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WO2008123537A1 - Ｄｎａメチル化測定方法 - Google Patents

Ｄｎａメチル化測定方法 Download PDF

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Publication number
WO2008123537A1
WO2008123537A1 PCT/JP2008/056524 JP2008056524W WO2008123537A1 WO 2008123537 A1 WO2008123537 A1 WO 2008123537A1 JP 2008056524 W JP2008056524 W JP 2008056524W WO 2008123537 A1 WO2008123537 A1 WO 2008123537A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
solution
seq
methylated
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2008/056524
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshitaka Tomigahara
Hirokazu Tarui
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Publication of WO2008123537A1 publication Critical patent/WO2008123537A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen.
  • Examples of a method for evaluating the methylation status of DN A ′ in the target DNA region of genomic DNA contained in a biological sample include methylated DNA in the target DNA region of genomic DNA. (For example, see Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11; 22 (15): 2990-7, and Proc Natl Acad Sci US A. 1997 Mar 18; 94 (6): 2284-9) )
  • the measurement method first, it is necessary to extract DNA containing a target DNA region from a DNA sample derived from genomic DNA: the extraction operation is complicated.
  • PCR polymerase chain reaction
  • An object of the present invention is to provide a method for easily measuring the content of methylated DNA in a target DNA region in genomic DNA contained in a biological specimen. ' That is, the present invention
  • a single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (a recognition site of a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA)
  • a single-stranded DNA containing no CpG in the methyl state is separated from the immobilized methylated DNA antibody into a single-stranded DNA (positive strand) (third (previous A) step:) .
  • the single-stranded DNA (positive strand) separated in the third (previous A) step is used as a saddle, and the single-stranded DNA (positive strand) has a partial base sequence (positive And complementary to the partial base sequence (positive strand) located further to the 3 ′ end than the 3 ′ end of the base sequence (positive strand) of the target DNA region.
  • an extension primer forward primer
  • the extension primer is extended once, so that the DNA (positive strand) in the single-stranded state is obtained.
  • the process of extending and forming double-stranded DNA (third (previous B) process) and the double-stranded DNA elongated and formed in the third (previously B) process are converted into single-stranded DNA containing the target DNA region ( Step of separating the DNA into a single-stranded DNA (negative strand) containing the target DNA region (positive strand) (third) Has a pre-C) step), and, as this process
  • the generated single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region is used as a cage, and the extension primer is extended once by using the foraging primer as an extension primer.
  • This step of extending and forming single-stranded DNA containing the target DNA region as double-stranded DNA—A (b) Using the generated single-stranded DNA (negative strand) containing the target DNA region as a cage, the partial base of the base sequence of the single-stranded DNA (negative strand) containing the target DNA region It is a sequence (negative strand) and is further to the end of the 3 ′ end of the 3 ′ end of the base sequence (negative strand) that is complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region.
  • extension primer By extending the extension primer once with the extension primer (reverse primer) having a partial base sequence (negative strand) and a complementary base sequence (positive strand) as the extension primer.
  • reverse primer having a partial base sequence (negative strand) and a complementary base sequence (positive strand) as the extension primer.
  • each of the steps is repeated after the elongated double-stranded DNA obtained in each step is once separated into a single-stranded state, and then methylated in the target DNA region. Amplify the amplified DNA to a detectable amount, and amplify the DN
  • a third step of quantifying the amount of A which is characterized by the following (hereinafter sometimes referred to as the present measuring method);
  • methylated DNA antibody in the third step is a methylcytosine antibody
  • a DNA sample derived from a genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample that has been digested in advance with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site.
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample digested with at least one methylation-sensitive restriction enzyme. The described method; 8. The method according to any one of 1 to 7 above, wherein the DNA sample derived from genomic DNA contained in the biological specimen is a DNA sample purified in advance;
  • a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA has a recognition cleavage site in the target DNA region of the genomic DNA contained in the biological sample.
  • methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA is Hhal which is a methylation sensitive restriction enzyme; .
  • the counter the method according to any one of 1 to 11 above, wherein an oligonucleotide is added; Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the amplification of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 from the prepared sample in Example 1 by PCR, and 1.5% of the obtained amplification product. It is the figure which showed the result used for agarose gel electrophoresis.
  • Sample “B” prepared from solution B, sample “A” prepared from solution A in UBC—M, “A” from DNA fragment Y2, sample “D” prepared from solution D in UBC—U, Results are shown for sample “C” prepared from UBC—U solution C, sample “A” prepared from solution B of UBC—U, and sample “A” prepared from solution A of UBC—U. .
  • Figure 2 shows that the sample prepared in Example 2 is labeled “A (no treatment)” or “B (ffiial treatment) ”is performed, the methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 is amplified by PCR, and the obtained amplification product 1.5% It is the figure which showed the result for which it used for the mouth-and-mouth gel electrophoresis.
  • FIG. 3 shows the arrangement of the sample that had been treated with methylated cytosine antibody in Example 3 in advance for either “A (no treatment)” or “B (Hhal treatment)”.
  • FIG. 5 shows the results of amplification of methylated DNA in the region consisting of the base sequence shown by No. 27 with PCR and subjecting the obtained amplification product to 1.5% agarose gel electrophoresis. .
  • FIG. 4 shows the amplification of the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 from the prepared sample in Example 4 by PCR, and the resulting amplification product.
  • FIG. 1 A diagram showing the results of 5% agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 5 shows the amplification of the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 from the prepared sample in Example 5 by PCR.
  • FIG. 5 shows the results of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK:”, methylated DNA fragment MY solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment Y solution “D” (negative) Control), methylated DNA fragment MY solution “MC”, unmethylated DNA fragment Y solution “C”, methylated DNA fragment MY solution “B”, unmethylated DNA The results are shown in solution “B” for fragment Y, solution “M′A” for methylated DNA fragment MY, and solution “A” for DNA fragment Y that is not methylated.
  • FIG. 6 shows the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 from the prepared sample in Example 6, using PCR.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of amplification and 1.5% agarose gel electrophoresis of the amplification product obtained. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MS solution “MC” (negative control), unmethylated DNA fragment S solution “C” ( Negative control), methyl 'methylated DNA fragment MS solution' MB ', unmethylated DNA fragment S solution' B ', methylated DNA fragment MS solution' MA ', methylated Not shown in DNA fragment S solution “A”, with results.
  • FIG. 7 shows the amplification obtained in Example 7 by amplifying methylated DNA in the target DNA region consisting of the salt sequence shown in SEQ ID NO: 72 from the prepared sample with PCR. It is the figure which showed the result of 1.5% agarose gel electrophoresis of the product. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK:”, methylated DNA fragment MT solution “MC” (negative control), methylated: not DNA fragment T solution “Cj (negative) Control solution), methylated DNA fragment MT solution “MB”, unmethylated DNA fragment T solution “B”, methylated DNA fragment MT solution “MA”, methylated The results for the DNA fragment T solution “A”, not shown.
  • FIG. 8 shows the amplification product obtained by amplifying methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 from the prepared sample in Example 8 using PCR.
  • HI showing the result of 5% agarose gel electrophoresis. From leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control) ) Methylated yeast genomic DNA solution "MC”, Unmethylated yeast genomic DNA solution "C”, Methylated yeast genomic DNA solution "MB”, Unmethylated yeast genomic DNA solution Results are shown for solution “B”, methylated yeast genomic DNA solution “MA”, and unmethylated yeast genomic DNA solution “A”. .
  • FIG. 1 shows the result of 5% agarose gel electrophoresis. From leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control) ) Meth
  • FIG. 9 shows the amplification product obtained by amplifying the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 from the prepared sample in Example 9 by PCR.
  • FIG. 5 shows the results of 5% agarose gel electrophoresis. From leftmost lane in the figure, DNA marker “MK:”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative) Control), methylated yeast genomic DNA solution “MC”, unmethylated yeast genomic DNA solution “C”, methylated yeast genomic DNA solution “MB”, unmethylated yeast genomic DNA solution Solution “B”, methylated yeast genomic DNA solution "MA”, unmethylated yeast 'genomic DNA solution "A”, shows the results.
  • FIG. 10 shows the amplification of the methylated DNA in the target DNA region consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 from the prepared sample by PCR.
  • FIG. 5 shows the results of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane, “MK:”, methylated DNA fragment MX solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment X solution “D” (Negative control) Methylated DNA fragment MX solution “MC”, Unmethylated DNA fragment X solution “C”, Methylated DNA fragment MX solution “MB” Results are shown for the unmethylated DNA fragment X solution “B”, the methylated DNA fragment MX solution “MA”, and the unmethylated DNA fragment X solution “A”. .
  • FIG. 11 shows the amplification product obtained in Example 11 by amplifying methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 from the prepared sample by PCR.
  • FIG. 12 is obtained by amplifying the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 from the prepared sample in Example 12 with PCR.
  • FIG. 5 shows the results of 1.5% agarose gel electrophoresis of amplification products. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK:”, methylated DNA fragment MT solution.
  • FIG. 13 shows the amplification of methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 from the prepared sample by PCR.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of 5% slag gel electrophoresis. From leftmost lane in the figure, DNA marker “MK:”, methylated human genomic DNA solution “MC” (negative control), unmethylated human genomic DNA solution “C” (negative control), methyl Results for the solution of methylated human genomic DNA “MB”, the solution of unmethylated human genomic DNA “B”, the solution of methylated human genomic DNA “MA”, and the solution of unmethylated human genomic DNA “A” Show.
  • FIG. 14 shows the results obtained by amplifying methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 from the prepared sample in Example 14 by PCR, and obtaining the amplified product 1
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of 5% agarose gel electrophoresis.
  • the DNA marker “MK”, methylated yeast Genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control), methylated yeast genomic DNA solution “MC”, unmethylated yeast genomic DNA Solution “C”, methylated yeast genomic DNA solution “MB”, unmethylated yeast genomic DNA solution “B”, methylated yeast genomic DNA solution “MA”, unmethylated yeast Results are shown for solution “A” of Genomic DN A.
  • FIG. 15 shows the amplification obtained in Example 15 by amplifying the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 from the prepared sample with PCR.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of electrophoresis of a product with 1.5% agarose gel.
  • DNA marker “MK:”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control) ), Methylated yeast genomic DNA solution “M (:”), Unmethylated yeast genomic DNA solution “C”, Methylated yeast genomic DNA solution “MB”, Unmethylated yeast genome Results are shown for DNA solution “B”, methylated yeast genomic DNA solution “MA”, and unmethylated yeast genomic DNA solution “A”.
  • biological specimen examples include, for example, a cell lysate, a tissue lysate (herein, tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.), or in mammals, plasma.
  • tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.
  • biological samples such as serum and lymph, body fluids such as body secretions (urine, milk, etc.), and genomic DNA obtained by extraction from these biological samples.
  • biological specimen examples include samples derived from microorganisms, viruses, and the like.
  • genomic DNA in the measurement method of the present invention means genomic DNAs such as microorganisms and viruses.
  • the measurement method of the present invention can be expected to be used in periodic health examinations and simple tests.
  • DNA extraction DNA may be extracted using a kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a normal method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (derived from cancer cells such as stomach cancer cells) Analysis of DNA derived from cancer cells such as gastric cancer cells, avoiding blood cell-derived DNA, cancer cells such as gastric cancer cells, tissues containing it, etc. Sensitivity for detection can be improved. Normally, there are four types of bases that make up a gene (genomic DNA).
  • methylated DNA means DNA produced by such methylation modification.
  • the “CpG pair” in the present invention means a double-stranded oligonucleotide formed by binding a base sequence represented by CpG and a complementary C pG by base pairing.
  • the “target DNA region” in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the target region) is a DNA region to be examined for the presence or absence of methylation of cytosine contained in the region, and includes at least one kind of DNA region. It has a recognition site for a methylation sensitive restriction enzyme. For example, Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor ⁇ bA305P22.2.
  • the useful protein gene is a Lysyl ox i dase gene, it is indicated by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences examples include genomic DNA nucleotide sequences containing exon 1 of the Lysyl oxidase gene derived from human ', and its promoter region located upstream of the gene.
  • genomic DNA nucleotide sequences containing exon 1 of the Lysyl oxidase gene derived from human ' and its promoter region located upstream of the gene.
  • SEQ ID NO: 1 corresponding to the base sequence represented by base numbers 16001 to 18661 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF270645
  • nucleotide sequence shown in sequence number 1 the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the Lysyl oxidase protein derived from human is shown in nucleotide numbers 2031 to 2033, and the nucleotide sequence of exon 1 above is shown. Is represented by nucleotide numbers 1957 to 2661. Cytosine in the nucleotide sequence represented by C p G present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, particularly C p in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Cytosine in C p G present in a region where G is densely present shows a high methylation frequency (ie, hypermethyl ation) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • a high methylation frequency ie, hypermethyl ation
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, base numbers 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661 168 2, 1686, 1696, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795, etc.
  • the useful protein gene is the HRAS-like suppressor gene Includes a base sequence containing one or more base sequences represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the HRAS-like suppres sor gene derived from human and the promoter region located 5 'upstream thereof can be mentioned.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 172001-173953 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC068162).
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 the base sequence of exon 1 of the HRAS-ike suppres sor gene derived from human is represented by base numbers 1'743-1953.
  • Cytosine in ' shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, base numbers 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 1405, 1409, 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449,: 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1479, 1483, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 1513, 1518, 1520
  • the cytosine shown by etc. can be mention
  • the useful protein gene is the M305P22.2.1 gene
  • the CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • Examples of the base sequence including one or more of the base sequences shown include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived bA305P22.2.1 gene and the promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 13001 to 13889 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL121673) can be mentioned. It is possible.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of bA305P22.2.1 protein derived from human is shown in nucleotide numbers 849 to 851, and the nucleotide sequence of exon 1 above is shown. Is shown in base numbers 663-889. Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 3, especially in the region where C p G is densely present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 3. The cytosine in CpG shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • a high methylation frequency ie, hypermethylation state
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, base numbers 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427 , '446, 465, 472, 486 etc. can be mentioned cytosine. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Gamma fil amin gene, the C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the base sequence containing one or more of the base sequences shown is the base sequence of the genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Ga thigh afil amin gene, and part 5 of the promoter region located upstream.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 63528 to 64390 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC074373) ).
  • the ATG codon encoding the methionine at the amino terminal of human-derived gamma fil amin protein is shown in base numbers 572 to 574, and the base sequence of exon 1 is base Numbers 463-863.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, base numbers 329, 333, 337, 350, 353, 360., 363, 370 379, 382, 384, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 505 and the like.
  • the useful protein gene is a HAND1 gene
  • the base sequence represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more of The base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the conventional HAND1 gene and the promo overnight region located 5 'upstream thereof can be given. More specifically, it is represented by SEQ ID NO: 5.
  • a base sequence (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base number 24303 26500 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC026688).
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the HAND1 protein derived from human is shown in base numbers 1656 to 1658, and the base sequence of the above exon 1 is base The number 1400-2198 is shown.
  • Cytosine in p′G shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, the base numbers 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, Examples include scissors represented by 1272, 1292, 1305, 1307, 1316, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434, and the like.
  • a useful protein gene is Homologue of RIKEN
  • the base sequence containing one or more base sequences indicated by CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translation region (coding region) is a human-derived homologue.
  • RIKEN 2210016F16 gene can include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 and the promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 .
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 corresponds to a complementary base sequence of the base sequence represented by base numbers 157056 to 159000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL354733.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 corresponds to a complementary base sequence of the base sequence represented by base numbers 157056 to 159000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL354733.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene is represented by nucleotide numbers 1392 to 1945.
  • the cytosine in it shows a high methylation frequency (ie, hypermethyl aUon) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in the gastric cancer cell J3 capsule for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, the base numbers 1172, 1175, 1180, 1183, 1189, 1204, 1209 1267, 1271, 1278, 1281, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378,
  • the cytosine shown by 1392, 1402, 1433, 1436, 1438 etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is the FLJ32130 gene
  • a base sequence including one or more sequences a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived FU32130 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (corresponding to the complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 2379 in the nucleotide sequence described in Genbank Accession No.
  • the ATG codon that encodes the amino acid terminal methionine of FLJ32130 protein derived from baboon is represented by base numbers 2136 to 2138, and the base sequence considered to be exon 1 is The base numbers 2136 to 2379 are shown.
  • the cytosine in G shows a high methylation frequency (ie, hypermethyl aU on) in cancer cells such as gastric cancer cells.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, the base numbers 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1795, 1814, 1894, The cytosine shown by 1911, 1915, 1925, 1940, 1955, 1968, etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is a PPARG angi opoi et in-related protein gene
  • its promoter region, untranslated region or translated region includes human-derived PPARG angiopoi et in-related protein gene exon 1 and 5 ′ upstream thereof.
  • the base sequence of genomic DNA containing a region of the promoter located can be mentioned, and more specifically, the base sequence shown by SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human-derived PPARG angiopoi et in-rel at ed prote in protein is represented by base numbers 717 to 719, and The base sequence of the 5 ′ portion of exon 1 is shown in base numbers 1957 to 2661.
  • cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, salt : group numbers 35, 43, 51, 54, 75, 85, 107, 127 , 129, 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251, 258 and the like.
  • the useful protein gene is a Thrombomodulin gene
  • the base represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • Examples of the base sequence containing one or more sequences include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived Thrombomodulin gene and the 5 'upstream promoter region.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471) can be mentioned.
  • the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human-derived Thrombomodulin protein is represented by base numbers 2590 to 2592.
  • the base sequence of exon 1 is The number 2048-6096 is shown. Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 9, especially in a region where C p G is densely present in the base sequence shown by SEQ ID NO: 9.
  • the cytosine present in CpG exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation) in cancer cells such as gastric cancer cells. More specifically, as cytosine with high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, base numbers 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, ', 1598, 1601, 1621, 1632, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, .1698, 1710,
  • the cytosine shown by 1724, 1726, ⁇ 56, etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is p53-responsive gene 2 gene, it is indicated by CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding 'region).
  • the base sequence including one or more base sequences include the genomic DNA base sequence containing exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene and a promoter region located 5 'upstream thereof. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 113501 to 116000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession! NO.
  • cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, the base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 131.5, 1319, 1349 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 and the like. More specifically, for example, when the useful protein gene is a Fibrillin gene, it is represented by C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences includes exon 1 of the Fibrillin gene derived from human and a promoter located 5 'upstream
  • the base sequence of genomic DNA containing one region can be mentioned, more specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (base number 118801 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC113387) It corresponds to a complementary sequence of the base sequence represented by ⁇ 121000.
  • the base sequence of exon 1 of the Fibrill in gene is shown in nucleotide numbers 1091 to 1345.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by C p G present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 has a high methylation frequency (that is, a highly methylated state (for example, in cancer cells such as knee cancer cells). hypermethyl at ion)).
  • cytosine having a high methylation frequency in a spleen cancer cell for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, the base numbers 679, 687, 690, 699, 746, 773, The cytosine shown by 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 etc. can be mentioned.
  • the useful protein gene is a neurofilament 3 gene
  • C p G present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the base sequence containing one or more of the base sequences indicated by is a genomic DNA base sequence containing exon 1 of a human-derived neurofilaments gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 28001 to 30000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived neurofilament 3 gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694.
  • Number 1 in 2 Cytosine in the base sequence shown by C p G present in the base sequence shown has a high methylation frequency (ie, hypermethyl at ion) in cancer cells such as, for example, presumptive cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in knee cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, the base numbers 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580 etc. can be raised.
  • a useful protein gene is di s integr in and
  • a nucleotide sequence containing one or more nucleotide sequences indicated by C p G present in the nucleotide sequence of the promoter region, non-translation region or translation region (coding region) As a specific example, the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human di s integr in and metal loprote inase domain 23 gene and the promoter region located 5 'upstream thereof can be mentioned. Includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 (corresponding to a base sequence represented by base numbers 21001 to 23300 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009225). In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13, the nucleotide sequence of exon ⁇ of human-derived lointe inase domain 23 gene is from nucleotide numbers 1194 to
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a high methylation frequency (ie, hypermethylated state (ie, hypermethylated state) in cancer cells such as knee cancer cells. at i on)).
  • cytosine having a high methylation frequency in pancreatic cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 base numbers 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026 1028, 1031, 1035, 1041, 1043, 1.045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1093, 1096, 1106, 1112, 1120, 1124, 1 126 etc. Can give.
  • the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene
  • Cp present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region)
  • the base sequence including one or more base sequences represented by G includes exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 (the salt represented by nucleotide numbers 75001 to 78000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009800) It corresponds to the base sequence.
  • base sequence represented by SEQ ID NO: 14 The base sequence of exon 1 of the G protein-coupled receptor 7 gene derived from human is shown in base numbers 1666 to 2652. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as, for example, a premature cancer cell. Indicates.
  • cytosine with high methylation frequency in spleen cancer cells for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, The cytosine shown by 1560, 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 etc. can be mentioned.
  • a useful protein gene is G-protein coupled
  • Nucleotide sequence including at least ⁇ base sequence '' The sequence includes exon 1 of the human Taki G-protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor gene and a promoter region located 5 'upstream thereof.
  • the base sequence of genomic DNA can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 (the base sequence represented by base numbers 57001 to 60000 of the base sequence described in Genbank. Accession No.
  • AC008971 It corresponds to the complementary sequence of the sequence.
  • the base sequence of exon 1 of human-derived G-protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor gene is represented by base numbers 776 to 2632.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as spleen cancer cells. Show.
  • cytosine having a high methylation frequency in spleen cancer cells includes, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 ′, nucleotide numbers 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, 514 , 522, 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 and the like. More specifically, for example, when a useful protein gene is a Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene, it exists in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region).
  • the base sequence containing one or more base sequences represented by C p G includes human origin 'Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene exon 1 and 5' upstream promoter region.
  • the base sequence of the contained genomic DNA can be mentioned, and more specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 (base sequences 78801 to 81000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC026802) It corresponds to the complementary sequence of the sequence.
  • SEQ ID NO: 16 base sequences 78801 to 81000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC026802
  • the base sequence of exon 1 of human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 is shown in base numbers 1479 to 1804.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 is, for example, cancer such as a premature cancer cell: high methylation frequency in the cell (ie, hypermethylation state) Indicates. More specifically, as succicin having high methylation frequency in S spleen cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, base numbers 1002, 1010, 1019, 1021, 1051, 1056, 1061 1063, 1080, 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184, and the like.
  • the “methylated DNA antibody” in the measurement method of the present invention means an antibody that binds with a methylated base in DNA as an antigen. Any antibody having the property of recognizing and binding to cytosine methylated at the 5-position in single-stranded DNA may be used, and more specifically, a methylcytosine antibody may be mentioned. Further, even a commercially available methylated DNA antibody may be used as long as it is capable of specifically recognizing and binding specifically to the methylated DNA described in this patent.
  • a methylated DNA antibody can be prepared by a conventional method using a methylated base, methylated DNA or the like as an antigen. Specifically, antibodies prepared using 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine as an antigen Can be prepared by selecting specific binding to methylcytosine in DNA as an index.
  • Antibodies obtained by immunizing animals with antigens include antibodies for the IgG fraction (polyclonal antibodies) and antibodies produced by a single clone (monoclonal antibodies).
  • polyclonal antibodies antibodies for the IgG fraction
  • monoclonal antibodies antibodies produced by a single clone
  • a cell fusion method As a method for producing a monoclonal antibody, a cell fusion method can be mentioned.
  • spleen cells (B cells) derived from immunized mice and myeloma cells are fused to produce a hyperidoma, and the antibody produced by the hyperidoma is selected, and a methylcytosine antibody (monoclonal) is produced.
  • Antibody When producing monoclonal antibodies by the cell fusion method, it is not necessary to purify the antigen. For example, 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or a mixture of DNA containing 5-methylcytosine is used as an antigen.
  • an antigen solution can be obtained by mixing the antigen with an adjuvant solution (for example, liquid paraffin and A race 1 A mixed with dead bacteria of Mycobacterium tuberculosis as an adjuvant) Can increase immunity.
  • an adjuvant solution for example, liquid paraffin and A race 1 A mixed with dead bacteria of Mycobacterium tuberculosis as an adjuvant
  • Can increase immunity Alternatively, add an equal amount of antigen-containing solution and adjuvant solution to make it sufficiently milky, then inject it subcutaneously or intraperitoneally into mice, or mix well with alum water and use pertussis killed as an adjuvant.
  • a method of adding It is also possible to boost the mouse intraperitoneally or intravenously after an appropriate period after the first immunization.
  • a solution in which the antigen is suspended may be directly injected into the mouse spleen for immunization.
  • the spleen is removed and the adipose tissue is removed, and then a spleen cell suspension is prepared.
  • the spleen cells are fused with, for example, HGPRT-deficient myeloma cells, to produce octabridomas.
  • Any cell fusion agent can be used as long as it can efficiently fuse spleen cells (B cells) and myeloma cells.
  • Sendai virus (HV J) poly And a method using ethylene glycol (PEG).
  • cell fusion may be performed by a method using a high voltage pulse.
  • an antigen-antibody reaction system can be used for the antibody detection method and antibody titer measurement method for selecting a hyperidoma producing the desired antibody.
  • antibody measurement methods for soluble antigens include radioisotope immunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (ELISA). 'If CpG present in the single-stranded DNA is methylated at least at one position, it can bind to the anti-methylated antibody.
  • “Methylated single-stranded DNA” in the measurement method of the present invention means single-stranded DNA in which CpG present in single-stranded DNA is methylated at least at one site. It is not limited to single-stranded DNA that has all methylated C p G's.
  • “(amplified to a detectable amount of methylated DNA in the target DNA region) and the amount of amplified DNA” refers to the genomic DNA contained in the biological sample. It means the amount of methylated DNA after amplification in the target region itself, that is, the amount determined in the third step of the measurement method of the present invention.
  • the biological specimen when the biological specimen is 1 mL of serum, it means the amount of DNA amplified based on the methylated DNA contained in 1 mL of serum.
  • the “single-stranded DNA comprising at least one CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA” refers to the restriction enzyme recognition site.
  • the single-stranded DNA that does not contain CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA refers to the restriction enzyme in the single-stranded DNA. This refers to single-stranded DNA in which cytosine in all C p G existing in the recognition site is methylated.
  • a methylated single-stranded DNA and an immobilized methylated DNA antibody are bound from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen, The single stranded DNA is selected.
  • the first step includes a first step (A) for separating methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen, and a methylated product.
  • the first step (B) involves selecting the single-stranded DNA by binding the single-stranded DNA to the immobilized methyl-DNA DNA antibody.
  • the first step (A) of the measurement method of the present invention when “isolating methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological sample”, two: one strand DNA In general, it is sufficient to operate to make a double-stranded DNA.
  • a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological sample may be dissolved in an appropriate amount of ultrapure water, heated at 95 ° C for 10 minutes, and then rapidly cooled in ice.
  • the “immobilized methylated DNA antibody” in step (B) of the measurement method of the present invention selects single-stranded DNA methylated from genomic DNA-derived DNA samples contained in biological samples. Used to do.
  • the immobilized methylated DNA antibody may be any antibody as long as it can be immobilized on a support.
  • the term “capable of being immobilized on a support” means that a methylated DNA antibody is directly or indirectly attached to a support. It means that it can be fixed.
  • the methylated DNA antibody may be immobilized on a support according to a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit / equipment (binding to a solid phase). Specifically, a support coated with streptavidin on a methylated D'NA antibody obtained by piotination of a methylated D'NA antibody (for example, a PCR tube coated with streptavidin, or coated with streptavidin) And fixing to a magnetic bead). .
  • a glass having a surface activated with a silane coupling agent or the like after a molecule having an active functional group such as an amino group, a thiol group, or an aldehyde group is covalently bonded to a methylated DNA antibody.
  • a method of covalently bonding to a saccharide derivative, silica gel, the above synthetic resin or the like, or a heat-resistant plastic support is also a method of covalently bonding to a saccharide derivative, silica gel, the above synthetic resin or the like, or a heat-resistant plastic support.
  • a covalent bond for example, a covalent bond may be made by using a spacer such as five triglycerides connected in series, a crosslinker, or the like.
  • the methylated DNA antibody may be directly immobilized on the support, or the antibody against the methylated DNA antibody (secondary antibody) is immobilized on the support, and the methylated antibody is bound to the secondary antibody. You may fix to a support body.
  • the immobilized methylated DNA antibody is immobilized on a support.
  • the single-stranded DNA (positive strand) and the immobilized methylated DNA antibody may be immobilized by the binding between the immobilized methylated DNA antibody and the support at the stage after the binding.
  • the first step (B) of the measurement method of the present invention “selecting the single-stranded DNA by binding a methylated single-stranded DNA and an immobilized methylated DNA antibody” Specifically, for example, “Piotin-labeled pyotinylated methylated cytosine antibody” may be used as the immobilized methylated DNA antibody, and the procedure may be carried out as follows.
