WO2008035527A1

WO2008035527A1 - ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-C1q

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Publication number: WO2008035527A1
Application number: PCT/JP2007/066200
Authority: WO
Inventors: Takahiro Ochi
Original assignee: MMT Co Ltd
Current assignee: MMT Co Ltd
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2008-03-27
Anticipated expiration: 2009-03-21
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Description

明細書

抗 Clqモノクローナル抗体

技術分野

[0001] 本発明は、抗 Clqモノクローナル抗体、力、かる抗体を用いた Clqの存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットなどに関するものである。

背景技術

[0002] 関節リウマチ (RA)患者は、将来重篤な関節破壊に陥る群と、そうでない群とに二分される。 RA患者がいずれの群に属するかで必要な治療方法は異なる力かかる予後を有効に診断する方法はなレ、。

[0003] RA患者の血中 Clqタンパク質の量によって、関節破壊に陥るか否かの予後診断が可能であることが報告されている（非特許文献 1)。し力もながら、臨床において、患者試料中の Clqタンパク質の定量に用いることができる抗 Clq抗体は確立されておらず、その開発が望まれていた。

非特許文献 1 : Ochi T et al.， Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-43

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明の解決課題は、 Clqタンパク質の定量に用いることができる抗 Clq抗体を得ること、かかる抗体の製造方法、特異的かつ再現性のある Clqタンパク質の定量方法、ならびにそのためのキットを開発することである。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、 Clqタンパク質量に依存して抗原と抗体の結合体量が増大する抗 Clqモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。

[0006] すなわち、本発明は、

(1) Clqタンパク質を特異的に認識することができる、抗 Clqモノクローナル抗体、

(2)配列番号 1〜 7のアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識することができる、（1)記載の抗体、 (3)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10649を有するハイプリドーマにより産生される、（1)または（2)記載の抗体、

(4)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10650を有するハイプリドーマにより産生される、（1)または（2)記載の抗体、

(5)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10651を有するハイプリドーマにより産生される、（1)または（2)記載の抗体、

(6)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10652を有するハイプリドーマにより産生される、（1)または（2)記載の抗体、

(7)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10653を有するハイプリドーマにより産生される、（1)または（2)記載の抗体、

(8)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP - 10654を有するハイプリドーマにより産生される、（ 1 )または（2)記載の抗体、

(9)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10649、 FERM BP— 10650、 FERM BP— 10651、 FERM BP— 1065 2、 FERM BP— 10653、または FERM BP— 10654を有する、抗 Clqモノクロ一ナル抗体を産生するハイブリドーマ、

(10)配列番号 1〜7のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗 C lqモノクローナル抗体の製造方法、

(11) (9)記載のハイプリドーマを培養することを特徴とする、抗 Clqモノクローナル抗体の製造方法、

(12) (1)〜（8)の!/、ずれか記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中の Clqタンパク質の存在または量を決定する方法、

(13) ELISA法によるものである、（12)記載の方法、

(14) (1)〜（8)のいずれか記載の抗体を 2種以上用いるものである、（12)または（1 3)記載の方法、

(15) (4)記載の抗体と（7)記載の抗体、（4)記載の抗体と（8)記載の抗体、（6)記載の抗体と（7)記載の抗体、または（6)記載の抗体と（8)記載の抗体を用いるものである、（14)記載の方法、 (16)関節リウマチの予後診断のための、（12)から（15)のいずれか記載の方法、

(17) (1)〜（8)のいずれか記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中の Clqタンパク質の存在または量を決定するためのキット、

(18) ELISA法によるものである、（17)記載のキット、

(19) (1)〜（8)のいずれか記載の抗体を 2種以上含むものである、（17)または（18) 記載のキット、

(20) (4)記載の抗体と（7)記載の抗体、（4)記載の抗体と（8)記載の抗体、（6)記載の抗体と（7)記載の抗体、または（6)記載の抗体と（8)記載の抗体を含むものである、（19)記載のキット、

