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WO2009071301A2 - Verfahren zum auffinden von effektoren der proteaseaktivität von cis/trans isomerasen - Google Patents

Verfahren zum auffinden von effektoren der proteaseaktivität von cis/trans isomerasen Download PDF

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WO2009071301A2
WO2009071301A2 PCT/EP2008/010303 EP2008010303W WO2009071301A2 WO 2009071301 A2 WO2009071301 A2 WO 2009071301A2 EP 2008010303 W EP2008010303 W EP 2008010303W WO 2009071301 A2 WO2009071301 A2 WO 2009071301A2
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WO
WIPO (PCT)
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cis
trans
trans isomerase
molecule
proenzyme
Prior art date
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PCT/EP2008/010303
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French (fr)
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WO2009071301A3 (de
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Gunter Fischer
Cordula Schiene-Fischer
Tobias AUMÜLLER
Günther JAHREIS
Gerhard KÜLLERTZ
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the present invention relates to a method for finding cis / trans isomerase effectors and for quantifying the cis / trans isomerase inhibiting or activating effect of corresponding effectors.
  • Enzymes that can catalyze the cis / trans isomerization of peptide bonds are referred to as cis / trans isomerases.
  • the cis / trans isomerases include the peptidyl prolyl cis / trans isomerases (PPIases) and the secondary amide peptide bond cis / trans isomerases (APIases).
  • APIases differ from PPIases in that their cis / trans isomerase activity is directed to the cis / trans isomerization of secondary amide peptide bonds (Rail-Fischer C. et al .: Nature Structural Biology., 9 (6): 419-). 424, 2002; Rail-Fischer C. et al.: Biological Chemistry 383 (12): 1865-1873, 2002). APIases and the inhibition of their APIase activity are of great importance in human and veterinary medicine (e.g. US 2006100130).
  • PPIases are the families of cyclophilins (Galat A.: Eur. J. Biochem 216 (1993) 689-707,hacker J. & Fischer G: Mol. Microbiol 10 (1993) 445-456), FKBP's and counted the parvulins.
  • cyclophilins refers to enzymes which have a PPIase activity and which can be determined, for example, by conventional methods of sequence comparison with known cyclophilins (eg: A. Galat: Arch. Bioch. & Biophys., 371 (1999) 149-162; IT Chou Sc CS. Gasser: Plant Mol. Biol. 35 (1997) 873-892; D.
  • cyclophilins is also intended to include those enzymes which, in addition to homologies to known cyclophilins, also have homologies to other PPlases, such as the enzymes recently discovered and termed FCBs (B. Adams et al.: Journal of Biological Chemistry 280 (2005) 24308-24314).
  • a special feature of cis / trans isomerases of the FKBP family is that their cis / trans isomerase activity can be inhibited by FK506.
  • FK506 A special feature of cis / trans isomerases of the FKBP family is that their cis / trans isomerase activity can be inhibited by FK506.
  • the FKBPs and the inhibition of their cis / trans isomerase activity are of great importance in human and veterinary medicine as well as in biochemical and biotechnological questions, as has been described for example in numerous publications (eg KR 2002024377, US Pat. EP 1687443, JP 2006166845, AU 2002317841, EP 1666053, WO 2006042406, WO 2006012256, WO 2005063964).
  • the cis / trans isomerase activity of representatives of the parvulin family can be significantly inhibited neither with cyclosporin A nor with FK506 at an inhibitor concentration ⁇ 1 ⁇ M with a 10-fold molar excess of inhibitor.
  • a specific irreversible inhibition by the natural product juglone (5-hydroxy-l, 4-naphthoquinone) could be detected ( Hennig et al.: Biochemistry 37 (1998) 5953-5960).
  • Juglone is a natural product isolated from walnut having both bacteriostatic and fungicidal and cytotoxic properties against eukaryotic cells (eg: TJ Monks et al.: Toxicol, Appl. Pharmacol. 112 (1992) 2-16; N. Didry et al. : Pharmacy 49 (1994) 681-683).
  • the first group comprises all eukaryotic enzymes with a specificity for substrates with (PO 3 H 2 ) Ser- / (PO 3 H 2 ) Thr residues before the amino acid residue proline.
  • These include, among others, the human Pinl (hPinl) and the ESS1 / PTF1 from yeast (eg: KP Lu et al .: Nature 380 (1996) 544-547; SD Hanes et al .: Yeast 5 (1998) 55-72, J Hani et al.: FEBS Lett. 365 (1995) 198-202).
  • the reversible phosphorylation of Ser / Thr residues plays a central role in the regulation of basic cellular processes.
  • the regulation of the eukaryotic cell cycle is, for example, subject to the principle of a temporally very precise sequence of activations of various signal transduction cascades. This process is mainly controlled by proline-specific Ser / Thr phosphatases and kinases.
  • the reversible phosphorylation of proteins on Ser / Thr residues leads to structural changes of proteins and thus regulates their biological activity, for example with regard to their stability, enzymatic activity or theirs Binding affinity to other proteins (EA Nigg Bioessays 17 (1995) 471-480).
  • PPIase inhibitors such as sirolimus or everolimus show comparable effects in transplantation immunology as cyclosporin A, without these active ingredients inhibiting in vitro the protein phosphatase calcineurin (eg Lisk W. et al.: Transplantation Proceedings 38 (2006) 69-73) , In addition, these drugs do not have the observed cancer-causing effect such as cyclosporin A (eg: Kauffman et al.: Transplantation 80 (2005) 883-889).
  • PPIase inhibitors which are used therapeutically in transplantation immunology and do not inhibit calcineurin, have an inhibitory effect on tumor growth and tumor angiogenesis (eg: J. Andrassy et al .: Transplantation 80 (2005) 171-174; SH Kim et al.: J. Pathology 164 (2004) 1567-1574; H. Yang et al.: J. of Surgical Res. 123 (2005) 312-319).
  • Known assays which detect the acceleration of cis / trans isomerization of peptide bonds by cis / trans isomerases can be subdivided into direct and indirect methods.
  • Direct assays (a-c) exploit physical measurable parameters whose size is directly related to the isomerization of cis / trans bonds.
  • Indirect tests (d, e) either exploit the altered nature of a substance used for detection due to the isomerization or use isomer-specific reaction principles.
  • Isomer-Specific Mobility If the electrophoretic mobility of suitable cis / trans isomerase substrates for ice and trans isomer is different, this difference can be used to detect cis / trans isomerase activities. So it is z. B is capable of determining the rate of cis / trans isomerase-catalyzed equilibration of previously separated cis / trans isomers from different mobilities by capillary electrophoresis such as e.g. by Brandsch et al. (J. Biol. Chem. 1998, 273, 3861-3864). Disadvantage of this method is the low throughput of analyzes per unit time.
  • Isomer-specific proteolysis The cis / trans-isomer-specific substrate hydrolysis by means of cis / trans isomer-specific proteases makes it possible to deduce from the peculiarity of the proteolysis kinetics the presence or the effectuation of present cis / trans isomerases, as described e.g. by G. Fisher et al. (Biomed.Biochim, Acta 43, 1101-1111 (1984)). The disadvantage here is that highly concentrated proteases must be used and that the half-life of the measuring signal is relatively short. In addition, this test is unsuitable for cis / trans isomerase substrates which are resistant to proteases or which are not degraded configuration specific.
  • Disadvantages here are the relatively complicated spectroscopic methods or the sensitivity of such assays to substances which influence the renaturation of the observed protein in a manner which does not influence the isomerase activity.
  • Another disadvantage is the high cis / trans isomerase concentrations necessary for the method, which can prevent a quantitative determination of high affinity inhibitors.
  • Another disadvantage of the listed methods is furthermore the relatively large amount of solvent to be used, which is necessary in order to shift the natural equilibrium between cis and trans isomer before the measurement.
  • Auxiliary substances used for the deflection of the equilibrium such as trifluoroethanol, are capable of effecting cis / trans isomerases or necessary proenzymes in a manner which is detrimental to the assay.
  • the major drawback of all of the foregoing methods is that they operate with deflected equilibria of cis to trans isomers. The activation energies required to adjust the equilibrium are relatively low, so that the equilibration can take place without the addition of cis / trans isomerases.
  • the difference between whether quantitative or qualitative changes can be observed by adding a catalyst is in usually associated with the activation energy necessary for the respective reaction. While in the abovementioned, previously known detection method of cis / trans isomerase activity, the activation energy required for the course of the reaction is so low that the chemical / biochemical reaction proceeds even under normal conditions even without the addition of a cis / trans isomerase Complex biological systems by the incomprehensible interaction of individual molecules or their functional groups at the molecular level in detail to reactions that can occur only in the presence of active cis / trans isomerases.
  • cis / trans isomerases In addition to cis / trans isomerase activity, which is directed to cis / trans isomerization of peptide bonds as described above, cis / trans isomerases have surprisingly been found to have protease activity toward certain substrates.
  • the method according to the invention has the advantage that effectors which inhibit or activate the protease activity of cis / trans isomerases can be found by means of the same in a procedurally simple and cost-effective manner.
  • the method according to the invention has the advantage that by means of it the cis / trans isomerase inhibiting / activating effect of corresponding effectors procedurally simple and thus can be quantified cost-effectively and reliably.
  • the method according to the invention has the advantage that effectors can be carried out by means of the same high throughput screening for cis / trans isomerase.
  • the method according to the invention thus makes it possible to find effectors for inhibiting or activating cis / trans isomerases either by proteolytic cleavage of a substrate molecule by the cis / trans isomerase or by means of the proenzyme activated by the cis / trans isomerase.
  • the determination according to step d) and optionally according to step e) takes place by means of the substrate molecule and / or by means of at least one substrate molecule fragment which is generated by the cis / trans isomerase caused proteolytic cleavage of the substrate molecule.
  • the determination of the protease activity by means of the substrate molecule and / or by means of hydrolysis products of the substrate molecule requires only a small amount of substrate molecule or fragments and is procedurally simple and therefore particularly inexpensive to carry out.
  • step d) If the determination according to step d) leads to the result that the candidate substance is an effector, quantification of the inhibitory / activating effect of the effector on the Protease activity take place.
  • the quantification of the inhibiting / activating effect can likewise be effected by means of the substrate molecule and / or by means of at least one substrate molecule fragment or else by means of other parameters or methods. The same applies analogously to substrates (auxiliary molecule) which have been reacted by the activated proenzyme.
  • the substrate molecule is a molecule whose proteolytic cleavage can be detected by spectroscopy.
  • the substrate molecule or substrate reacted with the activated proenzyme, when this is a pro-protease is a fluorescently labeled oligo- or polypeptide that alters its fluorescence properties upon proteolytic cleavage.
  • the substrate molecule is a fluorescently labeled oligopeptide having up to 12 amino acid residues.
  • the cis / trans isomerase with protease activity to be used is preferably substrate-specific with respect to the substrate molecule used.
  • the helper molecule is a protein or a peptide or an organic molecule, wherein the organic molecule has a mass of less than or equal to 2,000 Da.
  • the organic molecule has a mass of less than or equal to 2,000 Da.
  • auxiliary molecule it is possible, for example, to use organic molecules found by the method according to the invention and having activating the protease activity of cis / trans isomerases, such as peptides, proteins or a mass of less than or equal to 2,000 Da.
  • peptide is understood to mean a polypeptide having fewer than 12 amino acid residues, and from 12 amino acid residues, the term “protein” is used in the context of the present invention.
  • the present invention further relates in this connection to a method for finding substrate molecules which are proteolytically cleaved by cis / trans isomerases, comprising the steps of
  • substrate molecules candidate substance is proteolytically cleaved.
  • the method according to the invention furthermore makes it possible to find effectors which inhibit or activate the protease activity of cis / trans isomerases and to quantify the inhibiting or activating effect of corresponding effectors on the protease activity of cis / trans isomerases by contacting the cis / trans isomerase a proenzyme that interacts with the cis / trans isomerase.
  • EctIC reactions are preferably distinguished, for example, from the "conventional", ie known cis / trans isomerase catalyzed reactions, by comparison of the ratio of uncatalyzed and catalysed reaction rate of the reaction measured with the proenzyme
  • the physical / chemical / biochemical parameters are optimized which lead to the maximum reaction rate of the proenzyme when adding a suitable amount of cis / trans isomerase Conditions determined only without cis / trans isomerase addition If, under the conditions determined, the ratio of catalysed reaction rate to uncatalyzed reaction rate is greater than 10 and can be determined by addition of cis / trans isomerase inhibitors obtained a reaction rate with respect to the proenzyme, which corresponds to the no cis / trans isomerase addition, so it is an EctIC reaction in the context of the present invention.
  • Nonlinear turnover curve of a typical cis / trans isomerase activity determination can be measured and calculated according to non-linear evaluation models in order to quantify cis / trans isomerase activities.
  • EctIC reactions can circumvent these limitations. Both endpoint determinations and linear kinetics - known to the skilled person as "initial velocity measurement" - are possible by means of the EctIC reaction for the determination of cis / trans isomerase activities.
  • EctIC reactions The molecular basis of EctIC reactions is still largely unknown and may include, for example, both the cis / trans catalysis of a peptide bond of the proenzyme and the specific binding to the proenzyme.
  • cis / trans isomerization of one or more peptide bonds of the proenzyme such flexibility of chemical functionalities of the protein may occur that the proenzyme changes its properties so that it is suitable as a proenzyme for detecting an EctIC reaction.
  • the catalytic activity of the cis / trans isomerase on the proenzyme can also be the cis / trans isomerization of the enzyme substrate bound to the proenzyme or of the substrate interacting with the proenzyme in general, with bound enzyme substrate in the context of the present invention also all being obtained by catalysis of the proenzyme to the product leading intermediates of the enzyme substrate including cleaving residues or the product itself are to be understood.
  • the molecular basis of influencing the proenzyme may be in a change in the three-dimensional structure of the complex To find proenzyme and cis / trans isomerase be.
  • Such proteinaceous changing qualitative properties of one of the binding partners have long been described for numerous protein interactions and are detailed below.
  • a cis / trans isomerase interacts with a proenzyme to qualitatively alter its properties so that an EctlC reaction can be observed and that this change in the proenzyme by the cis / trans isomerase is mediated by the cis / trans isomerase Activity -effective effectors can be changed so that a state of the proenzyme is achieved, which corresponds to that of the proenzyme without effectuation by the cis / trans isomerase.
  • determining whether the proenzyme has the property or that determining the extent of the property of the proenzyme by means of an auxiliary molecule, which with the proenzyme depending on the extent of the property in Interaction occurs. It has been found that the above-mentioned determinations can be carried out more simply by means of an auxiliary molecule compared to a direct determination on the proenzyme.
  • the auxiliary molecule is a substance by means of which a successful interaction with the proenzyme can be detected spectroscopically.
  • the helper molecule is a fluorogenic molecule which, when interacting with the proenzyme, alters its spectroscopic properties.
  • the auxiliary molecule is a corresponding enzyme substrate for the enzyme generated from the proenzyme.
  • the enzyme substrate used is specific for the enzyme generated from the proenzyme.
  • the proenzyme is AvrRpt2. It has been found that the proenzyme AvrRpt2 can be used to carry out Ectlc reactions that are particularly sensitive to effectors.
  • step d) or e) takes place on the basis of the enzyme substrate and / or on the basis of the substrate reacted by the generated enzyme.
  • the property of the proenzyme generated by the cis / trans isomerase is proteolytic activity, since proteolytic activity can be determined and quantified relatively simply on the basis of the enzyme substrate or the fragments resulting therefrom
  • the property generated by the cis / trans isomerase in the proenzyme proteolytic activity is a fluorogenic oligopeptide, which changes its fluorescence properties after proteolytic cleavage, and the determination according to step d) or e) of the method according to the invention by means of fluorescence measurement.
  • the effector is an inhibitor or an activator.
  • the proenzyme is converted to the active form by a cis / trans isomerase.
  • the found EctIC responses can also be used to measure PPIase or APIase activities, e.g. in biological fluids such as blood serum, blood plasma, cerebrospinal fluid, urine or tissue homogenates.
  • biological fluids such as blood serum, blood plasma, cerebrospinal fluid, urine or tissue homogenates.
  • a method is particularly preferred, comprising the steps of:
  • proenzyme generally describes inactive enzyme precursors.
  • inactive enzyme precursors are e.g. known for pepsinogen or chymotrypsinogen. Only by the addition of other enzymes or the action of the same enzyme (autocatalysis, for example, in trypsin) or certain chemical compounds (such as HCl in pepsinogen), the proenzyme is converted into the active form.
  • plO5Rb riboblastoma gene product
  • Cypl Cui Y. et al .: Journal of Cellular Biochemistry, 86 (4): 630-641, 2002;).
  • glycosaminoglycan (GAGS) to CypB (Allain F. et al .: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (5): 2714-2719, 2002).
  • ATFKBP12 The binding of ATFKBP12 to ATFIP37, an Arabidopsis protein (Faure JD Plant Journal 15 (6): 783-789, 1998).
  • proenzyme and cis / trans isomerase are necessary.
  • proenzyme and cis / trans isomerase may be advantageous to use proenzyme and cis / trans isomerase as separate, non-coupled molecules.
  • the proenzyme N-terminal and the cis / trans Isomerase C-terminal or the proenzyme C-terminal and the cis / trans isomerase N-terminal linkage may also be advantageous to combine one or more molecules of the proenzyme with one or more molecules of cis / trans isomerase in a wide variety of sequences.
  • the linking of these molecules can be done directly to each other, but also over the skilled person under the term "linker" summed connecting structures.
