[go: up one dir, main page]

WO2009012766A1 - Verfahren und vorrichtung zum kombinierten untersuchen einer probe mit zu untersuchenden objekten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum kombinierten untersuchen einer probe mit zu untersuchenden objekten Download PDF

Info

Publication number
WO2009012766A1
WO2009012766A1 PCT/DE2008/001203 DE2008001203W WO2009012766A1 WO 2009012766 A1 WO2009012766 A1 WO 2009012766A1 DE 2008001203 W DE2008001203 W DE 2008001203W WO 2009012766 A1 WO2009012766 A1 WO 2009012766A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
measurement
sample
objects
examined
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2008/001203
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Torsten JÄHNKE
Torsten Müller
Kathryn Anne Poole
Detlef Knebel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JPK Instruments AG
Original Assignee
JPK Instruments AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JPK Instruments AG filed Critical JPK Instruments AG
Priority to US12/670,570 priority Critical patent/US8898809B2/en
Publication of WO2009012766A1 publication Critical patent/WO2009012766A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
    • G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
    • G01Q60/42—Functionalisation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y35/00—Methods or apparatus for measurement or analysis of nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q30/00—Auxiliary means serving to assist or improve the scanning probe techniques or apparatus, e.g. display or data processing devices
    • G01Q30/02—Non-SPM analysing devices, e.g. SEM [Scanning Electron Microscope], spectrometer or optical microscope
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q30/00—Auxiliary means serving to assist or improve the scanning probe techniques or apparatus, e.g. display or data processing devices
    • G01Q30/04—Display or data processing devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the combined examination of a sample with objects to be examined, in particular a sample with biological objects.
  • Scanning probe microscopy is a technique in which a probe scans a test sample to be examined and, for example, records a topography of the test sample.
  • a relative movement takes place between the measuring probe and the measuring sample, which is achieved by moving at least the measuring probe or at least the measuring sample.
  • the relative movement is carried out as a lateral movement.
  • a relative movement in the vertical direction can take place.
  • Scanning Probe Microscopy is Scanning Force Microscopy (SFM).
  • SFM Scanning Force Microscopy
  • the probe is formed in a design of a cantilever, which carries a fine measuring tip.
  • the SFM technique includes AFM (Atomic Force Microscopy).
  • An SPM measurement can be performed as a slow, imaging, label-free procedure.
  • a measuring beam suspended on one side there is a suitable measuring tip, for example a ligand-coated particle.
  • Measuring beam and measuring tip form a measuring probe, which is also called cantilever.
  • a relative movement is carried out between the measuring probe and a sample to be examined, which are, for example, cells having a receptor cut corresponding to the ligand.
  • Molecular interactions between sample (receptors) and measuring tip (ligands) can lead to a deflection of the measuring probe, which can be documented in particular in a bending of the measuring bar.
  • the SPM technique finds application both in the study of molecular interactions between isolated proteins and in the study of, for example, receptor-ligand interactions on cell-line, cell-particle or cell-substrate samples.
  • mechanical characteristics such as viscoelasticity, adhesion strength and surface topology are typically obtained.
  • automation of the SPM technique as disclosed in the documents DE 10 2004 048971 and WO 2006/040025. These describe an automated scanning microscopy measuring and evaluation device. If a lateral relative movement of the probe to the sample is performed by probe microscopy of a sample, a surface image with the corresponding mechanical-elastic properties of the sample can be detected.
  • the disadvantage is that for imaging using an AFM microscope depending on the local resolution of the measurement for a cell about 10 min to 1 h are needed. Thus, the AFM technology clear limits for the use of industrial drug screening set.
  • multi-cantilevers see DE 10 2007 023 435.
  • the areal imaging property of the AFM technique is dispensed with and the sample is sampled only occasionally, so that local interaction measurements are carried out.
  • this measurement principle is referred to as single cell force spectroscopy (SCFS), and the mechanical properties that can be detected by AFM include, for example, elasticity, such as the elasticity of a cell, and force measurement on cell lines. Cell or cell-substrate contacts With a suitable choice of probe design, the sample can also be electrically examined.
  • the object of the invention is to provide a method and a device for combined examination of a sample with objects to be examined, in particular a sample with biological objects, with which the sample can be examined more efficiently and more accurately. In particular, more time-efficient investigations should be possible.
  • the object is achieved by a method for combined examination of a sample with objects to be examined according to independent claim 1 and a device for carrying out a combined examination of a sample with objects to be examined according to independent claim 11.
  • Advantageous embodiments of the invention are the subject of dependent subclaims ,
  • a method of combined probing a sample with objects to be examined comprising: measuring results for one or more of the objects to be examined in the sample, by the one or more examined objects by means of an imaging measurement method, probe microscopic measurement results for the one or more objects to be examined are detected by the one or more objects to be examined by means of a probe microscopic measurement method are examined, and the measurement results and the probe microscopic measurement results, optionally previous intermediate processing, be assigned to each other.
  • an apparatus for exporting a combined examination of a sample with objects to be examined, in particular a sample with biological objects, with an imaging measuring device that is configured, measuring results for one or more of the objects to be examined acquire the sample by examining the one or more objects to be examined by means of an imaging measurement method, a probe microscopy measuring device configured to acquire probe microscopic measurement results for the one or more objects to be examined by the one or more to investigating objects are examined by means of a probe microscopic measurement method, and an evaluation device, which is coupled to the measuring device and the probe microscopic measuring device and configured according to the measurement results and the probe microscopic measurement results after optional previous intermediate processing to assign each other.
  • measurement results of an imaging measurement method on the one hand and probe microscopic measurement results from a probe microscopy measurement method for the same sample are combined with one another, whereby both the evaluation possibilities of the measurement results and the accuracy of the examination of the sample are improved.
  • the measurement results of the different examination methods are assigned to one another, so that measurement results of the imaging measurement method are related to corresponding probe microscopic measurement results and vice versa.
  • it may optionally be provided to process the measurement results initially obtained in the respective measurement method before the assignment, for example to optimize a signal-to-noise ratio or a smoothing. In this way, where appropriate, the assignment of the measurement results from the different measurement methods is facilitated.
  • the imaging measurement methods are preferably an optical imaging method in which z. B. an image is generated using an image pickup device, for. B. a camera device.
  • the image recording device can be combined in one embodiment with a light microscope.
  • a preferred embodiment of the invention provides that the imaging measurement method and the probe microscopic measurement method automated as a combined measurement of Sample be carried out.
  • the imaging measurement method and the probe-microscopic measurement method can be carried out at least partially parallel in time.
  • information about sample properties of the sample is derived from the measurement results and taken into account when carrying out the probe-microscopic measurement method.
  • An advantageous embodiment of the invention provides that position information about the position of the one or more objects to be examined in the sample is derived from the measurement results as information about sample properties and taken into account for positioning a measuring probe used in the probe-microscopic measurement method relative to the sample.
  • a preferred development of the invention can provide that information is derived from the probe-microscopic measurement results that are taken into account when carrying out the imaging measurement method. If, for example, the probe microscopic measurement method is carried out by detecting a force-distance curve, the acquisition of measurement results for the imaging measurement method can be triggered in part by triggering a measurement value acquisition for the imaging measurement method, if specified in the force-distance curve User-defined curve values can be achieved. For example, in this way the recording of a sample area of interest can be triggered by means of an image recording device if a threshold or trigger value is reached in the force-distance curve. In this way, a mutual assignment of measurement results of the two combined measuring methods takes place.
  • the triggered image data can thus be recorded, for example, in which area of the sample surface to be examined the image recording triggering measurement of the probe microscopic examination was detected.
  • the described coupling of the measurement results can also be provided for other types of probe microscopic examination, which differ from the recording of a force-distance curve. This includes, for example, the so-called "force clamp mode", in which the contact force on the object is kept constant for a selected time.
  • provision can furthermore be made for further investigation of the probe microscopic measurement method with changed observation parameters. For example, in connection with a scanning of the sample to be examined by means of the measuring probe of the probe microscopic measuring device, a distance between the sample and the measuring probe can be readjusted.
  • a development of the invention provides that the sample is arranged in the imaging and the probe microscopic measurement method in a fluidic cell.
  • a further development of the invention can provide that further probe microscopic measurement results for the one or more objects to be examined are detected by re-examining the one or more objects to be examined by means of the probe microscopic measurement method, wherein changed observation parameters are used which differ from observation parameters distinguished previously performed probe microscopic measurement method.
  • a preferred development of the invention provides that the imaging measurement method is carried out using at least one measurement technique selected from the following group of measurement techniques: electrical imaging measurement method such as Patchclamp and impedance measurement, chemical imaging method such as local pH measurement or ion-selective value measurement and optical imaging measurement method ,
  • the sonic microscopic measurement method is carried out using at least one measurement technique selected from the following group of measurement techniques: scanning probe microscopy, atomic force microscopy and light force microscopy.
  • probe microscopic and microscopic imaging examinations can be automated.
  • the combination of the measuring methods can be used both for the characterization of mechanical physical and biochemical properties and for the morphological / physiological characterization of biological samples, in particular of living cells. This improves the accuracy and depth of the investigation. The experiment will be accelerated, and personnel and training-related effort can be reduced. Especially in the field of cell-line, cell-particle and cell-substrate investigations, the method is of growing importance. Areas of application include immunology (B cell receptor investigation), cancer research (metastasis, immunology, developmental biology and infection biology to detect molecular and cellular mechanisms of action as well as drug discovery in the cellular-based screening of the pharmaceutical biotechnology industry.
  • the probe microscopic measurement is preferably carried out by means of a scanning probe microscopy form.
  • the scanning probe microscopic examination methods include, for example, the AFM measurement.
  • such a measurement consists essentially of the following steps A) to G).
  • the determining sections are briefly explained. However, individual deviations should not affect the general statement.
  • Streptavidin-biotin / ConA This is typically done 24 hours before the trial for multiple peaks simultaneously and is not time critical to the actual measurement.
  • the functionalization with ConA produces a very strong bond to a cell o- a particle that has a large number of corresponding sugars membrane-bound.
  • the sample substrate need not only be limited to cells or proteins but may also refer to polymers such as polylysine, sugars, amino acids and other components used in connection with cell biological issues.
  • the preparation time depends on the specific assignments, typically cells and proteins are applied 1 to 24 hours previously on a support.
  • the separation may be several tens of micrometers, depending on the viscoelastic properties of the target substrate, in particular.
  • Recovery time to give the probe cell a recovery phase (2 to 3min) may refer to the target cell if it is to be sampled repeatedly