(21)関節リウマチの予後診断のための、（17)〜（20)の!/、ずれか記載のキット、を提供するものである。

発明の効果

[0007] 本発明により、 Clqタンパク質の定量に用いることができる、 Clqタンパク質を特異的に認識する抗 Clqモノクローナル抗体およびその製造方法、抗 Clqモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗 Clqモノクローナル抗体を用いた試料中の Clq タンパク質の存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットなどが提供される。

図面の簡単な説明

[0008] [図 1]図 1は、ハイプリドーマの培養上清を用いた ELIS Aの結果を示す。

[図 2]図 2は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 8を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 35 (四角）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すグラフである。

[図 3]図 3は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 33を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 3 5 (四角）、抗 Clq抗体 # 54 (丸）、抗 Clq抗体 # 76 (菱形）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すグラフである。

[図 4]図 4は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 35を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 3 5 (四角）、抗 Clq抗体 # 54 (丸）、抗 Clq抗体 # 76 (菱形）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すグラフである。

[図 5]図 5は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 40を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 5 4 (丸）、抗 Clq抗体 # 76 (菱形）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すダラフである。

[図 6]図 6は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 54を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 3 5 (四角）、抗 Clq抗体 # 54 (丸）を用いたサンドイッチ ELIS A法の結果を示すダラフである。

[図 7]図 7は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 76を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 3 5 (四角）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すグラフである。

[図 8]図 8は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 107を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 33 (三角）、抗 Clq抗体 # 35 (四角）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すグラフである。

[図 9]図 9は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 112を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 35 (四角）、抗 Clq抗体 # 54 (丸）、抗 Clq抗体 # 76 (菱形）を用いたサンドイツチ ELISA法の結果を示すグラフである。

[図 10]図 10は、固相抗体として抗 Clq抗体 # 119を、感作抗体として抗 Clq抗体 # 33 (三角）を用いたサンドイッチ ELISA法の結果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0009] 本発明は、 1の態様において、 Clqタンパク質を特異的に認識することができる、抗 Clqモノクローナル抗体（以下、「抗 Clq抗体」ともいう）に関するものである。本発明の抗 Clqモノクローナル抗体は、 Clqタンパク質と特異的に結合できるだけでなぐ力、かるタンパク質量に依存して、形成される抗原と抗体の結合体量が増大する点、すなわち、 Clqタンパク質の定量に用いることができる点で非常に優れている。本発明の抗体は、例えば、マウスのような哺乳動物を Clqタンパク質で免疫し、免疫動物のリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイプリドーマを作製し、これを培養することにより、得ること力 Sできる。他の既知の方法、例えば、遺伝子組換え法、化学合成法などを用いて力、かる抗体を製造してもよ!/、。

[0010] Clqタンパク質のェピトープのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号 1〜7および配列番号 8〜； 16に示す。従って、本発明の抗 Clqモノクローナル抗体は、好ましくは、（a)配列番号 1〜7のアミノ酸配列を有するペプチド、（b)配列番号；!〜 7のアミノ酸配列において、 1個以上、好ましくは、 1または数個、例えば、 2、 3、 4 、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、または 14固のアミノ酸カ欠失、置換若しくは付カロされたアミノ酸配列を有するペプチド、および (c)配列番号 1〜7のアミノ酸配列と少なくとも 50%以上、列えば、、 60、 70、 75、 80、 85、 90、 93%の申目同十生を有するァミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドを特異的に認識することができるものである。アミノ酸配列の相同性は、例えば、 FASTA、 BLAST, DNASI S (日立ソフトウェアエンジニアリング (株)製）、 GENETYX ( (株）ジエネテイクス製）を用いて測定することができる。上記ペプチドまたはそれを含むタンパク質などでマウスなどの動物を免疫し、かかる免疫マウスのリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイプリドーマを作製し、抗 Clqモノクローナル抗体を得てもよい。