  • proenzyme and cis / trans isomerase may also be advantageous to use the proenzyme or cis / trans isomerase or the above-mentioned proenzyme and cis / trans isomerase construct on a water-soluble or insoluble support to bind.
  • a water-soluble or insoluble support As carriers, molecules with a molecular weight> 1000, but also surfaces, such as. Cuvettes or surfaces of the wells of titer plates often used for screening serve. Chemical coupling to such surfaces may be via covalent bonds, as will be apparent to those skilled in the art in a variety of coupling techniques (via linkers such as carbodiimide or disulfide bond).
  • the coupling can also be carried out by means of non-covalent methods, which are also known to the person skilled in the art in a broad spectrum of diverse methods (for example: Myszka DG, Energetics of Biological Macromolecules, pt c, 323 pg.
  • Preferred cis / trans isomerases for carrying out the process according to the invention via the interaction with a proenzyme are those cis / trans isomerases which, together with a suitable proenzyme, interact to such an extent that an EctIC reaction can be detected.
  • Suitable cis / trans isomerases should also be understood as meaning those molecules whose peptide sequence has been modified by a very wide variety of methods known to the person skilled in the art in such a way that neither by means of their molar mass nor of their peptide sequence does one react correspond to natural gene-encoded cis / trans isomerase, which, however, have cis / trans isomerase activity as a safe marker for a cis / trans isomerase under suitably optimized conditions.
  • Peptide sequence is to be understood as meaning the amino acid sequence which results from the chemical or biochemical assembly of natural or non-natural amino acids or their derivatives and which has a cis / trans isomerase activity in the correct three-dimensional conformation under optimal conditions.
  • Peptide sequence should also be understood as meaning the sequences in which one or more functional groups of amino acids have been altered by means of chemical or biochemical methods.
  • Assays for detecting cis / trans isomerase activity are known in the art and have been listed in part above. Suitable optimal conditions may require the addition of a wide variety of substances, such as suitable buffer substances, salts, chelators, emulsifiers, activators, inactivators, sugars and other substances, but also suitable physical parameters, such as a suitable reaction temperature.
  • the enzymatic action of the proenzyme can be significantly influenced and the influence can be reversed by inhibiting the cis / trans isomerase activity of the cis / trans isomerase.
  • the detection method of the EctIC reaction can be carried out here by quantification of the enzymatic reaction of the proenzyme. Detection methods for enzyme reactions are widely known to the person skilled in the art and are continuously available in the specialist press.
  • the detection of the EctIC reaction with the activated protease can take place by means of the protease reaction.
  • Suitable protease substrates are those substrates which allow the proteolytic To identify the activity of a protease activated by cis / trans isomerase activity by means of suitable detection methods. Detection methods of proteolytic activities have long been known and extensively published (eg: AU Kim JH et al .: Analytica Chimica Acta 577 (2): 171-177, 2006; Hamill et al .: Biological Chemistry.
  • protease detection methods with specific substrates, optimized for the proteolytic activity to be investigated, a whole series of methods are also described with which the proteolytic activity of numerous different proteases can be detected.
  • Kim J.H. et al. Fluorescence polarization assay described in Analytica Chimica Acta 577 (2006) 171-177
  • as a protease substrate a tetramethylrhodamine conjugated casein.
  • kinetic and endpoint methods in the above-described methods. Both types of methods can be used to detect an EctIC reaction when the proenzyme is a (pro-) protease, for example.
  • the kinetic method records changing parameters that correlate with the proteolytic reaction during the proteolytic reaction, depending on the reaction time before the end of the reaction. It then results in the application of values of the measurement signals obtained a relation to the course of the protease reaction.
  • An EctIC reaction for example, of a protease activated by the cis / trans isomerase activity can be recognized by the inhibition of the protease reaction after addition of an active substance which inhibits cis / trans isomerase activity.
  • Endpoint methods are usually characterized in that the enzymatic reaction is interrupted at a certain point in time and the reaction products formed up to this time or not yet up to this time fully reacted substrate of the enzymatic reaction is analyzed / quantified. For example, with knowledge of the course of the reaction, it is possible to conclude the reaction rate of the catalysis by means of calibration curves or calculation methods known to the person skilled in the art from the quantitative analysis of reaction product or starting substrate.
  • An EctIC reaction of a protease activated by the cis / trans isomerase activity can be recognized by the inhibition of the course of the protease reaction after addition of an inhibitor of the cis / trans isomerase activity.
  • EctlC reactions listed in items 1 to 8 above may require the addition of a wide variety of helper molecules to optimize the particular EctIC reaction.
  • buffering agents may be necessary to obtain a suitable proton concentration.
  • sugar molecules may be necessary to improve the physical consistency of the solution of ready-made test ingredients. It may also be necessary to use organic solvents, e.g. Ethanol or DMSO, e.g. to improve the solubility of the cis / trans isomerase activity effectors.
  • cytochemical methods for example methods which serve for the cytochemical representation of proteins in tissue sections or cell effusions (for example: Bendayan M .: Microscopy Research & Technique 57 (2002) 327-349; Lopez-Garcia C. et al.: Microscopy Research & Technique 56 (2002) 318-331; Boonacker E. and Van Noorden CJF: Journal of Histochemistry & Cytochemistry 49 (2001) 1473-1486; Nagata T: International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology, 211 (2001) 33-151; Bertoni-Freddari C. et al. : Micron. 32 (2001) 405-410; Bendayan M.: Biotechnic & Histochemistry.
  • tissue or cells are fixed with a variety of methods on a suitable object (such as a glass or plastic slide). Often here in tissues fixation by means of wax is made, which then allows the separation of fine tissue sections. Accordingly, tissue sections or cells after incubation with proenzyme and / or isomerase can be used to detect an EctlC reaction.
  • the incubation of cells with the proenzyme AvrRpt2 and a suitable fluorogenic substrate peptide such as Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO 2 ) amide, for the cytochemical detection of Cyclophilin be used.
  • a suitable fluorogenic substrate peptide such as Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO 2 ) amide
  • step d) and optionally according to step e) is carried out by means of an electrochemical, calorimetric, fluorimetric or luminescence method.
  • the substrate molecule is a fluorogenic peptide which measurably changes its fluorescence properties after proteolytic cleavage, and the determination according to step d) and optionally according to step e) is carried out by means of fluorescence measurement.
  • step d) and optionally according to step e) of the method according to the invention is preferably carried out by means of an endpoint method or a kinetic method.
  • Cis / trans isomerases from the group consisting of APIases and PPIases can be used in the process according to the invention. It is particularly preferred if the cis / trans Isomerase is selected from the family of FKBP 's, the cyclophilins or the family of parvulins.
  • cis / trans isomerases should also be understood as meaning those molecules whose peptide sequence has been modified by a very wide variety of methods known to the person skilled in the art so that they do not show either a natural, gene-encoded cis / trans Isomerase would be assigned, but which have cis / trans isomerase activity as a safe indicator for a cis / trans isomerase under suitable optimized conditions.
  • peptide sequence is meant the amino acid sequence which results from the chemical or biochemical assembly of natural or non-natural amino acids or their derivatives and which in the correct three-dimensional conformation has cis / trans isomerase activity under suitable conditions.
  • Peptide sequence should also be understood as meaning those sequences in which one or more functional groups of amino acids have been altered by means of chemical or biochemical methods.
  • Assays for detecting cis / trans isomerase activity are known in the art and have been listed in part above. Suitable conditions may include the addition of a wide variety of substances, e.g. suitable buffering agents, salts, chelators, emulsifiers, activators, inactivators, sugars and other substances, but also suitable physical parameters, e.g. a suitable reaction temperature.
  • the inventive method can be carried out in any containers usually. With regard to spectroscopic evaluations, however, it is preferred that the method is carried out on a titer plate or in a cuvette.
  • the cis / trans isorase and / or the substrate molecule and, if appropriate, the auxiliary molecule are immobilized on a carrier surface. It is preferred that the molecule (s) is / are immobilized by adsorption, by means of an antibody, by a covalent bond or by binding to biotin, avidin or streptavidin on the support surface.
  • the carrier surface is part of a detection strip.
  • test strips are to be understood as test strips, as used for example for pH determination.
  • the method is carried out in vivo.
  • the process is preferably carried out in eukaryotes or prokaryotes, whereby the effectuation is carried out by means of endogenously present isomerases as well as substrate molecules and exogenously added effectors.
  • the method according to the invention can also be carried out ex vivo, preferably by means of human body fluids.
  • tissue homogenates, cell suspensions, cell smears or Tissue sections performed in which the protease activity of PPIases and APIases and their effect is carried out by means of endogenously present in the respective media isomerases and substrate molecules and exogenously added effectors.
  • the present invention further relates to a kit for carrying out the method according to the invention, comprising a cis / trans isomerase and a substrate molecule which can be proteolytically cleaved by the cis / trans isomerase.
  • a kit for carrying out the method according to the invention comprising a cis / trans isomerase and a substrate molecule which can be proteolytically cleaved by the cis / trans isomerase.
  • the cis / trans isomerase and the substrate molecule can be developed according to the preferred embodiments of the method according to the invention.
  • the present invention further relates to a device for finding effectors which inhibit or activate the protease activity of cis / trans isomerases.
  • the device comprises a carrier material on whose surface a cis / trans isomerase and a substrate molecule are immobilized, it being possible for the substrate molecule to be proteolytically cleaved by the cis / trans isomerase.
  • the cis / trans isomerase and the substrate molecule can be developed according to the preferred embodiments of the method according to the invention.
  • the device according to the invention can also comprise an auxiliary molecule as described above immobilized on the substrate surface.
  • the device is designed as a detection strip.
  • the present invention relates to a method for finding effectors which inhibit or activate the protease activity of cis / trans isomerases
  • FIG. 1 Change in the concentrations of the cleavage products H-Gly-Trp-Tyr (NO 2 ) NH 2 (curve A) and Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-OH (curve B) and the concentration of the auxiliary molecule Abz-IIe-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO 2 ) NH 2 (curve C) at different reaction times.
  • FIG. 2 Change in fluorescence intensity over time after A) incubation of a hCypl8 / AvrRpt2 mixture with the excipient Abz-He-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide , B) incubation of a hCypl ⁇ (R55A) / AvrRpt2 mixture with the excipient Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide;
  • FIG. 3 Change in the fluorescence intensity over time after A) incubation of a hCypl8 / AvrRpt2 mixture with the excipient Abz-He-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide
  • Inset incubation of a hCypl8 / AvrRpt2 / Abz-He-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide mixture with the inhibitor cyclosporin A;
  • FIG. 4 Change in the concentration of the cleavage product H-Gly
  • Figure 6 H-Gly silver stained, 17.5% SDS gel.
  • Lane 1 molecular weight standards
  • Lane 2 sample before incubation at 37 0 C
  • Lanes 3,5 and 7 samples with FKBP inhibitor additive
  • Lanes 4,6 and 8 Samples without FKBP inhibitor additive. The samples were incubated for 1 h (lanes 3 and 4), 3 h (lanes 5 and 6) and 8 h (lanes 7 and 8) at 37 °.
  • FIG. 7 HPLC separation of a hydrolysis batch without CsA addition (a) after an incubation time of 130 h. Application of substrate removal during the incubation period with (b, squares) and without CsA addition (b, circles).
  • FIG. 8 Plot of product increase as area / time of the hydrolysis batch identified by HPLC and identified by MALDI with (a) and without (b) CsA addition. According to the HPLC / MALDI identification, square, circle or triangle represent fission products 1 to 3.
  • FIG. 9 Fluorescence spectrum of the substrate Atto425-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Gly-AEA-TAMRA (starting product (broken line) and end product (solid line).
  • FIG. 10 Cleavage kinetics of the substrate Atto425-Ile-Glu-Leu
  • a protease substrate which contains a fluorescence excitable moiety, the donor, and another part of the molecule, the quencher, wherein the quencher suppresses the excitability of the donor in the protease substrate. If a chemical bond between the quencher and the donor is separated by a protease, the donor can be excited, which can be qualitatively and quantitatively determined by means of devices suitable for fluorescence measurement.
  • Suitable donor-quencher pairs e.g. Aminobenzoic acid (Abz) as a donor and nitro-tyrosine as a quencher are known in the art. Methods to find suitable new pairs of donor and quencher are also fully described in the art.
  • -cis / trans isomerase solution 10 ⁇ M solution of hCypl ⁇ in 50 mM Hepes buffer, pH 7.8.
  • Substrate Molecule Solution Dissolve 2 mg / ml of Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide in dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a FluoroMax-2 fluorescence meter (Horiba Jobin Yvon Ine, USA) was used, which was excited to measure at a wavelength of 320 nm and measured at a wavelength of 418 nm. The measurement was carried out at a temperature of 20 ° C.
  • the cis / trans isomerase solution and the substrate molecule solution were mixed together with the initial concentration of the substrate molecule being 10 ⁇ M and that of hCypl8 being 2 ⁇ M.
  • the protease activity of hCypl ⁇ was confirmed by the registration of a fluorescence signal, which increased in intensity over time.
  • the example of the inhibition of the cis / trans isomerase activity of cis / trans isotnerases of the FKBP type shows how substrate molecules can be found that are proteolytically cleaved by these isomerases.
  • a basic prerequisite for finding corresponding substrate molecules according to this strategy is that the inhibition of the cis / trans isomerase activity of the isomerases also inhibits their protease activity.
  • Used for this purpose is a protein mixture, which is obtained in the homogenization of human blood cells and subsequent centrifugation.
  • lysis buffer 155 mM ammonium chloride, 10 mM sodium carbonate, 0.1 mM EDTA
  • the remaining blood cells were washed three times with 25 ml of isotonic saline solution at a temperature of 4 0 C, and then with 10 ml of 100 mM Tris buffer (pH 7.4) were mixed, aliquoted to each 500 ul at a temperature of -20 0 C stored. An aliquot of 500 ⁇ l was thawed, the cells contained therein were disrupted by ultrasound and the resulting suspension was then centrifuged for 5 minutes at 10,000 g. 180 ⁇ l of the supernatant were pipetted into an Eppendorf tube 2 times in each case.
  • the first vessel was treated with 20 ⁇ l of a 100 ⁇ M solution of dimethylcycloheximide (DMCHX, in 100 mM Tris buffer, pH 7.4) or the second vessel with 20 ⁇ l of corresponding Tris buffer.
  • DMCHX dimethylcycloheximide
  • the solutions of both vessels were incubated at a temperature of 37 0 C.
  • FIG. 6 shows the influence of the cis / trans isomerase inhibitor DMCHX on the protease activity of inhibited cis / trans isomerases.
  • the protein band indicated with A is more stable at about 38 kDa than without DMCHX inhibition.
  • protein bands in the region of ⁇ 20 kDa can be found to be increasingly amplified as potential degradation products of proteolysis by cis / trans isomerases.
  • Oligopeptide with and without inhibition of cis / trans isomerase activity Oligopeptide with and without inhibition of cis / trans isomerase activity
  • protease activity of cis / trans isomerases towards oligopeptides can be assessed by analysis of aliquots of the composition of the incubation mixture over the incubation period with a combination of chromatographic separation of the batch and subsequent mass spectrometry of the separated components of the approach to be determined.
  • the chromatographic separation allows the quantitative detection of changes in concentration of substrate molecule and occurring hydrolysis products.
  • Mass spectrometry makes it possible to assign the separate components of the measurement batch by means of their molecular mass.
  • FIG. 7a shows the chromatographic separation of an incubation batch of hCypl ⁇ with the substrate molecule without CsA as indicated below after 130 h.
  • the signals appearing at a retention time of about 24.8 min and 23 min could be assigned to the cis / trans isomerase hCypl ⁇ used or to the substrate molecule.
  • the signals between 10 and 20 min retention time could be assigned to the hydrolysis products of the substrate molecule.
  • the decrease of the initial concentration of the substrate molecule and the increase of the hydrolysis products over time can be graphically represented by analysis and evaluation of the experimental batch at different incubation times by means of samples taken from the experimental batch and their chromatographic behavior ( Fig. 2b, Fig. 3) and evaluate.
  • hCypl ⁇ inhibitor Cyclosporin A (CsA) CsA concentration in the approach: 50 ⁇ M
  • Incubation conditions incubation temperature: 20 ° C.
  • HPLC separation material Vydac-C8 HPLC gradient: 5-55% acetonitrile / aqua (0.1% TFA)
  • Example 4 Detection of an EctIC reaction by means of a fluorogenic substrate
  • a helper molecule Used as a helper molecule was a protease substrate containing a fluorescence excitable moiety, the donor, and another moiety, the quencher, wherein the Quencher suppresses the excitability of the donor in the protease substrate. If a chemical bond between the quencher and the donor is separated by a protease, the donor can be excited, which can be qualitatively and quantitatively determined by means of devices suitable for fluorescence measurement.
  • Suitable donor-quencher pairs such as aminobenzoic acid (Abz) as donor and nitro-tyrosine as quencher, are known in the art. Methods to find suitable new pairs of donor and quencher are well described in the art.
  • Hepes buffer pH 7.8.
  • Proenzyme (protease) solution 100 ⁇ M AvrRpt2 (mature AvrRpt2).
  • Auxiliary (protease substrate) solution Dissolve 2 mg / ml Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide in dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a fluorescence meter FluoroMax-2 (Horiba Jobin Yvon Ine, USA) was used; was excited at a wavelength of 320 nm; was measured at a wavelength of 418 nm and at a temperature of 20 0 C.
