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WO2009050309A1 - Isoformas del receptor de somatostatina humano tipo 5 producidas por procesamiento alternativo y parejas de oligonucleótidos para su detección por pcr - Google Patents

Isoformas del receptor de somatostatina humano tipo 5 producidas por procesamiento alternativo y parejas de oligonucleótidos para su detección por pcr Download PDF

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WO2009050309A1
WO2009050309A1 PCT/ES2007/000627 ES2007000627W WO2009050309A1 WO 2009050309 A1 WO2009050309 A1 WO 2009050309A1 ES 2007000627 W ES2007000627 W ES 2007000627W WO 2009050309 A1 WO2009050309 A1 WO 2009050309A1
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WO
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seq
isoforms
sequence
sstδc
pcr
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PCT/ES2007/000627
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English (en)
French (fr)
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Mario DURÁN PRADO
Antonio Jesús MARTÍNEZ FUENTES
Rafael VAZQUEZ MARTÍNEZ
Socorro GARCÍA NAVARRO
María del Mar MALAGÓN POYATO
Justo Pastor CASTAÑO FUENTES
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidad de Cordoba
Original Assignee
Universidad de Cordoba
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2010529416A priority patent/JP2011500047A/ja
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Priority to PT78230331T priority patent/PT2216340E/pt
Priority to EP07823033A priority patent/EP2216340B1/en
Priority to DK07823033.1T priority patent/DK2216340T3/da
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to two novel isoforms of the human somatostatin receptor type 5, as well as its detection in biological samples.
  • hypothalamic somatostatin neuropeptide acts in a multitude of organs and target tissues spread throughout the body, fundamentally exerting an inhibitory effect, either on the secretion and regulation of other hormones, as well as on various other biological processes ( Moller et al., 2003).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) GPCRs and among them, ssts, are involved in numerous medically relevant cellular processes, mediated by signal transduction pathways through G proteins. More specifically, one of these subtypes of ssts, the human sst ⁇ (WO 0177172, WO 0155319 , WO 0136446, EP 1369698, WO 03104816) has been related to a multitude of diseases of various kinds, such as hematological, cardiovascular diseases, alterations of the central and peripheral nervous system, cancer, inflammatory processes, liver diseases, gastrointestinal and genitourinary diseases, in mammals (WO03104816).
  • diseases of various kinds such as hematological, cardiovascular diseases, alterations of the central and peripheral nervous system, cancer, inflammatory processes, liver diseases, gastrointestinal and genitourinary diseases, in mammals (WO03104816).
  • the human somatostatin receptor type 5, sst ⁇ is deposited in public databases with access numbers, among others, GI39756975, GI21954086, Gl 13937340, which contain sequences belonging to DNA copying the coding sequence, as well as genomic sequences containing The complete gene structure of said receptor, containing in addition to the coding sequence, the promoter region, intronic sequences and 5 'and 3 ' non-coding regions. So far, no alternative processing of the human sst5 messenger RNA that originates any alternative isoform other than that deposited in the databases and described extensively in the literature has been described.
  • porcine sst ⁇ by means of the RACE PCR technique, partial and subsequently total sequences of messenger RNA variants were obtained, by alternative means, which encoded two new receptor isoforms, as in the case of rat sst2, but in this case they encoded receptors of six and three transmembrane domains, called porcine isoforms sst ⁇ B and sst ⁇ C (p-sst5B and p-sst ⁇ C) respectively.
  • GnRHR-I function by expression of a human type Il GnRHR gene fragment. Endocrinology 146 (6): 2639-2649.
  • a "somatostatin receptor” is a transmembrane protein coupled to a guanylate cyclase type protein, belonging to the family of seven transmembrane domains type proteins, activated by hypothalamic peptides of the somatostatin type.
  • RACE-PCR refers to Random Amplification of cDNA Ends
  • the present invention comprises the determination of the DNA sequence encoding two new types of human somatostatin receptor type 5 (sst5), called sst5B and sst ⁇ C, of five and four transmembrane domains respectively, originated by an alternative spindle of the messenger RNA contained in the genomic sequence deposited in a database with access number GH 3937340 ( Figure 1).
  • sst5B and sst ⁇ C new types of human somatostatin receptor type 5
  • Figure 1 By means of the procedure described in the embodiment of the invention, recombinant DNA molecules are obtained that encode polypeptides that exhibit, at least in part of the sequence, structural motifs of somatostatin receptors.
  • the invention also relates to DNA polynucleotide sequences that hybridize under restrictive conditions with those of these new isoforms, which implies a homology level of at least 60% between their sequences.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) nucleotides, preferably 75% homology and more preferably 90% homology, or that are derived from them by degeneracy of the genetic code or by mutagenesis.
  • the procedure used in the invention allows the obtaining of functional recombinant polypeptides for later study.
  • the insertion of the recombinant DNAs into expression vectors is carried out so that they contain a nucleotide sequence as described in SEQ ID 1,
  • SEQ ID 3 SEQ ID 5 and SEQ ID 7 or derived from them. Both polypeptides expressed in expression vectors within host cells provide a screening system for new drugs and compounds capable of selectively binding in vivo and in vitro selectively to the sst5B and sst ⁇ C isoforms, as well as second path modulation study systems. messengers for each of the isoforms in response to drugs.
  • the invention object of the present application refers to a purified human nucleic acid characterized in that it encodes an isoform of the human somatostatin receptor type 5 (sst5) selected from: sst5B (SEQ ID 5), sst5C (SEQ ID 7), its sequence complementary, a sequence with at least 90% homology with the previous ones, and fragments of the previous ones.
  • sst5B SEQ ID 5
  • sst5C SEQ ID 7
  • the invention also relates to a purified human nucleic acid characterized in that it comprises a partial coding sequence contained in SEQ ID 1 and SEQ ID 3.
  • the invention relates to a human nucleic acid characterized in that it comprises the 3'RACE PCR fragment corresponding to the sst ⁇ B whose sequence is SEQ ID 1, or fragments thereof.
  • the invention relates to a human nucleic acid characterized in that it comprises the 3 1 RACE PCR fragment corresponding to the sst5C whose sequence is SEQ ID 3, or fragments thereof.
  • the invention relates to a purified polypeptide characterized in that its amino acid sequence is defined in SEQ ID 2, SEQ ID 4, SEQ ID 6 and SEQ ID 8, and is encoded by one of the oligonucleotides described above in the text.
