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WO2008102038A2 - Método y producto para genotipado “in vitro” con aplicación en medicina anti-envejecimiento - Google Patents

Método y producto para genotipado “in vitro” con aplicación en medicina anti-envejecimiento Download PDF

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WO2008102038A2
WO2008102038A2 PCT/ES2008/000094 ES2008000094W WO2008102038A2 WO 2008102038 A2 WO2008102038 A2 WO 2008102038A2 ES 2008000094 W ES2008000094 W ES 2008000094W WO 2008102038 A2 WO2008102038 A2 WO 2008102038A2
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WO
WIPO (PCT)
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gene
seq
polymorphism
genetic risk
partial
Prior art date
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PCT/ES2008/000094
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French (fr)
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WO2008102038A3 (es
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Diego TEJEDOR HERNÁNDEZ
Laureano SIMÓN BUELA
Antonio MARTÍNEZ MARTÍNEZ
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Progenika Biopharma SA
Sabiobbi SL
Original Assignee
Progenika Biopharma SA
Sabiobbi SL
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Priority to US12/528,159 priority patent/US20110045997A1/en
Priority to EP08736698A priority patent/EP2128275A4/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations

Definitions

  • the invention is part of the technical-industrial sector of in vitro, extracorporeal diagnosis of biological samples for the detection of gene variants, for example, polymorphisms or genetic mutations, associated with diseases associated with aging, or associated with the response. drug treatments with apl 'cation in anti-aging medicine;
  • the invention relates to an in vitro method for determining the overall genetic risk of a subject to develop a pathology associated with aging from a combination of particular genetic risks.
  • the invention also relates to reagents and kits for the implementation of said method.
  • a genetic analysis can facilitate the very early detection of the particular vulnerability of each individual analyzed and at the same time, offers the possibility of giving a scientific basis to a treatment, which ceases to be empirical and generalist to be totally objective, since it will be formulated according to the principles of pharmacogenetics: a state-of-the-art tool that is being imposed as the last great revolution of modern medicine: the era of personalized medicine.
  • the most relevant diseases associated with aging are those that occupy the first places among the main causes of morbidity and mortality among people over 65, among which are cardiovascular diseases, cancer and osteoporosis. Aging has also been defined as the process resulting from an imperfect protection of the main cellular components against oxidative stress. In addition, as the drugs age, they stay longer in the body due to the decrease in the amount of water, so the prescription of appropriate doses becomes more important depending on the patient's response to the drugs to avoid adverse reactions. to them.
  • Vascular disease Vascular disease is one of the main causes of mortality and morbidity, so it is of great interest to develop risk prediction models to suffer from this type of disease, both to try to know the possible mechanisms that affect the increased risk, such as to be able to intervene early and avoid them. It is important from the perspective of the global assessment of vascular risk, to consider EV as a systemic process pathogenically related to endothelial dysfunction, on which various risk factors act that will determine the variability of interindividual expression (dyslipidemia, blood hypercoagulity, hyperhomocysteinemia) but that in any case will lead to it manifest as an organ disease at different levels: cardiovascular, cerebrovascular, peripheral vascular and / or renal.
  • the predisposition to dyslipidemia or alteration of lipid metabolism also turns out to be very heterogeneous at the molecular level and it is important to perform an evaluation of the whole as it is among each of the representatives of each genetic polymorphism (presence of the A or B allele) that are inherited in an individual, synergies or antagonisms can be established that will determine risks and therefore, very variable and particular vulnerabilities that allow individualizing each case not only in its overall assessment, but also in terms of the therapeutic strategy to be used.
  • Homocysteine is a demethylated amino acid derived from methionine and therefore, an intermediate of the methionine cycle. It is metabolized by methionine remethylation or by cysteine sulfuration. For remethylation, methionine synthetase needs vitamin Bl 2 as a cofactor and folic acid as a substrate. For transsulfurization a cysteatonin beta synthetase (CBS) and vitamin B6 are required as cofactor A defect in remethylation or transulfuration leads to hyperhomocysteinemia.
  • CBS cysteatonin beta synthetase
  • hyperhomocysteinemia even mild to moderate (greater than 12 nmol / mL) is an independent factor for cerebral ischemia, myocardial infarction, peripheral arterial disease and carotid stenosis. Although among its causes those from the external environment (non-genetic) are important, there are important genetic alterations to consider because they determine both the prognosis and the degree of therapeutic response of each case.
  • renin-angiotensin system and adrenergic receptors are also factors that predispose to high blood pressure and cardiovascular disease in general.
  • a state of hypercoagulability should be suspected in individuals with recurrent episodes of deep venous thrombosis, pulmonary embolism, family history of thrombotic events, unusual sites of arterial and venous thrombosis and in children, adolescents or young adults with thrombotic events in general.
  • Endothelial vulnerability The most obvious function of the vascular endothelium is to maintain a dilated vascular tone in the exact proportion to preserve blood pressure at normal values and allow tissue perfusion. This vasodilatory function is exerted by the endothelium through the synthesis and secretion of relaxation factors such as nitric oxide (ON).
  • the endothelium is an important element to maintain the balance with platelets and coagulation factors and thus maintain the fluidity of the blood in what we call homeostatic balance (hemostasis) since imbalance in one way or another will cause hemorrhage or thrombosis.
  • Most of the factors capable of attacking and damaging the vascular endothelium come from the external environment and among them, one of the most damaging is smoking. However, there are several genetic polymorphisms that determine a greater vulnerability to this damage and therefore contribute significantly to the increase in overall vascular risk. Even these polymorphisms aggravate the damage that would already cause the classic non-genetic risk factors such as smoking itself.
  • Oxidative stress is another factor that can also greatly influence the best or worst response at the endothelial level and vascular level in general, thus, another important pillar to consider in the molecular etiopathogenesis of general vascular disease, is the degree of defensive potential against oxidative stress.
  • Ischemic heart disease and acute myocardial infarction can be the expression of a process that begins with an excess of free radicals, which initiate the atherosclerotic process due to damage to the vascular wall, causing penetration into the subendothelial space of low density lipoproteins (LDL) and therefore to atherosclerotic plaque.
  • LDL low density lipoproteins
  • This risk refers to the susceptibility of polygenic and multifactorial basis, not to the monogenic variants of hereditary cancer, so it is recommended to adapt each risk to the personal clinical situation and family history of each case. Risk of adverse drug reactions
  • the authors of the present invention have developed a method to determine the overall genetic risk of a subject to develop a pathology associated with aging. This method is based on the combination of particular genetic risks to develop common pathologies associated with aging. These particular genetic risks are determined from the results obtained from the Simultaneous genotyping of certain gene variants, particularly SNPs associated with said pathologies associated with aging and, whose main objective, is their use in anti-aging medicine.
  • Aging is a multifactorial process that takes place during the last stage of the life cycle and is characterized by the progressive decrease of functional capacity in all tissues and organs of the body, and the consequent ability to adjust to environmental stimuli.
  • the life cycle is a specific characteristic, defined by a maximum potential duration between conception and death and a series of stages during which ontogenetic processes take place: growth, development, maturation and involution.
  • Ontogenetic processes the sequence in which they occur and their phenotypic expression are genetically programmed and environmentally limited.
  • the sequential and differential expression of the same set of genes in specific environments originates the continuum of successive phenotypes that correspond to the same individual throughout their life cycle.
  • the involuntary processes associated with aging are manifested at the molecular, cellular and functional level with an evident expression in the visible phenotype.
  • Anti-aging medicine is the part of medicine based on the application of scientific research and technologies for the prevention and early treatment of diseases related to age or caused by aging, with the aim of extending the hope of life and at the same time improve the quality of life.
  • the inventors of the present invention have developed a method that allows Global assessment of the genetic risk of a subject to suffer a pathology associated with aging from the calculation of the particular genetic risk to develop certain pathologies associated with aging, in particular, from the calculation of the following particular genetic risks: 1. Vascular risk;
  • the main objective of the present invention to develop an in vitro method to determine the overall genetic risk of a subject to develop a pathology associated with aging from a combination of particular genetic risks, in particular, vascular risk, risk oncogenic, risk of osteoporosis, risk of environmental stress and oxidative damage, and risk of adverse drug reactions.
  • the invention relates to an in vitro method for determining the overall genetic risk of a subject to develop a pathology associated with aging from a combination of particular genetic risks, hereinafter method of the invention, which understands:
  • iii) determine said global genetic risk based on the value of each particular genetic risk obtained in stage ii).
  • gene variant includes mutations, polymorphisms and allelic variants.
  • a genetic variant is found among individuals within populations and among populations within species.
  • the authors of the present invention have selected a total of 69 human gene variants from 49 human genes associated with pathologies associated with aging (Table 1); however, additional, different human gene variants can be analyzed in the same genes or in other human genes, associated with pathologies associated with aging.
  • the term "gene mutation” refers to a variation in the nucleotide sequence of a nucleic acid where each possible sequence is present in a proportion less than 1% in a population.
  • polymorphism refers to a variation in the nucleotide sequence of a nucleic acid where each possible sequence is present in a proportion equal to or greater than 1% in a population; In a particular case, when said variation is the nucleotide sequence occurs in a single nucleotide (A, C, T or G) it is called SNP.
  • allelic variant or “allele” are used interchangeably in the present description and refer to a polymorphism that occurs in the same locus in the same population.
  • the nucleic acid is extracted from a biological sample of the subject to analyze.
  • nucleic acid eg, DNA
  • a biological sample containing it from a subject such as a human being
  • any biological sample containing nucleic acid can be used for the practice of the invention; by way of illustration, not limitation, said biological sample may be a sample of blood, saliva, plasma, serum, secretions, tissue, etc.
  • nucleic acid Once the nucleic acid is obtained, those regions of said nucleic acid containing the gene variants to be identified are amplified.
  • gene variant includes polymorphisms (eg, SNPs), mutations and allelic variants.
  • SNPs polymorphisms
  • allelic variants eg, SNPs
  • Said oligonucleotide primers are described in detail below, form part of the present invention and constitute an additional aspect thereof.
  • said amplification products can be optionally marked during the amplification reaction, to obtain labeled amplification products, which contain the gene variants to be identified.
  • the DNA regions containing the gene variants to be identified are subjected to an amplification reaction to obtain amplification products containing the gene variants to be identified.
  • amplification reaction any technique or method that allows the amplification of all DNA sequences containing the gene variants to be identified can be used, in a particular embodiment, said sequences are amplified by multiplex amplification, which allows simultaneously genotyping said human gene variants to be identified. present in one or more genes.
  • pairs of oligonucleotide primers or primers capable of amplifying said target DNA regions containing the gene variants to be identified as explained above is required.
  • Virtually any pair of oligonucleotide primers that allow specific amplification of said target DNA regions can be used, preferably pairs of oligonucleotide primers that allow such amplification in the least possible number of amplification reactions.
  • pairs of oligonucleotide primers and the appropriate conditions all the target DNA regions necessary for the genotyping of said gene variants to be analyzed can be amplified with the minimum possible number of reactions.
  • said oligonucleotide primers are selected from the oligonucleotide primers identified as SEQ ID NO: 277-278, SEQ ID NO: 285-319, SEQ ID NO: 321-326, SEQ ID NO: 333-340, SEQ ID NO: 343-356, SEQ ID NO: 359-362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369-371, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 377-381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385-402, and SEQ ID NO: 404-414.
  • the method of the invention comprises the step of simultaneously genotyping multiple human gene variants present in one or more genes of a subject associated with an aging-associated pathology.
  • said simultaneous genotyping step is performed by an analysis with DNA-chips, for example, using an appropriate DNA-chip, such as the DNA-chip provided by this invention (DNA-chip of the invention , whose characteristics are mentioned below), that is, by hybridization with specific probes for said human gene variants.
  • said genotyping can be performed by gene sequencing of said amplification products.
  • the marking of the amplification products can be carried out in order to be able to subsequently detect the hybridization between the probes present in the DNA-chip of the invention, immobilized in the support, and the target DNA fragments containing the gene variants to be detected.
  • the marking of the amplification products can be carried out by conventional methods, for example, by incorporating a labeled nucleotide during the amplification reaction or by using labeled primers.
  • Said marking can be direct, for which fluorophores can be used, for example, Cy3, Cy5, fluorescein, alexa, etc., enzymes, for example, alkaline phosphatase, peroxidase, etc., radioactive isotopes, for example, 33P, 1251, etc., or any other marker known to the person skilled in the art.
  • fluorophores for example, Cy3, Cy5, fluorescein, alexa, etc.
  • enzymes for example, alkaline phosphatase, peroxidase, etc.
  • radioactive isotopes for example, 33P, 1251, etc., or any other marker known to the person skilled in the art.
  • said marking can be indirect through the use of chemical, enzymatic methods, etc .
  • the amplification product may incorporate a member of a specific binding pair, for example, avidin or streptavidin conjugated with a fluorochrome (label), and the probe binds to the other member of the specific binding pair, for example, biotin (indicator), the reading being carried out by fluorimetry, etc.
  • the amplification product may incorporate a member of a specific binding pair, for example, an anti-digoxigenin antibody conjugated to an enzyme (label), and the The probe binds to the other member of the specific binding pair, for example, digoxigenin (indicator), etc., the enzyme substrate is transformed into a luminescent or fluorescent product and the reading is carried out by chemo-luminescence, fluorimetry, etc.
  • the marking of the amplification product is carried out by using a nucleotide directly or indirectly labeled with one or more fluorophores. In another particular embodiment, the marking of the amplification product is carried out by using primers directly or indirectly labeled with one or more fluorophores.
  • said amplification products are subjected to a fragmentation reaction to obtain fragmentation products containing the gene variants to be identified, and, in case said amplification products would not have been previously marked in the amplification stage, said fragmentation products containing the gene variants to be identified can be labeled.
  • the amplification products are subsequently subjected to a fragmentation reaction in order to increase the efficiency of subsequent hybridization, thereby obtaining fragmentation products containing the gene variants to be identified.
  • the fragmentation of the amplification products can be carried out by any conventional method, for example, by contacting the amplification products with a Dnasa.
  • the resulting products of the fragmentation reaction undergo a very direct marking using, for example, fluorinated forums, enzymes, radioactive isotopes, etc. or indirectly using, for example, specific binding pairs that incorporate fluorinated forums, enzymes, etc., by conventional methods.
  • the amplification products have not been previously labeled during the amplification reaction, and the fragmentation products are subjected to direct or indirect marking with one or more markers, for example, one or more fluorophores, although they can be used. other markers known to those skilled in the art.
  • the fragmentation products are contacted with probes capable of detecting the corresponding gene variants under conditions that allow hybridization between said fragmentation products and said probes.
  • Said probes are deposited on a solid support following a predetermined arrangement, constituting a DNA-chip (DNA-chip of the invention), whose design and development must meet a series of requirements in order to be used in the method of the invention in terms of design of the probes, the number of probes to be deposited per gene variant to be detected, the number of replicas of probes to be deposited, the distribution of the probes on the support, etc.
  • DNA-chip of the invention The characteristics of said DNA-chip of the invention and of said probes are described in detail below.
  • Hybridization of fragmentation products with probes capable of detecting the corresponding gene variants deposited on a support is carried out by conventional methods using devices conventional.
  • hybridization is carried out in an automatic hybridization station.
  • the fragmentation products are contacted with said probes (DNA-chip of the invention) under conditions that allow hybridization between said fragmentation products and said probes.
  • Stable hybridization conditions allow the strand and appropriate length of the probes to be established in order to maximize discrimination, as mentioned below.
  • the image is captured and quantified.
  • the image of the hybridized and developed DNA-chip is collected with an appropriate device, for example, a scanner, then proceeding to quantify the absolute fluorescence values of each probe as well as the background noise. Therefore, in a particular embodiment, after the hybridization, or after the post-hybridization amplification or ligation reactions, the hybridized and developed DNA-chip is introduced into a scanner where it is subjected to a scan to quantify the intensity of the marking in the points where hybridization has occurred.
  • said scanner is a confocal fluorescence scanner.
  • the DNA-chip is introduced into the scanner and the signal emitted by the marking is scanned when it is excited by a laser, quantifying the intensity of the points where hybridization has occurred.
  • said scanner is a white light scanner.
  • Illustrative, non-limiting examples of scanners that can be used according to the present invention are Axon, Agilent, Perkin Elmer, etc. scanners.
  • the data is analyzed and interpreted, which can be carried out by using any appropriate genotyping software, such as the genotyping software referred to in Example 1, which uses the functions described in section 1.3.5 of said Example 1, and by using the functions developed by the inventors to calculate the corresponding particular genetic risks and, from them, the overall genetic risk, as described in detail below.
  • the analysis of the data and its interpretation is carried out, in general, through the use of computer programs (software).
  • the inventors have developed a sequential method of processing and interpreting the experimental data generated by the DNA-chip of the invention that allows detecting each of the Gene variants with sensitivity, specificity and reproducibility, and calculate the values of the corresponding particular genetic risks and, from them, the global genetic risk, using algorithms based on the genotype of the processed sample.
  • the algorithms and computer software developed by the inventors allow to facilitate and automate the application of the method of the invention.
  • the execution of the algorithms and computer software developed by the inventors to sequentially process and interpret the experimental data generated by the DNA-chip of the invention comprises carrying out a series of steps to characterize each of the gene variants of interest, namely: - first, the absolute intensity values of all probes are subtracted from their own background noise; next, the corresponding replicas are grouped to each of the 4 probes used to characterize each gene variant; the average intensity value for each of the 4 probes is calculated using the bounded average of the replicas to eliminate the aberrant points; known the average intensity values for each of the probes, the ratio 1 and ratio 2 are calculated, where:
  • Ratio 1 is the proportion of the bounded average of the intensities of the 10, 8 or 6 replicas of the probe 1 that detects the gene variant A divided by the bounded average of the 10, 8 or 6 replicas of the probe 1 that detects the Gene variant A plus the bounded average of the 10, 8 or 6 replicas of probe 2 that detects gene variant B and can be calculated using the equation:
  • Ratio 2 is the proportion of the bounded average of the intensities of the 10,
  • Average probe intensity 3 Average probe intensity 4
  • ratios ratio 1 and ratio 2 are replaced in three linear functions, which characterize each of the three possible genotypes:
  • AA represents the genotype of a homozygous subject for gene variant A
  • AB represents the genotype of a heterozygous subject for genetic variants A and B;
  • BB represents the genotype of a homozygous subject for the B gene variant
  • Function 1 is the Linear Function that characterizes patients with the AA genotype and consists of a linear combination of the variables ratio 1 and ratio 2;
  • Function 2 is the Linear Function for the AB genotype and consists of a linear combination of the variables ratio 1 and ratio 2
  • Function 3 is the Linear Function for the BB genotype and consists of a linear combination of the variables ratio 1 and ratio 2;
  • linear combinations are formed by constants and cofactors that accompany the variables ratio 1 and ratio 2; and the function that presents a higher absolute value determines the genotype presented by the patient for the gene variant analyzed.
  • genotyping of the multiple human gene variants or polymorphisms present in one or more genes of a subject associated with a pathology associated with aging in said biological sample is performed by gene sequencing. Once these gene variants have been genotyped, each particular genetic risk is determined. Depending on whether the particular genetic risk to be calculated is formed by a combination of partial particular risks, said particular genetic risk is calculated by applying different functions, as described below.
  • the determination (calculation) of the particular genetic risk (step ii) of the method of the invention) comprises:
  • RGP represents the particular genetic risk to be calculated
  • x represents the normalized value of the genotype characterized for a gene variant in a sample, in relation to the particular genetic risk to be calculated
  • LS ⁇ represents the upper limit value of the range of normalized values assigned to each gene variant, in relation to the particular genetic risk to be calculated; and n is the number of gene variants analyzed in relation to the particular genetic risk to be calculated; or alternatively
  • RGP represents the particular genetic risk to be calculated
  • RGPPi has the previously mentioned meaning;
  • x ⁇ represents the normalized value of the genotype characterized for a gene variant in a sample, in relation to the particular partial genetic risk to be calculated;
  • LS ⁇ represents the upper limit value of the range of normalized values assigned to each gene variant, in relation to the particular partial genetic risk to be calculated; and n is the number of gene variants analyzed in relation to the particular partial genetic risk to be calculated; Y
  • RGPP is the number of partial particular genetic risks analyzed in relation to the partial partial genetic risk to be calculated.
  • these variants are grouped by particular genetic risks and partial particular genetic risks, that is, the results of the analysis of the gene variants [mutations, polymorphisms (eg, SNPs) , allelic variants, etc.] are grouped by particular genetic risks and, where appropriate, by partial particular genetic risks, in order to calculate the particular genetic risk to each pathology associated with aging.
  • said particular genetic risk is selected from the group formed by a particular genetic risk associated with vascular disease (vascular risk), a particular genetic risk associated with osteoporosis, a particular genetic risk associated with carcinogenesis and a particular genetic risk associated with environmental stress and oxidative damage.
  • said vascular risk is determined based on the partial particular genetic risks selected from the group formed by partial particular genetic risk associated with lipid metabolism, partial partial genetic risk associated with thrombosis, partial partial genetic risk associated with stroke, associated partial particular genetic risk. to arterial hypertension and particular partial genetic risk associated with endothelial vulnerability.
  • each genotype of each gene variant is normalized or scored.
  • said values will be included in a range of normalized values, in which the genotype (s) most at risk of suffering a certain pathology will comprise (n) the value of the upper limit of said range of values, and the / the genotypes / s with the lowest risk to suffer a certain pathology will include (n) the value of the lower limit of said range of values.
  • a normalized value corresponding to said genotype is assigned depending on the genotype present in the analyzed sample.
  • the particular genetic risks are calculated according to equation [1] or [2] depending on whether the particular genetic risk to be calculated is formed by a combination of partial particular risks.
  • the particular genetic risk associated with osteoporosis, the particular genetic risk associated with carcinogenesis and the particular genetic risk associated with environmental stress and oxidative damage are calculated by equation [1], while in another particular embodiment, the risk Vascular is determined using equation [2] based on the partial particular genetic risks selected from the group formed by partial particular genetic risk associated with lipid metabolism, partial partial genetic risk associated with thrombosis, partial partial genetic risk associated with stroke, particular genetic risk partial associated with arterial hypertension and particular partial genetic risk associated with endothelial vulnerability, so that, in this case, the particular genetic risk is calculated based on the values of the different partial particular genetic risks analyzed as shown in Example 1 that It accompanies this description.
  • vascular risk The particular genetic risk associated with suffering from vascular risk or suffering from vascular disease (EV) (vascular risk) is, in all its magnitude, one of the main causes of mortality and morbidity in almost all of the world, that is why it is of great interest development of risk prediction models to suffer from such diseases, both to try to know the possible mechanisms that affect the increased risk, and to be able to intervene early and avoid them.
  • EV vascular disease
  • the method of the invention analyzes genetic risk factors among those genes with influence at the level of the structural and functional conservation of the vascular endothelium and among those involved in the defense mechanisms against oxidative stress.
  • dyslipidemia refers to various pathological conditions whose only common element is an alteration of lipid metabolism, with its consequent alteration of blood lipid and lipoprotein concentrations.
  • the predisposition to dyslipidemia turns out to be very heterogeneous at the molecular level and it is important to carry out an evaluation of the whole set since, between each of the alleles or variants of each genetic polymorphism that are inherited in an individual, synergies or antagonisms can be established that will determine risks and therefore, very variable and particular vulnerabilities that allow individualizing each case not only in its overall assessment, but also in terms of the therapeutic strategy to be used.
  • a state of hypercoagulability should be suspected in individuals with recurrent episodes of deep venous thrombosis, pulmonary embolism, family history of thrombotic events, unusual sites of arterial and venous thrombosis and in children, adolescents or young adults with thrombotic events in general.
  • This section includes several gene variations that can act synergistically (potentiating the pathogenic effect) or antagonistic (providing natural compensation).
  • hemodynamic status is analyzed, specifically assessing the renin-angiotensin system and adrenergic receptors that basically predispose to high blood pressure and cardiovascular disease in general. Its assessment would also allow objectively defining, on molecular basis, the most effective therapeutic strategy to achieve control in each case.
