frente a elF(iso)4E se detectó Ia presencia de dicho factor mediante Western blot en el inmunoprecipitado obtenido con anticuerpos monoclonales anti-HA a partir de extractos de plantas transgénicas que expresaban AtDBPI fusionada al epítopo HA bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de Ia coliflor (CaMV), de expresión constitutiva (Fig. 3B). Ello demuestra que ambas proteínas son capaces de interaccionar en Ia planta in vivo.
La inhibición de Ia expresión de AtDBPI conduce a una pérdida de susceptibilidad o aumento de Ia resistencia a Ia infección por potyvirus
Se intentó establecer si los mutantes 8.1 muestran resistencia recesiva específica a potyvirus. Análisis por Western-blot revelaron que estos mutantes presentan niveles inferiores de elF(iso)4E, de Io que se deduce que Ia pérdida de Ia función de este factor confiere resistencia frente a potyvirus. Aunque no se observó una ausencia total de Ia proteína elF(iso)4E en Ia línea de inserción de T-DNA 8.1 , Ia menor acumulación de elF(iso)4E en estas plantas con respecto a las plantas CoI-O sugiere Ia posibilidad de que Ia ausencia de AtDBPI (o perdida de función) produzca un fenotipo de resistencia a potyvirus. Por esta razón, se inocularon plantas CoI-O y plantas de Ia línea 8.1 con un clon infeccioso del Plum Pox Virus o virus de Ia sharka (PPV), miembro de Ia familia de los potyvirus. El clon viral utilizado además era portador del gen reportador GFP, Io cual permitía hacer un seguimiento in vivo del grado de colonización de Ia infección viral. Inicialmente se analizó Ia acumulación del RNA viral en tejido sistémico no inoculado mediante RT-PCR cuantitativa usando cebadores específicos para el gen marcador GFP. Como se muestra en Ia figura 4A, quince días después de Ia inoculación (dpi) se observa una acusada disminución en Ia acumulación del mRNA de GFP en plantas 8.1 frente a plantas CoI-O. Este resultado guarda correlación con el nivel de proteína GFP detectada mediante Western-blot en tejido sistémico de ambos genotipos, donde se observa asimismo una menor acumulación de Ia proteína en plantas 8.1 al comparar con plantas CoI-O a los 15 dpi (Fig. 4B). El gen marcador GFP permite a su vez realizar un seguimiento del movimiento y distribución del virus mediante microscopia de fluorescencia. Ello ha puesto de manifiesto un marcado retraso del movimiento viral en las plantas 8.1 respecto a plantas CoI-O, donde tanto Ia acumulación viral en el tejido vascular como el movimiento del virus a través del pecíolo hacia tejidos distales es más temprano (Fig.4C). Además, para cada uno de los tiempos analizados después de Ia inoculación, se observa que el tejido sistémico no inoculado analizado en las plantas CoI-O presenta una mayor invasión viral alcanzando casi toda Ia hoja, mientras que en el tejido equivalente en las plantas 8.1 Ia dispersión del virus afectaba predominantemente al tejido vascular. Por tanto, Ia pérdida de expresión y en consecuencia Ia pérdida de función de AtDBPI que presenta el muíante 8.1 ralentiza y atenúa Ia infección vírica.
Debido a Ia ausencia de síntomas en las infecciones con PPV, se analizó también Ia respuesta de plantas 8.1 frente a otro miembro de Ia familia de los potyvirus causante de síntomas en Arabidopsis, el Turnip Mosaic Virus (TuMV). Ello permitiría comprobar si Ia pérdida de susceptibilidad observada para el PPV podría extenderse a otros miembros de Ia familia. Como muestra Ia figura 5, Ia inoculación con TuMV provocó una sintomatología mucho menos severa en plantas 8.1 que Ia mostrada por plantas control CoI-O. La sintomatología a Ia que hace referencia Ia figura 5 se podría precisar mediante el análisis visual solamente en hojas, al generarse en Ia planta salvaje y no en Ia 8.1 por su especial resistencia, una inducción de clorosis y posterior necrosis que conlleva el colapso del tejido foliar consecuencia de Ia infección del tejido por el virus. En última instancia dicha clorosis y necrosis, si se trata de infecciones severas o gran título de virus, se extiende a todo el tejido foliar y eventualmente conlleva el colapso general de Ia planta; colapso y muerte de Ia planta que es característicos de infecciones patogénicas tan severas como Ia que estamos estudiando en este caso. Por tanto, Ia manipulación de Ia función de AtDBPI parece desencadenar un aumento en Ia resistencia o pérdida en Ia susceptibilidad a varios miembros de Ia familia de los potyvirus.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE UN MODO DE REALIZACIÓN
Crecimiento de las plantas y método de inoculación vírica:
Como material vegetal se emplearon plantas de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh del ecotipo CoI-O y de Ia línea muíante 8.1 , también en un fondo genético CoI-O, que corresponde a Ia línea de inserción de T-DNA SALK_005240 del SALK Institute (La JoIIa, EE.UU.). Las semillas de estas plantas se estratificaron durante 3 días a 40C tras Ia imbibición. Posteriormente las plantas fueron crecidas en sustrato compactado Jiffy-7 (Clause-Tezier Ibérica, Valencia, España) a 230C con un fotoperiodo de 10 horas de luz y 14 de oscuridad. El inoculo empleado consistía en una suspensión de Agrobacterium tumefaciens portador de un clon infeccioso del virus PPV (Plum Pox Virus o virus de Ia sharka) con el gen marcador GFP. El cultivo bacteriano fue resuspendido en tampón MES 10 mM pH 5.6, Mg2CI 10 mM, acetosiringona 150 μM, a una densidad óptica a 600 nm de 0.5 y mantenido varias horas a temperatura ambiente. Plantas de cinco semanas de edad fueron inoculadas con 20 μl de dicho inoculo, infiltrando por el envés de Ia hoja Ia mitad distal de una hoja por planta. Posteriormente las plantas inoculadas se mantuvieron en las mismas condiciones de luz y temperatura para hacer un seguimiento de Ia infección vírica a diferentes tiempos. Extracción y purificación de RNA
Para las extracciones de RNA se utilizó TriZol (Invitrogen), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La calidad e integridad del RNA extraído se analizó por espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa.
