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WO2008032777A1 - Antibacterial peptide and use thereof - Google Patents

Antibacterial peptide and use thereof Download PDF

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Publication number
WO2008032777A1
WO2008032777A1 PCT/JP2007/067824 JP2007067824W WO2008032777A1 WO 2008032777 A1 WO2008032777 A1 WO 2008032777A1 JP 2007067824 W JP2007067824 W JP 2007067824W WO 2008032777 A1 WO2008032777 A1 WO 2008032777A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
peptide
nls
lifr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/067824
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuhiko Yoshida
Nahoko Kobayashi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toagosei Co Ltd
Original Assignee
Toagosei Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toagosei Co Ltd filed Critical Toagosei Co Ltd
Priority to JP2008534381A priority Critical patent/JP5218843B2/ja
Publication of WO2008032777A1 publication Critical patent/WO2008032777A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an antimicrobial oligopeptide or polypeptide (hereinafter referred to as "antibacterial peptide") consisting of independent peptide chains in a form that does not exist in nature, and its use, in particular the antibacterial peptide.
  • antibacterial peptide an antimicrobial oligopeptide or polypeptide
  • the present invention relates to an antibacterial agent (composition) as a main component.
  • Antibacterial peptides generally have a broad antibacterial spectrum and are thought to be resistant to the emergence of drug-resistant bacteria. Therefore, antibacterial peptides can be used for the prevention and treatment of bacterial infectious diseases in humans and animals, or for foodstuffs and other items. It is expected to be used for the purpose of imparting antibacterial properties. To date, many antimicrobial peptides have been isolated from various animals and plants. For example, various natural antibacterial peptides are described in JP-A-2000-63400 and JP-A-2001-186887.
  • the present inventors have succeeded in developing an artificial antibacterial peptide by an approach completely different from the approach of isolating what exists as an antibacterial peptide in nature.
  • NLS nuclear localization signal sequence
  • an antibacterial peptide having only NLS as an amino acid sequence involved in antibacterial properties (hereinafter referred to as “NLS antibacterial peptide”). Although it has a broad antibacterial spectrum, its antibacterial activity against gram-negative bacteria is generally lower than that against gram-positive bacteria.
  • the present invention was developed to solve the above-mentioned problems related to existing NLS antibacterial peptides, and an object thereof is to provide an improved NLS antibacterial peptide that is superior in antibacterial activity against gram-negative bacteria. . It is a further object to provide an antibacterial agent (pharmaceutical composition) containing such an improved antibacterial peptide as an active ingredient. Another object of the present invention is to provide a method derived from an improved antibacterial peptide that can be used for various antibacterial applications (eg, DNA and other polynucleotides) and a method.
  • the antibacterial peptide provided by the present invention is a peptide developed by an approach different from the conventionally known antibacterial peptide, and utilizes an amino acid sequence different from a polypeptide that exists in nature as an antibacterial peptide. Is an antibacterial peptide.
  • the present inventor analyzed various amino acid sequences for the above purpose, and focused on a receptor protein identified as a leukemia inhibitory factor rec (to be referred to as LIFR hereinafter). .
  • the partial amino acid sequence (the EMBO Journal), Vol. 20, No. 7, 2001, pp. 1692- contained in the cytokine binding domain (CBD), which is a partial domain. 1703; FEBS Letters, 579, 2005, pp. 4317-4323; and The Journal of Biological Chemistry, 278, 26, 200 3 Pp. 23285-23294) and NLS have been found to be able to exert high antibacterial activity against gram-negative bacteria, and the present invention has been completed.
  • CBD cytokine binding domain
  • the non-naturally-occurring artificially designed antimicrobial peptide disclosed herein is a partial amino acid sequence consisting of at least 5 consecutive amino acid residues in the peptide chain, and at least An NLS-related amino acid sequence consisting of one unit of nuclear translocation sequence (NLS) or an amino acid sequence obtained by partially modifying the NLS;
  • NLS nuclear translocation sequence
  • X and X are independently or commonly S or F, and X is T or S.
  • X is L or I
  • X is Y, H, Q, L or T
  • X is ⁇ or S.
  • An LIFR-related amino acid sequence comprising an amino acid sequence obtained by partially modifying the LIFR-derived amino acid sequence
  • the total number of amino acid residues of the peptide chain is 50 or less.