  • Double-stranded DNA derived from genomic DNA contained in biological samples is buffered (for example, 33 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 mM K0Ac, lOmM MgOAc2, 0.5 mM
  • Dithothreitol Dithothreitol
  • the formed single-chain DN.A is added to an avidin-coated PCR tube on which a pyotinylated methylated cytosine antibody is immobilized, and then left at room temperature for about 1 hour. Promote binding between the cytosine antibody and methylated single-stranded DNA of the single-stranded DNA (formation of a conjugate) (At this stage, single-stranded DNA containing at least a non-methylated DNA region) Does not form a conjugate.) After that, the remaining solution is removed and washed.
  • wash buffer eg, 0.053 ⁇ 4 Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH2P04, 3 mM Na2HP0 ⁇ 7H20, 15 mM NaCl pH7.)] At a rate of 100 L / tube and remove the solution. Repeat this wash several times to leave the conjugate in the PCR tube (select conjugate).
  • the specific description of the first (A) step and the first (B) step is not limited to the above description.
  • the buffer used in (b) is not limited to the buffer as long as it is suitable for separating a double-stranded DNA derived from a genomic DNA derived from a biological sample into a single-stranded DNA.
  • the washing operations in (a) and (c) may be performed by the non-immobilized methylated DNA antibody floating in the solution, or the methylation floating in the solution that is not bound to the methylated DNA antibody. This is important for removing unsuspended single-stranded DNA or DNA suspended in a solution that has been extinguished with the restriction enzyme described below from the reaction solution.
  • the washing buffer only needs to be suitable for removing the above-mentioned free methylated DNA antibody, single-stranded DNA floating in the solution, etc.
  • FIA buffer PerkinElmer, Tris-HC1 pH 7.8 with Tween 80
  • TEA buffer etc.
  • the single-stranded DNA selected in the first step is digested with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA.
  • the single-stranded DNA selected in the first step is digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA, and then a free digest produced (single strand as described above). What is necessary is to remove at least one single-stranded DNA containing a Cp 0. in the methylated state at the recognition site of a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting DNA.
  • Methods of the second step of the measurement method of the present invention means, for example, that a recognition sequence containing methylated cytosine is not digested, but only a recognition sequence containing unmethylated cytosine is digested. It means a restriction enzyme that can be used. That is, in the case of a DNA in which the saccharin contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation sensitive restriction enzyme is methylated, the methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act on the DNA. The DNA is not cleaved.
  • methylation-sensitive restriction enzyme acts on the DNA. If so, the DN A will be disconnected.
  • a methylation-sensitive enzyme include HpaII, BstUK Narl, SacII, Hhal and the like.
  • the methylation-sensitive restriction enzyme is a double-stranded DNA containing a CpG pair in the hemimethyl state (that is, the cytosine of one strand of the CpG pair is methylated and the cytosine of the other strand is methylated). It does not cleave double-stranded DNA that is not methylated at the syn) and has already been revealed by Gruenbaum et al. (Nucleic Acid Research, 9, 2509-2515).
  • Methods of digesting single-stranded DNA refers to, for example, non-methylated cytosine that does not digest a recognition sequence containing methylated cytosine in single-stranded DNA. It means a restriction enzyme that can digest only the recognition sequence. That is, some methylation-sensitive restriction enzymes digest single-stranded DNA. The For example, Hhal and the like can be mentioned.
  • the target DNA region PCR is performed using a primer pair that can amplify DNA containing a recognition sequence containing cytosine to be analyzed, and the presence or absence of DNA amplification (amplified product). You can give a way to check. When cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained. On the other hand, if the cytosine to be analyzed is not methylated, an amplification product cannot be obtained. In this way, by comparing the amount of amplified DNA, the ratio of cytosine to be analyzed can be measured.
  • the target DNA region is in a single-stranded state, and the negative-strand oligonucleotide is the target DNA region. Since it does not bind, the single-stranded DNA is a single-stranded DNA derived from genomic DNA contained in a biological specimen. In addition, as described above, in the single-stranded DNA, not all CpGs in the target DNA region are methylated.
  • the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA does not cleave the single-stranded DNA in the methyl state, in the genomic DNA contained in the biological sample It is possible to distinguish whether or not cytosine in at least one C p G present in the recognition site of the restriction enzyme that can digest the single-stranded DNA is methylated, The content of methylated DNA in the target DNA region can be determined more accurately.
  • the single-stranded DNA selected by forming a conjugate with the methyl babies antibody Digestion with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, making it possible to select only single-stranded DNA containing the target DNA region that is truly methylated. Yes. That is, by digesting with the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA, it is assumed that the genomic DNA contained in the biological sample is assumed.
  • the CpG cytosine at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA contained in the target DNA region of single-stranded DNA derived from nom is methylated
  • a methylated DN ⁇ antibody is bound to the recognition site of a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting strand DNA, but it is included in the target DNA NA region of the genomic single-stranded DNA.
  • the CpG cytosine at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting strand DNA is not methylated, methylated DNA antibody is not bound, so methylation that can digest single-stranded DNA Digested by sensitive restriction enzymes.
  • the genomic DNA contained in the biological specimen is If at least one cytosine in the recognition site of the restriction enzyme is not methylated in CpG, no PCR amplification product can be obtained, while in biological samples. If cytosine in all C p G existing in the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA in the genomic DNA contained in An amplified product by PCR will be obtained.
  • methylation-sensitive restriction enzymes cannot digest single-stranded DNA even in the unmethylated state, but as mentioned above, some methylation-sensitive restriction enzymes can digest single-stranded DNA in the unmethylated state.
  • An example of a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA is Hhal.
  • Hhal a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA
  • the second step of the measurement method of the present invention may be performed as follows.
  • the single-stranded DNA selected in the first step is digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA, and then the resulting free digest ⁇ (as described above) Removal and washing (DNA purification) of at least one single-stranded DNA containing CpG in an ammethyl state at the recognition site of a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA.
  • 'More specifically, for example, when using a PCR tube coated with streptavidin, first remove the solution by pipetting or decantation, and then add TE to the volume of the biological sample. After adding the buffer, the TEA buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • the TE buffer can be removed by pipetting or decanting.
  • digested material single-stranded DNA containing at least one or more amethylated CpG at the recognition site of the restriction enzyme
  • DNA purification DNA purification
  • the above washing operation is not always necessary.
  • all the solutions obtained by the methylation-sensitive restriction enzyme treatment can be used in the third step.
  • the methylation sensitization capable of digesting single-stranded DNA in the second step of the measurement method of the present invention As a concern in the digestion treatment with sex restriction enzymes, there is a possibility that a recognition sequence containing unmethylated cytosine cannot be completely digested (so-called “DNA residue”). If such a concern becomes a problem, if there are many recognition sites for methylation-sensitive restriction enzymes capable of digesting single-stranded DNA, DNA residue can be minimized.
  • the target DNA region has at least one recognition site for a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, and the more recognition sites, the better.
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site.
  • a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site.
  • One preferred embodiment is that it is a prepared DNA sample.
  • the short type D NA is easier to select, and the purpose of PCR When amplifying a region, it is considered better to have a short cage DNA.
  • a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site is added to a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample. It may be used directly for digestion.
  • a general restriction enzyme treatment method may be used as a method of digesting with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site.
  • a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen is a DNA sample that has been digested with at least one or more methylation-sensitive restriction enzymes. be able to.
  • the amount of methylation can be obtained with high accuracy by previously digesting the biological specimen itself with the restriction enzyme as described above.
  • This method is useful for eliminating “DNA fragments” as described above.
  • a method for digesting a sample derived from genomic DNA contained in a biological sample with a methylation-sensitive restriction enzyme the same method as described above may be used when the biological sample is genomic DNA itself. If the specimen is tissue lysate, cell lysate, etc.
  • T-extinction treatment is performed using a large excess of methylation sensitive restriction enzyme, for example, 500 times (10U) or more methylation sensitive restriction enzyme for 25 ng of DNA. Just do it.
  • Genomic DNA basically exists as double-stranded DNA. Therefore, in this operation, not only methylation-sensitive restriction enzymes that can digest single strands (eg, fflial), but also methylation-sensitive restriction enzymes that can digest double-stranded DNA (eg, HpaII, BstUL NarK SacII, fflial etc.) can be used.
  • methylation-sensitive restriction enzymes that can digest single strands
  • double-stranded DNA eg, HpaII, BstUL NarK SacII, fflial etc.
  • a single-stranded DNA that does not contain CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme is separated from the immobilized methylated DNA antibody into a single-stranded DNA (positive strand).
  • extension primer forward primer having a certain base sequence (negative strand) as an extension primer
  • the extension primer is extended once, so that the DNA in the single-stranded state (positive strand) ) As a double-stranded DNA (third (previous B) step) and the third (previously B) double-stranded DNA that has been formed into a single-stranded DNA containing the target DNA region.
  • the single-stranded DNA (negative strand) that contains the target DNA region is A partial base sequence (negative strand) of the base sequence of the single-stranded DNA (negative strand) containing the target DNA region, and the base sequence (positive strand) of the target DNA region
  • This step of extending the single-stranded DNA A containing the target A region as a double-stranded DNA by extending the extended primer one time using the primer (reverse primer one) as an extension primer.
  • each of these steps is once separated into a single-stranded state after the extended double-stranded DNA obtained in each step is repeated, whereby methylation in the target DNA region 'is performed. Amplify the DNA to a detectable amount and quantify the amount of amplified DNA.
  • the third step of the measurement method of the present invention first, among the following steps of each of the following steps, as the third (previous : A) step, single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (described above) Single-stranded DNA that does not contain CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA) is separated from the immobilized methylated DNA antibody in the single-stranded state. Make it a certain DNA.
  • a single-stranded DNA which is an undegraded product obtained in the second step (the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA does not contain Cp G in the methyl state).
  • the resulting mixture is heated at 95 ° C. for several minutes to obtain single-stranded DNA (positive strand).
  • the third (previous B) step specifically, for example, the single-stranded DNA (positive strand) obtained in the third (previous A) step and the forward primer are mixed with sterile ultrapure water.
  • L, 3 ⁇ L of an optimal buffer e.g.
  • the Tm value of the forward primer is about Cool immediately to a temperature as low as 0 to 20 ° C, and keep at that temperature for several minutes.
  • the DNA in the single-stranded state annealed in (i) above is used as a saddle type, the primer for extension is used as an extension primer, and the primer is extended once.
  • the single-stranded DNA containing the DNA region to be extended is formed as double-stranded DNA (ie, third step 1 A). Specifically, for example, it may be carried out in accordance with the following explanation or the operation method in the extension reaction in the third (previous B) step of the measurement method of the present invention described above.
  • the extension primer (reverse primer) having a base sequence (negative strand) complementary to the partial base sequence (negative strand) located at is used as an extension primer, and the extension primer is extended once.
  • the DNA, which is in the single-stranded state, is used as an extended double-stranded DNA (that is, third step 1B). Specifically, for example, it may be carried out according to the operation method in the extension reaction in the third (previous B) step, as in the third step 1A of (iii) above. '
  • step B) the methylated DNA in the target DNA region is examined. Amplify until the amount is available and quantify the amount of amplified DNA.
  • the third step is the reaction from the third (previous A) step to this step. It can also be carried out as a single PCR reaction.
  • the third (previous A) step to the third (previous C) step can be performed as independent reactions, and only this step can be performed as a PCR reaction.
  • PCR As a method for amplifying a target DNA region (ie, a target region) after digestion with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, for example, PCR can be used.
  • a target region is amplified, by using a primer previously labeled with fluorescence or the like as an indicator, the presence or absence of an amplification product can be evaluated without performing cumbersome operations such as electrophoresis.
  • the PCR reaction solution for example, the DNA obtained in the second step of the measurement method of the present invention is prepared by adding 0.15 1 of a 50 M primer solution, 2.5 1 of 2 mM dNTP, and 10 ⁇ buffer (lOOmM Tris-HCl pH).
  • the reaction may be carried out by adding an appropriate amount of betaine, DMSO, etc. at times.
  • the above reaction solution is kept at 95 ° C. for 10 minutes, then at 95 ° C. for 30 seconds, then at 55 to 65 ° C. for 30 seconds and further at 72.
  • One example is a condition in which 30 to 40 cycles are performed for one cycle per second. After performing such PCR, the obtained amplification product is detected.
  • the amplification amount in the PCR reaction can be evaluated by measuring the amount of the fluorescent label after performing the same washing and purification operation as before.
  • Real-time PCR is a method of monitoring PCR in real time and analyzing the obtained monitoring results by force kinetics. For example, high-precision quantification that can detect even a slight difference of about twice the gene amount. This method is known as the PCR method.
  • the real-time PCR method examples include a method using a probe such as a saddle-type dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intermediary such as Cyber Green. Commercially available equipment and kits for real-time PCR may be used.
  • the detection is not particularly limited, and detection by any known method can be performed. In these methods, the operation up to the detection can be performed without changing the reaction container.
  • the third step can be performed without performing a digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA. Objective: If there is no base sequence that can be digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA in the DNA region to be, the third step may be performed without performing the second step.
  • a preferred embodiment for separating methylated single-stranded DNA includes addition of a counter oligonucleotide.
  • the counter oligonucleotide is a short oligonucleotide having the same base sequence as the target DNA region. The length is usually 10 to 100 bases, more preferably 20 to 50 bases. Note that the counter oligonucleotide is not designed on the base sequence that the forward primer or reverse primer binds complementarily to the target DNA region. Counter-oligonucleotide is added in a large excess compared to genomic DNA, and the target DNA region is made single-stranded (positive strand) and then bound to the immobilized methylated DNA antibody.
  • the amount of Kanuta oligonucleotide is at least 10 times, usually 100 times or more, compared to the target DNA region.
  • “adding a counter oligonucleotide when separating methylated single-stranded DNA” refers to methylated DNA samples derived from genomic DNA contained in biological samples.
  • a DNA sample derived from a genomic DNA contained in a biological specimen is mixed with a counter oligonucleotide, and the complementary strand of the target DNA region and the counter oligonucleotide are mixed together.
  • the double strands may be formed.
  • the DN A and the sample, the counter one Origonuku Reochido, buffer (330mM Tris- Acetate pH 7.9, 660mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2, ⁇ ⁇ 5mM Dithiothreitol) and 5 L, M g C 1 2 solution 5 LOOmM / L and 5 mg L of lmg / mL BSA solution, add sterilized ultrapure water to the mixture to a volume of 50 L, mix, heat at 95 ° C for 10 minutes, and heat to 70 ° Cool quickly to C, incubate for 10 minutes at that temperature> then cool to 50, incubate for 10 minutes, and then incubate for 10 minutes at 37 ° C, then return to room temperature.
  • abnormal DNA methylation occurs in various diseases (for example, cancer), and it is considered that the degree of various diseases can be measured by detecting this abnormal DNA methylation.
  • DNA region that is 100% methylated in genomic DNA contained in a sample derived from a disease patient there is a DNA region that is 100% methylated in genomic DNA contained in a sample derived from a disease patient, and if the measurement method of the present invention is performed on that DNA region, the amount of methylated DNA will increase. I will.
  • there is a DNA region that is not 100% methylated in genomic DNA contained in a sample derived from a disease patient and if the measurement method of the present invention is performed on that DNA region, the amount of methylated DNA Will be close to zero.
  • healthy living organisms DNA region that is hypomethylated in the genomic DNA contained in the sample of origin and hypermethylated in the genomic DNA contained in the biological sample of the patient with the disease
  • the amount of methylated DNA is close to 0 in the case of healthy subjects, while in the case of patients with diseases. Shows a value significantly higher than the value in the case of a healthy person, and therefore the “degree of disease” can be determined based on the difference between the values.
  • the “degree of disease” here has the same meaning as that generally used in this field. Specifically, for example, when the biological specimen is a cell, it means the malignancy of the cell.
  • the measurement method of the present invention makes it possible to diagnose various diseases by examining methylation abnormality.
  • a restriction enzyme, primer or probe that can be used in various methods for measuring the amount of methylated DNA in the target region is useful as a reagent for a detection kit.
  • the present invention also provides a detection kit containing these restriction enzymes, primers or probes as reagents, and a detection chip in which these primers or probes are immobilized on a support.
  • the scope of rights of the measurement method includes use in the form of a detection chip as described above, which utilizes the substantial principle of the method.
  • a commercially available methylated cytosine antibody (Aviva Systems Biology) is listed in the catalog using a commercially available biotinylated kit (Biot in Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories). According to the method described, it was labeled with piotin.
  • Solution of the resulting biotin-labeled methylated cytosine antibody [antibody about 0.1 ⁇ / 100 1 ⁇ 0.13 ⁇ 4 BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 ⁇ 7H 20 , 15 complement NaCl pH 7.4) The solution was stored refrigerated.
  • oligonucleotide solutions Separately synthesize methylated oligonucleotides UB C—-M consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and unmethylated oligonucleotides UBC— U consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 respectively.
  • oligonucleotide solutions were prepared.
  • N represents methylated cytosine.
  • PCR is performed on the PCR tubes thus obtained using the primer solutions (PF and PR) consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and the following reaction conditions:
  • PF and PR primer solutions
  • the methylated DNA in the target DNA region UBC SEQ ID NO: 21, methylated cytosine is also represented by C
  • a commercially available methylated cytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology) was labeled using a commercially available pyotinization kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog.
  • the resulting biotin-labeled methylated cytosine antibody in solution [antibody approx. 0 lg / 50 L ⁇ .13 ⁇ 4 BSA-containing phosphate buffer (ImM K3 ⁇ 4P0 3 mM Na 2 ⁇ 7 ⁇ 20 , 154 mM NaCl pH 7.4)
  • the solution was stored refrigerated.
  • oligonucleotide solutions Partially methylated oligonucleotide that is not digested with HhaI consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 2 GPR 7— 2 0 7 9-2 1 7 6/9 8mer-M (7), SEQ ID NO: 2 Partially methylated oligonucleotide digested with Hha I consisting of the base sequence shown GPR 7—207 9—2.1 7 6 / 98mer—HM (5), unmethylated oligo consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 Nucleotides GPR 7-2 0 7 9-2 1.76 / 98me r UMs were synthesized separately to prepare 0. l pmo 1/50 L TE buffer solutions (hereinafter referred to as oligonucleotide solutions).
  • N represents methylated scissin.
  • N represents methylated cytosine
  • the oligonucleotide solution 5 OL prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the above-mentioned pyotin-labeled methylated cytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 1 hour. After removing the solution in the PCR tube by pipetting, add 100 L of wash buffer [0.05%
  • Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0-7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4)] was added. Next, the buffer of the tube ⁇ was removed by pipetting. This operation was repeated two more times (or more, the first step of the present measuring method: corresponds to). The samples thus obtained were subjected to the following cocoon treatment or cocoon treatment (prepared for each one). .
  • A-treated group (untreated group): Buffer (330 mM Tris-Acetate ⁇ 7,9, 660 mM KOAc, lOOmM Mg0Ac 2 , 5 mM Dithiothreitol) IOL and BSA (Bovine serum albumin lmg / mL) ) After adding IOL, sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 100 L. .
  • Buffer 330 mM Tris-Acetate ⁇ 7,9, 660 mM KOAc, lOOmM Mg0Ac 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • BSA Bovine serum albumin lmg / mL
  • B treatment group Hha I treatment group: The sample prepared above was mixed with buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac 2 , 5 mM Dithiothreitol) 1 O ⁇ L, BSA (Bovine serum albumin l'mg / mL) After adding IOL and 64 U of Hha I, sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 50 0 L. Each reaction was incubated at 37 for 3 hours.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • BSA Bovine serum albumin l'mg / mL
  • PR2 5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • GPR7-2079-2176 5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGC
  • the DNA in the vertical form 5 L each of the primer solution consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 prepared in 3, and ea.ch 2 mM dNTP 5 ⁇ L Buffer solution (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500iM KCK 15mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 L, thermostable DNA polymerase (Amp liTaq Gold) 5UZ 0.25 L, 5 N betaine aqueous solution 10 Then, the mixture was further added with sterile ultrapure ice to make the liquid volume 50.
  • the reaction solution was incubated at 95 at 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of incubation at 95 for 30 seconds, 59 at 30 seconds and 72 at 45 seconds for one cycle. - After PCR, the obtained amplification product was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis to confirm DNA amplification. The result is shown in FIG. 2 (this corresponds to the third step of the measurement method of the present invention).
  • the partially methylated oligonucleotide GP 7-2079-2176 / 98mer-M (7) which is not digested with Hha I, was confirmed to have amplified DNA.
  • the product targeted DN A region: GPR7-2079-2176
  • GPR7-2079-2176 partially methylated oligonucleotide digested with Hha I GPR 7- 207 ⁇ 9-2176 / 98mer-HM (5)
  • amplification of DNA was not confirmed with the unmethylated oligonucleotide G 7-2079 _2176 / 981116 1 "-1; no amplification product was obtained.
  • immobilized methylated cytosine antibody It is possible to select a single-stranded DNA containing the target DNA region that has been methylated, and to limit methylation sensitivity by treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • a commercially available methylated cytosine antibody (Aviva Systems Biology) is described in the Kata log using a commercially available pyotinization kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories). According to the method described, it was labeled with piotin.
  • the resulting biotin-labeled methylated scissin antibody was used as a solution [antibody about 0.1 ⁇ / 50 ⁇ 1 ⁇ 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , '3 mM Na 2 HP0 ⁇ 7H 2 0, 154m NaCl pH7 ) Refrigerated as a solution].
  • Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0-7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4)] was added. Thereafter, the buffer in the tube was removed by pipetting. This operation was repeated two more times.
  • oligonucleotide solution Partial methylation not digested with Hti a I consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 Oligonucleotide G PR 7-2079-2176 / 98me r -M (7), Hha consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 Partially methylated oligonucleotide digested with I GPR 7-2079-2176 / 98me r -HM (5), unmethylated oligonucleotide GPR 7— 2079-2 1 76 / 98me r — UM was synthesized separately to prepare 0. l pmol / 50 xL TE buffer solution (hereinafter referred to as oligonucleotide solution).
  • N represents methylated cytosine
  • N represents methylated cytosine
  • Treatment group (untreated group): Samples prepared above (each l O iL) were mixed with buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5raM Dithiothreitol) 5 : and BSA (Bovine serum albumin lmg / mL) 5 L was added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 50 L.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5raM Dithiothreitol
  • BSA Bovine serum albumin lmg / mL
  • B treatment group Hha I treatment group: Samples prepared above (10 L each) were mixed with buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) 5 and BSA ( Bovine serum albumin lmg / mL) 5 L and Hhal 64U were added, and then sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50. Each reaction was incubated at 37 ° C for 3 hours.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • BSA Bovine serum albumin lmg / mL
  • the entire reaction solution was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylated cytosine antibody prepared above was immobilized, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, remove the solution in the PCR tube by pipetting, and then wash with 100 / L washing buffer.
  • PR2 5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • the partially methylated oligonucleotide GP R7—2079—21 76 / 98me r—M (7) which is not digested with Hha I, has been confirmed to have been amplified.
  • the target DNA region: GPR7—2079—2176) was obtained, but the partial methyl oligonucleotides digested with Hh ⁇ aI.
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology) can be used according to the method described in the catalog using a commercially available biotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories). Piotin labeled. Refrigerated Piochin labeled methylcytosine antibody obtained as a solution Antibody about 0.25 g / iL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4, 3mM Na 2 HP0 ⁇ 7 ⁇ 2 0, 154mM NaCl pH7.4) solution] saved.
  • PR 1 5'-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 '(SEQ ID NO: 29)
  • PCR reaction solutions 5 ng of genomic DNA in a bowl shape, each 3 1 oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, each 2 mM dNTP, and 1 OX buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I) 5U / 1 mixed with 0.25 1 Pure water was added to make the volume 50 1. The reaction solution was incubated at 95 for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 for 30 seconds, then 6: TC for 30 seconds and 72 for 45 seconds.
  • DNA fragment X was purified using Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA). About a part of the obtained DNA fragment solution, Sssl methylase (manufactured by NEB) 1 1, 10 x NEBuf fer 2 (manufactured by NEB) 1 0 1, S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) was mixed with 11 and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a solution with a volume of 100 1.
  • Sssl methylase manufactured by NEB
  • 10 x NEBuf fer 2 manufactured by NEB
  • S- adenosyl methionine 3.2 mM, NEB
  • reaction solution was incubated at 37 ° C for 15 to 30 minutes, and further S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was added to add 1 1 at 37 ° C. Incubated for 0 min. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, these operations were repeated 5 times to obtain methylated DNA fragment (MX, SEQ ID NO: 3 1.).
  • Solution B lOpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MX.
  • Solution MA 100pg / 10 6L TE solution
  • Solution MB lOpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution MC lpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution) 'In addition, the bases represented by SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 44 that can bind by complementarity to the negative strand of the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 A counter-oligonucleotide C1 to C12 consisting of a sequence was synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 M was prepared.
  • a PCR tube prepare the DNA fragment solution 1 O ⁇ L prepared above, 10 L of the counter-oligonucleotide solution prepared above, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei tol) 5 L, lOOmM M 8. 1 2 solution 5 was added BSA solution 5 L of lmg / mL, the liquid volume of 5.0 L further added with sterile ultrapure water to the mixture and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • Streptavidin coated with the above-mentioned pyotin-labeled methylcytosine antibody immobilized ⁇ 50 L of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the PCR tube and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF 1 and PR 1 consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, and the reaction conditions shown below:
  • the methylated DNA in the target DNA region X ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 was amplified.
  • PR1 5'-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • the PCR reaction solution is a type IV DNA, 3 L each of oligonucleotide primer solution prepared in 5 M, 5 L each 2 mM dNTP, buffer solution
  • Piotin labeled Using a commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) and a commercially available piotisylated kit (Biot in Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog, Piotin labeled. Obtained Piotin-labeled methylcytosine antibody 'as a solution [antibody 0.25 ug / fl 0.13 ⁇ 4 BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 • 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) solution] Stored refrigerated.
  • oligonucleotide primer primers (PF 2 and PR 2) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 below and reaction conditions PCR was performed to amplify a DNA fragment (Y, a region corresponding to nucleotide numbers 76606 to 76726 shown in SEQ ID NO: 47, Genbank Accession No. ac009800, etc.) used as a test sample.
  • PR 2 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3 '(SEQ ID NO: 46)
  • PCR reaction solution 5 ng of genomic DNA to form a cage, 3 1 each of oligonucleotide primer solution prepared in 5 M, 5 1 each 2 mM dNTP, 10X buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KCK 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) .5 l and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I) '511/1 mixed with 0.25 1 Pure water was added to make the volume 50 1. The reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 60 ° C for 30 seconds, and at 72 at 45 seconds for one cycle. I did a
  • Solution A lOOpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution B lOpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution)
  • TE solution negative control solution
  • Solution MA 100pg / 10 ⁇ L TE solution
  • Solution MB 10pg / 10 L TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution)
  • SEQ ID NO: 50, base sequence 24, and SEQ ID NO: 52 capable of binding to the negative strand of the target DNA region Y ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 by complementarity Counter-oligonucleotides C13, C14, and C15 having the indicated base sequence were synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 M was prepared.
  • a PCR tube prepare 10 L of the DNA fragment solution prepared above, 10 L of the counter oligonucleotide solution prepared above, and buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei tol) Add 5 L, lOOmM M ⁇ 1 2 solution 5 ⁇ , and add lmg / mL BSA solution 5 and sterilize ultrapure Water was added to make the volume 50 L and mixed. Thereafter, this PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, rapidly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes.
  • buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei tol
  • PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF 2 and PR 2 consisting of the base sequences represented by SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region Y ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 was amplified.
  • PR 2 5 '-GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (SEQ ID NO: 46)
  • the oligonucleotide prepared in 5 M was added to the vertical DNA.
  • 3 L each of the primer primer solution, 5 L each 2 mM dNTP, 5 L buffer ( ⁇ Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCK 15iM MgCl 2 , 0.01% Gelatin), heat resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) was mixed with 0.25 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 L.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then kept at 95 ° C for 20 seconds, then at 60 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 30 seconds for 25 cycles. PCR was performed.
  • methylcytosine antibody A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was converted into a commercially available pyotinized kit (Biot in Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. Piotin labeled.
  • Solution of the obtained Piotin-labeled methylcytosine antibody [Antibody 0.25 ig / fl 0.1% BSA-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 ⁇ 70, 154m Na'Cl pH 7.4) solution] As refrigerated.
  • PR 3 5'— AGACATGTGCTCACGTACGGT—3 ′ (SEQ ID NO: 54)
  • the PCR reaction solution is 10 ng genomic DNA, and 3 1 each of the oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, 5 1 each 2 mM dNTP, 1 OX buffer (LOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and heat-resistant DNA polymerase (ArapliTaq Gold, AB I) 511/1 mixed with 0.25 1 Then, sterilized ultrapure water was added thereto and the volume was 50 1. The reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then kept at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds and then at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 40 cycles. PC R was done.