Análisis de Ia expresión génica por RT-PCR
Para evaluar el grado de expresión de determinados genes se empleó Ia técnica de RT-PCR semicuantitativa. A partir de RNA total se obtuvo el correspondiente cDNA mediante transcripción inversa con oligodT usando el kit "Revertaid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit" (Fermentas). El cDNA obtenido se utilizó como molde en reacciones de PCR con cebadores específicos para el gen de interés en un termociclador PTC-100 Peltier Thermal Cycler. Los productos finales se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los cebadores utilizados (Seq. Id. No. 1 a 6) se muestran en Ia Tabla 1 :
TABLA 1
Figure imgf000024_0001
PCR en tiempo real
Las muestras fueron analizadas por triplicado y las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron usando Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en un detector de secuencias ABI PRlSM 7000. Los cebadores directo y reverso fueron diseñados usando el paquete informático Primer express. Las secuencias de los cebadores utilizados (Seq. Id. No 7 y 8) se muestran en Ia Tabla 2: TABLA 2
Figure imgf000025_0001
Sistema de doble híbrido en levadura
Con objeto de determinar si el factor elF(iso)4E es capaz de interaccionar de forma específica con AtDBPI se utilizó el sistema de doble híbrido en levadura. Para ello se generaron fusiones traduccionales de AtDBPI al dominio de unión a DNA del activador de levadura GAL4 y de elF(iso)4E al dominio de transactivación del mismo activador. Las dos proteínas de fusión se expresaron en Ia cepa de levadura PJ69-4A y se analizó Ia expresión del gen marcador HIS3, evaluando el crecimiento de Ia cepa de levadura transformada con ambas construcciones en medio sin histidina y suplementado con 3-amino-triazol, un inhibidor competitivo de Ia enzima HIS3, frente a cepas control.
REFERENCIAS
• Agrios, "Chapter 14: Plant diseases caused by viruses" (1988), Plant Pathology, 3rd Ed., San Diego, CA1 Academic Press, p.655.
• Baldi, P., Patocchi, A., Zini, E., Toller, C, Velasco, R. and Komjanc, M. (2004).
Cloning and linkage mapping of resistance gene homologues in apple. Theor. Appl. Genet 109, 231-239.
• Baulcombe, D. (2005). RNA silencing. Trenos Biochem. ScL 30, 290-293.
• Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431, 356-363.
• Boevnik, P. and Oparka, KJ. (2005). Virus-host interactions during movement processes. Plant Physiol. 138, 1815-1821.
• Browning, K.S. (1996). The plant translational apparatus. Plant Mol. BIoI. 32, 107-144.
• Carrasco, J. L., Ancillo, G., Mayda, E., and Vera, P. (2003). A novel transcription factor involved in plant defense endowed with protein phosphatase activity.
EMBO J. 22, 3376-3384.
• Carrasco, J. L., Ancillo, G., Castelló, MJ. and Vera, P. (2005). A novel DNA- binding motif, hallmark of a new family of plant transcription factors. Plant Physiol. 137, 602-606.
• Carrasco, J. L., Castelló, MJ. and Vera, P. (2006). 14-3-3 mediates transcriptional regulation by modulating nucleocytoplasmic shuttling of tobáceo DNA-binding protein-phosphatase-1. J. Biol. Chem. 281 , 22875-22881.
• Carrington, J. C, Kasschau, K.D., Mahajan, S.K. and Schaad, M. C. (1996). CeII- to-cell and long distance transport of viruses in plants. Plant CeII B, 1669-1681. • Chen, M.-H., Tian, G.-W., Gafni, Y. and Citovsky, V. (2005). Effects of calreticulin on viral cell-to-cell movement. Plant Physiol. 138, 1866-1876.
• Dempsey, D.A., Shah, J. and Klessig, D.F. (1999). Salicylic acid and disease resistance in plants. Crit. Rev. Plant Sci. 18, 547-575.
• Duprat, A., Garanta, C1 Revers, F., Menand, B., Browning, K.S. and Robaglia,
C. (2002). The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso) 4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. Plant J. 32, 927-934.
• Deng, Z., Huang, S., LJng, P., Chen, C, Yu, C1 Weber, C.A., Moore, G.A. and Gmitter, F.G. (2000). Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences ¡n citrus. Theor. Appl. Genet. 101, 814-
822.
• Di Gaspero, G. and Cipriani, G. (2002). Resistance gene analogs are candidate markers for disease-resistance genes ¡n grape (Vitis spp.). Theor. Appl. Genet. 106, 163-172.
• Díaz-Pendón, J.A., Truniger, V., Nieto, C, García-Mas, J., Bendahmane, A. and Aranda, M. (2004). Advances in understanding recessive resistance to plant virases. Mol. Plant Pathol. 5, 223-233.
• Dineshkumar, S.P., Whitham, S., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B. (1995). Transposon tagging of tobáceo mosaic virus resistance gene N: its possible role in the TMV-N~med¡ated signal transduction pathway. Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 92, 4175-4180.
• Dondini, L., Costa, F., Tataranni, G., Tartarini, S. and Sansavini, S. (2004). Cloning of apricot RGAs (Resistance Gene Analogs) and development of molecular markers associated with sharka (PPV) resistance. J. Horticul. Science and Biotech. 79, 729-734.