  • the proposed method with imaging measurement and probe microscopic measurement can be carried out in an expedient embodiment as follows: automated cantilever adjustment, determination of the position of the biological sample on a support and the probe position, subsequent position matching between sample and probe, time coordination all relevant systems such as image-optical technology, with probe microscopy and sample holder and fluidics as well as dispensing and other handling systems, comparison of the automated selection and orientation of several objects of the sample with subsequent recording (multiplexing) at least a first optical property of the sample and automated recording at least one first mechanical property of the biological cell sample by means of SPM and correlation of the mechanical and optical property.
  • a further optical and mechanical sampling can take place.
  • Automated AFM measurement for living cells can be subdivided into three main applications: (i) Zeil-Zeil, Zeil particles, or cell / particle substrate interaction measurements to characterize molecular interactions by force spectroscopy, (ii) cantilever cell Interaction measurements and (iii) measurement of cell stiffness. All three applications may also be associated with fluidic support and include rinse procedures and drug addition. Furthermore, it can be provided that the probe holder not only contains a cantilever, but is equipped with a multi-cantilever. It can be provided that an unusable cantilever is deposited and deposited in a separate area. For the sake of clarity, the improved embodiment will be explained in more detail with reference to application (iii).
  • the proposed method and the proposed device can be used for automation of the investigation, which leads to significant advantages in the serial and the parallel processing of processes and data.
  • the approximate location of sample cells is determined in a first step with a smaller lens that offers a larger image detail, then in a second step switched to a larger lens and determined at a larger binning of the camera, the location of the individual sample cells.
  • a fourth step a first state analysis of the cell is evaluated and the x, y position is calculated for a sampling. This determination of the position and the initial state is carried out for several cells. If a considered cell proves to be unsuitable for the first optical evaluation, the process begins with a new cell. If there are no or not enough cells in the neglected camera image section, the sample can be moved in the x, y plane.
  • the cell requires a recovery time. It is therefore proposed to sample the previously determined target cells one after the other in this time range (multiplexing). Ideally, the recovery time is in minutes. range greater than the time required for force measurement and optical imaging on multiple single cells. This can be achieved a very high time savings. In addition, this can reduce the experimental load on the cells.
  • an optical image acquisition is coupled with the passing of characteristic points of the force-distance curve.
  • characteristic points When passing through a schematic force-distance curve (see Fig. 2 below) occur characteristic points.
  • the recording of optical images in position (see reference numerals 30 and 36 in Fig. 2) is very simple and manually executed.
  • it is possible to previously agree on a specific optical image sequence also with variation of the z-focus by moving the objective - z-stack) at selected characteristic points, wherein the concrete force-distance values from sample to sample can vary individually as well as couple the sequence of images with the achievement of uniform fixed distances and or forces. Reaching the characteristic points sends itself a trigger triggers an optical image acquisition.
  • a decision tree is run through both from the imaging measurement and from the probe microscopic measurement, that is, it is decided as a function of the measurement result on the optional progress of the investigation. If, for example, an expected value of the SPM measurement, for example the number of breaks, is not reached after passing through a first examination, then the SPM measurement is carried out with changed parameters, for example force, contact time or speed. Alternatively it can be provided that, after the SPM measurement and the optical images, a data evaluation results that, for example, an expected value from the optical image data was not fulfilled. This generally refers to image data as used for optical characterization of microparticles and cells, for example intensity, intensity distribution and / or intensity ratios in different which fluoresces. Then the SPM measurement is done again.
  • a parameter is changed, for example, the contact force or the contact time.
  • An immediate image analysis can then be used to determine which SPM parameters caused what effect on the sample. This type of measurement can be advantageously used, for example, in the combined examination of the cell response to mechanical stimulation.
  • a time coordination of the movement of the cantilever, supporting devices such as dispensing, the sample holder, the microscope and objectives on the one hand and the optical image acquisition (for example by means of camera) on the other hand is an important aspect in one embodiment. It allows a satisfactory assignment of optical recording, SPM measurement, drug addition and physiological effect.
  • the following parameters are detected as a result of an automated measurement process.
  • repetition rate of the individual measurements Concentration series associated with intake LD 50; positive control; negative control (for example buffer); Test whether substance effect is reversible by rinsing with rinsing buffer; Test conditions - for example incubation time, incubation temperature; Carrying out the measurements of several cells; with several active ingredients ⁇ compounds); and statements about the local spatial distribution of cells with their individual properties for finding subpopulation and more uniform cell clusters.
  • a sample holder for example for receiving cells, has an array-like substructuring.
  • an otherwise rather random distribution of the cells from the sample or particles for the measuring probe is canceled and transferred into an orderly storage.
  • the sample receptacle may have a row and column arrangement of pores having a diameter smaller than the dimension of the single sample.
  • the array-like positioning of the objects can alternatively be done by means of micro-spotting the objects with a dispenser.
  • This method is particularly attractive if the topographical image is occupied by an array-like matrix of substances which promote the attachment of micro-objects, in particular cells (for example polylysine, fibronectin) or inhibit them (for example polyHEMA).
  • a matrix is produced by default by means of spotting or contact printing (for example nano- or micro-imprinting).
  • Another form of array arrangement may also be made by geometric solid shapes, as shown by NUNC with the LiveCellArray (www.nuncbrand.com).
  • At least one position marker for example a 2-dot mark, must be present on the substrate carrier.
  • the measuring chambers must be adapted to the requirements.
  • the control and regulation of the humidity is necessary.
  • an air conditioning box is proposed around the SPM measuring and observation unit, which at the same time is vibration-damping. For a uniform temperature and gas distribution, a circulation process is helpful. In order to avoid vibrations during the SPM measurement, the vibration-inducing control is switched off during the actual measurement if necessary.
  • a fluid supply / discharge at the measuring chamber can be provided to form a fluid supply / discharge at the measuring chamber.
  • a spatially and mechanically independent thereof and coming from the direction of the Cantileverhalters fluid connection can be provided. This can be achieved by a feed line fitted in the holder or else by a dispensing or micropipette unit mounted mechanically independently of the cantilever holder.
  • This second supply allows a fast, volume-reduced supply of active substances for the measurement, in particular in the case of separately installed measuring chambers. It can be provided that the above-mentioned properties of the measuring space not only apply to a solitary measuring chamber, but also a chamber composite is formed. In one embodiment, it is proposed by way of example that the intermediate walls of the chambers have flatter intermediate walls than the outer walls.
  • the separate measuring chambers can be filled separately in a fluidic manner, but if the level exceeds the height of the intermediate walls, these are located in a so-called fluidic continuum. In this way, the measuring probe can also be moved from one measuring chamber to the next, without resulting in a pronounced mechanical stress, especially of the measuring probe. It is also possible in an embodiment of these corresponding measuring chambers that not all the units of the multichamber communicate with each other fluidically. Furthermore, a spatial separation of particles for the measuring probe and for AFM sampling is proposed. The advantage is that a prior interaction of both types is prevented and an incubation with an active ingredient does not necessarily act on both types as well as facilitated optical object recognition, for example during the loading phase.
  • an automatic adjustment of the position of the laser beam on the cantilever and its imaging on the detector can be carried out by changing the mirror position (see below Fig. 1, step 8). It can be provided here, image-based execution of the bearing detection of the laser.
  • the brightness distribution is read out via an objective-side camera and analyzed in rows or columns, and adjusting knobs are adjusted by means of adjusting elements until the determined distribution coincides with an expected value range.
  • a lens of lesser magnification can be used. Then the system automatically switches to the work magnification and executes the fine-tuning.
  • the data already obtained are used for laser alignment and realized via motorized actuators.
  • test procedure can be used to perform regular optical control of the integrity of the cantilever, as breaking off one arm of the cantilever significantly alters the spring constant, dramatically affecting the conclusions from the measurements.
  • breaking off one arm of the cantilever significantly alters the spring constant, dramatically affecting the conclusions from the measurements.
  • a particular advantage in the adjustment could be achieved if the cantilever already has a window made of thinner material or otherwise coating or structuring, the clear Contrast is enhancing, so that the image-based adjustment can be carried out all the safer.
  • the examined objects are still in a vital state after the sampling. Especially when there is an uneven distribution of objects with particular striking features (subpopulations), it is necessary to isolate them. A common chemical detachment of all objects of a chamber ruled out for it. Therefore, alternative object isolation methods are proposed, such as laser cutting (cut and move), micropipette removal or working with a dielectric or magnetic tweezers.
  • fluidics not only describes possible hoses and fittings, but also refers to pumps, valves, injectors, mixers, and dispensers needed for experimental design.
  • FIG. 1 is a flowchart for a method for combined testing of a
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a force-distance curve with characteristic measuring points
  • FIG. 3 a shows a schematic representation of an arrangement of measuring chambers with different compartments for a sample, a measuring probe and a measuring probe deposit in plan view
  • Fig. 3b is a schematic representation of an arrangement with a multi-cantilever and an array formation with corresponding geometry
  • Fig. 4a to 4d is a schematic representation for describing a probe transfer with tuned fluid change
  • Figures 5a to 5c are flowcharts for describing a loop for automated meter setting.
  • FIG. 1 shows a flow chart for a method for combined examination of a sample using an imaging measurement method and a scanning probe microscopic measurement method
  • step 1 There is a separate preparation of the samples (step 1) and the probe (s) (step 2), which may also include a first functionalization.
  • the measuring instrument 3 with a data processing and analysis unit 4 additionally optionally connected to a separate unit for data updating / storage step (4a) are put into operation.
  • the measuring probe / cantilever (step 2) and the sample are then installed in the measuring instrument 3.
  • the measuring probe, sample and their specific holders form a separate sample chamber 6, which is equipped with fluidics (step 7).
  • the sample space 6 is filled via in step 4 by means of the fluidic device 7.
  • an automatic adjustment of the position of the laser beam on the cantilever and its imaging on the detector is achieved by changing the mirror position via, for example, electromechanical actuators.
  • the x, y, z position of the cantilever is determined with the aid of a reference run and the object recognition.
  • the calibration of the cantilever 2 is performed.
  • the spatial position determination of the cantilever and the sample substrate and their synchronization to each other is performed.
  • the position determination cantilever sample substrate can also alternatively at a target sample or a probe sample (particles for the probe) are performed. In this case, a fine adjustment of the x, y, z position of the target sample. Particularly by autofocus procedure, the optical interface is reliably determined in transparent carriers.
  • the sample position is adjusted with the cantilever position. It is also taken into account that the optimum position of a probe-bearing cantilever differs from that of a probe-free one.
  • the measuring probe For the actual force measurement, the measuring probe is moved to a waiting position (step 11). Subsequently, the selection of suitable target cells takes place by means of an automated image object recognition (step 12) and recording of a first image (data record) (step 13). In addition, x, y coordinates (step 14) for the positioning of the measuring probe (position from step 11) are output from the image, and these are guided to the derived respective position.
  • the image recognition can be carried out by a similar method as described in FIG. 5a or to introduced algorithms of object and cell recognition. This can be achieved both by the standard transmitted-light device and contrasting methods as well as by fluorescence microscopy.