  • the invention relates to an expression vector characterized in that it comprises a nucleotide sequence described above, transcriptionally coupled to an exogenous promoter.
  • said expression vector is characterized in that said nucleotide sequence encodes a polypeptide as defined above in this text.
  • the methods described above are characterized in that they are performed in vitro.
  • said search is performed in whole cells.
  • said method is characterized in that the polypeptides detailed in SEQ ID 2, SEQ ID 4, SEQ ID 6 and SEQ ID 8, come from an expression vector defined above in the text.
  • said polypeptide corresponds to one of those encoded by SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, or fragments thereof.
  • the invention also relates to new pairs of oligonucleotides detailed in the sequences SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, and SEQ ID 14 or sequences homologous thereto in Io minus 90%, which allow the isoforms A, B and C of the human sst ⁇ to be amplified by PCR.
  • the invention relates to the use of said oligonucleotides for the selective amplification of the sst ⁇ A, sst ⁇ B and sst ⁇ C isoforms by any PCR variant.
  • the invention also refers to the use of said oligonucleotides for the study of the quantitative tissue distribution of sst5A, sst5B, or sst ⁇ C in normal and tumor tissues.
  • the invention refers to a copy DNA characterized in that it hybridizes with the total or partial sequences contained in SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID ⁇ or SEQ ID 7.
  • the invention also refers to a copy DNA contained in SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID ⁇ SEQ ID 7 or homologous sequences in at least 90%, characterized in that it is capable of silently or independently silencing the gene expression of the sst ⁇ B and sst ⁇ C isoforms.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • a specific embodiment of the present invention refers to the use of sequences contained in SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5 or SEQ ID 7 for the generation of selective antibodies that discriminate between the sst ⁇ B and sst ⁇ C isoforms.
  • the present invention also allows the development of new drugs capable of selectively binding the new isoforms of the somatostatin receptor type 5, sst ⁇ B and sst5C, which act as agonists, antagonists or inverse agonists using second messenger measurement techniques such as Ia Microfluorimetric measurement of intracellular calcium (Landa et al., 2005).
  • recombinant DNAs contained in SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5 and SEQ ID 7 or derivatives thereof, in eukaryotic expression vectors of the type pCDNA3 (Invitrogen) allows transfection of said recombinant constructs in tumor cell lines of the type CHO-K1 or HEK-293T, widely used for the study of other somatostatin receptor subtypes.
  • the process whose methodology can be seen in more detail in Landa et al., (Landa et al., 2005) can be outlined in general terms as indicated:
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (5) Analysis of the transfected cells with a 4OX objective of immersion in oil, by means of the selective excitation at 340 and 380 nm and measurement of the emission signal at 505 nm, at intervals of 5 seconds. (6) The changes in the concentration of intracellular Ca 2+ before and after the administration of the drug in question are analyzed as a quotient of the image intensities obtained with the respective excitation wavelengths at 340 and 380 nm through the use of the MetaFluor software.
  • the present invention also enables the development of drugs that alter the baseline state of the new isoforms of the somatostatin receptor type 5, sst ⁇ B and sst ⁇ C.
  • the present invention would allow the use of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) technology to measure the physical interaction of both sst ⁇ B and sst ⁇ C isoforms with themselves, as well as with other proteins belonging to the GPCR family.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the insertion of the recombinant DNA contained in SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5 and SEQ ID 7 or derivatives thereof, in eukaryotic expression vectors variants of the type E-GFPN 1 (Clontech), such as E- CFPN 1 and E-YFPN1, would allow the co-transfection of said recombinant constructs in tumor cell lines of the HEK-293AD type.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (3) Mounting the coverslip in which the cells are attached in a camera coupled to an inverted microscope such as the Nikon Eclipse TE 2000 E, coupled to a Hamamatsu CCD camera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu), both controlled with MetaMorph and MetaFluor software (Molecular Devices).
  • Figure 1 Scheme of amplification of partial sequences corresponding to the sst5B and sst5C isoforms by means of the 3 ' RACE PCR technique. The steps described in the text are presented and the oligonucleotides used in each case are shown, according to the nomenclature of Table 1.
  • Figure 2 Scheme of amplification of the coding sequences of the sst5B and sst ⁇ C isoforms by means of the PCR amplification and triple ligation technique. The steps described in the text are presented and the oligonucleotides used in each case are shown, according to the nomenclature of Table 1.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (1) Isolation of total RNA from various tumor tissues and retrotranscription.
  • the described amplification method was performed following the instructions of the "GeneRacer® kit" of Invitrogen® life technologies, except steps (5) and (6).
  • exons 1 and exons 2 (E2) corresponding to each of the isoforms were amplified from human genomic DNA.
  • RNA isolation It was carried out using the Trizol reagent from Invitrogen®, according to the recommendations indicated by said commercial house.
  • Trizol reagent from Invitrogen®, according to the recommendations indicated by said commercial house.
  • tissues corresponding to two pituitary adenomas diagnosed as non-functioning type and a pituitary "cushing" sample were used.
  • the resulting RNA was resuspended in a final volume of 12 ⁇ l of H 2 O treated with DEPC, of which 1 ⁇ l was used for spectrophotometric quantification.
  • 2 ⁇ g of RNA from each of the tumors was used, in a final volume of 20 ⁇ l.
  • RNA from the HeLa tumor cell line from the "GeneRacer kit” was also used, using the same amount of RNA for the back transcription reaction ( Figure 1.1).
  • Figure 1.1 For the retrotranscription reaction, the indications of the "GeneRacer® kit” of Invitrogen® were followed. A heterogeneous battery of pituitary tumor tissues of which an amount of between 15 and 100 mg was used for total RNA extraction was also used for diagnosis. The resulting RNA was also resuspended in a final volume of 12 ⁇ l of H 2 O treated with DEPC, of which 1 ⁇ l was used for spectrophotometric quantification. For the retrotranscription, between 2 and 5 ⁇ g of RNA from each of the tumors were used, according to the performance of each extraction. The retrotranscription reaction was carried out in a total volume of 20 ⁇ l using the "PowerScript" enzyme of BD Biosciences, according to the manufacturer's instructions.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) nested Ra_hum_sst5_3 ' N (SEQ ID 17) and GeneRacer 3'N ( Figure 1.4), subjecting the samples to an initial denaturation of 2 minutes at 94 ° C and subsequently thirty-two cycles of 30 seconds of denaturation at 94 ° C , 30 seconds of alignment at 66 ° C and 40 seconds of extension at 72 ° C.