  • the most obvious function of the vascular endothelium is to maintain a dilated vascular tone in the exact proportion to preserve blood pressure at normal values and allow tissue perfusion. This vasodilatory function is exerted by the endothelium through the synthesis and secretion of relaxation factors such as Nitric Oxide (ON).
  • the endothelium is an important element to maintain the balance with platelets and coagulation factors and thus maintain the fluidity of the blood in what we call homeostatic balance (Hemostasis) since imbalance in one way or another will cause bleeding or thrombosis.
  • HCT homocysteine
  • methionine synthetase needs vitamin B12 as a cofactor and folic acid as a substrate.
  • CBS cysteatonin beta synthetase
  • vitamin B6 vitamin B6
  • a defect in remethylation or transsulfurization leads to hyperhomocysteinemia.
  • hyperhomocysteinemia even mild to moderate (greater than 12 nmol / mL)
  • myocardial infarction is an independent factor for cerebral ischemia, myocardial infarction, peripheral arterial disease and carotid stenosis and hence the importance of taking it into account in vascular risk assessment.
  • non-genetic are important, there are important genetic alterations to consider because they determine both the prognosis and the degree of therapeutic response of each case.
  • Oxidative stress is another factor that can also greatly influence our best or worst response at the endothelial level and at the vascular level in general. For this reason, this factor can be considered in the molecular etiopathogenesis of general vascular disease, and this is none other than the degree of defensive potential against oxidative stress.
  • Ischemic heart disease and acute myocardial infarction can be the expression of a process that begins with an excess of free radicals, which initiate the atherosclerotic process due to damage to the vascular wall, causing penetration into the subendothelial space of low density lipoproteins (LDL) and therefore to atherosclerotic plaque.
  • LDL low density lipoproteins
  • An excess of free radicals usually starts the damage to the vascular wall and LDL cholesterol is involved in this process.
  • a decrease in the incidence of cardiovascular diseases has been demonstrated with individual antioxidant supplements.
  • RGG represents the overall genetic risk to be calculated
  • RGP represents the value calculated for each particular genetic risk analyzed in relation to the overall genetic risk to be calculated, and is calculated using equations [1] or [2] previously described; and n is the number of particular genetic risks analyzed in relation to the overall genetic risk to be calculated.
  • the method provided by this invention to determine the overall genetic risk of a subject to develop a pathology associated with aging comprises calculating or determining the following particular genetic risks: 1. Particular genetic risk associated with suffering from vascular disease (vascular risk);
  • vascular risk is determined based on the particular partial genetic risks selected from the group formed by partial particular genetic risk associated with lipid metabolism, partial partial genetic risk associated with thrombosis, partial partial genetic risk associated with stroke, partial partial genetic risk associated with arterial hypertension and partial partial genetic risk associated with endothelial vulnerability.
  • said particular partial genetic risk associated with lipid metabolism is determined based on the gene variants selected from the group consisting of -75 G> A of the APOAl gene, Arg3480Trp of the APOB gene, Arg3500Gln of the APOB gene , Arg3531Cys of the APOB gene, Cysl l2Arg of the APOE gene, Argl 58Cys of the APOE gene, Arg451Gln of the CETP gene, Taq ⁇ B B1> B2 of the CETP gene, Glnl92Arg of the PON ⁇ gene, Gly595Ala of the SREBF2 gene, Leu7Pro of the same NP gene combinations .
  • said particular genetic risk associated with thrombosis is determined based on the gene variants selected from the group consisting of 4G> 5G of the PAIl gene, Leu33Pro of the ITGB3 gene, 20210 G> A of the FII gene, Arg506Gln of the FV gene Leiden, Val34Leu of the Fl 3Al gene, Ala222Val of the MTHFR gene, 833 T> C of the CBS gene, 844ins68 of the CBS gene, -455 G> A of the FGB gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with stroke is determined based on the gene variants selected from the group consisting of 4G> 5G of the PAIl gene, Leu33Pro of the ITGB3 gene, 20210 G> A of the FII gene, Arg506Gln of the FV gene Leiden, Val34Leu of the Fl 3Al gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with arterial hypertension is determined based on the gene variants selected from the group formed by Gly389Arg of the ADRBl gene; Gln27Glu of the ADRB2 gene, GlylóArg of the ADRB2 gene, Met235Thr of the AGT gene, 1 166 A> C of the AGTRl gene, 393 T> C (Ilel31 Ile) of the GNAS gene, 825 OT (Ser275Ser) of the GNB3 gene, intron 16 ins / del of the ACE gene, Trp64Arg of the ADRB3 gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with endothelial vulnerability is determined based on the gene variants selected from the group consisting of 5A> 6A of the MMP3 gene, -786 T> C of the NOS3 gene, Glu298Asp of the NOS3 gene, Ala222Val del MTHFR gene, 833 T> C of the CBS gene, 844ins68 of the CBS gene, Pro319Ser of the GJ A4 gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with osteoporosis is determined based on the variants genes selected from the group consisting of 1546 G> T of the COLlAl gene, IVS 1-397 T> C p> P (PvuII) of the ESRl gene, t »B of the VDR gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with carcinogenesis is determined based on the gene variants selected from the group consisting of -34 A> G of the CYP 17Al gene, Ile462Val of the CYPl Al gene, T3801C of the CYPlAl gene, Leu432Val of the gene CYPlBl, Allele * 4 (Asn453Ser) of the CYPlBl gene, 1558 C> T of the CYP 19A1 gene, Vall 58Met (Allele * 2) of the COMT gene, 331 G> A of the PGR gene, IVSl -397 T> C p> P ( PvuII) of the ESRl gene, t »B of the VDR gene, Ala49Thr of the SRD5A2 gene, Val89Leu of the SRD5A2 gene, Ala541Thr of the ELAC2 gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with environmental stress and oxidative damage is determined based on the gene variants selected from the group formed by Cys326Ser of the OGGl gene, Alai 6VaI of the SOD2 gene, Arg213His of the SULTlAl gene, present> null GSTMl, present> null GSTTl, IlelO5Val of the GSTPl gene, Alai 14VaI of the GSTPl gene, Vall58Met (Allele * 2) of the COMT gene, -174 OG of the IL6 gene, -1082 G> A of the ILlO gene, R64Q of the NAT2 gene, 282 C> T (Y94Y) of the NAT2 gene, I1 14T of the NAT2 gene, 481OT (L161L) of the NAT2 gene, R197Q of the NAT2 gene, K268R of the NAT2 gene, G286E of the NAT2 gene and combinations thereof.
  • said particular genetic risk associated with drug response is determined based on the gene variants selected from the group consisting of R64Q, 282 OT (Y94Y), Il 14T, 481OT (Ll 61 L), R197Q, K268R and G286E of the NAT2 gene; Argl44Cys (allele * 2) and Ile359Leu (allele * 3) of the CYP2C9 gene; 681 G> A (Pro227Pro) (allele * 2) of the CYP2C19 gene; 2549 A> of (allele * 3), 1847 G> A (allele * 4) and 1707 of> T (allele * 6) of the CYP2D6 gene; and combinations thereof.
  • the method of the invention comprises simultaneously genotyping multiple human gene variants or polymorphisms present in one or more genes of a subject associated with a pathology associated with aging in a biological sample of said subject, wherein said gene variant [mutation, polymorphism (eg, SNP) or allelic variation] to genotype selects from the group formed by the 16 ins / intron polymorphism of the ACE gene; the Gly389Arg polymorphism of the ADRBl gene; Gln27Glu and GlylóArg polymorphisms of the ADRB2 gene; the Trp64Arg polymorphism of the ADRB3 gene; Met235Thr polymorphism of the AGT gene; polymorphism 1 166 A> C of the AGTRl gene; the polymorphism -75 G> A of the APOAl gene; the polymorphisms Arg3480Trp, Arg35OOGln, and Arg3531Cys of the APOB gene; the Cys
  • the method of the invention thus constitutes an extracorporeal in vitro method for the simultaneous, sensitive, specific and reproducible genotyping of multiple human gene variants present in different genes, associated with pathologies associated with aging.
  • the method of the invention allows identification of nucleotide changes, insertions, deletions, etc. and determine the genotype of a subject for gene variants related to pathologies associated with aging analyzed.
  • the invention relates to DNA-chip, hereinafter
  • DNA-chip of the invention comprising a support on which a plurality of probes useful for detecting human gene variants present in one or more genes (associated with pathologies associated with aging are deposited.
  • said probes are selected of the group formed by the probes identified as SEQ ID NO: 1-13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17-44, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 53-128 SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132-172, SEQ ID NO: 181-200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210,
  • the DNA-chip of the invention comprises a support on which a plurality of probes useful for detecting human gene variants present in one or more genes associated with pathologies associated with aging are deposited.
  • the DNA chip of the invention comprises 4 probes, of which 2 probes detect a first gene variant and the other 2 detect a second gene variant, wherein the number of replicates of each of said probes is 10 , 8 or 6 replicas and the two probes do not have to be the same.
  • These probes are deposited following a specific pattern and distributed homogeneously between the 2 areas that constitute the DNA-chip but not grouped by gene variant to be detected, that is, they are distributed along the chip's length and width and also not grouped within a Same gene variant.
  • the DNA-chip of the invention may also contain, if desired, oligonucleotides deposited on the support useful as positive and negative controls of amplification and / or hybridization reactions.
  • the DNA-chip of the invention comprises two pairs of probes to detect each genetic variation.
  • Each pair of probes consists of a specific probe for the detection of a genetic variation (e.g., the A allele) and another probe designed for the detection of another genetic variation (e.g., the B allele).
  • the base that differs between allele A and B base to be interrogated
  • the design becomes completely equivalent considering the first nucleotide as the central position that is different in the normal sequence with respect to the mutated sequence.
  • the DNA-chip of the invention comprises 10 replicates of each of the 4 probes used to detect each genetic variation; In another particular embodiment, the DNA-chip of the invention comprises 8 replicates of each of the 4 probes used to detect each genetic variation; and, in another particular embodiment, the DNA-chip of the invention comprises 6 replicates of each of the 4 probes used to detect each genetic variation.
  • the arrangement (placement) of the probes in the holder is predetermined.
  • the probes deposited on the support although maintaining a By default, they are not grouped by genetic variation but have a random distribution, which, if desired, can always be the same.
  • probes of gene variants to discriminate between gene variants (eg, allele A and allele B) depends on the hybridization conditions, the sequence flanking the mutation and the secondary structure of the sequence in the one that wants to detect polymorphism. Stable hybridization conditions allow the strand and appropriate length of the probes to be established in order to maximize discrimination. Starting from 25 nucleotide probes that detect a genetic variation (eg, the A allele) and another genetic variation (eg, the B allele) in both strands (sense strand and antisense strand), an average of 8 is required probes tested experimentally to stay with the two final couples.
  • the probes designed interrogating both strands with typically comprised lengths between 19 and 27 nucleotides, and the hybridization temperature varies between 75 0 C and 85 ° C.
  • the DNA-chip of the invention may optionally contain oligonucleotides deposited on the support useful as positive and negative controls of amplification and / or hybridization reactions.
  • the DNA-chip of the invention comprises oligonucleotides deposited on the support useful as positive and negative controls of hybridization reactions.
  • each of the sub-arrays, which constitute a DNA-chip is flanked by external hybridization controls that allow the points on the support to be easily located.
  • the DNA-chip has two external hybridization controls marked, for example, with a fluorophore (eg, Cy3, Cy5, etc.), which are used to evaluate the quality of hybridization in both channels.
  • a fluorophore eg, Cy3, Cy5, etc.
  • nucleotide sequence of the external control is that identified in SEQ ID NO: 415 (CEH), and oligonucleotide sequences for detection are those identified in SEQ ID NO: 416 and SEQ ID NO: 417.
  • the support on which the plurality of probes are deposited can be any solid surface on which oligonucleotides can be attached.
  • said support can be a non-porous support, for example, a glass, silicon, plastic, etc. support, or a porous support, for example, membranes (nylon, nitrocellulose, etc.), microparticles, etc. .
  • said support is a glass slide.
  • the probes are immobilized (bound) on the support using conventional oligonucleotide immobilization techniques on the surface of the supports. These techniques depend, among other factors, on the nature of the support used [porous (membranes, microparticles, etc.) or non-porous (glass, plastic, silicon, etc.)]. In general, the probes can be immobilized on the support by the use of non-covalent immobilization techniques or by the use of immobilization techniques based on the covalent attachment of the probes to the surface of the support by chemical procedures.
  • non-porous supports eg, glass, silicon, plastic, etc.
  • reactive groups eg, amino, aldehyde, etc.
  • a member of a specific binding pair eg, avidin, streptavidin, etc.
  • the immobilization of the probes in the support can be carried out by conventional methods, for example, by techniques based on the in situ synthesis of the probes on the support itself (eg, photolithography, direct chemical synthesis, etc.), or by techniques based on the use of robotic arms that deposit the corresponding presynthesized probe (contactless printing, contact printing, etc.), etc.
  • the arrangement (placement) of the probes in the holder is predetermined.
  • the probes deposited on the solid support, while maintaining a predetermined arrangement they are not grouped by genetic variation but have a random distribution, which, if desired, can always be the same.
  • the support is a glass slide, and, in this case, the probes, in the set number of replicas (6, 8 or 10), are printed on previously treated glass slides, for example, aminosilanized, using automatic DNA-chip production equipment by deposition of the oligonucleotides on the glass slide ("microarrayer") under appropriate conditions, for example, by cross-linking with ultraviolet and baking radiation (80 0 C), keeping humidity controlled and temperature during the deposition process, typically 40-50% relative humidity and 20 0 C temperature.
  • ultraviolet and baking radiation 80 0 C
  • the replicas are distributed on the printing plates, which contain the oligonucleotides in solution, so that they are printed by a number of different tips equal to half of the replicas.
  • the replicas are distributed homogeneously among the areas or sectors (sub-arrays) that constitute the DNA-chip.
  • the number of replicas and their homogeneous distribution across the DNA-chip minimize the experimental variability from the printing and hybridization processes.
  • positive and negative hybridization controls are printed.
  • each of the sub-arrays that constitute the DNA-chip is flanked by external hybridization controls that allow the points on the support to be easily located.
  • the DNA-chip has two external hybridization controls marked, for example, with a fluorophore (e.g., Cy3, Cy5, etc.), which serve to evaluate the quality of hybridization in both channels.
  • a fluorophore e.g., Cy3, Cy5, etc.
  • the nucleotide sequence of the external control is previously identified as "CEH” and the oligonucleotide sequences for detection are those previously identified as ON1 and ON2.
  • the DNA-chip of the invention is a DNA-chip that allows simultaneous, sensitive, specific and reproducible detection of gene variants associated with pathologies related to aging; Illustrative, non-limiting examples of aging-associated gene variants that can be identified are shown in Table 1; however, the ratio of gene variants contained in said table can be increased with other gene variants that are subsequently identified and that are associated with pathologies related to aging.
  • Table 1 Illustrative, non-limiting examples of aging-associated gene variants that can be identified are shown in Table 1; however, the ratio of gene variants contained in said table can be increased with other gene variants that are subsequently identified and that are associated with pathologies related to aging.
  • the sequences of all the genes mentioned in Table 1 are known and are collected, among others, on the following websites: GeneBank (NCBI), and Snpper.chip.org (Innate Immunity PGA).
  • kit of the invention comprising a DNA-chip of the invention comprising a support on which a plurality of probes that allow the detection of human gene variants present in one or more genes associated with pathologies associated with aging.
  • the kit of the invention contains a protocol for detecting said gene variants, which comprises the use of an algorithm for the interpretation of the data generated with the application of said method; and, optionally, a risk calculation protocol conferred by said gene variants, comprising the use of various algorithms generated with the application of said method; and, optionally, a computer software that facilitates, automates and ensures the reproducibility of the application of said algorithm for the interpretation of the data generated with the application of the invention.
  • a DNA-chip was designed and manufactured to detect human gene variants, in particular SNPs (in English, Single Nucleotide Polymorphisms) associated with pathologies associated with aging that allows the simultaneous, sensitive, specific and reproducible detection of gene variants associated with said pathologies.
  • SNPs in English, Single Nucleotide Polymorphisms
  • the DNA-chip designed and manufactured consists of a support (glass slides) that contains on its surface a plurality of probes that allow the detection of the aforementioned gene variants.
  • These probes are capable of hybridizing with the amplified target sequences of genes associated with aging-related pathologies whose genetic variation is to be analyzed.
  • the DNA sequences of each of the probes used are the following [in general, the name of the gene and the genetic variation are indicated (amino acid change, nucleotide change, "ins”: insertion, "del”: deletion)] :
  • SEQ ID NO: 1 ACGTCACGCAGCAAAGGGACGAG
  • SNP15 CBS 844ins68 SEQ ID NO: 57 TGGGGTGGATC ATCC AGGTGGGG SEQ ID NO: 58 CCCCACCTGGATGATCCACCCCA
  • SNP30 CYP2D6 1847 G> A (allele * 4) SEQ ID NO: 1 17 CCCACCCCCAGGACGCCCCTT SEQ ID NO: 1 18 CCACCCCCAGGACGCCCCT SEQ ID NO: 1 19 CCCACCCCCAAGACGCCCCTT SEQ ID NO: 120 CCACCCCCAAGACGCCCCT
  • SNP40 GNB3 825 OT SEQ ID NO: 157 GGCATCACGTCCGTGGCCTTCTC SEQ ID NO: 158 GAGAAGGCCACGGACGTGATGCC SEQ ID NO: 159 GGCATCACGTCTGTGGCCTTCTC SEQ ID NO: 160 GAGAAGGCCATAG
  • SEQ ID NO: 181 CTTCTTTGGGAAGGGGAAGTAGG
  • the probes capable of detecting the different gene variants previously identified are printed on the aminosilanized support (glass slides) using DMSO as a printing buffer. Printing is carried out with a spott ⁇ r or oligonucleotide printer (probes) controlling temperature and relative humidity.
  • connection of the probes to the support is carried out by cross-linking with ultraviolet and baked radiation as described in the documentation provided by the manufacturer (for example, Corning Lifesciences http://www.corning.com ).
  • the relative humidity during the deposition process is maintained between 40-50% and the temperature around 20 0 C.
  • DNA from the individual is extracted from a biological sample (for example, peripheral blood, saliva, etc.) by means of a filtration protocol (for example, commercial kits from Macherey Nagel, Qiagen, etc.).
  • a biological sample for example, peripheral blood, saliva, etc.
  • a filtration protocol for example, commercial kits from Macherey Nagel, Qiagen, etc.
  • All exons and voyeurs of interest are amplified by multiplex amplification using the appropriate oligonucleotide primer pairs.
  • oligonucleotide primers used to carry out multiplex amplification for the detection of gene variants associated with aging-related pathologies can be designed using the sequences of the corresponding genes as described in GenBank using for example the softwares:
  • Primer 3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi ' ) or Web Primer (http://seq.veastgenome.org/cgi-bin/web-primer)
  • Oligonucleotide primers used SNPOl ACE Intron 16 ins / del
  • SNP40 GNB3 825 OT SEQ ID NO: 355 CTGCCGCTTGTTTGACCT
  • SNP51 NAT2 282 OT (Y94Y) SEQ ID NO: 377 CCATGGAGTTGGGCTTAGAG SEQ ID NO: 378 CC ATGCCAGTGCTGT ATTTG
  • Multiplex amplifications are carried out simultaneously under the same time and temperature conditions that allow specific amplification of the fragments of the genes in which the gene variant to be detected may exist. Once the multiplex amplification is finished, it is checked, in agarose gel, that an amplification reaction has taken place.
  • the sample to be hybridized (product of the amplification) is subjected to fragmentation with a Dnasa and the products resulting from the fragmentation process are subjected to an indirect tidal reaction.
  • a terminal transferase incorporates a nucleotide attached to a specific binding molecule, for example, biotin, at the end of these small fragments.
  • Hybridization is carried out automatically at the Ventana Discovery hybridization station (Ventana Medical Systems).
  • Prehybridization or blocking of the slide with BSA is performed. Then the sample is applied together with the hybridization solution [ChipMap Kit Hybridization Buffer (Ventana Medical System)] and maintained for 1 hour at 45 0 C following the protocol Window 9.0 Europe (Ventana Medical System). Finally, the slide is subjected to the action of different washing solutions [ChipMap hybridization Kit Buffers (Window Medical System)]. Once the hybridization process is finished, the final washing and drying of the slide is carried out.
  • the slide is inserted into the confocal fluorescence scanner, for example Axon scanner 4100A, and the signal emitted by the standard tide is scanned when it is excited by the laser.
  • the confocal fluorescence scanner for example Axon scanner 4100A
  • the scanner software itself allows quantification in the image obtained from the signal of the points where hybridization has occurred.
  • the genotype of the individual is established from the signal obtained with the probes that detect the different gene variants. To do this, briefly, first, the absolute intensity values of all probes are subtracted from their own background noise; Next, the corresponding replicas of each of the 4 probes that are used to characterize each gene variant are grouped. The average intensity value for each of the 4 probes is calculated using the bounded average of the replicas to eliminate aberrant points. Once the average intensity values are known for each of the probes, two ratios are calculated (ratio 1 and ratio 2):
  • Ratio 1 Average intensity probe I + Average intensity probe 2
  • the function that presents a higher absolute value determines the genotype presented by the patient.
  • obtaining these linear functions is carried out by analyzing 10 subjects for each of the three possible genotypes of the gene variant (AA, AB, BB). With the results, ratios 1 and 2 are calculated for the 30 subjects. These ratios serve as classification variables of the three groups to generate the linear functions. With these three linear functions, the classification capacity of the two pairs of designed probes is evaluated. In case the classification capacity is not 100%, the probes would be redesigned. New subjects characterized for each of the three genotypes constitute new ratios 1 and 2 to perfect the linear combinations of them that constitute the linear functions and, in short, to improve the classification capacity of the algorithm based on these three functions.
  • ratios 1 and 2 are within the range of ratios used to construct the groups, the average fluorescence intensity of the 40 replicates with respect to background noise is greater than 5 and the coefficient of variation of all DNA-chip replicas are below 0.25 (using a confocal fluorescence scanner) the result of the linear functions is considered correct.
  • each mutation has 4 probes on the slide (repeated 10 times) for detection. Two of these probes detect a gene variant and the other two the other gene variant.
  • a heterozygous subject for a given gene variant has both the gene variants; therefore, the probes that detect them have an equivalent hybridization signal. Ratios 1 and 2 will tend to 0.5 and the subjects will be assigned as AB heterozygotes.
  • the slide was introduced into the scanner and the signal emitted by the standard tide was scanned when it was excited by the laser (section 1.3.3) and to quantify the image obtained from the signal of the points where hybridization has occurred (section 1.3 .4).
  • each particular genetic risk For the determination of a particular genetic risk, first, the results obtained corresponding to each particular genetic risk are grouped. Thus, at this stage, the gene variants corresponding to each particular genetic risk studied are grouped. Tables 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17 and 25 show (see column 1) the gene variants associated with each of the pathologies associated with particular aging studied. Subsequently, each genotype associated with each gene variant is normalized or scored.
  • these values will be included in a range of normalized values, in which the genotype (s) most at risk of suffering a pathology determined will comprise (n) the value of the upper limit of said range of values, and the genotype (s) with the lowest risk to suffer a certain pathology will comprise (n) the value of the lower limit of said range of values.
  • a normalized value corresponding to said genotype is assigned depending on the genotype present in the analyzed sample.
  • the particular genetic risk is calculated according to equation [1] or [2], depending on whether said particular genetic risk is formed (or not) by a combination of partial particular risks.
  • RGP represents the particular genetic risk to be calculated
  • Xj represents the normalized value of the genotype characterized for a gene variant in a sample, in relation to the particular genetic risk to be calculated
  • LS J represents the upper limit value of the range of normalized values assigned to each gene variant, in relation to the particular genetic risk to be calculated; and n is the number of gene variants analyzed in relation to the particular genetic risk to be calculated.