  • the detection itself can be designed in two stages: (i) detection of potential target cells by a coarse intensity analysis - in this case the x, y, z positions of these objects are already stored. If no objects are in the field of vision, it will be Feedback to the process unit of the sample carrier moved in the x, y direction, and (ii) an image-based characterization and selection of the target cells connected.
  • step 15 After approaching the measuring probe to the measuring sample target cell (step 15), the scanning probe microscopic examination is carried out in step 16. Following the SPM examination with the results (step 17), a second image (record) 18 is taken.
  • the information from the two sets of images can be processed equally and combined with the force measurement and evaluated.
  • the experiment can be repeated under identical or changed parameters.
  • the recording of a second image data set can also take place during the sampling and, depending on the result, directly influence the AFM setting parameters.
  • each of the individual cells may vary a variation of setting parameters of force microscopy such as contact time, contact force, travel speed and loading rate (step 20) or to change the focus setting. All parameters can also be modulated temporally and or locally.
  • the measured value recording can now again be carried out for several individual cells.
  • the sample is provided with an active substance and the measurement is carried out repeatedly.
  • it may be necessary to run the measurement at staggered times.
  • it may also be advantageous to vary a variation of force microscopy setting parameters such as contact time, pressure, loading rate for each of the individual cells.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of a force-distance curve with characteristic measuring points.
  • the deflection of the cantilever is proportional to the force acting vertically on the cantilever or the probe.
  • the distance is the distance between the sample and the cantilever tip - also known as a probe.
  • the solid arrows symbolize the approaching motion attraction, while the dotted lines describe the wayward movement - retraction of the cantilever from the sample.
  • the cantilever is not a completely rigid beam, but may be both concave or convex bend during movement on and from the sample, while the actual tip / probe is still in contact with the sample.
  • the measuring point 30 describes the approach of the cantilever tip to the sample from a greater distance. At the end of the approach, the tip abruptly jumps to the sample surface (measurement point 31) due to attractive forces. Further approximation of the cantilever with the probe results in further increasing the repulsive forces (see measuring point 32) when the tip is in very close contact with the sample surface.
  • measuring point 32 stands for the closest approach between tip and sample. The cantilever then moves away from the closest contact while the tip is still in contact with the sample (see measuring point 33). In the end point, a maximum deflection of the cantilever is given.
  • a cell to be examined is stained with a dye which is accumulated inside the cell in vesicles. Due to the normal pH in the vesicles, the intensity of the dye is very low in a filter range considered. The observation is made by a suitable inverted microscope by means of a CCD camera. From an interesting Bess Kunststoff, in which the cell is, an average pixel intensity is determined. Activating the cell due to mechanical stress, for example by means of a cantilever, results in a change in the pH of the vesicles and thus in an increase in dye intensity. If the cantilever is suitably coated, for example with fibronectin, it is possible to measure the level of interaction with a receptor, for example integrin, on activated cells by means of force-value measurement (FIG. 2, measuring points 33 to 36).
  • the cantilever is positioned over the cell by probe microscopy and begins to approach the cell surface at preset values (see area 30 in Figure 2) at a rate vi (constant displacement, in the range of zero).
  • a first camera image first image data set
  • a selected camera setting for example, binning, exposure time
  • the approach is stopped or significantly slowed down.
  • the intensity is determined and stored in corresponding cantilever properties such as the degree of deflection as a measure of the force and the current z-position. If the determined intensity is below a previously set expected value (negative control), the approach is continued.
  • the deflection of the cantilever there is an increase in the deflection of the cantilever.
  • more camera images are regularly taken with camera settings equal to or different from the settings used for the first camera shot, and the movement of the cantilever is typically stopped or significantly slowed between them.
  • the intensity is continuously determined (within the total time for image acquisition and evaluation) and stored to the corresponding cantilever properties and time.
  • This method is carried out up to the degree of deflection of the cantilever in which the intensity of the region of interest is for the first time above a predetermined expectation value (positive control). Only then does the transition into the phase take place with the measuring points 33,..., 36.
  • This has the advantage that both the activation can be triggered and documented at the cell, and the force-displacement curve corresponding thereto can be recorded. This reduces the number of measurements required.
  • FIG. 3 a shows a schematic representation of an arrangement of measuring chambers with different compartments for a sample, a measuring probe and a measuring probe deposit in plan view.
  • FIG. 3b shows a schematic representation of an arrangement with a multi-cantilever and an array formation with a corresponding geometry.
  • a measuring chamber 42 In a measuring chamber 42 are at a defined distance from each other pores 43 and thus form an array.
  • the measuring chamber 42 is fluidly connected so that a suction pressure can be induced via the pores via a combination of valves and pumps 46.
  • the addition of particles 41 sucks the particles on free pore sites.
  • particles 45 arranged like an array are formed.
  • a placement can also be produced via an overpressure.
  • the arrangement can be cleaned so.
  • excess particles 44 are optionally deposited on interfaces. These can then be flushed away, while the placed objects 45 remain locally stable.
  • the fluidic contact is designed so that a line or column-wise occupancy is possible.
  • FIG. 3b an AFM measuring probe is shown, which consists of base body 47 and cantilever 48 with an additionally applied piezo actuator 49.
  • the cantilever spacing 50 should be exactly the same as the corresponding array spacing.
  • the individual bending bars of the multi-cantilever can also be individually controlled and readable.
  • FIG. 4a to 4d show a schematic representation for the description of a probe transfer with tuned fluid change and From Fig. 4a shows that a measuring chamber 50 is divided into two sections 51, 52, which are separated by an intermediate wall 53.
  • Each of the sections 51, 52 has in the illustrated embodiment, a fluid supply 54, 54 a, which can be operated independently of each other and both sucks and pumps.
  • a cantilever holder 55 with cantilever and measuring probe 56 there is another fluidic feed 57, which can act, for example, as an integrated micropipette or as a dispensing unit.
  • Both portions 51, 52 are filled to a liquid level 58, wherein in the solution I 59 particles 60 and in the solution 61 with 62 objects to the solution I 59 may be the same or different composition.
  • an SPM measurement of the measuring probe takes place on a particle 60.
  • an active substance is rinsed in via 57 (solution 63) and the measurement is repeated.
  • portion 51 is rinsed above 54, so that substantially identical fluid is contained in 51 and 52.
  • a flooding of the measuring chamber 50 over the height of the intermediate wall 53 also takes place up to a liquid level 64 by means of the feed line 54.
  • a flooding of the measuring chamber 50 over the height of the intermediate wall 53 also takes place up to a liquid level 64 by means of the feed line 54.
  • the cantilever is positioned over the second portion 52 (arrow b).
  • Fig. 4d is a lowering of the liquid level 64 to the original level 56 via the Fluidikport 54 or 54a, accompanied by a lowering of the Cantileverhalters with the probe to a working position in the vicinity of the sample particles.
  • an exchange of the liquid takes place, so that individual solutions are again present in the two subregions 51, 52 and the sampling of the particles 62 is carried out.
  • Figs. 5a to 5c show flowcharts for describing a loop for automated measurement device adjustment.
  • FIG. 5a starts after step 8 in FIG.
  • the aim is to first map the cantilever tip itself in the microscope camera image and to perform a position adjustment. It can be assumed that the location of the Cantiliverspitze is approximately known. Depending on the lens selected, however, the tip may be outside the camera's field of view. of lying.
  • a centering cross is displayed in the center of the camera. The goal is to align the cantilever tip with the center of the cross.
  • at least one camera image is recorded, and the intensity signals are recorded in rows and columns. The appropriate pixel size of the rows or columns must be tested in advance, but should be in the range of half of the cantilever width. From the intensity pattern, the position of the cantilever tip can be determined.
  • an appropriate direction correction is carried out via servomotors and the intensity distribution is determined again. In this way, the position in the x, y plane can be matched with the expected value.
  • a further contour analysis is then carried out by means of an intensity analysis. Switching to another type of illumination (not shown here) can help here. In this way it is possible to match the position of the cantilever tip in x, y, z direction with the camera image.
  • the bearing detection of the detection laser is also performed image-based.
  • the brightness distribution is read out via an objective-side camera and analyzed in rows or columns, as already described in detail in FIG. 5a.
  • the expected intensity patterns differ.
  • the adjusting elements the adjusting knobs are motorized changed until the determined distribution coincides with an expected value range.
  • a lens of lower magnification can be used, then the system automatically pivots to the working magnification and performs the fine tuning.
  • the laser position is initially optimized according to the sum signal by means of motorized actuators.
  • the vertical and lateral deflection are optimized according to an expected range. The values obtained here are compared with existing quality values, if necessary the calibration is repeated, logged and, if necessary, the user is provided with tips for optimization and troubleshooting.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten, bei dem Messergebnisse für ein oder mehrere der zu untersuchenden Objekte in der Probe erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines bildgebenden Messverfahrens untersucht werden, sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines sondenmikroskopischen Messverfahrens untersucht werden, und die Messergebnisse und die sondenmikroskopischen Messergebnisse, nach wahlweiser vorheriger Zwischenverarbeitung, einander zugeordnet werden. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Ausführen einer kombinierten Untersuchung einer Probe mit zu untersuchenden Objekten, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten.
Hintergrund der Erfindung
Die Zellbiologie und hiervon abhängige biomedizinische und pharmakologische / biotechnologische Forschung und Produktion nehmen an Bedeutung zu. Dies ist eingebettet in die Arbeiten zur Gen- / Protein-Charakerisierung, beeinflusst durch das Human Genome Project. Hierzu gehören nun auch die Schaffung und die Analyse von siRNA-Bibliotheken (vgl. zum Beispiel Pepperkok et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2006; 7: 690-696, High-Throughput Fluo- rescence Microscopy for Systems Biology) verbunden mit Verfahren zum Hochdurchsatz mit automatisierten bildgebenden, optischen Verfahren und Dispensierung.
Für diesen automatisierten bildbasierten Hochdurchsatz zur Zellevaluierung können mehrere, bereits existierende Module definiert werden. Bisher ist ein Kernelement des Hochdurchsat- zes die automatisierte, mikroskopische Aufnahme. Weiterhin gehört hierzu die Bildanalyse mit dem entsprechenden Datenmanagment (vgl. zum Beispiel das Produkt Opera von der Firma Evotec Technologies). Zu einem weiteren Modul können verschiedene Aspekte der Fluidik-Handhabung zusammengefasst werden. Hierunter ist beispielsweise die Zugabe / das Dispensieren von weiteren Agenzien, Medienwechsel etc. zu verstehen. Für die Arbeit mit Zellen ist die Handhabung von Zellkulturgefäßen, so genannte Multi-Plates wie 96er und 384- er Wellplatten essentiell. Dies bedeutet einen automatisierten Plattenwechsel. Um die Zellen sowohl für länger dauernde Untersuchung größerer Plattenmengen möglichst vital vorzuhalten werden auch verschiedene Ausführung zu einem Klimatisierungsmodul von kommerziellen Anbietern vorgestellt. In der Zwischenzeit haben einige Anbieter automatisierte Anlagen entwickelt, um insbesondere tierische adhärente Zellen zu kultivieren und mikroskopisch zu evaluieren. Die hochkomplexen Anlagen sollen hier nicht weiter ausgeführt werden, da sie kommerziell erhältlich sind (siehe zum Beispiel Terstegge et al., Nature Methods 1, 271-272, 2004, Hamilton's new cellhost System for füll automation of embryonic stem cell cultures). Als Ergebnis der Untersuchung werden im besonderen Maße optische (überwiegend Bildbasierende) Eigenschaften der biologischen Probe zur Bewertung herangezogen, nur geringfügig Merkmale wie pH- Wertänderungen und ionenselektive Medienänderung.
Eine ursprünglich auf die Untersuchung einzelner Zellen ausgelegte Technik ist die klassische Patch-Clamp-Technik. Für das Wirkstoffscreening wurden später Automaten entwickelt, die sowohl Mess- und Spülprozeduren automatisieren als auch parallelisiert in einem veränderten planaren Aufbau betrieben werden (vgl. zum Beispiel Beschreibung für MDC PatchXpress 7000A, 16-Channel Automated Patch Clamp System, http://www.chantest.com/ fastpatch.html). Manuelles Patchen ist der Goldstandard - bei vernünftigen Protokollen gibt es nahezu keine Falsch-negativen und Falsch-positive. Beim ebenen Patchen ist die Empfindlichkeit reduziert und kann die Abweichung bei Faktor drei liegen, wenn man mehr automatisiert sogar noch mehr, zusätzlich kann besonders die Falsch-Negative Aussage erhöht sein. In der Wirkstoffsuche wird deshalb in der Vor-, Haupt-, und Endphase von Messkampagnen gezielt mit verschiedenen Patch-Techniken gearbeitet, die sich in Preis, Durchsatz, Aussagegenauigkeit unterscheiden.