本発明の抗体の 1の具体例は、マウス骨髄腫細胞株とマウスリンパ球との融合細胞であるノヽイブリドーマ KS— 0131 # 8、KS— 0131 # 33、KS— 0131 # 35、K S - 0131 # 40、 KS— 0131 # 54、または KS— 0131 # 76により産生される抗 Clqモノクローナル抗体である。当該ハイプリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に寄託され、平成 18年 8月 2日付で受領され、それぞれ受託番号 FERM BP— 10649、 F ERM BP- 10650, FERM BP— 10651、 FERM BP— 10652、 FERM BP 10653、および FERM BP— 10654を付与された。かかるハイプリドーマを、公知の培養条件、例えば、組成： RPMI 1640 ( ohjin 16005005) 425mL、 L-Glut amine (SIGMA G7513) 5mL、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA S8636) 5mL、 HAT サプリメント（GIBCO 21060-017) lOmL、ペニシリン ·ストレプトマイシン（SIGMA P4 333) 2. 5mL, FBS 75mLの培地中、 37 ± 0. 1。C、 5 ± 0. 15% COにて培養

2 し、産生された抗 Clqモノクローナル抗体を公知の手段 ·方法にて回収 ·精製することにより、抗 C lqモノクローナル抗体を製造することができる。本明細書において、ハイブリドーマ KS— 0131 # 8、KS— 0131 # 33、 KS— 0131 # 35、 KS— 0131

# 40、 KS— 0131 # 54、および KS— 0131 # 76により産生される抗 Clqモノクローナル抗体をそれぞれ、抗 Clq抗体 # 8、抗 Clq抗体 # 33、抗じ；^抗体 # 35、抗 Clq抗体 # 40、抗 Clq抗体 # 54、および抗 Clq抗体 # 76と表す。 [0012] 本発明の抗 Clqモノクローナル抗体は、そのフラグメント、およびそのキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体または変異抗体もまた、元の抗体と同様の Clqタンパク質に対する特異性を有するものである。これらは、当業者に既知の手段 ·方法により製造され得る。

[0013] 本発明は、別の態様において、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10649、 FERM BP— 10650、 FERM BP— 10651、 FERM BP— 10652、 FERM BP— 10653、または FERM BP— 106 54を有する、抗 Clqモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するものである。本発明のハイプリドーマは、 Clqタンパク質で免疫されたマウス由来のリンパ球とマウス骨髄腫細胞株を融合させて得られた細胞である。

[0014] 本発明は、別の態様において、配列番号 1〜7のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗 Clqモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明のこの態様の製造方法において、（a)配列番号 1〜7のアミノ酸配列を有するペプチド、（b)配列番号 1〜7のアミノ酸配列において、 1個以上、好ましくは、 1また (ま数固、列え ( 、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、また (ま 14固のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、または（c)配列番号；!〜 7のアミノ酸酉己歹 IJと少なくとも 50%以上、列えば、 60、 70、 75、 80、 85、 90 、 93%の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを用いてもよい。

[0015] 本発明のこの態様の製造方法は、上記ペプチドでマウスなどの動物を免疫するェ程、抗 Clqモノクローナル抗体を精製する工程などを含んでいてもよい。ペプチドでの免疫、および抗 Clqモノクローナル抗体の精製は、当業者に既知の方法により行われ得る。

[0016] 本発明は、さらに別の態様において、本発明のハイプリドーマを培養することを特徴とする、抗 Clqモノクローナル抗体の製造方法に関するものでる。ハイプリドーマの培養は、インビトロ培養、およびインビボ培養の両方を含む。インビトロ培養は、公知の培養条件にて、例えば、組成： RPMI 1640 ( ohjin 16005005) 425mL、 L-G1 utamine (SIGMA G7513) 5mL、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA S8636) 5mL、 HA Tサプリメント（GIBCO 21060-017) 10mL、ペニシリン 'ストレプトマイシン（SIGMA P4333) 2. 5mL、FBS 75mLの培地中、 37 ± 0. 1。C、 5 ± 0. 15% COにて行

2 うこと力 Sできる。インビボ培養は、例えば、マウスのごとき動物の腹腔に本発明のハイプリドーマを移植することで、達成される。本発明の製造方法は、得られた抗体を精製する工程をさらに含んでいてもよい。精製方法を当業者は適宜選択して用いることができる。