  • the amplification program continued with 7 minutes of extension at 72 ° C to complete the synthesis of incomplete PCR products.
  • the mixture of Certamp de Biotools polymerases supplied with a specific buffer for complex mixtures was used. The different PCR reactions were carried out with all DNA copies in parallel.
  • the PCR products were visualized on 1% agarose gel and the bands obtained were purified by the commercial kit QuiaQuick Mini Elute (Quiagen).
  • the PCR products thus purified were cloned with blunt ends at the EcoRV restriction site of the pBluescript KSII + vector and sequenced, resulting in the corresponding sequence of 609 base pairs (SEQ ID 1) obtained from DNA copying HeLa cells and another sequence of 197 base pairs (SEQ ID 3), obtained from the copy DNA from the pituitary cushing.
  • exon 1 (E1) of each soforma was amplified by PCR, using a common sense oligonucleotide for sst ⁇ B and sst ⁇ C, sst5B-C_E1_U_Hindlll (SEQ ID 18) that incorporates a restriction sequence for Ia Hindlll enzyme, and a specific antisense oligonucleotide for each isoform, sst5B-E1_L_blunt (SEQ ID 19) and sst5C-E1_L_blunt (SEQ ID 22) for sst ⁇ B and sst ⁇ C, respectively ( Figure 2.1 and 3.2).
  • Exons 2 were amplified analogously, with the specific sense and antisense oligonucleotide pairs sst5B-E2-U_blunt (SEQ ID 20) / sst5B-E2- L_BamHI (SEQ ID 21) for the isoform sst ⁇ B and sst ⁇ C-E2_U_blunt (SEQ ID 23) / sst ⁇ C-E2_L_BamHI (SEQ ID 24) for the sst ⁇ C isoform.
  • the four PCR reactions were carried out in parallel using a program consisting of 2 minutes of initial denaturation at 94 ° C, followed by 34 cycles of 30 seconds of denaturation at 94 ° C, 30 seconds of alignment at 62 ° C and 40 Seconds of extension at 72 ° C.
  • a high fidelity copy polymerase of the Pfu Ultra (Stratagene) type was used, supplementing the reactions with 1M betaine (Sigma).
  • PCR fragments obtained were purified by means of the commercial kit QuiaQuick Mini Elute (Quiagen) and after the enzymatic digestion with Hindlll and BamHI were ligated by a triple reaction within the vector of
  • oligonucleotide pairs were developed for diagnostic purposes that allow selective PCR discrimination of each of the isoforms of human sst5, sst ⁇ A (GI39756975), sst ⁇ B and sst ⁇ C.
  • SEQ ID 12 amplifies a PCR fragment of 142 base pairs, using an alignment temperature of 68 ° C, contained in the sequence corresponding to sst5B (SEQ ID 5) and does not amplify the isoforms sst ⁇ C or sst5A (GI39756975) , while it originates an amplification product of 1643 base pairs contained in the human genomic sequence GM 3937340 and that includes the inlet located between exons E1 and E2 of the sst ⁇ B isoform.
  • the three PCR reactions are performed in parallel using a common PCR program consisting of an initial denaturation of 2 minutes at 94 ° C and 37 repetitions of 10 seconds at 94 ° C, 10 seconds of alignment at 68 ° C and 10 seconds of extension to

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Abstract

La presente invención se refiere a dos ácidos nucleicos humanos que comprenden secuencias que codifican dos nuevas isoformas del receptor de somatostatina humano tipo 5 originadas por ayuste alternativo, llamadas sst5B y sst5C con posible implicación en procesos tumorales. Adicionalmente, Ia invención se refiere a parejas de oligonucleótidos que permiten Ia detección diferencial de dichas isoformas mediante Ia técnica de PCR en diversos tejidos.

Description

ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE SOMATOSTATINA HUMANO TIPO 5 PRODUCIDAS POR PROCESAMIENTO ALTERNATIVO Y PAREJAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA SU DETECCIÓN POR PCR.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a dos isoformas nuevas del receptor de somatostatina humano tipo 5, así como a su detección en muestras biológicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El neuropéptido hipotalámico somatostatina (SRIF) actúa en multitud de órganos y tejidos diana extendidos por todo el organismo, ejerciendo fundamentalmente un efecto inhibidor, ya sea sobre Ia secreción y regulación de otras hormonas, así como sobre otros procesos biológicos diversos (Moller et al., 2003). Esta acción, generalmente inhibidora, pero en ciertas ocasiones estimuladora (Castaño et al., 1996) es ejercida a través de una familia de receptores del tipo de siete dominios transmembrana (7TMD) acoplados a proteínas G (GPCR), llamados receptores de somatostatina o ssts. Todos los ssts comparten una estructura común consistente en un extremo amino terminal extracelular, conectado a siete dominios hidrofóbicos insertados en Ia membrana, que a su vez están unidos entre si mediante ocho dominios hidrofílicos, y terminan en un extremo carboxilo terminal intracelular, este último, importante para Ia modulación de rutas de segundos mensajeros. Hasta el momento, en mamíferos, existen cinco subtipos diferentes de ssts, desde el sst1 hasta el sstδ, existiendo además, en ratón y rata, dos isoformas del subtipo 2 (sst2A y sst2B) producidas por ayuste alternativo del ARN mensajero precursor y que codifica dos proteínas diferentes en Ia región carboxilo terminal intracelular que presentan propiedades diferentes en cuanto a modulación de rutas intracelulares de señalización. En peces, sin embargo, se han descubierto otras isoformas de cada subtipo de receptor, debidas a fenómenos de duplicación génica en lugar de otros fenómenos de ayuste diferencial de los ARN mensajeros que codifican cada una de las isoformas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los GPCRs y entre ellos, los ssts, están implicados en numerosos procesos celulares médicamente relevantes, mediados por rutas de transducción de señales a través de proteínas G. Más concretamente, uno de estos subtipos de ssts, el sstδ humano (WO 0177172, WO 0155319, WO 0136446, EP 1369698, WO 03104816) ha sido relacionado con multitud de patologías de diversa índole, como enfermedades hematológicas, cardiovasculares, alteraciones del sistema nervioso central y periférico, cáncer, procesos inflamatorios, enfermedades