  • Example 5 Detection of an Inactive PPIase by EctlC Reaction and Fluorogenic Substrate
  • -cis / trans isomerase solution 10 ⁇ M solution of hCypl ⁇ (R55A) in 50 mM Hepes buffer, pH 7.8.
  • Proenzyme (protease) solution 100 ⁇ M AvrRpt2 (mature AvrRpt2).
  • Auxiliary (protease substrate) solution Dissolve 2 mg / ml Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide in dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a fluorescence meter FluoroMax-2 (Horiba Jobin Yv ⁇ n Ine, USA) was used; was excited at a wavelength of 320 nm; was measured at a wavelength of 418 nm and at a temperature of 20 ° C.
  • Example 6 Detection of a PPIase inhibitor by means of EctlC reaction and fluorogenic substrate
  • the PPIase activity of hCypl8 can be specifically inhibited by numerous known inhibitors.
  • the inhibition of PPIase activity of hCypl8 by the inhibitor cyclosporin A (CsA) is demonstrated by means of an EctIC reaction.
  • -cis / trans isomerase solution 10 ⁇ M solution of hCypl ⁇ (R55A) in 50 mM Hepes buffer, pH 7.8.
  • Proenzyme (protease) solution 100 ⁇ M AvrRpt2 (mature AvrRpt2).
  • Auxiliary (protease substrate) solution Dissolve 2 mg / ml Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amide in dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a fluorescence meter FluoroMax-2 (Horiba Jobin Yvon Ine, USA) was used; was excited at a wavelength of 320 nm; was measured at a wavelength of 418 nm and at a temperature of 20 0 C.
  • the example is based on the ability to separate starting product and cleavage products of proteolysis by chromatography from each other and then to quantify.
  • the EctIC reaction was investigated without and in the presence of the inhibitor hCypl ⁇ - CsA at a temperature of 10 0 C.
  • the reaction was started by addition of hCypl ⁇ . After 2, 4, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 20, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160 and 180 min, 100 ⁇ l of sample were removed and mixed with 4 ⁇ l (0.5 M). CsA stopped and frozen in N 2 i q or measured immediately. After rapid thawing of the (inhibited) samples, 80 ⁇ l were applied to a chromatography column (VydacCS) and washed with a water / HCN gradient of 15-60% (0.1% TFA) over 20 min chromatographed.
  • Figure 4 shows the detection of an EctlC reaction by product analysis by HPLC. Plotted are the concentrations (indicated as signal area of the
  • FIG. 5 shows evidence of an EctIC reaction by means of HPLC product analysis. Plotted are the concentrations (indicated as the signal area of the chromatographic curves) of the cleavage products H-Gly-Trp-Tyr (NO 2 ) NH 2 (curve A) and Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-OH (curve B) as well as the concentrations of the starting substrate Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Phe AIA-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO 2) 2 NH (curve C) at different reaction times at 10 0 C. the concentration of the auxiliary molecule in the measurement batch was 14 ⁇ M. 0.2 ⁇ M AvrRpt2 were used as the proenzyme and 1.8 ⁇ M hCypl ⁇ as the cis / trans isomerase.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von cis/trans Isomerase Effektoren und zum Quantifizieren der cis/trans Isomerase inhibierenden bzw. aktivierenden Wirkung entsprechender Effektoren.

Description

Verfahren zum Auffinden von Effektoren der Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von cis/trans Isomerase Effektoren und zum Quantifizieren der cis/trans Isomerase inhibierenden bzw. aktivierenden Wirkung entsprechender Effektoren.
Enzyme, welche die cis/trans- Isomerisierung von Peptid-Bindungen katalysieren können, werden als cis/trans Isomerasen bezeichnet. Zu den cis/trans Isomerasen (EC 5.2.1.8) gehören die Peptidyl- Prolyl-cis/trans Isomerasen (PPIasen) und die Sekundär-Amid- Peptidbindungs-cis/trans Isomerasen (APIasen) . Die Zuordnung von Enzymen zur Klasse der cis/trans Isomerasen erfolgt zumeist über Aminosäuresequenzidentitäts- oder -homologievergleiche der zuzuordnenden Enzyme mit den Aminosäuresequenzen bekannter cis/trans Isomerasen, über die Bestimmung der Katalyseeigenschaften der zuzuordnenden Enzyme sowie der Effektuierung dieser Katalyseeigenschaften mit verschiedenen Effektoren und/oder mittels auf der Grundlage von bekannten Vertretern der cis/trans Isomerasen generierter spezifischer Antikörper, die an Epitope binden, welche die spezifischen Eigenschaften der cis/trans Isomerasen bewirken.
Unabhängig von der Nomenklatur der weiter unten beschriebenen cis/trans Isomerase-Familien finden sich in der Literatur vereinzelt Bezeichnungen für bestimmte cis/trans Isomerasen, die auf besondere Eigenschaften dieser Enzyme zurückzuführen sind. So werden z.B. einige cis/trans Isomerasen gesondert unter der Bezeichnung „Immunophiline" zusammengefasst, da diese offensichtlich Zielmoleküle für immunsuppressiv wirkende Medikamente in der Humanmedizin darstellen (z.B.: Powell JD. Zheng Y.: Current Opinion in Investigational Drugs . 7(ll) :1002- 1007, 2006; Bell A. et al . : International Journal for Parasitology. 36 (3) : 261-276, 2006; He ZY. et al . : Plant Physiology. 134 (4) : 1248-1267 , 2004; Dugave C. : Current Organic Chemistry. 6 (15) : 1397-1431, 2002) . Andere cis/trans Isomerasen wiederum, wie z.B. das FKBP38, werden unter der Bezeichnung CaMAP' s zusammengefasst, da diese durch Calmodulin aktivierbar sind (z.B.: Edlich F. et al . : Journal of Biological Chemistry. 281(21) :14961-14970, 2006; Edlich F. et al.: EMBO Journal. 24 (14) :2688-2699, 2005) . Unabhängig von diesen gesonderten Bezeichnungen lassen sich jedoch alle cis/trans Isomerasen entweder den APIasen oder den PPIasen zuordnen und diesbezüglich wiederum entweder den Cyclophilinen, den FKBP' s oder den Parvulinen.
APIasen unterscheiden sich von den PPIasen dadurch, dass ihre cis/trans Isomerase-Aktivität auf die cis/trans-Isomerisierung sekundärer Amid-Peptidbindungen gerichtet ist (Schiene-Fischer C. et al.: Nature Structural Biology. 9 (6) : 419-424 , 2002; Schiene-Fischer C. et al . : Biological Chemistry. 383 (12) : 1865- 1873, 2002) . APIasen und die Hemmung ihrer APIase-Aktivität haben eine große Bedeutung in der Human- und Tiermedizin (z.B.: US 2006100130) .
Zu den PPIasen werden die Familien der Cyclophiline (Galat A. : Eur. J. Biochem. 216(1993)689-707; Hacker J. & Fischer G.: Mol. Microbiol 10(1993)445-456) , der FKBP's und der Parvuline gezählt .
Eine besondere Eigenschaft der Cyclophiline ist, dass sich ihre PPIase-Aktivität durch Cyclosporin A (z.B.: DD 281659) inhibieren lässt. Unter dem Begriff „Cyclophiline" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Enzyme verstanden, die eine PPIase-Aktivität aufweisen und die beispielsweise mittels üblicher Methoden des Sequenzvergleichs mit bekannten Cyclophilinen ermittelt werden können. Solche Methoden des Sequenzvergleichs sind in der Literatur umfassend beschrieben (z.B.: A. Galat: Arch. Bioch. & Biophys . 371(1999)149-162; I. T. Chou Sc CS. Gasser: Plant Mol. Biol. 35(1997)873-892; D. Roy et al.: Biochemical & Biophysical Research Communications 307(2003)422-429; J.W. Montague et al . : Journal of Biological Chemistry 272(1997)6677-6684) . Der Begriff „Cyclophiline" soll darüber hinaus auch solche Enzyme umfassen, die neben Homologien zu bekannten Cyclophilinen auch Homologien zu anderen PPlasen aufweisen, wie z.B. die kürzlich aufgefundenen und als FCB' s bezeichneten Enzyme (B. Adams et al . : Journal of Biological Chemistry 280(2005)24308-24314) .
Eine besondere Eigenschaft von cis/trans Isomerasen der FKBP- Familie ist es, dass sich deren cis/trans Isomerase-Aktvität mittels FK506 inhibieren lässt. Ebenso wie die Cyclophiline haben auch die FKBP' s und die Hemmung ihrer cis/trans Isomerase- Aktivität eine große Bedeutung in der Human- und Tiermedizin sowie bezüglich biochemischer und biotechnologischer Fragestellungen, wie dies beispielsweise in zahlreichen Publikationen dargelegt ist (z.B. : KR 2002024377, EP 1687443, JP 2006166845, AU 2002317841, EP 1666053, WO 2006042406, WO 2006012256, WO 2005063964) .
Die cis/trans Isomerase -Aktivität von Vertretern der Parvulin- Familie lässt sich weder mit Cyclosporin A noch mit FK506 bei einer Inhibitorkonzentrationen < 1 μM mit 10 -fächern molaren Überschuss an Hemmstoff signifikant hemmen. Für verschiedene Vertreter der Parvulin-Familie, nämlich das Parvulin aus Escherichia coli, das ESS1/PTF1 aus Saccharomyces cerevisiae und das humane Pinl, konnte eine spezifische irreversible Inhibierung durch den Naturstoff Juglon (5-Hydroxy-l, 4- naphtochinon) nachgewiesen werden (L. Hennig et al . : Biochemistry 37(1998)5953-5960) . Juglon ist ein aus der Walnuss isolierter Naturstoff mit sowohl bakteriostatischen und fungiziden als auch mit cytotoxischen Eigenschaften gegenüber eukaryotischen Zellen (z.B.: T. J. Monks et al . : Toxicol . Appl . Pharmacol. 112(1992)2-16; N. Didry et al . : Pharmazie 49 (1994) 681-683) .
Innerhalb der Parvulin-Familie wird zwischen zwei Gruppen von Enzymen unterschieden, die sich hinsichtlich ihrer Substratspezifität voneinander unterscheiden. Die erste Gruppe umfasst alle eukaryotischen Enzyme mit einer Spezifität für Substrate mit (PO3H2) Ser-/ (PO3H2) Thr-Resten vor dem Aminosäure- rest Prolin. Hierzu gehören u.a. das humane Pinl (hPinl) und das ESS1/PTF1 aus Hefe (z.B. : K.P. Lu et al . : Nature 380(1996)544- 547; S.D. Hanes et al . : Yeast 5(1998)55-72, J. Hani et al . : FEBS Lett. 365(1995)198-202) . Bisher bekannte prokaryotische cis/trans Isomerasen sowie einige der eukaryotischen Isomerasen sind hingegen nicht spezifisch für phosphorylierte Substrate. Sie werden in der zweiten Gruppe zusammengefasst . Auch Parvuline sowie die Hemmung ihrer PPIase-Aktivität sind in der Literatur Gegenstand von Diskussionen hinsichtlich ihrer Eignung als biochemisches oder biotechnologisches Werkzeug (z.B.: US6030826, US3798129) . Weitreichende Kenntnisse liegen bezüglich des Einsatzes von Parvulin- Inhibitoren als Wirkstoffe in der Human- und Tiermedizin in der Literatur vor (z.B.: WO 03093258, WO 03074001, US 2003096387, JP 2001316289) .
Die reversible Phosphorylierung von Ser/Thr-Resten spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation grundlegender zellulärer Prozesse. Die Regulation des eukaryotischen Zellzyklus unterliegt z.B. dem Prinzip einer zeitlich sehr genauen Abfolge von Aktivierungen verschiedener Signaltransduktionskaskaden. Dieser Prozess wird hauptsächlich durch Prolin-spezifische Ser/Thr- Phosphatasen und Kinasen gesteuert. Die reversible Phosphorylierung von Proteinen an Ser/Thr-Resten führt zu strukturellen Veränderungen von Proteinen und reguliert damit deren biologische Aktivität, beispielsweise in Bezug auf ihre Stabilität, enzymatische Aktivität oder auch ihre Bindungsaffinität gegenüber anderen Proteinen (E. A. Nigg Bioessays 17(1995)471-480) .
Das Auffinden und der Einsatz von cis/trans Isomerase-Effektoren wie Inhibitoren oder Aktivatoren ist neben dem medizinischen Interesse von großer Bedeutung auch in der wissenschaftlichen Literatur (z.B: J. F. Guichou et al . : J. Med. Chem. 49(2006)900- 910; Y. Q. Yu et al.: J. Med. Chem. 46(2003)1112-1115) und Gegenstand vieler Patentpublikationen (z.B.: US 2004204340, US 2003013645, US 2003068321, US 6270957, WO 2006033409, WO 2006005580, WO 2005097164, WO 2005021028) .
Für die immunsuppressive Wirkung von Cyclosporin A wird die Hemmung der Phosphatase -Aktivität der Proteinphosphatase Calzineurin durch einen Komplex aus Cyclosporin A und Cyclophilin 18 (z.B.: Rusnak F. & Mertz P.: Physiological Reviews 80(2000)1483-1521) angenommen. Dieser Mechanismus führte in der wissenschaftlichen Literatur auch zu dem Begriff der „ Immunophiline" , welcher PPIasen kennzeichnet, die zusammen mit einem PPIase-Inhibitor immunsuppressive Wirkungen zeigen (z.B.: Dugave C: Current Organic Chemistry 6(2002)1397-1431; Jorgensen K. A. et al.: Scandinavien Journal of Immunology 57(2003)93-98) . Das Auffinden der suppressiven Wirkung des Cyclophilin/Cyclo- sporin A-Komplexes auf das humane Immunsystem führte zu einer Reihe von pharmazeutisch wichtigen Anwendungen in der Humanmedizin (z.B.: Pollard S. et al . : Clinical Therapeutics 25(2003) 1654-1669) .
Neben der in der Transplantations-Medizin eingesetzten Immunosuppression durch Inhibition der PPIase-Aktivität von Cyclophilin mit Cyclosporin A wurden auch weitere, durch Inhibition von cis/trans Isomerasen bewirkte Effekte beobachtet, wie z. B. verstärktes Haarwachstum (z.B.: Gafter-Gvili A. et al.: Archives of Dermatological Research 296(2004)265-9; Shirai A. et al. : Journal of Dermatological Science 27(2001)7-13) , ein Einfluss auf die Haarergrauung (z.B.: Rebora J. et al . : International Journal of Dermatology 38(1999)229-230), eine breit anwendbare Wirkung auf Säugetierparasiten, wie z.B. auf das Malaria auslösende Plasmodium falciparum (z.B. : R. Kumar et al.: Molecular & Biochemical Parasitology 141(2005)29-37; A. Bell et al . : Biochemical Pharmacology 48(1994)495-503) und auf Trypanosomen (z.B. : J. Bua et al . : Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14(2004)4633-4637) , eine Wirkung auf Leishmania major Parasiten (z.B. : Meissner U. et al . : Parasitology Research 89(2003)221-227), eine Wirkung auf Echinococcen (z.B.: Colebrook A. L. et al.: Parasitology 125(2002)485-493) oder auf Nematoden (wie z.B.: Ma U. et al . : Journal of Biological Chemistry 277(2002)14925-14932) , eine Wirkung auf Chlamydien und Pneumokokken, eine Wirkung auf Viren, wie z.B. auf das Hepatitis C-Virus (HCV) oder das Dengue-Fieber auslösende Dengue-Virus und Retroviren, wie das HIV-Virus (z.B. Boss V. et al.: Molecular Pharmacology 54(1998)264-72), eine Wirkung auf Psoriasis (z.B.: Zachariae H. & Olsen T. S.: Clinical Nephrology 43(1995)154-8) und eine Wirkung auf das nephrotische Syndrom (z.B.: Noyan A. et al . : Nephron 70(1995)410-15) . Darüber hinaus konnten auch therapeutisch bedeutsame Wirkungen auf Nervenzellen (z.B.: Wong A., Cortopassi G.: Biochemical & Biophysical Research Communications 239(1997)139-45), auf Lungengewebe (z.B.: J.W. Eckstein & J. Fung: Expert Opinion on Investigational Drugs 12(2003)647-653) und auf Tumore (z.B.: T. Z. Wang et al . : Analytical Chemistry 76(2004)4343-4348; K. Kawano et al . : Cancer Research 60(2000)3550-3558) beobachtet werden. Eine große Anzahl dieser Effekte wurde durch die Anwendung des Wirkstoffs Cyclosporin A in der Transplantations- Medizin entdeckt und dort als Nebeneffekt beobachtet (z.B.: David-Neto E. et al . : Journal American Society Nephrology 11 (2000)343-9) .
Besonders gravierende Nebenwirkungen bei einer dauerhaften Therapie mit Cyclosporin A sind Schädigungen der Nieren, wie z.B. Nephrotoxizitat, Beeinflussung der glomerulären Filtration oder irreversible interstitiale Fibrosierung (z.B.: Kopp et al : Journal American Society Nephrology 1(1991)162-12), neurologische Veränderungen, wie z.B. das Auftreten eines Tremors (z.B.: De Groen et al . : New England Journal of Medicine 317(1987)861-74), vasculare Hypertension (z.B. : Kahan K. et al . : New England Journal of Medicine 321(1989)1725-33), die Bildung von Tumoren (z.B.: Kauffman L. et al . -. Transplantation 80(2005)883-889) und mit diesen Schädigungen zusammenhängende Komplikationen. Bekannt geworden sind auch Schädigungen der Leber oder Vergrößerungen des Peridontiums (z.B.: Tosti A. et al.: Drug Safety 10(1994)310-17; Borel J. F. et al . : Advances in Pharmacology 35(1996)79-114) .
