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WO2008120815A1 - がん細胞および癌随伴線維芽細胞への標的化剤 - Google Patents

がん細胞および癌随伴線維芽細胞への標的化剤 Download PDF

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WO2008120815A1
WO2008120815A1 PCT/JP2008/056735 JP2008056735W WO2008120815A1 WO 2008120815 A1 WO2008120815 A1 WO 2008120815A1 JP 2008056735 W JP2008056735 W JP 2008056735W WO 2008120815 A1 WO2008120815 A1 WO 2008120815A1
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WO
WIPO (PCT)
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cancer
targeting agent
carrier
cells
caf
Prior art date
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PCT/JP2008/056735
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiro Niitsu
Rishu Takimoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nitto Denko Corp
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Priority to AU2008233550A priority patent/AU2008233550B2/en
Priority to CA002682493A priority patent/CA2682493A1/en
Priority to EP08739842.6A priority patent/EP2135600B1/en
Priority to JP2009507561A priority patent/JP5302187B2/ja
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
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    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety

Definitions

  • Cancer is one of the most important diseases facing humanity, and extensive research efforts are being made to treat it.
  • various anticancer agents that suppress the growth of cancer cells have been developed and have achieved results to some extent.
  • various side effects such as nausea and vomiting, hair loss, bone marrow suppression, kidney damage, and neuropathy are problematic.
  • attempts have recently been made to deliver anticancer drugs specifically to cancer cells or cancer tissues.
  • Economy that specific delivery of anticancer drugs can not only prevent the anticancer drugs from reaching normal cells, reduce side effects, but also reduce the dose of anticancer drugs Benefits.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • ⁇ Lrt ⁇ transiorming growth factor- / 3
  • HG r hepatocyte growth factor
  • SDF-1 stromal
  • Patent Literature 3 Special Table 2007-529 1 97
  • Non-patent literature Camps et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1990; 87 (1): 75-9
  • Non-patent literature 3 Olumi et al., Cancer Res. 1999; 59 (19): 5002-11
  • the present invention provides a carrier that can deliver a substance such as a drug specifically for cancer cells, a cancer therapeutic agent and a cancer therapy using the carrier, a carrier that can deliver a drug specifically for CAF,
  • the purpose is to provide cancer therapeutics and cancer therapies.
  • the present inventors realized that there is no carrier that can deliver a drug specifically for CAF, and continued intensive research to develop such a carrier. It has been found that a carrier containing retinoide as a targeting agent specifically enhances drug delivery to CAF. As a result of further research on the carrier, it was found that the carrier specifically promotes substance delivery to cancer cells, thereby completing the present invention.
  • the content of the targeting agent is 0.2 to 20% by weight of the total carrier (3) the carrier;
  • An anti-cancer-associated fiber comprising the targeting agent of (1) or (2) or the carrier of any one of (3) to (5) and a drug that controls the activity or proliferation of cancer-associated fibroblasts Bud composition;
  • composition according to (6), wherein the drug that controls the activity or proliferation of cancer cells is an anticancer agent
  • FIG. 4 is a photograph showing the localization of siRNA in CAF reacted with VA-1iP-siRNA or 1ip-siRNA.
  • Figure 1 1 shows no treatment (upper left) force, or DaunoXome® (VA—: upper right), DaunoXome® + retinol (VA +: lower left) or DaunoXome® + retinoic acid (Retinoic acid +: lower right)
  • VA— upper right
  • DaunoXome® + retinol VA +: lower left
  • DaunoXome® + retinoic acid Retinoic acid +: lower right
  • Fig. 23 is a graph showing the results of evaluating the in vivo antitumor activity of VA-1 ip-DNR (administered twice a week).
  • the vertical axis represents the volume of the tumor mass (mm 3 ), and the horizontal axis represents the number of days after the start of treatment.
  • cancer-associated fibroblasts mean ⁇ -SMA (smooth muscle actin) -positive fibroblasts present in the cancer lesion and in or around the cancer lesion.
  • the presence of CAF has been confirmed for various cancers such as colorectal cancer, lung cancer, prostate cancer, breast cancer, stomach cancer, bile duct cancer, and basal cell cancer.
  • the cancer with CAF in the present invention is not particularly limited, for example, brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, vaginal cancer, Solid cancers such as gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, renal cancer, urinary tract cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, skin cancer and the like.
  • the targeting is a substance, such as a drug or a drug carrier, selected from a specific target, such as a specific cell or tissue (in the present invention, a group consisting of cancer cells and cancer-associated fibroblasts).
  • a targeting agent means a substance that can target the substance in this way when bound or reacted with the substance. Therefore, in the present specification, for example, a carrier or composition specific to cancer cells and a carrier or composition targeted to cancer cells are used in the same meaning. If the targeting agent is in the form of a molecule, this is synonymous with the targeting molecule.
  • the present invention also relates to a substance delivery carrier for cells selected from the group consisting of cancer cells and cancer-associated fibroblasts, comprising the targeting agent.
  • the carrier of the present invention may be constituted by only the above-mentioned targeting agent, or may be constituted by binding or including the targeting agent in a component other than the targeting agent other than the targeting agent. May be. Therefore, the carrier of the present invention may contain components other than the targeting agent.
  • Such a component is not particularly limited, and any force known in the field of medicine and pharmacy can be used Targeting agent, particularly a force that can include a retinoid Is preferred.
  • Conjugation or inclusion of the targeting agent to the carrier of the present invention involves binding or inclusion of the targeting agent to a component other than the targeting agent of the carrier by chemical and / or physical methods. It will be possible.
  • the targeting agent can be bound or included in the carrier of the present invention by mixing the targeting agent and components other than the carrier targeting agent at the time of preparation of the carrier. Become.
  • the amount of targeting agent to be bound to or included in the carrier of the present invention is from 0.001% to 100%, preferably 0.2% to 20% by weight in the carrier component including the targeting agent. %, More preferably 1 to 5%.
  • the substance or object delivered by the carrier is not particularly limited, but it is preferably of a size that can physically move within the organism from the administration site to the lesion site where cancer cells and / or CAF are present.
  • the carrier of the present invention carries not only substances such as atoms, molecules, compounds, proteins, and nucleic acids but also objects such as vectors, virus particles, cells, drug release systems composed of one or more elements, and micromachines. be able to.
  • Said substance or object preferably has some effect on cancer cells and Z or CAF, e.g. those that label cancer cells and / or CAF, activity of cancer cells and / or CAF or Includes those that control (eg, enhance or suppress) growth.
  • the activity of CAF refers to various activities such as secretion, uptake, and migration exhibited by CAF. In the present invention, typically, among these, it is particularly involved in cancer onset or progression. Activity. Such activities include, for example, TGF] 3, HGF, PDGF, VEGF, I GF (I FG1, I GF2, etc.), MMP (MM P1, 2, 3, 9, 11, 13, 14, etc.), FGF ( FGF 7, b FGF, etc.), bioactive substances such as PA, cathebsin, SDF-1, and extracellular matrix components such as collagen, proteoglycan, tenascin, fibronectin, thrombospondin, osteopontin, osteonectin, and elastin Production 'secretion.
  • an extracellular matrix for example, a drug that controls the metabolism of collagen, such as a cell produced by CAF.
  • SiRNA, ribozyme, antisense nucleic acid (RNA, targeting an outer matrix constituent molecule, or targeting one or more of the molecules involved in the production or secretion of the extracellular matrix constituent molecule A substance that has the effect of suppressing the expression of target molecules such as DNA, PNA, or a complex thereof, or a substance that has a dominant negative effect such as a dominant negative mutant, or a vector that expresses these. Is included.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-219893 describes a double-stranded polynucleotide comprising DNA and RNA that inhibits expression of a target gene.
  • this polynucleotide one of the two strands is DNA, and the other is RNA. Even if it is a DNAZR NA chimera, part of the same strand is DNA and the other part is RNA.
  • Such a polynucleotide preferably consists of 19 to 25, more preferably 19 to 23, more preferably 19 to 21 nucleotides.
  • the sense strand is DNA and the antisense strand is RNA.
  • a molecule that can suppress all production and secretion of extracellular matrix constituent molecules is preferable.
  • examples of such a molecule include, but are not limited to, HSP47. It is.
  • the gene sequence of HSP47 or a homologue thereof is disclosed, for example, as GenBank accession No. AB010273 (human), X60676 (mouse), M69246 (rat, gp46).
  • RNA targeting 113 to 47 for example, 3 i RNA targeting 113 to 47, DNAZRNA hybrid, chimeric polynucleotide, antisense nucleic acid and the like are preferable.
  • efficiency means the proportion of cells to which a substance has been delivered in the entire cells to be evaluated.
  • the present invention also controls the activity or proliferation of cancer cells, comprising the targeting agent or carrier, and one or more drugs that regulate the activity or proliferation of the cancer cells and Z or CAF.
  • a composition for treating or treating cancer (anti-cancer composition), a composition for controlling CAF activity or proliferation (anti-CAF composition), and treating cancer involving CAF
  • anti-cancer composition a composition for controlling CAF activity or proliferation
  • treating cancer involving CAF and the use of the targeting agent or carrier in the manufacture of these yarns and compositions.
  • cancers involving CAF broadly mean malignant S-hepatitis, and any cancer that is an epithelial malignant tumor, such as brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, gastric cancer, duodenal cancer, appendix Cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, vaginal cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, renal cancer, ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulva Cancer, vaginal cancer, skin cancer, and any other malignant solid tumor that is a non-epithelial malignant tumor, such as fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, Also included are leiomyosarcoma, angiosarcoma, force-positive sarcoma, lymphangiosarcoma, synovial sarcoma
  • the carrier may contain the delivery product inside or be attached to the outside of the delivery product. It may be mixed with a delivery product. Therefore, the composition may be coated with an appropriate material, such as an enteric coating or a time-degradable material, depending on the route of administration, drug release mode, etc. It may be incorporated into the system.
  • the targeting agent, carrier or composition of the present invention may be supplied in any form, but from the viewpoint of storage stability, it is preferably in a form that can be prepared at the time of use, for example, at or near the medical site. In a form that can be prepared by a physician and / or pharmacist, nurse, or other paramedical.
  • the targeting agent, carrier or composition of the present invention is provided as one or more containers containing at least one of the essential components thereof, and is used prior to use, for example, 24 hours Prepared within, preferably within 3 hours, and more preferably immediately before use.
  • a reagent, a solvent, a dispensing device and the like which are usually available at the place of preparation can be appropriately used.
  • the present invention further comprises a method for controlling cancer cell activity or growth, or for treating cancer, comprising administering an effective amount of said composition to a subject in need thereof, And a method for controlling the activity or growth of CAF or for treating a cancer involving CAF.
  • the effective amount means, for example, a method for treating cancer, reduces the onset of cancer, reduces symptoms, Or an amount that delays or stops progression, preferably an amount that prevents or cures the onset of cancer. An amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • the amount to be applied can be determined as appropriate by in vitro tests using cultured cells, etc., and tests in model animals such as mice, rats, dogs or pigs. Such test methods are well known to those skilled in the art. ing.
  • the dosage of the targeting agent contained in the carrier and the drug used in the method of the present invention can be appropriately determined by the force known to those skilled in the art, or the above-described tests and the like.
  • the specific dose of the composition administered in the methods of the present invention can vary depending on various conditions associated with the subject requiring treatment, such as severity of symptoms, general health of the subject, age, weight, subject sex, diet, It can be determined in consideration of the timing and frequency of administration, the drugs used in combination, responsiveness to treatment, and compliance with treatment.
  • the frequency of administration varies depending on the nature of the application, the composition of the composition, and the conditions of the subject as described above. For example, many times a day (ie, 2, 3, 4 or more times a day), 1 day Once, Every few days (ie every 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, etc.), several times a week (eg 2, 3, 4 times a week, etc.), every week, every few weeks (ie 2, Every 3 or 4 weeks).
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • the subject may be healthy or afflicted with any disease, but if cancer treatment is intended, is it typically afflicted with cancer? Means a subject at risk of suffering.
  • treatment shall also include all types of medically acceptable prophylactic Z or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate or prevent disease.
  • treatment encompasses medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or stopping the progression of cancer, regression or disappearance of a lesion, prevention of cancer development or prevention of recurrence, etc. To do.
  • the present invention also relates to a method for delivering a drug to cancer cell lines Z or C A F using the carrier.
  • This method includes, but is not limited to, for example, a step of carrying a delivery product on the carrier, and a carrier carrying the delivery product on a living organism or medium containing cancer cell line Z or CAF, such as a culture medium. Administering or adding. These steps can be appropriately achieved according to any known method or the method described in the present specification.
  • the delivery method can also be combined with other delivery methods, such as other delivery methods that target cancer cells and organs in which Z or C A F is present.
  • the method described above includes an embodiment performed in vitro and an embodiment targeting cancer cell hop Z or C A F in the body.