hepáticas, enfermedades gastrointestinales y genitourinarias, en mamíferos (WO03104816). El receptor de somatostatina humano tipo 5, sstδ, está depositado en bases de datos públicas con números de acceso, entre otros, GI39756975, GI21954086, Gl 13937340, que contienen secuencias pertenecientes a ADN copia de Ia secuencia codificante, así como secuencias genómicas que contienen Ia estructura génica completa de dicho receptor, conteniendo además de Ia secuencia codificante, Ia región promotora, secuencias intrónicas y regiones 5' y 3' no codificantes. Hasta el momento, no se ha descrito ningún procesamiento alternativo del ARN mensajero del sst5 humano que origine ninguna isoforma alternativa diferente a Ia que está depositada en las bases de datos y descrita ampliamente en la bibliografía. Recientemente, se ha clonado Ia secuencia correspondiente al ARN mensajero que contiene Ia secuencia codificante del receptor sst5 porcino, así como las regiones 5' (GI58223147) y 3' no codificantes (Duran et al., 2005; publicación en preparación). Durante el proceso de clonación del sstδ porcino mediante Ia técnica de RACE PCR, se obtuvieron secuencias parciales y posteriormente totales de variantes del ARN mensajero, por ayuste alternativo, que codificaban dos nuevas isoformas de receptor, como en el caso del sst2 de rata, pero en este caso codificaban receptores de seis y tres dominios transmembrana, llamados isoformas porcinas sstδB y sstδC (p-sst5B y p-sstδC) respectivamente. Existen datos de GPCRs truncados, producidos por ayuste alternativo de ARN mensajero, que codifican proteínas que forman estructuras de menos de siete dominios transmembrana, como se ha descrito previamente para receptores de GHRH (Rekasi et al., 2000), GnRH (Pawson et al., 2005), prostaglandina (Ishii
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) et al., 2001), etc., algunas de ellas funcionales y con posible relevancia en procesos tumorales.
Según los resultados obtenidos para el sstδ porcino se inició Ia clonación mediante RACE PCR de los posibles homólogos humanos de las isoformas sstδB y sst5C porcinas, para posteriormente evaluar su presencia e importancia en tumores endocrinos, mediante Ia técnica de PCR.
Bibliografía citada en el texto
1. Moller LN, Stidsen CE, Hartmann B, Holst JJ. 2003. Somatostatin receptors. Biochemica et Biophysica Acta, 1616: 1-84.
2. Castaño JP, Torronteras R, Ramírez JL, Gribouval A, Sánchez-Hormigo A, Ruiz-Navarro A, Gracia-Navarro F. 1996. Somatostatin increases growth hormone (GH) secretion in a subpopulation of porcine somatotropes: evidence for functional and morphological heterogeneity among porcine GH-producing cells. Endocrinology, 137:129-136.
3. Rekasi Z, Czompoly T, Schally AV, Halmos G. 2000. Isolation and sequencing of cDNAs for splice variants of growth hormone-releasing hormone receptors from human cancers. PNAS, 97: 10561-10566.
4. Pawson AJ, Maudsley S, Morgan K, Davidson L, Naor Z, Millar R. 2005. Inhibition of human type I gonadotropin-releasing hormone receptor
(GnRHR-I) function by expression of a human type Il GnRHR gene fragment. Endocrinology. 146(6):2639-2649.
5. lshii Y, Sakamoto K. 2001. Suppression of protein kinase C signaling by the novel isoform for bovine PGF2a Receptor! Biochemical and Biophysical Research Communications, 285: 1-8.
6. Landa RL, Harbeck M, Kaihara K, Chepurny O, Kitiphongspattana K, Graf O, Nikolaev VO, Lohse MJ, HoIz GG, Roe MW. 2005. lnterplay of Ca2+ and cAMP signaling in the insulin secreting MIN6 β-cell line. Journal of Biological Chemistry, 2;280(35):31294-31302. 7. Vilardaga JP, Bunemann M, Krasel C, Castro M & Lohse MJ. 2003. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat Biotechnol 21 807-812.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Para Ia correcta interpretación del presente texto se detallan los siguientes conceptos:
Un "receptor de somatostatina" es una proteína transmembrana acoplada a una proteína de tipo guanilato ciclasa, perteneciente a Ia familia de proteínas de tipo siete dominios transmembrana, activado por péptidos hipotalámicos del tipo de Ia somatostatina.
"RACE-PCR" se refiere a Random Amplification of cDNA Ends
(Amplificación aleatoria de los extremos de ADNc). Se trata de una técnica basada en PCR (Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de Ia polimerasa) mediante Ia cual, se introducen oligonucleótidos de secuencia conocida dentro de secuencias desconocidas de ADNc, que son utilizadas como secuencia diana para Ia amplificación por PCR de Ia región de ADNc comprendida entre dichos oligonucleótidos y Ia región de interés. "Cushing hipofisario" se refiere al síndrome de "cushing" o hipercortisolismo. Se trata de una enfermedad ocasionada por el incremento de
Ia producción de Ia hormona cortisol o por el uso excesivo de ésta y otras hormonas esteroides. El "cushing" es hipofisario cuando es debido a un exceso de producción de hormona adrenocorticotropa por parte de Ia hipófisis o glándula pituitaria.
La presente invención comprende la determinación de Ia secuencia de ADN que codifica dos nuevas ¡soformas del receptor de somatostatina humano tipo 5 (sst5), denominadas sst5B y sstδC, de cinco y cuatro dominios transmembrana respectivamente, originadas por un ayuste alternativo del ARN mensajero contenido en Ia secuencia genómica depositada en base de datos con número de acceso GH 3937340 (Figura 1). Por medio del procedimiento descrito en el modo de realización de Ia invención, se obtienen moléculas de ADN recombinante que codifican polipéptidos que exhiben, al menos en parte de la secuencia, motivos estructurales de receptores de somatostatina. La invención también se refiere a secuencias polinucleotídicas de ADN que hibridan en condiciones restrictivas con las de estas nuevas isoformas, Io cual implica un nivel de homología de al menos un 60% entre sus secuencias de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) nucleótidos, preferentemente un 75% de homología y más preferentemente un 90% de homología, o bien que sean derivadas de ellas por degeneración del código genético o por mutagénesis.