  • an artificially synthesized antibacterial peptide that does not exist in nature means an artificial chemical synthesis or biosynthesis (ie, a gene whose peptide chain is not independently present in nature). Peptide fragments produced by engineering production).
  • antibacterial peptide refers to an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds that exhibit antibacterial activity against at least one kind of bacteria, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain. Polypeptides composed of oligopeptides having up to about 10 amino acid residues or more amino acid residues are also encompassed by the antimicrobial peptide in the present specification.
  • amino acid residue means a peptide chain unless otherwise specified.
  • amino acids are represented by one-letter code (in the sequence listing, three-letter code) based on the nomenclature related to amino acids indicated in the IUPAC-IUB guidelines.
  • a “partially modified amino acid sequence (modified amino acid sequence IJ)” with respect to a predetermined amino acid sequence means the predetermined amino acid sequence.
  • the result of a so-called conservative amino acid replacement in which one or more (typically 2 or 3) amino acid residues are conservatively substituted is 1 J (for example, ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ( ⁇ ⁇ 2 ⁇ 3) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the peptide disclosed herein can express favorable antibacterial properties by having an NLS-related amino acid sequence (International Publication No. WO03 / 91429) in the peptide chain. Furthermore, the peptides disclosed herein have a LIFR-related amino acid sequence specified as described above in the peptide chain. This can improve antibacterial activity (particularly antibacterial activity against gram-negative bacteria such as E. coli) compared to NLS antibacterial peptides.
  • a preferred peptide is substantially composed of the NLS-related amino acid sequence and the LIFR-related amino acid sequence.
  • the LIFR-related amino acid sequence is arranged adjacent to the C-terminal side of the NLS-related amino acid sequence.
  • the peptide having such a structure is composed only of the amino acid sequence that characterizes the present invention (NLS-related amino acid sequence and LIFR-related amino acid sequence IJ), it can be easily produced by chemical synthesis with a short peptide chain. it can.
  • the LIFR-related amino acid sequence includes the following amino acid sequence:
  • the NLS-related amino acid sequence includes the following amino acid sequences:
  • NLS-related amino acid sequences are short NLS (a and c) consisting of 7 amino acid residues or Although it is a modified NLS (b), it can exhibit high antibacterial activity.
  • the antimicrobial peptide of this embodiment has a short NLS-related amino acid sequence and thus has a short peptide chain and can be easily produced by chemical synthesis.
  • the present invention provides a method for producing the antimicrobial peptide disclosed herein. That is, this method is a method for producing a naturally occurring antibacterial peptide having antibacterial activity against at least one kind of bacteria,
  • NLS-related partial amino acid sequence consisting of at least 5 consecutive amino acid residues, consisting of at least one unit of nuclear translocation sequence (NLS) or an amino acid sequence with partial modification of the NLS Determine (select) the amino acid sequence;
  • X is L or I
  • X is Y, H, Q, L or T
  • X is N or S.
  • the force S can be suitably used to suitably produce the antibacterial peptide of the present invention having the characteristics described above.
  • a peptide chain having a total number of amino acid residues of 50 or less is designed as the peptide chain.
  • Peptides consisting of such short and / or peptide chains are easy to chemically synthesize and are relatively low molecular weight peptides, so that they are used as materials for preparing pharmaceutical compositions such as antibacterial agents. I like it.
  • the peptide is substantially composed of an NLS-related amino acid sequence and a LIFR-related amino acid sequence, and the LIFR-related amino acid sequence is arranged adjacent to the C-terminal side of the NLS-related amino acid sequence.
  • the peptide chain with such a structure is Since it consists of only the amino acid sequence that characterizes the invention, the peptide chain can be shortened and can be easily produced by chemical synthesis.
  • the present invention provides an antibacterial agent comprising at least one antibacterial peptide disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the antibacterial peptide comprising the NLS-related amino acid sequence and the LIFR-related amino acid sequence provided by the present invention can exhibit high antibacterial activity against gram-positive bacteria as well as gram-negative bacteria. Therefore, the antibacterial agent disclosed here is a suitable antibacterial agent for antibacterial (bactericidal or bacteriostatic) purposes of gram-negative bacteria.