[0017] 本発明は、さらなる態様において、本発明の抗 Clqモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、試料中の Clqタンパク質の存在または量を決定する方法に関するものである。本発明の抗 Clqモノクローナル抗体は、 Clqタンパク質の量に依存して、抗原と抗体の結合体量が増大するという特性を有するので、試料中の Clqタンパク質の存在ば力、りでなぐ量を決定することができる。本発明の決定方法において用いられる抗 C lqモノクローナル抗体は 2種以上であってもよい。 2種以上の抗 Clqモノクローナル抗体を用いることで、決定感度および特異性が増大し、精度が向上する。好ましくは、抗 Clq抗体 # 33と抗 Clq抗体 # 54、抗 Clq抗体 # 33と抗 Clq抗体 # 76、抗 Clq抗体 # 40と抗 Clq抗体 # 54、抗 C lq抗体 # 40と抗 Clq抗体 76とが本発明の決定方法にお!/、て用いられる。本発明の決定方法にぉレ、て用いられる抗体は、標識されたものであってもよい。様々な標識が公知であり、当業者は適宜選択して用いることができる。例えば、 horseradish peroxidase (HRP)、 ALP、 Glue ose oxidase^ β - galactosidaseなどの酵素、 FITC、 Rhodamine、 Cy3、し y5、 Texas Red 、 Alexa Fluor類、 BODIPY類、 IRDye類、 MFP類、 Quantum Dot類、 AMCA、 Allophyc ocyanin, BMP, Cy2、 Cy3.5、 Cy5.5、 DTAF、 DyLight 547、 DyLight 647、 FluoroNano gold, Phycoerythrin, Phycocyanin, R_PE、 Saporin, TRITCなどの光標識、 Biotin、 Digoxigenin (DIG)、 Acridium Ester, Flashlightなどの化学物質、 60mm Microbeadなどのビーズ、 MagCellect Ferrofluid [登録商標]などの磁気ビーズ、 ¹ 1などの放射標識、金粒子、 Agaroseなどの標識が用いられる。力、かる標識を付すことで、本発明の決定方法を効率よく行うことができる。

[0018] 試料は、 Clqタンパク質が含まれる可能性があればいずれのものであってもよぐ例えば、血清、関節液、軟骨や骨及び各組織などが挙げられる。本発明の決定方法を用いることで、力、かる試料中の Clqタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定すること力 Sでさる。

[0019] 本発明の決定方法は、例えば、上記試料を本発明の抗 Clqモノクローナル抗体とインキュベーションし、該抗 Clq抗体と試料中の Clqタンパク質との結合体を形成させ、次に該結合体を測定することにより、行われてもよい。例えば、サンドイッチ ELISA 法などの ELISA法、ィムノブロット法、 Radioimmunoassay (RIA)法、免疫沈降法、プロティンアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法 (CLEIA)、生物発光酵素免疫測定法 (BLEIA)、毛細管現象によって輸液可能な展開器材 (免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いて本発明の決定方法を実施することができる。 ELISA法は、特殊な設備等を必要とせず、実際の医療現場において Clqタンパク質の存在または量の決定を迅速かつ容易に行うことが可能であるので、好ましく用いられる。

[0020] 本発明の抗 Clqモノクローナル抗体を用いて、 Clqタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、本発明の決定方法を RAの予後診断に用いることあでさる。

[0021] 本発明は、なおさらなる態様において、本発明の抗 Clqモノクローナル抗体を用いて試料中の Clqタンパク質の存在または量を決定することを特徴とする、患者における RAの予後の診断方法に関するものである。 Clqタンパク質の存在または量は上述の方法にて決定されてもよ!/、。

[0022] 本発明は、もう 1つの態様において、本発明の抗 Clqモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、患者における RAの治療方法に関するものである。