• Fraser, R.S.S. (1990). The genetics of resistance to plant viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 28, 179-200. • Fraser, R.S.S. (1999). Plant resistance to viruses. In: Encyclopedia of Virology (Granoff A. and Webster, R.G., eds). Academic Press, pp. 1300-1307. San Diego, CA.
• Hagiwara, Y., Komoda, K., Yamanaka, T., Tamai, A., Meshi, T, Fuñada, R., Tsuchiya, T., Naito, S. and Ishikawa, M. (2003). Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication. EMBO J. 22, 344-353.
• HuII, R. (2002). Matthews' Plant Virology. Academic Press.
• Ishikawa, M., Naito, S. and Ohno, T. (1993) Effects of the tom1 mutation of Arabidopsis thaliana on the multiplication of Tobacco mosaic virus RNA in protoplasts. J. Virol. 67, 5328-5338.
• Ishikawa, M., Obata, F., Kumagai, T. and Ohno, T. (1991). Isolation of mutants of Arabidopsis thaliana in which accumulation of Tobacco mosaic virus coat protein is reduced to low levéis. Mol. Gen. Genet. 230, 33-38.
• Kreps, J.A., Yajun, W., Chang, H.-S., Zhu, T., Wang, X. and Harper, J. F.
(2002). Transcriptome changes for Arabidopsis ¡n response to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiol. 130, 2129-2141.
• Lartey, R., Ghoshroy, S. and Citovsky, V. (1998). Identification of an Arabidopsis thaliana mutation {vsm1) tha restricts systemic movement of tobamoviruses. Mol. Plant-Microbe Interact. 11, 706-709.
• Lellis, A.D., Kasschau, K.D., Whitham, S.A. and Carrington, J. C. (2002). Loss- of-suscept¡bility mutants of Arabidopsis thaliana reveal an essential role for elF(iso)4E during potyvirus infection. Curr. Biol. 12, 1046-1051.
• Maule, AJ. , Leh, V. and Lederer, C. (2002). The dialogue between viruses and hosts in compatible interactions. Curr. Opin. Plant Biol. 5, 279-284. • Mayda, E., Marqués, C, Conejero, V., and Vera, P. (2000). Expression of a pathogen-induced gene can be mimicked by auxin insensitivity. Mol. Plant Microbe Internet 13, 23-31.
• Murphy, J. F., Rhoads, R.E., Hunt, A.G. and Shaw, J. G. (1990). The VPg of tobáceo etch virus RNA ¡s the 49-kDa proteinase or the N-terminal 24-kDa part of the proteinase. Virology 178, 285-288.
• Nicaise, V., German-Retana, S., Sanjuan, R., Dubrana, M. P., Mazier, M., Maisonneuve, B., Candrese, T., Garanta, C. and LeGaII, O. (2003). The eukaryotic translation initiation factor 4E controls lettuce susceptibility to the potyvirus Lettuce mosaic virus. Plant Physiol. 132, 1272-1282.
• Ohshima, K., Taniyama, T., Yamanaka, T., Ishikawa, M. and Naito, S. (1998). Isolation of a mutant of Arabidopsis thaliana carrying two simultaneous mutations affecting Tobacco mosaic virus multiplication within a single cell. Virology 243, 472-481.
• Revers, F., Le GaII, O., Candresse, T. and Maule, AJ. (1999). New advances in understanding the molecular biology of plant/potyvirus interactions. Mol. Plant Microbe Interact. 12, 367-376.
• Ritzenthaler, C. (2005). Resistance to plant viruses: oíd issue, news answers? Curr. Opin. Biotechnol. 16, 118-122.
• Robaglia, C. and Garanta, C. (2006). Translation initiation factors: a weak link in plant RNA virus ¡nfection. Trends Plant Sci. 11, 40-45.
• Ruffel, S., Dussault, M. H., Palloix, A., Moury, B., Bendahmane, A., Robaglia, C. and Garanta, C. (2002). A natural recessive resistance gene against Potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E (elF4E). Plant J. 32, 1067-1075.
• Sanford, J. C. and Johnston, SA (1985). The concept of parasite-derived resistance: driving resistance genes from the parasites own genome. J. Theor. Biol. 115, 395-405. • Shen, K.A., Meyers, B.C., Islam-Faridi, M.N., Chin, D.B., Stelly, D.M. and Michelmore, R.W. (1998). Resistance gene candidates identified using PCR wiíh degenerate primers map to resistance genes clusters in lettuce. Mol. Plant Microbe Internet 11, 815-823.
• Simón, L., Plante, D., Wittmann, S., Daigneault, N., Fortín, M. G. and Laliberté,
J. -F. (2000). Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity. J. Virol. 74, 7730- 7737.
• Soriano, J. M., Vilanova, S., Romero, C, Yacer, G. and Badenes, M. L. (2005). Characterization and mapping of NBS-LRR resistance gene analogs in apricot
(Prunus armeniaca L.) Theor. Appl. Genet. 110, 980-989.
• Stange, C. (2006). Plant-virus interactions during the infective process. Cien. Inv. Agr. 33, 1-18.
• Tsujimoto, Y., Numaga, T., Ohshima, K.,Yano, M., Ohsawa, R., Goto, D., Naito, S. and Ishikawa, M. (2003). Arabidopsis tobamovirus multiplication (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interaets with TOM1. EMBO J. 22, 335-343.
• Vanee, V. and Vaucheret, H. (2001). RNA silencing in plants-defense and counterdefense. Science 292, 2277-2280.
• Whitham, S., Dinesh-Kumar, S. P., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B.