  • RGP represents the particular genetic risk to be calculated
  • RGPP represents the value calculated for each particular partial genetic risk that, in combination with other partial particular genetic risks, constitute the particular genetic risk to be calculated, where said RGPPi is calculated by the equation
  • RGPPi has the previously mentioned meaning;
  • x represents the normalized value of the genotype characterized for a gene variant in a sample, in relation to the particular partial genetic risk to be calculated;
  • Ls represents the upper limit value of the range of normalized values assigned to each gene variant, in relation to the particular partial genetic risk to be calculated
  • n is the number of gene variants analyzed in relation to the particular partial genetic risk to be calculated
  • n ° RGPP is the number of partial particular genetic risks analyzed in relation to the particular partial genetic risk to be calculated.
  • RGG represents the overall genetic risk to be calculated
  • RGP represents the value calculated for each particular genetic risk analyzed in relation to the overall genetic risk to be calculated, and is calculated using equations [1] or [2] previously described; and n is the number of particular genetic risks analyzed in relation to the overall genetic risk to be calculated.
  • the overall genetic risk of the subject analyzed to a pathology associated with aging includes the determination of the following particular genetic risks:
  • vascular risk Particular genetic risk associated with suffering from vascular disease (vascular risk) [Tables 2-12];
  • partial particular genetic risk associated with lipid metabolism [Tables 2-3] Partial particular genetic risk associated with thrombosis [Tables 4-5]; Partial particular genetic risk associated with stroke [Tables 6-7]; Partial particular genetic risk associated with arterial hypertension [Tables 8-9]; and - partial particular genetic risk associated with endothelial vulnerability
  • Table 12 shows the result of the calculation of vascular genetic risk, which has been calculated based on the particular partial genetic risks: lipid metabolism, thrombosis, stroke, arterial hypertension and endothelial vulnerability.
  • Table 24 shows the result of the calculation of the global genetic risk of suffering a pathology associated with aging as explained above from an example sample of a subject based on the particular genetic risks: vascular risk, osteoporosis risk, risk Carcinogenic and environmental stress risk. Additionally, in this example, the particular genetic risk of the subject under study associated with drug response has been determined, that is, the particular genetic risk of suffering adverse drug reactions.
  • Table 25 shows the result of the general response to drugs related to those drugs metabolized by the following routes: NAT2, CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9. VASCULAR RISK
  • the risk is calculated on a 0-1 scale considering the maximum value of 18
  • the risk is calculated on a 0-1 scale considering the maximum value of 15 as
  • CYP2C9 Alleles * 1 (wt), * 2 and * 3)

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Abstract

La invención se refiere a un método 'in vitro' para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento. Dicho método, se basa en la combinación de riesgos genéticos particulares a desarrollar patologías comunes asociadas al envejecimiento. Dichos riesgos genéticos particulares se determinan a partir de los resultados obtenidos del genotipado simultáneo de determinadas variaciones genéticas asociadas a dichas patologías asociadas al envejecimiento y, cuyo principal objetivo, es su uso en medicina anti-envejecimiento.

Description

MÉTODO Y PRODUCTO PARA GENOTIP ADO "IN VITRO" CON APLICACIÓN EN MEDICINA ANTI-ENVEJECIMIENTO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas para la detección de variantes génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones genéticas, asociadas con enfermedades asociadas al envejecimiento, o asociadas con la respuesta a tratamientos farmacológicos, con apl'cación en medicina anti-envejecimiento; en particular, la invención se relaciona un método in vitro para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento a partir de una combinación de riesgos genéticos particulares. La invención también se relaciona con reactivos y kits para la puesta en práctica de dicho método.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Actualmente, gracias a los conocimientos obtenidos del análisis del genoma humano, se conocen muchos ejemplos de alelos definidos por polimorfismos de único nucleótido o SNPs (del inglés "single nucleotide polymorphism") que pueden afectar el buen funcionamiento de un determinado sistema y otros, que por el contrario, tienen un efecto beneficioso. Es importante tener presente que muchos de estos genes interaccionan entre sí y por esta razón, algunos de efectos antagónicos suelen compensar mutuamente su expresión, lo que clínicamente podemos traducir en la supresión de determinado signo o síntoma dentro del cuadro clínico. No obstante, en otros casos los efectos de algunos genes se potencian mutuamente y como fruto de esta sinergia pueden surgir complicaciones o peculiaridades tanto clínicas como de respuesta terapéutica que explican las diferencias que observamos en Ia evolución de varios casos con una misma enfermedad.
Estas diferencias también se manifiestan en la predisposición a padecer diversas enfermedades comunes y al desarrollo de sus complicaciones. Por ejemplo, la susceptibilidad genética a las dislipidemias seguramente repercutirá en un una vida más corta, por otra parte, haber heredado variantes génicas en genes que protegen contra enfermedades coronarias, contra el daño oxidativo o contra el cáncer, sin lugar a dudas ayudará a prolongar la vida. En este sentido, tenemos el equilibrio que puede establecerse entre genes de efectos negativos o deletéreos (predisponentes a enfermedades) y genes de efectos positivos (determinados genotipos protectores) en el mantenimiento de nuestras reserva de vida. Claro está, en esta interacción genética jamás debemos olvidar que de forma importante juegan un papel directo otros factores de riesgo, no genéticos, de efecto negativo (hábitos y estilos de vida poco saludables) en contraposición a los de efecto positivo (control de dichos hábitos, intervención farmacológica específica) que desplazan el equilibrio en uno u otro sentido, terminando de modular el fenotipo clínico final y determinando finalmente, nuestra mayor o menor expectativa de vida. Entre estos factores ambientales capaces de modular la expresión de los genes, los tratamientos médicos también influyen. Si resultaran ser los adecuados, contribuirían a incrementar la supervivencia una vez desarrollada alguna enfermedad.
Un análisis genético puede facilitar el detectar muy precozmente la vulnerabilidad particular de cada individuo analizado y al mismo tiempo, ofrece la posibilidad de dar una base científica a un tratamiento, que deja de ser empírico y generalista para ser totalmente objetivo, ya que se formulará de acuerdo a los principios de la farmacogenética: herramienta de última generación que se va imponiendo como la última gran revolución de la medicina moderna: la era de la medicina personalizada.
Si además, se tiene la posibilidad de analizar los polimorfismos genéticos implicados en la etiopatogenia de la enfermedad, se estaría en condiciones de realizar un análisis comprensivo del problema, bajo una perspectiva unitaria que engloba de un lado a los factores clásicos de riesgo y por otra parte los datos obtenidos de las variantes génicas estudiadas.
Hasta mediados del siglo veinte, se ha asumido que las enfermedades ante las cuales las personas de edad avanzada eran más vulnerables, como por ejemplo la osteoporosis, constituían atributos inevitables del proceso de envejecimiento. Es cierto que el envejecimiento predispone a aumentar la vulnerabilidad a la enfermedad, sin embargo, actualmente se está llevando a cabo mucha investigación dirigida a obtener información sobre la biología del envejecimiento y la longevidad. La medicina anti-envejecimiento se puede definir como cualquier intervención que retrasa el desarrollo de patologías relacionadas con el envejecimiento y otros cambios adversos relacionados con la edad y que oficialmente no se encuentran listados como enfermedades tales. En los últimos años se han descrito numerosos marcadores moleculares en el genoma relacionados con patologías asociadas al envejecimiento. Actualmente, dado que la lista de factores de riesgo genético de desarrollar una patología asociada al envejecimiento es cada vez más numerosa y sigue aumentando el interés por considerar su importancia en el determinismo de la enfermedad, existe una necesidad de disponer de herramientas que de forma rápida permitan realizar el análisis de todos estos factores genéticos en su conjunto.
Las enfermedades asociadas al envejecimiento más relevantes son las que ocupan los primeros lugares entre las principales causas de morbi-mortalidad entre personas mayores de 65 años, entre las que se encuentran las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y la osteoporosis. También se ha definido el envejecimiento como el proceso resultante de una protección imperfecta de los principales componentes celulares frente al estrés oxidativo. Además, a medida que se envejece los fármacos permanecen más tiempo en el organismo debido a la disminución de la cantidad de agua, por lo que adquiere mayor importancia la prescripción de dosis adecuadas en función de la respuesta del paciente a los fármacos para evitar reacciones adversas a los mismos.
Enfermedad vascular La enfermedad vascular (EV) es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad, por lo que resulta de gran interés el desarrollo de modelos de predicción del riesgo a padecer este tipo enfermedades, tanto para intentar conocer los posibles mecanismos que afectan al aumento del riesgo, como para poder intervenir precozmente y evitarlas. Es importante desde la perspectiva de la valoración global del riesgo vascular, considerar la EV como una proceso sistémico patogénicamente relacionada con la disfunción endotelial, sobre la que actúan diversos factores de riesgo que determinarán la variabilidad de expresión interindividual (dislipidemia, hipercoagulidad sanguínea, hiperhomocisteinemia) pero que en cualquier caso llevarán a que se manifieste como una enfermedad de órgano a diferentes niveles: cardiovascular, cerebrovascular, vascular periférica y/o renal.
La asociación entre la enfermedad coronaria y cerebrovascular ha estado en parte matizada y, su estudio y conocimiento ha sido lento, ya que el interés por el análisis de los tactores de riesgo en la enfermedad cerebrovascular ha sido escaso algo que explica porqué su estudio ha comenzado con posterioridad. A pesar que existía la tendencia a considerar que en la hipercolesterolemia familiar, prototipo de enfermedad que indicaba un alto riesgo coronario, no se acompañaba de ictus, estudios minuciosos llevados a cabo últimamente demuestran que lo que realmente ocurre es que la enfermedad cerebrovascular ateromatosa se desarrolla con más lentitud que la coronaria, por lo que por ejemplo en la hipercolesterolemia familiar la propia cardiopatía isquémica al ser más precoz en su debut es la que no permite el desarrollo de la enfermedad cerebrovascular en la mayoría de los casos. Según lo anterior, en la evaluación del riesgo vascular se debe hacer una estratificación exhaustiva para lograr ser lo más objetivos posibles a la hora de evaluar cada caso. Dentro de los grandes apartados que se deben analizar están: a) Riesgo metabólico: dislipemia, hiperhomocisteinemia; b) Hipercoagulabilidad sanguínea; c) Vulnerabilidad endotelial; y d) Estado hemodinámico (sistema renina- angiotensina)
Dislipidemia
La predisposición a la dislipidemia o alteración del metabolismo de los lípidos también resulta ser muy heterogénea a nivel molecular y es importante realizar una evaluación de todo el conjunto ya que entre cada uno de los representantes de cada polimorfismo genético (presencia del alelo A o B) que se hereden en un individuo, pueden establecerse sinergias o antagonismos que determinarán riesgos y por tanto, vulnerabilidades muy variables y particulares que posibilitan individualizar cada caso no sólo en su valoración global, sino también en cuanto a la estrategia terapéutica a emplear.
Hiperhomocisteinemia
La homocisteína (HCT) es un aminoácido desmetilado derivado de la metionina y por tanto, un intermediario del ciclo de la metionina. Se metaboliza por remetilación a metionina o por sulfuración a cisteína. Para la remetilación, la metionina sintetasa necesita vitamina Bl 2 como cofactor y ácido fólico como sustrato. Para la transsulfuración se requiere una cisteatonina beta-sintetasa (CBS) y vitamina B6 como cofactor. Un defecto en la remetilación o la trans- sulfuración lleva a una hiperhomocisteinemia. Diversos estudios han demostrado que la hiperhomocisteinemia, incluso leve a moderada (mayor de 12 nmol/mL), es un factor independiente para isquemia cerebral, infarto al miocardio, enfermedad arterial periférica y estenosis carotídea. Si bien entre sus causas las provenientes del ambiente externo (no genéticas) son importantes, existen alteraciones genéticas importantes a considerar porque determinan tanto el pronóstico como el grado de respuesta terapéutica de cada caso.
El sistema renina-angiotensina y los receptores adrenérgicos también son factores que predisponen a la hipertensión arterial y enfermedad cardiovascular en general.
Hipercoagulabilidad sanguínea
De acuerdo a la clásica tríada de Virchow, en la formación de un trombo han de tenerse en cuenta tres factores interrelacionados: alteración de la pared del vaso sanguíneo, del flujo sanguíneo y de la coagulabilidad de la sangre. Es precisamente la alteración de este último factor, que favorece la coagulación de la sangre, o estado de hipercoagulabilidad o protrombótico, lo que se define como trombofilia.
Como norma general se debe sospechar un estado de hipercoagulabilidad en individuos con episodios recurrentes de trombosis venosas profundas, embolismo pulmonar, historia familiar de eventos trombóticos, sitios inusuales de trombosis arteriales y venosa y en niños, adolescentes o adultos jóvenes con eventos trombóticos en general.
Vulnerabilidad endotelial La función más evidente del endotelio vascular es la del mantenimiento de un tono vascular dilatado en la proporción exacta para conservar la presión arterial en valores normales y permitir la perfusión tisular. Esta función vasodilatadora la ejerce el endotelio por intermedio de la síntesis y secreción de factores de relajación como el óxido nítrico (ON). Además, el endotelio es un elemento importante para mantener el equilibrio con plaquetas y factores de coagulación y así mantener la fluidez de la sangre en lo que llamamos equilibrio homeostático (hemostasia) ya que el desbalance en uno u otro sentido producirá hemorragia o trombosis. La mayoría de los factores capaces de agredir y dañar al endotelio vascular provienen del ambiente externo y entre ellos, uno de los más perjudiciales es el tabaquismo. No obstante, existen varios polimorfismos genéticos que determinan una mayor vulnerabilidad a este daño y por tanto, contribuyen considerablemente al aumento de riesgo vascular general. Incluso, estos polimorfismos agravan el daño que ya de por sí causarían los clásicos factores de riesgo no genéticos como el propio tabaquismo.
Estrés oxidativo El estrés oxidativo es otro factor que en gran medida también puede influir en la mejor o peor respuesta a nivel endotelial y a nivel vascular en general, así, otro pilar importante a considerar en la etiopatogenia molecular de la enfermedad vascular general, es el grado de potencial defensivo frente al estrés oxidativo.
La cardiopatía isquémica y el infarto agudo del miocardio pueden ser la expresión de un proceso que comienza con un exceso de radicales libres, los cuales inician el proceso aterosclerótico por daño en la pared vascular, provocando la penetración al espacio subendotelial de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y por ende a la placa aterosclerótica.
En diversas publicaciones científicas se analizan los mecanismos que posee nuestro organismo para producir y a la vez limitar la producción de especies reactivas de oxígeno. Un exceso de radicales libres suele iniciar el daño de la pared vascular y en este proceso se encuentra implicado el LDL-colesterol. Se ha demostrado una disminución en la incidencia de enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes.
Riesgo carcinogénico
Este riesgo se refiere a la susceptibilidad de base poligénica y multifactorial, no a las variantes monogénicas de cáncer hereditario, por lo que se recomienda adecuar cada riesgo a la situación clínica personal y a la historia familiar de cada caso. Riesgo a reacciones adversas a fármacos
Las personas mayores son más propensas a sufrir enfermedades crónicas y toman mayor cantidad de fármacos que los jóvenes, por ello son más propensas a reacciones adversas al fármaco. A medida que se envejece disminuye la cantidad de agua del organismo. Los fármacos alcanzan concentraciones más altas en las personas mayores. Muchos fármacos, una vez en el cuerpo, se disuelven en los líquidos del organismo pero en estas personas existe menos agua para diluirlos. Además, los ríñones son menos eficaces en la excreción de fármacos por la orina y el hígado tiene menos capacidad para metabolizarlos.
Por esta razón, a medida que se envejece adquiere mayor importancia la prescripción de dosis adecuadas en función de la respuesta del paciente a los fármacos para evitar reacciones adversas a los mismos.
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método que permita la detección simultánea, sensible, específica y reproducible de variantes génicas asociados con patologías asociadas al envejecimiento (riesgo vascular, riesgo carcinogénico, riesgo de osteroporosis, riesgo frente al estrés oxidativo y riesgo a reacciones adversas a fármacos) y que sea una herramienta útil en medicina, en particular en la medicina antienvejecimiento. Así, la traducción clínica y práctica de este análisis requiere del correspondiente algoritmo que integre el valor real de todos estas variantes génicas, teniendo en cuenta sinergias y antagonismos que ocurren entre ellos, presentando un riesgo en valores absolutos que sea diferente dependiendo del individuo analizado.
El valor real de este riesgo deberá considerarse en el contexto global de cada caso teniendo en cuenta todos los factores (no genéticos) clásicos de riesgo. Sólo así se garantizará un análisis objetivo y una visión unitaria de una enfermedad compleja y multifactorial como por ejemplo una enfermedad asociada a envejecimiento.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado un método para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento. Dicho método, se basa en la combinación de riesgos genéticos particulares a desarrollar patologías comunes asociadas al envejecimiento. Dichos riesgos genéticos particulares se determinan a partir de los resultados obtenidos del genotipado simultáneo de determinadas variantes génicas, en particular de SNPs asociadas a dichas patologías asociadas al envejecimiento y, cuyo principal objetivo, es su uso en medicina anti-envejecimiento.
El envejecimiento es un proceso multifactorial que tiene lugar durante la última etapa del ciclo vital y que se caracteriza por la disminución progresiva de la capacidad funcional en todos los tejidos y órganos del cuerpo, y de la consiguiente habilidad de ajustarse a estímulos ambientales. El ciclo vital es una característica específica, definida por una duración potencial máxima entre la concepción y la muerte y una serie de etapas durante las que tienen lugar los procesos ontogenéticos: crecimiento, desarrollo, maduración e involución. Los procesos ontogenéticos, la secuencia en que ocurren y su expresión fenotípica están genéticamente programados y ambientalmente limitados. La expresión secuencial y diferencial de un mismo conjunto de genes en ambientes concretos origina el continuo de fenotipos sucesivos que corresponden a un mismo individuo a lo largo de su ciclo vital. Los procesos involutivos asociados al envejecimiento se manifiestan a nivel molecular, celular y funcional con una expresión evidente en el fenotipo visible.
La medicina anti-envejecimiento es la parte de la medicina basada en la aplicación de la investigación científica y de las tecnologías para la prevención y tratamiento temprano de las enfermedades relacionadas con la edad o provocadas por el envejecimiento, con el objetivo de alargar la esperanza de vida y al mismo tiempo mejorar la calidad de vida.
Con el fin de lograr una valoración integral y objetiva de la mayor o menor capacidad adaptativa y de resistencia o vulnerabilidad de un sujeto frente a la mayoría de las enfermedades comunes asociadas al envejecimiento, los inventores de la presente invención han desarrollado un método que permite una valoración global del riesgo genético de un sujeto a padecer una patología asociada al envejecimiento a partir del cálculo del riesgo genético particular a desarrollar unas determinadas patologías asociadas al envejecimiento, en particular, a partir del cálculo de los riesgos genéticos particulares siguientes: 1. Riesgo vascular;
2. Riesgo a osteoporosis
3. Riesgo carcinogénico; y
4. Riesgo a estrés ambiental y daño oxidativo; y, opcionalmente 5. Riesgo a reacciones adversas a fármacos.
Así, es el objetivo principal de la presente invención el desarrollar un método in vitro para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento a partir de una combinación de riesgos genéticos particulares, en particular, el riesgo vascular, riesgo oncogénico, riesgo a osteoporosis, riesgo al estrés ambiental y daño oxidativo, y riesgo a reacciones adversas a fármacos.
Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento a partir de una combinación de riesgos genéticos particulares, en adelante método de la invención, que comprende:
i) genotipar simultáneamente múltiples variantes génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a una patología asociada al envejecimiento en una muestra biológica de dicho sujeto;
ii) determinar cada riesgo genético particular; y
iii) determinar dicho riesgo genético global en función del valor de cada riesgo genético particular obtenido en la etapa ii).
El término "variante génica", tal y como se utiliza en la presente descripción, incluye a las mutaciones, polimorfismos y variantes alélicas. Una variante genética se encuentra entre individuos dentro de las poblaciones y entre las poblaciones dentro de las especies. En una realización particular, los autores de la presente invención, han seleccionado un total de 69 variantes génicas humanas de 49 genes humanos asociadas con patologías asociadas al envejecimiento (Tabla 1); no obstante, pueden analizarse variantes génicas humanas adicionales, diferentes, en los mismos genes o en otros genes humanos, asociadas con patologías asociadas al envejecimiento. El término "mutación génica" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde cada secuencia posible está presente en una proporción inferior al 1 % en una población.
El término "polimorfismo" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde cada secuencia posible está presente en una proporción igual o superior a un 1% en una población; en un caso particular, cuando dicha variación es la secuencia nucleotídica ocurre en un sólo nucleótido (A, C, T o G) se denomina SNP.
Los términos "variante alélica" o "alelo" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un polimorfismo que ocurre en un mismo locus en una misma población.
Con el fin de genotipar simultáneamente dichas variantes génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociados a una patología asociada al envejecimiento mediante el método de la invención, en una primera etapa se procede a extraer el ácido nucleico de una muestra biológica del sujeto a analizar.
La extracción del ácido nucleico (e.g., DNA) a partir de una muestra biológica que lo contiene procedente de un sujeto, tal como un ser humano, se puede llevar a cabo por métodos convencionales utilizando, opcionalmente, productos comerciales útiles para extraer dicho ácido nucleico. Prácticamente cualquier muestra biológica que contiene ácido nucleico puede ser utilizada para la puesta en práctica de la invención; a modo ilustrativo, no limitativo, dicha muestra biológica puede ser una muestra de sangre, saliva, plasma, suero, secreciones, tejido, etc.
Una vez obtenido el ácido nucleico, se amplifican aquellas regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variantes génicas a identificar. Como se ha mencionado previamente, el término "variante génica", tal como se utiliza en esta descripción, incluye polimorfismos (e.g., SNPs), mutaciones y variantes alélicas. Para amplificar las regiones de ácido nucleico que contienen las variantes génicas a identificar se utilizan unos oligonucleótidos cebadores específicos que amplifican los fragmentos del genoma que pueden contener dichas variantes génicas. Dichos oligonucleótidos cebadores se describen detalladamente más adelante, forman parte de la presente invención y constituyen un aspecto adicional de la misma. Si se desea, dichos productos de amplificación pueden ser marcados, opcionalmente, durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, marcados, que contienen las variantes génicas a identificar.
Así, las regiones de DNA que contienen las variantes génicas a identificar (regiones DNA diana) se someten a una reacción de amplificación para obtener unos productos de amplificación que contienen las variantes génicas a identificar. Aunque puede utilizarse cualquier técnica o método que permita la amplificación de todas las secuencias de DNA que contienen las variantes génicas a identificar, en una realización particular, dichas secuencias se amplifican mediante una amplificación multiplex, lo cual permite genotipar simultáneamente dichas variantes génicas humanas a identificar presentes en uno o más genes.
Para la realización de una amplificación multiplex se requiere el empleo de unos pares de oligonucleótidos cebadores o iniciadores capaces de amplificar dichas regiones DNA diana que contienen las variantes génicas a identificar según se ha explicado anteriormente. Prácticamente puede utilizarse cualquier par de oligonucleótidos cebadores que permita la amplificación específica de dichas regiones DNA diana, preferentemente, pares de oligonucleótidos cebadores que permitan dicha amplificación en el menor número posible de reacciones de amplificación. De este modo, utilizando los pares de oligonucleótidos cebadores y las condiciones apropiadas, se pueden amplificar todas las regiones DNA diana necesarias para el genotipado de dichas variantes génicas a analizar con el mínimo número posible de reacciones. En una realización particular, dichos oligonucleótidos cebadores se seleccionan entre los oligonucleótidos cebadores identificados como SEQ ID NO: 277-278, SEQ ID NO: 285-319, SEQ ID NO: 321-326, SEQ ID NO: 333-340, SEQ ID NO: 343-356, SEQ ID NO: 359-362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369-371, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 377-381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385-402, y SEQ ID NO: 404-414.