El procedimiento utilizado en Ia invención permite Ia obtención de los polipéptidos recombinantes funcionales para su posterior estudio. Se lleva a cabo Ia inserción de los ADN recombinantes en vectores de expresión de forma que contengan una secuencia de nucleótidos como las descritas en SEQ ID 1 ,
SEQ ID 3, SEQ ID 5 y SEQ ID 7 o derivadas de ellas. Ambos polipéptidos expresados en vectores de expresión dentro de células hospedadoras proporcionan un sistema de escrutinio de nuevos fármacos y compuestos capaces de unirse in vivo e in vitro de forma selectiva a las isoformas sst5B y sstδC, así como sistemas de estudio de modulación de rutas de segundos mensajeros por cada una de las isoformas en respuesta a fármacos.
Así Ia invención objeto de Ia presente solicitud se refiere a un ácido nucleico humano purificado caracterizado porque codifica una isoforma del receptor de somatostatina humano tipo 5 (sst5) seleccionado entre: sst5B (SEQ ID 5), sst5C (SEQ ID 7), su secuencia complementaria, una secuencia con al menos un 90% de homología con las anteriores, y fragmentos de los anteriores. Asimismo, Ia invención también se refiere a un ácido nucleico humano purificado caracterizado porque comprende una secuencia parcial codificante contenida en SEQ ID 1 y SEQ ID 3.
En una realización concreta Ia invención se refiere a un ácido nucleico humano caracterizado porque comprende el fragmento 3'RACE PCR correspondiente al sstδB cuya secuencia es SEQ ID 1 , o fragmentos del mismo. En otra realización particular, Ia invención se refiere a un ácido nucleico humano caracterizado porque comprende el fragmento 31RACE PCR correspondiente al sst5C cuya secuencia es SEQ ID 3, o fragmentos del mismo. En una realización preferente, Ia invención se refiere a un polipéptido purificado caracterizado porque su secuencia de aminoácidos está definida en SEQ ID 2, SEQ ID 4, SEQ ID 6 y SEQ ID 8, y está codificada por uno de los oligonucleótidos descritos anteriormente en el texto.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Por otro lado, Ia invención se refiere a un vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente, transcripcionalmente acoplada a un promotor exógeno. En una realización concreta, dicho vector de expresión está caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido como el definido anteriormente en este texto.
En una realización concreta, los métodos descritos anteriormente se caracterizan porque se realizan in vitro. En una realización preferente dicha búsqueda se realiza en células completas. En una realización preferente, dicho método está caracterizado porque los polipéptidos detallados en SEQ ID 2, SEQ ID 4, SEQ ID 6 y SEQ ID 8, provienen de un vector de expresión definido anteriormente en el texto. En una realización más preferente, dicho polipéptido corresponde a uno de los codificados por SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, o fragmentos de los mismos.
Por otro lado, Ia invención también se refiere a nuevas parejas de oligonucleótidos detallados en las secuencias SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11 , SEQ ID 12, SEQ ID 13, y SEQ ID 14 o secuencias homologas a ellas en por Io menos el 90%, que permiten amplificar mediante PCR las isoformas A, B y C del sstδ humano. En una realización concreta, Ia invención se refiere al uso de dichos oligonucleótidos para Ia amplificación selectiva de las isoformas sstδA, sstδB y sstδC mediante cualquier variante de PCR. En una realización preferente, Ia invención también se refiere al uso de dichos oligonucleótidos para el estudio de Ia distribución tisular cuantitativa de sst5A, sst5B, o sstδC en tejidos normales y tumorales.
En otra realización concreta, Ia invención se refiere a un ADN copia caracterizado porque híbrida con las secuencias totales o parciales contenidas en SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID δ o SEQ ID 7. Por otro lado, la invención también se refiere a un ADN copia contenido en SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID δ SEQ ID 7 o secuencias homologas en al menos un 90%, caracterizado porque es capaz de silenciar independiente o conjuntamente Ia expresión génica de las isoformas sstδB y sstδC.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Una realización concreta de Ia presente invención se refiere al uso de secuencias contenidas en SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID 5 o SEQ ID 7 para Ia generación de anticuerpos selectivos que discriminen entre las isoformas sstδB y sstδC.
La presente invención permite además el desarrollo de nuevos fármacos capaces de unirse de forma selectiva a las nuevas isoformas del receptor de somatostatina de tipo 5, sstδB y sst5C, que actúen como agonistas, antagonistas o agonistas inversos empleando técnicas de medida de segundos mensajeros como Ia medida microfluorimétrica de calcio intracelular (Landa et al., 2005). Más específicamente, Ia inserción de los ADN recombinantes, contenidos en SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5 y SEQ ID 7 o derivados de ellos, en vectores de expresión eucariotas del tipo pCDNA3 (Invitrogen) permite Ia transfección de dichas construcciones recombinantes en líneas celulares tumorales del tipo CHO-K1 o HEK-293T, ampliamente utilizadas para el estudio de otros subtipos de receptores de somatostatina. El proceso, cuya metodología puede verse de forma más detallada en Landa et al., (Landa et al., 2005) puede esquematizarse de forma general según se indica:
(1) Cultivo de Ia línea celular que se va a transfectar, empleando cubreobjetos de vidrio estériles.
(2) Transfección de Ia línea celular con el plásmido recombinante de interés.
(3) Incubación de las células transfectadas con 2,5 μM de Fura- 2 AM (Molecular Probes, Eugene) durante 30 minutos a 37°
C, en medio DMEM suplementado con 20 mM de NaHCOs a pH 7,4.
(4) Montaje del cubreobjetos en el que están adheridas las células en una cámara acoplada a un microscopio invertido como el Nikon Eclipse TE 2000 E, acoplado a una cámara
CCD Hamamatsu (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu), ambos controlados con los software MetaMorph y MetaFluor (Molecular Devices).
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (5) Análisis de las células transfectadas con un objetivo de 4OX de inmersión en aceite, mediante Ia excitación selectiva a 340 y 380 nm y medida de Ia señal de emisión a 505 nm, a intervalos de 5 segundos. (6) Los cambios en Ia concentración de Ca2+ intracelular antes y después de Ia administración del fármaco en cuestión, son analizados como cociente de las intensidades de imagen obtenidas con las respectivas longitudes de onda de excitación a 340 y 380 nm mediante el uso del software MetaFluor.