Nähere Untersuchungen der Cyclosporin A-Wirkungen auf molekularer Ebene zeigten, dass sich ein Teil der beobachteten Effekte auf die Inhibierung der Proteinphosphatase Calzineurin zurückführen lassen. Durch Derivatisierung des Cyclosporins mit der Maßgabe der weitgehenden Beibehaltung der Raumstruktur des Cyclosporin A/Cyclophilin/Calzineurin-Komplexes (Jin. L. & Harrison S. C: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99(2002)13522-6) konnten Cyclophilin- Inhibitoren hergestellt werden, die die PPIase- Aktivität von Cypl8 hemmen können, wobei der Cypl8/Inhibitor- Komplex aber nicht mehr die Proteinphosphatase Calzineurin inhibiert (z.B: Zhang Y. X. et al . : J. of Biological Chemistry 280(2005)4842-4850) . Solche, die Proteinphosphatase Calzineurin im Komplex mit Cypl8 nicht inhibierenden Cypl8- Inhibitoren werden in der Literatur oft als „ nicht-immunosuppressive" Cyclophilin- Inhibitoren (non- immunosuppressive cyclophilin inhibitor Compounds) bezeichnet (z.B.: Carry J. C. et al . -. Synlett 2(2004)316-20; Evers M. et al . : Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 13(2003)4415-4419) . Allerdings gibt es in der Literatur zahlreiche Beispiele für niedermolekulare Wirkstoffe, die auch ohne eine Inhibierung der Proteinphosphatase Calzineurin zur Imraunosuppression beitragen. So zeigen z.B. PPIase-Inhibitoren wie Sirolimus oder Everolimus vergleichbare Wirkungen in der Transplantations- Immunologie wie Cyclosporin A, ohne dass diese Wirkstoffe in vitro die Proteinphosphatase Calzineurin inhibieren (z.B. Lisk W. et al . : Transplantation Proceedings 38(2006)69-73) . Darüber hinaus haben diese Wirkstoffe nicht die beobachtete Krebs auslösende Wirkung wie Cyclosporin A (z.B.: Kauffman et al . : Transplantation 80(2005)883-889). Während die Inhibierung von Calzineurin in Verbindung mit einer Erhöhung von TGF-ß zur Krebsprogression führt, konnte zumindest in Tierversuchen gezeigt werden, dass PPIase-Inhibitoren, die therapeutisch in der Transplantations- Immunologie angewendet werden und die Calzineurin nicht inhibieren, einen hemmenden Einfluss auf Tumorwachstum und Tumorangionese zeigen (z.B.: J. Andrassy et al . : Transplantation 80(2005)171-174; S. H. Kim et al . : Am J. Pathology 164(2004)1567- 1574; H. Yang et al . : J. of Surgical Res. 123(2005)312-319) . Neben einer großen Zahl wissenschaftlicher Aufsätze über den Nutzen von Cyclophilin-Inhibitoren in der Human- und Tiermedizin oder als biochemisches oder biotechnologisches Werkzeug gibt es ebenfalls eine große Zahl von Patentpublikationen, welche das große wirtschaftliche Interesse an Cyclophilinen und ihren Effektoren belegt (z.B. : KR 20040041458, CA 2541497, AU 2002259217, US 7041297, US 2006094646, WO 2006033409, JP 2006042803, CN 1698880, US 2005214317, US 2004157919, MXPA 03006666, US 2004053840, US 2003232815, MXPA 03004821, US 2004204340, US 2003013645, US 2003068787, CN 1379092, MXPA 02002578, US 2002165275, CN 1428348, WO 0248178) .
Da cis/trans Isomerasen sowie ihre Effektuierung im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Erkrankungen sowie kosmetischen Problemen stehen, besteht ein Bedarf an Verfahren, mit deren Hilfe sich das Vorliegen von cis/trans Isomerasen nachweisen lässt oder mit deren Hilfe sich Effektoren dieser Enzyme auffinden lassen, die das Potential haben, als Pharmaka eingesetzt zu werden.
Bekannte Assays, welche die Beschleunigung der cis/trans - Isomerisierung von Peptid-Bindungen durch cis/trans Isomerasen detektieren, lassen sich in direkte und indirekte Verfahren unterteilen. Direkte Assays (a-c) nutzen physikalische messbare Parameter aus, deren Größe direkt mit der Isomerisierung von cis/trans-Bindungen verknüpft sind. Indirekte Tests (d, e) nutzen entweder die durch die Isomerisierung veränderte Beschaffenheit einer zur Detektion benutzten Substanz aus oder benutzen isomerspezifische Reaktionsprinzipien.
a) Isomerspezifische Mobilität: Ist die elektrophoretische Mobilität geeigneter cis/trans Isomerase-Substrate für eis und trans-Isomer unterschiedlich, kann dieser Unterschied zur Detektion von cis/trans Isomerase-Aktivitäten benutzt werden. So ist es z. B möglich, die Geschwindigkeit der durch cis/trans Isomerasen katalysierten Gleichgewichtseinstellung von vorher separierten cis/trans-Isomeren anhand unterschiedlicher Mobilitäten mittels kapillarelektrophoretischer Untersuchungen, wie dies z.B. von M. Brandsch et al . (J. Biol. Chem. 1998, 273, 3861-3864) beschrieben wurde, zu analysieren. Nachteil dieser Methode ist der geringe Durchsatz von Analysen pro Zeiteinheit.
b) Isomerspezifische spektroskopische Unterschiede: Einige cis- und transIsomerase-Substrate weisen in Abhängigkeit von der Konfiguration voneinander verschiedene spektroskopische Eigenschaften auf. Eine cis/trans Isomerase bewirkt eine schnellere Einstellung des natürlichen Gleichgewichts eines ausgelenkten Gleichgewichts von eis- und trans- Isomeren. Die Einstellung des natürlichen Gleichgewichts kann in einem solchen Fall spektroskopisch verfolgt werden, wie dies z.B. von B. Janowski et al . (Analytical Biochemistry 1997, 252, 299-307) beschrieben wurde. Nachteile dieser Methode sind die geringen spektralen Änderungen, die hochempfindliche und daher teure Messgeräte zur Isomerase-Aktivitätsbestimmung erfordern. Ein weiterer Nachteil ist, dass es sehr schwierig ist, die Einstellung des cis/trans-Gleichgewichts abzustoppen, so dass Endpunktmessungen kaum möglich sind.
c) Isomerspezifische chemische Verschiebung bei Anwendung der magnetischen Kernresonanzspektroskopie (NMR) : Bestimmte cis/trans Isomerase-Substrate weisen kernresonanz- spektroskopische Unterschiede in der chemischen Verschiebung beider Konfigurationsisomere auf. Durch die in der NMR- Spektroskopie angewendeten Methoden wie Magnetisierungstransfer oder die Linienfortnanalyse kann die Wirkung von Isomerasen auf die cis/trans-Isomerisierungsgeschwindigkeit dieser Substrate quantifiziert werden, wie dies z.B. von D. Kern et al . (Biochemistry 1995 34, 13594-13602) beschrieben wurde. Nachteil dieser Methode sind die zur Messung notwendigen hohen Substratkonzentrationen .
d) Isomerspezifische Proteolyse: Durch die cis/trans - isomerspezif ische Substrathydrolyse mittels cis/trans- isomerspezifischer Proteasen kann aus der Eigentümlichkeit der Proteolysekinetik auf die Anwesenheit oder auf die Effektuierung anwesender cis/trans Isomerasen geschlossen werden, wie dies z.B. von G.Fischer et al . (Biomed.Biochim. Acta 43, 1101- 1111(1984) ) beschrieben wurde. Von Nachteil ist hierbei, dass hochkonzentrierte Proteasen eingesetzt werden müssen und dass die Halbwertszeit des Meßsignals verhältnismäßig kurz ist. Darüber hinaus ist dieser Test ungeeignet für cis/trans Isomerasen-Substrate, die gegenüber Proteasen resistent sind oder die nicht konfigurationsspezifisch abgebaut werden.
e) Renaturierung von Proteinen: Da cis/trans Isomerasen in zahlreich beschriebenen Verfahren (Liu CP. Zhou JM..- Biochemical & Biophysical Research Communications. 313 (3) : 509-515, 2004; Ow WB. et al. : Protein Science. 10 (11) : 2346-2353, 2001; Ideno A. et al.: Biochemical Journal. 357 (Part 2) : 465-471, 2001) die Renaturierung denaturierter Proteine beschleunigen können, kann die Beschleunigung dieser Renaturierung durch cis/trans Isomerasen zur Detektion der Aktivität von Isomerasen benutzt werden, wie dies z.B. von D. Kern et al . (Biocheraistry 1995 34, 13594-13602) beschrieben wurde. Nachteilig sind hier die relativ aufwendigen spektroskopischen Verfahren bzw. die Sensitivität solcher Assays gegenüber Substanzen, die in nicht die Isomerase- Aktivität beeinflussender Weise die Renaturierung des beobachteten Proteins beeinflussen. Ein weiterer Nachteil sind die für die Methode notwendigen hohen cis/trans Isomerasekonzentrationen, welche eine quantitative Bestimmung hochaffiner Inhibitoren verhindern können.
Ein weiterer Nachteil der aufgeführten Methoden ist weiterhin die verhältnismäßig große Menge an einzusetzendem Lösungsmittel, die erforderlich ist, um das natürliche Gleichgewicht zwischen eis- und trans-Isomer vor der Messung zu verschieben. Für die Auslenkung des Gleichgewichts eingesetzte Hilfssubstanzen, wie z.B. Trifluorethanol, sind in der Lage, cis/trans Isomerasen oder notwendige Proenzyme in einer für den Assay nachteiligen Weise zu effektuieren. Der größte Nachteil all der vorgenannten Verfahren ist jedoch, dass sie mit ausgelenkten Gleichgewichten von eis- zu trans -Isomeren arbeiten. Die zur Einstellung des Gleichgewichts benötigten Aktivierungsenergien sind verhältnismäßig gering, so dass die Gleichgewichtseinstellung auch ohne den Zusatz von cis/trans Isomerasen ablaufen kann. Um die Aktivität von cis/trans-Isomerasen messen zu können, wird deshalb oft bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur gearbeitet. Die Erkennung der cis/trans Isomerase-Aktivität ist dabei oft nur möglich, wenn es gelingt, die temporären Unterschiede der Reaktionskinetiken mit und ohne aktiver cis/trans Isomerase zu erfassen. Eine Bestimmung der cis/trans Isomerase-Aktivität mittels Endpunktmethode, also nach Ablauf der chemischen Reaktion ist bisher nur möglich, wenn es gelingt, die kinetischen Unterschiede der Reaktion mit und ohne cis/trans Isomerase-Aktivität durch geeignete Mittel einzufrieren, wie z.B. durch Absenkung der Temperatur bzw. -wie oben ausgeführt- durch Entfernung der durch die cis/trans-Katalyse umgesetzten Substrat- oder Produktmoleküle.
Im Unterschied zu den oben beschriebenen Nachweisverfahren von cis/trans Isomerase-Aktivitäten, welche durch chemische Reaktionen hervorgerufene quantitative Änderungen beobachten, ist es seit langem auch bekannt, dass cis/trans Isomerase- Aktivität in komplexen biologischen Systemen qualitative Änderungen hervorrufen kann. So führt die mittels gentechnischer Methoden mögliche Entfernung von cis/trans Isomerasen zu veränderten Phänotypen unterschiedlichster Lebewesen (z.B: Geisler M. et al . : Molecular Biology of the Cell. 14(10) :4238- 4249, 2003; Ansari H. et al . : Molecular & Cellular Biology. 22 (20) : 6993-7003, 2002; Bernhardt TG. et al . : Molecular Microbiology. 45 (1) : 99-108 , 2002; Metzner M. et al . : Journal of Biological Chemistry. 276 (17) : 13524-13529, 2001; DebRoy S. et al.: Infection & Immunity. 74 (9) : 5152-5160, 2006; Fanghanel J. et al.: FEBS Letters. 580 (13) : 3237-3245 , 2006; Ardon O. et al . : Journal of Virology. 80 (8) : 3694-3700, 2006) . In einigen wenigen Fällen konnte gezeigt werden, dass durch Hemmung der cis/trans Isomerase-Aktivität von cis/trans Isomerasen, welche sich räumlich abgrenzbaren zellulären Bereichen zuordnen lassen, wie z.B. Ionenkanälen, auch qualitative Effekte nachweisen lassen (z.B.: Nakagawa T. et al . : Nature. 434 (7033) : 652-658, 2005; Hansson MJ. et al: Journal of Bioenergetics & Biomembranes . 36 (4) :407-413, 2004; Waldmeier PC. et al . : Current Medicinal Chemistry. 10 (16) : 1485-1506 , 2003; Lin DT. et al . : Journal of Biological Chemistry. 277 (34) : 31134-31141, 2002) .
Der Unterschied, ob quantitative oder qualitative Änderungen durch Zusatz eines Katalysators beobachtet werden können, ist in der Regel mit der für die jeweilige Reaktion notwendigen Aktivierungsenergie verbunden. Während bei den oben aufgeführten, bisher bekannten Nachweisverfahren von cis/trans Isomerase -Aktivität die zum Reaktionsablauf notwendige Aktivierungsenergie so gering ist, dass die chemische/biochemische Reaktion schon bei Normalbedingungen auch ohne den Zusatz einer cis/trans Isomerase abläuft, kommt es in den erwähnten komplexen biologischen Systemen durch auf molekularer Ebene im Detail noch unverstandenem Zusammenwirken einzelner Moleküle oder ihrer funktionellen Gruppen zu Reaktionen, die erst in Gegenwart aktiver cis/trans Isomerasen ablaufen können.
Neben der cis/trans Isomerase-Aktivität , die - wie vorstehend beschrieben - auf die cis/trans -Isomerisierung von Peptidbindungen gerichtet ist, besitzen cis/trans Isomerasen, wie überraschend aufgefunden wurde, gegenüber bestimmten Substraten auch Proteaseaktivität .
Da, wie bereits vorstehend ausgeführt wurde, cis/trans Isomerasen im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Erkrankungen und kosmetischen Problemen stehen, besteht nunmehr auch ein Bedarf an Verfahren, mit deren Hilfe sich auf verfahrenstechnisch einfache und kostengünstige Weise Effektoren auffinden lassen, welche die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen beeinflussen, und ein Bedarf an Verfahren, mittels welchen die Proteaseaktivität inhibierende/aktivierende Wirkung entsprechender Effektoren quantifiziert werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mittels welchem sich auf verfahrenstechnisch einfache und kostengünstige Weise Effektoren auffinden lassen, welche die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen beeinflussen, und mittels welchem die die Proteaseaktivität inhibierende/aktivierende Wirkung entsprechender Effektoren quantifiziert werden kann.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, umfassend die Schritte des:
a) Bereitsteilens einer cis/trans Isomerase;
b) Inkontaktbringens der cis/trans Isomerase mit einem Substratmolekül, das von der cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten wird oder einem Proenzym, das von der cis/trans Isomerase aktiviert wird,-
c) Inkontaktbringens der cis/trans Isomerase mit einer Effektor-Kandidatsubstanz ;
d) Bestimmens, ob die Effektor-Kandidatsubstanz die Aktivität der cis/trans Isomerase inhibiert oder aktiviert;
und gegebenenfalls
e) Bestimmens des Ausmaßes der durch die Effektor- Kandidatsubstanz bewirkten Inhibierung bzw. Aktivierung der cis/trans Isomerase.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass sich mittels desselben auf verfahrenstechnisch einfache und kostengünstige Weise Effektoren auffinden lassen, die die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen inhibieren oder aktivieren.
Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass sich mittels desselben die die cis/trans Isomerase inhibierende/aktivierende Wirkung entsprechender Effektoren verfahrenstechnisch einfach und damit kostengünstig sowie zuverlässig quantifizieren lässt.
Ferner hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass mittels desselben Highthroughput-Screenings nach cis/trans Isomerase Effektoren durchgeführt werden können.
Es konnte ferner gezeigt werden, dass die die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen effektuierenden Substanzen (Effektoren) auch die cis/trans Isomerase-Aktivität der Isomerasen beeinflussen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit das Auffinden von Effektoren zur Inhibierung oder Aktivierung von cis/trans Isomerasen entweder anhand der proteolytischen Spaltung eines Substratmoleküls durch die cis/trans Isomerase oder mittels des Proenzyms, das von der cis/trans Isomerase aktiviert wird.
Wird das Verfahren anhand der proteolytische Spaltung eines Substratmoleküls durchgeführt, so ist es gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels des Substratmoleküls und/oder mittels zumindest eines Substratmolekülfragmentes erfolgt, welches durch die durch die cis/trans Isomerase bewirkte proteolytische Spaltung des Substratmoleküls generiert wird. Die Bestimmung der Proteaseaktivität mittels des Substratmoleküls und/oder mittels von Hydrolyseprodukten des Substratmoleküls benötigt nur eine geringe Menge an Substratmolekül bzw. -fragmenten und ist verfahrenstechnisch einfach und daher besonders kostengünstig durchführbar. Falls die Bestimmung gemäß Schritt d) zu dem Ergebnis führt, dass es sich bei der Kandidatsubstanz um einen Effektor handelt, so kann - wenn gewünscht - eine Quantifizierung der inhibierenden/aktivierenden Wirkung des Effektors auf die Proteaseaktivität erfolgen. Dabei kann die Quantifizierung der inhibierenden/aktivierenden Wirkung ebenfalls mittels des Substratmoleküls und/oder mittels zumindest eines Substratmolekülfragmentes erfolgen oder auch mittels anderer Parameter oder Methoden. Dasselbe gilt analog für Substrate (Hilfsmolekül) , die von dem aktivierten Proenzym umgesetzt worden sind.