  • Cancer tissue removed from colorectal cancer patients or surrounding normal tissue is shredded to 1 X 1 X 1 mm and then centrifuged twice with PBS and, pellet culture (collagenase typ e I (2 2 5 U / m 1), The cells were cultured for 24 hours in hyaluronidase (125 U ′ / m 1), 10% FBS (fetal bovine serum), streptomycin and penicillin-containing DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Thereafter, the supernatant was removed by aspiration, the culture medium was replaced with 10% FBS / DMEM, and the culture was continued.
  • hyaluronidase 125 U ′ / m 1
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin streptomycin
  • penicillin-containing DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the CAF or normal fibroblast obtained in Example 1 was seeded in a 6-well plate at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / well, cultured in 10% FB SZDMEM, and in a confluent state on the third day.
  • the culture solution was 0.5% FBSZDMEM, and colon cancer cell line M7609 cells (2 ⁇ 10 5 cells) were seeded in the culture solution and co-cultured for 8 days. On days 0, 3 and 5, the number of M7609 cells was counted with a Coulter counter (Beckman). The result is shown in figure 2. This shows that CAF promotes the growth of cancer cells.
  • ribosome a cationic ribosome (Lipotrust, Hokkaido System Science) containing DC-6-14, cholesterol and DOPE at a molar ratio of 4: 3: 3 was used.
  • VA nmo 1 all-trans-retinol
  • VA-1 ip-siRNA a VA-binding ribosome containing siRNA
  • the amount of VA added and the amount of VA contained in the purified ribosome was measured by the HP LC method, and the proportion of VA bound to the liposome was examined.
  • the majority of VA (95. 6 ⁇ 0.4 2% ) was found to bind to the ribosome.
  • the siRNA incorporation efficiency into the ribosome was 94.4 ⁇ 3.0%, as measured by RiboGreen assay (Molecular Probes). A part of VA is on the ribosome surface. It was exposed.
  • siRNA-containing ribosomes (1 i p-si RNA) and VA-binding ribosomes (VA-1 i p) were also prepared.
  • siRNA localization was evaluated by flow cytometry at 0, 0.5, 1, 3, 6, 12, 12, 18 and 24 hours after the start of the reaction (Fig. 3). After completion of the reaction, the cells were stained with DAP I (Mo 1 ecu 1 ar Probe) and Cy 3 labeled anti-mouse SMA antibody and analyzed for siRNA localization (FIGS. 4-5).
  • FIG. 3 shows the typical field of view used to evaluate the localization of siRNA.
  • VA-bound ribosome VA-1 ip-siRNA-FAM
  • siRNA was introduced into all CAFs in the field of view, whereas when ribosomes without VA (1 ip—si RNA-FAM) were used, 5 CAFs in the field of view were used. Of these, siRNA was introduced into only one of them.
  • Figure 5 shows that ribosomes without VA (1 ip—si RNA-FAM) have little siRNA localization in the CAF cells, whereas VA-bound ribosomes (VA—1 ip—si RN A -FAM) shows that most siRNAs are localized in cells, It can be seen that highly efficient introduction of siRNA into CAF is VA-dependent. From the above results, it has been clarified that a carrier containing VA specifically and significantly promotes the uptake of a substance into CAF.
  • DaunoXome® is dauno / levicin taenoate encapsulated in a ribosome composed of distearoylphosphatidylcholine (DSP C) and cholesterol (Choi).
  • the molar ratio of DS PC: Cho 1: Daunorubicin citrate is 10 : 5: 1 Place 2 XI 0 4 in each of the Z chambers with the CAF obtained in Example 1, normal fibroblasts, or commercially available fibroblasts (skin fibroblasts Cell Systems System, product number CS-2F0-101) on the champ slide. After seeding at a density and culturing overnight in 10% FBSZDMEM, it was washed once with a serum-free medium in a subconfluent state, and the medium was replaced with serum-added OPT I-MEM.
  • a liposomal suspension containing 1 ip-DNR or VA-1 ip-DNR obtained above as a DaunoXome® concentration of 5 g / m 1 is added to the medium, 37.
  • the reaction was carried out at C. Nuclei were stained with DAP I. Before the start of the reaction (0 minutes), 5 minutes after the start of the reaction, 15 minutes later, and 30 minutes later, the localization of DNR showing a red color was observed under a fluorescence microscope. The results are shown in Figs.
  • Example 7 Targeting VA-derivative retinoic acid (RA) to cancer cell line CAF
  • CAF cells were cloned and established from clinical specimens from human cancer patients.
  • Human fibrosarcoma cells HT-1080 (fibrosarcoma) and human hepatoma-derived cells HepG2 cells were purchased from the American Type Culture Collection. All cells were cultured in DMEM medium (SigmaAldrich) supplemented with 10% urine fetal serum (FB S). This After trypsinization, 4 ⁇ in E Le culture slide (BD Falcon # 354114), were seeded 2X 10 5 cells _ m 1 and so as, over ⁇ incubated at 37 ° C, 5% C0 2 under the conditions did.
  • DaunoXome® As a model drug, DaunoXome® (Gilead Sciences, Inc.), a formulation in which daunorubicin is encapsulated in ribosome, is used! / DaunoXome® [Contains Daunonorubicin at a concentration of 2 mg / m 1. DaunoXome® 10 1 with 10% FBS added DMEM 990 1 to prepare a 20 ⁇ gZm 1 solution here 7. Add 14 ⁇ l of all-trans retinol (VA) or all-trans retinoic acid (Retinoic acid, RA) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to 10 OmM.
  • VA all-trans retinol
  • RA all-trans retinoic acid
  • VA + an RA-added ribosome preparation
  • retinoic acid + an RA-added ribosome preparation
  • VA- a DaunoXome® solution that does not contain any RA or RA.
  • VA or RA ribosome preparation The culture medium was removed from the culture slide, and fresh 10% FB S-added DME M (750 ⁇ l) was added again.
  • VA— DaunoXorae® solution without VA and RA
  • VA + VA-added ribosome formulation
  • RA additives ribosome Ltd. agent retinoic acid +
  • the glass slide was observed with a phase contrast microscope and the fluorescence microscope.
  • the above slide glass was electronically fused with an image captured in a bright field with a phase contrast microscope, an image captured under green excitation light with the fluorescence microscope, and an image captured under UV excitation light (merge ).
  • the fused images are shown in Figs. 11 to 13, and the observation results are shown in Tables 1 to 3. In the table, + indicates that fluorescence was observed, and 1 indicates that fluorescence was not observed.
  • DaunoXome® + Retinoic acid + + + + As can be seen from the results, the presence of blue fluorescence of DAP I confirmed the presence of cell nuclei in any slide glass. Due to the presence of red fluorescence of daunorubicin, daunorubicin was localized in the cell nucleus in spite of a short incubation period of 15 minutes in glass slides using VA or RA. In contrast, daunorubicin was not localized in the cell nucleus in the glass slides that did not use VA or RA. This indicates that retinoids can be used as targeting agents for CAF or cancer cells.
  • Example 8 CAF-specific growth inhibition by a VA-binding ribosome-encapsulating drug The CAF growth-inhibiting activity of a VA-binding ribosome containing siRNA or DNR against gp46 was examined.
  • the siRNA having the sequence A described in Example 3 was used. Inoculate 1 x 10 4 CAF or normal fibroblasts in 24 Welde tissue, incubate in 10% FB S / DMEM for 24 hours, then add VA-1 ip-si RNA at a final concentration of 50 pmo 1 / ml The cells were washed after 1 hour incubation. After culturing in 10% FBS ZDMEM for 48 hours, the number of viable cells was measured by the WST_1 method.
  • VA-bound or non-bound ribosome (VA_ 1 ip-si RNA (ran) or 1 ip—si RNA (ran)) containing 1 ip— si RNA and rand om si RN A is used as a controller.
  • VA-bound or non-bound ribosome VA_ 1 ip-si RNA (ran) or 1 ip—si RNA (ran)
  • VA-bound or non-bound ribosome containing 1 ip— si RNA and rand om si RN A
  • Example 6 After 96 seeds were seeded with 2 x 10 3 CAF or normal fibroblasts, cultured for 24 hours in 10% FBS ZDMEM, the VA—1 ip—DNR or 1 ip—DNR obtained in Example 6 was used. The final concentration of DaunoXome® was added at 5 g / m 1, and the cells were washed after exposure for 15 minutes. After culturing in 10% FB SZDMEM for 24 hours, the number of viable cells was measured by the WST-1 method. U test was used to evaluate the significant difference. The results are shown in FIG.
  • Example 9 Examination of introduction efficiency of VA-1 ip—DNR into cancer cell Human fibrosarcoma-derived cell line HT_ 1 0 80, HS 9 1 3 T or Sw6 84, human breast cancer-derived cell line MCF 7, 1 x 10 4 human osteosarcoma-derived cell line Saos 2 (both purchased from AT CC) or human hepatoma-derived cell line Huh 7 (purchased from JCRB cell puncture) on a champa slide (Falcon) The cells were seeded at the cell density of the well, and after culturing, they were washed with DMEM containing 10% FBS.
  • ip—DN R (DaunoXome®) 5 ⁇ g / m 1 (8.85 ⁇ ⁇ as daunorubicin, 89.25 ⁇ as liposome), or VA—1 obtained in Example 6
  • the VA-binding ribosome used in Example 5 (VA-1 ip-si
  • RNA-FAM RNA-FAM
  • VA-free ribosome (1 i p— s i RNA-FA
  • Figure 23 shows the change in tumor volume after the start of administration. From the figure, it can be seen that the drug supported on the VA-binding carrier significantly suppresses the growth of the tumor.
  • composition of the present invention is extremely effective in the treatment of cancer.