Una vez que se han amplificado las secuencias de DNA que contienen las variantes génicas a identificar, el método de la invención comprende la etapa de genotipar simultáneamente múltiples variantes génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociados a una patología asociada al envejecimiento. En una realización particular de la invención, dicha etapa de genotipado simultáneo se realiza mediante un análisis con DNA-chips, por ejemplo, utilizando un DNA-chip apropiado, tal como el DNA-chip proporcionado por esta invención (DNA-chip de la invención, cuyas características se mencionan más adelante), es decir, por hibridación con sondas específicas para dichas variantes génicas humanas. Adicional, o alternativamente, dicho genotipado puede realizarse mediante secuenciación génica de dichos productos de amplificación. Así, si se desea, durante la reacción de amplificación, puede llevarse a cabo el mareaje de los productos de amplificación con el fin de poder detectar posteriormente la hibridación entre las sondas presentes en el DNA-chip de la invención, inmovilizadas en el soporte, y los fragmentos de DNA diana que contienen las variantes génicas a detectar. El mareaje de los productos de amplificación puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, incorporando un nucleótido marcado durante la reacción de amplificación o bien utilizando cebadores marcados. Dicho mareaje puede ser directo, para lo cual pueden utilizarse fluoróforos, por ejemplo, Cy3, Cy5, fluoresceína, alexa, etc., enzimas, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, por ejemplo, 33P, 1251, etc., o cualquier otro marcador conocido por el experto en la materia. Alternativamente, dicho mareaje puede ser indirecto mediante el empleo de métodos químicos, enzimáticos, etc.; a modo ilustrativo, el producto de amplificación puede incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina conjugada con un fluorocromo (marcador), y la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo, biotina (indicador), efectuándose la lectura mediante fluorimetría, etc., o bien, el producto de amplificación puede incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con una enzima (marcador), y la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo, digoxigenina (indicador), etc., transformándose el sustrato de la enzima en un producto luminiscente o fluorescente y, efectuándose la lectura mediante quimio-luminiscencia, fluorimetría, etc.
En una realización particular, el mareaje del producto de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de un nucleótido marcado directa o indirectamente con uno o más fluoróforos. En otra realización particular, el mareaje del producto de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de cebadores marcados directa o indirectamente con uno o más fluoróforos.
En un caso particular, dichos productos de amplificación se someten a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variantes génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, dichos productos de fragmentación que contienen las variantes génicas a identificar se pueden marcar.
Los productos de amplificación, opcionalmente marcados, se someten posteriormente a una reacción de fragmentación con el fin de aumentar la eficiencia de la hibridación posterior, obteniéndose de este modo unos productos de fragmentación que contienen las variantes génicas a identificar. La fragmentación de los productos de amplificación puede llevarse a cabo por cualquier método convencional, por ejemplo, poniendo en contacto los productos de amplificación con una Dnasa.
En caso de que los productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente durante la reacción de amplificación, y en caso de que, tras el proceso de hibridación, no se lleve a cabo una reacción de amplificación o ligación directamente en el soporte, los productos resultantes de la reacción de fragmentación (productos de fragmentación) se someten a un mareaje bien directo utilizando, por ejemplo, fluoró foros, enzimas, isótopos radiactivos, etc. o bien indirecto utilizando, por ejemplo, pares de unión específica que incorporan fluoró foros, enzimas, etc., mediante métodos convencionales. En una realización particular, los productos de amplificación no han sido marcados previamente durante la reacción de amplificación, y los productos de fragmentación se someten a un mareaje directo o indirecto con uno o varios marcadores, por ejemplo, uno o varios fluoróforos, aunque pueden utilizarse otros marcadores conocidos por los expertos en la materia.
A continuación, los productos de fragmentación se ponen en contacto con unas sondas capaces de detectar las variantes génicas correspondientes bajo condiciones que permiten la hibridación entre dichos productos de fragmentación y dichas sondas. Dichas sondas están depositadas en un soporte sólido siguiendo una disposición predeterminada, constituyendo un DNA-chip (DNA-chip de la invención), cuyo diseño y desarrollo debe cumplir una serie de requisitos para poder ser utilizado en el método de la invención en cuanto al diseño de las sondas, el número de sondas a depositar por variante génica a detectar, el número de réplicas de sondas a depositar, la distribución de las sondas sobre el soporte, etc. Las características propias de dicho DNA-chip de la invención y de dichas sondas se describen detalladamente más adelante.
La hibridación de los productos de fragmentación con las sondas capaces de detectar las variantes génicas correspondientes depositadas en un soporte (DNA-chip de la invención) se lleva a cabo por métodos convencionales utilizando dispositivos convencionales. En una realización particular, la hibridación se lleva a cabo en una estación automática de hibridación. Para llevar a cabo la hibridación, los productos de fragmentación se ponen en contacto con dichas sondas (DNA-chip de la invención) bajo condiciones que permiten la hibridación entre dichos productos de fragmentación y dichas sondas. Unas condiciones de hibridación estables permiten establecer la hebra y la longitud apropiada de las sondas con el fin de maximizar la discriminación, tal como se menciona más adelante.
Finalizado el proceso de hibridación se procede a la captura de la imagen y a su cuantificación. Para ello, la imagen del DNA-chip hibridado y revelado es recogida con un dispositivo apropiado, por ejemplo, un escáner, procediéndose, a continuación, a cuantificar los valores absolutos de fluorescencia de cada sonda así como del ruido de fondo. Por tanto, en una realización particular, tras la hibridación, o tras las reacciones de amplificación o ligación post-hibridación, el DNA-chip hibridado y revelado se introduce en un escáner donde es sometido a un escaneado para cuantificar la intensidad del mareaje en los puntos donde se ha producido la hibridación. Aunque prácticamente cualquier escáner puede ser utilizado, en una realización particular, dicho escáner es un escáner de fluorescencia confocal. En este caso, el DNA-chip se introduce en el escáner y se escanea la señal emitida por el mareaje al ser excitado por un láser, cuantificándose la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación. En una realización particular, dicho escáner es un escáner de luz blanca. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de escáneres que pueden ser utilizados según la presente invención son escáneres de Axon, Agilent, Perkin Elmer, etc.
A continuación se procede al análisis de los datos y a su interpretación, lo que puede llevarse a cabo mediante el empleo de cualquier software de genotipado apropiado, tal como el software de genotipado al que se hace referencia en el Ejemplo 1 , que utiliza las funciones descritas en el apartado 1.3.5 de dicho Ejemplo 1, y mediante el empleo de las funciones desarrolladas por los inventores para calcular los riesgos genéticos particulares correspondientes y, a partir de ellos, el riesgo genético global, tal como se describe detalladamente más adelante. El análisis de los datos y su interpretación se lleva a cabo, en general, mediante el empleo de programas informáticos (software). Los inventores han desarrollado un método secuencial de procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados por el DNA-chip de la invención que permite detectar cada una de las variantes génicas con sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, y calcular los valores de los riesgos genéticos particulares correspondientes y, a partir de ellos, el riesgo genético global, mediante algoritmos en función del genotipo de la muestra procesada. Los algoritmos y software informático desarrollado por los inventores permiten facilitar y automatizar la aplicación del método de la invención.
La ejecución de los algoritmos y software informático desarrollado por los inventores para procesar secuencialmente e interpretar los datos experimentales generados por el DNA-chip de la invención comprende la realización de una serie de etapas para caracterizar cada una de las variantes génicas de interés, concretamente: - en primer lugar, a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas se les resta su propio ruido de fondo; a continuación, se agrupan las réplicas correspondientes a cada una de las 4 sondas utilizadas para caracterizar cada variante génica; el valor medio de intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes; conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las sondas, se calcula el ratio 1 y el ratio 2, en donde:
Ratio 1 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variante génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variante génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 2 que detecta la variante génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Intensidad media sonda 1
Ratio 1 =
Intensidad media sonda 1 + Intensidad media sonda 2
Ratio 2 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10,
8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variante génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variante génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 4 que detecta la variante génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Intensidad media sonda 3 Ratio 2
Intensidad media sonda 3+ Intensidad media sonda 4
dichos ratios (ratio 1 y ratio 2) se sustituyen en tres funciones lineales, que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles:
AA Función 1
AB Función 2
BB Función 3
en donde
AA representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variante génica A;
AB representa el genotipo de un sujeto heterocigoto para las variantes geni cas A y B;
BB representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variante génica B;
Función 1 es la Función Lineal que caracteriza a los pacientes con el genotipo AA y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
Función 2 es la Función Lineal para el genotipo AB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2; Función 3 es la Función Lineal para el genotipo BB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
en donde las combinaciones lineales están formadas por constantes y cofactores que acompañan a las variables ratio 1 y ratio 2; y la función que presente un valor absoluto mayor determina el genotipo que presenta el paciente para la variante génica analizada.
Estos ratios sirven como variables de clasificación de los tres grupos para generar las funciones lineales.
En otra realización particular de la invención, el genotipado de las múltiples variantes génicas humanas o polimorfismos presentes en uno o más genes de un sujeto asociados a una patología asociada al envejecimiento en dicha muestra biológica se realiza por secuenciación génica. Una vez que se han genotipado dichas variantes génicas, se procede a determinar cada riesgo genético particular. Dependiendo de si el riesgo genético particular a calcular está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula aplicando unas funciones diferentes, tal como se describe más abajo. En una realización particular, la determinación (cálculo) del riesgo genético particular (etapa ii) del método de la invención) comprende:
i) agrupar los resultados obtenidos relativos a cada riesgo genético particular a desarrollar una patología asociada al envejecimiento;
ii) normalizar o el valor de cada genotipo de cada variante génica analizada;
iii) calcular cada riesgo genético particular de forma que:
iiia) cuando dicho riesgo genético particular no está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula mediante la ecuación [I]: RGP = -¿¿-=J — [1 ]
donde
RGP representa el riesgo genético particular a calcular; x, representa el valor normalizado del genotipo caracterizado para una variante génica en una muestra, en relación con el riesgo genético particular a calcular;
LSÍ representa el valor del límite superior del intervalo de valores normalizados asignado a cada variante génica, en relación con el riesgo genético particular a calcular; y n es el número de variantes génicas analizadas en relación con el riesgo genético particular a calcular; o, alternativamente,
iiib) cuando dicho riesgo genético particular está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula mediante la ecuación [2] :
Y RGPPi
RGP = ^^ [2] n° RGPP
donde RGP representa el riesgo genético particular a calcular;
RGPPj representa el valor calculado para cada riesgo genético particular parcial que, en combinación con otros riesgos genéticos particulares parciales, constituyen el riesgo genético particular a calcular, en donde dicho RGPPi se calcula mediante la ecuación [3]: RGPPi = [3]
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donde
RGPPi tiene el significado previamente mencionado; x¡ representa el valor normalizado del genotipo caracterizado para una variante génica en una muestra, en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular;
LSÍ representa el valor del límite superior del intervalo de valores normalizados asignado a cada variante génica, en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular; y n es el número de variantes génicas analizadas en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular; y
n°RGPP es el número de riesgos genéticos particulares parciales analizados en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular.
Así, en un primer paso, tras el genotipado de las variantes génicas humanas, dichas variantes se agrupan por riesgos genéticos particulares y riesgos genéticos particulares parciales, es decir, los resultados del análisis de las variantes génicas [mutaciones, polimorfismos (e.g., SNPs), variantes alélicas, etc.] se agrupan por riesgos genéticos particulares y, en su caso, por riesgos genéticos particulares parciales, con el fin de calcular el riesgo genético particular a cada patología asociada al envejecimiento. En una realización particular de la invención, dicho riesgo genético particular se selecciona del grupo formado por riesgo genético particular asociado a padecer enfermedad vascular (riesgo vascular), riesgo genético particular asociado a osteoporosis, riesgo genético particular asociado a carcinogénesis y riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo. Asimismo, en una realización particular, dicho riesgo vascular se determina en función de los riesgos genéticos particulares parciales seleccionados del grupo formado por riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico, riesgo genético particular parcial asociado a trombosis, riesgo genético particular parcial asociado a ictus, riesgo genético particular parcial asociado a hipertensión arterial y riesgo genético particular parcial asociado a vulnerabilidad endotelial.
Posteriormente, en un segundo paso, se normaliza o puntúa el valor de cada genotipo de cada variante génica. En este sentido, dichos valores estarán comprendidos en un intervalo de valores normalizados, en los que el/los genotipo/s de mayor riesgo a padecer una patología determinada comprenderá(n) el valor del límite superior de dicho intervalo de valores, y el/los genotipo/s de menor riesgo a padecer una patología determinada comprenderá(n) el valor del límite inferior de dicho intervalo de valores. Así, en función el genotipo presente en la muestra analizada se asigna un valor normalizado correspondiente a dicho genotipo. A continuación, se calculan los riesgos genéticos particulares según la ecuación [1] ó [2] dependiendo de si el riesgo genético particular a calcular está formado por una combinación de riesgos particulares parciales. En una realización particular, el riesgo genético particular asociado a osteoporosis, el riesgo genético particular asociado a carcinogénesis y el riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo se calculan mediante la ecuación [1], mientras que en otra realización particular, el riesgo vascular se determina utilizando la ecuación [2] en función de los riesgos genéticos particulares parciales seleccionados del grupo formado por riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico, riesgo genético particular parcial asociado a trombosis, riesgo genético particular parcial asociado a ictus, riesgo genético particular parcial asociado a hipertensión arterial y riesgo genético particular parcial asociado a vulnerabilidad endotelial, de modo que, en este caso, el riesgo genético particular se calcula en función de los valores de los distintos riesgos genéticos particulares parciales analizados tal como se muestra en el Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción.
En cualquier caso, el experto en la materia entenderá que, dependiendo de si se utilizan riesgos genéticos particulares parciales para determinar los riesgos genéticos particulares, utilizará en cada caso la ecuación apropiada. Riesgo vascular
El riesgo genético particular asociado a padecer riesgo vascular o a sufrir una enfermedad vascular (EV) (riesgo vascular) es, en toda su magnitud, una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en casi todo el mundo, por eso es de gran interés el desarrollo de modelos de predicción del riesgo a padecer este tipo enfermedades, tanto para intentar conocer los posibles mecanismos que afectan al aumento del riesgo, como para poder intervenir precozmente y evitarlas.
En este sentido, en la investigación de las bases moleculares de la EV se han señalado genes que intervienen en cada uno de los apartados y que confieren susceptibilidad a esta enfermedad.
Por una parte, se ha prestado atención a los genes que regulan todo lo relacionado con el metabolismo de los lípidos. Por otro lado, también se sabe que otra de las condiciones que predispone a la EV está en la tendencia a la formación de trombos, por ello los inventores han buscado polimorfismos de riesgo entre los genes que intervienen en la cascada de la coagulación y el sistema fibrinolítico. Por otra parte, el método de la invención analiza factores de riesgo genético entre aquellos genes con influencia a nivel de la conservación estructural y funcional del endotelio vascular y entre los que intervienen en los mecanismos de defensa contra el estrés oxidativo.
Riesgo genético particular parcial relacionado con la integridad del metabolismo lipidico (metabolismo lipidico)
El término dislipemia se refiere diversas condiciones patológicas cuyo único elemento común es una alteración del metabolismo de los lípidos, con su consecuente alteración de las concentraciones de lípidos y lipoproteínas en la sangre. La predisposición a la dislipidemia resulta ser muy heterogénea a nivel molecular y es importante realizar una evaluación de todo el conjunto ya que entre cada uno de los alelos o variantes de cada polimorfismo genético que se hereden en un individuo, pueden establecerse sinergias o antagonismos que determinarán riesgos y por tanto, vulnerabilidades muy variables y particulares que posibilitan individualizar cada caso no sólo en su valoración global, sino también en cuanto a la estrategia terapéutica a emplear.
Riesgo genético particular parcial a trombosis De acuerdo con la clásica tríada de Virchow, en la formación de un trombo han de tenerse en cuenta tres factores interrelacionados: alteración de la pared del vaso sanguíneo, del flujo sanguíneo y de la coagulabilidad de la sangre. Es precisamente la alteración de este último factor, que favorece la coagulación de la sangre, o estado de hipercoagulabilidad o protrombótico, lo que se define como trombofilia.
Como norma general se debe sospechar un estado de hipercoagulabilidad en individuos con episodios recurrentes de trombosis venosas profundas, embolismo pulmonar, historia familiar de eventos trombóticos, sitios inusuales de trombosis arteriales y venosas y en niños, adolescentes o adultos jóvenes con eventos trombóticos en general.
En este apartado se incluyen varias variaciones génicas que pueden actuar en forma sinérgica (potenciando el efecto patogénico) o antagónica (brindando una compensación natural).
Riesgo genético particular parcial a hipertensión arterial
En este caso, se analiza el estado a nivel hemodinámico valorando específicamente el sistema renina-angiotensina y los receptores adrenérgicos que básicamente predisponen a la hipertensión arterial y enfermedad cardiovascular en general. Su valoración también permitiría definir objetivamente, sobre bases moleculares, la estrategia terapéutica más efectiva para lograr el control en cada caso.
Riesgo genético particular parcial a vulnerabilidad endotelial
La función más evidente del endotelio vascular es la del mantenimiento de un tono vascular dilatado en la proporción exacta para conservar la presión arterial en valores normales y permitir la perfusión tisular. Esta función vasodilatadora la ejerce el endotelio por intermedio de la síntesis y secreción de factores de relajación como el Oxido Nítrico (ON). Además, el endotelio es un elemento importante para mantener el equilibrio con plaquetas y factores de coagulación y así mantener la fluidez de la sangre en lo que llamamos equilibrio homeostático (Hemostasia) ya que el desbalance en uno u otro sentido producirá hemorragia o trombosis.
La mayoría de los factores capaces de agredir y dañar al endotelio vascular provienen del ambiente externo y entre ellos, uno de los más perjudiciales es el tabaquismo. No obstante, existen diversas variaciones génicas que determinan una mayor vulnerabilidad a este daño y por tanto, contribuyen considerablemente al aumento de riesgo vascular general. Incluso, estas variaciones génicas agravan el daño que ya de por sí causarían los clásicos factores de riesgo no genéticos como el propio tabaquismo. Por otro lado, es sabido que la homocisteina (HCT), un aminoácido desmetilado derivado de la metionina, y, por tanto, un intermedio del ciclo de la metionina, se metaboliza por remetilación a metionina o por sulfuración a cisteína. Para la remetilación, la metionina sintetasa necesita vitamina B12 como cofactor y ácido fólico como sustrato. Para la trans-sulftiración se requiere una cisteatonina beta-sintetasa (CBS) y vitamina B6 como cofactor. Un defecto en la remetilación o la transsulfuración lleva a una hiperhomocisteinemia. Diversos estudios han demostrado que la hiperhomocisteinemia, incluso leve a moderada (mayor de 12 nmol/mL), es un factor independiente para isquemia cerebral, infarto al miocardio, enfermedad arterial periférica y estenosis carotídea y de ahí la importancia de tenerla en cuenta en la valoración del riesgo vascular. Si bien entre sus causas las provenientes del ambiente extemo (no genéticas) son importantes, existen alteraciones genéticas importantes a considerar porque determinan tanto el pronóstico como el grado de respuesta terapéutica de cada caso.
El estrés oxidativo es otro factor que en gran medida también puede influir en nuestra mejor o peor respuesta a nivel endotelial y a nivel vascular en general. Por esta razón, este factor se puede considerar en la etiopatogenia molecular de la enfermedad vascular general, y éste no es otro que el grado de potencial defensivo frente al estrés oxidativo.
La cardiopatía isquémica y el infarto agudo del miocardio pueden ser la expresión de un proceso que comienza con un exceso de radicales libres, los cuales inician el proceso aterosclerótico por daño en la pared vascular, provocando la penetración al espacio subendotelial de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y por ende a la placa aterosclerótica. En diversas publicaciones científicas se analizan los mecanismos que posee nuestro organismo para producir y a la vez limitar la producción de especies reactivas de oxígeno. Un exceso de radicales libres suele iniciar el daño de la pared vascular y en este proceso se encuentra implicado el colesterol de LDL. Se ha demostrado una disminución en la incidencia de enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes. Una vez determinado cada riesgo genético particular se procede a determinar el riesgo genético global aplicando unas funciones apropiadas. En una realización particular, la determinación (cálculo) del riesgo genético global se lleva a cabo mediante la ecuación [4]:
Y RGP
RGG = ^-. [4] n donde
RGG representa el riesgo genético global a calcular;
RGP representa el valor calculado para cada riesgo genético particular analizado en relación con el riesgo genético global a calcular, y se calcula mediante las ecuaciones [1] ó [2] previamente descritas; y n es el número de riesgos genéticos particulares analizados en relación con el riesgo genético global a calcular.
A modo simplemente ilustrativo, no limitativo, el método proporcionado por esta invención para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento comprende calcular o determinar los siguientes riesgos genéticos particulares: 1. Riesgo genético particular asociado a padecer enfermedad vascular (riesgo vascular);
2. Riesgo genético particular asociado a osteoporosis (riesgo a osteoporosis);
3. Riesgo genético particular asociado a carcino génesis (riesgo carcinogénico); y
4. Riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo. Asimismo, en una realización particular, dicho riesgo vascular se determina en función de los riesgos genéticos particulares parciales seleccionados del grupo formado por riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico, riesgo genético particular parcial asociado a trombosis, riesgo genético particular parcial asociado a ictus, riesgo genético particular parcial asociado a hipertensión arterial y riesgo genético particular parcial asociado a vulnerabilidad endotelial.
De forma más concreta, en una realización particular, dicho riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por -75 G>A del gen APOAl , Arg3480Trp del gen APOB, Arg3500Gln del gen APOB, Arg3531Cys del gen APOB, Cysl l2Arg del gen APOE, Argl 58Cys del gen APOE, Arg451Gln del gen CETP, TaqíB B1>B2 del gen CETP, Glnl92Arg del gen PONÍ, Gly595Ala del gen SREBF2, Leu7Pro del gen NPY y combinaciones de las mismas. En otra una realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a trombosis se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 4G>5G del gen PAIl, Leu33Pro del gen ITGB3, 20210 G>A del gen FII, Arg506Gln del gen FV Leiden, Val34Leu del gen Fl 3Al, Ala222Val del gen MTHFR, 833 T>C del gen CBS,844ins68 del gen CBS, -455 G>A del gen FGB y combinaciones de las mismas.
En otra una realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a ictus se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 4G>5G del gen PAIl, Leu33Pro del gen ITGB3, 20210 G>A del gen FII, Arg506Gln del gen FV Leiden, Val34Leu del gen Fl 3Al y combinaciones de las mismas.
En otra una realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a hipertensión arterial se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por Gly389Arg del gen ADRBl ; Gln27Glu del gen ADRB2, GlylóArg del gen ADRB2, Met235Thr del gen AGT, 1 166 A>C del gen AGTRl, 393 T>C (Ilel31 Ile) del gen GNAS, 825 OT (Ser275Ser) del gen GNB3, intron 16 ins/del del gen ACE, Trp64Arg del gen ADRB3 y combinaciones de las mismas.
En otra una realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a vulnerabilidad endotelial se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 5A>6A del gen MMP3, -786 T>C del gen NOS3, Glu298Asp del gen NOS3, Ala222Val del gen MTHFR, 833 T>C del gen CBS, 844ins68 del gen CBS, Pro319Ser del gen GJ A4 y combinaciones de las mismas.
Por otra parte, en una realización particular de la invención, dicho riesgo genético particular asociado a osteoporosis se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 1546 G>T del gen COLlAl, IVS 1-397 T>C p>P (PvuII) del gen ESRl, t»B del gen VDR y combinaciones de las mismas.