(1994). The product of the tobáceo mosaic virus resistance gene N: similarity to TOLL and the lnterleukin-1 receptor. Ce// 78, 1101-1115.
• Whitham, S., McCormick, S. and Baker, B. (1996). The N gene of tobáceo confers resistance to tobáceo mosaic virus ¡n transgenic tomato. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 8776-8781.
• Whitham, S., Yamamoto, M. and Carrington, J. (1999). Selectable viruses and altered susceptibility mutants in Arabidopsis thaliana. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 772-777. • Wittmann, S., Chatel, H., Fortín, M.G. and Laliberté, J. F. (1997). Interaction of the viral protein genome linked of turnip mosaic potyvirus with the translational eukaryotic initiation factor (¡so) 4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two- hybrid system. Virology 234, 84-92.
• Yamanaka, T., Imai, T., Satoh, R., Kawashima, A., Takahashi, M., Tomita, K.,
Kubota, K., Meshi, T., Naito, S. and Ishikawa, M. (2002). Complete ¡nhibition of tobamovirus multiplication by simultaneous mutations in two homologous host genes. J. Virol. 76, 2491-2497.
• Yamanaka, T., Ohta, T., Takahashi, M., Meshi, T., Schmidt, R., Dean, C, Naito, S. and Ishikawa, M. (2000). TOM1 , an Arabidopsis gene required for efficient multiplication of a tobamovirus, encodes a putative transmembrane protein. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 10107-10112.
• Yoshii, M., Nishikiori, M., Tomita, K., Yoshioka, N., Kozuka, R., Naito, S., Ishikawa, M. (2004). The Arabidopsis cucumovirus multiplication 1 and 2 loci encode translation initiation factors 4E and 4G. J. Virol. 78, 6102.
• Yoshii, M., Yoshioka, N., Ishikawa, M., and Naito, S. (1998a). Isolation of an Arabidopsis thaliana mutant ¡n which accumulation of Cucumber mosaic virus coat protein is delayed. Plant J. 13, 211-219.
• Yoshii, M., Yoshioka, N., Ishikawa, M. and Naito, S. (1998b). Isolation of an Arabidopsis thaliana mutant in which the multiplication of both Cucumber mosaic virus and Turnip crinkle virus is affected. J. Virol. 72, 8731-8737.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del gen AtDBPI en especies vegetales como regulador de Ia respuesta de las plantas frente a Ia infección por potyvirus.
2. Uso del gen AtDBPI según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque dicha regulación consiste en conferir resistencia o un aumento de resistencia a Ia infección por potyvirus comparada con las plantas de tipo salvaje.
3. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque Ia resistencia o mayor resistencia a Ia infección por potyvirus se produce por pérdida de función del gen AtDBPI .
4. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque Ia pérdida de función es por inhibición de su expresión.
5. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque Ia inhibición de su expresión es producida por Ia mutación 8.1.
6. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1-5, caracterizado por producir una menor acumulación de elF(iso)4e.
7. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el potyvirus es Plum Pox Virus (PPV).
8. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el potyvirus es Turnip Mosaic Virus (TuMV).
9. Uso del gen AtDBPI según las reivindicaciones 1 -8, para Ia obtención de plantas trasgénicas resistentes o que presenten mayor resistencia a Ia infección por potyvirus.
10. Plantas transgénicas resistentes o que presenten mayor resistencia a Ia infección por potyvirus obtenidas según reivindicación 9 caracterizadas por su pérdida de función del gen AtDBPI .
11. Planta modificada genéticamente según reivindicación 10 caracterizada porque Ia pérdida de función del gen AtDBPI es producida por Ia mutación 8.1.
PCT/ES2008/000595 2007-09-21 2008-09-19 Manipulación en la función de atdbp1 para generar resistencia frente a potyvirus Ceased WO2009037369A1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08832492A EP2208788A4 (en) 2007-09-21 2008-09-19 MANIPULATION OF THE FUNCTION OF ATDBP1 FOR GENERATING POTYVIRUS RESISTANCE
US12/679,360 US20100242133A1 (en) 2007-09-21 2008-09-19 MANIPULATION OF THE FUNCTION OF AtDBP1 IN ORDER TO GENERATE POTYVIRUS RESISTANCE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200702498 2007-09-21
ES200702498A ES2316298B1 (es) 2007-09-21 2007-09-21 Manipulacion en la funcion de atdbp1 para generar resistencia frente a potyvirus.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009037369A1 true WO2009037369A1 (es) 2009-03-26

Family

ID=40434721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2008/000595 Ceased WO2009037369A1 (es) 2007-09-21 2008-09-19 Manipulación en la función de atdbp1 para generar resistencia frente a potyvirus

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100242133A1 (es)
EP (1) EP2208788A4 (es)
ES (1) ES2316298B1 (es)
WO (1) WO2009037369A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6445006B2 (ja) * 2014-06-27 2018-12-26 日本たばこ産業株式会社 ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法
JP6792625B2 (ja) 2016-08-26 2020-11-25 日本たばこ産業株式会社 ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法
CN111321155B (zh) * 2020-03-24 2022-08-02 吉林省农业科学院 在原核细胞中增殖功能性马铃薯y病毒的方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994016097A1 (en) 1993-01-04 1994-07-21 Liofilchem S.R.L. Antibiotic assay and kits for the use thereof
WO1995004825A1 (en) 1993-08-06 1995-02-16 Unilever Plc Improvements in or relating to disease-resistance of plants
US5589612A (en) 1992-07-09 1996-12-31 Monsanto Company Virus resistant plants transformed with a PVY protease gene
US5986175A (en) 1992-07-09 1999-11-16 Monsanto Company Virus resistant plants
WO2001034823A2 (en) 1999-11-12 2001-05-17 University Of South Carolina Method for enhancing resistance in plants
ES2166361T3 (es) 1992-02-19 2002-04-16 State Of Oregon Acting By & Th Produccion de plantas resistentes a los virus a traves de la introduccion de rna viral intraducible de sentido positivo.