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Abstract

本発明の課題は、新たながんの治療剤および治療法を提供することである。前記課題は、レチノイドを含む、がん細胞および癌随伴線維芽細胞からなる群から選択される細胞への標的化剤、同標的化剤を含む前記細胞用の物質送達担体、同標的化剤または担体を利用した抗がん組成物および抗癌随伴線維芽細胞組成物、ならびにがん処置法により解決される。

Description

がん細胞および癌随伴線維芽細胞への標的化剤 技術分野
本発明は、 がん細胞おょぴ癌随伴線維芽細胞 （CAF ： cancer-associated fibroblast ¾ 7こは carcinoma— associated fibroblast) 力、らな >群力 ら選択 れ る細胞への標的化剤、 該標的化剤を明含む上記細胞用の物質送達担体、 ならびにこ れを利用した抗がん組成物、 抗 CAF組成物およびがんを処置するための方法に 関する。 書 背景技術
がんは人類が直面している最も重要な疾患の 1つであり、 その治療のために多 大な研究努力がなされている。 がん治療、 特にがんの内科的治療においては、 が ん細胞の増殖を抑制する種々の抗がん剤が開発され、 ある程度の成果を収めてい るが、 かかる薬剤は、 がん細胞のみならず正常な細胞の増殖をも抑制してしまう ために、 悪心嘔吐、 脱毛、 骨髄抑制、 腎障害、 神経障害といった様々な副作用が 問題となっている。 こうした副作用を低減するアプローチとして、 抗がん剤をが ん細胞またはがん組織に特異的に送達する試みが近年行われるようになった。 抗 がん剤の特異的送達により、 抗がん剤が正常細胞に到達するのを防ぎ、 副作用を 軽減することができるばかりでなく、 抗がん剤の投与量を減らすことができると いう経済的なメリットも得られる。
具体的な送達方法としては、 例えば、 EPR (e nh a n c e d p e rme a b i l i t y a n d r e t e n t i o n) 効果を利用したパッシブターゲ ティングや、 がん細胞に特異的に発現する表面分子のリガンドなどで薬物を修飾 するアクティブターゲティングなどの手法が開発されている。 アクティブターグ ティングに利用可能な分子としては、 リガンドの結合により細胞内にェンドサイ トーシスされる分子、 例えば、 CD 19、 HER2、 トランスフェリン受容体、 葉酸受容体、 V I P受容体、 EGFR (非特許文献 1)、 R A AG 10 (特許文献 1 )、 P I P A (特許文献 2 )、 K I D 3 (特許文献 3 ) などが報告されている。 しかしながら、 いずれの送達方法も未だ満足できるものではなく、 さらなるがん 細胞特異的な送達方法の開発が求められていた。
また、 がんの内科的治療においては、 がん細胞自体を死滅させればがんを治癒 できるとの考えから、 これまでにがん細胞を標的とした種々の抗がん剤が開発 · 使用されてきた。 しかしながら、 力かる試みは、 上記のような副作用の問題や、 微小残存病変による再発、 腫瘍細胞の抗癌剤に対する耐性といつた付加現象の発 生などに阻まれ、 必ずしも満足のいく成果をあげることができないで!/、た。
—方で、 がんの周辺環境、 例えば血管、 E CM、 線維芽細胞等を含む間質が、 がんの発症および進行に重要な役割を担っていること力 最近の研究により次第 に明らかになつてきた。 例えば、 Camps ら （非特許文献 2参照） は、 単独では腫 瘍を形成しないか、 腫瘍形成速度の遅い腫瘍細胞を、 腫瘍形成性線維芽細胞と共 に無胸腺ヌードマウスに接種したところ、 迅速かつ顕著な腫瘍形成がみられたこ とを、 そして、 Olumi ら （非特許文献 3参照） は、 前立腺腫瘍患者の腫瘍周囲線 維芽細胞 （すなわち C A F ) を、 ヒト前立腺細胞と共に無胸腺動物に移植したと ころ、 その腫瘍性増殖が顕著に促進されたことを報告している。 また、 このよう な腫瘍増殖に、 間質で産生される P D G F (platelet-derived growth factor) , Γ Lr t β (transiorming growth factor- /3 )、 H G r (hepatocyte growth factor)、 S D F - 1 (stromal cell-derived factor - 1) 等の生理活性物質が関与してい ることも明らかになってきている （非特許文献 4参照)。
こうした知見から、がんの周辺環境の重要性がクローズアップされ始めており、 がん細胞自体でなく、 その周辺環境を標的とした新しレ、治療法が検討されるよう になってきた。 なかでも、 種々の生理活性物質を分泌し、 がんの発症や進行に深 く関わる C A Fが最近注目を集めつつあるが、 その本格的な研究の歴史は十数年 とまだ浅く、 C A Fの分泌す ¾生理活性物質を標的にしたがん治療法の中にはあ る程度の効果が確認されたものはあるものの、 C A F自体を標的にしたがんの治 療法として何らかの成果が認められたものは未だ存在しないのが現状である （非 特許文献 4参照)。 参考文献リスト
特許文献 1. 特表 2005-532050
特許文献 2. 特表 2006-50607 1
特許文献 3. 特表 2007-529 1 97
特許文献 4. 国際公開第 2006/068232号パンフレット
非特許文献 1. Torchilin, MPS J. 2007； 9 (2)： E128-47
非特許文献 2. Camps et al. , Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 ;87(1) :75- 9 非特許文献 3. Olumi et al. , Cancer Res. 1999；59(19)： 5002-11
非特許文献 4. Micke et al.， Expert Opin Ther Targets. 2005 ;9 (6) :1217 - 33 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、 がん細胞特異的に薬物等の物質を送達できる担体、 これを利用した がん治療薬およびがん療法を提供すること、 また、 C A F特異的に薬物を送達で きる担体、 これを利用したがん治療薬およびがん療法を提供することを目的とす る。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 新たながんの治療法を探求する中で、 CAF特異的に薬物を送 達できる担体が未だ存在しないことに気付き、 かかる担体を開発すべく鋭意研究 を続けたところ、 レチノィドを標的化剤として含む担体が C A Fへの薬物送達を 特異的に促進することを見出した。 そして、 上記担体についてさらに研究を進め たところ、 同担体ががん細胞への物質送達も特異的に促進することを見出し、 本 発明を完成させた。
レチノールを含む担体が、 レチノールを貯蔵する星細胞に薬物を送達すること は知られていたが（特許文献 4参照）、がん細胞や CAFへの薬物送達を特異的に 促進することはこれまで知られていなかった。
すなわち、 本発明は以下に関する：
( 1 ) レチノイドを含む、 がん細胞およぴ癌随伴線維芽細胞からなる群から選択 される細胞への標的化剤；
(2) レチノィドがレチノールを含む、 - ( 1 ) の標的化剤；
(3) (1) または （2) の標的化剤を含む、 がん細胞おょぴ癌随伴線維芽細胞か らなる群から選択される細胞用の物質送達担体；
(4) 標的化剤の含有量が担体全体の 0. 2〜20重量％でぁる （3) の担体；
(5) 標的化剤と、 担体の標的化剤以外の構成成分とのモル比が 8 : 1〜1 ： 4 である （3) または （4) の担体；
(6) (1) または （2) の標的化剤または （3) 〜 （5) のいずれかの担体と、 がん細胞および Zまたは癌随伴線維芽細胞の活性または増殖を制御する薬物とを 含む、 抗がん組成物；
(7) (1) または （2) の標的化剤または （3) 〜 （5) のいずれかの担体と、 癌随伴線維芽細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、 抗癌随伴線維芽細 胞組成物；
(8) がん細胞の活性または増殖を制御する薬物が抗がん剤である、 （6) の組成 物；
( 9 )癌随伴線維芽細胞の活性または増殖を制御する薬物力 T G F j3、 HG F、 PDGF、VEGF vascular endothelial growth factor)、 I G F (insulin-like growth factor) s MMP (matrix metalloproteinase) FGF (fibroolast growth factor)、 u P A (urokinase- type plasminogen activator)、 カァプシンおょぴ SDF-1からなる群から選択される生理活性物質の活性または産生阻害剤、 細 胞活性抑制剤、 増殖阻害剤、 アポトーシス誘導剤、 ならびに、 癌随伴線維芽細胞 によって産生される細胞外マトリクス構成分子、 または該細胞外マトリクス構成 分子の産生もしくは分泌に関与する分子のうちの 1つまたはそれ以上を標的とす る s i RNA、 リボザィム、 アンチセンス核酸、 DNAZRNAキメラポリヌク レオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、 （6) 〜 ( 8 ) の組成物；
(10) 細胞外マトリクス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子が H S P 47である、 （9) の組成物；
(1 1) 薬物と、 標的化剤または担体とを、 医療の現場またはその近傍で混合し てなる、 （6) 〜 （10) の組成物；
(12) 薬物、 標的化剤、 ならびに、 必要に応じて標的化剤以外の担体構成物質 を、単独でまたは組み合わせて含む 1つまたはそれ以上の容器を含む、（ 6 )〜(： 1 1) のいずれかの組成物の調製キット。 発明の効果
本発明の担体は、 がん細胞および CAFを特異的な標的とするものであり、 所 望の物質や物体、 例えばがん細胞や C A Fの活性または増殖を制御する薬物等を がん細胞おょぴ Zまたは CAFに効率的に運搬することにより、 最大の効率およ び最小の副作用において、 所望の効果、 例えばがん細胞や C A Fの活性や増殖の 抑制、およびこれによるがんの治癒、進行の抑制または発症の予防を可能にする。 本発明の抗がん糸且成物は、 がん細胞自体に加え、 CAFを叩くことによりがん を処置するという全く新しいアプローチに基づくものであるため、 従来の治療法 では満足な結果が得られなかったがんにおいても有効性が期待でき、 さらに、 従 来の杭がん剤や血管新生阻害剤等との併用による相乗効果も見込まれる。
また、 本発明の担体は、 がん細胞および CAF特異的に物質を送達することが できるため、 がん細胞および C A F特異的な標識や、 遺伝子導入などに利用でき る。 図面の簡単な説明
図 1は、 がん組織由来の細胞を α— SMA、 ビメンチンおよびデスミンについ て免疫染色した写真図である。
図 2は、 CAFまたは正常線維芽細胞と、 がん細胞とを共培養した際の、 がん 細胞の細胞数の推移を示したグラフである。
図 3は、 CAFまたは正常線維芽細胞へ種々のリボソームにより s i RNAを 送達した際の導入率を、 経時的に比較したグラフである。
図 4は、 VA— 1 i P- s i RNAまたは 1 i p— s i RNAと反応させた C AFにおける s i RNAの局在を示した写真図である。
図 5は、 VA— 1 i p— s i RNA、 1 i p— s i RNAまたは VA— 1 i p と反応させた CAFまたは正常線維芽細胞における s i RNAの局在を示した写 真図である。
図 6は、 VA_ 1 i p_DNRまたは 1 i p— DNRと反応させた CAFにお ける DNRの局在を示した写真図である。 図中の数字は、 反応開始からの経過時 間 （分） を示す。 倍率は 200倍 （拡大像は 400倍） である。
図 7は、 VA_ 1 i p— DNRまたは 1 i p— DNRと反応させた正常線維芽 細胞における DNRの局在を示した写真図である。 図中の数字は、 反応開始から の経過時間 （分） を示す。 倍率は 200倍である。
図 8は、 VA— 1 i p _DNRまたは 1 i p— DNRと反応させた skin fibroblastにおける DNRの局在を示した写真図である。 図中の数字は、反応開 始からの経過時間 （分） を示す。 倍率は 200倍である。
図 9は、 VA— 1 i p -DNR (左） または 1 i p—DNR (右） と反応させ た CAFにおける DNRの局在を示した写真図である。 倍率は 400倍 （拡大像 は 800倍） である。
図 10は、緑色の励起光下で赤い蛍光を発するダウノルビシン（左上）、 UV励 起光下で青色蛍光を発する DAP I (4'，6- diamino-2- phenyl indole) (右上）、お よび紫色を呈する融合像 （下） を示した写真図である。
図 1 1は、 無処理 （No treatment：左上） 力、、 または、 DaunoXome® (VA—： 右上）、 DaunoXome® +レチノール （VA+：左下） もしくは DaunoXome® +レチノ イン酸 （Retinoic acid +：右下） と反応させた CAFにおける DNRの局在を示 した写真図である。 倍率は 400倍である。
図 12は、 無処理 （No treatment：左上） 、 または、 DaunoXome® (VA—： 右上）、 DaunoXome® +レチノール （VA+：左下） もしくは DaunoXome® +レチノ イン酸 （Retinoic acid +：右下） と反応させた HT— 1080における DNRの 局在を示した写真図である。 倍率は 400倍である。