  • Antibacterial agents based on antibacterial peptides with a total number of amino acid residues of 50 or less are preferred! Such an antibacterial agent containing a short chain length // peptide (that is, a relatively low molecular weight antibacterial peptide) is easy to handle and can be an antibacterial agent suitable for use in vivo and / or in vitro.
  • the antibacterial peptide used is preferably one in which at least one amino acid residue is amidated. Amidation of the carboxyl group of an amino acid residue (typically the C-terminal amino acid residue of the peptide chain) can improve the structural stability (eg protease resistance) of the antimicrobial peptide.
  • the present invention also relates to a non-naturally-occurring artificially designed polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding any of the antimicrobial peptides disclosed herein and / or a nucleotide sequence complementary to the sequence. (E.g., polynucleotides substantially composed of these sequences).
  • polynucleotide refers to a polymer (nucleic acid) in which a plurality of nucleotides are linked by phosphodiester bonds, and is not limited by the number of nucleotides. Various lengths of DNA and RNA fragments are encompassed by the polynucleotides herein.
  • an artificially designed polynucleotide that does not exist in nature refers to chemical synthesis or biosynthesis (ie, production based on genetic engineering) in which the nucleotide chain (full length) alone does not exist in nature. Polynucleotides that are artificially synthesized by!
  • polynucleotides disclosed herein include the amino acid sequence indicated by any of the sequence numbers in the present specification, or a sequence IJ) in which the sequence is partially modified. And / or a polynucleotide comprising or substantially consisting of a nucleotide sequence complementary to the sequence.
  • the antimicrobial peptide disclosed herein is an artificially designed peptide that does not exist in nature, and is a relatively short chain-length polypeptide or oligopeptide having an NLS-related amino acid sequence and an LIFR-related amino acid sequence. is there.
  • the antimicrobial peptides disclosed here exist in close proximity (particularly preferably adjacent) to the NLS and the partial amino acid sequence contained in the LIFR CBD, which have never been suggested to be combined in the past.
  • Peptide fragments are substances that are clearly distinguished from various naturally occurring polypeptides (peptide chains).
  • the peptide disclosed herein may be a primary structure in which an NLS-related amino acid sequence and an LIFR-related amino acid sequence are incorporated, or a primary structure consisting only of the two sequences.
  • the ratio of NLS-related amino acid sequences and LIFR-related amino acid sequences to the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is 50% or more, and this ratio is preferably 70% or more. More preferably 90% by number or more.
  • all amino acid residues are preferably L-type amino acids, but as long as the antibacterial activity is not lost, part or all of the amino acid residues are substituted with D-type amino acids. It may be.
  • individual amino acid residues constituting the peptide chain are subjected to various modifications (for example, the force of the C-terminal amino acid, the amidation of the loxyl group, the acylation of the amino terminal of the N-terminal amino acid). It may be For example, an N-terminal amino acid residue of a peptide chain is acylated (acetylated). According to the bacterial peptide, both high antibacterial activity and low hemolysis can be realized.
  • the chain length (number of amino acid residues) of the antibacterial peptide disclosed herein is not particularly limited because it may vary depending on the length of the NLS-related amino acid sequence and LIFR-related amino acid sequence contained, Those having a total number of amino acid residues of 50 or less (for example, 17 to 50) are preferred, and those having 30 or less (for example, 17 to 30) amino acid residues are more preferred.
  • the peptide conformation (three-dimensional structure) is not particularly limited as long as it exhibits antibacterial properties in the environment in which it is used, but it is difficult to become an immunogen (antigen).
  • a straight or helix type is preferred.
  • Such a peptide is difficult to construct an epitope.
  • the antibacterial peptide applied to the pharmaceutical composition is linear and has a relatively low molecular weight (typically 17-30 amino acid residues, for example, the number of amino acid residues: 19-20) are preferred.
  • NLS-related amino acid sequence for constituting the antibacterial peptide of the present invention it is conventionally possible to select any one of native NLS discovered from various organisms and viruses and use the sequence as it is. it can.
  • Specific examples include NLS force S shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 81, respectively.
  • Those having a high content of basic amino acid residues are preferred.
  • it is preferable that 40% or more (more preferably 50% or more) of amino acid residues are basic amino acid residues (lysine and / or arginine).
  • NLS comprising one unit with about 5 to 25 amino acid residues is preferred.