WO2003000898A1 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Syngenta Participations Ag Plant genes involved in defense against pathogens
WO2003066900A2 (fr) * 2002-02-08 2003-08-14 Genoplante-Valor Mutations du gene eif4e et resistance aux potyvirus
WO2004057941A2 (en) 2002-12-17 2004-07-15 Cornell Research Foundation, Inc. RECESSIVE PLANT VIRAL RESISTANCE RESULTS FROM MUTATIONS IN TRANSLATION INITIATION FACTOR eIF4E

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2166361T3 (es) 1992-02-19 2002-04-16 State Of Oregon Acting By & Th Produccion de plantas resistentes a los virus a traves de la introduccion de rna viral intraducible de sentido positivo.
US5589612A (en) 1992-07-09 1996-12-31 Monsanto Company Virus resistant plants transformed with a PVY protease gene
US5986175A (en) 1992-07-09 1999-11-16 Monsanto Company Virus resistant plants
WO1994016097A1 (en) 1993-01-04 1994-07-21 Liofilchem S.R.L. Antibiotic assay and kits for the use thereof
WO1995004825A1 (en) 1993-08-06 1995-02-16 Unilever Plc Improvements in or relating to disease-resistance of plants
WO2001034823A2 (en) 1999-11-12 2001-05-17 University Of South Carolina Method for enhancing resistance in plants
WO2003000898A1 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Syngenta Participations Ag Plant genes involved in defense against pathogens
WO2003066900A2 (fr) * 2002-02-08 2003-08-14 Genoplante-Valor Mutations du gene eif4e et resistance aux potyvirus
WO2004057941A2 (en) 2002-12-17 2004-07-15 Cornell Research Foundation, Inc. RECESSIVE PLANT VIRAL RESISTANCE RESULTS FROM MUTATIONS IN TRANSLATION INITIATION FACTOR eIF4E

Non-Patent Citations (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRIOS: "Plant Pathology, 3rd Ed", 1988, SAN DIEGO, CA, ACADEMIC PRESS, pages: 655
BALDI ET AL., THEOR. APPL. GENET., vol. 109, 2004, pages 231 - 239
BALDI, P.; PATOCCHI, A.; ZINI, E.; TOLLER, C.; VELASCO, R.; KOMJANC, M.: "Cloning and linkage mapping of resistance gene homologues in apple", THEOR. APPL. GENET., vol. 109, 2004, pages 231 - 239
BAULCOMBE, D.: "RNA silencing in plants", NATURE, vol. 431, 2004, pages 356 - 363
BAULCOMBE, D.: "RNA silencing", TRENDS BIOCHEM. SCI., vol. 30, 2005, pages 290 - 293
BAULCOMBE, NATURE, vol. 431, 2004, pages 356 - 363
BOEVNIK, P.; OPARKA, K.J.: "Virus-host interactions during movement processes", PLANT PHYSIOL., vol. 138, 2005, pages 1815 - 1821
BOEVNIK; OPARKA, PLANT PHYSIOL., vol. 138, 2005, pages 1815 - 1821
BROWNING, K.S.: "The plant translational apparatus", PLANT MOL. BIOL., vol. 32, 1996, pages 107 - 144
BROWNING, PLANT MOL. BIOL., vol. 32, 1996, pages 107 - 144
CARRASCO ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 32, 2006, pages 22875 - 22881
CARRASCO ET AL.: "A novel DNA-Binding Motif, Hallmark of a New Family of Plant Transcription Factors", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 137, 2005, pages 602 - 606
CARRASCO ET AL.: "A novel transcription factor involved in plant defense endowed with protein phosphatase activity", THE EMBO JOURNAL, vol. 22, no. 13, 2003, pages 3376 - 3384
CARRASCO J.L. ET AL.: "14-3-3 Mediates Transcriptional Regulation by Modulating Nucleocytoplasmic Shuttling of Tobacco DNA binding Protein Phosphatase-1", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 281, no. 32, 8 November 2006 (2006-11-08), pages 22875 - 22881, XP008123441 *
CARRASCO, J.L.; ANCILLO, G.; CASTELLÓ, M.J.; VERA, P.: "A novel DNA-binding motif, hallmark of a new family of plant transcription factor", PLANT PHYSIOL., vol. 137, 2005, pages 602 - 606
CARRASCO, J.L.; ANCILLO, G.; MAYDA, E.; VERA, P.: "A novel transcription factor involved in plant defense endowed with protein phosphatase activity", EMBO J., vol. 22, 2003, pages 3376 - 3384
CARRASCO, J.L.; CASTELLÓ, M.J.; VERA, P.: "14-3-3 mediates transcriptional regulation by modulating nucleocytoplasmic shuttling of tobacco DNA-binding protein-phosphatase-1", J. BIOL. CHEM., vol. 281, 2006, pages 22875 - 22881
CARRINGTON ET AL., PLANT CELL., vol. 8, 1996, pages 1669 - 1681
CARRINGTON, J.C; KASSCHAU, K.D.; MAHAJAN, S.K.; SCHAAD, M.C.: "Cell- to-cell and long distance transport of viruses in plants", PLANT CELL, vol. 8, 1996, pages 1669 - 1681
CHEN ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 138, 2005, pages 1866 - 1876
CHEN, M.-H.; TIAN, G.-W.; GAFNI, Y.; CITOVSKY, V.: "Effects of calreticulin on viral cell-to-cell movement", PLANT PHYSIOL., vol. 138, 2005, pages 1866 - 1876
DEMPSEY ET AL., CRIT. REV. PLAN SCI., vol. 18, 1999, pages 547 - 575