En otra realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a carcino génesis se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por -34 A>G del gen CYP 17Al, Ile462Val del gen CYPl Al , T3801C del gen CYPlAl , Leu432Val del gen CYPlBl, Alelo*4 (Asn453Ser) del gen CYPlBl, 1558 C>T del gen CYP 19A1 , Vall 58Met (Alelo*2) del gen COMT, 331 G>A del gen PGR, IVSl -397 T>C p>P (PvuII) del gen ESRl, t»B del gen VDR, Ala49Thr del gen SRD5A2, Val89Leu del gen SRD5A2, Ala541Thr del gen ELAC2 y combinaciones de las mismas.
En una realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por Cys326Ser del gen OGGl, Alai 6VaI del gen SOD2, Arg213His del gen SULTlAl, presente>nulo GSTMl, presente>nulo GSTTl, IlelO5Val del gen GSTPl, Alai 14VaI del gen GSTPl, Vall58Met (Alelo*2) del gen COMT, -174 OG del gen IL6, -1082 G>A del gen ILlO, R64Q del gen NAT2, 282 C>T (Y94Y) del gen NAT2, I1 14T del gen NAT2, 481OT (L161L) del gen NAT2, R197Q del gen NAT2, K268R del gen NAT2, G286E del gen NAT2 y combinaciones de las mismas. Si se desea, el método de la invención comprende, además, evaluar o determinar el riesgo genético particular asociado a respuesta a fármacos, es decir, el riesgo genético particular a padecer reacciones adversas a fármacos.
En una realización particular, dicho riesgo genético particular asociado a respuesta a fármacos se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por R64Q, 282 OT (Y94Y), Il 14T, 481OT (Ll 61 L), R197Q, K268R y G286E del gen NAT2; Argl44Cys (alelo*2) y Ile359Leu (alelo*3) del gen CYP2C9; 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2) del gen CYP2C19; 2549 A>del (alelo*3), 1847 G>A (alelo*4) y 1707 del>T (alelo*6) del gen CYP2D6; y combinaciones de las mismas.
Por tanto, en una realización particular, el método de la invención comprende genotipar simultáneamente múltiples variantes génicas humanas o polimorfismos presentes en uno o más genes de un sujeto asociados a una patología asociada al envejecimiento en una muestra biológica de dicho sujeto, en el que dicha variante génica [mutación, polimorfismo (e.g., SNP) o variación alélica] a genotipar se selecciona del grupo formado por el polimorfismo intron 16 ins/del del gen ACE; el polimorfismo Gly389Arg del gen ADRBl ; los polimorfismos Gln27Glu y GlylóArg del gen ADRB2; el polimorfismo Trp64Arg del gen ADRB3; el polimorfismo Met235Thr del gen AGT; el polimorfismo 1 166 A>C del gen AGTRl; el polimorfismo -75 G>A del gen APOAl; los polimorfismos Arg3480Trp, Arg35OOGln, y Arg3531Cys del gen APOB; los polimorfismos Cysl l2Arg y Argl58Cys del gen APOE; los polimorfismos 833 T>C y 844ins68 del gen CBS; los polimorfismos TaqlB B1>B2 y Arg451Gln del gen CETP; el polimorfismo 1546 G>T del gen COLlAl; el polimorfismo Vall58Met (Alelo*2) del gen COMT; el polimorfismo -34 A>G del gen CYP 17Al ; el polimorfismo 1558 OT del gen CYP 19Al; el polimorfismo Ile462Val y T38O1C del gen CYPlAl; el polimorfismo Leu432Val y Alelo*4 (Asn453Ser) del gen CYPlBl ; el polimorfismo Argl44Cys (alelo*2) y Ile359Leu (alelo*3) del gen CYP2C9; el polimorfismo 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2) del gen CYP2C19; el polimorfismo 2549 A>del (alelo*3), 1847 G>A (alelo*4) y 1707 del>T (alelo*6) del gen CYP2D6; el polimorfismo Ala541Thr del gen ELAC2; el polimorfismo IVS l -397 T>C p>P (PvuII) del gen ESRl; el polimorfismo Val34Leu del gen F 13 Al ; el polimorfismo -455 G>A del gen FGB; el polimorfismo 20210 G>A del gen FII; el polimorfismo Arg506Gln del gen FV Leiden; el polimorfismo Pro319Ser del gen GJ A4; el polimorfismo 393 T>C (Ilel31Ile) del gen GNAS; el polimorfismo 825 OT (Ser275Ser) del gen GNB3; el polimorfismo presente>nulo GSTMl; los polimorfismos IlelO5Val y Alai 14VaI del gen GSTPl ; el polimorfismo presente>nulo GSTTl ; el polimorfismo - 174 OG del gen IL6; el polimorfismo -1082 G>A del gen ILlO; el polimorfismo Leu33Pro del gen ITGB3; el polimorfismo 5A>6A del gen MMP3; el polimorfismo Ala222Val del gen MTHFR; los polimorfismos R64Q, 282 OT (Y94Y), Il 14T, 481OT (Ll 61 L), R197Q, K268R y G286E del gen NAT2; los polimorfismos - 786 T>C y Glu298Asp del gen N0S3; el polimorfismo Leu7Pro del gen NPY; el polimorfismo Cys326Ser del gen OGGl; el polimorfismo 4G>5G del gen PAIl; el polimorfismo 331 G>A del gen PGR; el polimorfismo Glnl92Arg del gen PONÍ ; el polimorfismo Alai 6VaI del gen SOD2; los polimorfismos Ala49Thr y Val89Leu del gen SRD5A2; el polimorfismo Gly595Ala del gen SREBF2; el polimorfismo Arg213His del gen SULTlAl; el polimorfismo b>B del gen VDR; y combinaciones de los mismos. Asimismo, si se desea, el método de la invención comprende, además, genotipar una o más variantes génicas adicionales asociadas a patologías asociadas al envejecimiento.
El método de la invención constituye, por tanto, un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples variantes génicas humanas presentes en distintos genes, asociadas con patologías adsociadas al envejecimiento. El método de la invención permite identificar cambios de nucleótidos, inserciones, deleciones, etc. y determinar el genotipo de un sujeto para las variantes génicas relacionadas con patologías asociadas al envejecimiento analizadas.
Para la puesta en práctica del método de la invención se ha desarrollado un DNA-chip de genotipado útil para detectar dichas variantes génicas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a DNA-chip, en adelante
DNA-chip de la invención, que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas útiles para detectar variantes génicas humanas presentes en uno o más genes ( asociadas a patologías asociadas con el envejecimiento. En una realización particular, dichas sondas se seleccionan del grupo formado por las sondas identificadas como SEQ ID NO: 1-13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17-44, SEQ ID
NO: 53-128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132-172, SEQ ID NO: 181-200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210,
SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 222, y SEQ ID NO: 224-276 (ver apartado 1.1 del
Ejemplo 1 que acompaña a la descripción).
El DNA-chip de la invención, comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas útiles para detectar variantes génicas humanas presentes en uno o más genes asociadas con patologías asociadas al envejecimiento. Por cada variante génica, el DNA chip de la invención comprende 4 sondas, de las cuales 2 sondas detectan una primera variante génica y las otras 2 detectan una segunda variante génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas y las dos sondas no tienen porqué ser iguales. Dichas sondas están depositadas siguiendo un patrón determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2 áreas que constituyen el DNA-chip pero no agrupadas por variante génica a detectar, es decir, que están distribuidas a lo largo y ancho del chip y además no agrupadas dentro de una misma variante génica. El DNA-chip de la invención también puede contener, si se desea, unos oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y negativos de las reacciones de amplificación y/o hibridación.
Para que el presente DNA-chip permita la detección simultánea, sensible, específica y reproducible de variantes génicas resulte del todo eficaz y sea realmente una herramienta útil en medicina anti-envejecimiento, la traducción clínica y práctica de este análisis requiere del correspondiente algoritmo que integre el valor real de todos estos polimorfismos, teniendo en cuenta sinergias y antagonismos que ocurren entre ellos, presentándonos un riesgo en valores absolutos que siempre será diferente en dependencia del individuo analizado. El valor real de este riesgo deberá considerarse en el contexto global de cada caso teniendo en cuenta todos los factores (no genéticos) clásicos de riesgo. Sólo así se garantiza un análisis objetivo y una visión unitaria de una enfermedad tan compleja y multifactorial como por ejemplo la enfermedad vascular.
Con el fin de disminuir al máximo la tasa de falsos positivos y negativos, el DNA-chip de la invención comprende dos parejas de sondas para detectar cada variación genética. Cada pareja de sondas está constituida por una sonda específica para la detección de una variación genética (e.g., el alelo A) y por otra sonda diseñada para la detección de otra variación genética (e.g., el alelo B). En el caso de mutaciones puntuales, la base que difiere entre el alelo A y el B (base a interrogar) se coloca en la posición central de la sonda, lo que asegura la máxima especificidad en la hibridación. En el caso de inserciones, duplicaciones o deleciones son varias las bases que se pueden interrogar. Sin embargo, el diseño se hace completamente equivalente considerando como posición central el primer nucleótido que es diferente en la secuencia normal con respecto a la secuencia mutada. En una realización particular, el DNA-chip de la invención comprende 10 réplicas de cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación genética; en otra realización particular, el DNA-chip de la invención comprende 8 réplicas de cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación genética; y, en otra realización particular, el DNA-chip de la invención comprende 6 réplicas de cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación genética.
La disposición (colocación) de las sondas en el soporte está predeterminada. En una realización particular, las sondas depositadas en el soporte, aunque mantienen una disposición predeterminada, no están agrupadas por variación genética sino que tienen una distribución al azar, la cual, si se desea, puede ser siempre la misma.
La capacidad de las sondas específicas de variantes génicas para discriminar entre las variantes génicas (e.g., el alelo A y el alelo B) depende de las condiciones de hibridación, de la secuencia que flanquea a la mutación y de la estructura secundaria de la secuencia en la que se quiere detectar el polimorfismo. Unas condiciones de hibridación estables permiten establecer la hebra y la longitud apropiada de las sondas con el fin de maximizar la discriminación. Partiendo de sondas de 25 nucleótidos que detectan una variación genética (e.g., el alelo A) y otra variación genética (e.g., el alelo B) en ambas hebras (hebra sentido y hebra antisentido), se requiere, en general, una media de 8 sondas ensayadas experimentalmente para quedarse con las dos parejas definitivas.
En una realización particular, para cada variación genética a detectar mediante el DNA-chip de la invención, las sondas diseñadas interrogan ambas hebras, con longitudes típicamente comprendidas entre 19 y 27 nucleótidos, y la temperatura de hibridación varía entre 750C y 85°C.
En la Tabla 1 (Ejemplo 1) se incluye una relación de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento; no obstante, se pueden ir incorporando en los DNA-chips de la invención sondas que permitan la identificación de otras variantes génicas asociadas con dichas enfermedades.
Como se ha mencionado previamente, el DNA-chip de la invención puede contener, opcionalmente, unos oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y negativos de las reacciones de amplificación y/o hibridación. En una realización particular, el DNA-chip de la invención comprende unos oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y negativos de las reacciones de hibridación. En general, cada uno de los sub-arrays, que constituyen un DNA-chip, está flanqueado por unos controles externos de hibridación que permiten localizar fácilmente los puntos sobre el soporte. Aunque con la misma secuencia, el DNA-chip dispone de dos controles externos de hibridación marcados, por ejemplo, con un fluoróforo (e.g., Cy3, Cy5, etc.), que sirven para evaluar la calidad de la hibridación en ambos canales. En una realización particular, la secuencia de nucleótidos del control externo es la identificada en la SEQ ID NO: 415 (CEH), y las secuencias de los oligonucleótidos para su detección son las identificadas en SEQ ID NO: 416 y SEQ ID NO: 417.
El soporte sobre el que están depositadas la pluralidad de sondas puede ser cualquier superficie sólida sobre la que se puedan unir oligonucleótidos. Prácticamente cualquier soporte sobre el que pueda unirse o inmovilizarse un oligonucleótido, utilizado en la producción de DNA-chips, puede ser utilizado para la puesta en práctica de esta invención. A modo ilustrativo, dicho soporte puede ser un soporte no poroso, por ejemplo, un soporte de cristal, silicio, plástico, etc., o bien un soporte poroso, por ejemplo, membranas (nylon, nitrocelulosa, etc.), micropartículas, etc. En una realización particular, dicho soporte es un portaobjetos (porta) de cristal.
Las sondas se inmovilizan (unen) sobre el soporte utilizando técnicas convencionales de inmovilización de oligonucleótidos sobre la superficie de los soportes. Dichas técnicas dependen, entre otros factores, de la naturaleza del soporte utilizado [porosa (membranas, micropartículas, etc.) o no porosa (cristal, plástico, silicio, etc.)]. En general, las sondas pueden inmovilizarse sobre el soporte mediante el empleo de técnicas de inmovilización no covalentes o bien mediante el empleo de técnicas de inmovilización basadas en la unión covalente de las sondas a la superficie del soporte mediante procedimientos químicos.
La preparación de soportes no porosos (e.g., cristal, silicio, plástico, etc.) requiere, en general, un tratamiento previo con grupos reactivos (e.g., amino, aldehido, etc.) o bien recubrir la superficie del soporte con un miembro de un par de unión específica (e.g., avidina, estreptavidina, etc.). Asimismo, en general, resulta conveniente activar previamente las sondas a inmovilizar mediante grupos tiol, amino, etc., o biotina, etc., con el fin de conseguir una inmovilización específica de las sondas sobre el soporte.
La inmovilización de las sondas en el soporte puede llevarse a cabo por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas basadas en la síntesis in situ de las sondas sobre el propio soporte (e.g., fotolitografía, síntesis química directa, etc.), o mediante técnicas basadas en el empleo de brazos robotizados que depositan la sonda correspondiente presintetizada (impresión sin contacto, impresión por contacto, etc.), etc..
La disposición (colocación) de las sondas en el soporte está predeterminada. En una realización particular, las sondas depositadas en el soporte sólido, aunque mantienen una disposición predeterminada, no están agrupadas por variación genética sino que tienen una distribución al azar, la cual, si se desea, puede ser siempre la misma.
En una realización particular, el soporte es un portaobjetos de cristal, y, en este caso, las sondas, en el número de réplicas establecido (6, 8 ó 10), se imprimen en portas de cristal previamente tratados, por ejemplo, aminosilanizados, usando un equipo de producción automática de DNA-chips por deposición de los oligonucleótidos en el portaobjetos de cristal ("microarrayer") bajo condiciones apropiadas, por ejemplo, mediante entrecruzamiento con radiación ultravioleta y horneado (800C), manteniendo controlada la humedad y temperatura durante el proceso de deposición, típicamente entre 40-50% de humedad relativa y 200C de temperatura.
Las réplicas (sondas) se distribuyen en las placas de impresión, que contienen los oligonucleótidos en solución, de forma que las impriman un número de puntas distintas igual a la mitad de las réplicas. Las réplicas se distribuyen homogéneamente entre las áreas o sectores (sub-arrays) que constituyen el DNA-chip. El número de réplicas así como su homogénea distribución a lo largo y ancho del DNA-chip minimizan la variabilidad experimental proveniente de los procesos de impresión e hibridación. Asimismo, se imprimen controles positivos y negativos de hibridación. En general, cada uno de los sub-arrays que constituyen el DNA-chip está flanqueado por unos controles externos de hibridación que permiten localizar fácilmente los puntos sobre el soporte. Aunque con la misma secuencia, el DNA-chip dispone de dos controles externos de hibridación marcados, por ejemplo, con un fluoróforo (e.g., Cy3, Cy5, etc.), que sirven para evaluar la calidad de la hibridación en ambos canales. En una realización particular, la secuencia de nucleótidos del control externo es la identificada previamente como "CEH" y las secuencias de los oligonucleótidos para su detección son las identificadas previamente como ONl y ON2.
Para controlar la calidad del proceso de fabricación del DNA-chip en términos de señal de hibridación, ruido de fondo, especificidad, sensibilidad, reproducibilidad de cada réplica (coeficiente de variación) así como del tamaño y forma de los puntos impresos (sondas) se puede utilizar un DNA comercial. A modo ilustrativo, como control de calidad de la impresión de los DNA-chips de la invención, se lleva a cabo la hibridación con un DNA con genotipo conocido de uno de cada un número determinado de soportes cargados con las sondas, por ejemplo, cada 20 soportes impresos. Se comprueba el correcto genotipado de ese DNA control. Los inventores han diseñado, producido y validado la utilización clínica del método de la invención en la detección de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento. Por tanto, en una realización particular, el DNA- chip de la invención es un DNA-chip que permite la detección simultánea, sensible, específica y reproducible de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de variantes génicas asociadas a envejecimiento que pueden ser identificados se recogen en la Tabla 1 ; no obstante, la relación de variantes génicas contenida en dicha tabla puede incrementarse con otras variantes génicas que vayan identificándose posteriormente y que estén asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento. Las secuencias de todos los genes mencionados en la Tabla 1 son conocidas y están recogidas, entre otras, en las siguientes páginas webs: GeneBank (NCBI), y Snpper.chip.org (Innate Immunity PGA).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit para la puesta en práctica del método de la invención, en adelante kit de la invención, que comprende un DNA- chip de la invención que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas que permiten la detección de variantes génicas humanas presentes en uno o más genes asociadas con patologías asociadas al envejecimiento. En una realización particular, el kit de la invención contiene un protocolo de detección de dichas variantes génicas, que comprende el empleo de un algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente, un protocolo de cálculo del riesgo que confieren dichas variantes génicas, que comprende el empleo de diversos algoritmos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente, un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de la invención.
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Detección de variantes génicas (polimorfismos) humanas asociadas a patologías asociadas al envejecimiento, utilizando un DNA-chip 1.1 Diseño del DNA-chip
Se diseñó y fabricó un DNA-chip para detectar variantes génicas humanas, en particular SNPs (del inglés, Single Nucleotide Polymorphisms) asociadas a patologías asociadas al envejecimiento que permite la detección simultánea, sensible, específica y reproducible de variantes génicas asociadas a dichas patologías.
A continuación se incluye una relación de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento; no obstante, se pueden ir incorporando en el DNA-chip de la invención sondas que permitan la identificación de otras variantes génicas asociadas con dichas enfermedades.