Es sind automatisierte Geräte sowie automatisierte bildgebende Verfahren zum Untersuchen zellbiologischer Vorgänge bekannt, die in der pharmakologisch, medizinisch und zellbiologi- sehen Forschung und Wirkstoffuntersuchung bis hin zum Substanz-Screening eingesetzt werden. Ausgewertet werden typischerweise fluoreszenzoptische Eigenschaften wie Änderung der Fluoreszenzintensität, der Fluoreszenzverteilung oder einer Fluoreszenzverschiebung, was zum Beispiel die Folge eines Energietransports sein kann (FRET- Fluorescence resonance energy transfer). Messwerte werden sowohl mittels konfokalen als auch nicht konfokalen Techniken aufgenommen. Eine kamerabasierte Bildaufnahme ist sehr schnell. In Abhängigkeit von einer Fluoreszenzmarkierung (Label), der Empfindlichkeit der Kamera, dem Objektiv, der Auflösung und der Anregungsintensität werden typischerweise etwa 2 bis etwa 100 Zellen mit einer Zellgröße von etwa lOxlOμm2 und einer Zellhöhe von 5μm gleichzeitig bei einer Belichtung von zum Beispiel 40ms aufgenommen. Diese Schnelligkeit erlaubt im AIl- gemeinen auch eine Aufnahme von Bildern in unterschiedlichen z-Höhen (z-Stack). Zeit limitierend ist bei den optischen bildgebenden Verfahren die Bildauswertung. Neben optischen, bildgebenden Untersuchungsmethoden sind rastersondenmikroskopische Messmethoden (SPM - Scanning Probe Mikroscopy) bekannt. Die Rastersondenmikroskopie ist eine Technik, bei der eine Messsonde eine zu untersuchende Messprobe abtastet und hierbei beispielsweise eine Topographie der Messprobe aufnimmt. In diesem Zusammenhang findet eine Relativbewegung zwischen Messsonde und Messprobe statt, die dadurch erreicht wird, dass mindestens die Messsonde oder mindestens die Messprobe bewegt wird. Üblicherweise wird die Relativbewegung als laterale Bewegung ausgeführt. Zusätzlich kann auch eine Relativbewegung in vertikaler Richtung stattfinden. Eine Form der Rastersondenmikroskopie ist die Rasterkraftmikroskopie (SFM - Scanning Force Microscopy). Bei einem hierfür verwendeten Rasterkraftmikroskop wird die Messsonde in einer Bauart von einem Cantilever gebildet, welcher eine feine Messspitze trägt. Zur SFM-Technik gehört die AFM-Technik (AFM - Atomic Force Microscopy).
Eine SPM-Messung kann als langsames, bildgebendes, labelfreies Verfahren ausgeführt wer- den. An einem einseitig freihängenden Messbalken befindet sich eine geeignete Messspitze, beispielsweise ein Ligand beschichtetes Partikel. Messbalken und Messspitze bilden eine Messsonde, die auch als Cantilever bezeichnet wird. Zum Messen wird eine Relativbewegung zwischen Messsonde und einer zu untersuchenden Probe ausgeführt, bei der es sich zum Beispiel um Zellen mit zu dem Liganden korrespondierendem Rezeptorbesteck handelt. Moleku- lare Wechselwirkungen zwischen Probe (Rezeptoren) und Messspitze (Liganden) können zu einer Auslenkung der Messsonde führen, was sich insbesondere in einer Verbiegung des Messbalkens dokumentieren kann.
Die SPM-Technik findet sowohl bei der Untersuchung molekulare Wechselwirkungen zwi- sehen isolierten Proteinen als auch bei der Untersuchung von zum Beispiel Rezeptor-Ligand- Interaktionen an Zeil-Zeil-, Zeil-Partikel- oder Zell-Substratproben Anwendung. Als Ergebnis der Untersuchung werden typischerweise eine Beschreibung mechanischer Merkmale wie Viskoelastizität, Adhäsionsstärke sowie der Topologie der Oberfläche erhalten. Bekannt sind Überlegungen zur Automatisierung der SPM-Technik, wie sie in den Dokumenten DE 10 2004 048971 und WO 2006/040025 offenbart sind. Diese beschreiben eine automatisierte rastermikroskopische Mess- und Auswerteinrichtung. Erfolgt bei der sondenmikroskopischen Untersuchung einer Probe eine laterale Relativbewegung der Messsonde zur Probe kann ein Oberflächenbild mit den korrespondierenden mechanisch-elastischen Eigenschaften der Probe erfasst werden. Nachteilig ist, dass für eine Bildge- bung bei Verwendung eines AFM-Mikroskops in Abhängigkeit von der örtlichen Auflösung der Messung für eine Zelle etwa 10 min bis 1 h benötigt werden. Damit sind der AFM- Technik klare Einsatzgrenzen für das industrielle Wirkstoffscreening gesetzt. Um den Zeitfaktor zu verbessern, wurde vorgeschlagen, Multi-Cantilever einzusetzen (vgl. DE 10 2007 023 435). Alternativ wird auf die flächige bildgebende Eigenschaft der AFM-Technik verzichtet und die Probe nur punktuell beprobt, so dass lokale Interaktionsmessungen durchgeführt wer- den. Üblicherweise wird dieses Messprinzip als „Single Cell Force Spectroscopy" (SCFS, Einzelzell-Kraftmikroskopie) bezeichnet. Zu den mechanischen Eigenschaften, die mittels AFM erfasst werden können, gehören zum Beispiel die Elastizität, beispielweise die Elastizität einer Zelle, und eine Kraftmessung an Zeil-Zeil- oder Zell-Substrat-Kontakten. Bei geeigneter Wahl der Messsondenausführung kann auch die Probe elektrisch untersucht werden.
Es bestehen wesentliche Unterschiede zwischen der Messung von mechanischen Eigenschaften wie der Protein-Protein- Wechselwirkungen und Messungen an zellfreien Ansätzen und zellulären Proben. Hierzu gehören die deutlich größere Höhenausdehung von Zellen (z-Höhe) und die diskontinuierliche Verteilung der Zellen. Typischerweise bilden die Zellen auf einem Kultivierungssubstrat in vitro kein einheitliches Kontinuum. Ihr Höhenprofil selbst und die Relativlage wichtiger Zellorganellen können variieren, ebenso der Zell-Zell-Abstand und die Zellform. Deshalb ist es auch bei der Einzelzell-Kraftmikroskopie wichtig, eine gezielte Platzierung der Messspitze vorzunehmen. Eine Eigenschaft konfokaler Mikroskopie ist es, dass nur ein in der Höhe auf etwa 1 bis 2 μm begrenzter Bildausschnitt erhalten wird. Ist das zu untersuchende Objekt in seiner Höhenabmessung größer, ist es unter Umständen wichtig, mehrere Kamerabilder aus unterschiedlichen Höhen aufzunehmen und einzeln auszuwerten oder als sogenannten z-Stack für eine 3D-Darstellung zusammen zusetzten.
Weiterhin ist nicht jede Interaktions- oder Wechselwirkungsmessung bei der Einzelzell- Kraftmikroskopie erfolgreich. Dies hängt stark von der biologischen Ausgangslage ab. So wurde von einer Adhäsionshäufigkeit von < 30% bei den Kraftmessungen (LFA-I /ICAM-I an A39 Zellen) berichtet (Wojcikiewicz et al., Biol. Proced. Online 2004:6 1-9, Force and compliance measurements on living cells using atomic force microscopy). Dieser Effekt kann die Messzeit und die Anzahl der benötigten Zellen sehr erhöhen. Gleichzeitig ermöglicht aber die Einzelzell-Kraftmikroskopie (SCFS) im Gegensatz zu „Bulk adhesion assays" verschiedene Subpopulation aufzulösen und den Effekt von Wirkstoffen, zum Beispiel Inhibitoren, auf Einzelzell- bis hin zum Einzelmolekülniveau zu beobachten.
Zu beachten ist, dass eine höherauflösende optische Detektion der Zellen, beispielsweise mittels Fluoreszenz, als Substrat typischerweise Dünnglas mit einer Dicke von etwa 170μm erfordert. Hierbei ist zu beachten, dass die verringerte mechanische Stabilität des Dünnglases nicht zu Vibrationen führt, die die AFM-Messung stören können.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten zu schaffen, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten, mit denen die Probe effizienter und genauer untersucht werden kann. Insbesondere sollen auch zeiteffizientere Untersuchungen ermöglicht sein.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten nach dem unabhängigen Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung zum Ausführen einer kombinierten Untersuchung einer Probe mit zu untersuchenden Objekten nach dem unabhängigen Anspruch 11. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.
Nach einem Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten geschaffen, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten, bei dem: Messergebnisse für ein oder mehrere der zu untersuchenden Objekte in der Probe erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines bildgebenden Messverfahrens untersucht werden, sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines sondenmikroskopischen Messverfahrens untersucht werden, und die Messergebnisse und die sondenmikroskopischen Messergebnisse, nach wahlweiser vorheriger Zwischenverarbeitung, einander zugeordnet werden. Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Ausfuhren einer kombinierten Untersuchung einer Probe mit zu untersuchenden Objekten geschaffen, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten, mit einer bildgebenden Messeinrichtung, die konfigu- riert ist, Messergebnisse für ein oder mehrere der zu untersuchenden Objekte in der Probe zu erfassen, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines bildgebenden Messverfahrens untersucht werden, eine sondenmikroskopische Messeinrichtung, die konfiguriert ist, sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte zu erfassen, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines sondenmikroskopischen Messverfahrens untersucht werden, und einer Auswerteeinrichtung, die an die Messeinrichtung und an die sondenmikroskopische Messeinrichtung gekoppelt und konfiguriert ist, die Messergebnisse und die sondenmikroskopischen Messergebnisse, nach wahlweiser vorheriger Zwischenverarbeitung, einander zuzuordnen.
Erfindungsgemäß werden Messergebnisse eines bildgebenden Messverfahrens einerseits und sondenmikroskopische Messergebnisse aus einem sondenmikroskopischen Messverfahren für die gleiche Probe miteinander kombiniert, wodurch sowohl die Auswertemöglichkeiten der Messergebnisse als auch die Genauigkeit der Untersuchung der Probe verbessert sind. Die Messergebnisse der unterschiedlichen Untersuchungsmethoden werden einander zugeordnet, so dass Messergebnisse des bildgebenden Messverfahrens in Beziehung gesetzt werden zu zugehörigen sondenmikroskopischen Messergebnissen und umgekehrt. Hierbei kann es wahlweise vorgesehen sein, die zunächst in den jeweiligen Messverfahren gewonnenen Messergebnisse vor der Zuordnung zu verarbeiten, beispielsweise zur Optimierung eines Signal-Rausch-Verhältnisses oder einer Glättung. Auf diese Weise wird gegebenenfalls auch die Zuordnung der Messergebnisse aus den unterschiedlichen Messverfahren erleichtert.
Bei den bildgebenden Messverfahren handelt es sich bevorzugt um ein optisches bildgebendes Verfahren, bei dem z. B. ein Bild mithilfe einer Bildaufnahmeeinrichtung erzeugt wird, z. B. einer Kameraeinrichtung. Kombiniert werden kann die Bildaufnahmeeinrichtung in einer Ausgestaltung mit einem Lichtmikroskop.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass das bildgebende Messverfahren und das sondenmikroskopische Messverfahren automatisiert als kombinierte Messung der Probe ausgeführt werden. Das bildgebende Messverfahren und das sondenmikroskopische Messverfahren können wenigstens teilweise zeitlich parallel ausgeführt werden.
Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass aus den Messergebnissen Informationen über Probeneigenschaften der Probe abgeleitet und beim Ausführen des sondenmikroskopischen Messverfahrens berücksichtigt werden.
Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass aus den Messergebnissen als Informationen über Probeneigenschaften Lageinformationen über die Lage des einen oder der mehreren zu untersuchenden Objekte in der Probe abgeleitet und zum Positionieren einer bei dem sondenmikroskopischen Messverfahren genutzten Messsonde relativ zu der Probe berücksichtigt werden.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, dass aus den sondenmikrosko- pischen Messergebnissen Informationen abgeleitet werden, die beim Ausführen des bildgebenden Messverfahrens berücksichtigt werden. Wird beispielsweise das sondenmikroskopische Messverfahren mittels Erfassen einer Kraft-Abstands-Kurve durchgeführt, kann das Erfassen von Messergebnissen für das bildgebende Messverfahren teilweise dadurch getriggert werden, dass eine Messwerterfassung für das bildgebende Messverfahren ausgelöst wird, wenn in der Kraft-Abstands-Kurve vorgegebene, insbesondere vom Benutzer definierte Kurvenwerte erreicht werden. Beispielsweise kann auf diese Weise das Aufnehmen eines interessierenden Probenbereiches mithilfe einer Bildaufnahmeeinrichtung ausgelöst werden, wenn in der Kraft-Abstands-Kurve ein Schwell- oder Triggerwert erreicht wird. Auf diese Weise erfolgt eine gegenseitige Zuordnung von Messergebnissen der beiden miteinander kombinierten Messverfahren. In den getriggert aufgenommenen Bilddaten kann so beispielsweise festgehalten werden, in welchem Bereich der zu untersuchenden Probenoberfläche der die Bildaufnahme auslösende Messwert der sondenmikroskopischen Untersuchung erfasst wurde. Es erfolgt eine Zuordnung zwischen der Messsondenposition relativ zur untersuchenden Messprobe in der Bildaufnahme und dem gemessenen sondenmikroskopischen Messwert. Die ge- schilderte Kopplung der Messergebnisse kann auch für andere Arten der sondenmikroskopischen Untersuchung vorgesehen sein, die sich von dem Aufnehmen einer Kraft-Abstands- Kurve unterscheiden. Hierzu gehört beispielsweise die sogenannte „Force clamp mode", bei der für eine gewählte Zeit die Kontaktkraft auf das Objekt konstant gehalten wird. Als Reaktion auf die Triggerung des bildgebenden Messverfahrens durch das Erreichen eines bestimmten Messwertes bei der sondenmikroskopischen Untersuchung kann weiterhin vorgesehen sein, im Anschluss daran das sondenmikroskopische Messverfahren mit geänderten Beobachtungsparametern weiter zu untersuchen. Beispielsweise kann in Verbindung mit einem Abrastern der zu untersuchenden Probe mittels der Messsonde der sondenmikroskopischen Messeinrichtung ein Abstand zwischen Probe und Messsonde neu eingestellt werden.
Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, dass die Probe bei dem bildgebenden und dem sondenmikroskopischen Messverfahren in einer Fluidikzelle angeordnet wird.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass bei dem bildgebenden und dem sondenmikroskopischen Messverfahren als zu untersuchenden Objekte in der Probe Zellen untersucht werden.
Eine Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, dass weitere sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels des sondenmikroskopischen Messverfahrens erneut untersucht wird, wobei geänderte Beobachtungsparameter verwendet werden, die sich von Beobachtungsparametern zuvor ausgeführten sondenmikroskopischen Messverfahrens unterscheiden.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass das bildgebende Messverfahren unter Verwendung mindestens einer Messtechnik ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Messtechniken ausgeführt wird: elektrisches bildgebendes Messverfahren wie Patchclamp und Impedanzmessung, chemisches bildgebendes Verfahren wie lokale pH- Wertmessung oder ionenselektive Wertmessung und optisches bildgebendes Messverfahren.
Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass das son- denmikroskopische Messverfahren unter Verwendung mindestens einer Messtechnik ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Messtechniken ausgeführt wird: Rastersondenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und Lichtkraftmikroskopie. Die vorangehend aufgezeigten, vorteilhaften Ausgestaltungen des Verfahrens zum kombinierten Untersuchen einer Probe gelten entsprechend für mögliche Fortbildungen der Vorrichtung zum Ausführen einer kombinierten Untersuchung einer Probe. Die Vorrichtung kann dann der jeweiligen Verfahrensausgestaltung entsprechend implementiert werden.
Mit den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Techniken zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten können sondenmikroskopische und mikroskopische bildgebende Untersuchungen automatisiert werden.
Die Kombination der Messmethoden kann sowohl für die Charakterisierung von mechanisch physikalischen und biochemischen Eigenschaften als auch für die morphologisch / physiologische Charakterisierung von biologischen Proben verwendet werden, insbesondere von lebenden Zellen. Es wird so die Aussagegenauigkeit und -tiefe der Untersuchung verbessert. Das Experiment wird beschleunigt, und der personelle und der ausbildungsbezogene Auf- wand kann verringert werden. Besonders auf dem Gebiet der Zeil-Zeil-, der Zeil-Partikel- und Zell-Substrat-Untersuchungen ist die Methode von wachsender Bedeutung. Anwendungsgebiete umfassen die Immunologie (B -Zellrezeptor-Untersuchung), die Krebsforschung (Me- tastasis, Immunologie, die Entwicklungsbiologie und die Infektionsbiologie zur Aufdeckung molekularer und zellulärer Wirkmechanismen als auch die Wirkstoffsuche im zellulär basier- ten Screening der pharmazeutisch biotechnologischen Industrie.
Die sondenmikroskopische Messung wird vorzugsweise mittels einer Form der Rastersondenmikroskopie ausgeführt. Zu den rastersondenmikroskopischen Untersuchungsmethoden gehört beispielsweise die AFM-Messung. Eine solche Messung besteht in einer Ausführungs- form im Wesentlichen aus den nachfolgenden Schritten A) bis G). Für ein besseres Verständnis werden die bestimmenden Abschnitte kurz erläutert. Einzelne Abweichungen sollen aber die generelle Aussage nicht beeinträchtigen.
A) Proben und Träger -Vorbereitung - Funktionalisierung der AFM-Sonde, beispielsweise über Concavalin A (Biotin-
Streptavidin-Biotin/ConA) - Dies erfolgt typischerweise etwa 24 h vor dem Versuch für mehrere Spitze gleichzeitig und ist für die eigentliche Messung nicht zeitkritisch. Die Funktionalisierung mit ConA erzeugt eine sehr starke Bindung an eine Zelle o- der ein Partikel, die eine Vielzahl korrespondierender Zucker Membranständig aufweisen.
Zell- oder Protein-Immobilisierung auf einem Substratträger: Das Probensubstrat muss nicht nur auf Zellen oder Proteine beschränkt sein sondern kann sich auch auf Polymere wie Polylysin, Zucker, Aminosäuren und andere im Zusammenhang mit zellbiologischen Fragestellungen eingesetzten Komponenten beziehen. Die Vorbereitungszeit hängt von den konkreten Belegungen ab, typischerweise werden Zellen und Proteine 1 bis 24h vorher auf einem Träger aufgebracht.
B) Inbetriebnahme des Gesamtgerätes, welches in einer Ausführungsform mindestens ein bildgebendes System, vorzugsweise ein Mikroskop, ein sondenmikroskopisches System, ein Fluidiksystem und eine Datenverarbeitungseinheit aufweist.
C) Einbau des Cantilevers
D) Kalibrierung des Cantilevers
E) Schritte zum Ausführen der eigentlichen AFM-Messung (siehe auch - Taubenberger et al., Revealing early Steps of α2 ßi Integrin-mediated adhesion to collagen type I be using single cell force spectroscopy Molecular Biology Cell 18, 1634-1644, 2007):
Beladung der Messsonde. Dies können Zellen, Partikeln oder auch nur die behandelte oder unbehandelte Cantilever selbst sein (Zeit T = Tloading). Dies ist ein sehr variierender Schritt. Bezogen auf eine Ausführung von E.P.Wojcikiewicz et al. Biol. Proced. Online 2004:6 1-9 werden die auf den Probenträger mit dem Targetsubtrat gegeben und von dort in einer manuellen Ausführung an die AFM-Spitze gebracht:
(i) Einspülen der Sondenzellen, dies kann unmittelbar in der Nähe der Targetzellen erfolgen oder in einem separaten Targetfreien Bereich des Messraumes, (ii) Fokus- sierung der Kamera (Objektiv) auf die Zelle, Annäherung des Cantilevers an die Zelle, vorsichtige Kontaktierung für eine kurze Zeit von etwa. 1 bis 5s und einer Anhaf- tungszeit von etwa 1 bis 5 min, damit es zu einem sicheren und festen Kontakt der
Partikelbasierende Sonde mit dem Cantilever kommt, (iii) ggf. Wegspülen der überflüssigen Sondenzellen, und (iv) Positionierung der Sonde in der Nähe des Targetsubstrates Annäherung der Messsonde an das Targetsubstrat (T = Tapproach)
Kontaktierung zwischen Sonde und Substrat = Tcontact etwa 50ms bis Is (oder 5 bis
600s)
- Retraktion Tretract - Separation Tseparation. Die Separation kann mehrere 10 Mikrometer umfassen, je nach den viskoelastische Eigenschaften besonders des Targetsubstrates.
Erholungszeit, um der Sonden-Zelle eine Erholungsphase zu geben (2 bis 3min), kann sich auf die Targetzelle beziehen, wenn diese wiederholt beprobt werden soll
Zugabe eines Wirkstoffs und nachfolgende Einwirkzeit - Wiederholung des Experiments in 2 bis 5 typischerweise 2 bis 20 x je Zelle und für
10 bis 20 Zellen: mit üblichen 20 bis80 Kraftkurven insgesamt, etwa 20 sec/Zelle mit etwa 20 bis 30 min für ein Gesamtexperiment, wenn die gleiche Sonde benutzt werden kann,
Spülen und - mögliche weitere Agens-Zugabe oder
Beladung mit neuer Messsonde oder Austausch des Cantilevers bei Punkt C)
F) Reinigung
G) Datenevaluierung
Das vorgeschlagene Verfahren mit bildgebender Messung und sondenmikroskopischen Messung, insbesondere rastersondenmikroskopischer Messung, kann in einer zweckmäßigen Ausführungsform wie folgt ausgeführt werden: automatisierte Cantileverjustage, Ermittlung der Lage der biologischen Probe auf einem Träger und der Sondenposition, nachfolgender Positi- onsabgleich zwischen Probe und Messsonde, Zeitkoordination aller relevanten Systeme wie bildoptischer Technik, mit Sondenmikroskopie und Probenhalterung und Fluidik sowie Dispensier- und anderer Handhabungssysteme, Abgleich der automatisierte Auswahl und Lagebestimmung mehrerer Objekte der Probe mit nachfolgender Aufnahme (Multiplexing) min- destens einer ersten optischen Eigenschaft der Probe und automatisierten Aufnahme mindestens einer ersten mechanischen Eigenschaft der biologischen Zellprobe mittels SPM und Korrelation der mechanischen und optischen Eigenschaft. In einem weitergehenden Schritt kann nach einer Zwischenevaluierung eine weitere optische und mechanische Beprobung erfolgen. Die Automatisierung in Verbindung mit einer AFM-Messung für lebende Zellen kann in drei Hauptanwendungen unterteilt werden: (i) Zeil-Zeil, Zeil-Partikel oder Zell/Partikel- Substrat Interaktionsmessungen zur Charakterisierung von molekularen Wechselwirkungen mittels Kraftspektroskopie, (ii) Cantilever-Zell Interaktionsmessungen und (iii) Messung der Zellstei- figkeit. Alle drei Anwendungen können zudem mit fluidischer Unterstützung verbunden sein und Spülprozeduren und Wirkstoffzugabe umfassen. Weiterhin kann vorgesehen sein, dass der Sondenhalter nicht nur einen Cantilever enthält, sondern mit einem Multi-Cantilever ausgestattet ist. Hierbei kann vorgesehen sein, dass ein unbrauchbarer Cantilever abgelegt und in einem separaten Bereich deponiert wird. Der Übersichtlichkeit halber wird die verbesserte Ausführung anhand der Anwendung (iii) näher erläutert.
Das vorgeschlagenen Verfahren und die vorgeschlagenen Vorrichtung können für eine Automatisierung der Untersuchung der genutzt werden, was zu wesentlichen Vorteilen in der se- riellen und der parallelen Bearbeitung von Prozessen und Daten führt. Die Erkennung und die Auswahl von geeigneten Targetzellen erfolgt durch eine automatisierte Bild-Objekterkennung und Aufnahme eines 1. Bild(datensatzes) zu einem Zeitpunkt T=O. Dabei wird beispielsweise in einem ersten Schritt mit einem kleineren Objektiv, dass einen größeren Bildausschnitt bietet die ungefähre Lage von Probenzellen ermittelt, danach wird in einem zweiten Schritt auf ein größeres Objektiv umgeschaltet und bei einem größeren Binning der Kamera die Lage der einzelnen Probenzellen ermittelt. Danach erfolgt im dritten Schritt eine Anpassung der Kamera (Belichtungszeit, Binning) und/oder Beleuchtungsparameter (Intensität) sowie des z-Fokus auf eine optimale erste Bildaufnahme zur Bewertung der jeweiligen Probe. In einem vierten Schritt wird eine erste Zustandsanalyse der Zelle ausgewertet und die x,y-Position für eine Beprobung errechnet. Diese Ermittlung der Lage und des Ausgangszustandes wird für mehrere Zellen ausgeführt. Sollte sich eine betrachtete Zelle bei der ersten optischen Evaluierung als ungeeignet erweisen, beginnt der Prozess bei einer neuen Zelle. Sollten keine oder nicht genügend Zellen im benachteten Kamerabildausschnitt vorliegen, so kann die Probe in der x,y-Ebene verfahren werden.
Es kann vorgesehen sein, dass nach einer ersten Kraftmessung die Zelle eine Erholungszeit benötigt. Es wird deshalb vorgeschlagen, in diesem Zeitbereich nacheinander die vorher ermittelten Zielzellen zu beproben (Multiplexing). Idealerweise ist die Erholungszeit im Minu- tenbereich größer als die Zeit, die für eine Kraftmessung und optischen Bildaufnahme an mehreren Einzelzellen benötigt wird. Damit kann eine sehr hohe Zeitersparnis erzielt werden. Zusätzlich kann damit die experimentelle Belastung der Zellen verringert werden.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass nach einer ersten Beprobung mehrerer individueller Targetzellen diese mit einem Wirkstoff beladen werden. Nach einer notwendigen Inkubationszeit und einem Spülprozess werden die zuvor ursprünglich untersuchten Zellen in der entsprechenden Reihenfolge wieder angefahren und beprobt. So wird die Messwertstreuung durch Einzelzellmessung verringert.
Es kann auch vorgesehen sein, dass eine optische Bildaufnahme gekoppelt ist mit dem Passieren von charakteristischen Punkten der Kraft-Distanz-Kurve. Beim Durchlaufen einer schematisierten Kraft-Abstand-Kurve (vgl. Fig. 2 unten) treten charakteristische Punkte auf. Die Aufnahme von optischen Bildern in Stellung (vgl. Bezugszeichen 30 und 36 in Fig. 2) ist sehr einfach und auch manuell ausführbar. Bei einer automatisierten und zeitkoordinierten Untersuchung ist es möglich, sowohl vorher eine bestimmt optische Bildfolge (auch unter Variation des z-Fokus durch Bewegung des Objektives - z-Stack ) an ausgewählten charakteristischen Punkten zu vereinbaren, wobei die konkreten Kraft-Distanzwerte von Probe zu Probe individuell variieren können als auch die Bildfolge mit dem vom Erreichen einheitlicher festgeleg- ter Distanzen und oder Kräfte zu koppeln. Das Erreichen der charakteristischen Punkte sendet selbst einen Trigger löst eine optische Bildaufnahme aus.
Es kann vorgesehen sein, dass sowohl aus der bildgebenden Messung wie auch aus der sondenmikroskopischen Messung ein Entscheidungsbaum durchlaufen wird, d.h. es wird in Ab- hängigkeit vom Messergebnis über den wahlweisen Fortgang der Untersuchung entschieden. Sollte nach dem Durchlaufen einer ersten Untersuchung zum Beispiel ein Erwartungswert der SPM-Messung, zum Beispiel die Anzahl der Abrisse, nicht erreicht werden, so wird die SPM- Messung mit veränderten Parametern, beispielsweise Kraft, Kontaktzeit oder Geschwindigkeit, wieder ausgeführt. Alternativ kann vorgesehen sein, dass nach der SPM-Messung und den optischen Bildern eine Datenauswertung ergibt, dass zum Beispiel ein Erwartungswert aus den optischen Bilddaten nicht erfüllt wurde. Damit sind allgemein Bilddaten gemeint, wie sie zur optischen Charakterisierung von Mikropartikeln und Zellen herangezogen werden, zum Beispiel Intensität, Intensitätsverteilung und / oder Intensitätsverhältnisse bei verschie- denen Fluoreszenzen. Dann erfolgt die SPM-Messung noch einmal. Hierbei wird ein Parameter verändert, zum Beispiel die Auflagekraft oder die Kontaktzeit. Über eine sofortige Bildauswertung kann dann bestimmt werden, welche SPM-Parameter welchen Effekt auf die Probe hervorgerufen haben. Diese Art der Messung kann zum Beispiel bei der kombinierten Un- tersuchung der Zellantwort auf eine mechanische Stimulation vorteilhaft angewendet werden.
Eine Zeitkoordination der Bewegung des Cantilevers, unterstützender Geräte wie Dispensieren, des Probenhalters, des Mikroskops und von Objektiven einerseits sowie der optischen Bildaufnahme (zum Beispiel mittels Kamera) andererseits ist ein wichtiger Aspekt in einer Ausführung. Es ermöglicht eine befriedigende Zuordnung von optischer Aufnahme, SPM- Messung, Wirkstoffzugabe und physiologischer Wirkung.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass im Ergebnis eines automatisierten Messvorganges nachfolgende Parameter erfasst werden. Hierbei müssen nicht notwendigerweise alle Merk- male immer erfasst und ausgegeben werden: Wiederholungsrate der Einzelmessungen; Konzentrationsreihe verbunden mit der Aufnahme LD 50; positive Kontrolle; negative Kontrolle (zum Beispiel Puffer); Test, ob Substanzwirkung mittels Spülen mit Spülpuffer reversibel ist; Testbedingungen - zum Beispiel Inkubationszeit, Inkubationstemperatur; Ausführen der Messungen mehreren Zellen; mit mehreren Wirkstoffen {Compounds); und Aussagen über die lokale räumliche Verteilung von Zellen mit ihren indiviuellen Eigenschaften für das Herausfinden von Subpopulation und einheitlicheren Zellclustern.
Es kann auch vorgesehen sein, dass eine Probenaufnahme, beispielsweise zum Aufnehmen von Zellen, eine arrayartige Substrukturierung aufweist. Hierdurch wird eine sonst eher zufäl- lige Verteilung der Zellen aus der Probe oder von Partikel für die Messsonde aufgehoben und in eine geordnete Ablage überführt. So sind das Auffinden der Objekte und die automatische Beprobung erleichtert. Beispielsweise kann die Probenaufnahme eine Zeilen- und spaltenweise Anordnung von Poren mit einem Durchmesser kleiner als die Abmessung der Einzelprobe aufweisen. Durch Anlegen eines Unterdruckes werden die suspendierten Objekte auf die Po- ren gesaugt und festgehalten, wie es aus der Technik des planaren Patch-Clamps bekannt ist. Objekte außerhalb der Poren können durch eine Querströmung weggespült werden. Die Positionierung kann auch durch Überdruck erfolgen. Typischerweise werden für die Druckerzeugung Pumpen eingesetzt. Die arrayartige Positionierung der Objekte kann alternativ auch mittels Micro-Spotting der Objekte mit einem Dispensers erfolgen. Diese Methode ist besonders attraktiv, wenn die to- pografische Aufnahme mit einer arrayartigen Matrix von Substanzen belegt ist, die die AnIa- gerung von Mikrobjekten, insbesondere Zellen fördern (zum Beispiel Polylysin, Fibronektin) oder hemmen (zum Beispiel polyHEMA). Solche eine Matrix wird standardmäßig mittels Spotting oder Kontaktprinting (zum Beispiel Nano- oder Mikroimprinting) hergestellt. Eine andere Form der Arrayanordnung kann auch durch geometrische feste Formen herstellt sein, wie es von NUNC mit dem LiveCellArray (www.nuncbrand.com) gezeigt ist.