DEMPSEY, D.A.; SHAH, J.; KLESSIG, D.F.: "Salicylic acid and disease resistance in plants", CRIT. REV. PLANT SCI., vol. 18, 1999, pages 547 - 575
DENG ET AL., THEOR. APPL. GENET., vol. 101, 2000, pages 814 - 822
DENG, Z.; HUANG, S.; LING, P.; CHEN, C.; YU, C.; WEBER, C.A.; MOORE, G.A.; GMITTER, F.G.: "Cloning and characterization of NBS-LRR class resistance-gene candidate sequences in citrus", THEOR. APPL. GENET., vol. 101, 2000, pages 814 - 822
DI GASPERO, G.; CIPRIANI, G.: "Resistance gene analogs are candidate markers for disease-resistance genes in grape (Vitis spp.)", THEOR. APPL. GENET., vol. 106, 2002, pages 163 - 172
DI GASPERO; CIPRIANI, THEOR. APPL. GENET., vol. 106, 2002, pages 163 - 172
DIAZ-PENDON ET AL., MOL. PLANT PATHOL., vol. 5, 2004, pages 223 - 233
DÍAZ-PENDÓN, J.A.; TRUNIGER, V.; NIETO, C.; GARCIA-MAS, J.; BENDAHMANE, A.; ARANDA, M.: "Advances in understanding recessive resistance to plant virases", MOL. PLANT PATHOL., vol. 5, 2004, pages 223 - 233
DINESHKUMAR ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 92, 1995, pages 4175 - 4180
DINESHKUMAR, S.P.; WHITHAM, S.; CHOI, D.; HEHL, R.; CORR, C.; BAKER, B.: "Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: its possible role in the TMV-N-mediated signal transduction pathway", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 92, 1995, pages 4175 - 4180
DONDINI ET AL., J. HORTICUL. SCIENCE AND BIOTECH., vol. 79, 2004, pages 729 - 734
DONDINI, L.; COSTA, F.; TATARANNI, G.; TARTARINI, S.; SANSAVINI, S.: "Cloning of apricot RGAs (Resistance Gene Analogs) and development of molecular markers associated with sharka (PPV) resistance", J. HORTICUL. SCIENCE AND BIOTECH., vol. 79, 2004, pages 729 - 734
DUPRAT ET AL., PLANT J., vol. 32, 2002, pages 927 - 934
DUPRAT, A.; CARANTA, C.; REVERS, F.; MENAND, B.; BROWNING, K.S.; ROBAGLIA, C.: "The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso) 4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses", PLANT J., vol. 32, 2002, pages 927 - 934
FRASER, R.S.S.: "The genetics of resistance to plant viruses", ANNU. REV. PHYTOPATHOL., vol. 28, 1990, pages 179 - 200
HAGIWARA ET AL., EMBO J., vol. 22, 2003, pages 344 - 353
HAGIWARA, Y.; KOMODA, K.; YAMANAKA, T.; TAMAI, A.; MESHI, T; FUNADA, R.; TSUCHIYA, T.; NAITO, S.; ISHIKAWA, M.: "Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication", EMBO J., vol. 22, 2003, pages 344 - 353
HULL: "Matthews Plant Virology", 2002, ACADEMIC PRESS
ISHIKAWA ET AL., J. VIROL., vol. 67, 1991, pages 5328 - 5338
ISHIKAWA, M.; NAITO, S.; OHNO, T.: "Effects of the toml mutation of Arabidopsis thaliana on the multiplication of Tobacco mosaic virus RNA in protoplasts", J. VIROL., vol. 67, 1993, pages 5328 - 5338
ISHIKAWA, M.; OBATA, F.; KUMAGAI, T.; OHNO, T.: "Isolation of mutants of Arabidopsis thaliana in which accumulation of Tobacco mosaic virus coat protein is reduced to low levels", MOL. GEN. GENET., vol. 230, 1991, pages 33 - 38
J. VIROL., vol. 76, 2002, pages 2491 - 2497
KREPS ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 130, 2002, pages 2129 - 2141
KREPS, J.A.; YAJUN, W.; CHANG, H.-S.; ZHU, T.; WANG, X.; HARPER, J.F.: "Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress", PLANT PHYSIOL., vol. 130, 2002, pages 2129 - 2141
LARLEY ET AL., MOL. PLANT-MICROBE INTERACT., vol. 11, 1998, pages 706 - 709
LARTEY, R.; GHOSHROY, S.; CITOVSKY, V.: "Identification of an Arabidopsis thaliana mutation (vsml) that restricts systemic movement of tobamoviruses", MOL. PLANT-MICROBE INTERACT., vol. 11, 1998, pages 706 - 709
LELLIS ET AL., CURR. BIOL., vol. 12, 2002, pages 1046 - 1051
LELLIS, A.D.; KASSCHAU, K.D.; WHITHAM, S.A.; CARRINGTON, J.C.: "Loss-of-susceptibility mutants of Arabidopsis thaliana reveal an essential role for eIF(iso)4E during potyvirus infection", CURR. BIOL., vol. 12, 2002, pages 1046 - 1051
MAULE ET AL., CURR. OPIN. PLANT BIOL., vol. 5, 2002, pages 279 - 284
MAULE, A.J.; LEH, V.; LEDERER, C.: "The dialogue between viruses and hosts in compatible interactions", CURR. OPIN. PLANT BIOL., vol. 5, 2002, pages 279 - 284
MAYDA, E.; MARQUÉS, C.; CONEJERO, V.; VERA, P.: "Expression of a pathogen-induced gene can be mimicked by auxin insensitivity", MOL. PLANT MICROBE INTERACT., vol. 13, 2000, pages 23 - 31
MOL. GEN. GENET., vol. 230, 1993, pages 33 - 38
MURPHY ET AL., VIROLOGY, vol. 178, 1990, pages 285 - 288
MURPHY, J.F.; RHOADS, R.E.; HUNT, A.G.; SHAW, J.G.: "The VPg of tobacco etch virus RNA is the 49-kDa proteinase or the N-terminal 24-kDa part of the proteinase", VIROLOGY, vol. 178, 1990, pages 285 - 288