  • DNA fragment S was purified using Wizard SV. Gel / PCR Kit (PR0MEGA) For a portion of the resulting DNA fragment solution, add Sssl methylase (NEB) 1 1, 10 x NEBuf fer 2 (NEB) 10 1, and S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) 1 was mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 1. Incubate the reaction solution at 37 ° C for 15-30 minutes. ⁇ Add 1 1 to S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) and incubate at 37 ° C for 15-30 minutes. . This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, this operation was repeated three times to obtain a methylated DNA fragment (MS, SEQ ID NO: 56). 'DNA fragment> (N stands for 5-methylcytosine)
  • Solution MC TE solution (negative control solution)
  • the negative DNA of the target DNA region S consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57
  • a counter oligonucleotide C16-C25 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 58 to SEQ ID NO: 67 capable of binding to the strand by complementarity was synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0 ⁇ '0 1 M was prepared.
  • ' ⁇ Target DNA region> methylcytosine is also represented by C
  • the DNA fragment solution 10 prepared above, 10 L of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 L of buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) LOOmM M 1 2 solution 5 was added B SA solution 5 L of lmg / mL, a liquid volume of 50 zL further added with sterile ultrapure water to the mixture and mixed.
  • the PCR tube was then heated at 95 for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • the above-prepared DNA fragment reaction solution 5 OL was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the above-mentioned pyotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Then, remove the solution by pipetting, and add 100 L of wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM 'Na 2 HPO-7H 2 0, 154 mM NaCl pH 7.4]] After the addition, the buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).
  • PCR was performed in the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions: The methylated DNA in the target A region S ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified.
  • Target DNA region> (5-methylcytosine is also represented by C)
  • PCR reaction solution As PCR reaction solution, the DNA in the vertical shape, 3 L each of oligonucleotide primer solution prepared at 5 M, 5 L each 2 mM dNTP, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, Mix 5 L of 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin), and heat resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 5 UZ L with 0.25 and add sterilized ultrapure water to the solution. A volume of 50 L was used. The reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then kept at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds and then at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 25 cycles. PCR was performed.
  • Piotin-labeled methylcytosine antibody obtained as a solution [Antibody 0.25 i / ll 0.13 ⁇ 4 BSA-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 • 7H 20 , 15 solution NaCl pH 7.4) solution] Stored refrigerated.
  • PCR was performed using the oligonucleotide primers (PF 4 and PR 4) and reaction conditions shown in SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69 and designed for PCR.
  • a DNA fragment (T, region corresponding to base number 384569-384685 of yeast chromosome VI I shown in SEQ ID NO: 70, Genbank Accession No. NC-001139, etc.) used as a test sample was amplified.
  • the PCR reaction solution includes 10 ng of genomic DNA in a bowl, 3 1 each of oligonucleotide primer solutions prepared at 5 M, 5 1 each 2 mM dNTP, 1 OX buffer (lOOmM Tris- HCl H 8.3, 500 mM KC1, 15iM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ⁇ ) 5U / 1 mixed with 0.25 1 Pure water was added to make the volume 50 1.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then kept at 95 ° C for 2 Q seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 40 cycles. PC R was done.
  • DNA fragment T was purified using Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA)
  • Sssl methylase (manufactured by NEB) was added to a part of the obtained DNA fragment solution.
  • 1 1 and 10 x NEBuf fer 2 (NEB) 10 1 and S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) 1 ⁇ 1 are mixed, and sterilized ultrapure water is added to the solution.
  • 100′1 was prepared.
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C for 15-30 minutes, and S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was added 1 and incubated at 37 ° C for 1'5-30 minutes. .
  • Solution B lpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution C TE solution (negative control solution) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MT.
  • Solution MC TE solution (negative control solution)
  • SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 76 which can bind more complementarily to the negative strand of the target DNA region T ′ consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 72
  • Counter oligonucleotides C 26 to C 29 consisting of the base sequences described above were synthesized, and TE buffer solutions with respective concentrations of 0.01 jM were prepared.
  • ⁇ Target DNA region> Metalcytosine is also represented by C
  • Each of the DNA fragment T solution and the DNA fragment MT solution was subjected to the following treatment.
  • a PCR tube 10 L of the DNA fragment solution prepared above, 10 L of the counter-oligonucleotide solution prepared above, and buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei tol) Add 5 L, lOOmM M 8 (: 1 2 solution 5 and 1 mg / mL BSA solution 5, and add sterile ultrapure water to the mixture to bring the volume to 50 ⁇ Li.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes, then cooled to 50 ° C and kept for 10 minutes.
  • the mixture was further incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • PCR is carried out in the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF 4 and PR 4 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69, and the reaction conditions described in the following:
  • the methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 was amplified.
  • PR4 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)
  • the PCR reaction solution consists of a vertical DNA, 3 / L of each oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, each 2 mM (11 ⁇ -?? 5 ⁇ , buffer solution
  • the baker's yeast strain X 2180-1A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, H 5.6-6.0) has a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1.0 and centrifuged at 10,000 for 10 minutes to prepare IxlO 7 yeast cells.
  • Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • Solution A 10ng / 5; «L TE solution.
  • Solution B lng / 5 ⁇ L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution).
  • Solution MA 1 Ong / 5 L TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution) The following treatment was performed on each of the above-mentioned yeast genome DNA solution and methylated yeast genome DNA solution. .
  • NC Genetic Codon Sequence Commission No. NC—A counter consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 58 to SEQ ID NO: 67 capable of binding by complementarity to the negative strand of yeast chromosome VII shown in 001139 etc.)
  • SEQ ID NO: 58 to SEQ ID NO: 67 capable of binding by complementarity to the negative strand of yeast chromosome VII shown in 001139 etc.
  • ⁇ -In a PCR tube prepare the genomic DNA reaction solution 20 prepared above, 10 L of the counter-oligonucleotide solution prepared above, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di and thiothrei tol) 5.
  • L, and Mg C 1 2 solution 5 L of lOOmM,.
  • B SA solution 5 L of lmg / mL, a liquid volume of 50 L further added with sterile ultrapure water to the mixture And mixed.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified.
  • PR 3 5 '-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3' (SEQ ID NO: 54)
  • the PCR reaction solution consists of ⁇ -shaped DNA, 3 L each of oligonucleotide primer solution prepared at 5 xM, 5 L each 2 mM dNTP, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCK). Mix 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 with heat resistant DNA polymerase (AmpliTaQ Gold, manufactured by AB I) 5 U; L 0.25 L and add sterilized ultrapure water to it. The liquid volume was 50. The reaction mixture was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then PCR was carried out under the conditions of incubation for 30 cycles at 95 ° C for 20 seconds, then 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. Went.
  • methylcytosine antibody manufactured by Aviva Systems Biology Co., Ltd.
  • Biotin Labeling Kit-NH 2 manufactured by Dojindo Laboratories
  • Piotin labeled The resulting Piochin labeled methylcytosine antibody: A solution [il 0.13 ⁇ 4 BSA-containing phosphate buffer one N antibody about 0.25 i (ImM KH 2 P0 4 , 3mM Na 2 HP0 ⁇ 7 ⁇ 2 0, 154mM NaCl pH7.4) solution] As refrigerated.
  • the baker's yeast strain X 2180-1A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) has a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1.0 and centrifuged at 10,000 ⁇ for 10 minutes to prepare lxlO 7 yeast cells.
  • Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • Solution B lng / 5 L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution)
  • ⁇ Solution MD TE solution (negative control solution) The following treatment was applied to each of the above-mentioned yeast genome DNA solution and methylated yeast genome DNA solution.
  • PCR tube 20 L of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 L of the counter-oligonucleotide solution prepared above, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) 5 and zL, and M 8_Rei 1 2 solution 5 LOOmM, was added BSA solution 5 L of lmg / mL, a liquid volume of 50 further added with sterile ultrapure water to the mixture and mixed. The PCR tube was then heated at 95 for 10 minutes, quickly cooled to 7 O, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • M 8_Rei 1 2 solution 5 LOOmM was added BSA solution 5 L of lmg /
  • PCR was performed on the above-mentioned PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF4 and PR4 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69 and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 was amplified.
  • PR4 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)
  • Target DNA region> (5-methylcytosine is also represented by C)
  • the PCR reaction solution is a vertical DNA, 3 each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, and 2 mM each. 5 ⁇ , buffer solution (lOOm Tris-HCl H 8.3, 500 mM KCK 15 mM MgCl in 0.01% Gelat in), 5 L, heat resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 5 UZ / L 0 . 25 L was mixed with sterilized ultrapure water to make the volume 50 iL. The reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then PCR was carried out under conditions of 31 cycles of incubation at 95 ° C for 20 seconds, then 58 for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. Went.
  • methylcytosine rod (Aviva Systems Biology) was used according to the method described in the catalog using a commercially available pyotinylated kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories). Piotin labeled.
  • the obtained piotin-labeled methylcytosine antibody was used as a solution [antibody 0.25 ug / i 0.13 ⁇ 4 BSA-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0: ⁇ 70, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] Stored refrigerated.
  • the oligonucleotide primer (? 1 and? 1) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 below and the reaction conditions
  • the DNA fragment (X, a region corresponding to nucleotide numbers 25687390-25687775 shown in SEQ ID NO: 30, Genbank Accession No. NT 029419, etc.) was amplified by performing PCR using the resulting DNA.
  • PR 1 5'-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • the PCR reaction solution was prepared as 5 ng of genomic DNA in a vertical form and 5 M: each oligonucleotide primer solution 3 1, each 2 mM dNTP 5 1, 10 X buffer (lOOmM Tris - HC1 pH 8.3, 500mM KCK 15mM MgCl 2, 0.01%
  • DNA fragment X was purified using Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • Sssl methylase (NEB) 1 1, 10 x NEBuf fer 2 (NEB) 1 0 1, and S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) 1 1 were mixed together. Pure water was added to adjust the liquid volume to 100 ⁇ 1.
  • the reaction solution was incubated at 37 ° C for 15 to 30 minutes, and further S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was added at 1 to 37 ° C. Incubated for 5-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, these operations were repeated 5 times to obtain a methylated DNA fragment (MX, SEQ ID NO: 31).
  • Solution B lOpg / 10 / zL TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MX.
  • Solution MD TE solution (negative control solution)
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 44 that can bind to the negative strand of the target DNA region X ′ consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 by complementarity Counter oligonucleotides C1 to C12 consisting of the following were synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 M was prepared. .
  • ⁇ Target DNA region> (5-methylcytosine is also represented by C)
  • a PCR tube prepare 10 L of the DNA fragment solution prepared above, 1 OL of the prepared counter oligonucleotide solution, buffer solution (330 niM Tris-Acetate H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc z , 5 mM Di thiothrei tol) 5 ⁇ L , and Mg ⁇ 1 2 solution 5 LOOmM, was added BSA solution 5 L of lmg / mL, a liquid volume of 50 L further added with sterile ultrapure water to the mixture and mixed. Then, this PCR tube Was heated at 95 for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • buffer solution 330 niM Tris-Acetate
  • Buffer solution (330mM Tris-Acetate H7.9, 660mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5mM Di thiot rei tol) is added to 5 zL of the streptavidin-coated PCR tube on which the piotine-labeled methylcytosine antibody that has been treated as above is immobilized.
  • BSA Bovine serum .. albumin lmg / ml
  • Hhal 16 U methylation sensitive restriction enzyme
  • wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (lmM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0-7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF1 and PR1 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region X ′ ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 was amplified.
  • the reaction solution of PCR is a vertical DNA, .3 each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, each 2 mM (11 ⁇ 5? 5), buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM KCI, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 0.25 L are mixed with sterilized ultrapure water. In addition, the solution volume was 50. The reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds, then at 61 ° C for 30 seconds and further at 72 ° C. PCR was performed under the condition of 25 cycles of heat insulation with one cycle of 30 seconds.
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology) can be used according to the method described in the catalog using a commercially available pyotinylated kit (Biot in Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories). Piotin labeled. Refrigerate the obtained piotin-labeled methylcytosine antibody as a solution [antibody 0.25 jLg / fl 0.1% BSA-containing phosphate buffer solution (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 • 70, 154 mM NaCl pH 7.4)] saved. .
  • the prepared yeast cells are suspended in Buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution is clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCK pH 7.4, 20 mM EDTA), sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w Zv), and Incubated for 30 minutes at 65 ° C.
  • Buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • PCR was performed using oligonucleotide primers (PF 3 and PR 3) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 below and reaction conditions.
  • DNA used as a test sample Fragment (S, SEQ ID NO : 55, region corresponding to nucleotide numbers 271743- 272083 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC-001139, etc.) was amplified.
  • PCR reaction solution 10 ng of genomic DNA, which is a cocoon type, was prepared to 5 M.
  • Each oligonucleotide primer solution 3 1 each 2 mM dNTP 5 U, 1 OX buffer (lOOmM Tris-HCl H 8.3, 500 mM CK 15m MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1, heat resistant DNA polymerase Z (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 5U / 1 was mixed with 0 .. 25 1 and sterilized ultrapure water was added to make the volume 501, which was used.
  • the reaction solution was kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95: for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds for one cycle for 40 cycles.
  • PCR was performed.
  • C 19 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 61)
  • C 20 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3 '(SEQ ID NO: 62)
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • 50 L of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the piotin-labeled methylcytosine antibody had been immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Then, the solution was removed by pipetting, and 100 L of washing buffer [0.05 Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0-7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4)] was added. Thereafter, the buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).
  • wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0-7H 20 , 154 mM NaCl pH7.)] The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified.
  • the PCR reaction solution consists of ⁇ ⁇ ⁇ -shaped DNA, 3 L each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, 5 L each 2 mM dNTP, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCK). Mix 5 L of 15 mM MgCl 2 and 0.01% Gelatin) and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 5UZ L with 0.25 iL and add sterilized ultrapure water to the solution. A volume of 50 L was used. The reaction The solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 20 seconds and then at 58 ° C for 30 seconds for an additional 72 seconds. PCR was carried out under conditions of 25 cycles of incubation at C for 30 seconds.
  • Baker's yeast strain X 2180-1 A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) with a turbidity of 0D 6 . .
  • the cells were cultured until 0.6-1.0 and centrifuged at 10,000 ⁇ for 10 minutes to prepare lxlO 7 yeast cells.
  • Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), and 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added to clear the solution. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour. Centrifuge at 550 for 10 minutes, collect the protoplasts, suspend in buffer B (50 mM Tris-, HC1, pH 7.4, 20 mM EDTA), and add sodium dodecyl sulfate to 1% (w Zv). After the addition, it was incubated at 65 for 30 minutes.
  • buffer A 1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4
  • 2-mercaptoethanol final concentration 14 mM
  • 100 U zymolase 10 mg / ml
  • the obtained genomic DNA was subjected to PCR using oligonucleotide primers (PF 4 and PR 4) designed for the PCR shown in SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69 below and reaction conditions.
  • oligonucleotide primers PF 4 and PR 4
  • a DNA fragment (T, region corresponding to nucleotide number 384569-384685 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 70, Genbank Accession No. NC-001139, etc.) used as a test sample was amplified. . 56524
  • PR4 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)
  • the reaction solution for PCR is 10 ng of genomic DNA, and 3 1 each of the oligonucleotide primer solution prepared in 5 M, and each 2 mM dNTP 5 1 10X buffer (lOOmM Tris_HCl ⁇ 8.3, 500m KCK 15mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 1 and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I) 5U / 1 0.25 1 And sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 1. The reaction was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then PCR was carried out under conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 for 30 seconds and then at 72 ° C for 30 seconds. I went.
  • DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PR0MEGA).
  • CTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT-3 ′ (SEQ ID NO: 71) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment T.
  • Solution B lOpg / lO ⁇ L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution) The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MT.
  • Solution MB 10pg / 10 L TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution)
  • a counter oligonucleotide C 26 to C 29 consisting of the sequence was synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 M was prepared.
  • a PCR tube In a PCR tube, add 10 L of the DNA fragment solution prepared above, 10 L of the counter oligonucleotide solution prepared above, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate, ⁇ 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei and tol), and M 8_Rei 1 2 solution 5 LOOmM, was added BSA solution 5 of lmg / mL, a liquid volume of 50 further added with sterile ultrapure water to the mixture and mixed. The PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • buffer solution 330 mM Tris-Acetate, ⁇ 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei and tol
  • the mixture was cooled to 50 ° C., kept warm for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • the above-prepared DNA fragment reaction solution 50 was added to a streptavidin-coated PCR tube on which the above-mentioned pyotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes.
  • wash buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0'7H 20 , 15 mM NaCl pH 7.4)] Then, the buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).
  • a buffer solution (330niM Tris-Acetate H7.9, 660mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5mM Di thi & threi tol) was added to 5 L of a streptavidin-coated PCR tube on which the piotine-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment was immobilized.
  • BSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Hhal methylation-sensitive restriction enzyme
  • PR4 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 6.9)
  • Target DNA region> (5-methylcytosine is also represented by C)
  • the reaction solution of PCR is the vertical DNA, 3 L of each oligonucleotide primer solution prepared to 5 M, 57 mM of each 2 mM dNTP, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM) Mix 5 L of KC1, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) with 0.2 5 L of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I) 5 U / L, and add sterile ultrapure water to this. In addition, the liquid volume was 50 L. The reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds, and at 72, 30 seconds is one cycle. PCR was performed under the condition of performing 28 cycles. ''
  • Solution B lng / 5 L TE solution
  • Solution C TE solution (negative control solution)
  • TE solution negative control solution
  • Solution MA 10ng / 5 L TE solution.
  • Solution M C TE solution (negative control solution)
  • SEQ ID NO: 33- that can bind by complementarity to the negative strand of DNA fragment X "(region corresponding to base numbers 25687390-25687775 shown in Genbank Accession No. NT-029419 etc.) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 83
  • Counter oligonucleotides C1 to C12 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 were synthesized, and TE buffer solutions each having a concentration of 0.01 M were prepared, and DNA fragments> (5-methylcytosine was also used.
  • a PCR tube In a PCR tube, add 10 L of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 L of the counter oligonucleotide solution prepared above, and buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Di thiothrei tol ) 5 L, 5 L of lOOmM MgCl 2 solution, and 5 L of lmg / mL BSA solution were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to bring the volume to 50 and mixed.
  • the PCR tube is then heated at 95 for 10 minutes, quickly cooled to 70, and kept at that temperature for 10 minutes. Warm up.
  • 5 ml of buffer solution (330 mM Tris-Aceiate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5iM Dithiothreitol) is added to the Streb® avidin-coated PC R tube to which the above-treated piotin-labeled methylcytosine antibody is immobilized.
  • PCR reaction solution is a D-shaped DNA, 3 zxL each of oligonucleotide primer solution prepared in 5 M, 5 L each 2 mM dNTP, buffer solution (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCK 15mM MgCl 2, 0.01% Gelatin) and a 5 L, heat resistance DNA polymerase (AmpliTaq Gold, AB I Co.) 5UZ L to 0 ⁇ 25 L and: mixing, this Then, sterilized ultrapure water was added to make the volume 50 L.
  • reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then PCR was carried out under conditions of 34 cycles of incubation at 95 ° C for 20 seconds, then at 61 ° C for 30 seconds and then at 72 ° C for 30 seconds. Went.
  • Example 14 A commercially available methylcytosine antibody (available from Aviva Systems Biology) was described in the catalog using a commercially available biotinylated kit (Biot.in Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories). Biotin was labeled according to the method described above. Refrigerate the resulting biotin-labeled methylcytosine antibody as a solution [antibody 0.25 / fl 0.1% BSA-containing phosphate buffer (l M KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 • 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) solution] saved.
  • the baker's yeast strain X 2180-1A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) has a turbidity of 0D 6 . . Cultured to 0.6-1.0, 10, 000 by centrifugation for 10 minutes to prepare a yeast cell lxlO 7. Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • Sssl methylase (NEB) 1 1, 10 xNEBuffer 2 (NEB) 10 l, S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) 1 1 was mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the volume 100 1 to prepare.
  • Solution A 10ng / 5 L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution)
  • TE solution negative control solution
  • Solution MC 0.1 ng / 5 L TE solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution)
  • the following treatment was applied to each of the above-mentioned yeast genome DNA solution and methylated yeast genome DNA solution.
  • NC—A counter consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 58 to SEQ ID NO: 67 that can bind by complementarity to the negative strand of yeast chromosome VII shown in Accession No. NC—001139 etc. synthesizing an oligonucleotide C 16 ⁇ C25, respectively; s concentration to prepare a TE buffer first solution is 0. 01 iM.
  • C 19 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 61)
  • C 20 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3 '(SEQ ID NO: 62)
  • genomic DNA reaction solution 20 prepared above, counter oligonucleotide solution 1 OL prepared above, and buffer solution (330 mM Tris-Acetaie H 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 5 mM Di thiothrei tol) 5 L, lOOmM Mg ⁇ 1 2 solution 5 and 1 mg / mL BSA solution 5 L were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture: to a volume of 50 zL and mixed.
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes. Next, it was cooled to 5′0 ° C. and kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).
  • Buffer L (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Di thiothrei tol) and 5 L were added to a streptavidin-coated PCR tube on which the piotine-labeled methylcytosine antibody was immobilized.
  • BSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • Hhal methylation-sensitive restriction enzyme
  • washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0-7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.);] was added The buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).
  • PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF 3 and PR 3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions:
  • the methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified.
  • the PCR reaction solution is a vertical DNA, 3 each of oligonucleotide primer solution prepared at 5 M, 5 L each 2 mM dNTP, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KC1 , 15 mM MgCl in 0.01% Gelatin), 5 and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 5U ⁇ L and 0.25 L are mixed with sterilized ultrapure water. What was set to 50 L was used. The reaction The solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 31 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, followed by 58 for 30 seconds and 72 for 30 seconds.
  • a commercially available methylcytosine antibody (manufactured by Aviva Systems Biology) was labeled with a biotin using a commercially available biotinylated kit (Biotin Labeling Kit_N, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. .
  • Biotin Labeling Kit_N Biotin Labeling Kit_N, manufactured by Dojindo Laboratories
  • As a solution [Phosphate buffer solution (ImM KH 2 P0 4 , 3 mM Na 2 HP0 • 7H 20 , 154 mM NaCl pH 7.4) containing 0.1% BSA antibody] Stored refrigerated.
  • the baker's yeast strain X 2180-1A in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) has a turbidity of 0D 6 . . Cultured to 0.6-1.0, 10, 000 by centrifugation for 10 minutes to prepare a yeast cell lxlO 7. Yeast genomes were obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbi ⁇ l, 0.1M EDTA, pH 7.4), and 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and .100 U zymolase (10 mg / ml) are added. Incubate with stirring for 1 hour at 30 ° C until the solution became clear. Protoplasts are collected by centrifugation at 550 for 10 minutes, suspended in buffer B (50 DiM Tris-HCK pH 7.4, 20 raM EDTA), and sodium dodecyl sulfate is added to 1% (w Xv). Incubated at 65 ° C for 30 minutes.
  • yeast genome DNA For the obtained yeast genome DNA, the following solutions were prepared.
  • Solution A 10ng / 5 / iL TE solution
  • Solution B lng / 5 L TE solution
  • Solution D TE solution (negative control solution)
  • TE solution negative control solution
  • Solution MD TE solution (negative control solution) The following treatment was applied to each of the above-mentioned yeast genome DNA solution and methylated yeast genome DNA solution.
  • DNA fragment T "(Genbank comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 78
  • reaction solution 20 of genomic DNA prepared above 10 L of county oligonucleotide solution prepared above, and buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol)
  • buffer 330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM K0Ac, lOOmM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol
  • 5j L 5 liters of lOOmM M80 1 2 solution, 5 L of lmg / mL BS A solution, and add sterilized ultrapure water to the mixture to make the volume 50 L, and mix .
  • the PCR tube was then heated at 95 ° C for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C, and kept at that temperature for 10 minutes.
  • Buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 6.6 OmM K0Ac, lOOmM Mg0Ac2, 5 mM Di thiothrei iol) is added to a Strept 'avidin-coated PCR tube to which the biotin-informed methylcytosine antibody has been treated.
  • BSA Bovine serum albumin lmg / ml
  • fflial methylation sensitive restriction enzyme
  • the PCR reaction solution is a vertical DNA, 3 L each of an oligonucleotide primer solution prepared at 5 M, 5 L each 2 mM dNTP, buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM) KC1, 15 mM MgCl (0.01% Gelatin) 5 and heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by AB I) 5UZ L 0.25 L and 'are mixed, and sterilized ultrapure water is added to the solution. A value of 50 was used.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, and then kept at 95 ° C for 20 seconds, then at 58 ° C for 30 seconds and then at 72 ° C for 30 seconds for 31 cycles. PCR was performed.
  • a target DN possessed by genomic DNA contained in a biological specimen It is possible to provide a method for easily measuring the content of methylated DNA in the A region. Sequence listing free text
  • Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 6 9 '
  • An oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 7 0
  • Amplified oligonucleotide consisting of the desired DNA region SEQ ID NO: 7 1

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Abstract

本発明は、生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。

Description

明細書
DNAメチル化測定方法 技術分野 '
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域にお けるメチル化された DN Aの含量を測定する方法等に関する。 背景技術
生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DN A領域における DN A 'のメチル化状態を評価するための方法としては、 例えば、 ゲノム DNA中の目的と する DNA領域におけるメチル化された DNAの含量を測定する方法がある （例え ば、 Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11 ;22 (15) :2990-7、 及び Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6) :2284-9参照） 。 当該測定方法では、 まず、 ゲノム DNA ： 由来の DNA試料から、'目的とする DNA領域を含む DNAを抽出する必要があり 、 抽出操作が煩雑である。
また、 抽出された DN Aの目的領域におけるメチル化された DN Aの含量を測定 する方法としては、 例えば、 （1) 亜硫酸塩等を用いて当該 DNAを修飾した後、 DNAポリメラ一ゼによる DNA合成の連鎖反応 （Polymerase Chain Reaction；以 下、 PCRと記すこともある。 ） に供することにより目的領域を増幅する方法、 （ 2) メチル化感受性制限酵素を用いて当該 DNAを消化した後、 PCRに供するこ とにより、 目的領域を増幅する方法等が知られている。 これらのいずれの方法とも 、 メチル化の検出のための DN Aの修飾及びその後の生成物の精製、 PCRのため の反応系の調製、 DNAの増幅の確認等に手間を要する。 発明の開示 ■
本発明は、 生物由来検体に含まれるゲノム DN A中の目的とする DNA領域にお けるメチル化された DNAの含量を簡便に測定する方法等を提供することを目的と する。 ' 即ち、 本発明は、
1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA鏔域におけるメチ ル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
(1) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 メチル化さ れた一本鎖 DN Aを分離する第一 （A) ェ樺と、 第一 （A) 工程で分離された一本 鎖 DNAと固定化メチル化 DNA抗体とを結合させる第一 （B) 工程からなる、 前 記の一本鎖 D N Aを選択する第一工程、
(2) 第一工程で選択された一本鎖 DNAを少なくとも 1種類の一本鎖 DNAを消 化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、 及び、
, (3) 下記の各本工程の前工程として、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記の一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にァ ンメチル状態の CpGを含まない一本鎖 DNA) を、 前記の固定化メチル化 DNA 抗体から分離して一本鎖状態である DNA (正鎖） にする工程 （第三 （前 A) 工程 ： ).と、
第三 （前 A) 工程で分離された一本鎖状態である DNA (正鎖） を铸型として、 当 該一本鎖状態である DNA (正鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （正鎖） であ つて、 且つ、 前記の目的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端よりさら に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負 鎖） を有する伸長プライマ一 （フォーワード用プライマー） を伸長プライマーとし て、 当該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である D NA (正鎖） を二本鎖 DNAとして伸長形成させる工程 （第三 （前 B) 工程） と、 第三 （前 B) 工程で伸長形成された二本鎖 DNAを、 目的とする DNA領域を含む 一本鎖 DNA (正鎖） と目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） に一旦 分離する工程 （第三 （前 C) 工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を铸型として、 前記フォヮ一ド用プライマ一を伸長プライマ一として、 当該伸長プライマーを一回 伸長させることにより、 前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aを二本鎖 DNAとして伸長形成させる本工程—Aと、 ， (b) 生成した目的とする DN A領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） を鐃型として、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分 塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖 ) に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3， 末端側に位置 する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長 プライマー （リバース用プライマ一） を伸長プライマ一として、 当該伸長プライマ 一を 1回伸長させることにより、 前記の目的とする DN A領域を含む一本鎖 DNA を二本鎖 DNAとして伸長形成させる本工程一 Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DNAを ,一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA.領域 におけるメチル化された DNAを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN
Aの量を定量する第三工程、 を有することを特徴とする方法 （以下、 本発明測定方 法と記すこともある。 ） ；
2. 第三工程のメチル化 DN A抗体がメチルシトシン抗体である、 前項 1記載の方 法；
3. 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項 1〜2 のいずれかに記載の方法；
4. 生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項 1〜2 のいずれかに記載の方法；
5. 生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項 1〜 2のいずれかに記載の方法；
6. 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料が、 当該ゲノム DN Aが有する目的とする DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理 されてなる DN A試料であることを特徴とする前項 1〜 5のいずれかに記載の方法 ；
7. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 少なくとも 1種 類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D N A試料であることを特徴と する前項 1〜 6のいずれかに記載の方法； . 8. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製されて なる DN A試料であることを特徴とする前項 1〜7のいずれかに記載の方法； '
9. 少なくとも 1種類の 1本鎖 DN Aを消化できるメチル化感受性制限酵素が、 生 物由来検体中に含まれるゲノム DN Aが有する目的とする DN A領域の中に認識切 '断部位を有する制限酵素であることを特徴とする前項 1〜 8のいずれかに記載の方 法；
10. 少なくとも 1種類以上の 1本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素 が、 メチル化感受性制限酵素である Hhalであることを特徴とする前項 1〜 9のいず れかに記載の方法； .