[0023] 本発明は、さらなる態様において、本発明の抗 Clqモノクローナル抗体を必須構成成分として含む、試料中の Clqタンパク質の存在または量を決定するためのキットに関するものである。本発明のキットに含まれる抗 Clqモノクローナル抗体は 2種以上であってもよい。 2種以上の抗 Clqモノクローナル抗体を含むことで、本発明のキットを用いて行われる Clqタンパク質の存在または量の決定の感度、特異性、精度を向上させること力 Sできる。本発明のキットは、本発明の抗 Clqモノクローナル抗体の他に、例えば、試料採取手段、標識、反応容器、決定用試薬等を含んでいてもよい。一般的に、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットにおいて、抗 Clqモノクローナル抗体は標識されたものであってもょレ、。

[0024] 本発明のキットにお!/、て、例えば、サンドイッチ ELISA法などの ELISA法、ィムノブ口ット法、 Radioimmunoassay (RIA)法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法 (CLEIA)、生物発光酵素免疫測定法 (BLEIA)、毛細管現象によって輸液可能な展開器材 (免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いてもよい。本発明のキットを用いて、 Clqタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定すること力 Sできるので、臨床現場において RA患者の予後診断が可能になる。また、本発明のキットを用いて RAの病理学的研究等を行うこともできる。

[0025] 以下に実施例を示して本発明を詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。

実施例 1

[0026] 抗 Clqモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製

雌の BALB/Cマウス 4匹に Clq精製タンパク質（純度 99%以上、 Calbiochem 20 4876) 0. lmgをアジュバント（タイターマックス、 SIGMA)と共に 2週間おきに 2〜3回、フットパットおよび背中皮下に投与し、免疫した。マウスの脾臓からリンパ球を回収し、抗原 30 ,i gを含む培地にて 3日間培養した。培養後、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株 P3U1細胞を、 PEG1500を用いて常法に従い融合させた。融合後、細胞を組成: R PMI 1640 ( ohjin 16005005) 425mL、 L-Glutamine (SIGMA G7513) 5mL、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA S8636) 5mL、 HATサプリメント（GIBCO 21060-017) lOmL、ペニシリン ·ストレプトマイシン（SIGMA P4333) 2. 5mL、 FBS 75mLの培地に懸濁し、あらかじめマウス胸腺細胞を播種した 96ゥエルプレートに分注した。 8 日後、上清中の抗体の有無を ELISA法によりスクリーニングした。 ELISA法の手順は以下の通りである。 1 a g/ml Clqの PBS中溶液を調製し、 ELISA用マイクロプレート（3912 ファルコン）に添加し、室温にて 2時間インキュベーションすることで結合させた。次に、 1 % スキムミルク/ PBSを用いてブロッキングを行い、抗原プレートとした。抗原プレートに培養上清を添加して反応させ、洗浄後、 ALP標識ャギ抗 IgG (ザィメット）を結合させた。 ALP基質を添加して、酵素反応させ、 492nmにおける吸光度を測定し、抗体陽性ゥエルを選択した。対照として、同様に免疫したゥサギの血清から分離したポリクローナル抗体を用いた。結果を図 1に示す。抗原を結合させていない ELISA用マイクロプレートを用い、非特異的反応を除去し、抗 Clqモノクロ一ナノレ抗体産生ノヽィフ、、リドーマ KS— 0131 # 8、KS— 0131 # 25、KS— 0131 # 33、KS— 0131 # 35、KS— 0131 # 40、KS— 0131 # 54、KS— 0131 # 76、KS— 0131 # 100、KS— 0131 # 102、KS— 0131 # 107、KS— 013 1 # 112、および KS— 0131 # 119などを得た。

実施例 2

[0027] Clqェピトープの同定

ヒト Clqのサブユニット A鎖、 B鎖、 C鎖のアミノ酸配列を配列番号 17〜19に、ヌクレオチド配列を配列番号 20〜22に示す。それぞれのアミノ酸配列をもとにして、各サブユニットのアミノ酸配列を 15アミノ酸 (残基）ずつ 3アミノ酸の間隔でずらした配列を合成ペプチド（順に、ペプチド番号；!〜 78、 97〜； 117、 193〜270番）としてガラスァレイ上に合成した。それぞれのペプチドの合成はアレイ上の特定の位置で行い、 C1 qのサブユニットの全アミノ酸配列を網羅する合成ペプチド含むペプチドアレイを作製した。尚、アレイの作製は JPT社に委託して行った。