NICAISE ET AL., PLANT PHYSIOL., vol. 132, 2003, pages 1272 - 1282
NICAISE, V.; GERMAN-RETANA, S.; SANJUAN, R.; DUBRANA, M.P.; MAZIER, M.; MAISONNEUVE, B.; CANDRESE, T.; CARANTA, C.; LEGALL, O.: "The eukaryotic translation initiation factor 4E controls lettuce susceptibility to the potyvirus Lettuce mosaic virus", PLANT PHYSIOL., vol. 132, 2003, pages 1272 - 1282
OHSHIMA ET AL., VIROLOGY, vol. 243, 1998, pages 472 - 481
OHSHIMA, K.; TANIYAMA, T.; YAMANAKA, T.; ISHIKAWA, M.; NAITO, S.: "Isolation of a mutant of Arabidopsis thaliana carrying two simultaneous mutations affecting Tobacco mosaic virus multiplication within a single cell", VIROLOGY, vol. 243, 1998, pages 472 - 481
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 93, 1996, pages 8776 - 8781
REVERS, F.; LE GALL, O.; CANDRESSE, T.; MAULE, A.J.: "New advances in understanding the molecular biology of plant/potyvirus interactions", MOL. PLANT MICROBE INTERACT., vol. 12, 1999, pages 367 - 376
RITZENTHALER, C.: "Resistance to plant viruses: old issue, new answers?", CURR. OPIN. BIOTECHNOL., vol. 16, 2005, pages 118 - 122
RITZENTHALER, CURR. OPIN. BIOTECHNOL., vol. 16, 2005, pages 118 - 122
ROBAGLIA, C.; CARANTA, C.: "Translation initiation factors: a weak link in plant RNA virus infection", TRENDS PLANT SCI., vol. 11, 2006, pages 40 - 45
ROBAGLIA; CARANTA, TRENDS PLANT SCI., vol. 11, 2006, pages 40 - 45
RUFFEL ET AL., PLANT J., vol. 32, 2002, pages 1067 - 1075
RUFFEL, S.; DUSSAULT, M.H.; PALLOIX, A.; MOURY, B.; BENDAHMANE, A.; ROBAGLIA, C.; CARANTA, C.: "A natural recessive resistance gene against Potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E)", PLANT J., vol. 32, 2002, pages 1067 - 1075
SANFORD, J.C.; JOHNSTON, S.A.: "The concept of parasite-derived resistance: driving resistance genes from the parasites own genome", J. THEOR. BIOL., vol. 115, 1985, pages 395 - 405
SANFORD; JOHNSTON, J. THEOR. BIOL., vol. 115, 1985, pages 395 - 405
See also references of EP2208788A4
SHEN ET AL., MOL. PLANT MICROBE INTERACT., vol. 11, 1998, pages 815 - 823
SHEN, K.A.; MEYERS, B.C.; ISLAM-FARIDI, M.N.; CHIN, D.B.; STELLY, D.M.; MICHELMORE, R.W.: "Resistance gene candidates identified using PCR wiih degenerate primers map to resistance genes clusters in lettuce", MOL. PLANT MICROBE INTERACT., vol. 11, 1998, pages 815 - 823
SIMON, L.; PLANTE, D.; WITTMANN, S.; DAIGNEAULT, N.; FORTIN, M.G.; LALIBERTÉ, J.-F.: "Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity", J. VIROL., vol. 74, 2000, pages 7730 - 7737
SORIANO ET AL., THEOR. APPL. GENET., vol. 110, 2005, pages 980 - 989
SORIANO, J.M.; VILANOVA, S.; ROMERO, C.; YACER, G.; BADENES, M.L.: "Characterization and mapping of NBS-LRR resistance gene analogs in apricot (Prunus armeniaca L.)", THEOR. APPL. GENET., vol. 110, 2005, pages 980 - 989
STANGE, C.: "Plant-virus interactions during the infective process", CIEN. INV. AGR., vol. 33, 2006, pages 1 - 18
STANGE, CIEN. INV. AGR., vol. 33, 2006, pages 1 - 18
TRENDS BIOCHEM. SCI., vol. 30, 2005, pages 290 - 293
TSUJIMOTO ET AL., EMBO J., vol. 22, 2003, pages 335 - 343
TSUJIMOTO, Y.; NUMAGA, T.; OHSHIMA, K.; YANO, M.; OHSAWA, R.; GOTO, D.; NAITO, S.; ISHIKAWA, M.: "Arabidopsis tobamovirus multiplication (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1", EMBO J., vol. 22, 2003, pages 335 - 343
VANCE, V.; VAUCHERET, H.: "RNA silencing in plants-defense and counterdefense", SCIENCE, vol. 292, 2001, pages 2277 - 2280
VAUCHERET, SCIENCE, vol. 292, 2001, pages 2277 - 2280
WHITHAM ET AL., CELL, vol. 78, 1994, pages 1101 - 1115
WHITHAM ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 96, 1999, pages 772 - 777
WHITHAM, S.; DINESH-KUMAR, S.P.; CHOI, D.; HEHL, R.; CORR, C.; BAKER, B.: "The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to TOLL and the Interleukin-1 receptor", CELL, vol. 78, 1994, pages 1101 - 1115
WHITHAM, S.; MCCORMICK, S.; BAKER, B.: "The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 93, 1996, pages 8776 - 8781
WHITHAM, S.; YAMAMOTO, M.; CARRINGTON, J.: "Selectable viruses and altered susceptibility mutants in Arabidopsis thaliana", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 96, 1999, pages 772 - 777
WITTMANN, S.; CHATEL, H.; FORTIN, M.G.; LALIBERTÉ, J.F.: "Interaction of the viral protein genome linked of turnip mosaic potyvirus with the translational eukaryotic initiation factor (iso) 4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybrid system", VIROLOGY, vol. 234, 1997, pages 84 - 92