Die Bestimmungen gemäß der Verfahrensschritte d) und e) können hierbei mittels Auswertung verschiedener oder gleicher Parameter oder unter Anwendung unterschiedlicher oder gleicher Methoden durchgeführt werden.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform ist es vorgesehen, dass das Substratmolekül ein Molekül ist, dessen erfolgte proteolytische Spaltung spektroskopisch nachgewiesen werden kann. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Substratmolekül bzw. das Substrat, das von dem aktivierten Proenzym -wenn dieses eine Pro-Protease istumgesetzt wird, ein fluoreszenzmarkiertes Oligo- oder Polypeptid ist, das nach proteolytischer Spaltung seine Fluoreszenzeigenschaften ändert. Vorzugsweise ist das Substratmolekül ein fluoreszenzmarkiertes Oligopeptid mit bis zu 12 Aminosäureresten.
Die einzusetzende cis/trans Isomerase mit Proteaseaktivität ist vorzugsweise substratspezifisch bezüglich des eingesetzten Substratmoleküls .
Die bislang aufgefundenen Paare von cis/trans Isomerase und Substratmolekül, das von der zugehörigen cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten wird, zeigen, dass die Aktivierungsenergie zur proteolytischen Spaltung einer Peptidbindung durch die cis/trans Isomerase nur verhältnismäßig wenig herabgesetzt wird, so dass die durch cis/trans Isomerasen katalysierte proteolytische Spaltung von Peptiden verhältnismäßig langsam verläuft. Entsprechend ist gemäß einer weiter bevorzugten Aus führungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass die cis/trans Isomerase mit einem Hilfsmolekül in Kontakt gebracht wird, welches die Proteaseaktivität der cis/trans Isomerase erhöht. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Hilfsmolekül um ein Protein oder um ein Peptid oder um ein organisches Molekül, wobei das organische Molekül eine Masse von kleiner/gleich 2.000 Da aufweist. Durch diese Maßnahme wird ein schnelleres und damit kostengünstigeres Screenen nach Effektorsubstanzen der Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen ermöglicht. Als Hilfsmolekül können dabei beispielsweise mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundene, die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen aktivierende Effektoren wie Peptide, Proteine oder ein Masse von kleiner/gleich 2.000 Da aufweisende organische Moleküle eingesetzt werden. Unter dem Begriff „Peptid" wird dabei ein Polypeptid mit weniger als 12 Aminosäureresten verstanden. Ab 12 Aminosäureresten ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Proteinen die Rede.
Die vorliegende Erfindung betrifft in diesem Zusammenhang ferner ein Verfahren zum Auffinden von Substratmolekülen, welche von cis/trans Isomerasen proteolytisch gespalten werden, umfassend die Schritte des
a) Bereitsteilens einer cis/trans Isomerase;
b) Inkontaktbringens der cis/trans Isomerase mit einer Substratmolekül -KandidatSubstanz;
c) Bestimmens, ob die Substratmolekül-Kandidatsubstanz proteolytisch gespalten wird. Mittels dieses Verfahrens können auf verfahrenstechnisch einfache Weise Substratmoleküle aufgefunden werden, die von cis/trans Isomerasen proteolytisch gespalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht desweiteren das Auffinden von Effektoren, welche die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen inhibieren oder aktivieren, und zum Quantifizieren der inhibierenden bzw. aktivierenden Wirkung entsprechender Effektoren auf die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen mittels des Inkontaktbringens der cis/trans Isomerase mit einem Proenzym, das mit der cis/trans Isomerase in Wechselwirkung tritt.
Die im Stand der Technik bekannten Reaktionen, die durch cis/trans Isomerasen katalysiert werden, weisen allesamt eine derart niedrige Aktivierungsenergie auf, dass sie bei Raumtemperatur auch ohne Isomerase-Zusatz ablaufen können. Die cis/trans Isomerase dient in diesen Reaktionen daher nur als Reaktionsbeschleuniger . Überraschend konnte nun gezeigt werden, dass für cis/trans Isomerasen auch Reaktionen existieren, die erst durch den Zusatz von cis/trans Isomerasen mit signifikanter Reaktionsgeschwindigkeit ablaufen können und die sich durch Hemmung/Aktivierung der cis/trans Isomerase-Aktivität mittels geeigneter Effektoren wieder unterbinden bzw. weiter aktivieren lassen.
So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die proteolytische Aktivität von AvrRpt2 gegenüber entsprechenden Substraten nur durch die Anwesenheit bestimmter cis/trans- Isomerasen mit einer geeigneten cis/trans Isomerase-Aktivität signifikant generiert und aufrechterhalten werden kann, wobei sich diese Generierung der proteolytischen Aktivität durch gegen die cis/trans Isomerase-Aktivität gerichtete Inhibitoren signifikant und quantifizierbar effektuieren lässt. Zur sprachlichen Abgrenzung von den bislang bekannten chemischen/biochemischen Reaktionen, mit deren Hilfe sich cis/trans Isomerasen nachweisen lassen, werden diese neu aufgefundenen Reaktionen, welche nur durch Zusatz von nicht inhibierten cis/trans Isomerasen mit signifikanter Reaktionsgeschwindigkeit ablaufen, „Essentielle cis/trans Isomerase-Catalysis" (EctIC) genannt.
EctIC-Reaktionen werden bevorzugt beispielsweise von den „herkömmlichen", d.h. bekannten durch cis/trans Isomerasen katalysierbaren Reaktionen, durch Vergleich des Verhältnisses von unkatalysierter und katalysierter Reaktionsgeschwindigkeit der mit dem Proenzym gemessenen Reaktion abgegrenzt. Unter Reaktionsgeschwindigkeit soll dabei die Reaktionsgeschwindigkeit verstanden werden, die unter ermittelbaren besten Bedingungen beobachtet werden kann. Dazu werden in einem ersten Schritt die physikalischen/chemischen/biochemischen Parameter optimiert, die bei Zusatz einer geeigneten Menge an cis/trans Isomerase zur maximalen Reaktionsgeschwindigkeit am Proenzym führen. In einem zweiten Schritt wird die Reaktionsgeschwindigkeit unter den gleichen Bedingungen nur ohne cis/trans Isomerase- Zusatz bestimmt . Ist unter den ermittelten Bedingungen das Verhältnis von katalysierter Reaktionsgeschwindigkeit zur unkatalysierter Reaktionsgeschwindigkeit größer als 10 und lässt sich durch Zusatz von cis/trans Isomerase- Inhibitoren eine Reaktionsgeschwindigkeit bezüglich des Proenzyms erhalten, die der ohne cis/trans Isomerase- Zusatz entspricht, so handelt es sich im um eine EctIC-Reaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung. Bisher bekannte kinetische Nachweisverfahren hinsichtlich cis/trans Isomerasen besitzen, bedingt durch die schnell ablaufende unkatalysierte Reaktion, z.B. für die Beobachtung der Katalyse von cis/trans-Isomerisierungen in Peptidyl-Prolyl- Peptidbindungen, mit Geschwindigkeitskonstanten für die cis- nach trans- bzw. trans- nach cis-Reaktion von >10"3 s"1 bei Raumtemperatur ein nur sehr kleines Zeitfenster von wenigen Sekunden, um die Inhibierung einer enzymatisch katalysierten cis/trans-Isomerisierung nachzuweisen. Oft muß die gesamte nichtlineare Umsatzkurve einer typischen cis/trans Isomerase- Aktivitätsbestimmung vermessen werden und nach nichtlinearen Auswertemodellen verrechnet werden, um cis/trans Isomerase- Aktivitäten quantifizieren zu können. Demgegenüber können, wie mittels der Beispiele dokumentiert, EctIC-Reaktionen diese Beschränkungen umgehen. Sowohl EndpunktbeStimmungen als auch lineare Kinetiken - dem Fachmann als „Anfangsgeschwindigkeitsmessung" bekannt - sind mittels EctIC-Reaktion zur Bestimmung von cis/trans Isomeraseaktivitäten möglich.
Die molekularen Grundlagen von EctIC-Reaktionen sind noch weitgehend unbekannt und können beispielsweise sowohl die cis/trans-Katalyse einer Peptidbindung des Proenzyms als auch die spezifische Bindung an das Proenzym beinhalten. So kann es durch cis/trans-Isomerisierung einer oder mehrerer Peptidbindungen des Proenzyms zu einer solchen Flexibilität chemischer Funktionalitäten des Proteins kommen, dass das Proenzym seine Eigenschaften so ändert, dass es als Proenzym zum Nachweis einer EctIC-Reaktion geeignet ist. Die katalytische Aktivität der cis/trans Isomerase am Proenzym kann aber auch die cis/trans-Isomerisierung des am Proenzym gebundenen Enzymsubstrates sein oder des mit dem Proenzym ganz allgemein wechselwirkenden Substrates sein, wobei unter gebundenem Enzymsubstrat im Sinne der vorliegenden Erfindung auch alle durch die Katalyse des Proenzyms zum Produkt führenden Zwischenstufen des Enzymsubstrates einschließlich sich abspaltender Reste oder das Produkt selbst verstanden werden sollen.
Ist die Bindung der cis/trans Isomerase an das Proenzym selbst und nicht die Katalyse der cis/trans-Isomerisierung am Proenzym oder gebundenem Peptidsubstrat Ursache einer EctIC-Reaktion, können die molekularen Grundlagen der Beeinflussung des Proenzyms in einer Änderungen der dreidimensionalen Struktur des Komplexes zwischen Proenzym und cis/trans Isomerase zu finden sein. Solche, durch Proteininteraktion sich ändernde qualitative Eigenschaften einer der Bindepartner sind seit längerem für zahlreiche Proteininteraktionen beschrieben und nachstehend näher ausgeführt. Niemals aber wurde bisher beobachtet, dass eine cis/trans Isomerase durch Wechselwirkung mit einem Proenzym dessen Eigenschaften qualitativ so verändert, dass eine EctlC- Reaktion beobachten werden kann und dass diese durch die cis/trans Isomerase ausgelöste Veränderung des Proenzyms durch die cis/trans Isomerase-Aktivität effektuierende Effektoren so verändert werden kann, dass ein Zustand des Proenzyms erreicht wird, welcher dem des Proenzyms ohne Effektuierung durch die cis/trans Isomerase entspricht.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass das Bestimmen, ob das Proenzym die Eigenschaft aufweist, bzw. dass das Bestimmen des Ausmaßes der Eigenschaft des Proenzyms mittels eines Hilfsmoleküls erfolgt, der mit dem Proenzym in Abhängigkeit von dem Ausmaß der Eigenschaft in Wechselwirkung tritt. Es wurde festgestellt, dass die genannten Bestimmungen mittels eines Hilfsmoleküles verfahrenstechnisch einfacher durchgeführt werden können im Vergleich zu einer direkten Bestimmung an dem Proenzym.
Entsprechend einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass das Hilfsmolekül eine Substanz ist, mittels der eine erfolgte Wechselwirkung mit dem Proenzym spektroskopisch nachgewiesen werden kann. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, wenn das Hilfsmolekül ein fluorogenes Molekül ist, das bei Wechselwirkung mit dem Proenzym seine spektroskopischen Eigenschaften ändert.
Da durch Wechselwirkung des Proenzyms mit der cis/trans Isomerase eine enzymatische Aktivität des Proenzyms hervorgerufen wird, wird gewährleistet, dass die Bestimmungen gemäß der Schritte d) und e) des erfindungsgemäßen Verfahrens auf verfahrenstechnisch einfache Weise mittels einer Aktivitätsbestimmung des aktivierten Enzyms durchgeführt werden können .
Wird das erfindungsgemäße Verfahren über die Wechselwirkung einer cis/trans Isomerase und eines Proenzyms durchgeführt, ist es bevorzugt, wenn das Hilfsmolekül ein entsprechendes Enzymsubstrat für das aus dem Proenzym generierte Enzym ist. Für eine besonders genaue Bestimmung gemäß der Schritte d) und e) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es hier von Vorteil, wenn das eingesetzte Enzymsubstrat für das aus dem Proenzym generierte Enzym spezifisch ist.
Entsprechend einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Proenzym AvrRpt2. Es wurde festgestellt, dass sich mittels des Proenzyms AvrRpt2 Ectlc- Reaktionen durchführen lassen, die besonders sensitiv auf Effektoren reagieren.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann es vorgesehen sein, dass die Bestimmung gemäß Schritt d) bzw. e) anhand des Enzymsubstrats und/oder anhand des durch das generierte Enzym umgesetzten Substrats erfolgt.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es besonders bevorzugt, wenn die durch die cis/trans Isomerase generierte Eigenschaft des Proenzyms proteolytische Aktivität ist, da proteolytische Aktivität verhältnismäßig einfach anhand des Enzymsubstrats oder der daraus resultierenden Fragmente festgestellt und quantifiziert werden kann
Besonders bevorzugt ist es, dass die Eigenschaft, die durch die cis/trans Isomerase bei dem Proenzym generiert wird, proteolytische Aktivität ist, der Hilfsmolekül ein fluorogenes Oligopeptid ist, das nach proteolytischer Spaltung seine Fluoreszenzeigenschaften ändert, und die Bestimmung gemäß Schritt d) bzw. e) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Fluoreszenzmessung erfolgt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich sowohl inhibierende als auch aktivierende Effektoren auffinden. Entsprechend ist bevorzugt, dass der Effektor ein Inhibitor oder ein Aktivator ist.
Wie vorstehend ausgeführt wird das Proenzym durch eine cis/trans Isomerase in die aktive Form überführt.
Die aufgefunden EctIC-Reaktionen können auch dazu genutzt werden, um PPIase- oder APIase-Aktivitäten zu messen, z.B. in biologischen Flüssigkeiten wie Blut-Serum, Blutplasma, Liquor, Urin bzw. Gewebshomogenaten. Dazu ist besonders ein Verfahren bevorzugt, umfassen die Schritte des:
a) Bereitstellens eines Proenzyms, das mit einer cis/trans Isomerase in Wechselwirkung treten kann und durch die Wechselwirkung bei dem Proenzym eine Eigenschaft hervorgerufen wird, deren Ausmaß von der Aktivität der cis/trans Isomerase abhängig ist;
b) Inkontakbringens des Proenzyms mit einer Probe, die daraufhin zu untersuchen ist, ob in dieser eine oder mehrere cis/trans Isomerasen vorliegen;
c) Bestimmens, ob das Proenzym die Eigenschaft aufweist;
oder
d) Bestimmens des Ausmaßes der Eigenschaft des Proenzyms. Durch die Wechselwirkung mit der cis/trans Isomerase wird die enzymatische Wirkung des Proenzyms signifikant beeinflusst. Als signifikante Beeinflussung wird vorzugsweise die Verminderung der molaren Katalysekonstante, gemessen unter den für diese Katalyse geeigneten Bedingungen, um den Faktor 10 verstanden.
Dass cis/trans Isomerasen mit einem zweiten Protein unter Ausbildung eines Heterodimeren Bindungen eingehen können oder dass auch heteromere Komplexe mit mehreren verschiedenen Proteinen und kleineren Liganden entstehen können, ist seit längerem bekannt (z.B.: Cell. 87 (7) : 1157-1159, 1996; Journal of Biological Chemistry. 282 (47) : 34148-34158 , 2007; Biochemistry . 46 (26) :7832-7843, 2007; Analytical Biochemistry. 359 (2) : 285-287 , 2006; Biochemical & Biophysical Research Communications. 321(3) :638-647, 2004; Endocrine . 20 (1-2) : 83-89, 2003) . Umfassende Untersuchungen von Interaktionen und Methoden zur Untersuchung von Interaktionen sind zahlreich beschrieben, wie z.B. z.B. Parrish JR. et al . in Current Opinion in Biotechnology. 17 (2006) : 387-393 ; Ito T. et al . Trends in Biotechnology. 19(10 Suppl S) :S23-S27, 2001) Der Begriff Proenzym beschreibt im allgemeinen inaktive Enzymvorstufen. Solche inaktiven Enzymvorstufen sind z.B. für Pepsinogen oder Chymotrypsinogen bekannt. Erst durch den Zusatz anderer Enzyme oder das Einwirken des gleichen Enzyms (Autokatalyse z. B. bei Trypsin) oder bestimmter chemischer Verbindungen (wie z. B. HCl bei Pepsinogen) wird das Proenzym in die aktive Form überführt.
Ebenso gibt es zahlreiche Beispiele in der Literatur, die belegen, dass durch die Wechselwirkung unterschiedlichster Proteine miteinander, einschließlich der Bindung zu weiteren Liganden, Eigenschaften dieser Komplexe nachweisbar sind, welche von den Eigenschaften der einzelnen Bestandteilen solcher Komplexe abweichen und auch nicht die Summation der Eigenschaften der einzelnen Bestandteile darstellen. Allerdings konnte trotz der zahlreichen bisher entdeckten Proteinkomplexe, welche cis/trans Isomerasen enthalten, bisher kein Hinweis auf eine EctIC-Reaktion gefunden werden. Publizierte Beispiele von Interaktionen zwischen cis/trans Isomerasen und anderen Proteinen sind z.B.:
• die SR-cyclophilin- Interaktion zu Pinin (Lin CL. et al . Biochemical & Biophysical Research Communications, 321(3) -.638-647, 2004) .