'11. 第二工程において一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素での消 化処理を実施せずに第三工程を実施することを特徴とする前項 1〜10のいずれか に記載の方法；および
12. 第一 （A) 工程でメチル化された一本鎖 DNAを分離する際に、 カウンター ：オリゴヌクレオチドを添加する前項 1〜 11のいずれかに記載の方法； 等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において、 調製されたサンプルから配列番号 21で示された塩 基配列からなる領域におけるメチル化された DNAを PCRにて増幅し、 得られた 増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動に供した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK」 、 UBC— Mの溶液 Dから 調製されたサンプル 「D」 、 UBC—Mの溶液 Cから調製されたサンプル 「C」 、 UBC— Mの溶液 Bから調製されたサンプル 「B」 、 UBC— Mの溶液 Aから調製 されたサンプル 「A」 、 DNAフラグメント Y2の 「A」 、 UBC— Uの溶液 Dか ら調製されたサンプル 「D」 、 UBC— Uの溶液 Cから調製されたサンプル 「C」 、 UBC— Uの溶液 Bから調製されたサンプル 」 、 UBC— Uの溶液 Aから調 製されたサンプル 「A」 での結果を示している。
図 2は、 実施例 2において、 調製されたサンプルに、 「A (無処理） 」.又は 「B (ffiial処理） 」 のいずれかの処理を施し、 配列番号 27で示された塩基配列からな る領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて増幅し、 得られた増幅産物 1 . 5 %ァガ口一スゲル電気泳動に供した結果を示した図である。
図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK」 、 Hha lで消化されない 部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 207.9— 2176/98me r— M ( 7) 溶液の 「A」 処理が施されたサンプル 「M」 、 Hh a Iで消化される部分メチ ル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079- 2176/98me r -HM (5) 溶 液の 「A」 処理が施されたサンプル 「HMJ 、 アンメチル化ォリゴヌクレオチド G PR7-2079-2176/98me r— UM溶液の 「A」 処理が施されたサンプ リレ 「U」 、 Hha Iで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2 07,9 - 2176/98me r -M (7) 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「M 」 、 Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 2176/98me r -HM (5) 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「HM」 、 ：アンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 -2079-2176/98me r— UM 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「U」 、 での結果を示している。
図 3は、 実施例 3において、 あらかじめ 「A (無処理） 」 又は 「B (Hhal処理） 」 のいずれかの処理を施されたサンプルについてメチル化シトシン抗体での処理を 施したサンプルにっき、 配列番号 27で示された塩基配列からなる領域におけるメ チル化された DNAを PC Rにて増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロース ゲル電気泳動に供した結果を示した図である。
図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 Hha lで消化されない 部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 -2079-2176/98me r— M ( 7) 溶液の 「A」 処理が施されたサンプル 「M」 、 Hh a Iで消化される部分メチ ル化オリゴヌクレオチド GPR 7 - 2079-2176/98me r-HM (5) 溶 液の 「A」 処理が施されたサンプル 「HM」 、 アンメチル化オリゴヌクレオチド G PR 7-2079-2176/98me r—UM溶液の 「A」 処理が施されたサンプ ル 「U」 、 Hh a Iで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2 079 - 2176/98me r -M (7) 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「M 」 、 Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079— 2176/98me r一 HM (5) 溶液の 「B」 処理が施されたサンプル 「Η 」 、 アンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 -2079-2176/98me r— UM 溶液の 「&」 処理が施されたサンプル 「U」 、 での結果を示している。
' 図 4は、 実施例 4において、 調製されたサンプルから配列番号 32で示される塩 基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて 増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図 である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化された D NAフラグメント MXの溶液 「M.D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化され 'ていない DN Aフラグメント Xの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル 化された DNAフラグメント MXの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DNAフ ラグメント Xの溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MXの溶液 「MB 」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Xの溶液 「B」 、 メチル化された D ： NAフラグメント MXの溶液 「MA」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Xの溶液 「A」 、 での結果を示している。
図 5は、 実施例 5において、 調製されたサンプルから配列番号 49で示される塩 基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを P C Rにて 増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図 である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化された D NAフラグメント MYの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化され ていない DNAフラグメント Yの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル 化された DNAフラグメント MYの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DNAフ ラグメント Yの溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MYの溶液 「 B 」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Yの溶液 「B」 、 メチル化された D NAフラグメント MYの溶液 「M'A」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Yの溶液 「A」 、 での結果を示している。
図 6は、 実施例 6において、 調製されたサンプルから配列番号 57で示される塩 基配列からなる目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aを PC Rにて 増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図 である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカ一 「MK」 、 メチル化された D NAフラグメント MSの溶液 「MC」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化され ていない DN Aフラグメント Sの溶液 「C」 （ネガティブコントロール） 、 メチル '化された DNAフラグメント MSの溶液 「MB」 、 メチル化されていない DNAフ ラグメント Sの溶液 「B」 、 メチル化された DNAフラグメント MSの溶液 「MA 」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Sの溶液 「A」 、 での結果を示して いる。
図 7は、 実施例 7において、 調製されたサンプルから配列番号 72で示される塩 '基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを P C R.にて 増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図 である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化された D NAフラグメント MTの溶液 「MC」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化され ：ていない DNAフラグメント Tの溶液 「Cj (ネガティブコント口一ル） 、 メチル 化された DNAフラグメント MTの溶液 「MB」 、 メチル化されていない DNAフ ラグメント Tの溶液 「B」 、 メチル化された DNAフラグメント MTの溶液 「MA 」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Tの溶液 「A」 、 での結果を示して いる。
図 8は、 実施例 8において、 調製されたサンプルから配列番号 57で示される塩 基配列からなる目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを PC Rにて 増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した HI である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマ一カー 「MK」 、 メチル化酵母ゲノ ム DNAの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化されていない酵母 ゲノム DNAの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化酵母ゲノム DN Aの溶液 「MC」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「C」 、 メチル 化酵母ゲノム DN Aの溶液 「MB」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶 液 「B」 、 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 「MA」 、 メチル化されていない酵母 ゲノム DNAの溶液 「A」 、 での結果を示している。 . 図 9は、 実施例 9において、 調製されたサンプルから配列番号 72で示される塩 基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを P C Rヒて 増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示した図 である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化酵母ゲノ 'ム DNAの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化されていない酵母 ゲノム DN Aの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化酵母ゲノム DN Aの溶液 「MC」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「C」 、 メチル 化酵母ゲノム DNAの溶液 「MB」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶 液 「B」 、 メチル化酵母ゲノム D.N Aの溶液 「MA」 、 メチル化されていない酵母 'ゲノム DNAの溶液 「A」 、 での結果を示している。
図 10は、 実施例 10において、 調製されたサンプルから配列番号 32で示され る塩基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された D N Aを P C R にて増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示し ：た図である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマ一力一 「MK：」 、 メチル化され た DNAフラグメント MXの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化 されていない DNAフラグメント Xの溶液 「D」 （ネガティブコント口一ル） 、 メ チル化された DNAフラグメント MXの捧液 「MC」 、 メチル化されていない DN Aフラグメント Xの溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MXの溶液 「 MB」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Xの溶液 「B」 、 メチル化され た DNAフラグメント MXの溶液 「MA」 、 メチル化されていない DNAフラグメ ント Xの溶液 「A」 、 での結果を示している。 · 図 11は、 実施例 11において、 調製されたサンプルから配列番号 57で示され る塩基配列からなる目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを PCR にて増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示し た図である。 図中の一番左のレー'ンから、 DNAマーカ一 「MK」 、 メチル化され た DNAフラグメント MSの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化 されていない DNAフラグメント Sの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メ チル化された DNAフラグメント MSの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DN Aフラグメント Sの溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MSの溶液 「 MB」 、 メチルイ匕されていない DNAフラグメント Sの溶液 「B」 、 メチル化きれ た DNAフラグメント MSの溶液 「MA」 、 メチル化されていない DNAフラグメ ント Sの溶液 「A」 、 での結果を示している。
' 図 12は、 実施例 12において、 調製されたサンプルから配列番号 72で示され る塩基配列からなる目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aを PC R にて増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示し た図である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマ一カー 「MK：」 、 メチル化され た DNAフラグメント MTの溶液.「MD」 (ネガティブコントロール) 、 メチル化 'されていない DNAフラグメント Tの溶液 「D」 （ネガティブコント口一ル） .、 メ チル化された DNAフラグメント MTの溶液 「MC」 、 メチル化されていない DN Aフラグメント Tの溶液 「C」 、 メチル化された DNAフラグメント MTの溶液 Γ MB」 、 メチル化されていない DNAフラグメント Tの溶液 「B」 、 メチル化され 'た DNAフラグメント MTの溶液 「MA」 、 メチル化されていない DNAフラグメ ン卜 Tの溶液 「A」 、 での結果を示している。
図 13は、 実施例 13において、 調製されたサンプルから配列番号 32で示され る塩基配列からなる目的とする D N A領 におけるメチル化された D N Aを P C R にて増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5 %ァガ口一スゲル電気泳動した結果を示し た図である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化ヒト ゲノム DNAの溶液 「MC」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化されていない ヒトゲノム DNAの溶液 「C」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化ヒトゲノ DNAの溶液 「MB」 、 メチル化されていないヒトゲノム DNAの溶液 「B」 、 メ チル化ヒトゲノム DNAの溶液 「MA」 、 メチル化されていないヒトゲノム DNA の溶液 「A」 、 での結果を示している。
図 14は、 実施例 14において、 調製されたサンプルから配列番号 57で示され る塩基配列からなる目的とする D N A領域におけるメチル化された DNAを PCR にて増幅し、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示し た図である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカ一 「MK」 、 メチル化酵母 ゲノム DNAの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化されていない 酵母ゲノム DN Aの溶液 「D」 （ネガティブコントロール） 、 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 「MC」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「C」 、 メ チル化酵母ゲノム DN Aの溶液 「MB」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNA の溶液 「B」 、 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 「MA」 、 メチル化されていない 酵母ゲノム DN Aの溶液 「A」 、 での結果を示している。
図 15は、 実施例 15において、 調製されたサンプルから配列番号 72で示され る塩基配列からなる目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aを PC R にて増幅し、 得られた増幅産物を.1. 5%ァガロースゲル電気泳動した結果を示し 'た図である。 図中の一番左のレーンから、 DNAマーカー 「MK：」 、 メチル化酵母 ゲノム DN Aの溶液 「MD」 （ネガティブコントロール) 、 メチル化されていない 酵母ゲノム DN Aの溶液 「D」 (ネガティブコントロール) 、 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 「M (：」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNAの溶液 「C」 、 メ 'チル化酵母ゲノム DN Aの溶液 「MB」 、 メチル化されていない酵母ゲノム DNA の溶液 「B」 、 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 「MA」 、 メチル化されていない 酵母ゲノム DNAの溶液 「A」 、 での結果を示している。 . 発明を実施するための形態
本発明における 「生物由来検体」 としては、 例えば、 細胞溶解液、 組織溶解液 （ ここでの組織とは、 血液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ） 若しくは、 哺乳 動物においては、 血漿、 血清、 リンパ液等の体液、 体分泌物 （尿や乳汁等） 等の生 体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノム D N Aをあげることができ る。 また当該生物由来検体としては、 例えば、 微生物、 ウィルス等由来の試料もあ げられ、 この場合には、 本発明測定方法における 「ゲノム DNA」 とは、 微生物、 ウィルス等のゲノム DNAを意味する。
哺乳動物申来の検体が血液である場合には、 定期健康診断や簡便な検査等での本 発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノム DNAを哺乳動物由来の検体から得るには、 例えば、 市販の DNA抽出用 キット等を用いて DNAを抽出すればよい。
血液を検体として用いる場合には、 血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を 調製し、 調製された血漿又は血清を検体として、 その中に含まれる遊離 DNA (胃 癌細胞等の癌細胞由来の DN Aが含まれる） を分析すると、 血球由来の DN Aを避 'けて胃癌細胞等の癌細胞由来の DNAを解析することができ、 胃癌細胞等の癌細胞 、 それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。 通常、 遺伝子 （ゲノム DNA) を構成する塩基は 4種類である。 これらの塩基の うち、 シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、 このような DN ' Aのメチル化修飾は、 5' — CG— 3， で示される塩基配列 （Cはシトシンを表し 、 Gはグァニンを表す。 以下、 当該塩基配列を 「CpG」 と記すこともある。 ） 中 のシトシンに限られている。 シトシンにおいてメチル化される部位は、 その 5位で ある。 細胞分裂に先立つ DNA複製に際して、 複製直後は铸型鎖の 「CpG」 中の ：シトシンのみがメチル化された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座 に新生鎖の 「CpG」 中のシトシンもメチル化される。 従って、 DNAのメチル化 の状態は、 DNA複製後も、 新しい 2組の DN Aにそのまま引き継がれることにな る。 本発明における.「メチル化された DNA」 とは、 このようなメチル化修飾によ り生じた DN Aを意味する。
本発明における 「CpG対」 とは、 CpGで示される塩基配列と、 これに相補す る C p Gが塩基対合により結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。 本発明における 「目的とする DNA領域」 （以下、 目的領域と記すこともある。 ) は、 当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べようとする DN A領域で あって、 少なくとも 1種類のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有する。 例えば 、 Lysyl oxidase, HRAS- like suppressor^ bA305P22.2. Gamma filamin, 画 Dl、 Homologue of RIKEN 2210016F16、 FLJ32130、 PPARG angiopoiet in-related protein 、 Thrombomodul in、 p53 - responsive gene 2、 Fibril lin2、 Neurof ilament3、 disintegrin and metalloproteinase domain 23、 G protein-coupled receptor 7、 G - protein coupled somatos tat in and angi otens in- 1 ike pept ide receptor、 Solute carr ier f ami ly 6 neurotransmi t ter transpor ter noradrenal in member 2 等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーデ イング領域） の塩基配列中に存在する C Gで示される塩基配列中のシトシンを一 'つ以上含む D NAの領域等を挙げることができる。 . 具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が Lysyl ox i dase遺伝子である場合には 、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配 列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト '由来の Lysyl oxidase遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモーター 領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列を挙げることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AF270645に記載される塩基 配列の塩基番号 16001〜18661で示される塩基配列に相当する。 ） が挙げられる。 配 "列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Lysyl oxidaseタンパク質のァ ミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2031~2033に示されてお り、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とり わけ配列番号 1で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在す る C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌 細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1で示され る塩基配列において、 塩基番号 1539、 1560、 1574、 1600、 1623、 1635、 1644、 1654 、 1661、 1682、 1686、 1696、 1717、 1767、 1774、 1783、 1785、 1787、 1795等で示さ れるシトシンを挙げることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が HRAS- l ike suppressor遺伝子で ある場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領 域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列と しては、 ヒト由来の HRAS- l ike suppres sor遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に 位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることがで き、 より具体的には、 配列番号 2で示される塩基配列 （Genbank Access i on NO. AC068162に記載される塩基配列の塩基番号 172001〜173953で示される塩基配列に, '相当する。 ） があげられる。 配列番号 2で示される壤基配列においては、 ヒト由来 の HRAS- l ike suppres sor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1'743〜1953に 示されている。 配列番号 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基 配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 2で示される塩基配列において C p Gが密に 存在する領域中に存在する C p G'中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞に 1おいて高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyperme thyl at i on) ) を示す。 • さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例え ば、 配列番号 2で示される塩基配列において、 塩基番号 1316、 1341、 1357、 1359、 1362、 1374、 1390、 1399、 1405、 1409、 1414、 1416、 1422、 1428、 1434、 1449、 : 1451、 1454、 1463, 1469、 1477、 1479、 1483、 1488、 1492、 1494、 1496、 1498、 1504、 1510、 1513、 1518、 1520等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 M305P22. 2. 1遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の 塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては 、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモ 一ター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的 には、 配列番号 3で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AL121673に記載され る塩基配列の塩基番号 13001〜13889で示される塩基配列に相当する。 ） があげられ る。 配列番号 3で示される塩基配列においては、 ヒト由来の bA305P22. 2. 1タンパク 質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 849〜851に示され ており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 663〜889に示されている。 配列番 号 3で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 と りわけ配列番号 3で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在 する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻 度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 胃 癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 3で示さ れる塩基配列において、 塩基番号 329、 335、 337、 351、 363、 373、 405、 424、 427、 ' 446、 465、 472、 486等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Gamma f i l amin遺伝子である場 合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ一デイング領域） の 塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては '、 ヒト由来の Ga腿 a f i l amin遺伝子のェクソン 1と、 その 5， 上流に位置するプロモ 一夕一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的 には、 配列番号 4で示される塩基配列 （Genbank Acces s i on No. AC074373に記載され る塩基配列の塩基番号 63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 4で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Gamma f i l aminタンパク質のァミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 572〜574に示されており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 463〜863に示さ れている。 配列番号.4で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列 中のシトシン、 とりわけ配列番号 4で示される塩基配列において C p Gが密に存在 する領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞におい て高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyperme thyl at i on) ) を示す。 さら に具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、. 配列番号 4で示される塩基配列において、 塩基番号 329、 333、 337、 350、 353、 360 . 、 363、 370、 379、 382、 384、 409、 414、 419、 426、 432、 434、 445、 449、 459、 472 、 474、 486、 490、 503、 505等で示されるシトシンをあげることができる。
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また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 HAND1遺伝子である場合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列 中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由 来の HAND1遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモ一夕一領域とが含 まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 5 で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AC026688に記載される塩基配列の塩基 番号 24303 26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 5で示される塩基配列においては、 ヒト由来の HAND1タンパク質のアミノ末 端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 1656〜1658に示されており、 上 記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1400〜2198に示されている。 配列番号 5で示 される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配 列番号 5で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p 'G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち 、 高メチル化状態 （hype ethylation) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞に おいてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 5で示される塩基 配列において、 塩基番号 1153、 1160、 1178、 1187、 1193、 1218、 1232、 1266、 1272 、 1292、 1305、 1307, 1316、 1356、 1377、 1399、 1401、 1422, 1434等で示されるシ 卜シンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Homologue of RIKEN
2210016F16遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領 域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列を一つ 以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のェ クソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモ一ター領域とが含まれるゲノム DNA の塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 6で示される塩基配列.
(Genbank Accession No. AL354733に記載される塩基配列の塩基番号 157056〜159000 で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 6で 示される塩基配列においては、 ヒ'ト由来の Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子の ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1392〜1945に されている。 配列番号 6で示さ れる塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列 番号 6で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する CpG 中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl aUon) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細 J3包にお いてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 6で示される塩基配 列において、 塩基番号 1172、 1175、 1180、 1183、 1189、 1204、 1209、 1267、 1271、 1278、 1281、 1313、 1319、 1332、 1334、 1338、 1346、. 1352、 1358、 1366、 1378、
1392、 1402、 1433、 1436、 1438等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 FLJ32130遺伝子である場合に は、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基 '配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては'、 ヒ ト由来の FU32130遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領 域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配 列番号 7で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC002310に記載される塩基配 '·列の塩基番号 1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。 ） があげら れる。 配列番号 7で示される塩基配列においては、 ヒ卜由来の FLJ32130タンパク質 のアミノ酸末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2136〜2138に示さ れており、 上記ェクソン 1と考えられる塩基配列は、 塩基番号 2136〜2379に示され ている。 配列番号 7で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中 のシトシン、 とりわけ配列番号 7で示される塩基配列において C p Gが密に存在す る領域中に存在する C p G中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において 高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl aU on) ) を示す。 さらに 具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配. 列番号 7で示される塩基配列において、 塩基番号 1714、 1716、 1749、 1753、 1762、 1795、 1814、 1894、 1911、 1915、 1925、 1940、 1955、 1968等で示されるシトシンを あげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 PPARG angi opoi et in-rel ated protein遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上 含む塩基配列としては、 ヒト由来の PPARG angiopoi et in- rel ated protein遺伝子の ェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 8で示される塩基配 '列があげられる。 配列番号 8で示される塩基配列においては、 ヒト由来の PPARG angiopoi et in-rel at ed prote inタンパク質のアミノ耒端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 717〜719に示されており、 上記ェクソン 1の 5 ' 側部分の塩 基配列は、 塩基番号 1957〜2661に示されている。 配列番号 8で示される塩基配列中 に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 8で示され 'る塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に存在する C p G中のシトシンは 、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylat ion) ) を示す。 さらに具体的には、 胃癌細胞においてメチル化頻 度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 8で示される塩基配列において、 塩 :基番号 35、 43、 51、 54、 75、 85、 107、 127、 129、 143、 184、 194、 223、 227、 236、 251、 258等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Thrombomodul in遺伝子である 場合には、 そのプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列として は、 ヒト由来の Thrombomodul in遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプ 口モーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具 体的には、 配列番号 9で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. AF495471に記載 される塩基配列の塩基番号 1〜6096で示される塩基配列に相当する。 ） があげられる 。 配列番号 9で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Thrombomodul inタンパク 質のアミノ末端のメチォニンをコードする ATGコドンが、 塩基番号 2590〜2592に示さ れており、 上記ェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 2048〜6096に示されている。 配 列番号 9で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシン 、 とりわけ配列番号 9で示される塩基配列において C p Gが密に存在する領域中に 存在する CpG中のシトシンは、 例えば、 胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル 化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さらに具体的には 、 胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 9で 示される塩基配列において、 塩基番号 1539、 1551、 1571、 1579、 1581、 1585、 1595, '、 1598、 1601、 1621、 1632、 1638、 1645、 1648、 1665、 1667、 1680、 .1698、 1710、
1724、 1726、 Π56等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 p53- responsive gene 2遺伝子 である場合には、 そのプロモータ 領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング '領域） の塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列 としては、 ヒト由来の p53- responsive gene 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流 に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム DN Aの塩基配列をあげることが でき、 より具体的には、 配列番号 10で示される塩基配列 （Genbank Accession ! NO.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の 相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1 0で示される塩基配列におい ては、 ヒト由来の p53_responsive gene 2遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番 号 1558〜1808に示されている。 配列番号 1 0で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞において高 いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を示す。 さらに具 体的には、 滕臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配 列番号 1 0で示される塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 131.5 、 1319、 1349、 1351、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげ ることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Fibrillin遺伝子である場合 には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ一ディング領域） の塩 基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の Fibrillin遺伝子のェクソン 1と、 その 5' 上流に位置するプロモータ 一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には 、 配列番号 1 1で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. AC113387に記載される 塩基配列の塩基番号 118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 1 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の
Fibr i l l in遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1091〜1345に示されている 。 配列番号 1 1で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中のシ トシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチルイヒ頻度 （即ち、 高メ チル化状態 (hypermethyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌細胞におい てメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 1で示される塩基配 '列において、 塩基番号 679、 687、 690、 699、 746、 773、 777、 783、 795、 799、 812、 823、 830、 834、 843等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Neurof i l ament 3遺伝子である "場合には、 そのプロモ タ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列として は、 ヒト由来の Neurof i l aments遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプ 口モーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具 体的には、 配列番号 1 2で示される塩基配列 (Genbank Access i on No. AF106564に記 載される塩基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当 する。 ) があげられる。 配列番号 1 2で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Neurof i l ament 3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 614〜1694に示されて.い る。 配列番号 1 2で示される塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列中の . シトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高 メチル化状態 （hypermethyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓癌細胞にお いてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 2で示される塩基 配列において、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506 、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあ げることができる。 ' また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 di s integr in and
metal loproteinase domain 23遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻 訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示され 'る塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来の di s integr in and metal loprote inase domain 23遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロ モーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、 より具体 的には、 配列番号 1 3で示される塩基配列 (Genbank Access ion No. AC009225に記載 される塩基配列の塩基番号 21001〜23300で示される塩基配列に相当する。 ） があげ 'られる。 配列番号 1 3で示される塩基配列においては、 ヒト由来の di s integr in and • me tal loprote inase domain 23遺伝子のェクソン Γの塩基配列は、 塩基番号 1194〜