[0028] 得られた抗 Clqモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから産生された抗 Clq抗体

# 8、 # 33、 # 40、 # 54、および # 76を Protein Gカラムを用いて精製した。精製した抗体の PBS (10mM リン酸緩衝液 pH7. 0、0. 1M NaCl)での 1 , 000倍希釈液 330 ,1 1をペプチドアレイ上に塗布し、シールをした後、 4°Cで 12時間インキュべートした。その後メタノール 1回、ー0水で5分間 5回洗浄した。遠心してアレイスライドを乾燥させ、蛍光スキャナー（Agilent DNAマイクロアレイスキャナ；アジレント社製）で、スキャンし、ソフトウェア（Feature Extractionソフトウェア；アジレント社製）を用いてアレイ上のそれぞれのペプチドスポットの蛍光強度を数化した。強い蛍光強度を示すいくつかのスポットを検出した。このうち、バックグラウンドレベルより 13, 00 0以上高!/、蛍光強度を示すペプチドスポットを表 1に示す（ペプチド番号 149、 150、 244〜246番のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 3〜7に示す）。

[0029] [表 1] ぺプチド配列蛍光強度

番号番号 # 8 # 33 #40 # 54 # 76

149 3 54， 01 7 1 3, 633 33, 732 26, 890 46， 230

1 50 4 44， 583 1 5, 765 43, 735 26, 50 1 64, 1 1 3

244 5 56， 144 48, 01 2 57, 993 63, 408 65， 31 2

245 6 6 5， 29 7 65, 31 1 65, 3 12 65, 31 2 65， 31 2

246 7 6 5， 29 7 46, 299 63， 698 43, 644 65， 31 2

* バックグラウンドの蛍光強度は 2. 6

[0030] 149番および 150番のペプチドは ClqBサブユニット（B鎖）由来の配列であり、 24 4番〜 246番のペプチドは ClqCサブユニット（C鎖）由来の配列である。これらの配列から、 Clqェピトープのアミノ酸配列は CKVPGLYYF (配列番号 2)の 9残基あるいはその一部を含むと予測した。

[0031] 「149番、 150番、 244〜246番のペプチドに共通するのは 9個のアミノ酸からなる酉己列 CKVPGLYYF (配列番号 2)であることから、かかる配列自体、あるいはかかる配列内に抗 Clq抗体のェピトープが存在すると考えられる。このアミノ酸配列に由来するより短いペプチドを使用することによって、ェピトープとして必要な配列をさらに特定すること力できる。そのような配列を有するペプチドとしては、例えば、 8アミノ酸（ CKVPGLYY (配列番号 23)、 KVPGLYYF (配列番号 24) )、 7アミノ酸 (CKVPG LY (配列番号 25)、 KVPGLYY (配列番号 26)、 VPGLYYF (配列番号 27) )、 6ァミノ酸（CKVPGL (配列番号 28)、 KVPGLY (配列番号 29)、 VPGLYY (配列番号 30)、 PGLYYF (配列番号 1))、 5アミノ酸（CKVPG (配列番号 31)、 KVPGL (配列番号 32)、 VPGLY (配列番号 33)、 PGLYY (配列番号 34)、 GLYYF (配列番号 3 5) )、 4アミノ酸 (CKVP (配列番号 36)、 KVPG (配列番号 37)、 VPGL (配列番号 3 8)、 PGLY (配列番号 39)、 GLYY (配列番号 40)、 LYYF (配列番号 41))からなるペプチド、またはそれ以下のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。

[0032] CKVPGLYYF (配列番号 2)の 9残基のペプチドが Clqェピトープであるかどう力、を決定するため、さらに以下の実験を行った。配列番号 2のアミノ酸配列を有するぺプチド（R2)、およびかかるペプチドより短!/、アミノ酸配歹 IJPGLYYF (配列番号 1)を有するペプチド（R1)を GL Biochem (Shanghai)社に委託して作製した。これらのペプチドを表 2に示す。それぞれのペプチドを 10mg/mlとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。