• die Interaktionen zwischen Hitzeschockproteinen und verschiedensten cis/trans-Iosomerasen wie Cyp40, FKBP51 und FKBP52 (Carrello A. et al . : Cell Stress & Chaperones .
9 (2) :167-181, 2004) .
• die Bindung von Cypl8 an das HlVl-virion (BonHomme M. et al.: Biophysical Chemistry. 105 (1) : 67-77, 2003.
• die Interaktion von CypH und Spliceosom (Ingelfinger D. et. al: Nucleic Acids Research. 31 (16) : 4791-4796, 2003) .
• die Bindung zwischen plO5Rb (Riboblastom-Genprodukt) und Cypl (Cui Y. et al . : Journal of Cellular Biochemistry . 86(4) :630-641, 2002;) .
• die Bindung von Glycosaminoglycans (GAGS) an CypB (Allain F. et al. : Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (5) : 2714-2719, 2002) .
• die Bindung eines pflanzlichen Cyclophilins (ROC7) an die Proteinphosphatase PP2A (Jackson K. Soll D.: Molecular & General Genetics. 262 (4-5) : 830-838 , 1999) ; Bindung von Cypl8 an Calreticulin (Reddy PA. Atreya CD. : International Journal of Biological Macromolecules . 25 (4) : 345-351, 1999) .
• die Interaktion zwischen CypH und der Adenin-Nucleotid- Translocase (Biochemical Journal. 336{Part 2) :287-290, 1998) .
• die Bindung von FKBP12,6 an den Ryanodin-Rezeptor (Huang FN. Et al . : Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (9) : 3456-3461 , 2006) .
• die Interaktion von Presenilinen mit FKBP38 (Wang HQ. et al.: Human Molecular Genetics. 14 (13) : 1889-1902, 2005) .
• die Bindung von FKBP51 an Calzineurin (Li TK. Et al . : Journal of Cellular Biochemistry . 84 (3) : 460-471, 2002) .
• die Bindung von Hsp90 an FKBP52 (Galigniana MD. Et al . : Journal of Biological Chemistry. 276 (18) : 14884-14889, 2001) .
• die Interaktion von FAP48 mit FKBP12 und FKBP52 (Neye H. : Regulatory Peptides. 97 (2-3) : 147-152, 2000) .
• die Bindung von ATFKBP12 zu ATFIP37, einem Arabidopsisprotein (Faure JD. Plant Journal. 15 (6) : 783-789, 1998) .
• die Bindung von FKBP12 zu TGF (Okadome T. et al . : Journal of Biological Chemistry. 271 (36) : 21687-21690 , 1996) .
• die Interaktion zwischen Pinl und Nek6 (Chen J. et al . : Biochemical & Biophysical Research Communications. 341(4) :1059-1065, 2006) . • die Wechselwirkung zwischen der Protein-Kinase CK2 and Pinl (Messenger MM. Et al . : Journal of Biological Chemistry. 277(25) =23054-23064, 2002) .
In keinem der bisher publizierten und oben in Auszügen summierten Beispiele konnte bisher eine Reaktion, welche einer EctIC-Reaktion entspricht, beobachtet werden. Oft wird sogar berichtet, dass durch die Bindung eines Proteins an eine cis/trans Isomerase deren aktives Zentrum scheinbar so verdeckt wird, dass für cis/trans Isomerasen hochaffine Effektoren nicht mehr an das aktive Zentrum binden können (z.B.: Journal of Cellular Biochemistry . 86 (4) : 630-641, 2002; Li TK. Et al . : Journal of Cellular Biochemistry. 84 (3) :460-471, 2002) . Wird wiederum eine Effektuierung der Bindung zwischen einer cis/trans Isomerase und einem weiteren Protein durch einen cis/trans Isomerase-Inhibitor beobachtet, wie z.B. bei der Bindung von CypH an die Adenine Nucleotide Translocase (Biochemical Journal. 336(Part 2) :287-290, 1998) oder der Bindung eines FKBP's an ein pflanzliches Protein (Faure JD. Plant Journal. 15 (6) : 783-789, 1998) , ist eine Effektuierung des potentiellen Proenzyms (hier die Translocase) nicht zu beobachten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Wechselwirkung zwischen Proenzym und cis/trans Isomerase notwendig. Zur Durchführung eines Assays kann es von Vorteil sein, Proenzym und cis/trans Isomerase als getrennte, nicht miteinander gekoppelte Moleküle zu verwenden. Es kann aber ebenso von Vorteil sein, um bespielsweise Testsysteme zu vereinfachen, Proenzym und cis/trans Isomerase mittels chemischem Linker miteinander zu verbinden oder mittels dem Biochemiker bekannten gentechnischen Methoden als Fusionsprotein herzustellen, bei dem Proenzym und cis/trans Isomerase miteinander verbunden sind. Dabei kann es von Vorteil sein, das Proenzym N-terminal und die cis/trans Isomerase C- terminal oder aber das Proenzym C- terminal und die cis/trans Isomerase N-terminal miteinander zu verknüpfen. Es kann aber auch von Vorteil sein, eines oder mehrere Moleküle des Proenzyms mit einem oder mehreren Molekülen cis/trans Isomerase in unterschiedlichsten Reihenfolgen miteinander zu verknüpfen. Die Verknüpfung dieser Moleküle kann direkt aneinander, aber auch über dem Fachmann unter dem Begriff „Linker" summierten Verbindungsstrukturen erfolgen.
Neben der Verknüpfung von Proenzym und cis/trans Isomerase mittels chemischer oder gentechnischer Techniken kann es auch von Vorteil sein, das Proenzym oder die cis/trans Isomerase oder das oben erwähnte Konstrukt aus Proenzym und cis/trans Isomerase an einen in Wasser löslichen oder unlöslichen Träger zu binden. Als Träger können Moleküle mit einem Molekulargewicht >1000, aber auch Oberflächen, wie z.B. Küvetten oder oft zum Screening genutzte Oberflächen der Kavitäten von Titerplatten dienen. Die chemische Kopplung an solche Oberflächen kann über kovalente Bindungen, dem Fachmann sind hier eine ganze Reihe von Kupplungsmethoden (über Linker wie z.B. mittels Carbodiimid oder Disulfidbrückenbindung) bekannt, erfolgen. Die Kuppelung kann aber auch mittels nicht-kovalenter Methoden, auch hier sind dem Fachmann ein breites Spektrum vielfältiger Methoden bekannt, ausgeführt werden (z.B.: Myszka DG. Energetics of Biological Macromolecules, pt c. 323 pg. 325-. 2000).
Bevorzugte cis/trans Isomerasen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens über die Wechselwirkung mit einem Proenzym sind solche cis/trans Isomerasen, welche zusammen mit einem geeignetem Proenzym eine solche Wechselwirkung eingehen, dass eine EctIC-Reaktion nachweisbar ist. Unter geeigneten cis/trans Isomerasen sollen auch solche Moleküle verstanden werden, deren Peptidsequenz durch unterschiedlichste, dem Fachmann bekannte Methoden, so verändert wurde, dass sie weder anhand ihrer molaren Masse, noch ihrer Peptidsequenz einer natürlichen Gen-kodierten cis/trans Isomerase entsprechen, welche aber als sicheres Kennzeichen für eine cis/trans Isomerase unter geeigneten optimierten Bedingungen cis/trans Isomerase-Aktivität aufweisen. Unter Peptidsequenz soll die Aminosäuresequenz verstanden werden, welche sich aus dem chemisch oder biochemischen Zusammenfügen natürlicher oder nicht-natürlicher Aminosäuren oder ihrer Derivate ergibt und welche in der richtigen dreidimensionalen Konformation unter optimalen Bedingungen eine cis/trans Isomerase-Aktivität aufweist. Unter Peptidsequenz sollen auch die Sequenzen verstanden werden, bei denen eine oder mehrere funktionelle Gruppen von Aminosäuren mittels chemischer oder biochemischer Methoden verändert wurden. Assays zum Nachweis der cis/trans Isomerase-Aktivität sind dem Fachmann bekannt und wurden teilweise oben aufgeführt. Geeignete optimale Bedingungen können den Zusatz unterschiedlichster Substanzen, wie z.B. geeignete Puffersubstanzen, Salze, Chelatoren, Emulgatoren, Akitvatoren, Inaktiviatoren, Zucker und weitere Substanzen, erfordern, aber auch geeignete physikalische Parameter, wie z.B. eine geeignete Reaktionstemperatur .
Durch die Wechselwirkung mit der cis/trans Isomerase kann die enzymatische Wirkung des Proenzyms signifikant beeinflusst und durch Hemmung der cis/trans Isomerase-Aktivität der cis/trans Isomerase die Beeinflussung wieder aufgehoben werden. Das Nachweisverfahren der EctIC-Reaktion kann hier anhand der Quantifizierung der enzymatischen Reaktion des Proenzyms erfolgen. Nachweisverfahren für Enzymreaktionen sind dem Fachmann umfänglich bekannt und stetig neu in der Fachpresse zugänglich.
Ist das Proenzym z.B. eine Vorstufe einer Protease, kann der Nachweis der EctIC-Reaktion mit der aktivierten Protease mittels der Proteasereaktion erfolgen. Geeignete Proteasesubsträte sind solche Substrate, die es ermöglichen, die proteolytische Aktivität einer durch cis/trans Isomerase -Aktivität aktivierten Protease mittels geeigneter Nachweisverfahren zu identifizieren. Nachweisverfahren von proteolytischen Aktivitäten sind seit langem bekannt und umfänglich publiziert (z.B. : AU Kim JH. et al.: Analytica Chimica Acta. 577 (2) : 171-177, 2006; Hamill et al.: Biological Chemistry. 387 (8) : 1063-1074 , 2006; Sparidans RW. et al.: Biomedical Chromatography . 20 (8) : 671-673 , 2006; De Vries L. et al.: Biochemical Pharmacology . 71 (10) : 1449-1458 , 2006; van Maarseveen NM. et al . : Journal of Virological Methods . 133 (2) .-185-194, 2006; Guarise C. et al . : Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (11) :3978-3982, 2006; Van Laethem et al. : Journal of Virological Methods. 132 (1-2) : 181-186 , 2006; Cottier V. et al . : Antimicrobial Agents & Chemotherapy . 50 (2) : 565-571, 2006; Sparidans RW. et al . : Biomedical Chromatography. 20(l) :72-76, 2006; Tsongalis GJ. et al . : Journal of Clinical Virology. 34 (4) :268-271, 2005; Kainmuller EK. et al . : Chemical Communications. (43) : 5459-5461, 2005; Vega Y. et al . : Journal of Clinical Microbiology . 43 (10) : 5301-5304 , 2005; Zhang ZD. et al . : Acta Oceanologica Sinica. 24 (4) : 155-161, 2005; Snoeck J. et al . : Journal of Virological Methods. 128 (1-2) : 47-53 , 2005; Hu K. et al.: Journal of Virological Methods. 128 (1-2) : 93-103 , 2005; Yoshida A. et al . : Microbes & Infection. 7 (5-6) : 820-824, 2005; Tribut O. et al . : Therapeutic Drug Monitoring. 27 (3) : 265-269, 2005; Menotti J. et al . : Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 49 (6) :2362-2366, 2005, Pelerin H. et al . : Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences. 819 (1) :47-57, 2005, Debrah O. et al . : Bioconjugate Chemistry. 15 (6) : 1322-1333 , 2004; Shan YF. et al.: Biochemical & Biophysical Research Communications 324 (2) : 579-583 , 2004; Kao RY. et al . : FEBS Letters. 576 (3 ) : 325-330 , 2004) und in zahlreichen Patentschriften beschrieben (z.B.: WO2005097818 , WO03065004, US2006240503A1, US2006183177A1 , US2006183177A1 , US2003170770A1 , US6821744B2, US6306619B1, US5891661A1, US3607859A1, EP0168738A2, CA2522795A1) . Die meisten dieser Verfahren stützen sich auf die Erkennung spektroskopischer Unterschiede zwischen Substrat- und Produktmolekülen. Ist das Proenzym eine generierte Exopeptidase, wird zum Protease Aktivitäts-Nachweis oft ein chromogenes Substrat genutzt, dessen Chromogen durch die Proteasereaktion freigesetzt wird.
Neben Proteasenachweismethoden mit spezifischen Substraten, optimiert für die zu untersuchende proteolytische Aktivität, sind auch eine ganze Reihe von Methoden beschrieben, mit deren Hilfe die proteolytische Aktivität zahlreicher unterschiedlicher Proteasen nachgewiesen werden kann. So nutzt z.B. der von Kim J. H. et al. (Analytica Chimica Acta 577 ( 2006)171-177) beschriebene Fluoreszenzpolarisationsassay, als Proteasesubstrat ein mit Tetramethylrhodamin konjugiertes Casein.
Generell kann man bei den vorbeschriebenen Verfahren zwischen kinetische und Endpunktmethoden unterscheiden. Beide Verfahrenstypen können zum Nachweis einer EctIC-Reaktion, wenn das Proenzym beispielsweise eine (Pro- ) Protease ist, genutzt werden. Die kinetische Methode protokolliert während der proteolytischen Reaktion sich ändernde und zur proteolytischen Reaktion korrelierende Parameter in Abhängigkeit von der Reaktionszeit vor dem Reaktionsende. Es ergibt sich dann beim Auftragen von Werten der erhaltenen Messsignale eine Relation zum Verlauf der Proteasereaktion. Eine EctIC-Reaktion beispielsweise einer durch die cis/trans Isomeraseaktivität aktivierten Protease ist daran zu erkennen, dass nach Zugabe eines die cis/trans Isomeraseaktivität hemmenden Wirkstoffes die Proteasereaktion gehemmt wird.
Endpunktmethoden sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt die enzymatische Reaktion unterbrochen wird und die bis zu diesem Zeitpunkt entstandenen Reaktionsprodukte oder das bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollkommen umgesetzte Substrat der enzymatischen Reaktion analysiert/quantifiziert wird. Beispielsweise bei Kenntnis des Reaktionsverlaufs kann mittels Eichkurven oder durch dem Fachmann bekannte Rechenmethoden aus der quantitativen Analyse von Reaktionsprodukt oder Ausgangssubstrat auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Katalyse geschlossen werden. Eine EctIC-Reaktion einer durch die cis/trans Isomeraseaktivität aktivierten Protease ist daran zu erkennen, dass nach Zugabe eines die cis/trans Isomeraseaktivität hemmenden Effektors der Verlauf der Proteasereaktion gehemmt wird.
Ebenso wie kinetische Proteaseassays sind eine Vielzahl von Endpunktmethoden bekannt. Grob lassen sich die Methoden danach unterscheiden, wie das zu analysierende Reaktionsprodukt oder die noch verbliebene Menge an Ausgangsstoff quantifiziert wird.
Alle unter den vorstehenden Punkten 1 bis 8 aufgeführten EctlC- Reaktionen können den Zusatz unterschiedlichster Hilfsmoleküle zur Optimierung der jeweiligen EctIC-Reaktion erfordern. So können Puffersubstanzen notwendig sein, um eine geeignete Protonenkonzentration zu erhalten. Der Zusatz von Zuckermolekülen kann notwendig sein, um die physikalische Konsistenz der Lösung vorgefertigter Testbestandteile zu verbessern. Es kann weiterhin notwendig sein, organische Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol oder DMSO, zuzusetzen, um z.B. die Löslichkeit von die cis/trans Isomeraseaktivität effektuierenden Effektoren zu verbessern.
Weitere Nachweisverfahren sind cytochemische Verfahren, beispielsweise Verfahren, die zur cytochemischen Darstellung von Proteinen in Gewebsschnitten oder Zellaustrichen dienen (z.B.: Bendayan M.: Microscopy Research & Technique. 57(2002)327-349 ; Lopez-Garcia C. et al . : Microscopy Research & Technique. 56(2002)318-331; Boonacker E. und Van Noorden CJF: Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49(2001)1473-1486; Nagata T: International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology, 211 (2001) 33-151; Bertoni-Freddari C. et al . : Micron. 32(2001)405- 410; Bendayan M. : Biotechnic & Histochemistry . 75(2000)203-242; Takizawa T. und Robinson JM. : Histology & Histopathology . 15(2000)515-522) . Dabei werden die Gewebe oder Zellen mit unterschiedlichsten Methoden auf einem geeigneten Objekt (wie z.B. ein Objektträger aus Glas oder Plastik) fixiert. Oft wird hier bei Geweben die Fixierung mittels Wachs vorgenommen, welche anschließend das Abtrennen feiner Gewebeschnitte ermöglicht. Entsprechend können Gewebeschnitte oder Zellen nach Inkubation mit Proenzym und/oder Isomerase zum Nachweis einer EctlC- Reaktion genutzt werden. So kann z.B. die Inkubation von Zellen mit dem Proenzym AvrRpt2 und einem geeigneten fluorogenen Substratpeptid, wie z.B. Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly- Trp-Tyr (NO2) amid, zum cytochemischen Nachweis von Cyclophilin verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es besonders bevorzugt, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer elektrochemischen, kalorimetrischen, fluorimetrischen oder Lumineszenz-Methode erfolgt.
Besonders bevorzugt ist es, dass das Substratmolekül ein fluorogenes Peptid ist, welches nach erfolgter proteolytischer Spaltung seine Fluoreszenzeigenschaften messbar ändert, und die Bestimmung gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels Fluoreszenzmessung erfolgt.