La presente invención también posibilita el desarrollo de fármacos que alteren el estado basal de las nuevas isoformas del receptor de somatostatina tipo 5, sstδB y sstδC. De esta forma, Ia presente invención permitiría Ia utilización de Ia tecnología de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) para medir Ia interacción física de ambas isoformas sstδB y sstδC consigo mismas, así como con otras proteínas pertenecientes a Ia familia de GPCRs. Mediante esta técnica se pueden estudiar de forma rápida y precisa cambios en el estado basal del receptor, ya sean de agregación o disociación de complejos proteicos ternarios, en respuesta a un fármaco. Más específicamente, Ia inserción de los ADN recombinantes contenidos en SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID 5 y SEQ ID 7 o derivados de ellos, en vectores de expresión eucariotas variantes del tipo E-GFPN 1 (Clontech), como E-CFPN 1 y E-YFPN1 , permitiría Ia cotransfección de dichas construcciones recombinantes en líneas celulares tumorales del tipo HEK-293AD.
El proceso, cuya metodología puede verse de forma más detallada en Vilardaga et al., (Vilardaga et al., 2003) puede esquematizarse de forma general según se indica:
(1) Cultivo de la línea celular que se va a transfectar, empleando cubreobjetos de vidrio estériles.
(2) Cotransfección de Ia línea celular con los plásmidos recombinantes de interés.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (3) Montaje del cubreobjetos en el que están adheridas las células en una cámara acoplada a un microscopio invertido como el Nikon Eclipse TE 2000 E, acoplado a una cámara CCD Hamamatsu (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu), ambos controlados con los software MetaMorph y MetaFluor (Molecular Devices).
(4) Análisis de las células transfectadas con un objetivo de 4OX de inmersión en aceite, mediante Ia excitación selectiva a 440 y 495 nm y medida de Ia señal a 510 y 540 nm respectivamente, a intervalos de 5 segundos. (5) Los cambios en Ia intensidad de Ia señal de ambas moléculas fluorescentes antes y después de Ia administración del fármaco en cuestión, son analizados como cociente de las intensidades de imagen obtenidas con las respectivas longitudes de onda de emisión a 510 y 540 nm mediante el uso del software MetaFluor.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Esquema de amplificación de secuencias parciales correspondientes a las isoformas sst5B y sst5C mediante Ia técnica de 3'RACE PCR. Se presentan las etapas descritas en el texto y se muestran los oligonucleótidos utilizados en cada caso, según Ia nomenclatura de Ia Tabla 1.
Figura 2: Esquema de amplificación de las secuencias codificantes de las isoformas sst5B y sstδC mediante Ia técnica de amplificación por PCR y triple ligación. Se presentan las etapas descritas en el texto y se muestran los oligonucleótidos utilizados en cada caso, según Ia nomenclatura de Ia Tabla 1.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
A continuación se describe un ejemplo para Ia mayor ilustración de Ia invención, pero en modo alguno limitativo de Ia misma.
EJEMPLO
Para Ia clonación de secuencias parciales de las isoformas sst5B y sstδC se siguieron las siguientes etapas descritas en Ia Figura 1 :
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (1) Aislamiento dθ ARN total de varios tejidos tumorales y retrotranscripción.
(2) Amplificación de Ia región 3' de las isoformas sst5B y sst5C mediante RACE PCR; y (3) reamplificación utilizando oligonucleótidos anidados a los utilizados en el paso (2).
(4) Clonación de los productos de PCR del paso (3) y secuenciación para Ia determinación de su correcta secuencia.
(5) Comprobación del inicio de transcripción de las isoformas sst5B y sstδC mediante PCR utilizando como molde los ADN copia generados en (1).
(6) Reamplificación de (5) para comprobar Ia especificidad de las bandas de PCR obtenidas en dicho paso.
El método de amplificación descrito se realizó siguiendo las indicaciones del "GeneRacer® kit" de Invitrogen® life technologies, excepto los pasos (5) y (6).
Para Ia clonación de las secuencias codificantes y expresión funcional de las isoformas sstδB y sstδC se utilizó Ia estrategia esquematizada en Ia Figura 2:
(1) Tanto los exones 1 (E1) como los exones 2 (E2) correspondientes a cada una de las isoformas se amplificaron a partir de ADN genómico humano. (2) Digestión enzimática de los fragmentos de PCR, y
(3) ligación de los exones E1 y E2 entre si y dentro de un vector de expresión (no mostrado en el esquema).
Se diseñaron además parejas de oligonucleótidos capaces de discriminar cada una de las isoformas sst5A, sstδB y sstδC (SEQ ID 9 a SEQ
ID 14) y que pueden ser empleadas con fines cuantitativos, discriminando selectivamente cada isoforma en condiciones específicas de PCR detalladas posteriormente en el texto.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Aislamiento de ácidos nucleicos.
Aislamiento de ARN. Fue realizado utilizando el reactivo Trizol de Invitrogen®, de acuerdo a las recomendaciones indicadas por dicha casa comercial. Como material de partida para el aislamiento de ARN total dedicado a clonación, se utilizaron tejidos correspondientes a dos adenomas hipofisarios diagnosticados como tipo no funcionante y una muestra de "cushing" hipofisario. El ARN resultante se resuspendió en un volumen final de 12 μl de H2O tratada con DEPC, de los cuales se utilizó 1 μl para Ia cuantificación espectrofotométrica. Para Ia retrotranscripción, se utilizaron 2 μg de ARN de cada uno de los tumores, en un volumen final de 20 μl. También se utilizó ARN de Ia línea celular tumoral HeLa proveniente del "GeneRacer kit", utilizándose Ia misma cantidad de ARN para Ia reacción de retrotranscripción (Figura 1.1). Para Ia reacción de retrotranscripción se siguieron las indicaciones del "GeneRacer® kit" de Invitrogen®. Con fin diagnóstico también se utilizó una batería heterogénea de tejidos tumorales hipofisarios de los cuales se utilizó una cantidad de entre 15 y 100 mg para Ia extracción de ARN total. El ARN resultante también se resuspendió en un volumen final de 12 μl de H2O tratada con DEPC, de los cuales se utilizó 1 μl para Ia cuantificación espectrofotométrica. Para Ia retrotranscripción se utilizaron entre 2 y 5 μg de ARN de cada uno de los tumores, según el rendimiento de cada extracción. La reacción de retrotranscripción se llevó a cabo en un volumen total de 20 μl utilizando Ia enzima "PowerScript" de BD Biosciences, según las indicaciones del fabricante.