1630に示されている。 配列番号 1 3で示される塩基配列中に存在する CpGで示される 塩基配列中のシトシンは、 例えば、 膝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻 '度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 塍 臓癌細胞においてメチルイ匕頻度が高いシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1 3で 示される塩基配列において、 塩基番号 998、 1003、 1007、 1011、 1016、 1018、 1020、 1026、 1028、 1031、 1035、 1041、 1043、 1.045、 1051、 1053、 1056、 1060、 1066、 1068、 1070、 1073、 1093、 1096、 1106、 1112、 1120、 1124、 1 126等で示されるシ卜 シンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G protein-coupl ed receptor 7遺伝子である場合には、 そのプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーデ ィング領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩 基配列としては、 ヒト由来の G prote in-coupl ed receptor 7遺伝子のェクソン 1と 、 その 5 ' 上流に位置するプロ ΐ一ター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列 をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 1 4で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩 基配列に相当する。 ) があげられる。 配列番号 1 4で示される塩基配列においては 、 ヒト由来の G protein- coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩 基番号 1666〜2652に示されている。 配列番号 14で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞におい て高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation) ) を示す。 さら 'に具体的には、 滕臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、 例えば 、 配列番号 14で示される塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で 示されるシトシンをあげることができる。 ' また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 G-protein coupled
somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor遺伝子である場合には、 そ のプロモーター領域、 のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コ一ディン グ領域） の塩基配列中に存在する C p Gで示される塩基配列を」つ以上含む塩基配 :列としては、 ヒト田来の G - protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領 域とが含まれるゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配 列番号 1 5で示される塩基配列 （Genbank. Accession No. AC008971に記載される塩基 配列の塩基番号 57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があ げられる。 配列番号 1 5で示される塩基配列においては、 ヒト由来の G- protein coupled somatostatin and angiotensin-1 ike peptide receptor遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 776〜2632に示されている。 配列番号 15で示される塩基 配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 塍臓癌細胞 等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hypermethylation ) ) を示す。 さらに具体的には、 塍臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシン としては、 例えば、 配列番号 15'で示される塩基配列において、 塩基番号 470、 472 、 490、 497、 504、 506、 509、 514、 522、 540、 543、 552、 566、 582、 597、 610、 612 等で示されるシトシンをあげることができる。 また具体的には例えば、 有用タンパク質遺伝子が、 Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 云子である場合には、 そ のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中 に存在する C p Gで示される塩基配列を一つ以上含む塩基配列としては、 ヒト由来 'の Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のェクソン 1と、 その 5' 上流に位置するプロモータ一領域とが含まれるゲ ノム DNAの塩基配列をあげることができ、 より具体的には、 配列番号 16で示さ れる塩基配列 （Genbank Accession No. AC026802に記載される塩基配列の塩基番号 78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列 >番号 16で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遣伝于のェクソン 1の塩 ¾ 配列は、 塩基番号 1479〜1804に示されている。 配列番号 16で示される塩基配列中 に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌 ：細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 (hypermethylation) ) を 示す。 さらに具体的には、 S萃臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシ卜シンとして は、 例えば、 配列番号 16で示される塩基配列において、 塩基番号 1002、 1010、 1019、 1021、 1051、 1056、 1061、 1063、 1080、 1099、 1110、 1139、 1141、 1164、 1169、 1184等で示されるシトシンをあげることができる。 本発明測定方法における 「メチル化 DNA抗体」 とは、 DNA中のメチル化され た塩基を抗原として結合する抗体を意味する。 一本鎖 DNA中の 5位がメチル化さ れたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体であればよく、 より具体的 には、 メチルシトシン抗体が挙げられる。 また、 市販されているメチル化 DN A抗 体であっても、 本特許記載のメチル化状態の DNAを特異的に認識して、 特異的に 結合できる抗体であればよい。
メチル化 DNA抗体は、 メチル化された塩基、 メチル化 DNA等を抗原として、 通常の方法により作成できる。 具体的には、 5—メチルシチジン、 5—メチルシト シン、 あるいは、 5—メチルシトシンを含む DN A等を抗原として作製された抗体 から D N A中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製 できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、 I g G画分の抗体 （ポリクローナ ル抗体） と、 単一のクローンが生産する抗体 （モノクローナル抗体） がある。 本特 許ではメチル化 D NA、 あるいはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体である ことが望ましいため、 モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、 細胞融合法による方法をあげるこ とができる。 例えば、 細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞 （B細胞） と骨髄 腫細胞とを細胞融合させることでハイプリドーマを作製し、 ハイプリドーマの生産 する抗体を選抜して、 メチルシトシン抗体 （モノクローナル抗体） を作製できる。 細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、 抗原を精製する必要がなく、 例えば、 5—メチルシチジン、 5—メチルシトシン、 又は、 5—メチルシトシンを 含む D NA等の混合物を抗原として、 免疫に用いる動物に投与できる。 投与方法と • しては、 5—メチルシチジン、 5—メチルシトシン、 又は、 5—メチルシトシンを 含む D NA等を、 直接、 抗体を産生させるマウスへ投与する。 抗体が産生されにく い場合は、 抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。 また、 アジュバント溶液 （ 例えば、 流動パラフィンと A r a c e 1 Aを混合し、 アジュバントとして結核菌 の死菌を混合したもの） と抗原をよく混合することや、 リボソームに組み入れて免 疫することで、 抗原の免疫性を上げることができる。 あるいは、 抗原を含む溶液と アジュバント溶液を等量添加し、 十分に乳液状にしてから、 マウスの皮下あるいは 腹腔内に注射する方法や、 ミョゥバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバ ントとして添加する方法がある。 尚、 最初の免疫をしてから適当な期間の後、 マウ スの腹腔内あるいは静脈内に追加免疫することもできる。 また、 抗原の量が少ない 場合には、 抗原が浮遊する溶液を、 直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。 最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、 脾細胞浮遊液を作 製する。 この脾細胞と、 例えば H G P R T欠損骨髄腫細胞とを細胞融合して八イブ リドーマを作製する。 細胞融合剤としては脾細胞 （B細胞） と骨髄腫細胞を効率的 に融合できる方法ならば何でもよく、 例えば、 センダイウィルス （HV J ) 、 ポリ エチレングリコール （PEG) を用いる方法などがあげられる。 また、 高電圧パル スを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、 HAT培地で培養し、 脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブ リドーマのクローンを選択し、 スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するの 'を待つ。 目的とする抗体を生産するハイプリドーマを選択するための抗体の検出法 や抗体力価の測定法には、 抗原抗体反応系を利用できる。 具体的には、 可溶性抗原 に対する抗体測定法で、 放射性同位元素免疫定量法 （R I A) 、 酵素免疫定量法 （ EL I SA) などがあげられる。 ' 一本鎖 DNA中に存在する CpGが少なくとも一箇所メチル化されていれば抗メ チル化抗体と結合することができる。 本発明測定方法における 「メチル化された一 本鎖 DNA」 とは、 一本鎖 DNA中に存在する CpGが少なくとも一箇所メチル化 されている一本鎖 DNAを意味しており、 一本鎖 DNA中に存在する C p Gの全て 'がメチル化されている 本鎖 DN Aに限った意味ではない。 本発明における 「 （目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを検出 可能な量になるまで増幅し、 ) 増幅された DNAの量」 とは、 生物由来検体中に含 まれるゲノム DN Aが有する目的領域におけるメチル化された DN Aの増幅後の量 そのもの、 即ち、 本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味する。 例えば、 生物 由来検体が lmLの血清であった場合には、 血清 lmL中に含まれる前記のメチル 化された DN Aに基づいて増幅された DN Aの量を意味する。 本発明における 「前記の一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素の認 識部位に少なくとも 1つ以上のアンメチル状態の CpGを含む一本鎖 DNA」 とは 、 前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも 1つの C p Gにおけるシ トシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖 DN Aを意味する。 また 「前 記の一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状 態の CpGを含まない一本鎖 DNA」 とは、 一本鎖 DNAにおける前記制限酵素の 認識部位の中に存在している全ての C p Gにおけるシトシンがメチル化されている 一本鎖 DN Aを意味するものである。 本発明測定方法の第一工程において、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A由 来の DNA試料から、 メチル化された一本鎖 DNAと、 固定化メチル化 DNA抗体 とを結合させることにより、 前記の一本鎖 DNAを選択する。 具体的には、 第一ェ 程は、 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 メチル化さ れた一本鎖 DN Aを分離する第一 （A) 工程と、 メチル化された一本鎖 DNAを固 定化メチルイ匕 DN A抗体とを結合させることにより、 前記の一本鎖 DNAを選択す 'る第一 （B) 工程からなる。 本発明測定方法の第一 （A) 工程において、 「生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料から、 メチル化された一本鎖 DNAを分離する」 際、 二本 ：鎖 DNAを一本鎖 DNAにするための一般的は操作を行えばよい。 具体的には、 生 物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料を適当量の超純水に溶解し 、 95°Cで 10分間加熱し、 氷中で急冷すればよい。 本発明測定方法の第一 （B) 工程における 「固定化メチル化 DN A抗体」 は、 生 物由来検体中に含まれるゲノム DN A由来の DN A試料からメチル化された一本鎖 DNAを選択するために用いられる。 当該固定化メチル化 DNA抗体は、 支持体に 固定化され得るものであればよく、 「支持体に固定化され得るもの」 とは、 メチル 化 DN A抗体を支持体へ直接的又は間接的に固定できることを意味する。
このように固定化されるためには、 メチル化 DN A抗体を通常の遺伝子工学的な 操作方法又は市販のキット ·装置等に従って、 支持体に固定すればよい （固相への 結合） 。 具体的には、 メチル化 D'NA抗体をピオチン化して得られたピオチン化メ チル化 DNA抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体 （例えば、 ストレブトァ ビジンで被覆した P CRチューブ、 ストレプトアビジンで被覆した磁気ビ一ズ等） に固定する方法を挙げることができる。 . また、 メチル化 DNA抗体に、 例えば、 アミノ基、 チオール基、 アルデヒド基等 の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、 これをシランカツプリング剤等で 表面を活性化させたガラス、 多糖類誘導体、 シリカゲル、 あるいは前記合成樹脂等 、 若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。 尚、 共有 '結合の際には、 例えば、 トリグリセライドを 5個直列に連結して成るようなスぺー サー、 クロスリンカ一等を利用して共有結合させてもよい。
さらに、 メチル化 DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、 また、 メチル化 DNA抗体に対する抗体 （二次抗体） を支持体に固定化し、 二次抗体にメチル化抗 体を結合させることで支持体に固定してもよい。
' 尚、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を選択する際には 、 固定化メチル化 DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、 （1) 当該一本 鎖 DNA (正鎖） と固定化メチル化 DN A抗体との結合前の段階で、 固定化メチル 化 DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、 また （2 当該一本鎖 DNA (正鎖） と固定化メチル化 DNA抗体との結合後の段階で、 固 定化メチル化 DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい
本発明測定方法の第一 （B) 工程において、 「メチル化された一本鎖 DNAと、 固定化メチル化 D N A抗体とを結合させることにより、 前記の一本鎖 D N Aを選択 する」 には、 具体的には例えば、 固定化メチル化 DN A抗体として 「ピオチン標識 されたピオチン化メチル化シトシン抗体」 を使用して、 以下のように実施すればよ い。
(a) ピオチン化メチル化シトシン抗体の適当量 （例えば、 0.1 i gZ5 O L) を アビジン被覆 PC Rチューブに添加して得られた混合物を、 室温で約 1時間静置す ることにより、 ピオチン化メチル化シトシン抗体とストレプトアビジンとの固定化 を促す。 当該操作後、 残溶液の除去及び洗浄を行う。 得られたアビジン被覆 PC R チューブに洗浄パッファー [例えば、 0. 05 % T w e e n 20含有リン酸バッ ファ一 （lmM KH,P04 3mM Na2HP0 · 7 0、 154mM NaCl pH7.4) ) を 10 Q fiL/チュ ーブの割合で添加した後、 当該アビジン被覆 P C Rチューブから溶液を取り除く。 この洗浄操作を数回繰り返することにより、 支持体に固定化されたピオチン化メチ ル化シトシン抗体をアビジン被覆 P C Rチューブ内に残す。
(b) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の二本鎖 DNAをバッファー （ '例えば、 33mM Tris-Acetate pH 7.9、 66mM K0Ac、 lOmM MgOAc2、 0.5mM
Dithothreitol) とを混合して、 95 °Cで数分間加熱する。 その後、 約 0〜4°Cの温 度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保温し、 一本鎖 DNAを形成させる。 そ の後、 室温に戻す。
(c) 形成された前記一本鎖 DN.Aを、 ピオチン化メチル化シトシン抗体が固定化 'されたアビジン被覆 PCRチューブに添加し、 その後、 室温で約 1時間静置レ、 ビ ォチン化メチル化シトシン抗体と、 前記一本鎖 DNAのうちメチル化された一本鎖 DNAとの結合を促す （結合体の形成） （この段階で、 少なくともメチル化されて ない DNA領域を含む一本鎖 DNAは、 結合体を形成しない。 ） 。 その後、 残溶液 の除去及び洗浄を行う。 .洗浄バッファ一 [例えば、 0.05¾ Tween20含有リン酸パッフ ァー （ImM KH2P04, 3mM Na2HP0 · 7H20、 15 mM NaCl pH7. ) ]を、 100 L/チュ ーブの割合で添加し、 溶液を取り除く。 この洗浄操作を数回繰り返し、 結合体を P CRチューブ内に残す （結合体の選択） 。 なお、 第一 （A) 工程、 第一 （B) 工程を具体的に実施する上では、 前記記述に 限定されない。 例えば、 （b) において使用するバッファ一としては、 生物試料 由来のゲノム DN A由来の二本鎖 DN Aを一本鎖 DN Aへ分離するために適してい れば良く、 前記バッファーに限らない。
また例えば、 （a) 及び （c) における洗浄操作は、 溶液中に浮遊している固定 化されていないメチル化 D N A抗体、 メチル化 D N A抗体に結合しなかつた溶液中 に浮遊しているメチル化されていない一本鎖 DNA、 または、 後述の制限酵素で消 化された溶液中に浮遊している DN A等を反応溶液から取り除くため重要である。 尚、 洗浄バッファ一は、 上記の遊離のメチル化 DNA抗体、 溶液中に浮遊している 一本鎖 DN A等の除去に適していれば良く、 前記洗浄バッファーに限らず、 DEL F I Aバッファー （PerkinElmer社製、 Tris- HC1 pH 7.8 with Tween 80) 、 TEA ッファー等でも良い。 ' 本発明測定方法の第二工程にでは、 第一工程で選択された一本鎖 DNAを少なく 'とも 1種類の一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する。 尚、 第一工程で選択された一本鎖 DNAを少なくとも 1種類以上の一本鎖 DNAを 消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、 生成した遊離の消化物 （前 記の一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも 1 つ以上のアンメチル状態の C p 0.を含む一本鎖 DNA) を除去すればよい。
' 本発明測定方法の第二工程における 「メチル化感受性制限酵素」 とは、 例えば、 メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、 メチル化されていないシトシ ンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。 即ち、 メチ ル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシ卜シンがメ ■チル化されている DNAの場合には、 当該メチル化感受性制限酵素を当該 DNAに 作用させても、 当該 DNAは切断されない。 これに対して、 メチル化感受性制限酵 素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていな い DN Aの場合には、 当該メチル化感受性制限酵素を当該 DN Aに作用させれば、 当該 DN Aは切断される。 このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、 例えば、 HpaII、 BstUK Narl、 SacII、 Hhal等を挙げることができる。 尚、 前記のメ チル化感受性制限酵素は、 へミメチル状態の CpG対を含む二本鎖 DNA (即ち、 前記 CpG対のうち、 一方の鎖のシトシンがメチル化されており、 他方の鎖のシト シンがメチル化されていないような二本鎖 DNA) を切断しないものであり、 すで に Gruenbaumらにより明らかにされている （Nucleic Acid Research, 9、 2509- 2515) 。
また、 「一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素」 とは、 例えば、 一 本鎖 DNA中の、 メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、 メチル化さ れていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味 する。 即ち、 メチル化感受性制限酵素の中には、 一本鎖 DNAを消化するものもあ る。 例えば、 Hhal等を挙げることができる。 当該一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べ る方法としては、 具体的には例えば、 前記のメチル化された一本鎖 DNAの内、 目 '的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを铸型とし、 解析対象とするシトシンが含 まれる認識配列を含む DNAを増幅可能なプライマー対を用いて P CRを行い、 D NAの増幅 （増幅産物） の有無を調べる方法をあげることができる。 解析対象とす るシトシンがメチル化されている場合には、 増幅産物が得られる。 一方、 解析対象 とするシトシンがメチル化されていない場合には、 増幅産物が得られない。 このよ 'うにして、 増幅された DN Aの量を比較することにより、 解析対象となるシトシン のメチル化されている割合を測定することができる。
因みに、 第一工程で選択されたメチル化された一本鎖 DNAにおいて、 目的とす る DNA領域は一本鎖状態であり、 負鎖としてのオリゴヌクレオチドは、 目的とす -る DNA領域とは結合しないため、 当該一本鎖 DNAは生物由来検体中に含まれる ゲノム DN A由来の一本鎖である。 また、 当該一本鎖 DN Aは、 前述の通り、 目的 とする DNA領域の全ての CpGがメチル化されているとは限らない。 したがって 、 前記の一本鎖 DN Aを消化できるメチル化感受性制限酵素がメチル状態である一 本鎖 DN Aを切断しないという特性を利用することにより、 前記の生物由来検体中 に含まれるゲノム D N Aにおける前記の一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性 制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも 1つ以上の C p Gにおけるシト シンがメチル化されていたか否かを区別することができ、 目的とする DNA領域に おけるメチル化された DNAの含量をより精度良く求めることができる。 つまり、 目的とする DNA領域または目的とする DNA領域以外のほんの一部の C p Gがメ チル化されていたためメチルイヒ抗体と結合体を形成し選択された一本鎖 DN Aにつ いて、 前記の一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理するこ とにより消化し、 真にメチル化された目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAの みを選択することを可能にしている。 即ち、 前記の一本鎖 DNAを消化できるメチ ル化感受性制限酵素で消化処理することにより、 仮に生物由来検体中に含まれるゲ ノム由来の一本鎖 D N Aの目的とする D N A領域に含まれる一本鎖 D N Aを消化で きるメチル化感受性制限酵素の認識部位の C p Gのシトシンがメチル化されている 場合には、 一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にはメチ ル化 D N Α·抗体が結合しているが、 ゲノム由来の一本鎖 D NAの目的とする D NA '領域に含まれる一本鎖 D NAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の C p Gのシトシンがメチル化されていない場合には、 メチル化 D N A抗体が結合して いないため、 一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素によって消化され る。
したがって、 消化処理を実施した後、 後述のように、 前記の目的とする D NA領 '域を増幅可能な一対のプライマーを用いた P C Rを実施すると、 生物由来検体中に 含まれるゲノム D N Aにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している、 少な くとも 1つ以上の C p Gにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、 P C Rによる増幅産物は得られず、 一方、 生物由来検体中に含まれるゲノム D NAに "おける前記の一本鎖 D NAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に 存在している全ての C p Gにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、 P C Rによる増幅産物が得られることになる。
殆どのメチル化感受性制限酵素は、 アンメチル化状態であつても一本鎖 D N Aを 消化できないが、 前述の通り、 一部のメチル化感受性制限酵素はアンメチル化状態 の一本鎖 D N Aを消化できる。 一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素 としては、 例えば、 Hhalがあり、 このような酵素を利用することにより、 一本鎖 D N Aのメチル化の有無を判別することができる。 即ち、 上記の操作で得られた固定 化メチル化抗体と結合した検体中の D N Aの一本鎖部分の、 Hhalの認識部位に含ま れる C p Gのシトシンがメチル化されていたならば、 Hhalは、 この D NAを消化す ることができず、 メチル化されていなければ、 Hhalは、 この D NAを消化する。 従 つて、 上記反応を実施後、 目的とする D NA領域を増幅可能な一対のプライマーを 用いて P C R反応を実施すると、 検体中の D NAがアンメチル化状態であれば増幅 産物は得られず、 検体中の D N Aがメチル化状態であれば増幅産物が得られること になる。 · 本発明測定方法の第二工程は、 具体的には例えば、 以下のように実施すれば い 。 第一工程で選択した一本鎖 DNAに、 最適な 10X緩衝液 (330iM Tris- Acetate pH 7.9, 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2, 5mM Di thothrei tol) を 3 L、 lig/mL BSA水溶液 'を 3^L、 一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素 Hhal (10U/ L) を夫々 1.5 L加え、 次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 30 iLとし、 37°Cで 1時 間〜 3時間ィンキュベーションすればよい。 このようにして第一工程で選択された一本鎖 DNAを少なくとも 1種類以上の一 '本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、 生成した遊離 ■ の消化物 （前記の一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に 少なくとも 1つ以上のアンメチル状態の CpGを含む一本鎖 DNA) の除去及び洗 浄 （DNA精製） を行う。
' より具体的には例えば、 ストレプトアビジンで被覆した PCRチューブを使用す る場合には、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いた後 、 これに生物由来検体の容量と略等量の TEバッファーを添加した後、 当該 TEA ッファーをピぺッティング又はデカンテ一シヨンにより取り除けばよい。 またスト レプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、 磁石によりビーズを固定 した後、 まず溶液をピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除いだ後、 生 物由来検体の容量と略等量の TEバッファーを添加した後、 当該 TEバッファ一を ピペッティング又はデカンテーシヨンにより取り除けばよい。
次いで、 このような操作を数回実施することにより、 消化物 （前記制限酵素の認 識部位に少なくとも 1つ以上のアンメチル状態の CpGを含む一本鎖 DNA) の除 去及び洗浄 （DNA精製） する。
尚、 上記洗浄操作は、 必ずしも必要ではない。 例えば、 前記メチル化感受性制限 酵素処理で得られた溶液全てを、 第三工程に用いることも可能である。 尚、 本発明測定方法の第二工程における一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受 性制限酵素による消化処理での懸念点として、 メチル化されていないシトシンを含 む認識配列を完全に消化できない （所謂 「DNAの切れ残し」 ） 虞を挙げることが できる。 このような虞が問題となる場合には、 一本鎖 DNAを消化できるメチル化 感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、 「DNAの切れ残し」 を最小限に抑 えることができるので、 目的とする DNA領域としては、 一本鎖 DNAを消化でき るメチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも 1つ以上有しており、 その認識 部位が多ければ多いほどよいと考えられる。 尚、 本発明測定方法において、 .「生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の 'DNA試料」 が、 当該ゲノム DNAが有する目的とする DNA領域を認識切断部位 • としない制限酵素で予め消化処理されてなる DNA試料であることを好ましい態様 の一つとして挙げることができる。 ここで、 生物由来検体中に含まれるゲノム DN A (鐽型 DNA) を本固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、 短い铸型 D ： NAの方がより選択され易く、 また、 PCRで目的領域を増幅する場合にも、 铸型 DNAが短い方がよいと考えられるので、 目的とする DNA領域を認識切断部位と しない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料に直接 使用し消化処理を実施してもよい。 尚、 目的とする DNA領域を認識切断部位とし ない制限酵素により消化処理する方法としては、 一般的な制限酵素処理法を用いれ ばよい。
また、 「生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料」 が、 少なく とも 1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D N A試料であ ¾ ことを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、 生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で 消化処理しておくことにより、 メチル化量を精度良く求めることができるためであ る。 当該方法は、' 上記のような 「DNAの切れ残し」 を無くすのに有用である。 生物由来検体に含まれるゲノム DN A由来の試料をメチル化感受性制限酵素によ り消化する方法としては、 生物由来検体がゲノム DNA自体の場合には前記の方法 と同様な方法でよく、 生物由来検体が組織溶解液、 細胞溶解液等の場合には前記の 方法と同様な方法に準じて、 大過剰のメチル化感受性制限酵素、 例えば、 25ngの D NA量に対して 500倍量 （10U) 又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用い T消 化処理を実施すればよい。
ゲノム DNAは、 基本的には二本鎖 DN Aとして存在している。 したがって、 本 '操作においては、 一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 fflial) だ けでなく、 二本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素 （例えば、 HpaII、 BstUL NarK SacII、 fflial等） を用いることができる。 本発明測定方法の第三工程にお.いて、 下記の各本工程の前工程として、 第二工程 'で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記の一本鎖 DNAを消化できるメチル 化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p Gを含まない一本鎖 DNA) を、 前記の固定化メチル化 DNA抗体から分離して一本鎖状態である DNA (正鎖 ) にする工程 （第三 （前 A) 工程） と、
：第三 （前 A) 工程で分離された一本鎖状態である DNA (正鎖） を铸型として、 当 該一本鎖状態である DNA (正鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （正鎖） であ つて、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端よりさら に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負 鎖） を有する伸長プライマ一 （フォーワード用プライマ一） を伸長プライマーとし て、 当該伸長プライマ一を 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である D NA (正鎖） を二本鎖 DNAとして伸長形成させる工程 （第三 （前 B) 工程） と、 第三 （前 B) 工程で伸長形成された二本鎖 DNAを、 目的とする DNA領域を含む 一本鎖 DNA (正鎖） と目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） に一旦 分離する工程 （第三 （前 C) 工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を铸型として、 前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、 当該伸長プライマーを一回 伸長させることにより、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる本工程— Aと、
(b) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） を铸型として、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分 塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖 ) に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置 する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長 'プライマー （リバース用プライマ一） を伸長プライマ一として、 当該伸長プライマ 一を 1回伸長させることにより、 前記の目的とする A領域を含む一本鎖 DN A を二本鎖 D N Aとして伸長形成させる本工程一 Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DNAを 一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域 'におけるメチル化された DNAを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量する。 本発明測定方法の第三工程では、 まず、 下記の各本工程の前工程のうち第三 （前 : A) 工程として、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記の一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態の C p G を含まない一本鎖 DNA) を、 前記の固定化メチル化 DNA抗体から分離して一本 鎖状態である DNA. (正鎖) にする。 具体的には例えば、 第二工程で得られた未消 化物である一本鎖 D N A (前記の一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵 素の認識部位にアンメチル状態の Cp Gを含まない一本鎖 DNA) に、 ァニ一リン グバッファーを添加することにより、 混合物を得る。 次いで、 得られた混合物を 9 5 °Cで数分間加熱することにより、 一本鎖状態である DNA (正鎖） を得る。 その 後、 第三 （前 B) 工程では、 具体的には例えば、 第三 （前 A) 工程で得られた一本 鎖状態の DNA (正鎖） とフォワードプライマーを、 滅菌超純水を 17.85 L、 最適 な緩衝液 （例えば、 ΙΟΟιη Tris-HCl pH 8.3、 500ra KCK 15mM MgCl2) を 3^L、 2mM dNTPを 3 L、 5N' ベ夕インを 6 t加え、 次いで当該混合物に Ampl iTaq (DNAポリ メラーゼの 1種： 5U/ iL) を 0.15 L加えて液量を 30 Lとした溶液中で混合し、 37 °Cで約 2時間インキュベーションし、 目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正 鎖） を二本鎖 DN Aに伸長形成させる。 第三 （前 C) 工程においては、 具体的には 例えば、 第三 （前 B) 工程で伸長形成された二本鎖 DNAに、 アニーリングバッフ ァーを添加することにより混合物を得て、 得られた混合物を 95°Cで数分間加熱す ることにより、 目的とする DN A領域を含む一本鎖 DN Aに一旦分離する。
その後、 本工程として、
' (i) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） に、 前記のフォヮ —ド用プライマーをアニーリングさせるために、 例えば、 前記のフォワード用ブラ イマ一の Tm値の約 0〜20°C低い温度まで速やかに冷却し、 その温度で数分間保 温する。
(ii)その後、 室温に戻す。 .
'(iii)上記（i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態である DNAを铸型として、 前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、 当該プライマーを 1回伸 長させることにより、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNAを二本鎖 D NAとして伸長形成させる （即ち、 第三工程一 A) 。 具体的には例えば、 後述の説 •明や前述の本発明測定方法の第三 （前 B) 工程における伸長反応での操作方法等に 準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） を鎵型として、 前 記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分塩 基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DN A領域の塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3'末端よりさらに 3'末端側に位置する部 分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長プライ マー （リバース用プライマー） を伸長プライマーとして、 当該伸長プライマーを 回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である DN Aを伸長形成された二本鎖 DNAとする （即ち、 第三工程一 B) 。 具体的には例えば、 上記（iii)の第三工程一 Aと同様に、 第三 （前 B) 工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すれ ばよい。 '
(V)さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成されたニ本鎖 D N A を一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すこと （例えば、 第三工程一 A及び第三ェ 程一 B) により、 前記の目的とする DNA領域におけるメチル化された DNAを検 出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量する 第三工程は、 具体的には、 第三 （前 A) 工程から開始して本工程に至るまでの反 応を、 一つの PC R反応として実施することもできる。 また、 第三 （前 A) 工程か 'ら第三 （前 C) 工程まで、 各々、 独立した反応として実施し、 本工程のみを PCR 反応として実施することもできる。 一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化処理の後に目的と する DNA領域 （即ち、 目的領域） を増幅する方法としては、 例えば、 PCRを用 'いることができる。 目的領域を増幅する際に、 予め蛍光等で標識されたプライマー を使用してその標識を指標とすれば、 電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅 産物の有無を評価できる。 PCR反応液としては、 例えば、 本発明測定方法の第二 工程で得た DNAに、 50 Mのプライマーの溶液を 0.15 1と、 2mM dNTPを 2.5 1と 、- 10X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 20mM MgCl2、 0.01% Gelatin) を と、 AmpliTaq Gold (耐熱性 DNAポリメラ一ゼの一種： 5U/ X 1)を 0.2 1 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげることがで きる。
目的とする DNA領域 （即ち、 目的領域） は、 GCリッチな塩基配列が多いため 、 時に、 ベタイン、 DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。 反応条件とし ては、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒 間次いで 55〜65°Cにて 30秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする保^ _を 30〜 40サイクル行う条件があげられる。 かかる PCRを行った後、 得られた増幅産物を 検出する。 例えば、 予め標識されたプライマーを使用した場合には、 先と同様の洗 浄 ·精製操作を実施した後、 蛍光標識体の量の測定により P C R反応での増幅量を 評価することができる。 また、 標識されていない通常のプライマーを用いた P CR を実施した場合には、 金コロイド粒子、 蛍光等で標識したプローブ等をァニーリン グさせ、 目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出すること ができる。 また、 増幅産物の量をより精度よく求めるには、 例えば、 リアルタイム P C R法を用いればよい。 リアルタイム P C R法とは、 P C Rをリアルタイムでモ 二ターし、 得られたモニター結果を力イネティックス分析する方法であり、 例えば 、 遺伝子量に関して 2倍程度のほんの僅かな差異をも検出できる高精度の定量 P C R法として知られる方法である。 当該リアルタイム P C R法には、 例えば、 鎵型依 '存性核酸ポリメラ一ゼプローブ等のプローブを用いる方法、 サイバーグリーン等の ィンタ一力レーターを用いる方法等を挙げることができる。 リアルタイム P C R法 のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。 以上の如く、 検出に ついては特に限定されることはなく、 これまでに周知のあらゆる方法による検出が 可能である。 これら方法では、 反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可 '能となる。 他に、 第二工程の態様としては、 一本鎖 D NAを消化できるメチル化感受性制限 酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する等を挙げることができる。 目的 ： とする D N A領域に一本鎖 D N Aを消化できるメチル化感受性制限酵素で切断され る塩基配列が無い場合には、 第二工程を実施せずに第三工程を実施しても構わない
他に第一 （A) 工程において、 メチル化された一本鎖 D NAを分離する際の好ま しい態様としては、 カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げること ができる。 カウンターオリゴヌクレオチドとは、 目的とする D NA領域と同じ塩基 配列を有する短いオリゴヌクレオチドである。 通常 1 0〜1 0 0塩基、 より好まし くは、 2 0 ~ 5 0塩基の長さに設計したものであればよい。 尚、 カウンターオリゴ ヌクレオチドは、 フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的 とする D NA領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。 カウンターオリ ゴヌクレオチドは、 ゲノム D NAこ比し、 大過剰で添加され、 目的とする D NA領 域を一本鎖 （正鎖） にした後、 固定化メチル化 D NA抗体と結合させる際に、 目的 とする D NA領域の相補鎖 （負鎖） と目的とする D NA領域の一本鎖 （正鎖） が相 補性により再結合することを妨げるために添加する。 目的とする D N A領域にメチ ル化 DNA抗体を結合させて、 DNAのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指 標値を測定する際に、 目的領域が一本鎖である方がメチル化 DNA抗体に結合しや すいからである。 尚、 カンウタ一オリゴヌクレオチドは、 目的とする DNA領域に 比べて、 少なくとも 10倍、 通常は 100倍以上の量が添加されることが望ましい 。
「メチル化された一本鎖 DN Aを分離する際にカウンタ一オリゴヌクレオチドを 添加する」 とは、 具体的には、 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DN A試料から、 メチル化された一本鎖 DNAを選択するために、 生物由来生物由来検 '体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料をカウンターオリゴヌクレオチドと 混合して、 目的とする DNA領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二 本鎖を形成させればよい。 例えば、 前記 DN A試料と、 前記カウンタ一オリゴヌク レオチドを、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 ·■ 5mM Dithiothreitol) 5 Lと、 lOOmMの M g C 12溶液 5 / Lと、 lmg/mLの BSA溶液 5^Lを添加し、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合して、 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温 度で 10分間保温し > 次いで、 50 まで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温した後、 室温に戻せばよい。 各種疾患 （例えば、 癌） において DNAのメチル化異常が起こることが知られて おり、 この DNAメチル化異常を検出することにより、 各種疾患の度合いを測定す ることが可能と考えられている。
例えば、 疾患患者由来の検体中に含まれるゲノム DNAにおいて 100%メチル 化されている DNA領域があり、 その DNA領域について、 本発明測定方法を実施 すれば、 メチル化された DNA 量は多くなるであろう。 また、 例えば、 疾患患者 由来の検体中に含まれるゲノム DNAにおいて 100 %メチル化されていない DN A領域があり、 その DNA領域について、 本発明測定方法を実施すれば、 メチル化 された DNAの量はほぼ 0に近い値となるであろう。 また、 例えば、 健常者の生物 由来検体中に含まれるゲノム D NAにおいて低メチル化状態 （hypomethylat ion) で 、 且つ、 疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノム D NAにおいて高メチル化状 態 （hypermethylat ion) である D NA領域があり、 その D NA領域について、 本発 明測定方法を実施すれば、 健常者の場合には、 メチル化された D NAの量は、 0に '近い値を示し、 一方、 疾患患者の場合には、 健常者の場合における値よりも有意に 高い値を示すため、 この値の差異に基づき、 「疾患の度合い」 を判定することがで きる。 ここでの 「疾患の度合い」 とは、 一般に当該分野において使用される意味と 同様であって、 具体的には、 例えば、 生物由来検体が細胞である場合には当該細胞 の悪性度を意味し、 また、 例えば、 生物由来検体が組織である場合には当該組織に 'おける疾患細胞の存在量等を意味している。 さらに、 生物由来検体が血漿 ·血清で ある場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。 従って、 本発明測定方 法は、 メチル化異常を調べることにより、 各種疾患を診断することを可能にする。
： -このような本発明測定方法における、 目的領域のメチル化された D NA量の測定 を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、 プライマ一又はプローブは、 検出用 キットの試薬として有用である。 本発明は、 これら制限酵素、 プライマー又はプロ 一ブ等を試薬として含有する検出用キットゃ、 これらプライマー又はプローブ等が 支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、 本発明測定方法の権利 範囲は、 当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キッドゃ検出 用チップのような形態での使用も含むものである。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるも のではない。 実施例 1 .