Im Anschluss an die SPM-Messung wird vorgeschlagen, die Proben für weitere Messungen weiter zu kultivieren. Damit eine Zuordnung späterer Daten für individuelle Objekte im Mikrometer-Bereich möglich ist, muss zumindest eine Lagemarkierung, zum Beispiel eine 2- Punktmarkierung, auf dem Substratträger vorhanden sein.
Darüber hinaus kann es vorgesehen sein, dass für eine automatisierte Vermessung von lebenden biologischen Proben auch die Messkammern den Erfordernissen angepasst werden müssen. Neben der Steuerung von Temperatur und CO2 ist auch die Kontrolle und Regelung der Luftfeuchte notwendig. Dafür wird eine Klimatisierungsbox um die SPM-Meß- und Beo- bachtungseinheit vorgeschlagen, die gleichzeitig vibrationsdämpfend ist. Für eine gleichmäßige Temperatur- und Gasverteilung ist ein Umwälzprozeß hilfreich. Damit keine Vibrationen während der SPM-Messung auftreten, wird während der eigentlichen Messung bei Bedarf die Vibrationsinduzierende Steuerung abgestellt.
Des weiteren kann vorgesehen sein, eine Fluidzuführung / -abführung an der Messkammer auszubilden. Auch ein räumlich und mechanisch hiervon unabhängiger und aus Richtung des Cantileverhalters kommender Fluidanschluss kann vorgesehen sein. Dies kann durch eine in den Halter eingepasste Zuleitung erreicht sein oder auch durch eine mechanisch unabhängig vom Cantileverhalter angebrachte Dispensier- oder Mikropipetteneinheit. Diese zweite Zufüh- rung gestattet, insbesondere bei getrennt aufgestellten Messkammern, eine schnelle, volumenreduzierte Versorgung mit Wirkstoffen für die Messung. Es kann vorgesehen sein, dass die oben benannten Eigenschaften des Messraumes nicht nur für eine solitäre Messkammer gelten, sondern auch ein Kammernverbund gebildet ist. In einer Ausführungsform wird beispielhaft vorgeschlagen, dass die Zwischenwände der Kammern flachere Zwischenwände haben als die Außenwände. Die getrennten Messkammern können fluidisch separat befüllt werden, übersteigt der Pegel aber die Höhe der Zwischenwände, so befinden sich diese in einem sogenannten fluidischen Kontinuum. Auf diese Weise kann die Messsonde auch von einer Messkammer zur nächsten bewegt werden, ohne dass es zu einer ausgeprägten mechanischen Belastung besonders der Messsonde kommt. Es ist in einer Ausführungsform dieser korrespondierenden Messkammern auch möglich, dass nicht alle Einhei- ten der Multikammer miteinander fluidisch kommunizieren. Weiterhin wird eine räumliche Separierung von Partikel für die Messsonde und für die AFM-Beprobung vorgeschlagen. Der Vorteil ist, dass eine vorhergehende Interaktion beider Typen unterbunden wird und eine Inkubation mit einem Wirkstoff nicht zwangsweise auf beide Typen einwirkt sowie eine erleichterte optische Objekterkennung zum Beispiel bei der Beladungsphase.
Auch kann eine automatische Justage der Lage des Laserstrahls auf dem Cantilever und seiner Abbildung auf dem Detektor mittels Veränderung an der Spiegelstellung ausgeführt werden (vgl. unten Fig. 1, Schritt 8). Es kann hierbei vorgesehen sein, die Lagererkennung des Lasers bildbasiert auszuführen. Hierbei wird die Helligkeitsverteilung über eine objektivseitige Ka- mera ausgelesen und zeilen- oder spaltenweise analysiert und über Stellelemente Justierknöpfe solange verändert, bis die ermittelte Verteilung mit einem Erwartungswert-Bereich übereinstimmt. In einem ersten Schritt der Objektfindung kann hierbei ein Objektiv geringerer Vergrößerung benutzt werden. Dann schwenkt das System automatisiert auf die Arbeitsvergrößerung um und führt die Feinabstimmung aus. Bei der Justage des Spiegels werden die schon anfallenden Daten für eine Laserausrichtung verwendet und über motorisierte Stellglieder realisiert. Die hier anfallenden Werte werden mit vorliegenden Qualitätswerten verglichen, ggf. die Eichung wiederholt, protokolliert und bei Bedarf dem Anwender Hinweise zur Optimierung und Fehlerbeseitigung angeboten. Darüber hinaus kann die Prüfprozedur benutzt werden, um eine regelmäßige optische Kontrolle der Intaktheit des Cantilevers auszuführen, da ein Abbrechen eines Armes des Cantilevers die Federkonstante deutlich verändert und damit die Schlussfolgerungen aus dem Messungen dramatisch beeinflusst. Ein besonderer Vorteil bei der Justage könnte erzielt werden, wenn der Cantilever schon ein Fenster aus dünnerem Material oder eine anderweitige Beschichtung oder Strukturierung aufweist, die deutlich Kontrast verstärkend ist, damit die Bildbasierende Justage um so sicherer ausgeführt werden kann.
Es kann des weiteren vorgesehen sein, dass alle für die Experiment relevanten Daten wie zum Beispiel Cantilevertyp, Federkonstante, SPM-Daten wie Kraft, Geschwindigkeit, Belastungsrate sowie Bilder, Zeitkontrolle und Substanzzugaben in einem nichtveränderbaren Rohdatensatz hinterlegt, der den Ansprüchen der Good Manufactering Practice (GMP) oder der Guten Laborpraxis (GLP) für eine Qualitätssicherung im pharmazeutisch biomedizinischen Bereich genügen.
Weiterhin kann vorgesehen sein, dass die untersuchten Objekte nach der Beprobung sich weiter in einem vitalen Zustand befinden. Besonders wenn es eine uneinheitliche Verteilung von Objekten mit besonderen auffallenden Eigenschaften gibt (Subpopulationen) ist es notwendig, diese zu isolieren. Eine übliche chemische Ablösung aller Objekte einer Kammer scheidet dafür aus. Es werden deshalb alternative Objektisolationsverfahren vorgeschlagen wie Herausschneiden mit einem Laser („Cut and move"), Entnahme mittels Mikropipettentechnik oder das Arbeiten mit einem dielektrischen oder magnetischen Tweezers.
Der Begriff Fluidik beschreibt nicht nur mögliche Schläuche und Ansatzstücken, sondern bezieht sich auch auf Pumpen, Ventile, Injektoren, Mischer und Dispensierer, die zur Versuchssausführung benötigt werden.
Neben der AFM- und der SPM-Technik können noch andere Methoden vorgesehen sein, mit denen molekulare Wechselwirkungen bei Partikel-Partikel- und Partikel-Substrat-Inter- aktionen (eine Zelle kann auch ein Partikel sein) oder viskoelastische Eigenschaften der Proben gemessen werden können. Dazu zählen die PFM- Technik (PFM - Photonic Force Mic- roscopy, Lichtraftmikroskopie) und die Laser-Tweezer-Technik sowie die Mikropipetten- Technik. Auch diese sondenmikroskopischen Untersuchungsmethoden können einzeln oder in beliebiger Zusammenstellung mit der bildgebenden Untersuchungsmethode kombiniert wer- den. Beschreibung bevorzuRter Ausflihrungsbeispiele der Erfindung
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausfuhrungsbeispielen unter Bezugnahme auf
Figuren einer Zeichnung näher erläutert. Hierbei zeigen: Fig. 1 ein Ablaufdiagramm für ein Verfahren zum kombinierten Untersuchen einer
Probe unter Verwendung eines bildgebenden Messverfahrens sowie eines ras- tersondenmikroskopischen Messverfahrens,
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Kraft-Abstandskurve mit charakteristischen Messpunkten, Fig. 3 a eine schematische Darstellung für eine Anordnung von Messkammern mit unterschiedlichen Kompartimenten für eine Probe, eine Messsonde und eine Messsondenablage in Draufsicht,
Fig. 3b eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einem Multi-Cantilever und einer Arrayformation mit korrespondierender Geometrie, Fig. 4a bis 4d eine schematische Darstellung zur Beschreibung einer Messsondenüberführung mit abgestimmtem Flüssigkeitswechsel und
Fig. 5a bis 5c Ablaufdiagramme zum Beschreiben eines Regelkreises für eine automatisierte Messvorrichtungseinstellung.
Fig. 1 zeigt ein Ablaufdiagramm für ein Verfahren zum kombinierten Untersuchen einer Probe unter Verwendung eines bildgebenden Messverfahrens sowie eines rastersondenmikrosko- pischen Messverfahrens
Es erfolgt separat eine Vorbereitung der Proben (Schritt 1) und der Messsonde(n) (Schritt 2), die auch eine erste Funktionalisierung beinhalten können. Das Messinstrument 3 mit einer Datenprozess- und Analyseeinheit 4 zusätzlich wahlweise verbunden mit einer separaten Einheit zur Datenevualierung / Speicherung Schritt (4a) werden in Betrieb genommen. Dabei erfolgt ein Referenzlauf (Homingprozeß) der x,y,z Achsen der Probenträgereinheit (Schritt 5) und eine Einnahme einer Arbeitsstellung. Dann erfolgen Einbau der Messsonde / Cantilevers (Schritt 2) und der Probe in das Messinstrument 3. Dabei bilden Messsonde, Probe und deren spezifischen Halter einen gesonderten Probenraum 6, der mit einer Fluidik ausgestattet ist (Schritt 7). Der Probenraum 6 wird über im Schritt 4 mittels der fluidischen Einrichtung 7 befüllt. In einem Schritt 8 wird eine automatische Justage der Lage des Laserstrahls auf dem Cantile- ver und seiner Abbildung auf dem Detektor durch Veränderung an der Spiegelstellung über zum Beispiel elektromechanische Stellglieder erzielt. In einem in den Fig. 5a bis 5c näher ausgeführten Prozess werden die x,y,z-Position des Cantilevers mit Unterstützung eines Referenzlaufs und der Objekterkennung ermittelt.
In einem weiteren Schritt 9 wird die Kalibrierung des Cantilevers 2 ausgeführt. In einem nachfolgenden Schritt 10 erfolgen die räumliche Positionsbestimmung des Cantilevers und des Probensubstrats und ihre Synchronisierung zu einander. Ein wesentlicher Aspekt ist, dass nicht nur eine räumliche Koordinatenabstimmung erfolgt, sondern auch eine zeitliche Synchronisierung aller relevanten Elemente, insbesondere Bildaufnahme der Kamera und Detek- tion der Bewegung des Cantilevers und die Cantileverhalterbewegung selbst. Die Positionsbestimmung Cantilever Probensubstrat kann auch alternativ an einer Targetprobe oder einer Sondenprobe (Partikel für die Messsonde) ausgeführt werden. Dabei erfolgt ein Feinabgleich der x,y,z-Position der Targetprobe. Besonders durch Autofokusprozedur wird die optische Grenzfläche bei transparenten Trägern sicher bestimmt. Im Anschluss erfolgt eine Abstimmung der Probenposition mit der Cantileverposition. Dabei wird auch berücksichtigt, dass die optimale Position eines Sondentragenden Cantilevers sich unterscheidet von der eines Son- denfreien.
Für die eigentliche Kraftmessung wird die Messsonde in eine Warteposition (Schritt 11) gefahren. Anschließend erfolgt die Auswahl geeigneter Targetzellen durch eine automatisierte Bild-Objekterkennung (Schritt 12) und Aufnahme eines 1. Bild(datensatzes) (Schritt 13). Dar- über hinaus werden aus dem Bild x,y -Koordinaten (Schritt 14) für die Positionierung der Messsonde (Position aus Schritt 11) abgegeben und diese an die abgeleitete jeweilige Position geführt. Die Bilderkennung kann nach einem ähnlichen Verfahren wie in Fig. 5a beschrieben erfolgen oder auf eingeführte Algorithmen der Objekt- und Zellerkennung. Dies kann sowohl durch die Standard-Durchlichteinrichtung und Kontrastverfahren erzielt werden als auch mit Fluoreszenzmikroskopie. Die Erkennung selbst kann zweistufig angelegt sein: (i) Erkennung von potentiellen Targetzellen durch eine grobe Intensitätsanalyse - hierbei werden die x, y, z- Positionen dieser Objekte schon hinterlegt. Sollten keine Objekte im Blickfeld sein, wird nach Rückmeldung an die Prozesseinheit der Probenträger in x, y-Richtung bewegt, und (ii) eine bildbasierte Charakterisierung und Auswahl der Targetzellen angeschlossen.
Nach der Annäherung der Messsonde an die Messprobe - Targetzelle (Schritt 15) wird die rastersondenmikroskopische Untersuchung im Schritt 16 ausgeführt. Im Anschluss an die SPM-Untersuchung mit den Ergebnissen (Schritt 17) wird ein 2. Bild(datensatz) 18 aufgenommen.
Je nach Aufgabenstellung kann die Information aus den beiden Bildsätzen gleich verarbeitet und mit der Kraftmessung kombiniert und ausgewertet werden.
Über eine Entscheidungsmatrix (Schritt 19) kann das Experiment unter gleichen oder auch veränderten Parametern wiederholt werden. Die Aufnahme eines 2. Bilddatensatzes kann auch schon während der Beprobung stattfinden und in Abhängigkeit von dem Ergebnis die AFM-Einstellparameter unmittelbar beeinflussen. Darüber hinaus ist es möglich, dass der 2. Bilddatensatz aufgenommen wird in einer veränderten Fokushöhe, wie es bei der Aufnahme eines z-Stacks ausgeführt wird.
In Abhängigkeit von den Assaybedingungen kann es erforderlich sein, die Messung zu gestaf- feiten Zeiten auszuführen. Zur Unterscheidung von Subpopulation kann es auch vorteilhaft sein für jede der Einzelzellen ein Variation von Einstellparametern der Kraftmikroskopie wie Kontaktzeit, Auflagekraft, Verfahrgeschwindigkeit und Belastungsrate (loading rate) zu verändern (Schritt 20) oder die Fokuseinstellung zu ändern. Alle Parameter können auch zeitlich und oder örtlich moduliert werden.
Die Messwertaufnahme kann jetzt wiederum für mehrere Einzelzellen ausgeführt werden. Im nächsten Schritt 21 wird die Probe mit einem Wirkstoff versehen und die Messung wiederholt ausgeführt. In Abhängigkeit von den Assaybedingungen kann es erforderlich sein die Messung zu gestaffelten Zeiten auszuführen. Zur Unterscheidung von Subpopulation kann es auch vorteilhaft sein, für jede der Einzelzellen ein Variation von Einstellparametern der Kraftmikroskopie wie Kontaktzeit, Druck, Belastungsrate zu verändern.
Anschließend wird die Messsonde gespült und das Experiment beendet (Schritt 22). Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung einer Kraft-Abstandskurve mit charakteristischen Messpunkten.
Hierbei ist die Ablenkung des Cantilevers proportional zur Kraft, die auf den Cantilever oder der Messsonde vertikal wirkt. Der Abstand ist die Distanz zwischen Probe und Cantile- verspitze - auch als Messsonde bezeichnet. Die durchgezogenen Pfeile symbolisieren die Annäherungsbewegung - Attraktion, während die gepunkteten Linien die Wegbewegung - Retraktion des Cantilevers von der Probe beschreiben. Hierbei ist der Cantilever kein völlig starrer Balken, sondern kann sich bei der Bewegung auf und von der Probe sowohl konkav oder konvex durchbiegen, während die eigentliche Spitze/Messsonde noch im Kontakt mit der Probe ist.