  • RRMKWKK SEQ ID NO: 1
  • RVHPY QR SEQ ID NO: 2
  • PKKKRKV SEQ ID NO: 4
  • GKKRSKA SEQ ID NO: 5
  • RGRRR RQR SEQ ID NO: 7
  • RKKRRQRRR SEQ ID NO: 20
  • PRRRK Peptides containing 1 unit or 2 units or more of an NLS-related amino acid sequence composed of 5 amino acid residues or more as in 26) are preferred.
  • one unit is 4 amino acid residues or less, such as RKRR (SEQ ID NO: 27)
  • an amino acid sequence having a total of 5 amino acid residues or more in combination with the same or different NLS may be designed. That is, an NLS-related amino acid sequence containing 2 units or more (typically 2 units, 3 units, or 4 units) of NLS in which one unit is 4 amino acid residues or less may be designed.
  • RKRR SEQ ID NO: 27
  • the sequence is linked to a two-unit tandem! A sequence consisting of 8 amino acid residues (RKRRRKRR) is the NLS-related amino acid sequence.
  • force S is selected as the NLS.
  • an NLS for constructing an antibacterial peptide from an available information source such as a database, it is preferable to select an NLS rich in basic amino acid residues.
  • NLS in which 40% or more, preferably 50% or more, particularly preferably 70% or more of the total number of amino acid residues is an arginine residue and / or lysine residue may be a suitable candidate.
  • an NLS-related amino acid sequence so as to include 2 units or 3 units or more of NLS, it is preferably designed so that these NLSs are arranged adjacent to each other in the peptide chain.
  • a preferred example of such a modified sequence is a sequence in which one or several amino acid residues are conservatively substituted. Further, there may be mentioned a sequence in which one or several (typically about 2 or 3) abasic amino acid residues are substituted with basic amino acid residues.
  • a sequence in which one or several (typically about 2 or 3) abasic amino acid residues are substituted with basic amino acid residues For example, the sequence RKKKR KV (SEQ ID NO: 82) in which proline, which is the N-terminal amino acid residue of PKKKRKV (SEQ ID NO: 4), which is a typical NLS consisting of 7 amino acid residues, is substituted with a basic amino acid residue (eg, arginine). ) Or an arrangement 1!
  • the peptide disclosed herein includes a partial amino acid sequence included in the LIFR site force-in-binding 'domain (CBD) possessed by various biological species. As a related amino acid sequence.
  • the peptide disclosed here has the following sequence as a LIFR-related amino acid sequence: DFX TX X X X LKWX
  • X in the sequence is T or S, X is L or I, X is Y, H, Q, L or T,
  • X is N or S.
  • SEQ ID NO: 84- Each sequence shown by 88 is mentioned.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84 is a partial amino acid sequence contained in CBD1 (cytokine binding domain 1), which is one of the cytoforce-in binding domains of human-derived LIFR.
  • CBD1 is known as a domain involved in cytoforce-in binding such as CNTF (Ciliary neurotrophic factor), and this partial amino acid sequence is thought to be involved in CNTF binding and signaling (FEBS Letters (F EBS Letters), 579, 2005, pp. 4317-4323).
  • CNTF Central neurotrophic factor
  • the position of the NLS-related amino acid sequence and the LIFR-related amino acid sequence in the peptide chain is not particularly limited as long as preferable antibacterial activity can be exhibited.
  • the peptide chain should be designed so that the NLS-related amino acid sequence is arranged near the N-terminus and the LIFR-related amino acid sequence is arranged on the C-terminal side. It is particularly preferable that the NLS-related amino acid sequence and the LIFR-related amino acid sequence are continuously arranged in tandem as viewed from the N-terminal side of the peptide chain.
  • the antibacterial peptides shown in the examples described later do not mean that the suitable peptides that are preferred specific examples of the antibacterial peptides disclosed herein are limited to those having these amino acid sequences.
  • antimicrobial peptides disclosed herein those having a relatively short peptide chain can be easily produced according to a general chemical synthesis method. For example, it is possible to adopt a deviation or deviation from a conventionally known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method! /.
  • a solid phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or! /, Or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as a protecting group for the amino group is preferred.
  • the desired amino acid sequence and modified (C-terminal amidation, etc.) moiety can be obtained by a solid phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer (for example, available from PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, etc.). It is possible to synthesize peptide chains.