市販のメチル化シトシン抗体 (Aviva Sys tems Bio logy社製） を、 巿販ピオチン化 キット （Biot in Label ing Ki t- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載 された方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチル化シトシン 抗体を溶液[抗体約0.1 ^/100 1^ 0.1¾ BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 · 7H20、 15補 NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。 ' ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計.8本） に、 上記のピオチン標識 メチル化シ卜シン抗体溶液を各 1 0 O ^Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置する ことにより PCRチューブに固定化した。 その後、 当該 PC Rチューブ内の溶液を ピベッティングにより取り除いた後、 前記 PCRチューブ内に 1 00 Lの洗浄バッフ ァ一 [0.05 Tween20含有リン酸バ.ッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 - 7H20 15 mM 'NaCl pH7. ) ]を添加した。 次いで、 前記バッファーをピペッティングにより取り除 いた。 この操作をさらに 2回繰り返した。 配列番号 1 7で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチド UB C— - M, 及び、 配列番号 1 8で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオ チド UBC— Uを別々合成して、 夫々にっき以下の溶液 （以下、 オリゴヌクレオチ ド溶液と記す。 ） を調製した。
溶液 A： 0. OlpmoL/lOO^L TEバッファー溶液
溶液 B： O.OOlpmoL/lOO L TEバッファー溶液
溶液 C： 0. OOOlpmoL/lOO L TEバッファー溶液
溶液 D： OpmoL/lOO^L TEバッファー溶液 （ネガティブコントロール液）
<メチル化オリゴヌクレオチド > Nはメチル化シトシンを示す。
UBC-M： 5'-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACAT CCAGA -3' (配列番号 1 7) '
<アンメチル化オリゴヌクレオチド >
UBC-U： 5' - CCAGA-3' (配列番号 18) 得られた夫々の溶液について、 以下の処理を施した （各溶液について 1本ずつ調 製） 。 ·
前記のピオチン標識メチルイヒシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被 覆済み PCRチューブに、 前記で調製されたオリゴヌクレオチド溶液 100 Lを加 え、 室温で 2時間放置した。 その後、 当該 PCRチューブ内の溶液をピペッティングに より取り除いた後、 前記チューブ内に 200 の洗浄バッファ一 [0.05% Tween20 含有リン酸バッファー （lmM K¾P0い 3mM Na2HP0 · 7H20、 154m NaCl pH7.4) ]を添 '加した。 次いで、 当該 PCRチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り 除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第一工程に相 当する） 。
次に、 このようにして得られた PCRチューブに、 配列番号 19及び配列番号 2 0で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液 （PF及び PR) 及び、 下記の 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 目的とする DNA領域 UBC (配列番 号 21、 メチル化シトシンも Cで表す） におけるメチル化された DNAを増幅した。
'一 >
PF： 5' -AGTGACACCATCGAGAATGTCA-3' (配列番号 19 )
PR： 5' -TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3 ' (配列番号 20 )
<目的とする DNA領域 >
UBC： 5' - AGTGACA
CCAGA-3' (配列番号 21)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 50 Mに調製された配列番号 19及び配列番号 20で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各 0. 3 と 、 each 2mM dNTP 5 Lと、 緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500m KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelat in) 5 Lと、 耐熱性 DNAポリメラーゼ (Am liTaq Gold ) \J/ 0. 2 5 Lとを混合した後、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加え て液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した 後、 95 にて 30秒間次いで 59 °Cにて 30秒間さらに 72 にて 45秒間を 1 'サイクルとする保温を 22サイクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動に供することにより DNA の増幅を確認した。 その結果を図 1に示した （以上、 本発明測定方法の第三工程に 相当する。 ) 。 UBC— Mの溶液 A (O.Olpmol) 、 溶液 B (OOOlpmol) 、 及び、 溶 液 C (0. OOOlpmol) で、 DN Aの増幅が確認されその増幅産物 （目的とする DNA '領域： UBC) が得られた。 UBC— Mの溶液 D (Opmol) では、 DNAの増幅が確 認されずその増幅産物は得られなかった。 一方、 UBC— Uの溶液 A (0,01pmol) 、 溶液 B (O.OOlpmol) 、 溶液 C (0. OOOlpmol) 、 及び、 溶液 D (Opmol) の全ての 群において、 D N Aの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかつた。 以上より、 固定化されたメチル化シトシン抗体で、 メチル化された目的とする D N A領域を含む一本鎖 DN Aを選択することが可能であること、 且つ、 前記の目的 とする DN A領域におけるメチル化されていない DN Aを増幅することなく、 メチ ル化された DN Aのみを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAの量を 定量できること等が確認された。 実施例 2
市販のメチル化シトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化 キット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載 された方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチル化シト.シン 抗体を溶液 [抗体約 0. l g/50 L Ό.1¾ BSA含有リン酸バッファ一 （ImM K¾P0い 3mM Na2鹏 · 7Η20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 6本） に、 上記のピオチン標識 メチル化シトシン抗体溶液を各 50； Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置するこ とにより PCRチューブに固定化した。 その後、 当該 PCRチューブ内の溶液をピぺッ ティングにより取り除き、 1 0 0 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸 バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 - 7H20、 15 m NaCl pH7.4) ]を添加した。 次 いで、 当該 PCRチューブ内の当該バッファ一をピペッティングにより取り除いた。 こ 'の操作をさらに 2回繰り返した。
配列番号 2 2で示される塩基配列からなる Hh a Iで消化されない部分メチル化 オリゴヌクレオチド GPR 7— 2 0 7 9 - 2 1 7 6/9 8me r -M (7) 、 配列番 号 2 3で示される塩基配列からなる Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌク レオチド GPR 7— 207 9— 2.1 7 6/98me r— HM (5) 、 配列番号 24で '示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 - 2 0 7 9 - 2 1.76/98me r一 UMを別々合成して、 夫々にっき 0. l pmo 1/50 L TEバッファー溶液 （以下、 オリゴヌクレオチド溶液と記す。 ） を調製した。
• <Hh a Iで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nはメチル化シ卜シンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7) ：
5'-
GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTG GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 22)
<Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド >
Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5) ：
5' -
GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTG GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 2 3)
ぐアンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-U ： 5' -
GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTG GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 24) ' 得られた夫々の溶液について、 以下の処理を施した （各溶液について 2本ずつ調 製） 。
前記のピオチン標識メチル化シトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被 覆済み P CRチューブに、 前記で調製 wされたオリゴヌクレオチド溶液 5 O Lを加 え、 室温で 1時間放置した。 その後、 当該 PCRチューブ内の溶液をピペッティングに 'より取り除いた後、 前記の PCRチューブ内に 100 Lの洗浄バッファー [0.05%
Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 - 7H20, 154mM NaCl pH7.4 ) ]を添加した。 次いで、 当該チューブ Λの前記バッファーをピペッティングにより 取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第一工程 : に相当する） 。 このようにして得られたサンプルに、 以下の Α処理又は Β処理を施した （各 1本 ずつ調製） 。 .
A処理群 （無処理群） ：前記で調製されたサンプルに、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate ρΗ 7,9、 660mM KOAc, lOOmM Mg0Ac2, 5mM Dithiothreitol) I O Lと、 BSA (Bovine serum albumin lmg/mL) I O Lとを加えた後、 さらに当該混合物 に滅菌超純水を加えて液量を 100 Lとした。 .
B処理群 （Hh a I処理群） ：前記で調製されたサンプルに、 緩衝液 (330mM Tris - Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Dithiothreitol) 1 O ^Lと、 BSA (Bovine serum albumin l'mg/mL) I O Lと、 Hh a Iを 64 Uとを加えた 後、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 5 0 ^ Lとした。 各々の反応液を 37 で 3時間インキュベーションした。 次いで、 PCRチューブ内 の溶液をピベッティングにより取り除いた後、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 · 7H20、 154mM NaCl pH7.4 ) ]を添加した。 その後、 当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。 この 操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第二工程に相当する） 。 次に、 このようにして得られた PCRチューブに、 配列番号 25及び配列番号 26で 示される塩基配列からなるプライマーの各溶液 （PF2及び PR2) 及び、 下記の 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 目的とする DNA領域 （GPR7-20 79-2176、 配列番号 27、 メチル化シトシンも Cで表す） におけるメチル化さ れた DNAを増幅した。
'一 >
PF2： 5' -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3' (配列番号 25)
PR2： 5' -TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3' (配列番号 26)
<目的とする DNA領域 >
GPR7-2079-2176： 5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGC
GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 27)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 3 に調製された配列番号 2 5及び配列番号 26で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各 5 Lと、 ea.ch 2mM dNTP 5 ^Lと、 緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500iM KCK 15mM MgCl2 、 0.01% Gelatin) 5 Lと、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （Amp liTaq Gold) 5UZ 0. 2 5 Lと、 5 Nベタイン水溶液 10 とを混合した後、 更に当該混合物 これに滅菌超純氷を加えて液量を 50 としたものを用いた。 当該反応液を、 95 でにて 10分間保温した後、 95 にて 30秒間次いで 59 にて 30秒間さらに 72 にて 45秒間を 1サイクルとする保温を 18サイクル行う条件で PCRを行 つた。 - PCRを行った後、 得られた増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動に供す ることにより DNAの増幅を確認した。 その結果を図 2に示した （以上、 本発明測 定方法の第三工程に相当する。 ) 。 A処理群 （無処理群） の場合、 Hha lで消化 されない部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079 -2176/98me r一 M (7) と、 Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 -2079-2176/98me r -HM (5) とでは、 DNAの増幅が確認されそ の増幅産物 （目的とする DNA領域： GPR7— 2079— 2176) が得られた 。 アンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7 -2079-2176/98me r— U Mでは、 DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 B処理群 （H 'ha I処理群） の場合、 Hh a Iで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド GP 7 - 2079- 2176/98me r—M (7) では、 DNAの増幅が確認さ れその増幅産物 （目的とする DN A領域： GPR7— 2079— 2176) が得ら れたが、 Hha Iで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 207 ■ 9 - 2176/98me r -HM (5) 、 及び、 アンメチル化オリゴヌクレオチド G 卩 7— 2079 _2176/981116 1"—1； では、 D NAの増幅が確認されずそ の増幅産物は得られなかった。 以上より、 固定化されたメチル化シトシン抗体で、 メチル化された目的とする D NA領域を含む一本鎖 DN Aを選択することが可能であること、 また、 メチ'ル化感 受性制限酵素で処理することにより、 メチル化感受性制限酵素認識部位がメチル化 されていない目的とする DNA領域を消化できること、 且つ、 前記の目的とする D N A領域におけるメチル化されていない DN Aを増幅することなく、 メチル化され た D N Aのみを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された D N Aの量を定量でき ること等が確認された。 実施例 3 .
市販のメチル化シトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化 キット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタ'ログに記載 された方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチル化シ卜シン 抗体を溶液[抗体約0.1 ^/50^1^ 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、' 3mM Na2HP0 · 7H20, 154m NaCl pH7. ) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 6本） に、 上記のピオチン標識 ■メチル化シトシン抗体溶液を各 50 tLの割合で添加し、 約 1時間室温で放置するこ とにより PCRチューブに固定化した。 次いで、 当該 PCRチューブ内の溶液をピぺッテ ィングにより取り除いた後、 前記 PCRチューブ内に 100 Lの洗浄バッファー
[0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 - 7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した。 その後、 当該チューブ内の前記バッファーをピベッティ 'ングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した。
配列番号 22で示される塩基配列からなる Hti a Iで消化されない部分メチル化 オリゴヌクレオチド G PR 7— 2079 - 2176/98me r -M (7) 、 配列番 号 23で示される塩基配列からなる Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌク レオチド GPR 7 - 2079-2176/98me r -HM (5) 、 配列番号 24で 示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079 - 2 1 76/98me r— UMを別々合成して、 夫々にっき 0. l pmo l/50 xL TEバッファー溶液.（以下、 オリゴヌク オチド溶液と記す。 ） を調製した。
<Hh a Iで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド >
Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7) ：
5' -
GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTG GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 22)
<H a Iで消化される部分メヂル化オリゴヌクレオチド >
Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)：
5' - . GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTG GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 23)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
' 5'-
GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 24) このようにして得られたサンプルについて、 以下の A処理又は B処理を施した （ '各 1本ずつ調製） ό
Α処理群 （無処理群） ：前記で調製されたサンプル （各 l O iL) に、 緩衝液 （ 330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5raM Dithiothreitol) 5 : と、 BSA (Bovine serum albumin lmg/mL) 5 Lとを加えた後、 さらに当該 混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした。
B処理群 （Hh a I処理群） ：前記で調製されたサンプル （各 10 L) に、 緩衝 液 （330mM Tr is- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol ) 5 と、 BSA (Bovine serum albumin lmg/mL) 5 Lと、 Hh a lを 64U とを加えた後、 さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 とした。 各々の反応液を 37°Cで 3時間インキュベーションした。 反応液全てを、 前記で 調製されたビォチン標識メチル化シトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン 被覆済み PCRチューブに添加した後、 室温で 1時間放置した。 次いで、 PCRチューブ 内の溶液をピペッティングにより'取り除いた後、 100 /Lの洗浄バッファー
[0.05% Tween20含有リン酸バッファー （1 KH2P04、 3mM Na2HP0 - 7¾0、 15 raM NaCl pH7.4) ]を添加した。 その後、 当該バッファーをピペッティングにより取り除 いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の第一工程に相当 する） 。 次に、 このようにして得られた PCRチューブに、 配列番号 25及び配列番号 26で 示される塩基配列からなるプライマーの各溶液 （PF 2及び PR2) 及び、 下記の 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 目的とする DNA領域 （GPR7- 20 79- 2176、 配列番号 27、 メチル化シトシンも Cで表す) におけるメチル化さ れた DN Aを増幅した。
'― >
'PF2： 5' -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3' (配列番号 25)
PR2： 5' -TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3' (配列番号 26)
<目的とする DNA領域 >
GPR7-2079-2176： 5'-
G TGGCCACTGCGGAGTCGC GGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3' (配列番号 27)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 3 Mに調製された配列番号 2 5及び配列番号 26で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各 5 Lと、 each 2mM dNTP 5 Lと、 緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2 、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold) 5 U/ iLを 0. 25 ^Lと、 5 Nベタイン水溶液 10 Lとを混合した後、 更に当該混令 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応液を、 95で にて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 59 °Cにて 30秒間さら 7 2 °Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 18サイクル行う条件で P C Rを行つ た。 '
P C Rを行った後、 得られた PCR産物を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動に供する ことにより DNAの増幅を確認した。 その結果を図 2に示した （以上、 本発明測定 方法の第三工程に相当する。 ） 。 A処理群 （無処理群） の場合、 Hh a lで消化さ WO 2008/123537
50 れない部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR 7— 2079 -2176/98me r 一 M (7) と、 Hh a Iで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド GPR ー 2079-2176/98me r -HM (5) とは、 D N Aの増幅が確認されその増 幅産物 （目的とする DN A領域： GPR7— 2079— 2176) が得られた。 ァ ンメチル化オリゴヌクレオチド GPR7— 2079-2176/98me r—UMで は、 DN Aの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 B処理群 （Hh a I処理群） の場合、 Hh a Iで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド GP R7— 2079— 21 76/98me r— M (7) では、 増幅が確認されその増幅産 物 （目的とする DNA領域： G PR 7— 2079— 2176) が得られたが、 Hh ■ a Iで消化される部分メチルイ匕オリゴヌクレオチド. GPR7— 2079- 21.76/ 98me r -HM (5) 、 及び、 アンメチル化オリゴヌクレオチド GP R 7— 20 79-2176/98me r一 UMでは、 D N Aの増幅が確認されずその増幅産物は 得られなかった。 実施例 4
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 巿販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 g/iL 0.1% BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 ·7Η20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 jLig/50 溶液を各 50 の割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピぺッチイ ングにより取り除き、 100 の洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー (ImM KH2P04、 3mM Na2HP0'7H20、 154raM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファ一をピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DN Aについて、 以下の配列 番号 28及び配列番号 29で示される PCRのために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一プライマ一 （？ 1及び？尺1) 及び反応条件を用いて PC Rを行う ことにより、 供試サンプルとして用いられる DN Aフラグメント （X、 配列番号 3 0、 Genbank Accession No. NT— 029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に
'相当する領域） を増幅した。
< P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー >
PF 1 ： 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 28)
PR 1 ： 5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 29)
'く DNAフラグメント〉
X： 5'-
Figure imgf000052_0001
AGTTTGGCCAG (配列番号 30 )
PCRの反応液としては、 錄型とするゲノム DNAを 5 ngと、 5 Mに調製され たオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 1と、 each 2 mM dNTPを と、 1 OX緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 5U/ 1を 0. 25 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とし たものを用いた。 当該反応液を、 95 にて 10分間保温した後、 95 にて 30 秒間次いで 6： TCにて 30秒間更に 72 にて 45秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント X.を精製した 得られた D NAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1と、 1 0 xNEBuf fer 2 (NEB社製）を 1 0 1と、 S— adenosyl methionine (3. 2 mM, NEB社製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 1 0 0 1と 'したものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5 - 3 0分間インキュベーションし 、 さらに S- adenosyl methionine (3. 2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 1 5 - 3 0分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Ki t (PROMEGA 社） により精製した。 さらにこれらの操作を 5回繰り返し、 メチル化した D NAフ ラグメン卜 （MX、 配列番号 3 1.) を得た。
,
<D NAフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す）
MX： 5' -
CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCAC ACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGC TTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGG AAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTC NGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCC AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 3 1 ) 得られた D NAフラグメント Xについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： lOOpg/lO ^L TE溶液
溶液 B： lOpg/lO ^L TE溶液
溶液 C： lpg/10 /z L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られた D NAフラグメント MXについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 100pg/10 6L TE溶液
溶液 MB： lOpg/lO ^L TE溶液 ' 溶液 MC： lpg/lO^L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液） ' また、 配列番号 32で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域の負鎖に '相補性により結合可能な配列番号 33〜配列番号 44で示される塩基配列からなる カウンタ一オリゴヌクレオチド C 1〜C 12を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 M である TEバッファ一溶液を調製した。
<目的とする DNA領域 > ( 5 -メチルシトシンも Cで表す）
'Χ' : 5'—
Figure imgf000054_0001
AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 32)
<カウンターオリゴヌクレオチド>
C 1 ： 5' - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG - 3, (配列番号 33)
C 2 ： 5' - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号 34)
C 3 ： 5' - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号 35)
C4 ： 5' - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号 36)
C 5 ： 5' - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号 37)
C 6 ： 5' - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号 38 )
C 7 ： 5' ― CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号 39 )
C 8 ： 5' - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号 40)
C 9 ： 5' - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC - 3, (配列番号 41)
C 10 ： 5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号 42)
C 1 1 ： 5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号 43) C 12 ： 5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号 44) 前記の DNAフラグメント Xの溶液及びメチル化した DNAフラグメント MXの溶 液の夫々について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメント溶液 1 O^Lと、 前記で調製 したカウンタ一オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Di thiothrei tol) 5 Lと、 lOOmMの M 8。 12溶液5 と、 lmg/mLの BSA溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 5.0 Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチュー 'ブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する) 。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 ■済み PC Rチューブに 前記で調製した DN Aフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 Lの洗浄バッファー [0.05¾ Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7¾0, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。
次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 28及び配列番号 29で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 1及び P R 1の各溶液及び、 下 3 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 32で示される塩基配列か らなる目的とする DNA領域 X' におけるメチル化された DNAを増幅した。 <PC Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー >
PF 1 ： 5' - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 28 )
PR1 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 29)
<目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す） · W
55
X' : 5'-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCAC
Figure imgf000056_0001
AAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTC
AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 3 2)
PCRの反応液としては、 铸型.とする DN Aに、 5 Mに調製されたオリゴヌク 'レオチドプライマ一溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液
(lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5UZ Lを 0. 25 と を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 Lとしたものを用いた。 当該反応 '液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 61 °Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロー ゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 4に示した。 メチル化された DNAフラグメント MXの溶液 MA、 MB及び MCでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 增 幅が確認されなかった。 メチル化されていない DNAフラグメント Xの溶液 A、 B 、 C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DNAを選択するこどが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 実施例 5
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチシ化キ ット （Biot in Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 'を溶液 [抗体約 0.25 ug/fl 0.1¾ BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 •7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ 'ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー (ImM KH2P04、 3mM Na2HPO-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 • クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の配列 番号 45及び配列番号 46で示される PC Rのために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一プライマ一 （PF 2及び PR 2) 及び反応条件を用いて PCRを行う ことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフラグメント （Y、 配列番号 4 7、 Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号 76606- 76726に相当する 領域） を増幅した。 ぐ P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF2 ： 5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC - 3' (配列番号 45)
PR 2 ： 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号 46)
<DNAフラグメン卜 >
Υ : 5'- '
GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAG AGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号 47) P CRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 5 ngと、 5 Mに調製され たオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 1と、 each 2mM dNTPを 5 1 と、 10X緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を .5 lと、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） '511/ 1を0. 25 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とし たものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30 秒間次いで 60°Cにて 30秒間更に 72でにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 5 0サイクル行う条件で P CRを行った。
P CRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 'Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Yを精製した
得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を ： 1 1と、 10 xNEBuffer2 (NEB社製）を 10 lと、 S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 /i 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1と したものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5-30分間インキュベーションし 、 さらに S-adenosyl . methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37 にて 1 5 - 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PROMEGA 社） により精製した。 さらにこの操作を 5回繰り返し、 メチル化した DNA'フラグ メント （MY、 配列番号 48) を得た。
<DNAフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す）
MY： 5'-
GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAG AGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3' (配列番号 48) 得られた DN Aフラグメント Yについて、 以下の溶液を調製した
溶液 A： lOOpg/lO^L TE溶液 溶液 B： lOpg/lO^L TE溶液
溶液 C： lpg/10 L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られた DNAフラグメント MYについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 100pg/10^L TE溶液
溶液 MB： 10pg/10 L TE溶液
溶液 MC： lpg/10//L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液） また、 配列番号 49で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 Y' の負 鎖に相補性により結合可能な配列番号 50、 塩基配列 24及び配列番号 52 示さ れる塩基配列からなるカウンタ一オリゴヌクレオチド C 13、 C 14、 及び C 1 5 を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 Mである TEバッファ一溶液を調製した。
<目的とする D N A領域〉 ( 5 -メチルシトシンも Cで表す）
Y' ： 5'- GCGCCGGGTC
AGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号 49)
<カウンターオリゴヌクレオチド >
C 13 ： 5'- GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号 50)
C 1 ： 5'- CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3' (配列番号 5 1)
C 1 5 : 5'- CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3' (配列番号 52)
液の夫々について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメント溶液 10 Lと、 前記で調 製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2, 5mM Di thiothrei tol) 5 Lと、 lOOmMの M < 12溶液5 ^しと、 lmg/mLの BSA溶液 5 を添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合した。 その後、 本 PC Rチュー ブを 95 で 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 '温した。 次いで、 50 まで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆 済み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 1時間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 ' Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸パッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 45及び配列番号 46で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー PF 2及び PR 2の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて PC Rを行うことにより、 配列番号 49で示される塩基配列か らなる目的とする D N A領域 Y ' におけるメチル化された D N Aを増幅した。 <PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF2 ： 5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号 45)
PR 2 ： 5' - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号 46)
<目的とする DNA領域 >
Y' : 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAG AGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号 49)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (ΙΟΟπιΜ Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15iM MgCl2, 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） を 0. 25 と を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応 液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 20秒間次いで 60°Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気 動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） '。
その結果を図 5に示した。 メチル化された DNAフラグメント MYの溶液 MA、 MB及び MCでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでほ、 増 幅が確認されなかった。 メチル化されていない DNAフラグメント Yの溶液 A、 B : 、- C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 実施例 6
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化.キ ット （Biot in Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 ig/fl 0.1% BSA含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 ·7 0、 154m Na'Cl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 6本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 μ /50 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PCRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 1 0 0 の洗浄バッファー [0.05 Tween20含有リン酸バッ ファー （ImM K¾P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7. ) ]を添加した後、 当 ¾バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 · パン酵母酵母株 X 2 1 8 0— 1Aを YPD培地 （1¾ Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6Q。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10,000^ で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
' 調製した酵母細胞を、 バッファ一 A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2-メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- HC1、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w /γ) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M CH3C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000 で 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M C¾C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15, 000 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 7 0% エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 3 7 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase (Sigma社製） を 500 g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 %
(w/v) になるように加えた後、 これを 5 5 で約 1 6時間振とうした。 振とう 終了後、 当該混合物をフエノ一ル [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム 抽出処理した。 氷層を回収し、 ごれに Na C lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 7 0%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。
得られたゲノム DN Aから、 以下の配列番号 5 3及び配列番号 54で示される P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （P F 3及び PR 3) 及び 反応条件を用いて P CRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNA フラグメント （S、 配列番号 55、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示される 酵母染色体 VIIの塩基番号 271743- 272083に相当する領域） を増幅した。
<P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF3 ： 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 53 )
PR 3 ： 5'— AGACATGTGCTCACGTACGGT—3' (配列番号 54 )
<DNAフラグメント > .