Aislamiento de ADN. Fue realizado utilizando el reactivo Trizol de Invitrogen®, empleando 107 linfocitos humanos como material de partida. El ADN genómico obtenido fue cuantificado espectrofotométricamente.
Amplificación por PCR y obtención de secuencias parciales de las isoformas sstδB y sst5C.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Como se indicó anteriormente, se utilizó el sistema de amplificación comercial "GeneRacer® kit" de Invitrogen® combinado con oligonucleótidos específicamente diseñados, señalados en Ia Tabla 1.
Tabla 1. Oligonucleótidos empleados para Ia amplificación selectiva de secuencias parciales de h-sst5B y h-sst5C.
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*Las bases que aparecen en cursiva representan dianas de restricción enzimática.
Tras Ia reacción de retrotranscripción se utilizaron 100 ng de ADN copia para cada reacción de PCR, empleando los oligonucleótidos Ra_hum_sst5_3' (SEQ ID 16) y GeneRacer 3' (Figura 1.3), en Ia que se sometió a las muestras a una desnaturalización inicial de 2 minutos a 94° C, seguida de cinco repeticiones de 30 segundos de desnaturalización a 94° C y 1 minuto 30 segundos de alineamiento y extensión a 72° C, además de otros treinta y cinco ciclos ¡guales al anterior, pero empleando una temperatura de alineamiento menos astringente de 66° C. El programa de amplificación continuó con 7 minutos de extensión a 72° C para finalizar Ia síntesis de productos de PCR incompletos. De cada producto de PCR, 1 μl fue reamplificado con los oligonucleótidos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) anidados Ra_hum_sst5_3'N (SEQ ID 17) y GeneRacer 3'N (Figura 1.4), sometiendo a las muestras a una desnaturalización inicial de 2 minutos a 94° C y posteriormente a treinta y dos ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 94° C, 30 segundos de alineamiento a 66° C y 40 segundos de extensión a 72° C. El programa de amplificación continuó con 7 minutos de extensión a 72° C para finalizar Ia síntesis de productos de PCR incompletos. Para ambas amplificaciones se utilizó Ia mezcla de polimerasas Certamp de Biotools suministrada con un tampón específico para mezclas complejas. Las distintas reacciones de PCR se llevaron a cabo con todos los ADN copia en paralelo. Los productos de PCR se visualizaron en gel de agarosa al 1 % y las bandas obtenidas se purificaron mediante el kit comercial QuiaQuick Mini Elute (Quiagen). Los productos de PCR así purificados se clonaron con extremos romos en el sitio de restricción EcoRV del vector pBluescript KSII+ y se secuenciaron, resultando en Ia secuencia correspondiente de 609 pares de bases (SEQ ID 1) obtenida a partir del ADN copia de células HeLa y otra secuencia de 197 pares de bases (SEQ ID 3), obtenida a partir del ADN copia proveniente del "cushing" hipofisario. Posteriormente ambos ADN copia obtenidos de células HeLa y "cushing" hipofisario, fueron amplificados con los oligonucleótidos Hum_sst5_ATG (SEQ ID 15) y GeneRacer 3' (Figura 1.5) y los productos de dichas reacciones fueron reamplificados con el mismo oligonucleótido Hum_sst5_ATG y el oligonucleótido anidado GeneRacer 3'N (Figura 1.6). Para ambas reacciones de amplificación mediante PCR se empleó el mismo programa consistente en 2 minutos de desnaturalización inicial a 94° C1 seguidos de 40 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 94° C, 30 segundos de alineamiento a 62° C y 1 minuto 30 segundos de extensión a 72° C. La visualización en gel de agarosa al 1% permitió comprobar Ia existencia de una banda de alrededor de 1 kilobase obtenida a partir de ADN copia de HeLa y de otra banda de alrededor de 700 pares de bases obtenida a partir de ADN copia del "cushing" hipofisario. Este resultado permitió comprobar que análogamente a las secuencias porcinas homologas ambas isoformas, denominadas respectivamente sstδB y sst5C, comparten un inicio putativo de Ia traducción común con Ia isoforma sstδA cuya secuencia era previamente
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) conocida y disponible en las bases de datos, con número de acceso GI39756975.
Obtención de las secuencias codificantes correspondientes a las isoformas sstδB y sstSC.
Para Ia clonación y expresión funcional de las isoformas sstδB y sst5C se siguió una estrategia basada en Ia amplificación independiente de los dos exones que constituyen cada isoforma (Figura 2) y una posterior ligación de ambos fragmentos dentro de un vector de expresión eucariota. Más específicamente, partiendo de ADN genómico como molde se amplificó mediante PCR el exón 1 (E1) de cada ¡soforma, empleando un oligonucleótido sentido común para sstδB y sstδC, sst5B-C_E1_U_Hindlll (SEQ ID 18) que incorpora una secuencia de restricción para Ia enzima Hindlll, y un oligonucleótido antisentido específico para cada isoforma, sst5B-E1_L_blunt (SEQ ID 19) y sst5C-E1_L_blunt (SEQ ID 22) para sstδB y sstδC, respectivamente (Figura 2.1 y 3.2). Los exones 2 (E2) se amplificaron de forma análoga, con las parejas de oligonucleótidos sentido y antisentido específicas sst5B-E2-U_blunt (SEQ ID 20)/ sst5B-E2- L_BamHI (SEQ ID 21) para Ia isoforma sstδB y sstδC-E2_U_blunt (SEQ ID 23)/ sstδC-E2_L_BamHI (SEQ ID 24) para Ia isoforma sstδC. Las cuatro reacciones de PCR se llevaron a cabo en paralelo utilizando un programa consistente en 2 minutos de desnaturalización inicial a 94° C, seguidos de 34 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 94° C, 30 segundos de alineamiento a 62° C y 40 segundos de extensión a 72° C. En todos los casos se utilizó una polimerasa de alta fidelidad de copia del tipo Pfu Ultra (Stratagene) suplementando las reacciones con 1M de betaina (Sigma). Mediante estas reacciones de PCR, se consiguió incorporar una secuencia de restricción para Ia enzima Hindlll en el extremo δ' de cada E1 , extremo romo en 3' del E1 , extremo romo en el δ' del E2 y una secuencia de restricción para Ia enzima BamHI en el extremo 3' de cada E2. Previamente se comprobó que ninguna de las enzimas de restricción tenía sitios de corte adicionales dentro de las secuencias de interés. Los fragmentos de PCR obtenidos se purificaron mediante el kit comercial QuiaQuick Mini Elute (Quiagen) y después de Ia digestión enzimática con Hindlll y BamHI fueron ligados mediante una reacción triple dentro del vector de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) expresión eucariota pCDNA3+ (Invitrogen) previamente Nnearizado con las enzimas de restricción anteriores. Ambas construcciones sst5B-pCDNA3+ y sst5C-pCDNA3+, fueron secuenciadas al menos por duplicado para comprobar Ia integridad de las secuencias y compararlas con Ia secuencia genómica GH 3937340, que contiene las dos isoformas, mediante el uso del programa BLAST 2 SEQUENCES http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi.