  • a commercially available peptide synthesizer for example, available from PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, etc.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (for example, yeast, insect cell, plant cell, animal (mammalian) cell) by a general technique, and the host cell or a tissue containing the cell under a predetermined condition. And cultivate individuals.
  • a predetermined host cell for example, yeast, insect cell, plant cell, animal (mammalian) cell
  • the target polypeptide can be expressed and produced in the cell.
  • the target antimicrobial peptide can be obtained by isolating and purifying the polypeptide from the host cell (in the medium if secreted).
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (for example, a yeast, an insect cell, a plant cell, or a mammalian cell) by a general technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell under a predetermined condition. Is cultured. As a result, the target polypeptide can be expressed and produced in the cell.
  • the target antimicrobial peptide can be obtained by isolating and purifying the polypeptide from the host cell (in the medium if secreted).
  • the method for constructing the recombinant vector, the method for introducing the constructed recombinant vector into the host cell, etc. can be applied as it is if the method conventionally used in the field is used as it is. It is not a characterization! /, So a detailed explanation is omitted.
  • a fusion protein expression system can be used to efficiently produce large quantities in a host cell. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the target antibacterial peptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is expressed in an appropriate fusion protein expression vector (for example, Novagen Corp. is also provided! /, PET series). And GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vectors (such as the pGEX series) provided by Amersham Biosciences. A host cell (typically E. coli) is transformed with the vector. Culturing the obtained transformant Prepare the fusion protein of interest. The protein is then extracted and purified.
  • fusion protein expression vector for example, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the target antibacterial peptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is expressed in an appropriate fusion protein expression vector (for example, Novagen Corp. is also provided! /, PET series).
  • GST Glutathione S-transfer
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the released target peptide fragment (designed antibacterial peptide) is recovered by a method such as affinity chromatography.
  • a predetermined enzyme protease
  • affinity chromatography a method such as affinity chromatography.
  • a cage DNA for cell-free protein synthesis system ie, synthetic gene fragment containing nucleotide sequence encoding amino acid sequence of antibacterial peptide
  • various compounds ATP, RNA polymerase, Amino acids
  • Cell-free protein synthesis systems are described in, for example, Shimizu et al. (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001), Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2), 559-564 (2000)).
  • the target antimicrobial peptide can be easily produced by the cell-free protein synthesis system according to the amino acid sequence.
  • the antibacterial peptide of the present invention based on the Pure System (registered trademark) of Post Genome Research Institute in Japan.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the antimicrobial peptide of the present invention and / or a nucleotide sequence complementary to the sequence can be easily produced (synthesized) by a conventionally known method. it can. That is, by selecting a codon corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence IJ, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the antimicrobial peptide can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a desired nucleoside is obtained using a DNA synthesizer or the like.
  • a polynucleotide (single strand) corresponding to the tide sequence can be easily obtained. Further, the obtained double-stranded DNA can be obtained by employing various enzymatic synthesis means (typically PCR) using the obtained single-stranded DNA as a cage.
  • various enzymatic synthesis means typically PCR
  • the polynucleotide provided by the present invention may be in the form of DNA or RNA (such as mRNA).
  • DNA can be provided in double-stranded or single-stranded form. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) of a complementary sequence.
  • the polynucleotide provided by the present invention is used as a material for constructing a recombinant gene (expression cassette) for production of antimicrobial peptides in various host cells or in a cell-free protein synthesis system. Can be used.
  • nucleotide sequence that encodes a peptide having an amino acid sequence that has been partially modified (or a peptide comprising the amino acid sequence) and / or a nucleotide sequence that is complementary to the sequence (or consists essentially of the sequence) A) non-naturally-occurring artificially designed polynucleotides are provided.
  • the antibacterial peptide of the present invention exhibits effective antibacterial activity against gram-negative bacteria as well as gram-positive bacteria, and preferably has a relatively broad antibacterial spectrum. For this reason, it can be suitably used as the main component of the antibacterial agent. For example, it can be used for the purpose of treating bacterial infections, disinfecting wound surfaces, preventing eye diseases, cleaning the mouth (gargle), preserving foods, maintaining freshness, deodorizing, sterilizing furniture or sanitary equipment surfaces, or bacteriostatically.