Das Bestimmen gemäß Schritt d) und ggf. gemäß Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise mittels einer Endpunktmethode oder einer kinetischen Methode.
In das erfindungsgemäße Verfahren können cis/trans Isomerasen aus der Gruppe bestehend aus APIasen und PPIasen eingesetzt werden. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die cis/trans Isomerase aus der Familie der FKBP' s, der Cyclophiline oder der Familie der Parvuline ausgewählt ist.
Unter cis/trans Isomerasen sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung aber auch solche Moleküle verstanden werden, deren Peptidsequenz durch unterschiedlichste, dem Fachmann bekannte Methoden so verändert wurde, dass sie weder anhand ihrer molaren Masse noch ihrer Peptidsequenz einer natürlichen, Gen-kodierten cis/trans Isomerase zuzuordnen wären, welche aber als sicheres Kennzeichen für eine cis/trans Isomerase unter geeigneten optimierten Bedingungen cis/trans Isomerase-Aktivität aufweisen. Unter Peptidsequenz soll die Aminosäuresequenz verstanden werden, welche sich aus dem chemischen oder biochemischen Zusammenfügen natürlicher oder nicht-natürlicher Aminosäuren oder ihrer Derivate ergibt und welche in der richtigen dreidimensionalen Konformation unter geeigneten Bedingungen eine cis/trans Isomerase-Aktivität aufweist. Unter Peptidsequenz sollen dabei auch die Sequenzen verstanden werden, bei denen eine oder mehrere funktionelle Gruppen von Aminosäuren mittels chemischer oder biochemischer Methoden verändert wurden. Assays zum Nachweis der cis/trans Isomerase-Aktivität sind dem Fachmann bekannt und wurden teilweise oben aufgeführt. Geeignete Bedingungen können den Zusatz unterschiedlichster Substanzen, wie z.B. geeignete Puffersubstanzen, Salze, Chelatoren, Emulgatoren, Akitvatoren, Inaktiviatoren, Zucker und weitere Substanzen, erfordern, aber auch geeignete physikalische Parameter, wie z.B. eine geeignete Reaktionstemperatur.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Regel in beliebigen Behältnissen durchgeführt werden. Hinsichtlich spektroskopischer Auswertungen ist es jedoch bevorzugt, dass das Verfahren auf einer Titerplatte oder in einer Küvette durchgeführt wird.
Hinsichtlich der Durchführung von Highthroughput-Screening- Verfahren kann es gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen sein, dass die cis/trans Isoraerase und/oder das Substratmolekül und ggf. das Hilfsmolekül auf einer Trägeroberfläche immoblisiert ist/sind. Dabei ist es bevorzugt, dass das/die Moleküle durch Adsorption, mittels eines Antikörpers, durch eine kovalente Bindung oder durch eine Bindung an Biotin, Avidin oder Streptavidin an der Trägeroberfläche immobilisiert ist/sind.
Um beispielsweise Effektoren im Labormaßstab zu bestimmen, kann es gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen sein, dass die Trägeroberfläche Teil eines Nachweisstreifens ist. Dabei sollen unter Nachweisstreifen Teststreifen verstanden werden, wie sie beispielsweise zur pH-Wert Bestimmung eingesetzt werden.
Alternativ zu der Immobilisierung einer oder mehrerer der genannten Moleküle zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es auch vorgesehen sein, dass das Verfahren in homogener Lösung durchgeführt wird.
Entsprechend einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass das Verfahren in vivo durchgeführt wird. Dabei wird das Verfahren vorzugsweise in Eukaryoten oder Prokaryoten durchgeführt, wobei die Effektuierung mittels endogen vorhandener Isomerasen sowie Substratmoleküle und exogen zugesetzter Effektoren durchgeführt wird.
Alternativ dazu kann das erfindungsgemäße Verfahren auch ex vivo durchgeführt werden, vorzugsweise mittels humaner Kδrperflüssigkeiten.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dasselbe mittels Gewebshomogenaten, Zellsuspensionen, Zellausstrichen oder Gewebsschnitten durchgeführt, in denen die Proteaseaktivität von PPIasen und APIasen und deren Effektuierung mittels in den jeweiligen Medien endogen vorhandener Isomerasen sowie Substratmoleküle und exogen zugesetzter Effektoren durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend eine cis/trans Isomerase und ein Substratmolekül, welches von der cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten werden kann. Dabei können die cis/trans Isomerase und das Substratmolekül entsprechend der bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens weitergebildet sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zum Auffinden von Effektoren, welche die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen inhibieren oder aktivieren. Die Vorrichtung umfasst ein Trägermaterial, an dessen Oberfläche eine cis/trans Isomerase sowie ein Substratmolekül immobilisiert sind, wobei das Substratmolekül von der cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten werden kann. Dabei können die cis/trans Isomerase und das Substratmolekül entsprechend der bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens weitergebildet sein. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch ein wie vorstehend beschriebenes Hilfsmolekül an der Trägermaterialoberfläche immobilisiert umfassen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist es vorgesehen, dass die Vorrichtung als Nachweisstreifen ausgebildet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Auffinden von Effektoren, welche die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen inhibieren oder aktivieren
umfassend die Schritte des a) Bereitsteilens eines Gemisches von Cyclophilin, insbesondere hCyplδ, und AvrRPT2 ;
b) Inkontaktbringens des Gemisches mit einem Substratmolekül, das von dem Gemisch proteolytisch gespalten wird;
c) Inkontaktbringens des Gemisches gemäß b) mit einer Effektor-Kandidatsubstanz;
d) Bestimmens, ob die Effektor-Kandidatsubstanz die Aktivität des Cyclophilins inhibiert oder aktiviert;
und gegebenenfalls
e) Bestimmens des Ausmaßes der durch die Effektor- Kandidatsubstanz bewirkten Inhibierung bzw. Aktivierung des Cyclophilins .
Beispiele und Figuren
Die nachfolgenden Beispiele und Figuren dienen im Zusammenhang mit der Zeichnung der Erläuterung der Erfindung. Es zeigen:
Figur 1: Änderung der Konzentrationen der Spaltprodukte H-GIy- Trp-Tyr (NO2)NH2 (Kurve A) und Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala- Phe-Gly-OH (Kurve B) sowie der Konzentration des Hilfsmoleküls Abz -IIe-GIu-Leu- Pro-AIa-Phe-GIy-GIy-Trp- Tyr (NO2) NH2 (Kurve C) zu verschiedenen Reaktionszeiten.
Figur 2: Änderung der Fluoreszenz-Intensität über die Zeit nach A) Inkubation eines hCypl8/AvrRpt2 -Gemisches mit dem HilfStoff Abz -He-GIu-AIa- Pro-Ala- Phe-GIy-Gly-Trp- Tyr (NO2) -amid, B) Inkubation eines hCyplδ (R55A) /AvrRpt2 -Gemisches mit dem HilfStoff Abz-Ile-Glu- Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amid;
Figur 3: Änderung der Fluoreszenz-Intensität über die Zeit nach A) Inkubation eines hCypl8/AvrRpt2-Gemisches mit dem HilfStoff Abz -He-Glu-Ala- Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp- Tyr (NO2) -amid, Einschub: Inkubation eines hCypl8 /AvrRpt2/Abz-He-Glu-Ala- Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp- Tyr (NO2) -amid-Gemisches mit dem Hemmer Cyclosporin A;
Figur 4: Änderung der Konzentration des Spaltproduktes H-GIy-
Trp-Tyr (NO2)NH2 zu verschiedenen Reaktionszeiten durch Proteolyse von Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp- Tyr (NO2) NH2 durch ein Gemisch von hCypl8 und AvrRpt2 in Abwesenheit und in Gegenwart von dem Inhibitor Cyclosporin A (ausgefüllte Kreise: ohne Inhibitor; Dreiecke: mit Inhibitor) . Innenliegend sind die nach 0, 10, 30, 60 und 180 min erhaltenen Chromatogramme (mit und ohne Inhibitor) eingezeichnet; Figur 5: Änderung der Fluoreszenz-Intensität über die Zeit nach A) Vorlage der cis/trans Isomerase hCyplδ, B) Inkubation der Isomerase mit dem Proenzym AvrRpt2, C) Inkubation des Isomerase/Proenzym-Gemisches mit dem Hilfsmolekül Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp- Tyr (NO2) -amid;
Figur 6: H-Gly-Silber-gefärbtes, 17,5%-iges SDS-GeI. Bahn 1: Molekulargewichtsstandards; Bahn 2: Probe vor Inkubation bei 37 0C; Bahnen 3,5 und 7: Proben mit FKBP- Inhibitor- Zusatz; Bahnen 4,6 und 8: Proben ohne FKBP- Inhibitor- Zusatz. Die Proben wurden 1 h (Bahnen 3 und 4) , 3 h (Bahnen 5 und 6) bzw. 8 h (Bahnen 7 und 8) bei 37 ° inkubiert.
Figur 7: HPLC-Trennung eines Hydrolyseansatzes ohne CsA-Zusatz (a) nach einer Inkubationszeit von 130 h. Auftragung der Substratabnahme während der Inkubationszeit mit (b, Quadrate) und ohne CsA-Zusatz (b, Kreise) .
Figur 8: Auftragung der Produktzunähme als Fläche/Zeit des mittels HPLC quantifizierten und MALDI identifizierten Hydrolyseansatzes mit (a) und ohne (b) CsA-Zusatz. Entsprechend der HPLC/MALDI-Identifizierung stehen Quadrat, Kreis bzw. Dreieck für Spaltprodukte 1 bis 3.
Figur 9: Fluoreszenzspektrum des Substrates Atto425-Ile-Glu-Leu- Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Gly-AEA-TAMRA (Ausgangsprodukt (unterbrochene Linie) und Endprodukt (durchzogene Linie) .
Figur 10: Spaltungskinetik des Substrates Atto425-Ile-Glu-Leu-
Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Gly-AEA-TAMRA in Gegenwart von Cyclophilin (hCypl8) und AvrRpt2. Die Punkte entsprechen einzelnen Messwerten, die durchgezogene Linie wurde durch Berechnung der kinetischen Kurve nach einer Reaktion Erster Ordnung erhalten.
Beispiel 1: Nachweis der Proteaseaktivität von hCyplδ
Eingesetzt als Substratmolekül wurde ein Proteasesubstrat , welches einen durch Fluoreszenz anregbaren Molekülteil, den Donor, und einen weiteren Molekülteil, den Quencher, enthält, wobei der Quencher die Anregbarkeit des Donors im Proteasesubstrat unterdrückt. Wird durch eine Protease eine chemische Bindung zwischen Quencher und Donor getrennt, lässt sich der Donor anregen, was mittels zur Fluoreszenzmessung geeigneter Geräte qualitativ und quantitativ erfasst werden kann. Geeignete Donor-Quencher-Paare, wie z.B. Aminobenzoesäure (Abz) als Donor und Nitro-Tyrosin als Quencher, sind im Stand der Technik bekannt. Methoden, um geeignete neue Paare von Donor und Quencher aufzufinden, sind im Stand der Technik ebenfalls umfassend beschrieben.
Folgende Lösungen wurden hergestellt:
-cis/trans Isomerase-Lösung: 10 μM Lösung von hCyplδ in 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,8.
-Substratmolekül-Lösung: 2 mg/ml Abz-Ile-Glu-Ala-Pro-Ala-Phe- Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amid in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
Zur Fluoreszenzmessung wurde ein Fluoreszenzmessgerät FluoroMax- 2 (Horiba Jobin Yvon Ine, USA) verwendet, wobei zur Durchführung der Messung bei einer Wellenlänge von 320 nm angeregt und bei einer Wellenlänge von 418 nm gemessen wurde. Die Messung wurde bei einer Temperatur von 20 0C durchgeführt. Die cis/trans Isomerase-Lösung und die Substratmolekül -Lösung wurden miteinander vermischt, wobei die Anfangskonzentration des Substratmoleküls 10 μM und die des hCypl8 2 μM betrug. Die Proteaseaktivität von hCyplδ konnte anhand der Registrierung eines Fluoreszenzsignals belegt werden, das im Laufe der Zeit immer weiter an Intensität zunahm.
Beispiel 2: Auffinden von natürlichen cis/trans Isomerase- Protease-Substraten
Im Folgenden wird am Beispiel der Hemmung der cis/trans Isomerase-Aktivität von cis/trans Isotnerasen des FKBP-Typs gezeigt, wie sich Substratmoleküle auffinden lassen, die von diesen Isomerasen proteolytisch gespalten werden. Grundvoraussetzung für dass Auffinden entsprechender Substratmoleküle gemäß dieser Strategie ist, dass durch die Inhibierung der cis/trans Isomerase-Aktivität der Isomerasen auch deren Proteaseaktivität inhibiert wird. Genutzt hierzu wird ein Proteingemisch, welches bei der Homogenisation humaner Blutzellen und anschließender Zentrifugation anfällt.
Leukozyten Präparation
50 ml BuffyCoat eines gesunden Blutspenders wurden bei 1500 g 10 min lang zentrifugiert . Zum Entfernen von Erythrozyten wurde das Zentrifugat bei einer Temperatur von 0 0C mit 50 ml Lysispuffer (155 mM Ammoniumchlorid, 10 mM Natriumcarbonat , 0,1 mM EDTA) 10 min lang inkubiert. Nach abermaliger Zentrifugation bei 1500 g und Entfernen des Überstandes wurde der Lysisschritt nochmals wiederholt. Anschließend wurden die verbleibenden Blutzellen drei Mal mit je 25 ml isotoner Kochsalzlösung bei einer Temperatur von 4 0C gewaschen und anschließend mit 10 ml 100 mM Trispuffer (pH 7,4) vermischt, zu je 500 μl aliquotiert und bei einer Temperatur von -20 0C aufbewahrt. Ein Aliquot von 500 μl wurde aufgetaut, die darin enthaltenen Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen und die resultierende Suspension anschließend 5 min lang bei 10.000 g zentrifugiert . 2 Mal 180 μl des Überstandes wurden jeweils in ein Eppendorfgefäß pipettiert. Das erste Gefäß wurde mit 20 μl einer 100 μM Lösung von Dimethyl-Cycloheximid (DMCHX; in 100 mM Trispuffer, pH 7,4) bzw. das zweite Gefäß nur mit 20 μl entsprechenden Trispuffers versetzt. Die Lösungen beider Gefäße wurden bei einer Temperatur von 37 0C inkubiert.
Nach 1, 3 und 8 Stunden wurden jeweils 20 μl Probe entnommen und mit 180 μl vorgenannten Trispuffers bei einer Temperatur von 95 0C 5 min lang inkubiert. Je 8 μl der so erhaltenen Lösungen wurden zusammen mit einem Molekulargewichtsstandard auf ein 17,5%-iges SDS-GeI aufgetragen und nach Standardprozedur elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Silberfärbung (Rabilloud T. et al . : Electrophoresis 9(1988)288-91) visualisiert . Figur 6 zeigt den Einfluss des cis/trans Isomerase- Inhibitors DMCHX auf die Proteaseaktivität gehemmter cis/trans Isomerasen. So ist bei FKBP-Hemmung die mit A indizierte Proteinbande bei etwa 38 kDa stabiler als ohne DMCHX- Hemmung. Demgegenüber sind ohne FKBP-Hemmung Proteinbanden im Bereich < 20 kDa, wie z.B. die mit B indizierte Bande, als mögliche Abbauprodukte der Proteolyse durch cis/trans Isomerasen verstärkt zu finden.
Beispiel 3: Proteaseaktivität von hCypl8 gegenüber einem
Oligopeptid mit und ohne Hemmung der cis/trans Isomeraseaktivität
Die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen gegenüber Oligopeptiden kann durch Analyse von Aliquoten der Zusammensetzung des Inkubationsansatzes über die Inkubationszeit hinweg mit einer Kombination von chromatografischer Auftrennung des Ansatzes und anschließender Massenspektrometrie der aufgetrennten Bestandteile des Ansatzes bestimmt werden. Die chromatografische Trennung ermöglicht dabei die quantitative Erfassung von Konzentrationsänderungen von Substratmolekül und auftretenden Hydrolyseprodukten. Die Massenspektrometrie ermöglicht die Zuordnung der getrennten Bestandteile des Messansatzes mittels ihrer molekularen Masse.
Bei der Verwendung unterschiedlicher Oligopeptidsequenzen können so sowohl Angaben über die Substratspezifität der Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen als auch über die Katalysekonstanten der Proteaseaktivität dieser Enzyme gegenüber den jeweiligen Polypeptidsequenzen erhalten werden.
Figur 7a zeigt die chromatografische Trennung eines Inkubationsansatzes von hCyplδ mit dem Substratmolekül ohne CsA wie unten angegeben nach 130 h. Mittels Massenspektrometrie konnten die bei einer Retentionszeit von etwa 24,8 min und 23 min erscheinenden Signale der eingesetzten cis/trans Isomerase hCyplδ bzw. dem Substratmolekül zugeordnet werden. Die Signale zwischen 10 und 20 min Retentionszeit konnten den Hydrolyseprodukten des Substratmoleküls zugeordnet werden. Da die Fläche der Signale direkt mit der jeweiligen Peptidkonzentration korreliert, lässt sich durch Analyse und Auswertung des Versuchsansatzes zu verschiedenen Inkubationszeiten mittels aus dem Versuchsansatz entnommener Proben und ihrem Chromatografieverhalten die Abnahme der Ausgangskonzentration des Substratmoleküls sowie, die Zunahme der Hydrolyseprodukte über die Zeit grafisch darstellen (Fig. 2b; Fig. 3) und bewerten.