図 13は、 無処理 （No treatment：左上） か、 または、 DaunoXome® (VA-： 右上）、 DaunoXome® +レチノール (VA+：左下） もしくは DaunoXome® +レチノ イン酸 （Retinoic acid +：右下） と反応させた H e p G 2における D NRの局在 を示した写真図である。 倍率は 400倍である。 図 14は、 CAFまたは正常線維芽細胞に対する VA— 1 i P- s i RNAの 増殖阻害活性を評価した結果を示すグラフである。 縦軸は処置前の生細胞数を 1 00とした場合の、 処置後の生細胞数の比率を示す。
図 15は、 CAFまたは正常線維芽細胞に対する VA— 1 i p-DNRの増殖 阻害活性を評価したダラフである。 縦軸は処置前の生細胞数を 100とした場合 の、 処置後の生細胞数の比率を示す。
図 16は、ヒト線維肉腫由来細胞株 HT— 1080における、リポ化 DNR (V A—） または VA結合リポ化 DNR (VA+) の細胞内局在の状況を示した写真 図である。 上段は DNRの局在を、 下段は DAP Iにて核染色した細胞を、 そし て数字は添加後の時間を示す。
図 17は、 ヒト線維肉腫由来細胞株 HS 913Tにおける、 リポ化 DNR (V A—） または VA結合リポ化 DNR (VA+) の細胞内局在の状況を示した写真 図である。 上段は DNRの局在を、 下段は DAP Iにて核染色した細胞を、 そし て数字は添加後の時間を示す。
図 18は、 ヒト線維肉腫由来細胞株 Sw684における、 リポ化 DNR (VA 一） または VA結合リポ化 DNR (VA+) の細胞内局在の状況を示した写真図 である。 上段は DNRの局在を、 下段は DAP Iにて核染色した細胞を、 そして 数字は添加後の時間を示す。
図 19は、 HT— 1080、 HS 913T、 Sw684、 Huh 7、 MCF 7 および S a o s 2細胞におけるリポ化 DNR (VA (一）） または VA結合リポ化 DNR (VA (+))の細胞内局在の状況を示した写真図である（添加後 15分)。 なお、 B l a nkは、 リポ化 DNRおよび VA結合リポ化 DNRのいずれをも添 加しなかった場合の鏡検像である。
図 20は、 ヒト線維肉腫由来細胞株 HT— 1080、 HS 913 Tまたは S w 684に対するリポ化 D N Rまたは V A結合リポ化 D N Rの増殖抑制活性を評価 したグラフである。
図 21は、 VA— 1 i p— s i RNAまたは 1 i p— s i RNAを静脈内投与 した担癌マウスの腫瘍組織における s i RNAの局在を示した写真図である。 右 側が VA— l i p-s i RNA投与個体、 左側が 1 i p— s i RNA投与個体で あり、 上側が F AM像、 下側が F AMと C y 3の融合像である。 なお、 倍率は 2 0 0倍である。
図 2 2は、 VA— 1 i p— s i RN Aを静脈内投与した担癌マウスの腫瘍組織 における s i R NAの局在を示した写真図である。 左上が F AM像、 右上が C y 3像、 左下が F AMと C y 3の融合像、 右下が F AM、 C y 3および D A P Iの 融合像である。 なお、 倍率は 2 0 0倍である。
図 2 3は、 VA— 1 i p - D N R (週 2回投与） の in vivoにおける抗腫瘍活 性を評価した結果を示すグラフである。 縦軸は、 腫瘍塊の体積 (mm 3) を、 横 軸は処置開始後の日数をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明において、 がん細胞は特に限定されずに、 例えば、 線維肉腫、 悪性線維 性組織球腫、 脂肪肉腫、 横紋筋肉腫、 平滑筋肉腫、 血管肉腫、 力ポジ肉腫、 リン パ管肉腫、 滑膜肉腫、 軟骨肉腫、 骨肉腫などの肉腫、 脳腫瘍、 頭頸部癌、 乳癌、 肺癌、 食道癌、 胃癌、 十二指腸癌、 虫垂癌、 大腸癌、 直腸癌、 肝癌、 膝癌、 胆嚢 癌、 胆管癌、 肛門癌、 腎癌、 尿管癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 陰茎癌、 精巣癌、 子宮 癌、 卵巣癌、 外陰癌、 膣癌、 皮膚癌などの癌種、 さらには白血病や悪性リンパ腫 などにおけるがん細胞が挙げられる。 なお、本発明では、 「がん」 は、上皮性悪性 腫瘍および非上皮性悪性腫瘍を含む。 したがって、 本発明におけるがん細胞は、 任意の部位、 例えば、 脳、 頭頸部、 胸部、 四肢、 肺、 心臓、 胸腺、 食道、 胃、 小 腸 （十二指腸、 空腸、 回腸)、 大腸 （結腸、 盲腸、 虫垂、 直腸)、 肝臓、 膝臓、 胆 嚢、肛門、 腎、 尿管、膀胱、 前立腺、 陰茎、 精巣、 子宮、 卵巣、 外陰、膣、 皮膚、 横紋筋、 平滑筋、 滑膜、 軟骨、 骨、 甲状腺、 副腎、 腹膜、 腸間膜、 骨髄、 血液、 血管系、 リンパ節等のリンパ系、 リンパ液などに存在する。
本発明の一態様において、 がん細胞は、 S刊蔵および滕臓以外の部位に存在する ことが好ましい。 したがって、 この態様におけるがん細胞は、 好ましくは、 例え ば、 脳、 頭頸部、 胸部、 四肢、 肺、 心臓、 胸腺、 食道、 胃、 小腸 （十二指腸、 空 腸、 回腸)、 大腸 （結腸、 盲腸、 虫垂、 直腸)、 胆嚢、 肛門、 腎、 尿管、 膀胱、 前 立腺、 陰茎、精巣、子宮、 卵巣、 外陰、膣、皮膚、横紋筋、 平滑筋、 滑膜、軟骨、 骨、 甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、 リンパ節等のリンパ系、 リンパ液などに存在するものである。 また、 本発明の一態様において、 がん細胞 は、 肝癌細胞および瞎癌細胞以外のものであることが好ましレ、。
本発明において、 癌随伴線維芽細胞 （C A F ) とは、 がん病変の内部および Z または周囲に存在する、 α— S MA (平滑筋ァクチン） 陽性の線維芽細胞を意味 する。 C A Fは、 大腸癌、 肺癌、 前立腺癌、 乳癌、 胃癌、 胆管癌、 基底細胞癌等 の種々のがんについてその存在が確認されている。
本発明では、 ある細胞が C A Fであるかは次の手法で判定する。 すなわち、 が ん病変の内部および Ζまたは周囲に存在する細胞を、 C A Fのマーカーであるひ - S MAに対する標識抗体、 例えば、 F I T C標識抗 α— SMAirCf^C y 3標 識抗 α— S MA抗体で免疫染色し、 ひ一 SMAが検出されるものが、 C A Fであ ると判定する。
本発明における C A Fを伴うがんは特に限定されないが、 例えば、 脳腫瘍、 頭 頸部癌、 乳癌、 肺癌、 食道癌、 胃癌、 十二指腸癌、 虫垂癌、 大腸癌、 直腸癌、 肝 癌、滕癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、 腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、 陰茎癌、 精巣癌、 子宮癌、 卵巣癌、 外陰癌、 膣癌、 皮膚癌などの固形癌が挙げられる。 ま た、 C A Fは、典型的には癌に随伴するものである力 同様の性質を有する限り、 癌以外の悪性固形腫瘍、 例えば、 線維肉腫、 悪性線維性組織球腫、 脂肪肉腫、 横 紋筋肉腫、 平滑筋肉腫、 血管肉腫、 力ポジ肉腫、 リンパ管肉腫、 滑膜肉腫、 軟骨 肉腫、 骨肉腫などの肉腫に随伴するものであってもよく、 これらも本発明の範囲 に含まれる。
本発明の一態様において、 C A Fは、 肝臓および膝臓以外の部位に存在する。 したがって、 この態様における C A Fは、例えば、脳、頭類部、胸部、 四肢、肺、 心臓、胸腺、食道、 胃、小腸（十二指腸、空腸、 回腸)、大腸（結腸、盲腸、 虫垂、 直腸)、 胆嚢、 肛門、 腎、 尿管、 膀胱、 前立腺、 陰茎、 精巣、 子宮、 卵巣、 外陰、 膣、 皮膚、 横紋筋、 平滑筋、 滑膜、 軟骨、 骨、 甲状腺、 副腎、 腹膜、 腸間膜など に存在するものである。
レチノィドは、 4個のィソプレノィド単位がへッド一トゥ一一ティル式に違結 した骨格を持つ化合物の群の 1員である。 G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents, " 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)を参照されたい。 ビタミン Aは、 レチノールの生物学的活 1"生を定 I"生的に示 すレチノイドの一般的な記述子である。 本発明におけるレチノイドは、 がん細胞 および C A Fへの特異的な物質送達を促進する （すなわち物質をこれらの細胞に 標的化する） ものである。 かかるレチノイドとしては特に限定されず、 例えばレ チノール、 レチナール、 レチノイン酸、 レチノールと脂肪酸とのエステル、 脂肪 族アルコールとレチノイン酸とのエステル、 ェトレチナ一ト、 トレチノイン、 ィ ソトレチノイン、 ァダパレン、 ァシトレチン、 タザ口テン、 パノレミチン酸レチノ ールなどのレチノィド誘導体、およびフェンレチニド （4—H P R)、べキサロテ ンなどのビタミン Aアナ口グを用いることができる。
なお、 本発明におけるレチノィドは、 レチノィド誘導体およぴ Zまたはビタミ ン Aアナログと同じ意味である。 レチノィドががん細胞および C A Fへの特異的 な物質送達を促進するメカニズムは完全には解明されていないが、 がん細胞およ ぴ C A F表面上のある種のレセプターを介した取り込みが関与していると考えら れる。
これらのうち、 レチノール、 レチナール、 レチノイン酸、 レチノールと脂肪酸 とのエステル （例えばレチュルアセテート、 レチニルパルミテート、 レチニルス テアレート、 およぴレチュルラウレート） および脂肪族アルコールとレチノイン 酸とのエステル （例えばェチルレチノエート） は、 がん細胞および C A Fへの特 異的な物質の送達の効率の点で好ましい。
レチノイドのシス一トランスを含む異性体全ては、 本発明の範囲内に入る。 レ チノィドはまた 1または 2以上の置換基で置換されることもある。 本発明におけ るレチノイドは、 単離された状態のものはもちろんのこと、 これを溶解または保 持することができる媒体に溶解または混入した状態のレチノィドをも含む。
本発明の一側面は、 レチノイドを含む、 がん細胞おょぴ癌随伴線維芽細胞から なる群から選択される細胞への標的化剤に関する。 ここで、 標的化とは、 物質、 例えば薬物や薬物担体などを特定の標的、 例えば特定の細胞や組織 （本発明にお いてはがん細胞および癌随伴線維芽細胞からなる群から選択される細胞） に、 標 的としない細胞や組織よりも、 標的化していない前記物質と比較して、 迅速、 効 率的かつ zまたは大量に送達すること、 すなわち標的に特異的に送達することを 可能にすることをいい、 標的化剤とは、 物質と結合または反応した場合に、 当該 物質をこのように標的化できる物質を意味する。 したがって、 本明細書において は、 例えば、 がん細胞特異的な担体または組成物と、 がん細胞に標的化された担 体または組成物とは同様の意味で用いられる。 なお、 標的化剤が分子の形態であ る場合には、 これは標的化分子と同義である。
本発明の標的化剤は、 上記のレチノイド自体で構成してもよいし、 レチノイド 以外の構成要素、.例えば、 標的化剤と担体や薬物との結合を促進または安定ィ匕さ せる要素や、 保存時、 製剤製造への使用時または製剤の保存時にレチノィドを保 護する要素、 レチノィドと担体や薬物とを空間的に隔てるスぺーサ一などを含ん でもよレ、。 本発明の標的化剤は、 任意の担体や薬物と結合させ、 これらの担体や 薬物をがん細胞およぴ癌随伴線維芽細胞からなる群から選択される細胞に対して 標的化することができる。
本発明はまた、 上記標的化剤を含む、 がん細胞および癌随伴線維芽細胞からな る群から選択される細胞用の物質送達担体に関する。 本発明の担体は、 上記の標 的化剤のみで構成してもよいし、 標的化剤を、 これとは別の、 担体の標的化剤以 外の構成成分に結合または包含させることにより構成してもよい。 したがって、 本発明の担体は、 標的化剤以外の構成成分を含んでいてもよい。 かかる成分とし ては、 特に限定されずに、 医薬および薬学の分野で知られる任意のものを用いる ことができる力 標的化剤、 特にレチノイドを包含し得る力 \ または、 これと結 合し得るものが好ましい。
このような成分としては、 脂質、 例えば、 グリセ口リン脂質などのリン脂質、 スフインゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、 コレステロールなどのステロール、 大豆油、 ケシ油などの植物油、 鉱油、 卵黄レシチンなどのレシチン類等が挙げら れるが、 これらに限定されない。 このうち、 リボソームを構成し得るもの、 例え ば、 レシチンなどの天然リン脂質、 ジミリストイルホスファチジルコリン （DM P C)、 ジパルミ トイルホスファチジルコリン （D P P C)、 ジステアロイルホス ファチジルコリン （D S P C) などの半合成リン脂質、 ジォレイルホスファチジ ルエタノールァミン（DOPE)、ジラウロイルホスファチジルコリン（DLPC)、 コレステロールなどが好ましい。
特に好ましい成分としては、細網内皮系による捕捉を回避し得る成分、例えば、 N— （ α—トリメチルァンモニオアセチル） 一ジドデシルー D—グルタメートク ロリ ド（TMAG)、 N, Ν，， Ν'，， Ν'" —テトラメチル一 Ν, Ν', Ν", Ν'" ーテトラパルミチルスペルミン（TMTP S)、 2， 3—ジォレイルォキシ一N— [2 (スペルミンカルボキサミド) ェチル] — N, N—ジメチル一 1一プロパン アミ-ゥムトリフルォロアセテート （D〇S PA)、 N— [1— (2, 3—ジォレ ィルォキシ） プロピル] — N, N, N—トリメチルアンモ -ゥムクロリ ド （DO TMA)、 ジォクタデシルジメチルアンモユウムクロリ ド （DODAC)、 ジドデ シルアンモニゥムブロミ ド （DDAB)、 1 , 2—ジォレイルォキシー 3—トリメ チルアンモニォプロパン （DOTAP)、 3 β— [Ν— (Ν，， Ν' —ジメチルァ ミノエタン） 力ルバモイル] コレステロール （DC— Ch ο 1 )、 1 , 2—ジミリ ストィルォキシプロピル一 3—ジメチルヒドロキシェチルアンモニゥム (DMR I Ε)、 Ο, Ο' ージテトラデカノィル一 Ν— (α—トリメチルアンモニオアセチ ル） ジエタノールァミンクロリド （D C— 6— 1 4 ) などの力チオン性脂質が挙 げ'られる。