  • the carrier or secondary component (typically pharmaceutically acceptable depending on the application) included in the antibacterial agent may vary depending on the use and form of the antibacterial agent.
  • Water typically distilled water, saline and other buffers
  • various organic solvents such as ethanol, glycol dimethacrylate, glycol dimethacrylate, glycol dimethacrylate, glycol dimethacrylate, glycol dimethacrylate, glycol dimethacrylate, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol, glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol glycol dimethoxylate, glycerin, ol dimethoxymethyl methacrylate,
  • the antibacterial agent since it is used for injection and the like, it can be dissolved in physiological saline or an appropriate buffer solution (for example, PBS) immediately before use to prepare a lyophilized product or a granulated product for preparing a drug solution.
  • the carrier contained in the antibacterial agent may vary depending on the form of the antibacterial agent.
  • the preparation method itself does not characterize the present invention as long as it is in accordance with a conventionally known method, and therefore detailed description is omitted.
  • Comprehensive Medicinal Chemistry supervised by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990) can be cited as a detailed information source regarding the treatment.
  • the antibacterial agent provided by the present invention can be used in a method and dose depending on its form and purpose.
  • the antimicrobial peptides containing the NLS-related amino acid sequences and LIFR-related amino acid sequences disclosed herein have high antimicrobial activity even in systems where organic substances such as relatively high concentrations of cations, salts (eg sodium chloride) or serum are present. Can be maintained. Therefore, the antibacterial agent disclosed herein is particularly suitable for use in a system (place) where cations, salts, serum, and the like are present.
  • the antibacterial agent provided by the present invention can be administered to a patient as a liquid agent by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal or intraperitoneal injection, or ileum. Alternatively, solid forms such as tablets can be administered orally.
  • sanitary ware surface disinfection (sterilization) or food preservatives spray a liquid containing a relatively large amount (for example, 1 to 100 mg / ml) of an antimicrobial peptide directly on the surface of the object.
  • a liquid containing a relatively large amount for example, 1 to 100 mg / ml
  • the surface of the object may be wiped with force or with a cloth or paper wetted with the solution.
  • the antibacterial peptides disclosed herein are the bacteria causing the infection (eg Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, pathogenic E. coli etc. High antibacterial activity against gram-negative bacteria). Therefore, the antibacterial peptide of the present invention is useful as a main component of the antibacterial agent.
  • the polynucleotide encoding the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a material used for so-called gene therapy.
  • a gene encoding an antimicrobial peptide typically a DNA segment or RNA segment
  • the antimicrobial peptide according to the present invention is always present in a living body (cell).
  • Peptides can be expressed. Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the antibacterial peptide of the present invention is useful as a drug for preventing or treating bacterial infection in the above-mentioned patients.
  • the antimicrobial peptides disclosed herein can selectively exhibit antibacterial activity against bacteria that have extremely low toxicity to mammalian cells and tissues. Therefore, it is extremely useful as a drug for preventing bacterial infection of cultured organs. For example, by adding an antibacterial peptide of the present invention alone or an antibacterial agent comprising the peptide as one of the main components to the culture solution at an appropriate concentration, bacterial infection of organs or the like being cultured can be prevented.
  • the polynucleotide encoding the antimicrobial peptide of the present invention can be used as a material for gene therapy for cultured cells and cultured tissues.
  • a gene typically a DNA segment or RNA segment
  • the antimicrobial peptide according to the present invention can be expressed in (cell). Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the antimicrobial peptide of the present invention provided by the present invention is useful as a drug for preventing bacterial infection of cultured tissues.
  • each of the peptides of samples ;! to 7 has an NLS-related amino acid sequence arranged on the N-terminal side and an LIFR-related amino acid sequence arranged on the C-terminal side adjacent thereto. That is, the N-terminal arrangement IJ “: KKKRKV” in sample 1, the N-terminal arrangement “RIRKKLR” in samples 2 to 6, and the N-terminal arrangement “PKKKRKV” in sample 7 are! /, Both of which are NLS-related amino acids. All sequences adjacent to the C-terminal side of the sequence are LIFR-related amino acid sequences.
  • DFSTSTLYLKWN in samples 1, 2 and 7 is a partial amino acid sequence consisting of 12 amino acid residues from position 147 (Asp) to position 158 (Asn) contained in CB D1 of human-derived LIFR. is there.