Tabla 1
Variantes génicas de patologías asociadas al envejecimiento analizadas
SNP01 ACE intron 16 ins/del SNP02 ADRBl Gly389Arg
SNP03 ADRB2 Gln27Glu
SNP04 ADRB2 GlylóArg
SNP05 ADRB3 Trp64Arg
SNP06 AGT Met235Thr SNP07 AGTRI l 166 A>C
SNP08 APOAl -75 G>A
SNP09 APOB Arg3480Trp
SNP 10 APOB Arg3500GIn
SNPI l APOB Arg3531Cys SNP 12 APOE Cysl l2Arg
SNP 13 APOE Argl58Cys
SNP 14 CBS 833 T>C
SNP 15 CBS 844ins68
SNP 16 CETP TaqlB B1>B2 SNP 17 CETP Arg451 GIn
SNP 18 COLlAl 1546 G>T
SNP19 COMT Valí 58Met (Alelo*2)
SNP20 CYP17A1 -34 A>G SNP21 CYP 19Al 1558 OT
SNP22 CYPlAl Ile462Val
SNP23 CYPlAl T38O1C
SNP24 CYPlBl Leu432Val
SNP25 CYPlBl Alelo*4 (Asn453Ser)
SNP26 CYP2C9 Argl44Cys (alelo*2)
SNP27 CYP2C9 Ile359Leu (alelo*3)
SNP28 CYP2C19 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2)
SNP29 CYP2D6 2549 A>del (alelo*3)
SNP30 CYP2D6 1847 G>A (alelo*4)
SNP31 CYP2D6 1707 del>T (alelo*6)
SNP32 ELAC2 Ala541Thr
SNP33 ESRl IVSl -397 T>C (PvuII) p>P
SNP34 F13A1 Val34Leu
SNP35 FGB -455 G>A
SNP36 FII 20210 G>A
SNP37 FV Leiden Arg506Gln
SNP38 GJA4 Pro319Ser
SNP39 GNAS 393 T>C (Ilel31Ile)
SNP40 GNB3 825 OT (Ser275Ser)
SNP41 GSTMl presente>nulo
SNP42 GSTPl He 105VaI
SNP43 GSTPl Alai 14VaI
SNP44 GSTTl presentonulo
SNP45 IL6 -174 OG
SNP46 ILlO -1082 G>A
SNP47 ITGB3 Leu33Pro
SNP48 MMP3 5A>6A
SNP49 MTHFR Ala222Val
SNP50 NAT2 R64Q
SNP51 NAT2 282 OT (Y94Y)
SNP52 NAT2 I114T
SNP53 NAT2 481OT (L161 L) SNP54 NAT2 R197Q
SNP55 NAT2 K268R
SNP56 NAT2 G286E
SNP57 NOS3 -786 T>C SNP58 NOS3 Glu298Asp
SNP59 NPY Leu7Pro
SNP60 OGGl Cys326Ser
SNP61 PAIl 4G>5G
SNP62 PGR 331 G>A SNP63 PONÍ Glnl92Arg
SNP64 SOD2 AlalóVal
SNP65 SRD5A2 Ala49Thr
SNP66 SRD5A2 Val89Leu
SNP67 SREBF2 Gly595Ala SNP68 SULTlAl Arg213His
SNP69 VDR b>B
En este caso concreto, el DNA-chip diseñado y fabricado consta de un soporte (portaobjetos de cristal) que contiene sobre su superficie una pluralidad de sondas que permiten la detección de las variantes génicas mencionadas anteriormente. Estas sondas son capaces de hibridar con las secuencias diana amplificadas de genes asociados con patologías relacionadas con el envejecimiento cuya variación genética se desea analizar. Las secuencias de DNA de cada una de las sondas utilizadas son las siguientes [en general, se indica el nombre del gen y la variación genética (cambio del aminoácido, cambio de nucleótido, "ins": inserción, "del": deleción)]:
Sondas utilizadas
SNPOl ACE Intron 16 ins/del SEQ ID NO: 1 GATTACAGGCGTGATACAGTCAC SEQ ID NO: 2 GTGACTGTATCACGCCTGTAATC SEQ ID NO: 3 AGACCTGCTGCCTATACAGTCAC SEQ ID NO: 4 GTGACTGTATAGGCAGCAGGTCT SNP02 ADRBl Gly389Arg
SEQ ID NO: 5 AGGCCTTCCAGCGACTGCTCTGC
SEQ ID NO: 6 GCAGAGCAGTCGCTGGAAGGCCT SEQ ID NO: 7 AGGCCTTCCAGGGACTGCTCTGC
SEQ ID NO: 8 GCAGAGCAGTCCCTGGAAGGCCT
SNP03 ADRB2 Gln27Glu
SEQ ID NO: 9 ACGTCACGCAGGAAAGGGACGAG SEQ ID NO: 10 CGTCACGCAGGAAAGGGACGA
SEQ ID NO: 1 1 ACGTCACGCAGCAAAGGGACGAG
SEQ ID NO: 12 CGTCACGCAGCAAAGGGACGA
SNP04 ADRB2 GlylóArg SEQ ID NO: 13 TGGCACCCAATAGAAGCCATGCG
SEQ ID NO: 14 CTGGCACCC AATAGAAGCCATGCGC
SEQ ID NO: 15 TGGCACCCAATGGAAGCCATGCG
SEQ ID NO: 16 CTGGCACCCAATGGAAGCCATGCGC
SNP05 ADRB3 Trp64Arg
SEQ ID NO: 17 TGGCCATCGCCTGGACTCCGAGA
SEQ ID NO: 18 TCTCGGAGTCCAGGCGATGGCCA
SEQ ID NO: 19 TGGCCATCGCCCGGACTCCGAGA
SEQ ID NO: 20 TCTCGGAGTCCGGGCGATGGCCA
SNP06 AGT Met235Thr
SEQ ID NO: 21 GGCTGCTCCCTGACGGGAGCCAGTGTG
SEQ ID NO: 22 CACACTGGCTCCCGTCAGGGAGCAGCC
SEQ ID NO: 23 GGCTGCTCCCTGATGGGAGCCAGTGTG SEQ ID NO: 24 CACACTGGCTCCCATCAGGGAGCAGCC SNP07 AGTRl 1166 A>C
SEQ ID NO: 25 ACCAAATGAGCATTAGCTACTTT
SEQ ID NO: 26 AAAGTAGCTAATGCTCATTTGGT
SEQ ID NO: 27 ACCAAATGAGCCTT AGCTACTTT SEQ ID NO: 28 AAAGT AGCT AAGGCTCATTTGGT
SNP08 APOAl -75 G>A
SEQ ID NO: 29 AGCCCAGCCCCGGCCCTGTTG SEQ ID NO: 30 GCCCAGCCCCGGCCCTGTT SEQ ID NO: 31 AGCCC AGCCCTGGCCCTGTTG SEQ ID NO: 32 GCCCAGCCCTGGCCCTGTT
SNP09 APOB Arg3480Trp
SEQ ID NO: 33 CGGTTCTTTCTCGGGAATATTCA SEQ ID NO: 34 TGAAT ATTCCCGAGAAAGAACCG SEQ ID NO: 35 CGGTTCTTTCTTGGGAAT ATTCA
SEQ ID NO: 36 TGAATATTCCCAAGAAAGAACCG
SNPlO APOB Arg3500Gln SEQ ID NO: 37 CAAGAGCACACGGTCTTCAGTGA
SEQ ID NO: 38 TCACTGAAGACCGTGTGCTCTTG
SEQ ID NO: 39 CAAGAGCACACAGTCTTCAGTGA SEQ ID NO: 40 TCACTGAAGACTGTGTGCTCTTG
SNPIl APOB Arg3531Cys
SEQ ID NO: 41 CCAC ACTCCAACGCAT ATATTCC
SEQ ID NO: 42 GGAATAT ATGCGTTGGAGTGTGG SEQ ID NO: 43 CCACACTCCAATGCAT AT ATTCC
SEQ ID NO: 44 GGAATAT ATGCATTGGAGTGTGG SNP12 APOE Cysll2Arg
SEQ ID NO: 45 ATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGG SEQ ID NO: 46 CCAGGCGGCCGCACACGTCCTCCAT SEQ ID NO: 47 ATGGAGGACGTGCGCGGCCGCCTGG SEQ ID NO: 48 CCAGGCGGCCGCGCACGTCCTCCAT
SNP13 APOE Argl58Cys
SEQ ID NO: 49 GACCTGC AGAAGCGCCTGGC AGTGT SEQ ID NO: 50 ACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTC SEQ ID NO: 51 GACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGT SEQ ID NO: 52 ACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTC
SNP14 CBS 833 T>C
SEQ ID NO: 53 GATCCACCCCAGTGATCTGCAGA SEQ ID NO: 54 ATCCACCCCAGTGATCTGCAG
SEQ ID NO: 55 GATCCACCCCAATGATCTGCAGA
SEQ ID NO: 56 ATCCACCCCAATGATCTGCAG
SNP15 CBS 844ins68 SEQ ID NO: 57 TGGGGTGGATC ATCC AGGTGGGG SEQ ID NO: 58 CCCCACCTGGATGATCCACCCCA
SEQ ID NO: 59 TGGGGTGGATCCCGAAGGGTCCA SEQ ID NO: 60 TGGACCCTTCGGGATCCACCCCA
SNP16 CETP TaqlB B1>B2
SEQ ID NO: 61 CACTGGGGTTCGAGTT AGGGTTC
SEQ ID NO: 62 GAACCCTAACTCGAACCCCAGTG
SEQ ID NO: 63 CACTGGGGTTCAAGTTAGGGTTC SEQ ID NO: 64 GAACCCT AACTTGAACCCCAGTG SNP17 CETP Arg451Gln
SEQ ID NO: 65 GATTATCACTCGAGATGTGAGTA SEQ ID NO: 66 ATTATCACTCGAGATGTGAGT SEQ ID NO: 67 GATTATCACTCAAGATGTGAGTA SEQ ID NO: 68 ATTATCACTCAAGATGTGAGT
SNPl 8 COLlAl 1546 G>T
SEQ ID NO: 69 TCATCCCGCCCCCATTCCCTGGG SEQ ID NO: 70 CATCCCGCCCCCATTCCCTGG
SEQ ID NO: 71 TCATCCCGCCCACATTCCCTGGG
SEQ ID NO: 72 CATCCCGCCCACATTCCCTGG
SNP19 COMT Vall58Met (Alelo*2) SEQ ID NO: 73 ATTTCGCTGGCGTGAAGGACAAG
SEQ ID NO: 74 CTTGTCCTTCACGCCAGCGAAAT
SEQ ID NO: 75 ATTTCGCTGGCATGAAGGACAAG
SEQ ID NO: 76 CTTGTCCTTCATGCCAGCGAAAT
SNP20 CYP17A1 -34 A>G
SEQ ID NO: 77 TCTACTCCACTGCTGTCTATC SEQ ID NO: 78 AGATAGACAGCAGTGGAGTAGAA
SEQ ID NO: 79 TCTACTCCACCGCTGTCTATC SEQ ID NO: 80 AGATAGACAGCGGTGGAGTAGAA
SNP21 CYP19A11558 OT
SEQ ID NO: 81 TGGTCAGTACCCACTCTGGAGCA SEQ ID NO: 82 TGCTCCAGAGTGGGTACTGACCA SEQ ID NO: 83 TGGTCAGTACCTACTCTGGAGCA SEQ ID NO: 84 TGCTCCAGAGTAGGTACTGACCA SNP22 CYPlAl Ile462Val
SEQ ID NO: 85 TCGGTGAGACCATTGCCCGCTGG
SEQ ID NO: 86 CCAGCGGGCAATGGTCTCACCGA
SEQ ID NO: 87 TCGGTGAGACCGTTGCCCGCTGG SEQ ID NO: 88 CCAGCGGGCAACGGTCTCACCGA
SNP23 CYPlAl T3801C
SEQ ID NO: 89 TCCACCTCCTGGGCTCACA
SEQ ID NO: 90 TCCACCTCCCGGGCTCACA SEQ ID NO: 91 TCCACCTCCTGGGCTCACA
SEQ ID NO: 92 TCCACCTCCCGGGCTCACA
SNP24 CYPlBl Leu432Val
SEQ ID NO: 93 AATC ATGACCC ACTG AAGTGGC CTA SEQ ID NO: 94 TAGGCCACTTCAGTGGGTCATGATT
SEQ ID NO: 95 AATCATGACCCAGTGAAGTGGCCTA
SEQ ID NO: 96 TAGGCCACTTCACTGGGTCATGATT
SNP25 CYPlBl Alelo*4 (Asn453Ser) SEQ ID NO: 97 CGGCCTCATCAACAAGGACCTGA
SEQ ID NO: 98 TCAGGTCCTTGTTGATGAGGCCG SEQ ID NO: 99 CGGCCTCATCAGCAAGGACCTGA
SEQ ID NO: 100 TCAGGTCCTTGCTGATGAGGCCG
SNP26 CYP2C9 Argl44Cys (alelo*2)
SEQ ID NO: 101 GCATTGAGGACCGTGTTCAAGAG SEQ ID NO: 102 CTCTTGAACACGGTCCTCAATGC SEQ ID NO: 103 GCATTGAGGACTGTGTTC AAGAG SEQ ID NO: 104 CTCTTGAACACAGTCCTCAATGC SNP27 CYP2C9 Ile359Leu (alelo*3)
SEQ ID NO: 105 TCCAGAGAT AC ATTGACCTTCTC SEQ ID NO: 106 GAGAAGGTCAATGT ATCTCTGGA SEQ ID NO: 107 TCCAGAGATACCTTGACCTTCTC SEQ ID NO: 108 GAGAAGGTCAAGGT ATCTCTGGA
SNP28 CYP2C19 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2)
SEQ ID NO: 109 GATTATTTCCCGGGAACCCATAA SEQ ID NO: 1 10 ATTATTTCCCGGGAACCCATA SEQ ID NO: 1 11 GATTATTTCCCAGGAACCCATAA SEQ ID NO: 1 12 ATTATTTCCCAGGAACCCATA
SNP29 CYP2D6 2549 A>del (alelo *3)
SEQ ID NO: 113 CCAGGTCATCCTGTGCTCAGTTA SEQ ID NO: 114 CAGGTCATCCTGTGCTCAGTT
SEQ ID NO: 1 15 CCAGGTCATCCGTGCTCAGTTAG SEQ ID NO: 1 16 CAGGTCATCCGTGCTCAGTTA
SNP30 CYP2D6 1847 G>A (alelo*4) SEQ ID NO: 1 17 CCCACCCCCAGGACGCCCCTT SEQ ID NO: 1 18 CCACCCCCAGGACGCCCCT SEQ ID NO: 1 19 CCCACCCCCAAGACGCCCCTT SEQ ID NO: 120 CCACCCCCAAGACGCCCCT
SNP31 CYP2D6 1707 del>T (alelo*6)
SEQ ID NO: 121 GCTGGAGC AGTGGGTGACCGA SEQ ID NO: 122 CTGGAGCAGTGGGTGACCG SEQ ID NO: 123 CGCTGGAGCAGGGGTGACCGA SEQ ID NO: 124 GCTGGAGC AGGGGTGACCG SNP32 ELAC2 Ala541Thr
SEQ ID NO: 125 GCACCCTGGCTGCTGTGTTTGTG SEQ ID NO: 126 CACAAAC AC AGC AGCC AGGGTGC SEQ ID NO: 127 GCACCCTGGCTACTGTGTTTGTG SEQ ID NO: 128 CACAAACACAGTAGCCAGGGTGC
SNP33 ESRl IVSl -397 T>C (PvuII) p>P
SEQ ID NO: 129 AATGTCCC AGCTGTTTTATGCTT SEQ ID NO: 130 ATGTCCCAGCTGTTTT ATGCT SEQ ID NO: 131 AATGTCCCAGCCGTTTTATGCTT SEQ ID NO: 132 ATGTCCCAGCCGTTTTATGCT
SNP34 F13A1 Val34Leu
SEQ ID NO: 133 AGCTTCAGGGCGTGGTGCCCCGG SEQ ID NO: 134 GCTTCAGGGCGTGGTGCCCCG SEQ ID NO: 135 AGCTTC AGGGCTTGGTGCCCCGG SEQ ID NO: 136 GCTTCAGGGCTTGGTGCCCCG
SNP35 FGB -455 G>A SEQ ID NO: 137 TTGATTTT AATGGCCCCTTTTGA SEQ ID NO: 138 TC AAAAGGGGC C ATT AAAATC AA SEQ ID NO: 139 TTGATTTTAATAGCCCCTTTTGA SEQ ID NO: 140 TC AAAAGGGGCTATT AAAATC AA
SNP36 FII 20210 G>A
SEQ ID NO: 141 TGACTCTC AGCGAGCCTC AATGC SEQ ID NO: 142 GC ATTG AGGCTC GCTG AG AGTC A SEQ ID NO: 143 TGACTCTCAGCAAGCCTCAATGC SEQ ID NO: 144 GCATTGAGGCTTGCTGAGAGTCA SNP37 FV Leiden Arg506Gln
SEQ ID NO: 145 CCTGGACAGGCGAGGAATACAGG SEQ ID NO: 146 CCTGTATTCCTCGCCTGTCCAGG SEQ ID NO: 147 CCTGGACAGGCAAGGAATACAGG SEQ ID NO: 148 CCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGG
SNP38 GJA4 Pro319Ser
SEQ ID NO: 149 ATGGCCAAAAACCCCCAAGTCGT SEQ ID NO: 150 ACGACTTGGGGGTTTTTGGCCAT SEQ ID NO: 151 ATGGCCAAAAATCCCCAAGTCGT SEQ ID NO: 152 ACGACTTGGGGATTTTTGGCCAT
SNP39 GNAS 393 T>C (Ilel31Ile)
SEQ ID NO: 153 GTGGACTACATTCTGAGTGTGAT SEQ ID NO: 154 ATCACACTCAGAATGTAGTCCAC
SEQ ID NO: 155 GTGGACTACATCCTGAGTGTGAT
SEQ ID NO: 156 ATCACACTCAGGATGTAGTCCAC
SNP40 GNB3 825 OT (Ser275Ser) SEQ ID NO: 157 GGCATCACGTCCGTGGCCTTCTC SEQ ID NO: 158 GAGAAGGCCACGGACGTGATGCC SEQ ID NO: 159 GGCATCACGTCTGTGGCCTTCTC SEQ ID NO: 160 GAGAAGGCCACAGACGTGATGCC
SNP41 GSTMl presente>nulo
SEQ ID NO: 161 CACAT ATTCTTGGCCTTCTGCAGAT SEQ ID NO: 162 ATCTGCAGAAGGCCAAGAATATGTG SEQ ID NO: 163 CACATATTCTTGACCTTCTGCAGAT
SEQ ID NO: 164 ATCTGCAGAAGGTCAAGAAT ATGTG SNP42 GSTPl IlelO5Vai
SEQ ID NO: 165 GCTGCAAAT ACATCTCCCTCATC SEQ ID NO: 166 GATGAGGGAGATGT ATTTGCAGC SEQ ID NO: 167 GCTGCAAAT ACGTCTCCCTCATC SEQ ID NO: 168 G ATG AGGG AG AC GT ATTTGC AGC
SNP43 GSTPl Alai 14VaI
SEQ ID NO: 169 CTGGCAGGAGGCGGGC AAGGATG SEQ ID NO: 170 ATCCTTGCCCGCCTCCTGCCA SEQ ID NO: 171 CTGGC AGGAGGTGGGC AAGGATG SEQ ID NO: 172 ATCCTTGCCCACCTCCTGCCA
SNP44 GSTTl presente>nulo
SEQ ID NO: 173 CTGCCT AGTGGGTTCACCTGCCCAC SEQ ID NO: 174 GTGGGCAGGTGAACCCACTAGGCAG SEQ ID NO: 175 CTGCCTAGTGGGGTCACCTGCCCAC SEQ ID NO: 176 GTGGGCAGGTGACCCCACTAGGCAG
SNP45 IL6 -174 OG SEQ ID NO: 177 TTGTGTCTTGCGATGCT AAAGGA SEQ ID NO: 178 TCCTTT AGC ATCGCAAGACACAA SEQ ID NO: 179 TTGTGTCTTGCCATGCTAAAGGA SEQ ID NO: 180 TCCTTT AGCATGGCAAGACACAA
SNP46 ILlO -1082 G>A
SEQ ID NO: 181 CTTCTTTGGGAAGGGGAAGTAGG
SEQ ID NO: 182 CCTACTTCCCCTTCCCAAAGAAG
SEQ ID NO: 183 CTTCTTTGGGAGGGGGAAGTAGG
SEQ ID NO: 184 CCTACTTCCCCCTCCCAAAGAAG SNP47 ITGB3 Leu33Pro
SEQ ID NO: 185 GCCCTGCCTCTGGGCTCACCT SEQ ID NO: 186 GAGGTGAGCCCAGAGGCAGGGCC SEQ ID NO: 187 GCCCTGCCTCCGGGCTCACCT SEQ ID NO: 188 GAGGTGAGCCCGGAGGCAGGGCC
SNP48 MMP3 5A>6A
SEQ ID NO: 189 ATGGGGGGAAAAAACCATGTCTT SEQ ID NO: 190 GGGGAAAAAACCATGTCTTGTC SEQ ID NO: 191 ATGGGGGGAAAAACCATGTCTTG SEQ ID NO: 192 GGGGAAAAACCATGTCTTGTCC
SNP49 MTHFR Ala222Val
SEQ ID NO: 193 TCTGCGGGAGCCGATTTCATC SEQ ID NO: 194 TGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC SEQ ID NO: 195 TCTGCGGGAGTCGATTTCATC SEQ ID NO: 196 TGATGAAATCGACTCCCGCAGAC
SNP50 NAT2 R64Q SEQ ID NO: 197 ACCACCCACCCCGGTTTCTTCTT SEQ ID NO: 198 CCACCCACCCCGGTTTCTTCT SEQ ID NO: 199 ACCACCCACCCTGGTTTCTTCTT SEQ ID NO: 200 CCACCCACCCTGGTTTCTTCT
SNP51 NAT2 282 OT (Y94Y)
SEQ ID NO: 201 AGGGT ATTTTTAC ATCCCTCC AGTT
SEQ ID NO: 202 GGGTATTTTTACATCCCTCCAGT
SEQ ID NO: 203 AGGGTATTTTTATATCCCTCCAGTT
SEQ ID NO: 204 GGGTATTTTTATATCCCTCCAGT SNP52 NAT2 I114T
SEQ ID NO: 205 GCAGGTGACCATTGACGGCAGGA SEQ ID NO: 206 CAGGTGACCATTGACGGCAGG SEQ ID NO: 207 GCAGGTGACCACTGACGGCAGGA SEQ ID NO: 208 CAGGTGACCACTGACGCJCAGG
SNP53 NAT2 481OT (L161L)
SEQ ID NO: 209 GGAATCTGGTACCTGGACCAAATCA SEQ ID NO: 210 AGGAATCTGGTACCTGGACC AAATC AG SEQ ID NO: 21 1 GGAATCTGGTACTTGGACCAAATCA
SEQ ID NO: 212 AGGAATCTGGTACTTGGACCAAATCAG
SNP54 NAT2 R197Q
SEQ ID NO: 213 CGCTTGAACCTCGAAC AATTGAAGA SEQ ID NO: 214 GCTTGAACCTCGAACAATTGAAG SEQ ID NO: 215 CGCTTGAACCTCAAACAATTGAAGA
SEQ ID NO: 216 GCTTGAACCTCAAACAATTGAAG
SNP55 NAT2 K268R SEQ ID NO: 217 AAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAA SEQ ID NO: 218 TTAAATATATTTTTCAGCACTTCTT SEQ ID NO: 219 AAGAAGTGCTGAGAAATATATTTAA
SEQ ID NO: 220 TT AAATAT ATTTCTCAGCACTTCTT
SNP56 NAT2 G286E
SEQ ID NO: 221 AAC CTGGTGATGGATC C CTTACTAT SEQ ID NO: 222 ACCTGGTGATGGATCCCTTACTA SEQ ID NO: 223 AACCTGGTGATGAATCCCTTACTAT SEQ ID NO: 224 ACCTGGTGATGAATCCCTTACTA SNP57 NOS3 -786 T>C
SEQ ID NO: 225 TCTTCCCTGGCTGGCTGACCCTG SEQ ID NO: 226 CAGGGTCAGCCAGCCAGGGAAGA SEQ ID NO: 227 TCTTCCCTGGCCGGCTGACCCTG SEQ ID NO: 228 CAGGGTCAGCCGGCCAGGGAAGA
SNP58 NOS3 GIu298Asp
SEQ ID NO: 229 GCCCCAGATGAGCCCCCAGAACT
SEQ ID NO: 230 AGTTCTGGGGGCTCATCTGGGGC SEQ ID NO: 231 GCCCCAGATGATCCCCCAGAACT
SEQ ID NO: 232 AGTTCTGGGGGATCATCTGGGGC
SNP59 NPY Leu7Pro
SEQ ID NO: 233 CGGAC AGCCCCAGTCGCTTGTTA SEQ ID NO: 234 TAACAAGCGACTGGGGCTGTCCG SEQ ID NO: 235 CGGACAGCCCCGGTCGCTTGTTA SEQ ID NO: 236 TAACAAGCGACCGGGGCTGTCCG
SNP60 OGGl Cys326Ser SEQ ID NO: 237 CCTGCGCCAATCCCGCCATGCTC SEQ ID NO: 238 CTGCGCCAATCCCGCCATGCT SEQ ID NO: 239 CCTGCGCCAATGCCGCCATGCTC SEQ ID NO: 240 CTGCGCCAATGCCGCCATGCT
SNP61 PAIl 4G>5G
SEQ ID NO: 241 CTGACTCCCCCACGTGT SEQ ID NO: 242 CTGACTCCCCACGTGTC SEQ ID NO: 243 CTGACTCCCCCACGTGT SEQ ID NO: 244 CTGACTCCCCACGTGTC SNP62 PGR 331 G>A
SEQ ID NO: 245 CGGGAGATAAAAGAGCCGCGTGT SEQ ID NO: 246 ACACGCGGCTCTTTTATCTCCCG SEQ ID NO: 247 CGGGAGAT AAAGGAGCCGCGTGT SEQ ID NO: 248 ACACGCGGCTCCTTTATCTCCCG
SNP63 PONÍ Glnl92Arg
SEQ ID NO: 249 CCCCT ACTT ACAATCCTGGGAGA
SEQ ID NO: 250 TCTCCCAGGATTGT AAGTAGGGG SEQ ID NO: 251 CCCCT ACTT ACGATCCTGGGAGA
SEQ ID NO: 252 TCTCCCAGGATCGTAAGTAGGGG
SNP64 SOD2 AlalóVal
SEQ ID NO: 253 GATACCCCAAAGCCGGAGCCAGC SEQ ID NO: 254 ATACCCCAAAGCCGGAGCCAG SEQ ID NO: 255 GATACCCCAAAACCGGAGCCAGC SEQ ID NO: 256 ATACCCCAAAACCGGAGCCAG
SNP65 SRD5A2 Ala49Thr SEQ ID NO: 257 CCCGCCTGCCAGCCCGCGCCGCC
SEQ ID NO: 258 CCGCCTGCCAGCCCGCGCCGC
SEQ ID NO: 259 CCCGCCTGCCAACCCGCGCCGCC
SEQ ID NO: 260 CCGCCTGCCAACCCGCGCCGC
SNP66 SRD5A2 Val89Leu
SEQ ID NO: 261 C CTCTTCTGC GTAC ATTACTT SEQ ID NO: 262 CTCTTCTGCGTACATTACT SEQ ID NO: 263 CCTCTTCTGCCTACATTACTT SEQ ID NO: 264 CTCTTCTGC CTAC ATTACT SNP67 SREBF2 GIy595Ala
SEQ ID NO: 265 GCTGCTGCCGGCAACCTACAA
SEQ ID NO: 266 TTGTAGGTTGCCGGCAGCAGC
SEQ ID NO: 267 GCTGCTGCCGCCAACCTACAA SEQ ID NO: 268 TTGTAGGTTGGCGGCAGCAGC
SNP68 SULTlAl Arg213His
SEQ ID NO: 269 TTTGTGGGGCGCTCCCTGCCA SEQ ID NO: 270 TTGTGGGGCGCTCCCTGCC SEQ ID NO: 271 TTTGTGGGGCACTCCCTGCCA SEQ ID NO: 272 TTGTGGGGCACTCCCTGCC
SNP69 VDR b>B
SEQ ID NO: 273 GACAGGCCTGCGCATTCCCAATA SEQ ID NO: 274 TATTGGGAATGCGCAGGCCTGTC
SEQ ID NO: 275 GACAGGCCTGCACATTCCCAATA
SEQ ID NO: 276 TATTGGGAATGTGCAGGCCTGTC
1.2 Producción del DNA-chip para genotipado de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento: Impresión v procesamiento de los portaobjetos de vidrio
Las sondas capaces de detectar las distintas variantes génicas identificadas previamente se imprimen en el soporte (portaobjetos de cristal) aminosilanizado empleando DMSO como tampón de impresión. La impresión se lleva a cabo con un spottβr o impresor de oligonucleótidos (sondas) controlando la temperatura y la humedad relativa.
La unión de las sondas al soporte (portaobjetos de cristal) se lleva a cabo mediante entrecruzamiento con radiación ultravioleta y horneado tal y como se describe en la documentación aportada por el fabricante (por ejemplo, Corning Lifesciences http://www.corning.com). La humedad relativa durante el proceso de deposición se mantiene entre el 40-50% y la temperatura en torno a 200C. 1.3 Validación de la utilidad clínica del DNA-chip para la identificación de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento: Detección simultánea, sensible, específica y reproducible de variantes génicas humanas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento
1.3.1 Preparación de la muestra a hibridar
Se extrae DNA del individuo a partir de una muestra biológica (por ejemplo, sangre periférica, saliva, etc) mediante un protocolo de filtración (por ejemplo, kits comerciales de Macherey Nagel, Qiagen, etc).