本発明の担体への標的ィ匕剤の結合または包含は、 化学的および Ζまたは物理的 な方法によつて標的化剤を担体の標的化剤以外の構成成分に結合させるかまたは 包含させることによつても可能となる。 または、 本発明の担体への標的化剤の結 合または包含は、 該担体の作製時に、 標的化剤と、 担体の標的化剤以外の構成成 分とを混合することによつても可能となる。 本発明の担体に結合させるかまたは 包含させる標的化剤の量は、 標的化剤を含めた担体構成成分中の重量比で 0. 0 1 %〜1 00%、 好ましくは 0. 2%〜20%、 さらに好ましくは 1〜5%とす ることが可能である。 担体への標的化剤の結合または包含は、 該担体に薬物等を 担持させる前に行ってもよいし、 担体、 標的化剤および薬物等を同時に混合する ことなどによって行ってもよいし、または、薬物等を既に担持した状態の担体と、 標的化剤とを混合することなどによって行ってもよい。 したがって、 本発明はま た、 既存の任意の薬物結合担体や薬物封入担体、 例えば、 DaunoXome®、 Doxil、 Caelyx®, Myocet®などのリボソーム製剤に標的化剤を結合させる工程を含む、 が ん細胞および C A Fからなる群から選択される細胞に標的化された製剤の製造方 法にも関する。
本発明の担体の形態は、 所望の物質や物体を、 標的とするがん細胞や C A Fに 運搬できればいずれの形態でもよく、 例えば、 限定するものではないが、 高分子 ミセル、 リボソーム、 ェマルジヨン、 微小球、 ナノ小球などのうちいずれの形態 をとることもできる。 本発明の担体のサイズは、 薬物の種類等に依存して変化し 得る。 かかるサイズは特に限定されないが、 直径が例えば 5 0〜2 0 0 /z mであ ることが好ましく、 7 5〜1 5 0 μ πιであることがより好ましい。 これは、 この ようなサイズががん組織への集積を促進する E P R効果の発現に好適であり、 後 述するがん細胞および Ζまたは C A Fの活性または増殖を制御する薬物の送達に 適するためである。 かかる直径は動的光散乱法 （dynamic light scattering method) で測定された値である。
本発明の担体においては、 標的化剤と、 担体の標的化剤以外の構成成分とのモ ル比 （存在比） は、 投与時において、 好ましくは 8 ： 1〜1 ： 4、 より好ましく は 4 ： 1〜1 ： 2、 さらに好ましくは 3 ： 1〜1 ： 1、 特に 2 ： 1である。 何ら 理論に拘束されることなく、 かかるモル比は、 標的化剤の担体への有効な （すな わち、 標的化剤の標的化機能を損なわない） 結合または包含、 および物質のがん 細胞や C A Fへの特異的送達に効果的であると信じられる。
本発明においては、 送達効率の高さ、 送達できる物質の選択肢の広さや製剤化 の容易性等の観点から、 これらのうちリボソームの形態が好ましく、 中でもカチ オン性脂質を含むカチオン性リボソームが特に好ましい。
本発明の担体は、 これに含まれる標的化剤が、 標的化機能を発揮する態様で存 在していれば、 運搬物を内部に含んでも、 運搬物の外部に付着して存在しても、 また、 運搬物と混合されていてもよい。 ここで、 標的化機能を発揮するとは、 標 的化剤を含む担体が、 これを含まない担体よりも迅速、 効率的かつ Zまたは大量 に、 標的細胞であるがん細胞および/または C A Fに到達し、 力っ または取り 込まれることを意味し、 これは、 例えば、 標識を付した、 または標識を含む担体 をがん細胞おょひンまたは C A F培養物に添加し、 所定時間後に標識の存在部位 を分析することにより容易に確認することができる。 予測できないことに、 標的 ィ匕剤を、 遅くともがん細胞および または C A Fに到達するまでに、 担体を含む 製剤の外部に少なくとも部分的に露出させることで、 がん細胞および Zまたは C A F特異的な物質送達が効率的に実現されることを本発明者らは見出した。 これ は、 担体を含む製剤の外部に露出した標的化剤が、 がん細胞および/または C A F表面上のある種のレセプターを介して、 通常の拡散よりもより効率的に、 がん 細胞および Zまたは C A Fに取り込まれる現象によるものであると本発明者は考 察している。 担体を含む製剤の外部に標的化剤を露出させる手段としては特に限 定されないが、 例えば担体を調製する際に、 標的化剤を担体の標的化剤以外の構 成成分に比して過剰に配合することが挙げられる。 より具体的には、 標的化剤を 担体を含む製剤の外部に効率的に露出させるためには、 標的化剤と担体の標的化 剤以外の構成成分とのモル比 （配合比） は、 配合時において好ましくは 8 ： 1〜 1 ： 4、 より好ましくは 4 ： 1〜1 ： 2、 さらに好ましくは 3 ： 1〜1 ： 1、 特 に 2 ： 1である。
本担体が送達する物質や物体は特に制限されないが、 投与部位からがん細胞お よび/または C A Fが存在する病変部位へ、 生物の体内を物理的に移動できるよ うな大きさであることが好ましい。 したがって、 本発明の担体は、 原子、 分子、 化合物、タンパク質、核酸等の物質はもとより、ベクター、 ウィルス粒子、細胞、 1以上の要素で構成された薬物放出 ステム、 マイクロマシン等の物体をも運搬 することができる。 前記物質または物体は、 好ましくはがん細胞および Zまたは C A Fに何らかの影響を与える性質を有し、 例えば、 がん細胞および/または C A Fを標識するものや、 がん細胞および/または C A Fの活性または増殖を制御 する （例えば、 これを増強または抑制する） ものを含む。
したがって、 本発明の一態様においては、 担体が送達する物は 「がん細胞およ ぴ Zまたは C A Fの活性または増殖を制御する薬物」 である。 ここで、 がん細胞 の活性とは、 がん細胞が示す分泌、 取り込み、 遊走等の種々の活性を指すが、 本 発明においては、 典型的に、 これらのうち特にがんの発症、 進行、 再発おょぴ Z または転移、 悪液質などの症状の発現や増悪化などに関与する活性を意味する。 力かる活性としては、 例えば、 限定することなく、 副甲状腺ホルモン関連タンパ ク質 （ P T H r P ) や免疫抑制酸性タンパク （ I A P ) などの産生 ·分泌が挙げ られる。
また、 CAFの活性とは、 CAFが示す分泌、 取り込み、 遊走等の種々の活性 を指すが、 本発明においては、 典型的に、 これらのうち特にがんの発症おょぴ Z または進行に関与する活性を意味する。かかる活性としては、例えば、 TGF ]3、 HGF、 PDGF、 VEGF、 I GF (I FG1、 I GF2など）、 MMP (MM P l、 2、 3、 9、 11、 13、 14など）、 FGF (FGF 7、 b FGFなど）、 u PA, カテブシン、 S D F— 1等の生理活性物質や、 コラーゲン、 プロテオグ リカン、 テネイシン、 フイブロネクチン、 トロンボスポンジン、 ォステオポンチ ン、 ォステオネクチン、 エラスチン等の細胞外マトリクス成分などの産生'分泌 が挙げられる。
したがって、 がん細胞の活性または増殖を制御する薬物とは、 がんの発症、 進 行およぴ Zまたは再発に関係するがん細胞の物理的、 化学的および Zまたは生理 的な作用等を直接または間接に抑制する何れの薬物であってもよく、 限定されず に、 がんの発症、 進行および/または再発を抑制する抗がん剤、 例えば、 限定す ることなく、 ィホスフアミ ド、 塩酸二ムスチン、 シクロホスフアミ ド、 ダカルバ ジン、 メルファラン、 ラニムスチン等のアルキル化剤、 塩酸ゲムシタビン、 エノ シタビン、 シタラビン ·オタホスファート、 シタラビン製剤、 テガフール ' ゥラ シル、テガフール ·ギメラシル ·ォテラシルカリゥム配合剤、 ドキシフルリジン、 ヒ ドロキシカルバミ ド、 フルォロウラシル、 メ ト トレキサート、 メルカプトプリ ン等の代謝拮抗剤、塩酸イダルビシン、塩酸ェピルビシン、塩酸ダウノルビシン、 クェン酸ダウノルビシン、 塩酸ドキソルビシン、 塩酸ピラルビシン、 塩酸ブレオ マイシン、 硫酸ぺプロマイシン、 塩酸ミ トキサントロン、 マイ トマイシン C等の 抗腫瘍性抗生物質、 ェトポシド、 塩酸ィリノテカン、 酒石酸ピノレルビン、 ドセ タキセル水和物、 パクリタキセル、 硫酸ビンクリスチン、 硫酸ビンデシン、 硫酸 ビンブラスチン等のアル力ロイ ド、ァナストロゾール、タエン酸タモキシフェン、 タエン酸トレミフェン、 ビカノレタミ ド、 フノレタミド、 リン酸エストラムスチン等 のホルモン療法剤、カルポプラチン、シスブラチン、ネダプラチン等の白金錯体、 サリ ドマイド、 ネオパスタツト、 べバシズマブ等の血管新生阻害剤、 L—ァスパ ラギナーゼなど、上記生理活性物質の活性もしくは産生を阻害する薬物、例えば、 前記生理活性物質を中和する抗体および抗体断片、 前記生理活性物質の発現を抑 制する、 s i R NA、 リボザィム、 アンチセンス核酸（R NA、 D NA、 P NA、 またはこれらの複合物を含む） などの物質、 もしくはドミナントネガティブ変異 体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、 またはこれらを発現するべクタ 一、ナトリウムチャンネル阻害剤などの細胞活性抑制剤、 細胞増殖抑制剤、 なら びに compound 861、 gliotoxinなどのアポトーシス誘導剤を包含する。 また、 本 発明における 「がん細胞の活性または増殖を制御する薬物」 は、 がんの発症、 進 行および Zまたは再発の抑制に直接または間接に関係するがん細胞の物理的、 化 学的およぴ Zまたは生理的な作用等を直接または間接に促進する何れの薬物であ つてもよい。上記薬物のうち、抗がん剤が治療効果などの観点から特に好ましい。 また、 C A Fの活性または増殖を制御する薬物とは、 がんの発症および/また は進行に関係する C A Fの物理的、 化学的および Zまたは生理的な作用等を直接 または間接に抑制する何れの薬物であってもよく、 限定されずに、 上記生理活性 物質の活性もしくは産生を阻害する薬物、 例えば、 T G F ]3に拮抗する T G F |3 I I型受容体 (切断型 T G F i3 I I型受容体、可溶性 T G F /3 I I型受容体など）、 バチマスタットなどの MMP阻害剤、 および前記生理活性物質を中和する抗体お よび抗体断片、 前記生理活性物質の発現を抑制する、 s i R NA、 リボザィム、 アンチセンス核酸 （R NA、 D NA、 P NA、 またはこれらの複合物を含む） な どの物質、 もしくはドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果 を有する物質、 またはこれらを発現するベクター、 ナトリウムチャンネル阻害剤 などの細胞活性抑制剤、 アルキル化剤 （例えば、 ィホスフアミド、 塩酸-ムスチ ン、 シクロホスフアミ ド、 ダカルバジン、 メルファラン、 ラニムスチン等）、 抗腫 瘍性抗生物質 （例えば、 塩酸イダルビシン、 塩酸ェピルビシン、 塩酸ダウノルビ シン、 クェン酸ダウノルビシン、 塩酸ドキソルビシン、 塩酸ピラルビシン、 塩酸 ブレオマイシン、 硫酸ぺプロマイシン、 塩酸ミ トキサントロン、 マイトマイシン C等）、 代謝拮抗剤 （例えば、 塩酸ゲムシタビン、 エノシタビン、 シタラビン'ォ クホスフアート、 シタラビン製剤、 テガフール' ゥラシル、 テガフール 'ギメラ シル ·ォテラシルカリゥム配合剤、 ドキシフルリジン、 ヒドロキシカルバミ ド、 フルォロウラシル、 メ トトレキサート、 メルカプトプリン等）、 エトポシド、 塩酸 イリノテカン、 酒石酸ビノレルビン、 ドセタキセル水和物、 パクリタキセル、 硫 酸ビンクリスチン、 硫酸ビンデシン、 硫酸ビンブラスチン等のアル力ロイド、 お よびカルポプラチン、 シスプラチン、 ネダプラチン等の白金錯体などの細胞増殖 抑制剤、ならびに compound 861、 gliotoxinなどのアポトーシス誘導剤を包含す る。 また、 本発明における 「C A Fの活性または増殖を制御する薬物」 は、 がん の発症および Zまたは進行の抑制に直接または間接に関係する C A Fの物理的、 化学的および/または生理的な作用等を直接または間接に促進する何れの薬物で あってもよい。
本発明における「C A Fの活性または増殖を制御する薬物」の別の例としては、 細胞外マトリクス、例えばコラーゲンの代謝を制御する薬物を挙げることができ、 これには、 例えば C A Fによって産生される細胞外マトリクス構成分子を標的と する、 または該細胞外マトリクス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子の うちの 1つまたはそれ以上を標的とする、 s i R NA、 リボザィム、 アンチセン ス核酸 （R NA、 D NA、 P NA、 またはこれらの複合物を含む） などの標的分 子の発現を抑制する効果を有する物質、 もしくはドミナントネガティブ変異体等 のドミナントネガティブ効果を有する物質、 またはこれらを発現するベクターな どが含まれる。
s i R NAは、 mR NAなどの標的分子に特異的な配列を有する 2本鎖 R NA であり、 標的分子の分解を促進することにより、 それによつて形成される物質、 例えばタンパク質の発現を抑制する （R NA干渉)。 Fire らによってその原理が 発表されて以来 （Nature, 391 : 806-811, 1998)、 s i R NAの最適化に関してはす でに広範な研究がなされており、 当業者はかかる技術に精通している。 また、 s i R NA以外の、 R NA干渉またはその他の遺伝子発現阻害反応をもたらす物質 についても精力的な研究がなされており、 現在ではこのような物質も数多く誕生 している。