Der Messpunkt 30 beschreibt die Annäherung der Cantileverspitze an die Probe aus einer größeren Entfernung. Am Ende der Annäherung springt die Spitze schlagartig an die Probenoberfläche (Messpunkt 31) infolge von Anziehungskräften. Eine weitere Annäherung des Cantilevers mit der Sonde führt zur weiteren Erhöhung der abstoßenden Kräfte (vgl. Messpunkt 32), wenn die Spitze in sehr nahem Kontakt zur Probenoberfläche ist. Hierbei steht Messpunkt 32 für die engste Annäherung zwischen Spitze und Probe. Der Cantilevers entfernt sich dann wieder vom engsten Kontakt, während die Spitze noch im Kontakt zur Probe ist (vgl. Messpunkt 33). Im Endpunkt ist eine maximale Ablenkung des Cantilevers gegeben. Während sich der Cantilever nur sehr geringfügig weiter von der Probe entfernt und die Spitze weiter Kontakt zur Probe hat, kommt es zur sprunghaften Änderung der Cantileverablen- kung (vgl. Messpunkte 34, 35). Dies ist beispielsweise der Fall, wenn Material aus der Probe gezogen wird (zum Beispiel Fäden - Jether" ziehen aus Membranen). Die Ablenkung des Cantilevers wird sprunghaft verändert, ohne dass es zu einer motorisierten Veränderung des Cantilevers selbst kommt. Insgesamt verringert sich die notwendige Zugkraft schlagartig. Es sind noch die folgenden Messpunkte in Fig. 2 gezeigt: 37 - maximale Ablenkungskraft in Punkt 33, 36 - ab Ende von 35 und Beginn von 36 ist die Spitze kontaktfrei zur Probe und wird weiter entfernt.
Nachfolgend wird unter Bezugnahme auf Fig. 2 ein automatisierter Messablauf nach einem Ausführungsbeispiel innerhalb des in Fig. 1 erläuterten Ablaufs beschrieben. Eine zu untersuchende Zelle ist mit einem Farbstoff angefärbt, der im Zellinnern in Vesikeln akkumuliert ist. Aufgrund des im Normalzustand vorliegenden pH- Wertes in den Vesikeln ist die Intensität des Farbstoff in einem betrachteten Filterbereich sehr gering. Die Beobachtung erfolgt durch ein geeignetes Invertmikroskop mittels CCD-Kamera. Aus einem interessieren- den Bessbereich, in dem sich die Zelle befindet, wird eine durchschnittliche Pixelintensität ermittelt. Wird die Zelle aufgrund einer mechanischen Belastung aktiviert, beispielsweise mittels eines Cantilevers, führt dies zu einer Veränderung im pH-wert der Vesikel und so zu einer Zunahme der Farbstoffintensität. Ist der Cantilever geeignet beschichtet, zum Beispiel mit Fibronektin, kann über die Kraft-Anstandsmessung (Fig. 2, Messpunkte 33 bis 36) die Interaktionsstärke mit einem Rezeptor, beispielsweise Integrin, an aktivierten Zellen vermessen werden.
Der Cantilever wird bei der sondenmikroskopischen Untersuchung über der Zelle positioniert und beginnt mit vorher eingestellten Werten eine Annäherung an die Zelloberfläche (vgl. Be- reich 30 in Fig. 2) mit einer Geschwindigkeit vi (konstante Auslenkung, im Bereich von Null). In dieser Phase wird ein erstes Kamerabild (erster Bilddatensatz) aufgenommen mit einer gewählten Kameraeinstellung (zum Beispiel Binning, Belichtungszeit), und die Annäherung wird gestoppt oder deutlich verlangsamt. Innerhalb des interessierenden Bereiches wird die Intensität ermittelt und zu korrespondierenden Cantilevereigenschaften wie Grad der De- flektion als Maß der Kraft und die aktuelle z-Position gespeichert. Ist die ermittelte Intensität unterhalb eines vorher eingestellten Erwartungswertes (Negativkontrolle), wird die Annäherung fortgesetzt.
In den Messpunkten 31, 32 kommt es zu einer Zunahme der Ablenkung des Cantilevers. In- nerhalb der Annäherungsphase bei dem Messpunkten 31, 32 werden regelmäßig weitere Kamerabilder aufgenommen mit Kameraeinstellungen, die gleich oder verschiedenen von den für die erste Kameraaufnahme genutzten Einstellungen sind, und die Bewegung des Cantilevers wird dazwischen typischerweise gestoppt oder deutlich verlangsamt. Innerhalb des interessierenden Bereiches wird die Intensität fortlaufend ermittelt (innerhalb der Gesamtzeit für Bildaufnahme und Auswertung) und zu den korrespondierenden Cantilevereigenschaften und der Zeit gespeichert. Dieses Verfahren wird bis zu dem Ablenkungsgrad des Cantilevers ausgeführt, bei dem die die Intensität des interessierenden Bereiches erstmalig oberhalb eines vorgegebenen Erwartungswertes (Positivkontrolle) ist. Dann erst erfolgt der Übergang in die Phase mit den Messpunkten 33, ..., 36. Das hat den Vorteil, dass an der Zelle sowohl die Aktivierung ausgelöst und dokumentiert werden kann, und die hiezu korrespondierende Kraftabstandskurve kann aufgenommen werden. Hierdurch wird die Anzahl der notwendigen Messungen vermindert.
Fig. 3 a zeigt eine schematische Darstellung für eine Anordnung von Messkammern mit unterschiedlichen Kompartimenten für eine Probe, eine Messsonde und eine Messsondenablage in Draufsicht. Fig. 3b zeigt eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einem Multi- Cantilever und einer Arrayformation mit korrespondierender Geometrie.
In einer Messkammer 42 befinden in einem definierten Abstand voneinander Poren 43 und bilden so ein Array. Die Messkammer 42 ist so fluidisch angeschlossen, dass über eine Kom- bination aus Ventilen und Pumpen 46 ein Ansaugdruck über die Poren induziert werden kann. Die Zugabe von Partikeln 41 saugt die Partikel auf freien Porenplätze. Im Ergebnis entstehen arrayartig angeordnete Partikel 45. Alternativ kann auch über einen Überdruck eine Platzierung erzeugt werden. Auch kann die Anordnung so gereinigt werden. Weiterhin werden wahlweise überschüssige Partikel 44 auf Zwischenflächen abgelagert. Diese können danach weggespült werden, während die platzierten Objekte 45 lokal stabil bleiben. Vorzugsweise ist die fluidische Kontaktierung so ausgelegt, dass eine zeilen- oder spaltenweise Belegung ermöglicht wird.
In Fig. 3b ist eine AFM-Messsonde dargestellt, die aus Grundkörper 47 und Cantilever 48 mit einem zusätzlich aufgebrachten Piezo-Stellelement 49 besteht. Bevorzugt sollte bei einem Multi-Cantilever der Cantileverabstand 50 genauso groß sein wie der korrespondierende Ar- rayabstand. Die einzelnen Biegebalken des Multi-Cantilevers können auch individuell ansteuerbar und auslesbar sein.
Fig. 4a bis 4d zeigen eine schematische Darstellung zur Beschreibung einer Messsondenüberführung mit abgestimmtem Flüssigkeitswechsel und Aus Fig. 4a ergibt sich, dass eine Messkammer 50 unterteilt ist in zwei Teilbereiche 51, 52, die durch eine Zwischenwand 53 getrennt sind. Jeder der Teilbereiche 51, 52 weist in dem dargestellten Ausführungsbeispiel eine Fluidzuführung 54, 54a auf, die unabhängig voneinander betrieben werden kann und sowohl saugt als auch pumpt. Neben einem Cantileverhalter 55 mit Cantilever und Messsonde 56 befindet sich eine weitere fluidische Zuführung 57, die zum Beispiel als integrierte Mikropipette oder als Dispensiereinheit fungieren kann. Beide Teilbereiche 51, 52 sind bis zu einer Flüssigkeitshöhe 58 gefüllt, wobei sich in der Lösung I 59 Partikel 60 befinden und in der Lösung 61 mit Objekten 62 eine zur Lösung I 59 gleiche oder hiervon verschiedene Zusammensetzung vorliegen kann.
In Fig. 4b erfolgt zunächst eine SPM-Messung der Messsonde an einem Partikel 60. Im An- schluss an eine erste Messung wird über 57 ein Wirkstoff eingespült (Lösung 63) und die Messung wiederholt. Nach der SPM-Messung wird Teilbereich 51 wieder gespült über 54, so dass in 51 und 52 im Wesentlichen ein identisches Fluid enthalten ist.
In Fig. 4c erfolgt eine Flutung der Messkammer 50 über die Höhe der Zwischenwand 53 hinaus bis zu einem Flüssigkeitsstand 64 mittels der Zuleitung 54. Begleitend zur Erhöhung des Pegels wird der Abstand zwischen Cantileverhalter und Partikel 60 vergrößert (Pfeil a). Im Anschluss wird der Cantilever über dem zweiten Teilbereich 52 positioniert (Pfeil b).
In Fig. 4d erfolgt eine Absenkung des Flüssigkeitspegels 64 auf den ursprünglichen Stand 56 über die Fluidikport 54 oder 54a, begleitet von einer Absenkung des Cantileverhalters mit der Messsonde auf eine Arbeitsposition in der Nähe der Probenpartikel. Zusätzlich erfolgt ein Austausch der Flüssigkeit, so dass in den zwei Teilbereichen 51, 52 wieder individuelle Lö- sungen vorliegen und es wird die Beprobung der Partikeln 62 vorgenommen.
Fig. 5a bis 5c zeigen Ablaufdiagramme zum Beschreiben eines Regelkreises für eine automatisierte Messvorrichtungseinstellung.
Fig. 5a setzt nach dem Schritt 8 in Fig. 1 an. Ziel ist es, zunächst die Cantileverspitze selbst im Mikroskop-Kamerabild abzubilden und einen Positionsabgleich vorzunehmen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Lage der Cantiliverspitze ungefähr bekannt ist. In Abhängigkeit von dem gewählten Objektiv kann die Spitze aber außerhalb des Kamerasichtfel- des liegen. Zunächst wird ein Zentrierkreuz mittig in der Kamera angezeigt. Ziel ist es, die Cantileverspitze mit dem Kreuzmittelpunkt in Übereinstimmung zu bringen. Hierfür wird mindestens ein Kamerabild aufgenommen, und die Intensitätssignale werden zeilen- und spaltenweise aufgenommen. Die geeignete Pixelgröße der Zeilen oder der Spalten muss vorher ausgetestet werden, sollte aber im Bereich der Hälfte der Cantileverbreite liegen. Aus dem Intensitätsmuster lässt sich die Lage der Cantileverspitze ermitteln. Stimmt die Position noch nicht mit dem Zielbereich überein, so werden über Stellmotoren eine entsprechende Richtungskorrektur ausgeführt und nochmalig die Intensitätsverteilung ermittelt. Auf diese Weise kann die Position in der x,y-Ebene mit dem Erwartungswert abgestimmt werden. Um die rich- tige Fokushöhe des Cantilevers zu erzielen, wird dann eine nochmalige Konturenanalyse über eine Intensitätsanalyse ausgeführt. Hierbei kann die Umschaltung auf eine andere Beleuchtungsart (hier nicht gezeigt) hilfreich sein. Auf diese Weise ist es möglich die Position der Cantileverspitze in x, y, z-Richtung mit dem Kamerabild abzugleichen.
In Fig. 5b wird die Lagererkennung des Detektionslasers ebenfalls bildbasiert ausgeführt. Hierbei wird die Helligkeitsverteilung über eine objektivseitige Kamera ausgelesen und Zeilen- oder Spaltenweise analysiert, wie in Fig. 5a schon eingehend beschrieben. Dabei unterscheiden sich natürlich die erwarteten Intensitätsmuster. Die Stellelemente die Justierknöpfe werden solange motorisiert verändert bis die ermittelte Verteilung mit einem Erwartungswert- Bereich übereinstimmt. In einem ersten Schritt der Objektfindung kann dabei ein Objektiv geringerer Vergrößerung benutzt werden, dann schwenkt das System automatisiert auf die Arbeitsvergrößerung um und führt die Feinabstimmung aus.
Die Justage des Spiegels ist in Fig. 5c beschrieben. Hierbei erfolgt zunächst eine Optimierung der Laserstellung nach dem Summensignal mittels motorisierter Stellglieder. In einem zweiten Schritt werden die vertikale und laterale Deflektion nach einem Erwartungsbereich optimiert. Die hier anfallenden Werte werden mit vorliegenden Qualitätswerten verglichen, ggf. die Eichung wiederholt, protokolliert und bei Bedarf dem Nutzer Hinweise zur Optimierung und Fehlerbeseitigung angeboten.
Die in der vorstehenden Beschreibungen, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausfuhrungsformen von Bedeutung sein.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum kombinierten Untersuchen einer Probe mit zu untersuchenden Objekten, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten, bei dem: - Messergebnisse für ein oder mehrere der zu untersuchenden Objekte in der Probe er- fasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines bildgebenden Messverfahrens untersucht werden,
- sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines sondenmikroskopischen Messverfahrens untersucht werden, und
- die Messergebnisse und die sondenmikroskopischen Messergebnisse, nach wahlweiser vorheriger Zwischenverarbeitung, einander zugeordnet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Mess- verfahren und das sondenmikroskopische Messverfahren automatisiert als kombinierte
Messung der Probe ausgeführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Messergebnissen Informationen über Probeneigenschaften der Probe abgeleitet werden, die beim Ausführen des sondenmikroskopischen Messverfahrens berücksichtigt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Messergebnissen als Informationen über Probeneigenschaften Lageinformationen über die Lage des einen oder der mehreren zu untersuchenden Objekte in der Probe abgeleitet und zum Positionieren einer bei dem sondenmikroskopischen Messverfahren genutzten Messsonde relativ zu der Probe berücksichtigt werden.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus den sondenmikroskopischen Messergebnissen Informationen abge- leitet werden, die beim Ausführen des bildgebenden Messverfahrens berücksichtigt werden.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe bei dem bildgebenden und dem sondenmikroskopischen Messverfahren in einer Fluidikzelle angeordnet wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem bildgebenden und dem sondenmikroskopischen Messverfahren als zu untersuchenden Objekte in der Probe Zellen untersucht werden.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass weitere sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte erfasst werden, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels des sondenmikroskopischen Messverfahrens erneut untersucht wird, wobei geänderte Beobachtungsparameter verwendet werden, die sich von Beobachtungsparametern von zuvor ausgeführten sondenmikroskopischen Messver- fahrens unterscheiden.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Messverfahren unter Verwendung mindestens einer Messtechnik ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Messtechniken ausgeführt wird: elektrisches bildgebendes Messverfahren wie Patchclamp und Impedanzmessung, chemisches bildgebendes Verfahren wie lokale pH- Wertmessung oder ionenselektive Wertmessung und optisches bildgebendes Messverfahren.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass das sondenmikroskopische Messverfahren unter Verwendung mindestens einer Messtechnik ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Messtechniken ausgeführt wird: Rastersondenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und Lichtkraftmikroskopie.
11. Vorrichtung zum Ausführen einer kombinierten Untersuchung einer Probe mit zu untersuchenden Objekten, insbesondere einer Probe mit biologischen Objekten, mit: - einer bildgebenden Messeinrichtung, die konfiguriert ist, Messergebnisse für ein oder mehrere der zu untersuchenden Objekte in der Probe zu erfassen, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines bildgebenden Messverfahrens untersucht werden,
- eine sondenmikroskopische Messeinrichtung, die konfiguriert ist, sondenmikroskopische Messergebnisse für das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte zu er- fassen, indem das eine oder die mehreren zu untersuchenden Objekte mittels eines sondenmikroskopischen Messverfahrens untersucht werden, und
- einer Auswerteeinrichtung, die an die Messeinrichtung und an die sondenmikroskopische Messeinrichtung gekoppelt und konfiguriert ist, die Messergebnisse und die sondenmikroskopischen Messergebnisse, nach wahlweiser vorheriger Zwischenverarbei- tung, einander zuzuordnen.
PCT/DE2008/001203 2007-07-24 2008-07-24 Verfahren und vorrichtung zum kombinierten untersuchen einer probe mit zu untersuchenden objekten Ceased WO2009012766A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/670,570 US8898809B2 (en) 2007-07-24 2008-07-24 Method and apparatus for the combined analysis of a sample with objects to be analyzed