Amplificación selectiva diferencial con fines cualitativos de secuencias parciales correspondientes a las isoformas sstSA, sstδB y sst5C. Se desarrollaron parejas de oligonucleótidos con fin diagnóstico que permiten Ia discriminación selectiva por PCR de cada una de las isoformas del sst5 humano, sstδA (GI39756975), sstδB y sstδC. La pareja de oligonucleótidos Hum_sst5A_cuant_U / Hum_sst5A_cuantJ_, SEQ ID 9 y SEQ ID 10, respectivamente, amplifica un producto de PCR de 154 pares de bases utilizando una temperatura de alineamiento de 68° C. La pareja de oligonucleótidos Hum_sst5B_cuant_U / Hum_sst5B_cuant_L, SEQ ID 11 y SEQ ID 12, respectivamente, amplifica un fragmento de PCR de 142 pares de bases, utilizando una temperatura de alineamiento de 68° C, contenido en Ia secuencia correspondiente al sst5B (SEQ ID 5) y no amplifica las isoformas sstδC o sst5A (GI39756975), mientras que origina un producto de amplificación de 1643 pares de bases contenido en Ia secuencia genómica humana GM 3937340 y que incluye al íntrón situado entre los exones E1 y E2 de Ia isoforma sstδB. La pareja de oligonucleótidos Hum_sstδC_cuant_U / Hum_sstδC_cuant_L, SEQ ID 13 y SEQ ID 14, respectivamente, amplifica un fragmento de PCR de 137 pares de bases, utilizando una temperatura de alineamiento de 68° C, contenido en Ia secuencia correspondiente al sstδC (SEQ ID 6) y además amplifica un fragmento de 488 pares de bases contenido en Ia secuencia correspondiente al sstδB y otro fragmento de 1989 pares de bases contenido en Ia secuencia genómica humana GH 3937340 y que incluye al intrón situado entre los exones E1 y E2 de Ia isoforma sstδC. Las tres reacciones de PCR se realizan en paralelo utilizando un programa de PCR común consistente en una desnaturalización inicial de 2 minutos a 94° C y 37 repeticiones de 10 segundos a 94° C, 10 segundos de alineamiento a 68° C y 10 segundos de extensión a
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 720C. Mediante el uso de estas condiciones de PCR cada pareja de oligonucleótidos sólo amplifica de forma selectiva el fragmento de PCR específico de cada isoforma, sin amplificar las otras secuencias adicionales mencionadas anteriormente. En todos los casos se suplementaron las reacciones con betaina 1M (Sigma). Esta metodología permitió observar Ia presencia selectiva de Ia isoforma sst5B en varios tumores hipofisarios clínicamente clasificados como no funcionantes.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico humano purificado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica una isoforma del receptor de somatostatina humano tipo 5 (sst5) seleccionado entre: sstδB (SEQ ID 5), sstδC (SEQ
ID 7), su secuencia complementaria, una secuencia con al menos un 90% de homología con las anteriores, y fragmentos de los anteriores.
2. Un ácido nucleico humano purificado según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque comprende el fragmento 31RACE PCR correspondiente al sstδB cuya secuencia es SEQ ID 1 o fragmentos del mismo.
3. Un ácido nucleico humano purificado según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque comprende el fragmento 3'RACE PCR correspondiente al sstδC cuya secuencia es SEQ ID 3 o fragmentos del mismo.
4. Un polipéptido purificado caracterizado porque su secuencia de aminoácidos está codificada por un oligonucleótido definido en una de las reivindicaciones 1 a 3. δ. Un vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos definida en una de las reivindicaciones 1 a 3, transcripcionalmente acoplada a un promotor exógeno.
6. Un vector de expresión según Ia reivindicación δ, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido definido en Ia reivindicación 4. 7. Un vector de expresión según una de las reivindicaciones δ o 6, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos está seleccionada entre: SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID δ, y SEQ ID 7.
8. Parejas de oligonucleótidos definidos por las secuencias SEQ ID 9, SEQ ID 10, SEQ ID 11 , SEQ ID 12, SEQ ID 13, y SEQ ID 14, o secuencias homologas a ellas en al menos un 90%, caracterizadas porque permiten amplificar mediante PCR las ¡soformas A, B y C del sstδ humano.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
9. Uso de los oligonucleótidos descritos en Ia reivindicación 8 para Ia amplificación selectiva de las isoformas sst5A, sstδB y sstδC mediante cualquier variante de PCR.
10. Uso de oligonucleótidos según Ia reivindicación 9, para el estudio de Ia distribución tisular de sstδA, sst5B, o sst5C en tejidos normales y tumorales.
11. Un ADN copia caracterizado porque híbrida con las secuencias totales o parciales definidas en la reivindicación 1.
12. Un ADN copia contenido en SEQ ID 1 , SEQ ID 3, SEQ ID 5 y SEQ ID 7 o secuencias homologas en al menos un 90%, caracterizado porque es capaz de silenciar independiente o conjuntamente Ia expresión génica de las isoformas sst5B y sstδC.
13. Uso de las secuencias definidas en Ia reivindicación 1 para Ia generación de anticuerpos selectivos que discriminen las isoformas sstδB y sstδC.
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