例えば、 特開 2003 - 219893号公報には、 標的遺伝子の発現を阻害する D NAと R NAとからなる 2本鎖ポリヌクレオチドが記載されている。 このポリヌクレオ チドは、 2本鎖の一方が D NAで、 他方が R NAである D NAZR NAハイプリ ッドであっても、 同じ鎖の一部が DNAで、 他の部分が RNAである DNAZR NAキメラであってもよレ、。かかるポリヌクレオチドは、好ましくは 19〜25、 より好ましくは 19〜23、さらに好ましくは 19〜21ヌクレオチドからなり、 DNAZRNAハイブリッドの場合は、 センス鎖が DNAであり、 アンチセンス 鎖が RNAであるものが好ましく、 また、 DNA/RNAキメラの場合は、 2本 鎖ポリヌクレオチドの上流側の一部が RNAであるものが好ましい。 かかるポリ ヌクレオチドは、 自体公知の化学合成法により定法に従って、 任意の配列を有す るものを作製することが可能である。
前記標的分子としては、 例えば細胞外マトリクス構成分子の産生おょぴ Zまた は分泌を全て抑制できるような分子が好ましく、 そのような分子の例として、 限 定するものではないが、 HSP47が含まれる。 HS P 47またはそのホモログ の遺伝子配列は、 例えば、 GenBank accession No. AB010273 (ヒト）、 X60676 (マ ウス）、 M69246 (ラット、 g p 46) として開示されている。
したがって、 本発明の CAFの活性または増殖を制御する薬物としては、 例え ば、 113?47を標的とする 3 i RNAや、 DNAZRNAハイブリッドもしく はキメラポリヌクレオチド、 ァンチセンス核酸などが好ましレ、。
本発明の担体が送達する物質や物体は、 標識されていてもいなくてもよい。 標 識化により、 運搬の成否や、 がん細胞や C A Fの増減などをモニタリングするこ とが可能となり、 特に試験'研究レベルにおいて有用である。 標識は、 当業者に 公知な任意のもの、 例えば、 任意の放射性同位体、 磁性体、 標識化物質に結合す る物質（例えば抗体)、 蛍光物質、 フルオロフオア、化学発光物質、 および酵素な どから選択することができる。
本発明において 「がん細胞用」 または 「癌随伴線維芽細胞用」 とは、 がん細胞 または癌随伴線維芽細胞を標的として使用するのに適していることを意味し、 こ れは例えば、 標的細胞、 すなわち、 がん細胞または癌随伴線維芽細胞に、 他の細 胞（非標的細胞）、例えばがん化していない細胞または正常な線維芽細胞よりも迅 速、 高効率かつ または大量に物質を送達できることを含む。 例えば、 本発明の 担体は、 がん細胞または癌随伴線維芽細胞に、 他の細胞に比べ、 1. 1倍以上、 1. 2倍以上、 1. 3倍以上、 1. 5倍以上、 2倍以上、 さらには 3倍以上の速 度および zまたは効率で物質を送達することができる。 なお、 ここで 「効率」 と は、 評価対象となる細胞全体のうち物質が送達された細胞の割合を意味する。 本発明はまた、 前記標的化剤または担体と、 前記がん細胞および Zまたは C A Fの活性または増殖を制御する 1種または 2種以上の薬物とを含む、 がん細胞の 活性または増殖を制御するための、 またはがんを処置するための組成物 （抗がん 組成物）、 C A Fの活性または増殖を制御するための組成物 （抗 C A F組成物）、 および、 C A Fが関与するがんを処置するための組成物、 ならびに、 前記標的化 剤または担体の、 これらの糸且成物の製造への使用に関する。
本発明においてがんは、 任意の悪性腫瘍、 例えば、 線維肉腫、 悪性線維性組織 球腫、 脂肪肉腫、 横紋筋肉腫、 平滑筋肉腫、 血管肉腫、 力ポジ肉腫、 リンパ管肉 腫、 滑膜肉腫、 軟骨肉腫、 骨肉腫、 さらには、 脳腫瘍、 頭頸部癌、 乳癌、 肺癌、 食道癌、 胃癌、 十二指腸癌、 虫垂癌、 大腸癌、 直腸癌、 肝癌、 膝癌、 胆嚢癌、 胆 管癌、 肛門癌、 腎癌、 尿管癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 陰茎癌、 精巣癌、 子宮癌、 卵 巣癌、 外陰癌、 膣癌、 皮膚癌、 白血病、 悪性リンパ腫なども含む。 上記がんは、 C A Fを伴っていてもいなくてもよい。 本発明の一態様において、 がんは、 月干癌 および膝癌以外のがんであることが好ましい。 また、 別の態様において、 がんの 処置は、 肝癌おょぴ膝癌の予防以外のものであることが好ましい。
また、 本発明において C A Fが関与するがんは、 その内部または周囲に C A F が存在する、「C A Fを伴うがん」のみならず、 C A Fとは空間的に離れているが、 C A Fの放出する上述の生理活性物質によりその増殖や活性が促進されているが んをも含む。 したがって、 C A Fが関与するがんは広く悪性 S重瘍を意味し、 上皮 性の悪性腫瘍である任意の癌、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、 胃癌、 十二指腸癌、 虫垂癌、 大腸癌、 直腸癌、 肝癌、 滕癌、 胆嚢癌、 胆管癌、 肛 門癌、 腎癌、 尿管癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 陰茎癌、 精巣癌、 子宮癌、 卵巣癌、 外 陰癌、 膣癌おょぴ皮膚癌、 さらには、 非上皮性の悪性腫瘍である上記以外の任意 の悪性固形腫瘍、 例えば、 線維肉腫、 悪性線維性組織球腫、 脂肪肉腫、 横紋筋肉 腫、 平滑筋肉腫、 血管肉腫、 力ポジ肉腫、 リンパ管肉腫、 滑膜肉腫、 軟骨肉腫、 骨肉腫なども含む。 本発明では有利には、 C A Fの増殖への寄与度の高さなどか ら、 結腸直腸癌、 肺癌、 乳癌、 前立腺癌、 胃癌、 胆管癌、 基底細胞癌などの皮膚 癌から選択される C A Fが関与するがんを処置することができる。 本発明の一態 様において、 C A Fが関与するがんは、 肝癌およぴ睦癌を含まない。 また、 別の 態様において、 C A Fが関与するがんの処置は、 肝癌おょぴ降癌の予防を含まな い。
本発明の抗がん組成物の一態様は、 前記標的化剤または担体とがん細胞の活性 または増殖を制御する薬物とを含み、これをがん細胞に直接送達することにより、 抗がん作用を発揮する。 本発明の抗がん組成物の別の態様は、 前記標的化剤また は担体と C A Fの活性または増殖を制御する薬物とを含み、 これを C A Fに送達 してその活性または増殖を制御することにより、間接的に抗がん作用を発揮する。 本発明の抗がん組成物のさらに別の態様は、 前記標的化剤または担体と、 がん細 胞の活性または増殖を制御する薬物および C A Fの活性または増殖を制御する薬 物のいずれか一方、 またはその両方とを含み、 がん細胞の活性または増殖を制御 する薬物ががん細胞に、 そして C A Fの活性または増殖を制御する薬物が C A F にそれぞれ作用することにより、 二重に抗がん作用を発揮する。 この態様におい ては、 がん細胞の活性または増殖を制御する薬物と C A Fの活性または増殖を制 御する薬物とは同一のものであっても、 それぞれ別の物質であってもよい。
本発明の組成物においては、 標的化剤が標的化機能を発揮する態様で存在する 限り、 担体は、 送達物をその内部に含んでも、 送達物の外部に付着して存在して も、 また、 送達物と混合されていてもよい。 したがって、 投与経路や薬物放出様 式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、 時限崩壌性の材料で被覆してもよく、 また、 適切な薬物放出システムに,組み込ん でもよい。
本発明の組成物は、 経口および非経口の両方を包含する種々の経路、 例えば、 限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、 門脈内、 心室内、 経粘膜、 経皮、 鼻内、 腹腔内、 腫瘍内、 肺内および子宮内等の経路で投 与してもよく、 各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。 力かる剤形および製 剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる （例えば、 標準薬剤学、 渡辺喜照ら編、 南'江堂、 2 0 0 3年などを参照)。
例えば、 経口投与に適した剤形としては、 限定することなく、 散剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 ゲル剤、 シロップ剤などが挙げられ、 また非経口投与に適した剤形としては、 溶液性注射剤、 懸濁性注射剤、 乳濁性注 射剤、 用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。 非経口投与用製剤は、 水性 または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
本発明の標的化剤、担体または組成物は、いずれの形態で供給されてもよいが、 保存安定性の観点から、 好ましくは用時調製可能な形態、 例えば、 医療の現場あ るいはその近傍において、 医師および/または薬剤師、 看護士、 もしくはその他 のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供される。 この場合、 本発 明の標的化剤、 担体または組成物は、 これらに必須の構成要素の少なくとも 1つ を含む 1個または 2個以上の容器として提供され、 使用の前、 例えば、 2 4時間 前以内、 好ましくは 3時間前以内、 そしてより好ましくは使用の直前に調製され る。 調製に際しては、 調製する場所において通常入手可能な試薬、 溶媒、 調剤器 具などを適宜使用することができる。
したがって、 本発明はまた、 標的化剤、 および/または送達物、 および Zまた. は標的化剤以外の担体構成物質を、 単独でもしくは組み合わせて含む 1個または 2個以上の容器を含む担体もしくは組成物の調製キット、 ならびに、 そのような キットの形で提供される担体または組成物の必要構成要素にも関する。 本発明の キットは、 上記のほか、 本発明の標的化剤、 担体おょぴ組成物の調製方法や投与 方法などに関する説明書や、 C D、 D VD等の電子記録媒体などを含んでいても よい。 また、 本発明のキットは、 本発明の標的化剤、 担体または組成物を完成す るための構成要素の全てを含んでレ、てもよいが、 必ずしも全ての構成要素を含ん でいなくてもよい。 したがって、 本発明のキットは、 医療現場や、 実験施設など で通常入手可能な試薬や溶媒、 例えば、 無菌水や、 生理食塩水、 ブドウ糖溶液な どを含んでいなくてもよい。
本発明はさらに、 前記組成物の有効量を、 それを必要とする対象に投与するこ とを含む、 がん細胞の活性または増殖を制御するための、 またはがんを処置する ための方法、 および、 C A Fの活性または増殖を制御するための、 または C A F が関与するがんを処置するための方法に関する。 ここで、 有効量とは、 例えば、 がんを処置するための方法については、 がんの発症を低減し、 症状を軽減し、 ま たは進行を遅延もしくは停止する量であり、 好ましくは、 がんの発症を予防し、 またはがんを治癒する量である。 また、 投与による利益を超える悪影響が生じな い量が好ましい。 力かる量は、 培養細胞などを用いた in vitro試験や、 マウス、 ラット、 ィヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定すること ができ、 このような試験法は当業者によく知られている。 また、 担体に含まれる 標的化剤、 および本発明の方法に用いる薬物の用量は当業者に公知である力、、 ま たは、 上記の試験等により適宜決定することができる。
本発明のがん処置方法の一態様は、 前記標的化剤または担体とがん細胞の活性 または増殖を制御する薬物とを含む抗がん組成物を投与し、 薬物をがん細胞に直 接送達することによりがんを処置する。 本発明のがん処置方法の別の態様は、 前 記標的化剤または担体と C A Fの活性または増殖を制御する薬物とを含む抗がん 組成物を投与し、 薬物を C A Fに送達してその活性または増殖を制御することに より、 間接的にがんを処置する。 本発明のがん処置方法のさらに別の態様は、 前 記標的化剤または担体と、 がん細胞の活性または増殖を制御する薬物および C A Fの活性または増殖を制御する薬物のいずれか一方、 またはその両方とを含む抗 がん組成物を投与し、 がん細胞の活 1 "生または増殖を制御する薬物をがん細胞に、 そして C A Fの活性または増殖を制御する薬物を C A Fにそれぞれ送達すること により、 2つのルートでがんを処置する。 この態様においては、 がん細胞の活个生 または増殖を制御する薬物と C A Fの活性または増殖を制御する薬物とは同一の ものであっても、 それぞれ別の物質であってもよい。
本発明の方法において投与する組成物の具体的な用量は、 処置を要する対象に 関する種々の条件、 例えば、 症状の重篤度、 対象の一般健康状態、 年齢、 体重、 対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、 およぴ治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、 経口おょぴ非経口の両方を包含する種々の経路、 例えば、 経口、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 局所、 直腸、 動脈内、 門脈内、 心室內、 経粘膜、 経皮、 鼻内、 腹腔内、 腫瘍内、 肺内およぴ子宫内等の経路が含まれる。
投与頻度は、 用レ、る組成物の性状や、 上記のような対象の条件によつて異なる 力 例えば、 1日多数回（すなわち 1日 2、 3、 4回または 5回以上）、 1日 1回、 数日毎 （すなわち 2、 3、 4、 5、 6、 7日毎など）、 1週間に数回 （例えば、 1 週間に 2、 3、 4回など）、 1週間毎、数週間毎（すなわち 2、 3、 4週間毎など） であってもよい。