Se amplifican todos los exones e mirones de interés mediante amplificación multiplex utilizando las parejas de oligonucleótidos cebadores apropiadas. Prácticamente puede utilizarse cualquier pareja de oligonucleótidos cebadores que permita la amplificación específica de fragmentos génicos en los que pueda existir la variación genética a detectar, ventajosamente, aquellas parejas que permitan dicha amplificación en el menor número posible de reacciones de amplificación; en particular se seleccionaron unos oligonucleótidos cebadores que permiten amplificar en tan solo 5 reacciones de amplificación multiplex, los fragmentos necesarios para el genotipado de las 69 variantes génicas previamente mencionadas analizadas utilizando el DNA-chip de la invención para la detección de variantes génicas asociadas a patologías asociadas al envejecimiento.
Los oligonucleótidos cebadores utilizados para llevar a cabo la amplificación multiplex para la detección de variantes génicas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento pueden ser diseñados utilizando las secuencias de los genes correspondientes tal y como se describen en GenBank usando por ejemplo los softwares:
Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi') o Web Primer (http://seq.veastgenome.org/cgi-bin/web-primer) Los oligonucleótidos cebadores utilizados para amplificar, mediante amplificación multiplex las variantes génicas correspondientes asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento, se mencionan a continuación.
Oligonucleótidos cebadores utilizados SNPOl ACE Intron 16 ins/del
SEQ ID NO: 277 GGGACTCTGTAAGCCACTGC SEQ ID NO: 278 CCATGCCCATAACAGGTCTT
SNP02 ADRBl Gly389Arg
SEQ ID NO: 279 GGCCTTCAACCCCATCATCTA SEQ ID NO: 280 CCGGTCTCCGTGGGTCGCGT
SNP03 ADRB2 GIn27Glu SEQ ID NO: 281 GCTCACCTGCC AGACTGC
SEQ ID NO: 282 GCCAGGACGATGAGAGACAT
SNP04 ADRB2 GlylóArg
SEQ ID NO: 283 GCTCACCTGCCAGACTGC SEQ ID NO: 284 GCCAGGACGATGAGAGACAT
SNP05 ADRB3 Trp64Arg
SEQ ID NO: 285 CAATACCGCCAACACCAGT SEQ ID NO: 286 CGAAGTCACGAACACGTTG
SNP06 AGT Met235Thr
SEQ ID NO: 287 GAACTGGATGTTGCTGCTGA SEQ ID NO: 288 TTGCCTTACCTTGGAAGTGG
SNP07 AGTRI l 166 A>C SEQ ID NO: 289 CCGCCCCTCAGATAATGTAA SEQ ID NO: 290 GCAAAATGTGGCTTTGCTTT
SNP08 APOAl -75 G>A
SEQ ID NO: 291 CACCTCCTTCTCGCAGTCTC SEQ ID NO: 292 GGGACAGAGCTGATCCTTGA SNP09 APOB Arg3480Trp
SEQ ID NO: 293 AGCCTCACCTCTTACTTTTCCATTGAGTC SEQ ID NO: 294 CGTTGGTGAAAAAGAGGCCCTCTA
SNPlO APOB Arg3500Gln
SEQ ID NO: 295 AGCCTCACCTCTTACTTTTCCATTGAGTC SEQ ID NO: 296 CGTTGGTGAAAAAGAGGCCCTCTA
SNPIl APOB Arg3531Cys SEQ ID NO: 297 AGCCTCACCTCTTACTTTTCCATTGAGTC SEQ ID NO: 298 CGTTGGTGAAAAAGAGGCCCTCTA
SNP12 APOE Cysll2Arg
SEQ ID NO: 299 CTGTCCAAGGAGCTGCAG SEQ ID NO: 300 CTGTTCCACCAGGGGCCC
SNP13 APOE Argl58Cys
SEQ ID NO: 301 CTGTCCAAGGAGCTGCAG SEQ ID NO: 302 CTGTTCCACCAGGGGCCC
SNP14 CBS 833 T>C
SEQ ID NO: 303 GCTTTTGCTGGCCTTGAG
SEQ ID NO: 304 GGGTGAGTTACAGGCTGCAC
SNP15 CBS 844ins68
SEQ ID NO: 305 GCTTTTGCTGGCCTTGAG SEQ ID NO: 306 GGGTGAGTTACAGGCTGCAC
SNP16 CETP TaqlB B1>B2 SEQ ID NO: 307 GCAAACAGCCAGGTATAGGG SEQ ID NO: 307 AAGAGACTGAGGCCCAGAGA SNP17 CETP Arg451Gln
SEQ ID NO: 309 AGCCCTCATGAACAGCAAAG SEQ ID NO: 310 AATCCTGTCTGGGCCTCTCT
SNP18 COLlAl 1546 G>T
SEQ ID NO: 31 1 AGCCGCTCCCATTCTCTTAG SEQ ID NO: 312 GCGTGGTAGAGACAGGAGGA
SNP19 COMT Vall58Met (Alelo*2) SEQ ID NO: 313 GGGCCTACTGTGGCTACTCA SEQ ID NO: 314 CCCTTTTTCC AGGTCTGAC A
SNP20 CYP17A1 -34 A>G
SEQ ID NO: 315 GGGCTCC AGGAGAATCTTTC SEQ ID NO: 316 AGGGT AAGCAGCAAGAGAGC
SNP21 CYPl 9Al 1558 OT
SEQ ID NO: 317 CCTTGCACCCAGATGAGACT SEQ ID NO: 318 GGCAAGGATGGATGATTTGT
SNP22 CYPlAl Ile462Val
SEQ ID NO: 319 TGATGGTGCTATCGACAAGG
SEQ ID NO: 320 TTTGGAAGTGCTCACAGCAG
SNP23 CYPlAl T3801C
SEQ ID NO: 321 CCGCTGCACTT AAGCAGTCT SEQ ID NO: 322 GGCCCCAACTACTCAGAGG
SNP24 CYPlBl Leu432Val SEQ ID NO: 323 ACCTCTGTCTTGGGCTACCA SEQ ID NO: 324 GCCAGGATGGAGATGAAGAG SNP25 CYPlBl Alelo*4 (Asn453Ser)
SEQ ID NO: 325 ACCTCTGTCTTGGGCTACCA SEQ ID NO: 326 GCCAGGATGGAGATGAAGAG
SNP26 CYP2C9 Argl44Cys (alelo*2)
SEQ ID NO: 327 CCTGGGATCTCCCTCCTAGT SEQ ID NO: 328 CCACCCTTGGTTTTTCTCAA
SNP27 CYP2C9 Ile359Leu (alelo*3) SEQ ID NO: 329 CCACATGCCCTACACAGATG SEQ ID NO: 330 TCGAAAACATGGAGTTGCAG
SNP28 CYP2C19 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2)
SEQ ID NO: 331 CAACCAGAGCTTGGCATATTG SEQ ID NO: 332 TAAAGTCCCGAGGGTTGTTG
SNP29 CYP2D6 2549 A>del (alelo*3)
SEQ ID NO: 333 GGGCCTGAGACTTGTCCAGG SEQ ID NO: 334 GCCGAGAGCAT ACTCGGGAC
SNP30 CYP2D6 1847 G>A (alelo*4)
SEQ ID NO: 335 CCACGCGCACGTGCCCGTCCCA
SEQ ID NO: 336 CCTGCAGAGACTCCTCGGTCTCTC
SNP31 CYP2D6 1707 del>T (alelo*6)
SEQ ID NO: 337 CCACGCGCACGTGCCCGTCCCA SEQ ID NO: 338 CCTGCAGAGACTCCTCGGTCTCTC
SNP32 ELAC2 Ala541Thr SEQ ID NO: 339 CCGACACGTCTCTGCTACTG SEQ ID NO: 340 AACAAAAGCTCTGGGCAAGT SNP33 ESRl IVSl -397 T>C (Pvuíl) p>P
SEQ ID NO: 341 AGGGTTATGTGGC AATGAC G SEQ ID NO: 342 ACCAATGCTCATCCCAACTC
SNP34 F13A1 Val34Leu
SEQ ID NO: 343 CATGCCTTTTCTGTTGTCTTCTT SEQ ID NO: 344 CCCAGTGGAGACAGAGGATG
SNP35 FGB -455 G>A SEQ ID NO: 345 GGGTCTTTCTGATGTGTATTTTTCA SEQ ID NO: 346 GACCT ACTCACAAGGCAACCA
SNP36 FII 20210 G>A
SEQ ID NO: 347 GAGAGTAGGGGGCCACTCAT SEQ ID NO: 348 CCTGAGCCCAGAGAGCTG
SNP37 FV Leiden Arg506Gln
SEQ ID NO: 349 GCCCAGTGCTT AACAAGACC SEQ ID NO: 350 CCC ATT ATTTAGCC AGGAGACC
SNP38 GJA4 Pro319Ser
SEQ ID NO: 351 CCTCCTCAGACCCTTACACG
SEQ ID NO: 352 GCAGCCAGACTTCTCAGGAC
SNP39 GNAS 393 T>C (Ilel31Ile)
SEQ ID NO: 353 AGTACGTGCTGGCTCCTTGT SEQ ID NO: 354 CACAAGTCGGGGTGTAGCTT
SNP40 GNB3 825 OT (Ser275Ser) SEQ ID NO: 355 CTGCCGCTTGTTTGACCT
SEQ ID NO: 356 CACACGCTCAGACTTCATGG SNP41 GSTMl presen te>nulo
SEQ ID NO: 357 TGCTTCACGTGTTATGGAGGT SEQ ID NO: 358 GGGCTCAAATATACGGTGGA
SNP42 GSTPl IlelO5Val
SEQ ID NO: 359 CTCTATGGGAAGGACCAGCA SEQ ID NO: 360 GAAGCCCCTTTCTTTGTTCA
SNP43 GSTPl Alai 14VaI SEQ ID NO: 361 GCAAGCAGAGGAGAATCTGG SEQ ID NO: 362 CTCACCTGGTCTCCCACAAT
SNP44 GSTTl presente>nulo
SEQ ID NO: 363 GGCAGCATAAGCAGGACTTC SEQ ID NO: 364 CTGCAGTTGCTCGAGGACAA
SNP45 IL6 -174 OG
SEQ ID NO: 365 GCCTCAATGACGACCTAAGC SEQ ID NO: 366 TCATGGGAAAATCCCACATT
SNP46 ILlO -1082 G>A
SEQ ID NO: 367 TCCCCAGGT AGAGCAACACT
SEQ ID NO: 368 ATGGAGGCTGGATAGGAGGT
SNP47 ITGB3 Leu33Pro
SEQ ID NO: 369 GCTCCAATGTACGGGGTAAA SEQ ID NO: 370 ACTC ACTGGG AACTC GATGG
SNP48 iMMP3 5A>6A SEQ ID NO: 371 TCACTGCCACCACTCTGTTC SEQ ID NO: 372 GC CTCAAC CTCTC AAAGTGC SNP49 MTHFR Ala222Val
SEQ ID NO: 373 GCCTCTCCTGACTGTCATCC SEQ ID NO: 374 CAAAGCGGAAGAATGTGTCA
SNP50 NAT2 R64Q
SEQ ID NO: 375 CCATGGAGTTGGGCTTAGAG SEQ ID NO: 376 GGCTGATCCTTCCCAGAAAT
SNP51 NAT2 282 OT (Y94Y) SEQ ID NO: 377 CCATGGAGTTGGGCTTAGAG SEQ ID NO: 378 CC ATGCCAGTGCTGT ATTTG
SNP52 NAT2 1114T
SEQ ID NO: 379 CCATGGAGTTGGGCTTAGAG SEQ ID NO: 380 CCATGCCAGTGCTGT ATTTG
SNP53 NAT2 481C>T (L161L)
SEQ ID NO: 381 CAGGTGCCTTGCATTTTCT SEQ ID NO: 382 GATGAAGCCC ACC AAAC AGT
SNP54 NAT2 R197Q
SEQ ID NO: 383 CAGGTGCCTTGCATTTTCT
SEQ ID NO: 384 GATGAAGCCCACCAAACAGT
SNP55 NAT2 K268R
SEQ ID NO: 385 AAAGAC AAT AC AGATCTGGTCGAG SEQ ID NO: 386 TCTTC AAAAT AACGTGAGGGTAGA
SNP56 NAT2 G286E SEQ ID NO: 387 AAAGACAATACAGATCTGGTCGAG SEQ ID NO: 388 TCTTCAAAATAACGTGAGGGTAGA SNP57 NOS3 -786 T>C
SEQ ID NO: 389 GTGTACCCC ACCTGCATTCT SEQ ID NO: 390 CCCACCCTGTCATTCAGTG
SNP58 NOS3 Glu298Asp
SEQ ID NO: 391 GAAGGCAGGAGAC AGTGGAT SEQ ID NO: 392 CAGTCAATCCCTTTGGTGCT
SNP59 NPY Leu7Pro SEQ ID NO: 393 CTCTGCCTGGTGATGAGGTT SEQ ID NO: 394 GCAGAGGAGGGAGGTGCT
SNP60 OGGl Cys326Ser
SEQ ID NO: 395 TAGTCTCACCAGCCCTGACC SEQ ID NO: 396 TGGGGAATTTCTTTGTCCAG
SNP61 PAIl 4G>5G
SEQ ID NO: 397 C AACCTC AGCC AGAC AAGGT
SEQ ID NO: 398 CAGCCACGTGATTGTCTAGG
SNP62 PGR 331 G> A
SEQ ID NO: 399 GCTTCACAGCATGCACGAGT SEQ ID NO: 400 GAGGACTGGAGACGCAGAGT
SNP63 PONÍ Glήl92Arg SEQ ID NO: 401 TATTGTTGCTGTGGGACCTG SEQ ID NO: 402 CAAATCCTTCTGCCACCACT
SNP64 SOD2 AlalóVal
SEQ ID NO: 403 GGCTGTGCTTTCTCGTCTTC SEQ ID NO: 404 CCGTAGTCGTAGGGCAGGT SNP65 SRD5A2 Ala49Thr
SEQ ID NO: 405 AGC AC ACGGAG AGC CTGA SEQ ID NO: 406 AGGGGAAAAAC GCTAC CTGT
SNP66 SRD5A2 Val89Leu
SEQ ID NO: 407 AGCACACGGAGAGCCTGA SEQ ID NO: 408 AGGGGAAAAAC GCT ACCTGT
SNP67 SREBF2 Gly595Ala SEQ ID NO: 409 GGCCAGTGACCATT AACACC SEQ ID NO: 410 TCTTCAAAGCCTGCCTCAGT
SNP68 SULTlAl Arg213His
SEQ ID NO: 411 GTAATC C GAGC CTC CACTGA SEQ ID NO: 412 GCTGTGGTCCATGAACTCCT
SNP69 VDR b>B
SEQ ID NO: 413 CCTCACTGCCCTTAGCTCTG SEQ ID NO: 414 CCCGCAAGAAACCTCAAATA
Las amplificaciones multiplex se llevan a cabo simultáneamente bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura que permiten la amplificación específica de los fragmentos de los genes en los que pueda existir la variante génica a detectar. Finalizada la amplificación multiplex se comprueba, en gel de agarosa, que ha tenido lugar reacción de amplificación.
A continuación, la muestra a hibridar (producto de la amplificación) se somete a fragmentación con una Dnasa y los productos resultantes del proceso de fragmentación se someten a una reacción de mareaje indirecto. Una transferasa terminal incorpora un nucleótido unido a una molécula de unión específica, por ejemplo, biotina, al final de estos pequeños fragmentos.
Antes de aplicar la muestra sobre el DNA-chip se procede a desnaturalizar la muestra mediante calentamiento a 950C durante 5 minutos y, posteriormente, se añade el tampón de hibridación "ChipMap Kit Hybridization Buffer" (Ventana Medical System).
1.3.2 Hibridación
La hibridación se lleva a cabo de forma automática en la estación de hibridación Ventana Discovery (Ventana Medical Systems).
Se realiza una prehibridación o bloqueado del portaobjetos con BSA. A continuación, se aplica la muestra junto con la solución de hibridación [ChipMap Kit Hybridization Buffer (Ventana Medical System)] y se mantiene durante 1 hora a 450C siguiendo el protocolo Ventana 9.0 Europe (Ventana Medical System). Finalmente, el portaobjetos se somete a la acción de diferentes soluciones de lavado [ChipMap hybridisation Kit Buffers (Ventana Medical System)]. Una vez finalizado el proceso de hibridación se procede al lavado final y secado del portaobjetos.
Finalizada la hibridación, el revelado con estreptavidina-Cy3 marca los puntos (sondas) en los que se ha producido la hibridación.
1.3.3. Escaneado del portaobjetos
Se introduce el portaobjetos en el escáner de fluorescencia confocal, por ejemplo Axon escaner 4100A, y se procede a escanear la señal emitida por el mareaje estándar al ser excitado por el láser.
1.3.4 Cuantificación de la imagen
El software del propio escáner permite la cuantificación en la imagen obtenida de la señal de los puntos donde se ha producido hibridación.
1.3.5 Interpretación de los resultados Determinación del genotipo del individuo, respecto a las variantes génicas humanas asociadas a patologías relacionadas con el envejecimiento.
A partir de la señal que se obtiene con las sondas que detectan las diferentes variantes génicas se establece el genotipo del individuo. Para ello, brevemente, en primer lugar, a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas se les resta su propio ruido de fondo; a continuación, se agrupan las réplicas correspondientes a cada uno de las 4 sondas que se usan para caracterizar cada variante génica. El valor medio de intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes. Conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las sondas se calculan dos ratios (ratio 1 y ratio 2):
Intensidad media sonda 1
Ratio 1 = Intensidad media sonda I + Intensidad media sonda 2
Intensidad media sonda 3
Intensidad media sonda 3 + Intensidad media sonda 4
Estos ratios se sustituyen en tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles:
AA Función 1 AB Función 2
BB Función 3
La función que presente un valor absoluto mayor determina el genotipo que presenta el paciente. En este caso, la obtención de dichas funciones lineales se lleva a cabo mediante el análisis de 10 sujetos por cada uno de los tres posibles genotipos de la variante génica (AA, AB, BB). Con los resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 30 sujetos. Estos ratios sirven como variables de clasificación de los tres grupos para generar las funciones lineales. Con estas tres funciones lineales se evalúa la capacidad de clasificación de las dos parejas de sondas diseñadas. En caso de que la capacidad de clasificación no sea del 100%, las sondas serían rediseñadas. Nuevos sujetos caracterizados para cada uno de los tres genotipos constituyen nuevos ratios 1 y 2 para perfeccionar las combinaciones lineales de los mismos que constituyen las funciones lineales y, en definitiva, para mejorar la capacidad de clasificación del algoritmo basado en estas tres funciones.
Siempre que los ratios 1 y 2 se encuentren dentro del rango de los ratios usados para construir los grupos, la intensidad de fluorescencia media de las 40 réplicas respecto al ruido de fondo sea mayor de 5 y el coeficiente de variación de todas las réplicas del DNA-chip esté por debajo de 0,25 (utilizando un escáner de fluorescencia confocal) el resultado de las funciones lineales se considera correcto.
Resumiendo, cada mutación presenta en el portaobjetos 4 sondas (repetidas 10 veces) para su detección. Dos de dichas sondas detectan una variante génica y las otras dos la otra variante génica.
En el caso de un sujeto homocigoto para la variante génica A, este no presentará variante génica B; por consiguiente, en la imagen que se obtiene del soporte de cristal las sondas que detectan la variante génica B presentan una señal de hibridación notablemente inferior a la presentada por la variante génica A y viceversa; en este caso, los ratios 1 y 2 tenderán a 1 y los sujetos serán asignados como homocigotos AA.
Por otro lado, un sujeto heterocigoto para una variante génica determinada presenta ambos la variantes génicas; por tanto, las sondas que los detectan presentan una señal de hibridación equivalente. Los ratios 1 y 2 tenderán a 0,5 y los sujetos serán asignados como heterocigotos AB.
1.3.6. Análisis de los resultados:
El portaobjetos se introdujo en el escáner y se procedió a escanear la señal emitida por el mareaje estándar al ser excitado por el láser (apartado 1.3.3) y a cuantificar la imagen obtenida de la señal de los puntos donde se ha producido hibridación (apartado 1.3.4).
El análisis de los resultados se llevó a cabo utilizando las funciones descritas en el apartado 1.3.5. Después de genotipar las 69 variantes génicas humanas descritas en la Tabla 1 , dichas variantes se agrupan por riesgos genéticos particulares.
Así, para la determinación de un riesgo genético particular, en primer lugar, se agrupan los resultados obtenidos correspondientes a cada riesgo genético particular. De este modo, en esta etapa, se agrupan las variantes génicas correspondientes a cada riesgo genético particular estudiado. En las Tablas 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17 y 25 se muestran (ver columna 1) las variantes génicas asociadas a cada una de las patologías asociadas a envejecimiento particulares estudiadas. Posteriormente, se normaliza o puntúa cada genotipo asociado a cada variante génica. En este sentido, dichos valores estarán comprendidos en un intervalo de valores normalizados, en los que el/los genotipo/s de mayor riesgo a padecer una patología determinada comprenderá(n) el valor del límite superior de dicho intervalo de valores, y el/los genotipo/s de menor riesgo a padecer una patología determinada comprenderá(n) el valor del límite inferior de dicho intervalo de valores. Así, en función del genotipo presente en la muestra analizada se asigna un valor normalizado correspondiente a dicho genotipo.
A continuación, se calcula el riesgo genético particular según la ecuación [ 1] ó [2], dependiendo de si dicho riesgo genético particular está formado (o no) por una combinación de riesgos particulares parciales.
Cuando el riesgo genético particular no está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula mediante la ecuación [I]:
Figure imgf000065_0001
donde
RGP representa el riesgo genético particular a calcular; Xj representa el valor normalizado del genotipo caracterizado para una variante génica en una muestra, en relación con el riesgo genético particular a calcular;
LSJ representa el valor del límite superior del intervalo de valores normalizados asignado a cada variante génica, en relación con el riesgo genético particular a calcular; y n es el número de variantes génicas analizadas en relación con el riesgo genético particular a calcular.
Cuando el riesgo genético particular está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula mediante la ecuación [2]: ∑" RGPPi
RGP = ^i=! [2] n° RGPP
donde
RGP representa el riesgo genético particular a calcular; RGPP, representa el valor calculado para cada riesgo genético particular parcial que, en combinación con otros riesgos genéticos particulares parciales, constituyen el riesgo genético particular a calcular, en donde dicho RGPPi se calcula mediante la ecuación
[3]:
RGPPi = - Σ^" — * Γ3]
∑" Lsi
donde
RGPPi tiene el significado previamente mencionado; x, representa el valor normalizado del genotipo caracterizado para una variante génica en una muestra, en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular;
Ls, representa el valor del límite superior del intervalo de valores normalizados asignado a cada variante génica, en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular; y n es el número de variantes génicas analizadas en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular; y n°RGPP es el número de riesgos genéticos particulares parciales analizados en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular. Una vez calculados los riesgos genéticos particulares, el riesgo genético global se determina mediante la ecuación [4]:
Y RGP
RGG = ^ [4] n donde
RGG representa el riesgo genético global a calcular;
RGP representa el valor calculado para cada riesgo genético particular analizado en relación con el riesgo genético global a calcular, y se calcula mediante las ecuaciones [1] ó [2] previamente descritas; y n es el número de riesgos genéticos particulares analizados en relación con el riesgo genético global a calcular.