  • DFSTSTIHLKWN in Sample 3 is the amino acid sequence of the corresponding site in the LIFR derived from Inu.
  • DFSTSTLQLKWN in Sample 4 is the amino acid sequence of the corresponding site of rat-derived LIFR.
  • DFFTSSLLLK WN in sample 5 is the amino acid sequence of the corresponding site of mouse-derived LIFR.
  • samples 8 to 11 are samples for comparison. That is, as shown, sample 8 is a peptide consisting only of LIFR-related amino acid sequences, and samples 9-1 1 is a peptide consisting only of an NLS-related amino acid sequence.
  • Each peptide described above (20 amino acid residues or less) was synthesized by a solid phase synthesis method (F modi) using a commercially available peptide synthesizer (PEP TIDE SYNTHESIZER 9050, manufactured by PerSeptive Biosystems).
  • PEP TIDE SYNTHESIZER 9050 commercially available peptide synthesizer
  • HATU Applied Biosystems product
  • the resin and amino acid used in the solid phase synthesis method were purchased from NOVA biochem.
  • the peptide chain is extended from the Fmoc-amino acid that binds to the resin by repeating the deprotection group reaction and the condensation reaction according to the synthesis program of the above peptide synthesizer, and the synthetic peptide having the desired chain length is obtained.
  • the synthesized peptide chain is transferred together with the resin to a centrifuge tube, and ethanediol 1.8 mL, m-taresol 0.6 mL, thioanisole 3.6 mL and trifluoroacetic acid 24 mL are added, and the mixture is added at room temperature. Stir for hours. Thereafter, the resin bound to the peptide chain was removed by filtration.
  • the column was run at a flow rate of 1.5 mL / min. Separation and purification was performed for 30 to 40 minutes.
  • the peptide eluted from the reverse phase column was detected at a wavelength of 220 nm using an ultraviolet detector (490E Detector: product of Waters), and was shown as a peak on the recording chart.
  • the molecular weight of each eluted peptide was measured using the Voyager DE RP (trademark) manufactured by PerS tive Biosystems, using MALD-TOF / MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry). Analysis). As a result, it was confirmed that the target peptide was synthesized and purified.
  • Antibacterial activity (minimum inhibitory concentration) against Gram-negative bacteria (E. coli IFO 3972) and Gram-positive bacteria (S. aureus FDA209P) for the synthetic peptides obtained above (samples;! To 11) : MIC) was determined by a liquid medium dilution method using a 96-well microplate.
  • each sample peptide at a concentration 40 times the maximum test concentration in sterile distilled water, and then adjust the peptide concentration to one in the range of 200 to 0 ⁇ 78 ⁇ .
  • Each medium (DIFCO product “Mueller Hinton Broth”) was prepared.
  • test cells on an agar plate (DIFCO product “Müller Hinton Agar”) cultured at 37 ° C. for 18 hours were sprinkled in a loop and suspended in sterile physiological saline.
  • 2 10 6113/111 and a correspondingly adjusted bacterial solution 5 were inoculated into each well of the microplate and inoculated into each MHB medium containing a predetermined concentration of peptide (number of test bacteria: approx. X 10 6 cell S / mL).
  • cultivation was started in a 37 ° C incubator, and the presence or absence of bacteria was examined by turbidity after 24 hours.
  • the antibacterial peptide according to the present invention can maintain high antibacterial activity even with MHB containing a relatively high concentration of cations. Therefore, the antibacterial peptide of the present invention is suitable for use in a system (for example, in blood) in which various cations (or salts) such as serum are present in a relatively large amount.
  • NLS related The force S adopts two kinds of sequences shown in Table 1 as amino acid sequences, other known NLS (see Sequence Listing), or modified sequences thereof.
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention has a high antibacterial activity, it can be used as an active ingredient of bactericides and antibacterial agents used in various applications including pharmaceuticals and agricultural chemicals.