· S ： 5'-
Figure imgf000063_0001
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3 ' (配列番号 55)
P CRの反応液とレては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、.5 Mに調製され たオリゴヌクレオチドプライマ一溶液各 3 1と、 each 2mM dNTPを 5 1 と、 1 OX緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （ArapliTaq Gold, AB I社製） 511/ 1を0. 25 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とレ たものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 20 秒間次いで 58 °Cにて 30秒間更に 72 °Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PC Rを行った。
P CRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、
Wizard SV . Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 D N Aフラグメント Sを精製した 得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1と、 10 xNEBuf fer 2 (NEB社製）を 10 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1と したものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30分間インキュベーションし ■、 さらに S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 1 5 - 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PROMEGA 社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化した DNAフラグ メント （MS、 配列番号 56) を得た。 'く DNAフラグメント > (Nは 5 -メチルシトシンを示す）
MS.: 5'-
AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGT GACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNG
: TTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATG
CNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 56) . 得られた DN Aフラグメント Sについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A 10pg/10 L TE溶液
溶液 B lpg/lO^L TE溶液
溶液 C TE溶液 （ネガティブコントロール液) 得られた DNAフラグメント MSについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA : lGpg/lO^L TE溶液
溶液 MB： lpg/lO^L TE溶液
溶液 MC： TE溶液 （ネガティブコントロール液） また、 配列番号 57で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 S， の負 鎖に相補性により結合可能な配列番号 58〜配列番号 67で示される塩基配列から なるカウンターオリゴヌクレオチド C 16〜C25を合成し、 夫々の濃度が 0·' 0 1 Mである TEバッファ一溶液を調製した。 '<目的とする DNA領域 > (メチルシトシンも Cで表す）
S' ： 5' -
Figure imgf000065_0001
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 57)
<カウンター -オリゴヌクレオチド >
C 16 ： 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 58)
e 17 ： 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号 5 9)
C 18 ： 5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号 6 0)
C 19 ： 5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号 6 1)
C 20 ： 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号 6 2)
C 21 ： 5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号 6 3)
C 22 ： 5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号 64)
C 23 ： 5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG - 3' (配列番号 6 5)
C 24 ： 5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号 6 6)
C 25 ： 5' - CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号 6 7) 前記の DNAフラグメント Sの溶液及びメチル化した DNAフラグメント MSの 溶液の夫々について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメント溶液 10 と、 前記で調 製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) 5 Lと、 lOOmMの M 12溶液5 と、 lmg/mLの B SA溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 zLとし、 混合した。 その後、 本 PCRチュー ブを 95 で10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間保温 'した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆 済み PC Rチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 5 O Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM 'Na2HPO-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。
• 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 53及び配列番号 54で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 PF 3及び PR3の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 57で示される塩基配列か らなる目的とする A領域 S ' におけるメチル化された D N Aを増幅した。
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
P F 3 ： 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 53 )
PR 3 ： 5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 54 )
く目的とする D N A領域 > ( 5 -メチルシトシンも Cで表す）
S' : 5' -
Figure imgf000066_0001
TTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATG
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 5 7 ) PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 5 Mに調製されたオリゴタク レオチドプライマー溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 '熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5UZ Lを 0. 25 と を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応 液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 20秒間次いで 58°Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で PCRを行った。
' PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 6に示した。 メチル化された DNAフラグメント MSの溶液 M A、 ：及び MBでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MCでは、 増幅が 確認されなかった。 メチル化されていない DNAフラグメント Sの溶液 A、 B、 及 び Cでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン^ ί体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DN Αを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DN A を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aをより高感度に検出できるこ とが確認された。 実施例 7
市販のメチルシトシン抗体 （Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 i /ll 0.1¾ BSA含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 •7H20、 15械 NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 6本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 μg/ O 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッ ィ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ 'ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X2180— 1 Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, pH 5.6- 6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， 000 で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods 'in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような.、 一 - 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2_メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100ϋ zymolase (10 mg/ml) ' を添加して、 溶液が透明になるまで 30° C で 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファ一 B (50 mM Tris- HC1、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w Zv) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M C C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000 で 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15,000 4°Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 % エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 で 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 g/m 1及びドデシル硫酸ナトリゥムを 1 % (wZv) になるように加えた後、 これを 55 で約 16時間振とうした。 振とう 終了後、 当該混合物をフエノ一ル [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。
得られたゲノム DN Aから、 以下の配列番号 68及び配列番号 69で示され ¾P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 4及び PR 4) 及び 反応条件を用いて PC Rを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNA フラグメント （T、 配列番号 70、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示される 酵母染色体 VI Iの塩基番号 384569- 384685に相当する領域） を増幅した。
<P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
P F 4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 68 )
' PR4 ： 5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG - 3' (配列番号 69 )
く DNAフラグメント〉
T： 5' -
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 70 )
P CRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5 Mに調製され たオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 1と、 each 2mM dNTPを 5 1 と、 1 OX緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KC1、 15iM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold, ΑΒ Γ社製） 5U/ 1を 0. 25 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とし たものを用いた。 当該反応液を、 95でにて 10分間保温した後、 95°Cにて 2 Q 秒間次いで 58°Cにて 30秒間更に 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、
Wizard SV Gel /PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した
得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1と、 10 xNEBuf fer 2 (NEB社製）を 10 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 ^ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 ' 1と したものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30分間インキュベーションし 、 さらに S - adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 1 ' 5-30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PRO EGA 社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化した DNAフラグ メント （MT、 配列番号 71) を得た。
<D N Aフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す）
'MT： 5'-
CTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 71)
: 得られた DNAフラグメント Tについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A : lOpg/lO^L TE溶液
溶液 B： lpg/lO^L TE溶液
溶液 C： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られた DN Aフラグメント MTについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： lOpg/lO^L TE溶液
溶液 MB： lpg/lO^L TE溶液
溶液 MC： TE溶液 （ネガティブコントロール液） また、 配列番号 72で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 T' の負 鎖に相補性に'より結合可能な配列番号 73〜配列番号 76で示される塩基配列から なるカウンターオリゴヌクレオチド C 26〜C 29を合成し、 夫々の濃度が 0. 0 1 j Mである TEバッファー溶液を調製した。 <目的とする DNA領域 > (メチルシトシンも Cで表す)
T' : 5'-
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 72 )
'ぐカウンターオリゴヌクレオチド >
C 26 ： 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 73)
C 27 ： 5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 74)
C 28 ： 5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 75)
C 29 ： 5' - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号 76 )
,
前記の DNAフラグメント Tの溶液及びメチルイ匕した: DNAフラグメント MTの 溶液の夫々について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメント溶液 10 Lと、 前記で調 ：製したカウンタ一オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM KOAc, lOOmM MgOAc2、 5mM Di thiothrei tol) 5 Lと、 lOOmMの M 8(： 12溶液5 と、 lmg/mLの B SA溶液 5 を添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 ^ Liし、 混合した。 その後、 本 PCRチュー ブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50 °Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 °Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 しを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ']を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 68及び配列番号 69で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 4及び P R 4の各溶液及び、 卞記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 72で示される塩基配列か らなる目的とする D N A領域 T ' におけるメチル化された D N Aを増幅した。
'
<P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
P F 4 ： 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 68 )
PR4 ： 5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 69 )
<目的とする DN A領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す）
'Τ， ： 5'-
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3 ' (配列番号 72)
： - PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 / Lと、 each 2mM (11^丁？を5 ^と、 緩衝液
(lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Golc^ AB I社製） 5U///Lを 0· 25 Lと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 28サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 7に示した。 メヂル化された DNAフラグメント MTの溶液 MA、 及び MBでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MCでは、 増幅が 確認されなかった。 メチル化されていない DNAフラグメント Tの溶液 A、 B、 及 び Cでは、 増幅が確認されなかった。 · 以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された D A を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aをより高感度に検出できるこ とが確認された。
'
実施例 8
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット (Biotin Labeling Kit-NH2, 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識.した。 得られたピオチン標識メチルシトシンお体 'を溶液 [抗体約 0.25 i /fl 0.1% BSA含有リン酸バッファー （lmM K P04、 3mM Na2HP0 •7H20、 154iM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 iLの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー (ImM KH2P04, 3mM Na2HPO-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該パ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X 2180— 1Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, H 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， 000 で 10分間遠心して、 IxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファ一 A (1M ソルビ! ^一ル、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2_メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- HCK pH 7. 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w /v) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M CH3C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000 で 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15, 000 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70% 'エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー
(10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 で 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 g/m 1及びドデシル硫酸ナトリゥムを 1 %
(wZv) になるように加えた後、 これを 55 で約 16時間振とうした。 振とう '終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris- HC1 (pH.8.0) にて飽和] 'クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをェタノ一ル沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。 得られた酵母ゲノム DNAの一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1 と、 10 xNEBuffer2 (NEB社製）を 10 lと、 S，adenosyl.methionine (3.2 mM， NEB社製）を 1 n 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1とした ものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30分間インキュベーションし、 さ らに S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 15- 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化酵母ゲノム DNAを得 た。 得られた酵母ゲノム DN Aについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A : 10ng/5;«L TE溶液 . 溶液 B ： lng/5^L TE溶液
溶液 C： 0.1ng/5 L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） . 得られたメチル化酵母ゲノム DN Aについて、 以下の溶液を調製した。 溶液 M A： 1 Ong/5 L TE溶液
溶液 MB ： lng/5 L TE溶液
' 溶液 MC： 0.1ng/5^L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 上記の酵母ゲノム D N Aの溶液及びメチル化酵母ゲノム D N Aの溶液の夫々につい て、 以下の処理を施した。 .
' PCRチューブに、 上記に調製したゲノム DNA溶液 5 Lと、 制限酵素 X s p I を 5 Uと、 X s p Iに最適な 10 x緩衝液 (200mM Tris-HCl H 8.5、 lOOmM MgCl2 、 lOmM DithiothreitoK lOOOmM KC1) 2 1とを混合し、 これに滅菌超純水 ¾加え て液量を 20 β 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュべ ：ーションした。
配列番号 77で示される塩基配列からなる DNAフラグメント S" (Genbank
Accession No. NC— 001139等に示される酵母染色体 VIIの塩基番号 271742-272080に相 当する領域） の負鎖に相補性により結合可能な配列番号 58〜配列番号 67で示さ れる塩基配列からなるカウンタ一オリゴヌクレオチド C 16〜C 25を合成し、 夫 々の濃度が 0. 01 iMである TEバッファー溶液を調製した。
<DNAフラグメント > (メチルシトシンも Cで表す） . " ： 5'-
Figure imgf000075_0001
GTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCAT GCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGT CCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3' (配列番号 77) 2008/056524
75 ぐカウンターオリゴヌクレオチド >
C 1 6 ： 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 58 )
C 1 7 ： 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA - 3, (配列番号 5 9)
C 1 8 ： 5' - CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC - 3， (配列番号 6 0)
C 1 9 ： 5'_ ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' . (配列番号 6 1)
C 2 0 ： 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号 6 2)
C 2 1 ： 5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号 6 3)
C 2 2 ： 5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号 64)
C 2 3 ： 5' - TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号 6 5)
'C 2 4 ： 5' - ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号 6 6)
C 2 5 ： 5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号 6 7)
前記の酵母ゲノム D N A及びメチル化酵母ゲノム D N Aの夫々の反応液について、 以下の処理を施した。
■ - PCRチューブに、 前記で調製したゲノム DNA反応液 20 と、 前記で調製し たカウンタ一オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 （330mM Tris-Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Di thiothrei tol) 5. Lと、 lOOmMの Mg C 12溶液 5 Lと、. lmg/mLの B SA溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合物 に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブ を 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温 した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37 で 10分間保温し た後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレブドアビジン被覆 済み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 Lの洗浄パヅファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HPO-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。 · 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 53及び配列番号 54で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 3及び P R 3の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 57で示される塩基配列か らなる目的とする DN A領域 S ' におけるメチル化された D N Aを増幅した。
<P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
P F 3 ： 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 53 )
PR 3 ： 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 54)
<目的とする DN A領域 > ( 5 -メチルシトシンも Cで表す）
S ' ： 5'-
Figure imgf000077_0001
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 57)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 5 xMに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 と、 耐 熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaQ Gold、 AB I社製） 5Uノ; Lを 0. 25 Lと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを用いた。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 にて 20秒間次いで 58 °Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 31サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第 Ξ工程に相当する。 ） その結果を図 8に示した。 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 MA、 MB及び MC では、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 増幅が確認され なかった。 メチル化されていない酵母ゲノム DN Aの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DN A 領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DN A を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 '実施例 9
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 巿販ピオチン化キ ット (Biotin Labeling Kit-NH2, 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 ：を溶液 [抗体約 0.25 iん il 0.1¾ BSA含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 ·7Η20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 15 mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチルイ匕 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X 2180— 1Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10,000^ で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファ一 A (1M ソルビ! ^一ル、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2-メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファ一 B (50 mM Tris- HCK pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w 'Ζν) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M C¾C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， 000 で 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15，000 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70% エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー ' (10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、.40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 g/m 1及ぴドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (wZv) になるように加えた後、 これを 55 °Cで約 16時間振とうした。 振とう ■■終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 ζ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。 得られた酵母ゲノム DNAの一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1 と、 10 xNEBuffer2 (NEB社製）を 10 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 ^ 1とした ものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30分間インキュべ ^"シヨンし、 さ らに S - adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて Γ 5- 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化酵母ゲノム DNAを得 た。 得られた酵母ゲノム DN Aについて、 以下の溶液を調製した 溶液 ： 101½/5^ TE溶液
溶液 B： lng/5 L TE溶液
溶液 C： 0.1ng/5 L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液）
'
得られたメチル化酵母ゲノム DNAについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 10ng/5^L TE溶液
溶液 MB ： lng/5^L TE溶液
溶液 MC： 0. lng ^L TE溶液
■ 溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 上記の酵母ゲノム D N Aの溶液及びメチル化酵母ゲノム D N Aの溶液の夫々につい て、 以下の処理を施した。
- - PCRチューブに、 上記に調製したゲノム DNA溶液 5 Lと、 制限酵素 X s p I を 5 Uと、 X s p Iに最適な 10 x緩衝液 （200mM Tris-HCl ρΗ 8.5、 lOOm MgCl2 、 ΙΟιΜ DithiothreitoK lOOOmM KC1) とを混合し、 これに滅菌超純水を加え て液量を 20 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37 にて 1時間インキュべ ーションした。
配列番号 78で示される塩基配列からなる DNAフラグメント T" (Genbank Accession No. NC— 001139等に示される酵母染色体 VIIの塩基番号 384523- 384766に相 当する領域） の負鎖に相補性により結合可能な配列番号 73〜配列番号 76及び配 列番号 79〜配列番号 82で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオ チド C26〜C 33を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 Mである TEバッファ一溶 液を調製した。 く DNAフラグメント > (メチルシトシンも Cで表す）
T" ： 5'- CCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号 78 )
<力ゥンターォリゴヌクレオチド>
' C 26 : 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 73)
C 27 ： 5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 74)
C 28 ： 5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 75)
C 29 ： 5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号 76)
C 30 ： 5'- AATACATTCCGAGGGCGC.CCGCACAAGGCC -3' (配列番号 79)
, C 31 ： 5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' (配列番号 80)
C 32 ： 5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号 8 1)
C 33 ： 5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号 82)
- -前記の酵母ゲノム DN A及びメチル化酵母ゲノム DN Aの夫々の反応液について 、 以下の処理を施した。 .
PCRチューブに、 前記で調製したゲノム DNAの反応液 20 Lと、 前記で調製 したカウンタ一オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) 5 zLと、 lOOmMの M 8〇 12溶液5 と、 lmg/mLの B S A溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 とし、 混合した。 その後、 本 PCRチュー ブを 95 で10分間加熱し、 7 O まで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50 まで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み PCRチュニブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 .溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 tihの洗浄バッファー [0.05¾ Tween20含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0'7H20、 154mM NaCl pH7. ) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。 ' 次に、 上記の PC Rチューブに、 配列番号 68及び配列番号 69で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー PF 4及び PR4の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 72で示される塩基配列か らなる目的とする DN A領域 T' におけるメチル化された DN Aを増幅した。
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
, P F 4 : 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' , (配列番号 68 )
PR4 ： 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 69)
く目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す）
T' ： 5'- CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 72 )
PCRの反応液としては、 铸型とする DN Aに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 と、 each 2mM 丁？を5 ^と、 緩衝液 (lOOm Tris-HCl H 8.3、 500mM KCK 15mM MgClい 0.01% Gelat in)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5UZ/ Lを 0. 25 Lと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 iLとしたものを用いた。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 にて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 31サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5 %ァガ口一スゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 9に示した。 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 MA、 MB及び MC では、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 増幅が確認され なかった。 メチル化されていない酵母ゲノム DN Aの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA '領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 実施例 10
' 市販のメチルシトシン钪体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 ug/i 0.1¾ BSA含有リン酸バッファ一 （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0 ： ·7 0、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 iLの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PCRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー (lmM KH2P04、 3mM Na2HPO-7H20, 154iM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DN A抗体の調製に相当する） 。 クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DN Aについて、 以下の配列 番号 28及び配列番号 29で示される PC Rのために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一プライマー （？ 1及び？ 1) 及び反応条件を用いて PC Rを行う ことにより、 供試サンプルとして用いられる DNAフラグメント （X、 配列番号 3 0、 Genbank Accession No. NT一 029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に 相当する領域） を増幅した。 <PC Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー〉
PF 1 ： 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 28)
PR 1 ： 5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 29 )
<DNAフラグメン卜 >
X： 5'-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCAC
Figure imgf000084_0001
AGTTTGGCCAG (配列番号 30 )
PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 5 n gと、 5 Mに調製され ：たオリゴヌクレオチドプライマ一溶液各 3 1と、 each 2mM dNTPを 5 1 と、 1 0 X緩衝液（lOOmM Tris - HC1 pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01%
Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 5U/ 1を 0. 2 5 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とし たものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 1 0分間保温した後、 9 5°Cにて 3 0 秒間次いで 6 1 にて 3 0秒間更に 7 2°Cにて 45秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で PC Rを行った。
PCRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Xを精製した 得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1と、 1 0 xNEBuf fer 2 (NEB社製）を 1 0 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 1 0 0 ^ 1と したものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1 5-3 0分間インキュベーションし 、 さらに S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 1 5-30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PROMEGA 社） により精製した。 さらにこれらの操作を 5回繰り返し、 メチル化した DNAフ ラグメント （MX、 配列番号 31) を得た。
<DN Aフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す）
MX： 5'-
CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCAC ACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGC TTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGG
NGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCC AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 31) 得られた DN Aフラグメント Xについて、 以下の溶液を調製した。
- 溶液 A： lOOpg/lO^L TE溶液
溶液 B： lOpg/10/zL TE溶液
溶液 C： lpg/lO^L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） られた DNAフラグメント MXについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： lOOpg/lO^L TE溶液
溶液 MB： 10pg/10^L TE溶液
溶液 MC： lpg/lO^L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液） また配列番号 32で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 X' の負鎖 に相補性により結合可能な配列番号 33〜配列番号 44で示される塩基配列からな るカウンターオリゴヌクレオチド C 1〜C 12を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 Mである TEバッファ一溶液を調製した。 . <目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す)
X' : 5'_
Figure imgf000086_0001
AAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTC
AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 32 )
<力ゥン夕一才リゴヌクレオチド>
C 1 ： 5' - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号 33)
C 2 ： 5' - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号 34)
C 3 ： 5' - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号 35)
C 4 ： 5' - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号 36)
C 5 ： 5' - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号 37)
C 6 ： 5' - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号 38 )
C 7 ： 5' - CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号 39)
C 8 ： 5' - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号 40)
C 9 ： 5' - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号 41)
C 10 ： 5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3 (配列番号 42)
C 11 : 5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3 (配列番号 43)
C 12 ： 5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3 (配列番号 44)
PCRチューブに前記に調製した DNAフラグメント溶液 10 Lと、 調製した カウンターオリゴヌクレオチド溶液 1 O Lと、 緩衝液 （330niM Tris- Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAcz, 5mM Di thiothrei tol) 5^Lと、 lOOmMの Mg < 12溶液5 と、 lmg/mLの BSA溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合物 に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブ を 95 で 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温 した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温し た後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。
前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み PCRチューブに、 上記に調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 の洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （lmM KH2P04、 3mM Na2HPO'7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファ一をピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の ,第二工程に相当する） 0
上記の処理を施したピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプト アビジン被覆済み P CRチューブに、 緩衝液 （330mM Tris- Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thiot rei tol) を 5 zLと、 BSA (Bovine serum ·. albumin lmg/ml) を 5 と、 メチル化感受性制限酵素 Hhalを 16 Uを加え、 さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした各々の混合液を 37 で 1時間インキュベーションした。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファ一をピぺッテ イングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方 法の第二工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 28及び配列番号 29で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 1及び P R 1の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 32で示される塩基配列か らなる目的とする DNA領域 X' 'におけるメチル化された DNAを増幅した。
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF1 ： 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 28 ) PR1 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 29)
<目的とする D N A領域 > ( 5 -メチルシトシンも Cで表す）
X' ： 5'-
Figure imgf000088_0001
AAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTC
AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 32 )
P CRの反応液としては、 铸型とする DNAに、. 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 と、 each 2mM (11^丁？を5 と、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM KCI、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 と、 耐 熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） を 0. 2 5 Lと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを用いた。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 61°Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で P CRを行った。
•PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 10に示した。 メチル化された DN Aフラグメント MXの溶液 MA 、 MB及び MCでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 増幅が確認されなかった。 メチル化されていない DN Aフラグメント Xの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 実施例 11
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット （Biot in Labeling Kit- NH2、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 jLg/fl 0.1% BSA含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 •7 0、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。.
ストレプトアビジン被覆済み P.CRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ,ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 / Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー (ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ：]を添加した後、 当該パ ： ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。. パン酵母酵母株 X 2180— 1八を丫？0培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, H 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10,000^ で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)【こ ti載 れてレ るよつ.な、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファ一 A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2-メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- HCK pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w Zv) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M C¾C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15， 000gで 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M C¾C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15,000 4 °Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 % エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 gZm 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55 °Cで約 16時間振とうした。 振とう 終了後、 当該混合物をフエノ一ル [1M Tris- HC1 (pH 8.0) にて飽和： 1 ·クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ,ノールでリンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム DNAから、 以下の配列番号 53及び配列番号 54で示される P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 3及び PR 3) 及び 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNA : フラグメント （S、 配列番号 55、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示される 酵母染色体 VIIの塩基番号 271743- 272083に相当する領域） を増幅した。
<P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
PF3 ： 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 53 )
PR 3 ： 5'-AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 54)
<DNAフラグメント >
S ： 5' -
Figure imgf000090_0001
CGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTC CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 5 5)
P CRの反応液としては、 錶型とするゲノム DNAを 10ngと、 5 Mに調製され たオリゴヌクレオチドプライマー溶液各 3 1と、 each 2mM dNTPを 5 U と、 1 OX緩衝液（lOOmM Tris-HCl H 8.3、 500mM CK 15m MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 5U/ 1を 0.. 25 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とし 'たものを用いた。 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 :にて 20 秒間次いで 58°Cにて 30秒間更に 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行つた。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気 動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel /PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Sを精製した ,。
得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1と、 10 xNEBuf fer 2 (NEB社製）を 10 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 n 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1と したものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30分間インキュベーションし 、 さらに S- adenosyl methionine (3. mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37°Cにて 1 5 - 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel /PCR Kit (PR0MEGA 社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化した DNAフラグ メント （MS、 配列番号 56) を得た。 く DNAフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す）
MS ： 5'-
AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGT GACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNG TTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATG NGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTC CNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 56 ) 得られた DN Aフラグメント Sについて、 以下の溶液を調製した。 溶液 A lOOpg/lO^L TE溶液
溶液 B lOpg/lO^L TE溶液
溶液 C lpg/10/iL TE溶液
溶液。 TE溶液 （ネガティブコント口一ル液) 得られた DN Aフラグメント MSについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA !OOpg/lO L TE溶液
溶液 MB lOpg/10 L TE溶液
溶液 MC lpg/lO^L Τβ溶液
溶液 MD TE溶液 （ネガティブコントロール液) また、 配列番号 57で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 S' の負 鎖に相補性により結合可能な配列番号 58〜配列番号 67で示される塩基配列から なるカウンターオリゴヌクレオチド C 16〜C 25を合成し、 夫々の濃度が 0. 0 1 Mである TEバッファ一溶液を調製した。
<目的とする DNA領域 > (メチルシトシンも Cで表す)
S' : 5' -
Figure imgf000092_0001
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 57 )
<カウンターオリゴヌクレオチド >
C 16 ： 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 58)
C 17 ： 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号 59)
C 18 ： 5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号 60)
C 1 9 ： 5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号 61) C 20 ： 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号 62)
C 21 ： 5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号 63)
C 22 ： 5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号 64)
C 23 ： 5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号 65)
C 24： 5' - ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号 66 )
C 25 ： 5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号 67) 前記の DNAフラグメント Sの溶液及びメチル化した DNAフラグメント MSの 溶液の夫々について、 以下の処理を施した。
, PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメント溶液 10 Lと、 前記で調 製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate H 7.9, 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Di thiothrei tol) 5 と、 lOOmMの M 8〇 12溶液5 // と、 lmg/mLの B S A溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合 ：物に滅菌超純水を加えて液量を 50 とし、 混合した。 その後、 本 PC Rチュー ブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 Lの洗浄バッファ一 [0.05 Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。
上記の処理を施したピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプト アビジン被覆済み PC Rチューブに、 緩衝液 (330m Tris-Acetate pH 7.9, 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thiothrei tol) を 5 Lと、 BSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 と、 メチル化感受性制限酵素 Hhalを 16 Uを加え、 さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした各々の混合液を 37 で 1時間インキュベーションした。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7. ) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッテ イングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方 法の第二工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 53及び配列番号 54で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 3及び P R 3の各溶液及び、 下記 ,の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 57で示される塩基配列か らなる目的とする DNA領域 S' におけるメチル化された DN Aを増幅しだ。
< P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー >
： P F 3 ： 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 53)
P R 3 ： 5' - AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号 54)
<目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す）
S' ： 5'-
Figure imgf000094_0001
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 57)
PCRの反応液としては、 铸型とする DNAに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5UZ Lを 0. 25 iLと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた.。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30 秒間さらに 72。Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 25サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガ口一スゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 11に示した。 メチル化された DNAフラグメント MSの溶液 MA 、 MB及び MCでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 増幅が確認されなかった。 メチル化されていない DNAフラグメント Sの溶液 A、 ,B、 C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aをより高感度に検出できるこ ： とが確認された。 実施例 12
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 巿販ピオチン化キ ット （Biot in Labeling KU_N 、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 ug/iL 0.1¾ BSA含有リン酸バッファ一 （ImM K P04、 3 M Na2HP0 •7H20、 154mM NaCl pH7. ) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 の割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 L'の、洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0'7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X 2180- 1 Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10,000^ で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2 -メルカプトエタノール (終濃度 14mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロ.トプラストを回収後、 バッファー B (50 mM Tris- ,HC1、 pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w Zv) になるように加えた後、 65 で 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M CH3C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000 で 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ：ノールを加えてよく混和し、 15， 000 4°Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70% エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファー (10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 gZm 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55 °Cで約 16時間振とうした。 振とう 終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム DNAから、 以下の配列番号 68及び配列番号 69で示される P CRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー （PF 4及び PR 4) 及び 反応条件を用いて PCRを行うことにより、 供試サンプルとして用いられる DNA フラグメント （T、 配列番号 70、 Genbank Accession No. NC— 001139等に示される 酵母染色体 VIIの塩基番号 384569-384685に相当する領域） を増幅した。 . 56524
96
<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
P F 4 ： 5' - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 68 )
PR4 ： 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 69 )
く DNAフラグメント〉
T： 5'-
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 70 ) , PCRの反応液としては、 铸型とするゲノム DNAを 10n gと、 5 Mに調製され たオリゴヌクレオチドプライマ一溶液各 3 1と、 each 2mM dNTPを 5 1 と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris_HCl ρΗ 8.3、 500m KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold, AB I社製） 5U/ 1を 0. 25 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 1とし たものを用いた。 当該反応液を、 95でにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20 秒間次いで 58でにて 30秒間更に 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 40サイクル行う条件で P C Rを行つた。
P C Rを行った後、 1. 5 %ァガ口一スゲル電気 動により増幅を確認し、 Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により、 DNAフラグメント Tを精製した 。
得られた DNAフラグメント溶液の一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1〃 1と、 10 xNEBuf f er 2 (NEB社製）を 10 1と、 S_adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 n 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1と したものを調製した。 当該反応液を、 37 にて 15-30分間インキュベーションし 、 さらに S-adenosyl methionine '(3.2 mM, NEB社製）を 1 ( 1を追加して 37 にて 1 5 - 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA 社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化した DNAフラグ メント （MT、 配列番号 7 1) を得た。 . く DNAフラグメント > (Nは 5-メチルシトシンを示す）
MT： 5'-
GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACT
. CTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 71 ) 得られた DN Aフラグメント Tについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： lOOpg/lO^L TE溶液
溶液 B： lOpg/lO^L TE溶液
, 溶液 C： lpg/lO^L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られた DNAフラグメント MTについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： lOOpg/lO L TE溶液
溶液 MB ： 10pg/10 L TE溶液
溶液 MC： lpg/lO^L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガティプコントロール液） また、 配列番号 72で示される塩基配列からなる目的とする DNA領域 T' の負 鎖に相補性により結合可能な配列番号 73〜配列番号 76で示される塩基配列から なるカウンターオリゴヌクレオチド C 26〜C 29を合成し、 夫々の濃度が 0. 0 1 Mである TEバッファ一溶液を調製した。
<目的とする DNA領域 > (メチルシトシンも Cで表す）
T， ： 5'- ,
GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACT
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 72 )
<カウンタ一オリゴヌクレオチド> , C 26 ： 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 73)
C 27 ： 5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 74)
C 28 : 5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 75)
C 29 : 5' - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号 76)
·
前記の DN Aフラグメント Tの溶液及びメチル化した DN Aフラグメント MTの 溶液の夫々について、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメント溶液 10 Lと、 前記で調 製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 （330mM Tr is- Acetate ,ρΗ 7.9, 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2, 5mM Di thiothrei tol) と、 lOOmMの M 8〇 12溶液5 と、 lmg/mLの BSA溶液 5 を添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 とし、 混合した。 その後、 本 PCRチュー ブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 ,温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み PC Rチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 を加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 1 0 0 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0'7H20、 15 mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。
上記の処理を施したピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプト アビジン被覆済み PCRチューブに、 緩衝液 (330niM Tris-Acetate H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thi&threi tol) を 5 Lと、 B S A (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 ^Lと、 メチル化感受性制限酵素 Hhalを 16 Uを加え、 さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした各々の混合液を 37でで 1時間インキュベーションした。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HPO-7H20 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺヅテ イングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方 法の第二工程に相当する） 。
.