本発明の方法において、 用語 「対象」 は、 任意の生物個体を意味し、 好ましく は動物、 さらに好ましくは哺乳動物、 さらに好ましくはヒトの個体である。 本発 明において、 対象は健常であっても、 何らかの疾患に罹患していてもよいものと するが、 がんの処置が企図される場合には、 典型的にはがんに罹患しているか、 罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、 用語 「処置」 は、 疾患の治癒、 一時的寛解または予防などを目的とする 医学的に許容される全ての種類の予防的おょぴ Zまたは治療的介入を包含するも のとする。 例えば、 「処置」 の用語は、 がんの進行の遅延または停止、 病変の退縮 または消失、 がん発症の予防または再発の防止などを含む、 種々の目的の医学的 に許容される介入を包含する。
本発明はまた、 上記担体を利用した、 がん細胞おょぴ Zまたは C A Fへの薬物 送達方法に関する。 この方法は、 限定されずに、 例えば、 上記担体に送達物を担 持させる工程と、 送達物を担持した担体をがん細胞おょぴ Zまたは C A Fを含む 生物や媒体、 例えば培養培地などに投与または添加する工程とを含む。 これらの 工程は、 公知の任意の方法や、 本明細書中に記載された方法などに従って適宜達 成することができる。 上記送達方法はまた、 別の送達方法、 例えば、 がん細胞お よび Zまたは C A Fが存在する臓器を標的とする他の送達方法などと組み合わせ ることもできる。 また、 上記方法は、 in vitroでなされる態様も、 体内のがん細 胞ぉょぴ Zまたは C A Fを標的とする態様も含む。
本発明を以下の実施例を用いてより具体的に説明するが、 本発明の範囲は、 こ れらの実施例に限定されない。
<実施例 1 > C A Fの分離
大腸癌患者から摘出したがん組織または周辺正常組織 （がん組織から 2 c m以 上離れた部位から分離した正常組織） を 1 X 1 X 1 mmに細断後、 P B Sにて 2 回遠心洗浄し、 ペレットを培養液 （コラゲナーゼ t y p e I ( 2 2 5 U/m 1 )、 ヒアルロニダーゼ (1 25 U'/m 1 )、 1 0%FB S (fetal bovine serum)、 ス トレプトマイシン ' ペニシリ ン含有 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) にて 24時間培養した。 その後、 上清を吸引除去し、 培養液を 1 0%F B S/DMEMに交換して培養を継続した。 培養細胞を CAFのマーカーである a一 S MAおよび間葉系細胞のマーカーであるビメンチンについて F I T C標識 抗体で免疫染色したところ、 がん組織由来の細胞にのみひ一 S MAが検出され、 この細胞が CAFであることが確認された （図 1参照）。 なお、 ビメンチンは、 い ずれの組織に由来する細胞においても陽性であり、 上皮系細胞のマーカーである デスミンは陰両生であった。
<実施例 2 > C A Fの腫瘍増殖活性
実施例 1で得た C A Fまたは正常線維芽細胞を、 6穴プレートに 1 X 1 05個 /ゥエルの密度でそれぞれ播種し、 10%FB SZDMEMにて培養し、 3日目 にコンフルェントの状態で培養液を 0. 5%FBSZDMEMとし、 大腸癌細胞 系 M7609細胞 （2 X 1 05個） を培養液中に播種し、 Ί日間共培養した。 0、 3および 5日目に M7609細胞の細胞数をコールターカウンター （ベックマン 社） で計測した。 結果を図 2に示す。 これにより、 CAFががん細胞の増殖を促 進することが分かる。 く実施例 3 > s i RN Aの作製
ヒ ト HS P 4 7のラットホモログである g ρ 4 6 (GenBank Accession No. M69246) を標的とする 3種類の s i RNA、 および、 コントロールの r a n d o m s i RN Aは、北海道システムサイエンスより購入した。各 s i RNAは 3' 側にオーバーハングを有する 27の塩基からなり、 配列は以下のとおりである。
3' (センス、 配列番号： 1) チセンス、 配列番号： 2) 3， （センス、 配列番号： 3) チセンス、 配列番号： 4)
3' (センス、 配列番号： 5) チセンス、 配列番号： 6)
r a n d om s i RNA： 5 ' - C G AUUC G C U AG AC C GG C UU CAUUGCAG— 3， （センス、 配列番号： 7) チセンス、 配列番号： 8)
また、 蛍光色素 6' 一カルボキシフルォレセィン (6— FAM) を 5' 側に標 識した s i RNAも作製した。 <実施例 4 > s i RNA含有 V A結合リボソームの作製
リボソームとして、 DC— 6—14、 コレステロールおよび DOPEを 4： 3 ： 3のモル比で含むカチオン性リボソーム（Lipotrust、北海道システムサイエンス） を用いた。 1. 5m 1チューブにて 10 nmo 1のリボソームと 20 nmo 1の 全トランスレチノール （以下 「VA」 と記す） とを DM SO中で混合後、 クロ口 ホルムで溶解し、 一度蒸散後、 PBSに懸濁した。 その後、 実施例 3で得た s i RNA ( 10 g /m 1 ) とリボソーム懸濁液とを 1 ： 1 (wZw) の割合で混 合した。 得られたリボソーム懸濁液に含まれる遊離の V Aおよび s i RNAをマ ィク口パーテイションシステム （Sartorion VIVASPIN 5000MWC0 PES)で除去し、 s i RNA含有 VA結合リボソーム （VA— 1 i p— s i RNA) を得た。 添カロ した VA量と精製リボソーム内に含まれる VA量を HP LC法で測定し、 リポソ ームに結合した VAの割合を検討したところ、 VAの大部分 （95. 6±0. 4 2%) がリボソームに結合したことが判明した。 また、 s i RNAのリボソーム への取り込み効率は、 RiboGreen assay (Molecular Probes)で測定したところ、 94. 4 ±3. 0%と高いものであった。 なお、 V Aの一部はリボソーム表面に 露出していた。
上記と同様にして、 s i RNA含有リボソーム （1 i p— s i RNA) および VA結合リボソーム （VA— 1 i p) も作製した。 く実施例 5 >VA— 1 i p— s i RNAの取り込み
6穴プレートに C A Fまたは正常線維芽細胞をそれぞれ 5 X 1 05個 Zゥェル の密度で播種し、 1 0%FB SZDMEMにて培養後、 2日後に、 サブコンフル ェントの状態で無血清培地にて 1回洗浄し、 培地を血清添加 O P T I一 MEMに 置換した。 次に、 実施例 4で得た s i RNA (終濃度 5 O p mo I /m l) を含 有するリポソーム懸濁液を培地に加え、 37 °Cにて 24時間反応させた。 なお、 V A結合リボソームを添加する場合は、 VAの終濃度が 40 nmo 1 /m 1とな るようにした。 また、 s i RNAは 6— FAMで標識した r a n d om s i R NAを用いた。 反応開始後 0、 0. 5、 1、 3、 6、 1 2、 1 8および 24時間 目に、 各細胞種への s i RN Aの取り込みをフローサイトメトリー法で評価した (図 3)。反応終了後、細胞を DAP I (Mo 1 e c u 1 a r P r o b e) およ び Cy 3標識抗ひー SMA抗体で染色し、 s i RNAの局在を分析した （図 4〜 5)。
図 3から明らかなとおり、 V Aを含む担体を用いた場合、 CAFへの s i RN Aの導入速度は、 正常線維芽細胞への導入速度に比べて 3倍以上であり、 24時 間経過した時点でも C A Fへの取り込みはほぼ 100 %維持され、 特異†生ならび に導入効率が極めて高いことが分かった。 また、 図 4は、 s i RNAの局在を評 価するのに用いた代表的な視野を示したものであるが、 これによると、 VA結合 リボソーム （VA— 1 i p - s i RNA-FAM) を用いた場合は、 視野中の全 ての CAFに s i RNAが導入されたのに対し、 VAを含まないリボソーム （1 i p— s i RNA-FAM) を用いた場合は、 視野中の 5個の C A Fのうち、 わ ずか 1個にしか s i RNAが導入されなかった。 さらに、 図 5は、 VAを含まな いリボソーム （1 i p— s i RNA-FAM) では s i RNAが CAFの細胞内 にほとんど局在しないのに対し、 VA結合リボソーム （VA— 1 i p— s i RN A-FAM) ではほとんどの s i RNAが細胞内に局在することを示しており、 s i RNAの CAF内への高効率の導入が VA依存性であることが分かる。 以上 の結果より、 V Aを含む担体が、 C A Fへの物質の取り込みを特異的かつ顕著に 促進することが明らかとなつた。 く実施例 6 >VA— 1 i p— DNRの取り込み
s i RNAの代わりにダウノルビシン （DNR) を含む VA結合リボソームを 用いて、 C A Fへの取り込みを検討した。
DNR封入リボソーム （1 i p— DNR、 DaunoXorae®, 以下リポ化 DNRとも 称する） と、 VAとを、 リボソーム ： VA=1 ： 2のモル比にて DMSO中で混 合後、 クロロホノレムで溶解し、 一度蒸散後、 PBSに懸濁した。 得られたリポソ ーム懸濁液に含まれる遊離の V Aをマイク口パーティションシステム（Sartorion VIVASPIN 5000MWC0 PES) で除去し、 DNR含有 VA結合リボソーム （VA— 1 i p— DNR、 以下 VA結合リポィ匕 DNRとも称する） を得た。 添加した VA量と 精製リボソーム内に含まれる V A量を HP LC法で測定し、 リポソームに結合し た V Aの割合を検討したところ、 VAの大部分 （98%) がリボソームに結合し ていた。 また、 VAの一部はリボソーム表面に露出していた。 なお、 DaunoXome® は、 タエン酸ダウノ/レビシンを、 ジステアロイルホスファチジルコリン （DSP C) とコレステロール (Ch o i) からなるリボソームに封入したもので、 DS PC： Ch o 1 ：クェン酸ダウノルビシンのモル比は 10 : 5 : 1となっている。 チャンパースライドに、 実施例 1で得た C A F、 正常線維芽細胞、 または市販 の線維芽細胞（skin fibroblasts セルズシステム社、製品番号 CS- 2F0- 101) を、 それぞれ 2 X I 04個 Zチャンバ一の密度で播種し、 10%FBSZDMEMに て一晩培養後、 サブコンフルェントの状態で無血清培地にて 1回洗浄し、 培地を 血清添加 OPT I— MEMに置換した。 次に、 1 i p— DNRまたは上記で得た VA- 1 i p— DNRを、 DaunoXome®の濃度として 5 g/m 1含有するリポソ ーム懸濁液を培地に加え、 37。Cにて反応させた。 また、 核は DAP Iで染色し た。反応開始前 （0分)、反応開始の 5分後、 15分後おょぴ 30分後に、 蛍光顕 微鏡下で赤色を呈する DNRの局在を観察した。 結果を図 6〜 9に示す。
VA- 1 i p— DNRを添加した CAFにおいては、 添加後 15分の時点です でに細胞内に DNRの赤色が認められるが、 1 i p_DNR添加群においては細 胞内への DNRの局在は認められなかった （図 6および 9)。 また、正常線維芽細 胞 （図 7) および skin fibroblast (図 8) では、 VA— 1 i p— DNR添加群、 1 i p— DNR添加群とも、 DNRの局在は認められなかった。 以上の結果は、 V A結合担体が、 C A F特異的な薬物送達をもたらすことを示すものである。 く実施例 7 >VA誘導体であるレチノイン酸 （RA) の、 がん細胞おょぴ CAF の標的化
(1) 培養細胞 '
CAF細胞はヒトがん患者の臨床検体よりクローニングして樹立した。 ヒト線 維肉腫細胞である HT—1080 (fibrosarcoma)、および、 ヒト肝癌由来細胞で ある H e ρ G 2細胞は、 American Type Culture Collectionより購入した。 いず れの細胞も、 10%ゥシ胎仔血清（FB S)を加えた DMEM培地（SigmaAldrich) により培養した。 これをトリプシン処理ののち、 4—ゥェルカルチャースライド (BD Falcon #354114) に、 2X 105細胞 _ m 1 となるよう播種して、 37°C、 5%C02条件下でー晚培養した。
(2) V A添加リボソーム製剤の調製
モデル薬物として、 リボソームにダウノルビシンを封入した製剤である、 DaunoXome® (Gilead Sciences, Inc. ) を用！/ヽた。 DaunoXome®【こ (ま、 物ダウノノレ ビシンが 2 mg/m 1の濃度で含まれている。 DaunoXome® 10 1に 10 %F B S添加 DMEMを 990 1加え、 20 μ gZm 1の溶液を調製した。 ここに 1 0 OmMとなるようジメチルスルフォキシド （DMSO) に溶解した全トランス レチノール（VA)または全トランスレチノイン酸（Retinoic acid, RA)を 7. 14μ 1加えて混合し、 それぞれ V Α添加リボソーム製剤 （VA+)、 および RA 添加リボソーム製剤 (retinoic acid+) を得た。 なお、 VAまたは RAの少なく とも一部は、リポソーム表面に露出していた。これらのリボソーム製剤に加えて、 対照群として、 V Aも R Aも含まない DaunoXome®溶液である製剤 （VA— ) も調 製した。