[表 2]

[0034] ヒト Clqタンパク質（Carbiochem社製）を 10mM HEPES、 300mM NaCl, 40%

グリセローノレ（_ρΗ7· 2) ίこ溶角早し、 ZOO ^ g/mlおよび 50 g/ml ヒト Clqタンノク質溶液を調製した。ヒト Clqタンパク質溶液を 5mm X 15mmの大きさのニトロセルロース膜（Hybond C ;アマシャム社製）に表 3の通りスポットし、室温にて約 1時間風乾した。ニトロセルロース膜を TBSに浸し、 5分ほどなじませてから 5%ブロッキング剤 (Amersham ECL blocking reagent； GE Healthcare社製）を含む TBS (20mM Tris -HC1 pH7. 5、 150mM NaCl)を用いて室温にて 1時間ブロッキングを行った。ブロッキングを行ったニトロセルロース膜を TBSで軽く洗浄し、各抗 Clq抗体および合成ペプチドを含む溶液（20 1)に浸して室温にて 1時間反応させた。 TTBS (TBS に最終濃度 0. 05%で Tween 20を加えたもの）にてニトロセルロース膜を一度軽く洗浄した後、十分量の TTBSで 10分 X 3回振盪しながら洗浄した。結合の検出を以下の通り行った。

[0035] [表 3]

ALP標識抗 Clq抗体を用いた場合の検出方法

ニトロセルロース膜を ALP発色バッファー（lOOmM NaCl、 5mM MgCl入り Tri

2 s -HCl, pH9. 5)で軽く洗浄後、 BCIP/NBT溶液（プロメガ社製）を含む ALP発色バッファー 30 に浸し、室温で 10分間発色させた。染色像が得られたところで二トロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してエプソン社製デジタルスキャナ GT— 8300UFを用いて染色像の取り込みを行った。

[0037] HRP標識抗 C lq抗体を用いた場合の検出方法

ニトロセノレロース膜を Amersham ECL Advance Western Blotting Detectionキット (G E healthcare社製）中の A液 · Β液等量混合液に浸し、室温にて 1分間反応させた。その後、反応液を軽く振り払い、ニトロセルロース膜をプラスチックフィルムで挟み、ボラロイドフィルムに感光させることで膜上の化学発光の検出を行った。

[0038] ALP標識抗 C lq抗体（1/1000希釈）と C lqの結合が、ペプチドにより阻害される力、どうかを検討した。ペプチド R1および R2を添加した系は、ペプチドを添加していない対照と比べて、色濃度が低ぐ C lqへの結合が大幅に阻害されていることがわかつた。 9残基のアミノ酸からなるペプチド R2だけでなぐ 6残基のアミノ酸からなるぺプチド R1でも結合が阻害されていることから、 C lqのェピトープは、 9残基のアミノ酸、または 6残基のアミノ酸からなることが確認できた。

[0039] 次に、 HRP標識抗 C lq抗体（1/20, 000希釈）と C lqの結合の阻害に必要なぺプチドの濃度を検討した。 125、 62. 5、 31. 3、および 15 · 6 μ g/ml ペプチド Rl を抗 C lq抗体と混合し、 C lqとの結合を発色強度で評価した。 15. 6 g/mlの濃度のペプチドを用いた場合に、抗 C lq抗体と C lqの結合が見られた力 S、それ以上の濃度のペプチドを用いた場合には、抗 C l q抗体と C lqの結合が阻害され、発色強度が下がっていることを確認した。この結果から、抗 C lq抗体と C lqとの結合は抗体濃度にも依存する力 15. 6-31. 3 g/mlの濃度範囲の R1ペプチドで阻害されることカゎカゝつた。