次に、 上記の P C Rチューブに、 配列番号 6 8及び配列番号 6 9で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 4及び P R の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて P CRを行うことにより、 配列番号 7 2で示される塩基配列か らなる目的とする DNA領域 T' おけるメチル化された DNAを増幅した。
,
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
P F 4 ： 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 68)
PR4 ： 5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 6.9 )
く目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す）
T' : 5'-
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 72)
P CRの反応液としては、 铸型とする DN Aに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 57iLと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5 U/ Lを 0. 2 5 Lと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 5 0 Lとしたものを用いた。 当該反応 液を、 9 5 °Cにて 1 0分間保温した後、 9 5でにて 2 0秒間次いで 5 8 °Cにて 3 0 秒間さらに 7 2 にて 3 0秒間を 1サイクルとする保温を 2 8サイクル行う条件で P CRを行った。' '
P CRを行った後、 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 12に示した。 メチル化された DNAフラグメント MTの溶液 MA 、 MB及び MCでは、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MDでは、 増幅が確認されなかつた。 メチル化されていない D NAフラグメント Tの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 増幅が確認されなかった。
· 以上より、 固定化したメチルシ卜シン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む D N Aを選択することが可能であること、'また、 メチル化された D N A を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aをより高感度に検出できるこ とが確認された。 ,実施例 13
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット (Biot in Labeling Kit-NH2 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 ：を溶液 [抗体約 0.25 ug/{l 0.1¾ BSA含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 ·7Η20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 6本） に、 合成して得られたピ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 μg/^ 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PCRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー (ImM KH2P04、 3m Na2HPO-7H20, 15 mM NaCl pH7. ) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 Sssl met ylase (NEB社製）を 1 ^ 1と、 10 xNEBuf fer 2 (NEB社製）を 10 ^ 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を 加えて液量を 10 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30 分間インキュベーションし、 さらに S - adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1を追加して 37でにて 15-30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PROMEGA社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチ ル化ヒトゲノム DNAを得た。
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノム DNAについて、 以下の溶液 を調製した.。
· 溶液 A： 10ng/5^L TE溶液
溶液 B： lng/5 L TE溶液
溶液 C： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られたメチル化ヒトゲノム DNAについて、 以下の溶液を調製した。
, 溶液 MA： 10ng/5 L TE溶液 .
溶液 MB： lng/5/ L TE溶液
溶液 M C： TE溶液 （ネガティブコント口ール液）
： .上記のヒトゲノム DN Aの溶液及びメチル化ヒトゲノム DN Aの溶液の夫々につ いて、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 上記に調製したゲノム DNA溶液 5 iLと、 制限酵素 A 1 u I を 6 Uと、 A 1 u Iに最適な 10 x緩衝液 （lOOmM Tris-HCl pH 7.5、 lOOmM gCl2 、 lOmM DithiothreitoK 500mM NaCl) とを混合し、 これに滅菌超純水を加え て液量を 10 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュべ —シヨンした。
配列番号 83で示される塩基配列からなる DNAフラグメント X" (Genbank Accession No. NT— 029419等に示される塩基番号 25687390- 25687775に相当する領域 ) の負鎖に相補性により結合可能な配列番号 33〜配列番号 44で示される塩基配 列からなるカウンターオリゴヌクレオチド C 1〜C 12を合成し、 夫々の濃度が 0 . 01 Mである TEバッファー溶液を調製した。 く DNAフラグメント > (5-メチルシトシンも Cで表す）
X" ： 5'- , CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCAC
Figure imgf000103_0001
AAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTC
AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 83)
<カウンターオリゴヌクレオチド >
C 1 ： 5' - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号 3 3)
C 2 ： 5' - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号 3 4)
,C 3 ： 5' - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号 3 5)
C4 ： 5' - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号 3 6)
C 5 ： 5' - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号 3 7)
C 6 ： 5' - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号 3 8)
C 7 ： 5' - CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号 3 9)
C 8 ： 5' - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号 4 0)
C 9 ： 5' - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号 4 1)
C I O : 5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号 42)
C 1 1 ： 5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号 43)
C 1 2 ： 5'_ CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号 44)
：応液について
、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製したゲノム DNAの反応液 10 Lと、 前記で調製 したカウンターオリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Di thiothrei tol) 5 Lと、 lOOmMの M gC l 2溶液 5 Lと、 lmg/mLの BSA溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 とし、 混合した。 その後、 本 PCRチュー ブを 95でで 10分間加熱し、 70 まで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50でまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のビォチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトァビジン被覆 済み PCRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 の洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HPO'7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。 .'
, 上記の処理を施したピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレブ卜 アビジン被覆済み PC Rチューブに、 緩衝液 (330mM Tris-Aceiate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5iM Dithiothreitol) を 5 Lと、 BSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 Lと、 メチル化感受性制限酵素 Hhalを 1 6 Uを加え、 さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした各々の混合液を 37 °Cで 1時間インキュベーションした。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 の洗浄バッファ一 [0.05% Tween20含有リン酸バッファー （ImM K P04、 3mM Na2HP0'7 0、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファ一をピぺッテ イングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方 法の第二工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 28及び配列番号 29で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー P F 1及び P R 1の各溶液及び、 下記 の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 32で示される塩基配列か らなる目的とする DN A領域 X' におけるメチル化された DNAを増幅した。
,
< P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー >
PF1 ： 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号 28 )
PR 1 ： 5' - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号 29) . <目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す）
X' ： 5'-
CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCAC ACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGC TTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGG AAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTC
AGTTTGGCCAG -3' (配列番号 32) , PCRの反応液としては、 铸型とする DN Aに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマー溶液各 3 zxLと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCK 15mM MgCl2、 0.01% Gelatin)を 5 Lと、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5UZ Lを 0· 25 Lと :を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応 液を、 95 にて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 61 °Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 34サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） 。
その結果を図 13に示した。 メチル化ヒトゲノム DNAの溶液 MA、 及び MBで は、 増幅が確認された。 ネガティブコントロール溶液 MCでは、 増幅が確認されず その増幅産物は得られなかった。 メチル化されていないヒトゲノム DNAの溶液 A 、 B、 及び Cでは、 増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
以上より、 固定化したメチルシ小シン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DN Aを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 ， 2008/056524
105
実施例 14 ' 市販のメチルシトシン抗体.（Aviva Systems Biology社製） を、 市販ピオチン化キ ット (Biot.in Labeling Kit-NH2, 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ビォチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 /fl 0.1% BSA含有リン酸バッファー （l M KH2P04、 3mM Na2HP0 •7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の P.1 g/50 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 ,約 1時間室温で放置して PCRチューブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー （ImM KH2P04、 3raM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ ,以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。
パン酵母酵母株 X 2180— 1Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， 000 で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルピトール、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2-メルカプトエタノール (終濃度 mM) 及び 100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファ一 B (50 niM Tris- HCU pH 7.4、 20 mM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w Zv) になるように加えた後、 65'°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M C¾C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000 で 30分間遠心し て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M CH3C00Naと等量のイソプロパ ノ〜ルを加えてよく混和し、 15，000 4°Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70% エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 lml の TEバッファー (10 mM Tris - HC1、 pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 ig/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase. K (Sigma社製） を 500 g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % · (w/v) になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう 終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ■クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。
, 得られた酵母ゲノム DNAの一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1 と、 10 xNEBuffer 2 (NEB社製）を 10 lと、 S - adenosyl methionine (3.2 mM， NEB社製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1とした ものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 15-30分間インキュベーションし、 さ ; らに S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 n 1を追加して 37°Cにて 15 - 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化酵母ゲノム DNAを得 た。 得られた酵母ゲノム DNAについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： 10ng/5 L TE溶液
溶液 B： lng/5^L TE溶液
溶液 C： 0. lng/5^L TE溶液
溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られたメチル化酵母ゲノム DNAについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 10ng/5^L TE溶液
溶液 MB： lng/5 ^L TE溶液
溶液 MC： 0.1ng/5 L TE溶液 ， 溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液) 上記の酵母ゲノム DN Aの溶液及びメチル化酵母ゲノム DN Aの溶液の夫々につ いて、 以下の処理を施した。
· P CRチューブに、 上記に調製したゲノム DNA溶液 5 Lと、 制限酵素 Xs p I を 5Uと、 Xs p Iに最適な 1 Ox緩衝液 （200mM Tris-HCl H 8.5、 lOOmM MgCl2 、 lOmM DithiothreitoK lOOOmM KC1) 2 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加え て液量を 20 μ 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37°Cにて 1時間インキュべ ーシヨンした。
, 配列番号 77で示される塩基配列からなる DNAフラグメント S" (Genbank
Accession No. NC— 001139等に示される酵母染色体 VIIの塩基番号 271742- 272080に相 当する領域） の負鎖に相補性により結合可能な配列番号 58〜配列番号 67で示さ れる塩基配列からなるカウンタ一オリゴヌクレオチド C 16〜C25を合成し、 夫 ;々の濃度が 0. 01 iMである TEバッファ一溶液を調製した。
<DNAフラグメント > (メチルシトシンも Cで表す）
S" ： 5'-
Figure imgf000108_0001
CCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3' (配列番号 77 )
<カウンターオリゴヌクレオチド>
C 16 ： 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 58)
C 17 ： 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号 59)
C 18 : 5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号 60)
C 19 ： 5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号 61) C 20 ： 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号 62)
C 21 ： 5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC - 3, (配列番号 63)
C 22 ： 5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT - 3' (配列番号 64)
C 23 ： 5' - TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号 65)
· C 24 ： 5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号 66)
C 25 ： 5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号 67) 前記の酵母ゲノム DN Α及びメチル化酵母ゲノム DN Αの夫々の反応液について 、 以下の処理を施した。
, PCRチューブに、 前記で調製したゲノム DNA反応液 20 と、 前記で調製し たカウンターオリゴヌクレオチド溶液 1 O Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetaie H 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2 5mM Di thiothrei tol) 5 Lと、 lOOmMの M g < 12溶液5 と、 lmg/mLの BSA溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合物 ：に滅菌超純水を加えて液量を 50 zLとし、 混合した。 その後、 本 PCRチューブ を 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保温 した。 次いで、 5'0°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温し た後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。
前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み PC Rチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 50 Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 0 Lの洗浄バッファ一[0.05% Tween20含有リン酸バッファー （lmM KH2P04、 3mM Na2HPO'7H20、 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。
上記の処理を施したピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプト アビジン被覆済み PC Rチューブに、 緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thiothrei tol) を 5 Lと、 BSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 Lと、 メチル化感受性制限酵素 Hhalを 16 Uを加え、 さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 i Lとした各々の混合液を 37 で 1時間インキュベーションした。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 154mM NaCl pH7. ) ；]を添加した後、 当該バッファーをピぺッテ イングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方 法の第二工程に相当する） 。 次に、 上記の PCRチューブに、 配列番号 53及び配列番号 54で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー P F 3及び P R 3の各溶液及び、 下記 ,の反応条件を用いて PCRを行うことにより、 配列番号 57で示される塩基配列か らなる目的とする DNA領域 S' におけるメチル化された DN Aを増幅した。
<P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 >
： P F 3 ： 5' - AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号 53 )
PR 3 ： 5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT - 3' (配列番号 54)
<目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す）
S ' ： 5'-
Figure imgf000110_0001
CCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号 57)
PCRの反応液としては、 铸型とする DN Aに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 と、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 と、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5U ^Lを 0. 25 Lと を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとしたものを用いた。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 にて 30 秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする保温を 31サイクル行う条件で PCRを行った。
PCRを行った後、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 14に示した。 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 MA、 MB及び M Cでは、 増幅が確認されその増幅産物が得られた。 ネガティブコントロール溶液 M Dでは、 増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 メチル化されていない ,酵母ゲノム DNAの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 増幅が確認されずその増幅産物は 得られなかった。
以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DN Aを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DN A ：を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DNAをより高感度に検出できるこ とが確認された。 実施例 15
市販のメチルシトシン抗体 (Aviva Systems Biology社製） を、 巿販ピオチン化キ ット （Biotin Labeling Kit_N 、 同仁化学研究所製） を用いて、 カタログに記載さ れた方法に準じて、 ピオチン標識した。 得られたピオチン標識メチルシトシン抗体 を溶液 [抗体約 0.25 i /zl 0.1% BSA含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0 •7H20、 154mM NaCl pH7.4) 溶液]として冷蔵保存した。
ストレプトアビジン被覆済み PCRチューブ （計 8本） に、 合成して得られたビ ォチン標識メチルシトシン抗体の 0.1 g/50 溶液を各 50 Lの割合で添加し、 約 1時間室温で放置して PC Rチ'ユーブに固定化した。 その後、 溶液をピベッティ ングにより取り除き、 100 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッ ファー （ImM KH2P04、 3mM Na2HP0-7H20, 15 mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バ ッファーをピペッティングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （ 以上、 本発明測定方法で使用する固定化メチル化 DNA抗体の調製に相当する） 。 パン酵母酵母株 X 2180— 1Aを YPD培地 （1% Yeast extract, 2% Peptone 、 2% Glucose, pH 5.6-6.0) で、 濁度が 0D6。。 0.6-1.0 になるまで培養し、 10， 000 で 10分間遠心して、 lxlO7の酵母細胞を調製した。 調製した酵母細胞から、 Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、 一 般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、 バッファー A (1M ソルビ] ^一ル、 0.1M EDTA、 pH 7.4) に 懸濁し、 2-メルカプトエタノール （終濃度 14mM) 及び.100U zymolase (10 mg/ml) を添加して、 溶液が透明になるまで 30° Cで 1時間、 撹拌しながらインキュベート ,した。 550 で 10分間遠心してプロトプラストを回収後、 バッファー B (50 DiM Tr is - HCK pH 7.4、 20 raM EDTA) に懸濁してから、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1% (w Xv) になるように加えた後、 65°Cで 30分間インキュベートした。 続いて、 体積比 2/5量の 5M C¾C00Kを添加して混和してから 30分間氷冷後、 15, 000 で 30分間遠心し ,て上清を回収した。 回収した上清に体積比 1/10量の 3M C C00Naと等量のイソプロパ ノールを加えてよく混和し、 15，000 4°Cで 30分間遠心して得られた沈澱を 70 % エタノールでリンスして回収した。 沈澱を乾燥させてから、 1ml の TEバッファ一 (10 mM Tris-HCK pH 8.0、 1 mM EDTA) に溶解し、 40 g/mlになるように RN a s e A (Sigma社製） を加えて 37 °Cで 1時間インキュベートし、 続いて、 混合液に proteinase K (Sigma社製） を 500 ^ g/m 1及びドデシル硫酸ナトリウムを 1 % (w/v) になるように加えた後、 これを 55 °Cで約 16時間振とうした。 振とう 終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCl (pH 8.0) にて飽和] ·クロ口ホルム 抽出処理した。 水層を回収し、 これに NaC lを 0. 5Nとなるよう加えた後、 こ れをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。 回収された沈澱を 70%エタ ノールでリンスすることにより、 ゲノム DNAを得た。
得られた酵母ゲノム DNAの一部について、 Sssl methylase (NEB社製）を 1 1 と、 10 xNEBuffer 2 (NEB社製）を 10 1と、 S- adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製）を 1 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 100 1とした ものを調製した。 当該反応液を、 37eCにて 1 5-30分間インキュベーションし、 さ らに S- adenosyl methionine (3.2 mM， NEB社製）を 1 (i 1を追加して 37t:にて 15 - 30分間インキュベーションした。 これを Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA社） により精製した。 さらにこの操作を 3回繰り返し、 メチル化酵母ゲノム DNAを得 た。
·
得られた酵母ゲノム DN Aについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 A： 10ng/5/iL TE溶液
溶液 B： lng/5 L TE溶液
溶液 C： 0.1ng/5 L TE溶液
, 溶液 D： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 得られたメチル化酵母ゲノム DNAについて、 以下の溶液を調製した。
溶液 MA： 10ng/5 L TE溶液
溶液 MB： lng/5 L TE溶液
溶液 MC： 0.1ng/5//L TE溶液
溶液 MD： TE溶液 （ネガティブコントロール液） 上記の酵母ゲノム D N Aの溶液及びメチル化酵母ゲノム D N Aの溶液の夫々につ いて、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 上記に調製したゲノム DNA溶液 5 Lと、 制限酵素 X s p I を 5 Uと、 X s p Iに最適な 10 x緩衝液 (200mM Tris-HCl H 8.5、 ΙΟΟ Μ MgCl2 、 lOm DithiothreitoU lOOOmM KC1) 2 lとを混合し、 これに滅菌超純水を加え て液量を 20 1としたものを調製した。 当該反応液を、 37t:にて 1時間インキュべ ーシヨンした。
配列番号 78で示される塩基配列からなる DNAフラグメント T" (Genbank
Accession No. NC— 001139等に示される酵母染色体 VI Iの塩基番号 384523- 384766に相 当する領域） の負鎖に相補性により結合可能な配列番号 73〜配列番号 76及び配 列番号 79〜配列番号 82で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオ チド C 26〜C 33を合成し、 夫々の濃度が 0. 01 である TEバッファー溶 液を調製した。 く DNAフラグメント > (メチルシトシンも Cで表す)
T" ： 5'-
Figure imgf000114_0001
CCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号 78)
,<カウンターオリゴヌクレオチド >
C 26 ： 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 73)
C 27 ： 5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号 74)
C 28 ： 5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号 75)
; C 29 ： 5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号 76)
C 30 : 5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' (配列番号 79)
C 31 ： 5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' (配列番号 80)
C 32 ： 5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号 81)
C 33 ： 5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号 82) 前記の酵母ゲノム D N A及びメチル化酵母ゲノム D N Aの夫々の反応液について 、 以下の処理を施した。
PCRチューブに、 前記で調製したゲノム DNAの反応液 20 と、 前記で調製 したカウン夕一オリゴヌクレオチド溶液 10 Lと、 緩衝液 (330mM Tris-Acetate pH 7.9、 660mM K0Ac、 lOOmM MgOAc2、 5mM Dithiothreitol) 5j Lと、 lOOmMの M 8〇 12溶液5 丄と、 lmg/mLの BS A溶液 5 Lを添加し、 さらに当該混合 物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとし、 混合した。 その後、 本 PCRチュー ブを 95°Cで 10分間加熱し、 70°Cまで速やかに冷却し、 その温度で 10分間保 温した。 次いで、 50°Cまで冷却し 10分間保温し、 さらに 37°Cで 10分間保温 した後、 室温に戻した （以上、 本発明測定方法の第一 （A) 工程に相当する） 。 前記のピオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆 済み P CRチューブに、 前記で調製した DNAフラグメントの反応液 5 O Lを加え 、 室温で 30分間放置した。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 10 ' 0 Lの洗浄バッファー [0.05% Tween20含有リン酸バッファ一 （ImM KH2P04 3mM Na2HP0'7 0、 15 mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッティン グにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方法の 第一 （B) 工程に相当する） 。
上記の処理を施したビォチン檩識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプト 'アビジン被覆済み PC Rチューブに、 緩衝液 (330mM Tris- Acetate pH 7.9、 6.6 OmM K0Ac、 lOOmM Mg0Ac2、 5mM Di thiothrei iol) を 5 Lと、 BSA (Bovine serum albumin lmg/ml) を 5 Lと、 メチル化感受性制限酵素 fflialを 16 Uを加え、' さら に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を 50 Lとした各々の混合液を 37でで ： 1時間インキュベーションした。 その後、 溶液をピペッティングにより取り除き、 100 j^Lの洗浄バッファー [0.05¾ Tween20含有リン酸バッファー （ImM K¾P04、 3mM Na2HPO-7H20, 154mM NaCl pH7.4) ]を添加した後、 当該バッファーをピぺッテ イングにより取り除いた。 この操作をさらに 2回繰り返した （以上、 本発明測定方 法の第二工程に相当する） 。 次に、 上記の P CRチューブに、 配列番号 6 8及び配列番号 6 9で示される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ一 P F 4及び P R 4の各溶液及び、 下^ の反応条件を用いて P CRを行うことにより、 配列番号 7 2で示される塩基配列か らなる目的とする DNA領域 T' におけるメチル化された DNAを増幅した。 ' <P CRのために設計されたオリ'ゴヌクレオチドプライマー >
P F 4 ： 5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号 6 8 )
P R4 ： 5' - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号 6 9 ) ぐ目的とする DNA領域 > (5-メチルシトシンも Cで表す)
T' ： 5'-
CTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号 72 )
'
PCRの反応液としては、 铸型とする DN Aに、 5 Mに調製されたオリゴヌク レオチドプライマ一溶液各 3 Lと、 each 2mM dNTPを 5 Lと、 緩衝液 (lOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KC1、 15mM MgClい 0.01% Gelatin)を 5 と、 耐 熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold、 AB I社製） 5UZ Lを 0. 25 Lと 'を混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 50 としたものを用いた。 当該反応 液を、 95 °Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 20秒間次いで 58 °Cにて 30 秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 31サイクル行う条件で PCRを行った。
■ PCRを行った後、 1.. 5%ァガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。 そ の結果は、 以下の通りであった （以上、 本発明測定方法の第三工程に相当する。 ） その結果を図 15に示した。 メチル化酵母ゲノム DNAの溶液 MA、 MB及び M Cでは、 増幅が確認されその増幅産物が得られた。 ネガティブコントロール溶液 M Dでは、 増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。 メチル化されていない 酵母ゲノム DNAの溶液 A、 B、 C及び Dでは、 増幅が確認されずその増幅産物は 得られなかった。 . 以上より、 固定化したメチルシトシン抗体で、 メチル化された目的とする DNA 領域を含む DNAを選択することが可能であること、 また、 メチル化された DNA を検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aをより高感度に検出できるこ とが確認された。 ' 産業上の利用可能性
本発明により、 生物由来検体中に含まれるゲノム DNAが有する目的とする DN A領域におけるメチル化された DN Aの含量を簡便に測定する方法等を提供するこ とが可能となる。 配列表フリーテキスト
'配列番号 17
設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 18
設計されたォリゴヌクレオチド
配列番号 19
. PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 20
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 21
設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 22
設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 23 ·
設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 24
設計されたォリゴヌクレオチド
配列番号 25 ·
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 26
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 27 · '
設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 28
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 . 2008/056524
117 配列番号 2 9
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 3 0
目的とする D N A領域からなる増幅されたォリゴヌクレオチド
配列番号 3 1
目的とする D N A領域からなる設計されたォリゴヌクレオチド
配列番号 3 2
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 3
' 実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 4
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 5
： 実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 6
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 7
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 8
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 3 9
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 4 0
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 4 1 '
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 4 2
実験のために設計されたォリゴヌクレオチド T JP2008/056524
118 配列番号 4 3
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 4 4
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
'配列番号 4 5
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 4 6
P C Rのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 4 7
' 目的とする D N A領域からなる増幅されたオリゴヌクレオチド
配列番号 4 8
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 4 9
-目的とする D NA領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 5 0
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 5 1 .
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 5 2
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 5 3
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 5 4
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 5 5 ' '
目的とする D N A領域からなる増幅されたオリゴヌクレオチド
配列番号 5 6
目的とする D N A領域からなる設計されたォリゴヌクレオチド 配列番号 5 7
目的とする D N A領域からなる設計されたォリゴヌクレオチド 配列番号 5 8
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
'配列番号 5 9
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 0
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 1
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 2
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 3
• 実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 4
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 5 ,
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 6
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 7
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 6 8
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 6 9 '
P C Rのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 7 0
目的とする D N A領域からなる増幅されたオリゴヌクレオチド 配列番号 7 1
目的とする D N A領域からなる設計されたォリゴヌクレオチド' 配列番号 7 2
目的とする D N A領域からなる設計されたォリゴヌクレオチド '配列番号 7 3
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 7 4
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 7 5
. 実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 Ί 6
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 7 7
-目的とする D NA領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 7 8
目的とする D N A領域からなる設計されたォリゴヌクレオチド 配列番号 7 9
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 8 0
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 8 1
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 8 2
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 8 3 · '
目的とする D N A領域からなる設計されたオリゴヌクレオチド

Claims

請求の範囲
1. 生物由来検体に含まれるゲノム DNA中の目的とする DNA領域におけるメチ ル化された D N Aの含量を測定する方法であって、
(1) 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の； DNA試料から、 メチル化さ れた一本鎖 DNAを分離する第一 （A) 工程と、 第一 （A) 工程で分離された一本 鎖 DNAと固定化メチル化 DNA抗体とを結合させる第一 （B) 工程からなる、 前 記の一本鎖 D N Aを選択する第一工程、
(2) 第一工程で選択された一本鎖 DNAを少なくとも 1種類の一本鎖 DNAを消 '化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、 及び、
(3) 下記の各本工程の前工程として、 第二工程で得られた未消化物である一本鎖 DNA (前記の一本鎖 DN Aを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にァ ンメチル状態の CpGを含まない一本鎖 DNA) を、 前記の固定化メチル化 DNA
：抗体から分離して一本鎖状態である DNA (正鎖） にする工程 （第三 （前 A) 工程 ) と、
第三 （前 A) 工程で分離された一本鎖状態である DNA (正鎖） を铸型として、 当 該一本鎖状態である DNA (正鎖） が有する塩基配列の部分塩基配列 （正鎖） であ つて、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖） の 3' 末端よりさら に 3' 末端側に位置する部分塩基配列 （正鎖） に対して相補性である塩基配列 （負 鎖） を有する伸長プライマ一 （フォ一ワード用プライマ一） を伸長プライマーとし て、 当該伸長プライマーを 1回伸長させることにより、 前記の一本鎖状態である p NA (正鎖） を二本鎖 DNAとして伸長形成させる工程 （第三 （前 B) 工程） と、 第三 （前 B) 工程で伸長形成された二本鎖 DNAを、 目的とする DNA領域を含む 一本鎖 DNA (正鎖） と目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖) に一旦 分離する工程 （第三 （前 C) 工程） を有し、 且つ、 本工程として
(a) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (正鎖） を鎳型として、 前記フォワード用プライマーを伸長プライマ一として、 当該伸長プライマーを一回 伸長させることにより、 前記の目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N Aを二本鎖 DN Aとして伸長形成させる本工程一 Aと、
(b) 生成した目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） を铸型として、 前記の目的とする DNA領域を含む一本鎖 DNA (負鎖） が有する塩基配列の部分 塩基配列 （負鎖） であって、 且つ、 前記の目的とする DNA領域の塩基配列 （正鎖 ') に対して相補性である塩基配列 （負鎖） の 3' 末端よりさらに 3' 末端側に位置 する部分塩基配列 （負鎖） 、 に対して相補性である塩基配列 （正鎖） を有する伸長 プライマ一 （リバース用プライマー） を伸長プライマ一として、 当該伸長プライマ 一を 1回伸長させることにより、 前記の目的とする D N A領域を含む一本鎖 D N A を二本鎖 D N Aとして伸長形成させる本工程一 B工程とを有し、
'さらにかかる各本工程を、 前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖 DNAを - 一本鎖状態に一旦分離した後、 繰り返すことにより、 前記の目的とする DNA領域 におけるメチル化された DN Aを検出可能な量になるまで増幅し、 増幅された DN Aの量を定量する第三工程、 を有することを特徴とする方法。 2. 第三工程のメチル化 DNA抗体がメチルシトシン抗体である、 請求項 1記載の 方法。
3. 生物由来検体が、 哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項 1〜 2のいずれかに記載の方法。
4. 生物由来検体が、 哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項 1〜 2のいずれかに記載の方法。
5. 生物由来検体が、 細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項 1 〜 2のいずれか fc記載の方法。 '
6. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 当該ゲノム DN Aが有する目的とする DNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理 されてなる DN A試料であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記載の方 法。
7. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 少なくとも 1種 '類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなる D N A試料であることを特徴と する請求項 1〜 6のいずれかに記載の方法。
8. 生物由来検体中に含まれるゲノム DNA由来の DNA試料が、 予め精製されて なる DN A試料であることを特徼とする請求項 1〜 Ίのいずれかに記載の方法。 '
9. 少なくとも 1種類の 1本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、 生 物由来検体中に含まれるゲノム DN Aが有する目的とする DN A領域の中に認識切 断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれかに記載の
-方法。
10. 少なくとも 1種類以上の 1本鎖 DN Aを消化できるメチル化感受性制限酵素 が、 メチル化感受性 限酵素である Hhalであることを特徴とする請求項 1〜 9のい ずれかに記載の方法。
1 1. 第二工程において一本鎖 DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素での消 化処理を実施せずに第三工程を実施することを特徴とする請求項 1〜 10のいず かに記載の方法。
12. 第一 （A) 工程でメチル化された一本鎖 DN Aを分離する際に、 カウン夕一 オリゴヌクレオチドを添加する請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の方法。
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