Während unter den gewählten Bedingungen das Substratmolekül nach ca. 290 Stunden komplett hydrolysiert (Fig. 2b, Kreise) wurde, kann die Hydrolysegeschwindigkeit durch vollständige Hemmung der cis/trans Isomeraseaktivität mit einer 1,6 fachen CsA- Konzentration gegenüber hCyplδ im Ansatz verlangsamt werden (Fig. 2b, Quadrate) . Die kinetische Analyse der Zunahme der Hydrolyseprodukte (Fig. 3) mit (Fig. 3a) und ohne (Fig. 3b) Hemmung der cis/trans Isomeraseaktivität belegt den Einfluss dieser Hemmung auf die Substratspezifität der Proteaseaktivität , sichtbar durch das transiente Auftreten differenter Hydrolyseprodukte .
Inkubationsansatz (mit und ohne CsA) : Gesamtvolumen des Ansatzes: 400 μl
Substratmolekül •. Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-
Tyr (NO2)NH2 Substratmolekül -Konzentration im Ansatz: 150 μM
cis/trans Isomerase: hCyplδ hCyplδ -Konzentration im Ansatz: 30 μM
hCyplδ -Inhibitor: Cyclosporin A (CsA) CsA-Konzentration im Ansatz: 50 μM
Puffer: 35 mM Hepes pH 7,8
Inkubationsbedingungen : Inkubationstemperatur: 20 0C
Chromatografische Äuftrennung: HPLC-Trennmaterial: Vydac-C8 HPLC-Gradient:5-55% Acetonitril/Aqua (0,1% TFA)
Beispiel 4: Nachweis einer EctIC-Reaktion mittels eines fluorogenen Substrats
Eingesetzt als Hilfsmolekül wurde ein Proteasesubstrat , welches einen durch Fluoreszenz anregbaren Molekülteil, den Donor, und einen weiteren Molekülteil, den Quencher, enthält, wobei der Quencher die Anregbarkeit des Donors im Proteasesubstrat unterdrückt. Wird durch eine Protease eine chemische Bindung zwischen Quencher und Donor getrennt, lässt sich der Donor anregen, was mittels zur Fluoreszenzmessung geeigneter Geräte qualitativ und quantitativ erfasst werden kann. Geeignete Donor- Quencher-Paare, wie z.B. Aminobenzoesäure (Abz) als Donor und Nitro-Tyrosin als Quencher, sind im Stand der Technik bekannt. Methoden, um geeignete neue Paare von Donor und Quencher zu aufzufinden, sind im Stand der Technik umfassend beschrieben.
Folgende Lösungen wurden hergestellt:
-cis/trans Isomerase-Lösung: 10 μM Lösung von hCypl8 in 50 mM
Hepes-Puffer, pH 7,8.
-Proenzym (Protease) -Lösung: 100 μM AvrRpt2 (mature AvrRpt2) .
-Hilfsmolekül (Proteasesubstrat) -Lösung: 2 mg/ml Abz-Ile-Glu-Ala- Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amid in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst .
Zur Fluoreszenzmessung wurde ein Fluoreszenzmessgerät FluoroMax- 2 (Horiba Jobin Yvon Ine, USA) verwendet ; angeregt wurde bei einer Wellenlänge von 320 nm; gemessen wurde bei einer Wellenlänge von 418 nm und bei einer Temperatur von 20 0C.
In der Figur 1 sind die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung graphisch dargestellt: Signal A) Vorlage der cis/trans Isomerase hCyplδ; Signal B) Inkubation der Isomerase mit 10 μM AvrRpt2 (Proenzym) ; Signal C) Start der Reaktion zum Zeitpunkt t=0 durch Zugabe von Hilfsmolekül-Lösung zu der Mischung von hCypl8 mit AvrRpt2; die Anfangskonzentration des Hilfsmoleküls betrug 10,5 μM, des hCyplδ 1 μM und des AvrRpt2 10 μM. Beispiel 5 : Detektion einer inaktiven PPIase mittels EctlC- Reaktion und fluorogenem Substrat
Während hCyplδ in üblichen PPIase-Aktivitätsassays eine PPIase- Aktivität zeigt, führt die Substitution der Aminosäure Arginin in Sequenzposition 55 durch die Aminosäure Alanin (R55A) zu einer im gleichen Assay inaktiven PPIase. Das vorliegende Beispiel zeigt, dass die EctIC-Reaktion genutzt werden kann, um inaktive PPIasen zu detektieren.
Folgende Lösungen wurden hergestellt:
-cis/trans Isomerase-Lösung: 10 μM Lösung von hCyplδ (R55A) in 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,8.
-Proenzym (Protease) -Lösung: 100 μM AvrRpt2 (mature AvrRpt2) .
-Hilfsmolekül (Proteasesubstrat) -Lösung: 2 mg/ml Abz-Ile-Glu-Ala- Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2) -amid in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
Zur Fluoreszenzmessung wurde ein Fluoreszenzmessgerät FluoroMax- 2 (Horiba Jobin Yvσn Ine, USA) verwendet ; angeregt wurde bei einer Wellenlänge von 320 nm; gemessen wurde bei einer Wellenlänge von 418 nm und bei einer Temperatur von 20 °C.
In der Figur 2 sind die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung graphisch dargestellt: Signal A) Start der Reaktion zum Zeitpunkt t=0 durch Zugabe von Hilfsmolekül -Lösung zu einer Mischung von hCyplδ und AvrRpt2; die Anfangskonzentration des Hilfsmoleküls betrug 10,5 μM, des hCyplδ 8 , 3 μM und des AvrRpt2 10 μM. Signal B) Start der Reaktion zum Zeitpunkt t=0 durch Zugabe von Hilfsmolekül -Lösung zu einer Mischung von der hCyplδ- Mutante R55A mit AvrRpt2 ; die Anfangskonzentration des Hilfsmoleküls betrug 10,5 μM, der hCypl8 -Mutante R55A 8,6 μM und des AvrRpt2 10 μM.
Beispiel 6: Detektion eines PPIase-Inhibitors mittels EctlC- Reaktion und fluorogenem Substrat
Die PPIase-Aktivität von hCypl8 läßt sich durch zahlreiche bekannte Inhibitoren spezifisch hemmen. Im vorliegenden Beispiel wird die Hemmung der PPIase-Aktivität von hCypl8 durch den Inhibitor Cyclosporin A (CsA) mittels einer EctIC-Reaktion gezeigt.
Folgende Lösungen wurden hergestellt:
-cis/trans Isomerase-Lösung: 10 μM Lösung von hCyplδ (R55A) in 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,8.
-Proenzym (Protease) -Lösung: 100 μM AvrRpt2 (mature AvrRpt2) .
-Hilfsmolekül (Proteasesubstrat) -Lösung: 2 mg/ml Abz-Ile-Glu-Ala- Pro-AIa-Phe-GIy-GIy-Trp-Tyr (NO2) -amid in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
Zur Fluoreszenzmessung wurde ein Fluoreszenzmessgerät FluoroMax- 2 (Horiba Jobin Yvon Ine, USA) verwendet ; angeregt wurde bei einer Wellenlänge von 320 nm; gemessen wurde bei einer Wellenlänge von 418 nm und bei einer Temperatur von 20 0C.
In der Figur 3 sind die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung graphisch dargestellt: Signal A) Start der Reaktion zum Zeitpunkt t=0 durch Zugabe von Hilfsmolekül -Lösung zu einer Mischung von hCypiS und AvrRpt2; die Anfangskonzentration des Hilfsmoleküls betrug 10,5 μM, des hCyplδ 8,3 μM und des AvrRpt2 10 μM. Einschub: Zur Zeit t=100 s werden zu der Reaktionsmischung 19,3 μM CsA zugemischt. Noch während der Mischzeit von ca. 5 s kommt es zum Stillstand der Fluoreszenzzunähme .
Beispiel 7: Nachweis einer EctIC-Reaktion mittels analytischer HPLC
Das Beispiel beruht auf der Möglichkeit, Ausgangsprodukt und Spaltprodukte der Proteolyse mittels Chromatographie voneinander zu trennen und anschließend zu quantifizieren.
Folgende Lösungen wurden hergestellt:
hCyplδ: 216 μM in Hepes,- AvrRpt2 : 46 μM; CsA: 0,5 M in 50 %iger EtOH/H2O -Lösung,- Hilfsmolekül : Abz-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly- GIy-Trp-Tyr (NO2)NH2 1,71 mM in Hepes ; Puffer: 35 mM Hepes pH 7,8; die Hilfsmolekül -Lösung enthielt 5 % DMSO (photometrische Bestimmung: ε3Blnm=2200 M"1 cm"1) . Das Küvettenvolumen betrug 2,2 ml. Die EctIC-Reaktion wurde ohne und in Gegenwart des hCyplδ- Inhibitors CsA bei einer Temperatur von 10 0C untersucht.
Ansatz (A) Ansatz (B)
18 μl HiIfsmolekül-Lösung 18 μl Hilfsmolekül-Lösung
18,3 μl hCyplδ 18,3 μl hCyplδ
9 , 6 μl AvrRpt2 9.6 μl AvrRpt2
2150 μl Puffer 4 μl CsA
2146 μl Puffer
Die Reaktion wurde jeweils durch Zugabe von hCyplδ gestartet. Nach 2, 4, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 20, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160 und 180 min wurden 100 μl Probe entnommen und mit 4 μl (0,5 M) CsA abgestoppt und in N2iq eingefroren bzw. sofort vermessen. Nach dem schnellen Auftauen der (inhibierten) Proben wurden 80 μl auf eine Chromatographiesäule (VydacCS) aufgetragen und mit einem Wasser/HCN-Gradienten von 15-60 % (0,1% TFA) über 20 min chromatographiert . Figur 4 zeigt den Nachweis einer EctlC- Reaktion durch Produktanalyse mittels HPLC. Aufgetragen sind die Konzentrationen (angegeben als Signalfläche der
Chromatografiekurven) des Spaltproduktes H-Gly-Trp-Tyr (NO2) NH2 zu verschiedenen Reaktionszeiten der Spaltung von 14 μM Abz-Ile- Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Tyr (NO2)NH2 durch ein Gemisch von 1,8 μM hCyplδ und 0 , 2 μM AvrRpt2 bei 10 0C ohne und in Gegenwart von 0,9 μM CsA (ausgefüllte Kreise: ohne Inhibitor; Dreiecke: mit Inhibitor) . Innenliegend sind die nach 0, 10, 30, 60 und 180 min erhaltenen Chromatogramme (mit und ohne Inhibitor) eingezeichnet .
In Figur 5 ist ein Nachweis einer EctIC-Reaktion mittels HPLC- Produktanalyse gezeigt. Aufgetragen sind die Konzentrationen (angegeben als Signalfläche der Chromatografiekurven) der Spaltprodukte H-Gly-Trp-Tyr (NO2)NH2 (Kurve A) und Abz-Ile-Glu-Leu- Pro-Ala-Phe-Gly-OH (Kurve B) sowie die Konzentrationen des Ausgangssubstrates Abz-Ile-Glu-Leu- Pro-AIa- Phe-Gly-Gly-Trp- Tyr (NO2) NH2 (Kurve C) zu verschiedenen Reaktionszeiten bei 10 0C. Die Konzentration des Hilfsmoleküls im Messansatz betrug 14 μM. Als Proenzym wurden 0,2 μM AvrRpt2, als cis/trans Isomerase 1,8 μM hCyplδ eingesetzt.
Beispiel 8 : Nachweis einer EctIC-Reaktion mittels fluorogenem Substrat
a) Synthese des Substrates
Das fluorogene Substrat Atto425-Ile-Glu-Leu-Pro-Ala-Phe-Gly-Gly- Trp-Gly-AEA-TAMRA enthaltend die beiden Farbstoffe ATTO 425
(Fluoreszenzmarker mit Cumarinstruktur (ATTO-TEC GmbH, Deutschland) und TAMRA (ein Rhodaminderivat) wurde an einer DAE- chlortrityl-Matrix mittels automatisierter Festphasensynthese
(Syro II, MultiSynTech, Witten, Deutschland) nach einem Fmoc- Standardprotokoll synthetisiert. Die Frabstoffe ATTO-425 und TAMRA wurden als N-Succinimidester gekuppelt. Die Reinigung und Isolation des Endproduktes erfolgte mittels präparativer RP- HPLC, die Analyse mittels MALDI -Massenspektroskopie . Es wurde eine Molmasse von 1884.16 ermittelt.
b) Nachweis der EctIC-Reaktion:
Die Moleküle ATTO 425 und TAMRA im Substrat Atto425-Ile-Glu-Leu- Pro-Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Gly-AEA-TAMRA bilden ein Fluoreszens/Quencherpaar . Nach Spaltung der kovalenten Bindung zwischen beiden Farbstoffen ändert sich das Fluoreszenzspektrum des Inkubationsansatzes (Figur 9) . Dadurch ist die Spaltung des Substrates einer kinetischen Analyse zugänglich. Der zeitliche Verlauf der Hydrolyse des Substrates Atto425-Ile-Glu-Leu-Pro- Ala-Phe-Gly-Gly-Trp-Gly-AEA-TAMRA in Gegenwart von 7,5 μM hCyplδ und 0,9 μM AvrRpt2 bei 200C in 35 mM HEPES-Puffer bei pH 7 , 8 einer Substratkonzentration von 100 μM und einer Gesamtkonzentration von 1 % DMSO zeigt Figur 10.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Auffinden von Effektoren, welche die
Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen inhibieren oder aktivieren, und zum Quantifizieren der inhibierenden bzw. aktivierenden Wirkung entsprechender Effektoren auf die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen,
umfassend die Schritte des
a) Bereitsteilens einer cis/trans Isomerase;
b) Inkontaktbringens der cis/trans Isomerase mit einem Substratmolekül, das von der cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten wird oder mit einem Proenzym, das von der cis/trans Isomerase aktiviert wird;
c) Inkontaktbringens der cis/trans Isomerase mit einer Effektor-Kandidatsubstanz ;
d) Bestimmens, ob die Effektor-Kandidatsubstanz die Aktivität der cis/trans Isomerase inhibiert oder aktiviert;
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels des Produkts der proteolytische Spaltung des Substratmoleküls bzw. mittels eines Produkts erfolgt, das von dem aktivierten Proenzym umgesetzt worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer spektroskopischen Methode erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer elektrochemischen Methode erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer kalorimetrischen Methode erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer fluorimetrischen Methode erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer Lumineszenz -Methode erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer Endpunktmethode erfolgt .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen gemäß Schritt d) und gegebenenfalls gemäß Schritt e) mittels einer kinetischen Methode erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase ein Enzym ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den APIasen und den PPIasen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase ein Enzym ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mitgliedern der Familie der Parvuline.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase ein Enzym ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mitgliedern der Familie der FKBPs .
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase ein Enzym ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mitgliedern der Familie der Cyclophiline .
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren desweiteren die Zugabe eines Hilfsmoleküls umfasst, welches mit der cis/trans Isomerase in Kontakt gebracht wird bzw. mit dem aktivierten Proenzym in Kontakt gebracht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Hilfsmolekül ein Molekül ist, welches die Protease-Aktivität der cis/trans Isomerase erhöht.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Hilfsmolekül ein Protein, ein Peptid oder ein organisches Molekül ist, wobei das organische Molekül eine Masse von kleiner/gleich 2.000 Da aufweist.
17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Hilfsmolekül ein Enzymsubstrat für das aktivierte Proenzym ist.
18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren auf einer Titerplatte oder in einer Küvette durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren auf einem Objektträger durchgeführt wird mittels eines Zellausstrichs oder eines Gewebeschnittes .
20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase und gegebenenfalls das Hilfsmolekül an einer Trägeroberfläche immobilisiert ist/sind.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase und gegebenenfalls das Hilfsmolekül mittels Adsorbtion an der Trägeroberfläche immobilisiert ist/sind.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase und gegebenenfalls das Hilfsmolekül mittels eines Antikörpers an der Trägeroberfläche immobilisiert ist/sind.
23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase und gegebenenfalls das Hilfsmolekül mittels kovalenter Bindung an der Trägeroberfläche immobilisiert ist/sind.
24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die cis/trans Isomerase und gegebenenfalls das Hilfsmolekül mittels einer Bindung an Biotin, Avidin oder Streptavidin an der Trägeroberfläche immobilisiert ist/sind.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche Teil eines Nachweisstreifens ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in homogener Lösung durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Effektor ein Inhibitor oder ein Aktivator ist.
28. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend eine cis/trans Isomerase und ein Substratmolekül, das von der cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten werden kann oder ein Proenzym, das von der cis/trans Isimerase aktiviert wird.
29. Kit nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit ferner ein Hilfsmolekül wie in den Ansprüchen 14 bis 17 definiert umfasst.
30. Vorrichtung zum Auffinden von Effektoren, welche die Proteaseaktivität von cis/trans Isomerasen inhibieren oder aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Trägermaterial umfasst, an dessen Oberfläche eine cis/trans Isomerase sowie ein Substratmolekül oder ein Proenzym immobilisiert sind, wobei das Substratmolekül von der cis/trans Isomerase proteolytisch gespalten wird bzw. das Proenzym von der cis/trans Isomerase aktiviert wird.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass an der Trägermaterialoberfläche ferner ein Hilfsmolekül wie in den Ansprüchen 14 bis 17 definiert immobilisiert ist.
32. Vorrichtung nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung als Nachweisstreifen ausgebildet ist.
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