En este ejemplo, a modo simplemente ilustrativo, no limitativo, el riesgo genético global del sujeto analizado a una patología asociada al envejecimiento comprende la determinación de los siguientes riesgos genéticos particulares:
1. Riesgo genético particular asociado a padecer enfermedad vascular (riesgo vascular) [Tablas 2-12];
2. Riesgo genético particular asociado a osteoporosis (riesgo a osteoporosis) [Tablas 13-14];
3. Riesgo genético particular asociado a carcinogénesis (riesgo carcinogénico) [Tablas 15-16]; y
4. Riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo [Tablas
17-18]. Además, para determinar el riesgo vascular, se han determinado los riesgos genéticos particulares parciales siguientes: riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico [Tablas 2-3]; riesgo genético particular parcial asociado a trombosis [Tablas 4-5]; riesgo genético particular parcial asociado a ictus [Tablas 6-7]; riesgo genético particular parcial asociado a hipertensión arterial [Tablas 8-9]; y - riesgo genético particular parcial asociado a vulnerabilidad endotelial
[Tablas 10-1 1].
En la Tabla 2 se muestra un ejemplo de cómo se ha determinado el valor de un riesgo genético particular parcial, metabolismo lipídico, en una muestra de un sujeto. En este caso, el riesgo genético particular parcial asociado a metabolismo lipídico se ha calculado en función de 1 1 SNPs (SNP08, SNP09, SNP10, SNPI l, SNP 12, SNP 13,
SNP 17, SNP 16, SNP63, SNP67 y SNP59).
En la Tabla 12 se muestra el resultado del cálculo del riesgo genético vascular, que se ha calculado en función de los riesgos genéticos particulares parciales: metabolismo lipídico, trombosis, ictus, hipertensión arterial y vulnerabilidad endotelial. En la Tabla 24 se muestra el resultado del cálculo del riesgo genético global a sufrir una patología asociada al envejecimiento según se ha explicado anteriormente a partir de una muestra ejemplo de un sujeto en función de los riesgos genéticos particulares: riesgo vascular, riesgo osteoporosis, riesgo carcinogénico y riesgo estrés ambiental. Adicionalmente, en este ejemplo, se ha determinado el riesgo genético particular del sujeto en estudio asociado a respuesta a fármacos, es decir, el riesgo genético particular a padecer reacciones adversas a fármacos. En la Tabla 25 se muestra el resultado de la respuesta general a fármacos relacionada con aquellos fármacos metabolizados por las siguientes vías: NAT2, CYP2D6, CYP2C19 y CYP2C9. RIESGO VASCULAR
PUNTUACIÓN SEGÚN
SNP08
SNP09
SNP10
SNP11
SNP12-13*
SNP17
SNP16
SNP63
SNP67
SNP59
Figure imgf000069_0001
* Ver Tabla 20
Tabla 2 OO
El sumatorio de la puntuación máxima de los límites superiores de los intervalos de valores es de 19 puntos ( V" ' Lsi =19).
El riesgo se calcula en una escala 0-1 considerando el valor máximo de 19 como riesgo = 1.
Figure imgf000069_0002
Suma RGPP 2/19=0,11
Tabla 3
SNP61 SNP47 SNP36 SNP37 SNP34 SNP49 SNP14 SNP15 SNP35
Figure imgf000070_0001
Tabla 4
El sumatorio de la puntuación máxima de los límites superiores de los intervalos de valores es de 20 puntos ( ^" Ls i =20).
El riesgo se calcula en una escala 0-1 considerando el valor máximo de 20 como
Figure imgf000070_0002
riesgo=l . Suma
RGPP 5/20=0,25
Tabla 5
SNP61 SNP47 SNP36 SNP37 SNP34
Figure imgf000071_0001
Tabla 6
El sumatorio de la puntuación máxima de Puntuación del
Genoti o Genoti o los límites superiores de los intervalos de valores es de 30 puntos ( ∑' Lsi =30). O
El riesgo se calcula en una escala 0-1 considerando el valor máximo de 30 como
Figure imgf000071_0002
riesgo=l Suma RGPP 3/10=0,30
Tabla 7
RIESGO
HIPERTENSIÓN
ARTERIAL PUNTUACIÓN SEGÚN GENOTIPO
SNP02 SNP04
SNP03 SNP06 SNP07 SNP39 SNP40 SNP01 SNP05
Figure imgf000072_0001
Tabla 8
-~J
El sumatorio de la puntuación máxima de los limites superiores de los intervalos de valores es de 18 puntos
(∑>/ =18).
El riesgo se calcula en una escala 0-1 considerando el valor máximo de 18
Figure imgf000072_0002
Suma 11 como riesgo=l RGPP 11/18=0,61
Tabla 9
RIESGO
VULNERABILIDAD ENDOTELIAL PUNTUACIÓN SEGÚN GENOTIPO
SNP48
SNP57 SNP58 SNP49 SNP14 SNP15 SNP38
Figure imgf000073_0001
Tabla 10
IO
El sumatorio de la puntuación máxima de los límites superiores de los intervalos de valores es de 15 puntos ( ^ 1 Ls i =15).
El riesgo se calcula en una escala 0-1
Figure imgf000073_0002
considerando el valor máximo de 15 como
Suma riesgo=l
RGPP 3/15=0,20
Tabla 11
RIESGO VASCULAR
METABOLISMO LIPÍDICO 0,11
RIESGO TROMBOSIS 0,25
RIESGO ICTUS 0,30
RIESGO HIPERTENSIÓN ARTERIAL 0,61
RIESGO VULNERABILIDAD ENDOTELIAL 0,20
RGP: Riesgo Vascular 0,29 Tabla 12
PUNTUACIÓN SEGÚN
RIESGO OSTEOPOROSIS GENOTIPO
SNP18*
SNP33
SNP69
Figure imgf000074_0001
*en hombres solamente se considera este polimorfismo
Tabla 13
El sumatorio de la puntuación máxima de los límites superiores de los intervalos de valores es de 6 puntos en mujeres y de 2 en
Figure imgf000074_0002
hombres ( ^T"_( Ls i =6 ó 2).
Suma 2 RGP 2/6=0,33 El riesgo se calcula en una escala O- l considerando el valor máximo de 6 ó 2 como riesgo= 1
Tabla 14
SNP20*
SNP23*
SNP22*
SNP24*
SNP25*
SNP21 *
SNP19**
SNP62"
SNP33"
SNP69**
SNP65*"
SNP66*"
SNP32***
Figure imgf000075_0001
Tabla 15
*SNPs incluidos en hombres y en mujeres. Puntuación del **SNPs incluidos en mujeres. "*SNPs incluidos en hombres.
El sumatorio de la puntuación máxima de los límites superiores de los intervalos de valores es de 18 puntos en hombres y 20 en mujeres ( ]T" Ls i =18 ó 20).
El riesgo se calcula en una escala 0-1 considerando el valor máximo de 18 ó 20 como riesgo=l
Figure imgf000075_0002
Suma RGP 7/26=0,27
Tabla 16
RIESGO ESTRÉS AMBIENTAL
SNP60 SNP64 SNP68 SNP41 SNP44
SNP42
SNP43
SNP19
SNP45
SNP46
SNP50-51 -52-53-
54-55-56
Figure imgf000076_0001
Tabla 17
Puntuación del
Genoti o Genoti o
El sumatorio de la puntuación máxima de los límites superiores de los intervalos de valores es de 22 puntos (^" Ls i =22).
El riesgo se calcula en una escala 0-1 considerando el valor máximo de 22 como riesgo=l
Figure imgf000076_0002
Suma RGP 5/22=0,23
Tabla 18
Tabla 19
SNP50 SNP51 SNP52 SNP53 SNP54 SNP55 SNP56
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Tabla 20
CYP2D6
SNP29 SNP30 SNP31
-~1
OO
Figure imgf000079_0002
Tabla 21
CYP2C19
SNP28
Figure imgf000080_0001
Tabla 22 CYP2C9
Figure imgf000080_0002
Tabla 2*
RESUMEN RIESGO GENÉTICO GLOBAL
RIESGO VASCULAR O ,29 RIESGO OSTEOPOROSIS O ,33 RIESGO CARCINOGENICO O ,27 ESTRÉS AMBIENTAL O ,23
RGG 0,28
Tabla 24
RESPUESTA A FÁRMACOS
SNP50-51-52- 53-54-55-56
Figure imgf000081_0001
OO O
CYP2D6 (Átelos *3, *4 y *6)
GENOTIPO METABOLIZADOR
SNP29-30-31 M/*4 Lento Ver Tabla 21
SNP28
Figure imgf000081_0002
CYP2C9 (Alelos *1 (wt), *2 y *3)
GENOTIPO METABOLIZADOR
SNP26-27 *1/*3 Rápido Ver Tabla 23
Tabla 25

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para determinar el riesgo genético global de un sujeto a desarrollar una patología asociada al envejecimiento a partir de una combinación de riesgos genéticos particulares que comprende:
i) genotipar simultáneamente múltiples variantes génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a una patología asociada al envejecimiento en una muestra biológica de dicho sujeto;
ii) determinar cada riesgo genético particular; y
iii) determinar dicho riesgo genético global en función del valor de cada riesgo genético particular obtenido en la etapa ii).
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa i) se realiza mediante análisis de DNA-chips y/o secuenciación génica.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa ii) comprende:
i) agrupar los resultados obtenidos relativos a cada riesgo genético particular a desarrollar una patología asociada al envejecimiento;
ii) normalizar el valor de cada genotipo de cada variante génica analizada;
iii) calcular cada riesgo genético particular de forma que:
iiia) cuando dicho riesgo genético particular no está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula mediante la ecuación [I]:
l RG Σ" X P = -« [1]
Σ" ^Si donde
RGP representa el riesgo genético particular a calcular; x, representa el valor normalizado del genotipo caracterizado para una variante génica en una muestra, en relación con el riesgo genético particular a calcular;
Ls¡ representa el valor del límite superior del intervalo de valores normalizados asignado a cada variante génica, en relación con el riesgo genético particular a calcular; y n es el número de variantes génicas analizadas en relación con el riesgo genético particular a calcular; o, alternativamente,
iiib) cuando dicho riesgo genético particular está formado por una combinación de riesgos particulares parciales, dicho riesgo genético particular se calcula mediante la ecuación [2]:
Y" RGPPi
RGP = ¿=4≤ [2] n°RGPP
donde
RGP representa el riesgo genético particular a calcular; RGPPj representa el valor calculado para cada riesgo genético particular parcial que, en combinación con otros riesgos genéticos particulares parciales, constituyen el riesgo genético particular a calcular, en donde dicho RGPPi se calcula mediante la ecuación
[3]:
∑n Xl
Λurn = - — [3]
/ , LSI donde
RGPPi tiene el significado previamente mencionado; x, representa el valor normalizado del genotipo caracterizado para una variante génica en una muestra, en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular;
Ls, representa el valor del límite superior del intervalo de valores normalizados asignado a cada variante génica, en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular; y n es el número de variantes génicas analizadas en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular; y
n°RGPP es el número de riesgos genéticos particulares parciales analizados en relación con el riesgo genético particular parcial a calcular.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el riesgo genético global se calcula mediante la ecuación [4]:
Y RGP
RGG = ^ [4] n donde
RGG representa el riesgo genético global a calcular; RGP representa el valor calculado para cada riesgo genético particular analizado en relación con el riesgo genético global a calcular, y se calcula mediante las ecuaciones [1] ó [2] previamente descritas; y n es el número de riesgos genéticos particulares analizados en relación con el riesgo genético global a calcular.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho riesgo genético particular se selecciona del grupo formado por riesgo genético particular asociado a padecer enfermedad vascular (riesgo vascular), riesgo genético particular asociado a osteoporosis, riesgo genético particular asociado a carcinogénesis y riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho riesgo vascular se determina en función de los riesgos genéticos particulares parciales seleccionados del grupo formado por riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico, riesgo genético particular parcial asociado a trombosis, riesgo genético particular parcial asociado a ictus, riesgo genético particular parcial asociado a hipertensión arterial y riesgo genético particular parcial asociado a vulnerabilidad endotelial.
7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho riesgo genético particular parcial asociado al metabolismo lipídico se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por -75 G>A del gen APOAl, Arg3480Trp del gen APOB, Arg3500Gln del gen APOB, Arg3531Cys del gen APOB, Cysl 12Arg del gen APOE, Argl58Cys del gen APOE, Arg451Gln del gen CETP, TaqlB B1>B2 del gen CETP, Glnl92Arg del gen PONÍ, Gly595Ala del gen SREBF2, Leu7Pro del gen NPY y combinaciones de las mismas.
8. Método según la reivindicación 6, en el que dicho riesgo genético particular asociado a trombosis se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 4G>5G del gen PAIl, Leu33Pro del gen ITGB3, 20210 G>A del gen FII, Arg506Gln del gen FV Leiden, Val34Leu del gen F13A1, Ala222Val del gen MTHFR, 833 T>C del gen CBS,844ins68 del gen CBS, -455 G>A del gen FGB y combinaciones de las mismas.
9. Método según la reivindicación 6, en el que dicho riesgo genético particular parcial asociado a ictus se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 4G>5G del gen PAIl, Leu33Pro del gen ITGB3, 20210 G>A del gen FII, Arg506Gln del gen FV Leiden, Val34Leu del gen Fl 3Al y combinaciones de las mismas.
10. Método según la reivindicación 6, en el que dicho riesgo genético particular parcial asociado a hipertensión arterial se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por Gly389Arg del gen ADRBl ;
Gln27Glu del gen ADRB2, GlylóArg del gen ADRB2, Met235Thr del gen AGT, 1 166 A>C del gen AGTRl, 393 T>C (Ilel31Ile) del gen GNAS, 825 OT (Ser275Ser) del gen GNB3, intron 16 ins/del del gen ACE, Trp64Arg del gen ADRB3 y combinaciones de las mismas.
1 1. Método según la reivindicación 6, en el que dicho riesgo genético particular parcial asociado a vulnerabilidad endotelial se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 5A>6A del gen MMP3, - 786 T>C del gen NOS3, Glu298Asp del gen NOS3, Ala222Val del gen MTHFR, 833 T>C del gen CBS, 844ins68 del gen CBS, Pro319Ser del gen
GJ A4 y combinaciones de las mismas.
12. Método según la reivindicación 5, en el que dicho riesgo genético particular asociado a osteoporosis se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por 1546 G>T del gen COLlAl, IVS1-397
T>C p>P (PvuII) del gen ESRl, b>B del gen VDR y combinaciones de las mismas.
13. Método según la reivindicación 5, en el que dicho riesgo genético particular asociado a carcinogénesis se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por -34 A>G del gen CYP 17Al, Ile462Val del gen CYPlAl, T3801C del gen CYPlAl, Leu432Val del gen CYPlBl, Alelo*4 (Asn453Ser) del gen CYPlBl, 1558 OT del gen CYP 19Al, Vall58Met $6
(Alelo*2) del gen COMT, 331 G>A del gen PGR, IVSl -397 T>C ρ>P (PvuII) del gen ESRl, b»B del gen VDR, Ala49Thr del gen SRD5A2, Val89Leu del gen SRD5A2, Ala541Thr del gen ELAC2 y combinaciones de las mismas.
14. Método según la reivindicación 5, en el que dicho riesgo genético particular asociado a estrés ambiental y daño oxidativo se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por Cys326Ser del gen OGGl, Ala 16VaI del gen SOD2, Arg213His del gen SULTlAl, presente>nulo GSTMl, presente>nulo GSTTl, He 105VaI del gen GSTPl, Ala 1 14VaI del gen GSTPl, Vall58Met (Alelo*2) del gen COMT, - 174 OG del gen IL6, -1082
G>A del gen ILlO, R64Q del gen NAT2, 282 C>T (Y94Y) del gen NAT2, I1 14T del gen NAT2, 481OT (LlólL) del gen NAT2, R197Q del gen NAT2, K268R del gen NAT2, G286E del gen NAT2 y combinaciones de las mismas.
15. Método según la reivindicación 1, que comprende, además, determinar el riesgo genético particular asociado a respuesta a fármacos.
16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho riesgo genético particular asociado a respuesta a fármacos se determina en función de las variantes génicas seleccionadas del grupo formado por R64Q, 282 OT (Y94Y), Il 14T, 481OT
(Llól L), R197Q, K268R y G286E del gen NAT2; Argl44Cys (alelo*2) y Ile359Leu (alelo*3) del gen CYP2C9; 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2) del gen CYP2C19; 2549 A>del (alelo*3), 1847 G>A (alelo*4) y 1707 del>T (alelo*6) del gen CYP2D6; y combinaciones de las mismas.
17. Método según la reivindicación 1 , en el que dicha variante génica a genotipar se selecciona del grupo formado por el polimorfismo intron 16 ins/del del gen ACE; el polimorfismo Gly389Arg del gen ADRBl ; los polimorfismos Gln27Glu y Glyl6Arg del gen ADRB2; el polimorfismo Trp64Arg del gen ADRB3; el polimorfismo Met235Thr del gen AGT; el polimorfismo 1 166 A>C del gen AGTRl; el polimorfismo -75 G>A del gen APOAl ; los polimorfismos Arg3480Trp, Arg35OOGln, y Arg3531Cys del gen APOB; los polimorfismos Cysl l2Arg y Argl58Cys del gen APOE; los polimorfismos 833 T>C y 844ins68 del gen CBS; los polimorfismos TaqíB B1>B2 y Arg451Gln del gen CETP; el polimorfismo 1546 G>T del gen COLlAl ; el polimorfismo Vall 58Met (Alelo*2) del gen COMT; el polimorfismo -34 A>G del gen CYP17A1 ; el polimorfismo 1558 OT del gen CYP19A1; el polimorfismo Ile462Val y T38O1C del gen CYPlAl; el polimorfismo Leu432Val y Alelo*4
(Asn453Ser) del gen CYPlBl ; el polimorfismo Argl44Cys (alelo*2) y Ile359Leu (alelo*3) del gen CYP2C9; el polimorfismo 681 G>A (Pro227Pro) (alelo*2) del gen CYP2C19; el polimorfismo 2549 A>del (alelo*3), 1847 G>A (alelo*4) y 1707 del>T (alelo*6) del gen CYP2D6; el polimorfismo Ala541Thr del gen ELAC2; el polimorfismo IVSl -397 T>C p>P (PvuII) del gen ESRl; el polimorfismo Val34Leu del gen F13A1; el polimorfismo -455 G>A del gen FGB; el polimorfismo 20210 G>A del gen FII; el polimorfismo Arg506Gln del gen FV Leiden; el polimorfismo Pro319Ser del gen GJ A4; el polimorfismo 393 T>C (Ilel31 Ile) del gen GNAS; el polimorfismo 825 OT (Ser275Ser) del gen GNB3; ei polimorfismo preseníe>nulo GSTMl; los polimorfismos lie 105VaI y
Alai 14VaI del gen GSTPl; el polimorfismo presente>nulo GSTTl; el polimorfismo - 174 OG del gen IL6; el polimorfismo -1082 G>A del gen ILlO; el polimorfismo Leu33Pro del gen ITGB3; el polimorfismo 5A>6A del gen MMP3; el polimorfismo Ala222Val del gen MTHFR; los polimorfismos R64Q, 282 OT (Y94Y), I114T, 481OT (L161L), R197Q, K268R y G286E del gen
NAT2; los polimorfismos -786 T>C y Glu298Asp del gen NOS3; el polimorfismo Leu7Pro del gen NPY; el polimorfismo Cys326Ser del gen OGGl ; el polimorfismo 4G>5G del gen PAIl ; el polimorfismo 331 G>A del gen PGR; el polimorfismo Glnl92Arg del gen PONÍ ; el polimorfismo Ala 16VaI del gen SOD2; los polimorfismos Ala49Thr y Val89Leu del gen SRD5A2; el polimorfismo Gly595Ala del gen SREBF2; el polimorfismo Arg213His del gen SULTlAl ; el polimorfismo b>B del gen VDR; y combinaciones de los mismos.
18. Método según la reivindicación 17, que comprende, además, genotipar una o más variantes génicas adicionales asociadas a patologías asociadas al envejecimiento.
19. Un DNA-chip que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas útiles para detectar variantes génicas humanas presentes en uno o más genes, en el que dichas sondas se seleccionan del grupo formado por las sondas identificadas como SEQ ID NO: 1-13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17-44, SEQ ID NO: 53-128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132-172, SEQ ID
NO: 181-200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 222, y SEQ ID NO: 224-276.
20. Un kitque comprende un DNA-chip según la reivindicación 19.
21. Un oligonucleótido cebador seleccionado entre los oligonucleótidos cebadores identificados como SEQ ID NO: 277-278, SEQ ID NO: 285-319, SEQ ID NO: 321-326, SEQ ID NO: 333-340, SEQ ID NO: 343-356, SEQ ID NO: 359-362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369-371, SEQ ID NO: 374,
SEQ ID NO: 377-381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385-402, y SEQ ID NO: 404-414.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010146214A3 (es) * 2009-06-17 2011-06-30 Progenika Biopharma, S.A. Método para la evaluación del comportamiento atlético de un sujeto
CN108841966A (zh) * 2018-06-12 2018-11-20 广州中安基因科技有限公司 一种瘦身基因检测试剂盒
CN109355368A (zh) * 2018-10-22 2019-02-19 江苏美因康生物科技有限公司 一种快速检测高血压个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
CN111212069A (zh) * 2019-12-31 2020-05-29 重庆邮电大学 一种5g功能开放设备接口的脆弱性评估方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013162783A (ja) * 2012-01-10 2013-08-22 Arkray Inc Ｐｏｎ１遺伝子多型（ｑ１９２ｒ）を検出する方法
US10395759B2 (en) 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
AU2017218149B2 (en) 2016-02-12 2020-09-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for detection of abnormal karyotypes
JP2019136000A (ja) * 2018-02-13 2019-08-22 国立大学法人金沢大学 冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法又は判定の補助方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001012851A2 (en) * 1999-08-12 2001-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Identification of genetic markers of biological age and metabolism
US20030036057A1 (en) * 2001-03-09 2003-02-20 Andreas Braun Genes and polymorphisms associated with cardiovascular disease and their use
WO2003035691A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Xenon Genetics, Inc. Apolipoprotein a-i mutation useful for diagnosis and treatment of cardiovascular diseases
US20040043389A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-04 Vitivity, Inc. Methods and compositions for identifying risk factors for abnormal lipid levels and the diseases and disorders associated therewith
WO2004085996A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Biomarkers for longevity and disease and uses thereof
US20050191678A1 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Geneob Usa Inc. Genetic predictability for acquiring a disease or condition
EP1566449A1 (en) * 2004-02-18 2005-08-24 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Use of haplotypes and SNPs in lipid-relevant genes for the analyses and diagnosis of cardiovascular diseases
US7622271B2 (en) * 2004-07-26 2009-11-24 University Of Washington Identification of aging genes through large-scale analysis
EP1910569A4 (en) * 2005-06-17 2009-08-05 Genizon Biosciences Inc GENEMAP GENE CARD OF HUMAN GENES ASSOCIATED WITH LONGEVITY
US20080233582A1 (en) * 2005-07-26 2008-09-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Single nucleotide polymorphisms associated with susceptibility to cardiovascular disease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of EP2128275A4 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010146214A3 (es) * 2009-06-17 2011-06-30 Progenika Biopharma, S.A. Método para la evaluación del comportamiento atlético de un sujeto
ES2395679A1 (es) * 2009-06-17 2013-02-14 Progenika Biopharma, S.A. Método para la evaluación del comportamiento atlético de un sujeto.
CN108841966A (zh) * 2018-06-12 2018-11-20 广州中安基因科技有限公司 一种瘦身基因检测试剂盒
CN109355368A (zh) * 2018-10-22 2019-02-19 江苏美因康生物科技有限公司 一种快速检测高血压个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
CN111212069A (zh) * 2019-12-31 2020-05-29 重庆邮电大学 一种5g功能开放设备接口的脆弱性评估方法
CN111212069B (zh) * 2019-12-31 2022-02-25 重庆邮电大学 一种5g功能开放设备接口的脆弱性评估方法

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