実施例 3

[0040] サンドイッチ ELISAによる C lqタンパク質の定量

5 μ g/mL 抗 C lqモノクローナル抗体（固相抗体）溶液 100 μ 1を ELISA用マイク口プレートに結合させた。 1 % スキムミルク/ PBS 100 ^ 1を添カロし、室温にて 30〜 60分間インキュベーションした。次に、 10 g/mL C lqタンパク質抗原 2倍連続希釈溶液 100 1を添加して、 37°Cで 1〜2時間反応させた。純水で 2回洗浄後、 5 μ g/mL Clqモノクローナル抗体（感作抗体）溶液 100 1を添加し、 4°Cにてー晚反応させた。次に、 2次抗体（アビジン化 ALP抗体）を 100 1/ゥエルにて添加し、 4°C 〜室温で;!〜 2時間反応させた。純水で 4回洗浄後、 ALP基質発色液を添加して発色させた。マイクロプレートリーダにて 492nmにおける吸光度（OD)を測定した（参照波長： 660nm)。結果を図 2〜； 10に示す。 Clqタンパク質濃度と吸光度との間に正の相関関係が認められ、抗 Clqモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ ELISA 法により、試料中の Clqタンパク質を定量できることが分かった。図示してはいないが、濃度〜 400 g/mLの Clqタンパク質について定量可能であった。

産業上の利用可能性

本発明により、 Clqタンパク質の定量に用いることができる、抗 Clqモノクローナル抗体、力、かる抗体を用いた Clqタンパク質の検出および/または定量方法、およびそのためのキットなどが得られるので、 RA患者の予後診断、（RAの病理学的)研究等の分野において極めて有用である。

Claims

請求の範囲

[I] Clqタンパク質を特異的に認識することができる、抗 Clqモノクローナル抗体。

[2] 配列番号 1〜7のアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識することができる、請求項 1記載の抗体。

[3] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10649を有するハイプリドーマにより産生される、請求項 1または 2記載の抗体。

[4] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10650を有するハイプリドーマにより産生される、請求項 1または 2記載の抗体。

[5] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10651を有するハイプリドーマにより産生される、請求項 1または 2記載の抗体。

[6] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10652を有するハイプリドーマにより産生される、請求項 1または 2記載の抗体。

[7] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10653を有するハイプリドーマにより産生される、請求項 1または 2記載の抗体。

[8] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10654を有するハイプリドーマにより産生される、請求項 1または 2記載の抗体。

[9] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM B

P— 10649、 FERM BP— 10650、 FERM BP— 10651、 FERM BP— 10652

、 FERM BP— 10653、または FERM BP— 10654を有する、抗 Clqモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマ。

[10] 配列番号 1〜7のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗 Clq モノクローナル抗体の製造方法。

[I I] 請求項 9記載のハイプリドーマを培養することを特徴とする、抗 Clqモノクローナル抗体の製造方法。

[12] 請求項 1〜8のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中の Clqタンノク質の存在または量を決定する方法。

[13] ELISA法によるものである、請求項 12記載の方法。

[14] 請求項 1〜8のいずれか記載の抗体を 2種以上用いるものである、請求項 12または 13記載の方法。

[15] 請求項 4記載の抗体と請求項 7記載の抗体、請求項 4記載の抗体と請求項 8記載の抗体、請求項 6記載の抗体と請求項 7記載の抗体、または請求項 6記載の抗体と請求項 8記載の抗体を用いるものである、請求項 14記載の方法。

[16] 関節リウマチの予後診断のための、請求項 12から 15のいずれか記載の方法。

[17] 請求項;!〜 8のいずれか記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中の Clqタンパク質の存在または量を決定するためのキット。

[18] ELISA法によるものである、請求項 17記載のキット。

[19] 請求項 1〜8のいずれか記載の抗体を 2種以上含むものである、請求項 17または 1 8記載のキット。

[20] 請求項 4記載の抗体と請求項 7記載の抗体、請求項 4記載の抗体と請求項 8記載の抗体、請求項 6記載の抗体と請求項 7記載の抗体、または請求項 6記載の抗体と請求項 8記載の抗体を含むものである、請求項 19記載のキット。

[21] 関節リウマチの予後診断のための、請求項 17〜20のいずれか記載のキット。