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007034854A DE102007034854A1 (de) 2007-07-24 2007-07-24 Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Messung und Kombination von Bildaufnahme und Kraftmessung
DE102007034854.3 2007-07-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009012766A1 true WO2009012766A1 (de) 2009-01-29

Family

ID=39831802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2008/001203 Ceased WO2009012766A1 (de) 2007-07-24 2008-07-24 Verfahren und vorrichtung zum kombinierten untersuchen einer probe mit zu untersuchenden objekten

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8898809B2 (de)
DE (1) DE102007034854A1 (de)
WO (1) WO2009012766A1 (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008036064B4 (de) * 2008-06-17 2015-07-09 Jpk Instruments Ag Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen der Zellaktivierung einer Zielzelle durch einen Aktivator
US8387158B2 (en) * 2009-08-05 2013-02-26 The United States of America as represented by the Secretary of Commerce, the National Institute of Standards and Technology Laser guided tip approach with 3D registration to a surface
KR102012577B1 (ko) 2015-02-26 2019-08-20 살렌트, 엘엘씨 나노-전자-기계적-시스템 프로브들을 제작하기 위한 방법들 및 시스템들
JP2018510364A (ja) 2015-02-26 2018-04-12 クサレント リミテッド ライアビリティー カンパニー 集積マルチチップ走査型プローブ顕微鏡
CN104946523B (zh) * 2015-05-28 2017-09-15 三捷生物科技（北京）有限公司 一种细胞力学的测量装置及测量方法
US9928403B2 (en) 2016-02-09 2018-03-27 Molecular Devices, Llc System and method for image analysis of multi-dimensional data
US10866273B2 (en) 2016-03-09 2020-12-15 Xallent, LLC Functional prober chip
US10784054B2 (en) 2017-04-06 2020-09-22 Kwame Amponsah Nanoelectromechanical devices with metal-to-metal contacts
GB201710294D0 (en) * 2017-06-28 2017-08-09 Infinitesima Ltd Scanning probe microscope
US10663484B2 (en) 2018-02-14 2020-05-26 Xallent, LLC Multiple integrated tips scanning probe microscope with pre-alignment components

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0701102A1 (de) * 1994-09-09 1996-03-13 Seiko Instruments Inc. Optisches Nahfeld-Rastermikroskop/Rasterkraftmikroskop mit Beobachtung in einer Flüssigkeit
US5874668A (en) * 1995-10-24 1999-02-23 Arch Development Corporation Atomic force microscope for biological specimens
DE102004048971B3 (de) * 2004-10-07 2006-05-24 Nambition Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Rastersondenmikroskopie

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK9742002A3 (en) * 2000-01-07 2003-02-04 Transform Pharmaceuticals Inc High-throughput formation, identification, and analysis of diverse solid-forms
US6862921B2 (en) * 2001-03-09 2005-03-08 Veeco Instruments Inc. Method and apparatus for manipulating a sample
US6858436B2 (en) * 2002-04-30 2005-02-22 Motorola, Inc. Near-field transform spectroscopy
JP2004264039A (ja) * 2003-01-30 2004-09-24 Hitachi Ltd 走査プローブ顕微鏡及びｃｄ・断面プロファイル計測方法並びに半導体デバイス製造方法
DE102004063980A1 (de) 2004-10-07 2006-08-10 Nambition Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Rastersondenmikroskopie
DE102007023435A1 (de) 2007-05-16 2008-11-20 Jpk Instruments Ag Verfahren zum rastersondenmikroskopischen Untersuchen einer Messprobe, Messsystem und Messsondensystem

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0701102A1 (de) * 1994-09-09 1996-03-13 Seiko Instruments Inc. Optisches Nahfeld-Rastermikroskop/Rasterkraftmikroskop mit Beobachtung in einer Flüssigkeit
US5874668A (en) * 1995-10-24 1999-02-23 Arch Development Corporation Atomic force microscope for biological specimens
DE102004048971B3 (de) * 2004-10-07 2006-05-24 Nambition Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Rastersondenmikroskopie

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUJII T ET AL: "DEVELOPMENT OF A NEW FORCE MICROSCOPE WITH A FLUORESCENCE OPTICAL MICROSCOPE", THIN SOLID FILMS, ELSEVIER-SEQUOIA S.A. LAUSANNE, CH, vol. 243, no. 1/02, 1 May 1994 (1994-05-01), pages 407 - 410, XP000471509, ISSN: 0040-6090 *
WOJCIKIEWICZ E P ET AL: "Force and compliance measurements on living cells using atomic force microscopy (AFM)", BIOLOGICAL PROCEDURES ONLINE 20040115 CA, vol. 6, no. 1, 15 January 2004 (2004-01-15), pages 1 - 9, XP002500731, ISSN: 1480-9222 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102007034854A1 (de) 2009-01-29
US8898809B2 (en) 2014-11-25
US20100263098A1 (en) 2010-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009012766A1 (de) Verfahren und vorrichtung zum kombinierten untersuchen einer probe mit zu untersuchenden objekten
EP1125112B1 (de) Vorrichtung zur visualisierung von molekülen
EP2064310B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur automatisierten entnahme von zellen und/oder zellkolonien
US9354249B2 (en) Scanning ion conductance microscopy using piezo actuators of different response times
EP0819930A2 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand
WO2000037984A2 (de) Positionierung des messvolumens in einem scanning-mikroskopischen verfahren
DE60023678T2 (de) Optische mikroskopie und deren verwendung bei der untersuchung von zellen
EP3561040A1 (de) Dispensiervorrichtung mit einem dispenser zum ausgeben einer wenigstens eine zelle und/oder wenigstens ein partikel enthaltenen flüssigkeit
EP3161463B1 (de) Vorrichtung und verfahren für die stöchiometrische analyse von proben
DE102004063980A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Rastersondenmikroskopie
DE102007023435A1 (de) Verfahren zum rastersondenmikroskopischen Untersuchen einer Messprobe, Messsystem und Messsondensystem
EP0765470A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur gezielten entnahme von komponenten aus komplexen mischungen
WO2009012765A2 (de) Messsondenvorrichtung für ein sondenmikroskop, messzelle sowie rastersondenmikroskop
WO2009071065A2 (de) Vorrichtung zur messung von transportsystemen
LU102108B1 (de) Verfahren zum automatischen Untersuchen einer flüssigen Probe
EP1594613B1 (de) Verfahren zur untersuchung zellulärer proben
DE102021202518B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Absetzen von Flüssigkeit auf Träger
EP1807696B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur messung von zelleigenschaften
DE102004048971B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Rastersondenmikroskopie
US11591574B2 (en) Optical-quality surface that imparts spatial control of macrophage fusion
DE112006003969B4 (de) Verfahren zum Betreiben einer eine Rastersondenmikroskopeinrichtung aufweisenden Messanordnung und Messanordnung
DE102017010815A1 (de) Vorrichtung und Verfahren für die parallele Handhabung, Beobachtung und Kontrolle von gewebeähnlichen Zellverbänden
AT407801B (de) Kraftmikroskop
Yanagida et al. Near-Field Microscopy for Biomolecular Systems
PACCAGNAN Chemo-mechanical triggering of membrane potential at single cell level

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08784380

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12670570

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08784380

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1