YAMANAKA ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 97, 2000, pages 10107 - 10112
YAMANAKA, T.; IMAI, T.; SATOH, R.; KAWASHIMA, A.; TAKAHASHI, M.; TOMITA, K.; KUBOTA, K.; MESHI, T.; NAITO, S.; ISHIKAWA, M.: "Complete inhibition of tobamovirus multiplication by simultaneous mutations in two homologous host genes", J. VIROL., vol. 76, 2002, pages 2491 - 2497
YAMANAKA, T.; OHTA, T.; TAKAHASHI, M.; MESHI, T.; SCHMIDT, R.; DEAN, C.; NAITO, S.; ISHIKAWA, M.: "TOM1, an Arabidopsis gene required for efficient multiplication of a tobamovirus, encodes a putative transmembrane protein", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 10107 - 10112
YOSHII ET AL., J. VIROL., vol. 72, 1998, pages 8731 - 8737
YOSHII ET AL., J. VIROL., vol. 78, 2004, pages 6102
YOSHII ET AL., PLANT J., vol. 13, 1998, pages 211 - 219
YOSHII, M.; NISHIKIORI, M.; TOMITA, K.; YOSHIOKA, N.; KOZUKA, R.; NAITO, S.; ISHIKAWA, M.: "The Arabidopsis cucumovirus multiplication 1 and 2 loci encode translation initiation factors 4E and 4G", J. VIROL., vol. 78, 2004, pages 6102
YOSHII, M.; YOSHIOKA, N.; ISHIKAWA, M.; NAITO, S.: "Isolation of an Arabidopsis thaliana mutant in which accumulation of Cucumber mosaic virus coat protein is delayed", PLANT J., vol. 13, 1998, pages 211 - 219
YOSHII, M.; YOSHIOKA, N.; ISHIKAWA, M.; NAITO, S.: "Isolation of an Arabidopsis thaliana mutant in which the multiplication of both Cucumber mosaic virus and Turnip crinkle virus is affected", J. VIROL., vol. 72, 1998, pages 8731 - 8737

Also Published As

Publication number Publication date
ES2316298B1 (es) 2010-02-16
US20100242133A1 (en) 2010-09-23
EP2208788A4 (en) 2011-04-27
EP2208788A1 (en) 2010-07-21
ES2316298A1 (es) 2009-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Expression of artificial microRNAs in tomato confers efficient and stable virus resistance in a cell-autonomous manner
Igarashi et al. Apple latent spherical virus vectors for reliable and effective virus-induced gene silencing among a broad range of plants including tobacco, tomato, Arabidopsis thaliana, cucurbits, and legumes
ES2382898T3 (es) Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas
Yoshii et al. Disruption of a novel gene for a NAC‐domain protein in rice confers resistance to Rice dwarf virus
Ghag et al. Transgenic banana plants expressing a Stellaria media defensin gene (Sm-AMP-D1) demonstrate improved resistance to Fusarium oxysporum
JP2007527717A (ja) ウイルス性疾患に耐性がある接木植物及びその生成法
Cho et al. Cis-acting element (SL1) of Potato virus X controls viral movement by interacting with the NbMPB2Cb and viral proteins
CN106282225B (zh) 一种负调控植物对飞虱科昆虫的抗性的基因及其应用
Tzean et al. Engineering plant resistance to tomato yellow leaf curl Thailand virus using a phloem-specific promoter expressing hairpin RNA
US8933298B2 (en) Mutated eIF4E sequences from potato which impart resistance to potato virus Y
ES2316298B1 (es) Manipulacion en la funcion de atdbp1 para generar resistencia frente a potyvirus.
CN101092634B (zh) 一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法
Moreira et al. In planta RNAi targeting Meloidogyne incognita Minc16803 gene perturbs nematode parasitism and reduces plant susceptibility
Gao et al. NIa-Pro of Papaya ringspot virus interacts with Carica papaya eukaryotic translation initiation factor 3 subunit G (CpeIF3G)
Gupta et al. RNA silencing suppression mechanisms of Triticum mosaic virus P1: dsRNA binding property and mapping functional motifs
Pang et al. Transgenic rice plants overexpressing BBTI4 confer partial but broad-spectrum bacterial blight resistance
US9238680B2 (en) Engineering heat-stable disease resistance in plants
Zhang et al. Regulation of eukaryotic initiation factor 4E and its isoform: implications for antiviral strategy in plants
Hammond et al. Alternanthera mosaic virus-an alternative'model'potexvirus of broad relevance
WO2007100094A1 (ja) 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法
JP7440190B2 (ja) ジェミニウイルス抵抗性植物
US6956149B1 (en) Method of conveying BNYVV resistance to sugar beet plants
van Grinsven Mind the gap: Analysis of Tsw resistance against tospoviruses
KR20230001349A (ko) CaSIRF1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법
Vleeshouwers et al. In planta expression systems

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08832492

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12679360

Country of ref document: US

Ref document number: 2008832492

Country of ref document: EP