(3) VAまたは R Aリボソーム製剤の投与 カルチャースライドより培地を除去し、 改めて新鮮な 1 0%FB S添加 DME Mを 7 50 μ 1加えた。 ここに、 無処理 （No treatment) カルチャースライドを 除いて、 それぞれ 2 5 0 μ 1の、 VAも RAも含まない DaunoXorae®溶液である製 剤 （VA—）、 V A添加リボソーム製剤 （VA+)、 または R A添加リボソーム製 剤 （retinoic acid+) を加え、 3 7°C、 5 %C02条件下で 1 5分インキュベー トした。 それぞれのカルチャースライドから培地を除去し、 1 m lの PB Sで 2 回洗浄したのち、 l m 1の 4%パラホルムアルデヒド溶液 （和光純薬） を加え、 室温で 5分細胞を固定した。 そして固定液を取り除き、 PB Sで細胞を 3回洗浄 した。 そしてそれぞれのカルチャースライドよりスライドガラスを取り出し、 Prolong Gold (Invitrogen)を滴下したのちカバーガラスをかけて封入した。
(4) 顕微鏡観察
上記スライドガラスを、 蛍光顕微鏡 （キーエンス BZ8000) で観察した。 ダウノ ルビシンは、 細胞の核に取り込まれて、 緑色の励起光下で赤い蛍光を発すること が知られる （図 1 0左上)。 また封入時に用いた Prolong Goldは、 蛍光色素 DA P Iを含んでいる。 DAP Iも細胞の核に結合して、 UV励起光下で青色蛍光を 呈する （図 1 0右上)。 したがって、顕微鏡観察において、 リボソーム製剤の取り 込みが起これば赤おょぴ青の両方の蛍光が観察され、 その結果、 両画像を重ね合 わせると紫色を呈する （図 1 0下)。一方、 リボソーム製剤が細胞内に取り込まれ ない場合は、 DAP I由来の青色蛍光のみ検出される。
上記スライドガラスを、 位相差顕微鏡および上記蛍光顕微鏡で観察した。 上記 スライドガラスを、 位相差顕微鏡により明視野下で撮像した画像、 前記蛍光顕微 鏡により緑色励起光下で撮像した画像、 および UV励起光下で撮像した画像を、 電子情報的に融合した （merge)。 融合した画像を図 1 1〜 1 3に、 観察結果を表 1〜3に示す。 なお、 表中において、 +は蛍光が観察されたことを、 一は蛍光が 観察されなかったことを表す。
CAFにおけるリボソーム製剤の取り込み （図 1 1)
DAP I ダウノルビシン
(青色蛍光） (赤色蛍光） 無処理 (No treatment) + ―
DaunoXome® (VA—) + ―
DaunoXome® +レチノール (VA+) + +
DaunoXome® +レチノィン酸 (Retinoic acid +) + + 表 2 HT— 1080におけるリボソーム製剤の取り込み （図 12)
DAP I ダウノ ビシン
(青色蛍光） (赤色蛍光） 無処理 (No treatment) + 一
DaunoXome® (VA— ) + 一
DaunoXome® +レチノーノレ (VA+) + +
DaunoXome® +レチノ ン酸 (Retinoic acid +) + + 表 3 He pG2におけるリボソーム製剤の取り込み （図 13)
DAP I ダウノ ビシン
(青色蛍光） (赤色蛍光） 無処理 (No treatment) + ―
DaunoXome® (VA—； + 一
DaunoXome® +レチノール （ V A + ) + +
DaunoXome® +レナノィン酸 (Retinoic acid +) + + 結果より明らかなように、 DAP Iの青色蛍光の存在により、 いずれのスライ ドガラスにおレ、ても細胞核の存在が確認された。 ダウノルビシンの赤色蛍光の存 在により、 VAまたは RAを用いたスライドガラスにおいては、 15分という短 いインキュベーションにもかかわらず、 ダウノルビシンが細胞核に局在ィヒした。 これに対して、 VAも RAも用いなかったスライドガラスにおいては、 ダウノル ビシンが細胞核に局在ィ匕しなかった。 このことは、 レチノイドが CAFまたはが ん細胞への標的化剤として使用できることを示している。 く実施例 8 > V A結合リボソーム封入薬剤による C A F特異的な増殖阻害 g p 46に対する s i RNAまたは DNRを含む VA結合リボソームの、 C A F増殖阻害活性を検討した。
(1) VA— 1 i p— s i RNAによる増殖阻害
s i RNAとしては、 実施例 3に記載の配列 Aのものを用いた。 24ゥェルデ イツシュに C A Fまたは正常線維芽細胞をそれぞれ 1 X 104個播種し、 10 % FB S/DMEMにて 24時間培養後、 VA— 1 i p— s i RNAを終濃度 50 pmo 1/mlで添加し、 1時間ィンキュベート後、 細胞を洗浄した。 10 % F B S ZDMEMにて 48時間培養後、 W S T _ 1法にて生細胞数を測定した。 な お、 コントローノレとして、 1 i p— s i RNA, および r a n d om s i RN Aを含む V A結合または非結合リボソーム（VA_ 1 i p - s i RNA (r a n) または 1 i p— s i RNA(r a n))を用い、有意差の評価には U検定を用いた。 結果を図 14に示す。 同図より、 VA— 1 i p— s i RNAを添カ卩した CAFに おいて、 生細胞数は処置前の 50%未満に顕著に減少している一方、 その他の処 置群では、 生細胞数の変化がほとんど認められなかったことが分かる。
(2) VA- 1 i p—DNRによる増殖阻害 '
96ゥヱルディッシュに CAFまたは正常線維芽細胞をそれぞれ 2 X 103個 播種し、 10 % F B S ZDMEMにて 24時間培養後、 実施例 6で得た V A— 1 i p— DNRまたは 1 i p—DNRを DaunoXome®の終濃度として 5 g/m 1 添加し、 15分間暴露させた後、 細胞を洗浄した。 10%FB SZDMEMにて 24時間培養後、 WST—1法にて生細胞数を測定した。 有意差の評価には U検 定を用いた。 結果を図 15に示す。 同図より、 VA— 1 i p— DNRを添加した CAFにおいて、 生細胞数は処置前の約 40%に顕著に減少している一方、 1 i p_DNRを添加した CAFや、 正常線維芽細胞においては、 生細胞数の変化が ほとんど認められなかつたことが分かる。
以上の結果は、 VA結合担体に担持された薬剤が、 CAF特異的な増殖阻害活 性を発揮することを示すものである。 <実施例 9 >VA- 1 i p— DNRのがん細胞内導入効率の検討 ヒト線維肉腫由来細胞株 HT_ 1 0 8 0、 HS 9 1 3 Tもしくは Sw6 84、 ヒ ト乳癌由来細胞株 MCF 7、 ヒ ト骨肉腫由来細胞株 S a o s 2 (いずれも AT C Cより購入） またはヒト肝癌由来細胞株 H u h 7 (J C R B細胞パンクより購 入） を、 チャンパースライド （Falcon社） に 1 X 1 04個 ゥェルの細胞密度で 撒き、 一晚培養後、 1 0%FB S含有 DMEMで洗浄した。 次に、 1 i p— DN R (DaunoXome®) 5 μ g/m 1 (ダウノルビシンとして 8. 8 5 ^αΜ、 リポソ一 ムとして 8 9. 2 5 μΜ)、または実施例 6で得た VA— 1 i p -DNR 5 μ g /m 1 (レチノ一ノレ 1 7 8. 5 μΜを含む） を添加し、 添加から 1 5分後および /または 3 0分後に細胞を洗浄して、 4%ホルムアルデヒ ドで固定した。 PB S で洗浄後、 Prolong Gold (Invitrogen社） で封入し、 蛍光顕微鏡下で DNRの局 在を観察した。
図 1 6〜1 8に示す結果から、 いずれの細胞においても、 VA— l i p -DN R添加群において、 蛍光顕微鏡下で赤色を呈する DNRが添加のわずか 1 5分後 に大部分の細胞の内部に局在しているのに対し、 l i p— DNRは、 30分が経 過してもほとんど取り込まれていないことが分かる。 これは、 VAの結合により リポ化 D N Rの細胞への取り込みが顕著に促進されたことを示すものである。 ま た、 図 1 9に示す結果から、 上記促進効果が、 肉腫および癌腫を含む種々のがん 細胞で認められることが明らかとなった。 く実施例 1 0 >VA結合リポ化ダウノルビシンの抗腫瘍効果の検討
ヒト線維肉腫由来細胞株 HT— 1 0 8 0、 HS 9 1 3 Tまたは S w 6 84を 2 X 1 03個/ゥヱルの細胞密度で 9 6穴プレートに撒き、 ー晚培養後、 実施例 6 で使用した l i p— DNR 5 gZm 1または VA— 1 i p— DNR 5 μ g /m lを添加して 1 5分間培養した。 その後、 細胞を洗浄して細胞外の薬剤を除 去した後、 1 0 % F B S添加 D M E Mで 2 2時間培養した。 WST-1 Cell Proliferation Assay Kit (Cayman Chemical社） を 2時間添加した後、 吸光度を 測定し未処理時の細胞数に対する割合を計算した。 図 2 0に示す結果から、 V A の結合によりリポ化 D NRの抗腫瘍活性が顕著に増大することが分かる。 く実施例 1 1 >in vivoにおける C A F特異的送達
NOD- s c i dマウス （6週齢、 雌、 n=8、 三協ラボサービスより購入） に胃癌細胞株 K AT O— I I I 2 X 106個を皮下接種し、 担癌マウスとした。 接種後 28日目に、 実施例 5で用いた V A結合リボソーム （VA— 1 i p— s i
RNA-FAM) または VAを含まないリボソーム （1 i p— s i RNA-FA
M) を、 VA 200 o l l i p 100nmo l s i RNA 100 μ gの用量で尾静脈投与した。 なお、 この VA結合リボソームは、 投与時すでに リポソーム表面に V Aの一部が露出していた。 投与から 24時間後に腫瘍組織を 採取して組織標本を作製し、これを DAP I (Mo l e c u l a r P r o b e) および Cy 3標識抗 α— SMA抗体で染色して、 s i RNAの局在を分析した。 結果を図 21および 22に示す。
図 21から分かるように、 VAを含まないリボソームでは、 糸且織中に Cy 3の 赤色で示される CAFが存在するにも関わらず、 FAMの緑色で示される s i R NAがほとんど認められないのに対し、 VA結合リボソームでは、 CAFと s i
R N Aとの共局在が認められた。 く実施例 12 > in vivoにおける V A— 1 i p— D N Rの抗腫瘍活性
ヌードマウス （6週齢、 雌、 n=10、 三協ラボサービスより購入） に、 大腸 癌細胞系 M 7609細胞 2 X 106個を皮下接種し、 担癌マウスとした。 接種後 14日目から、 VA— 1 i p— DNRまたは 1 i p— DNRを DaunoXome®の通常 の抗癌投与量の 1ノ40の用量 （マウスの体重 1 gあたり 0. 05 /i g) で、 週 2回尾静脈投与した。 なお、 この VA— 1 i p— DNRは、 投与時すでにリポソ ーム表面に V Aの一部が露出していた。 投与開始後の腫瘍の体積の推移を図 23 に示す。 同図より、 VA結合担体に担持された薬剤が、 腫瘍の増殖を顕著に抑制 することが分かる。
以上の結果は、 本発明の組成物ががんの処置において極めて有効であることを 示すものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. レチノイドを含む、 がん細胞および癌随伴線維芽細胞からなる群から選択 される細胞への標的化剤。
2. レチノィドがレチノールを含む、 請求項 1に記載の標的化剤。
3. 請求項 1または 2の標的化剤を含む、 がん細胞および癌随伴線維芽細胞か らなる群から選択される細胞用の物質送達担体。
4. 標的化剤の含有量が担体全体の 0. 2〜 20重量％である、 請求項 3に記 載の担体。
5. 標的化剤と、 担体の標的化剤以外の構成成分とのモル比が 8 ： 1〜1 : 4 である、 請求項 3または 4に記載の担体。
6. 請求項 1もしくは 2に記載の標的化剤、 または、 請求項 3〜 5のいずれか に記載の担体と、がん細胞および/または癌随伴線維芽細胞の活性または増殖 を制御する薬物とを含む、 抗がん組成物。
7. 請求項 1もしくは 2に記載の標的化剤、 または、 請求項 3〜 5のいずれか に記載の担体と、 癌随伴線維芽細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含 む、 抗癌随伴線維芽細胞組成物。
8. がん細胞の活性または増殖を制御する薬物が抗がん剤である、 請求項 6に 記載の組成物。
9. 癌随伴線維芽細胞の活性または増殖を制御する薬物が、 T G F 、 HG F、 PDGF、 VEGF、 I GF、 MMP、 FGF、 u PA, カテブシンおよび SDF-1からなる群から選択される生理活性物質の活性または産生阻害剤、 細胞活性抑制剤、 増殖阻害剤、 アポトーシス誘導剤、 ならびに、 癌随伴線維 芽細胞によって産生される細胞外マトリクス構成分子、 または該細胞外マト リクス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子のうちの 1つまたはそれ 以上を標的とする s i RNA、 リボザィム、 アンチセンス核酸、 DNAノ R NAキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群か ら選択される、 請求項 6〜 8のいずれかに記載の組成物。
10. 細胞外マトリクス構成分子の産生もしくは分泌に関与する分子が H S P 4 7である、 請求項 9に記載の組成物。
. 薬物と、 標的化剤または担体とを、 医療の現場またはその近傍で混合し てなる、 請求項 6 ~ 1 0のいずれかに記載の組成物。
. 薬物、 標的化剤、 ならびに、 必要に応じて標的化剤以外の担体構成物質 を、 単独でまたは組み合わせて含む 1つまたはそれ以上の容器を含む、 請求 項 6〜 1 1のいずれかに記載の組成物の調製キット。
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