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Description

明 細 書
抗菌ペプチド及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、天然には存在しない形態の独立したペプチド鎖から成る抗菌性を有す るオリゴペプチド又はポリペプチド（以下「抗菌ペプチド」という。）及びその利用、特 に該抗菌ペプチドを主成分とする抗菌剤 (組成物）に関する。
本願は 2006年 9月 14日に出願された日本国特許出願第 2006— 249284号に基 づく優先権を主張しており、この出願の全内容は本明細書中に参照として援用され ている。
背景技術
[0002] 抗菌ペプチドは一般に幅広い抗菌スペクトルを有し、薬剤耐性菌が出現し難いと 考えられていることから、ヒト及び動物の細菌感染性疾患の予防や治療、或いは、食 材等の物品に抗菌性を付与する目的での利用が期待されている。これまでに多くの 抗菌ペプチドが種々の動植物から単離されている。例えば、特開 2000— 63400号 公報および特開 2001— 186887号公報には、種々の天然由来の抗菌ペプチドが 記載されている。
一方、本発明者等は、このような自然界に抗菌ペプチドとして存在しているものを単 離するアプローチとは全く異なるアプローチで人工的な抗菌ペプチドの開発に成功 した。
即ち、本発明者等は、本来は細胞内で核に移行する種々のポリペプチド中に存在 する部分的な配列である核移行性配列（nuclear localization signal sequence :以下、 NLSという）に着目し、種々の生物種やウィルスから単離された NLSをペプチド鎖に 有する合成抗菌ペプチドを開発した。詳しくは、国際公開第 WO03/91429号を参 照されたい。
発明の開示
[0003] ところで、上記文献 WO03/91429号に開示されているような、抗菌性に関与する アミノ酸配列として NLSのみ備える抗菌ペプチド（以下「NLS抗菌ペプチド」という。 ) は、広範な抗菌スペクトルを示すものの、一般にグラム陰性細菌に対する抗菌活性 はグラム陽性細菌に対する抗菌活性よりも低力、つた。
[0004] そこで本発明は、既存の NLS抗菌ペプチドに関する上記課題を解決すべく開発さ れたものであり、従来よりもグラム陰性細菌に対する抗菌活性に優れる改良型 NLS 抗菌ペプチドの提供を目的とする。また、そのような改良型抗菌ペプチドを有効成分 として含む抗菌剤 (薬学的組成物）の提供を更なる目的とする。また、改良型抗菌ぺ プチドから派生するものであって種々の抗菌用途に利用し得るもの（例えば DNAそ の他のポリヌクレオチド）および方法の提供を他の目的とする。
[0005] 本発明によって提供される抗菌ペプチドは、従前知られている抗菌ペプチドとは異 なるアプローチにより開発されたペプチドであり、自然界において抗菌ペプチドとして 存在するポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を利用して創出された抗菌ペプチドで ある。
即ち、本発明者は、上記目的のために、種々のアミノ酸配列を解析し、白血病阻害 因子受容体（leukemia inhibitory factor rec印 tor :以下、 LIFRという）として同定され ている受容体タンパク質に着目した。そして、その一部のドメインであるサイト力イン結 合ドメイン（cytokine binding domain： CBD)に含まれる部分アミノ酸配列（EMBOジ ヤーナノレ（The EMBO Journal), 20巻 7号、 2001年、 pp. 1692- 1703; FEBSレタ ーズ (FEBS Letters), 579巻、 2005年、 pp. 4317— 4323;及びジャーナル'ォブ · バイオロジカノレ.ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry), 278巻 26号、 200 3年、 pp. 23285— 23294参照）と NLSとから成るペプチド鎖がグラム陰性細菌に対 して高い抗菌活性を奏し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0006] 即ち、ここで開示される天然に存在しない人為的に設計された抗菌ペプチドは、そ のペプチド鎖中に、少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列 であって、少なくとも 1単位の核移行性配列（NLS)又は該 NLSに部分的な改変が 施されたアミノ酸配列から成る NLS関連アミノ酸配列と、
以下の白血病阻害因子受容体 (LIFR)由来の部分アミノ酸配列：
DFX TX X X X LKWX
1 2 3 4 5 6
(ここで、 X及び Xは互いに独立して或いは共通して S又は Fであり、 Xは T又は Sで あり、 Xは L又は Iであり、 Xは Y, H, Q, L又は Tであり、 Xは Ν又は Sである。）又は
4 5 6
該 LIFR由来アミノ酸配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列から成る LIFR関 連アミノ酸配列と、
を有する。好ましくは、該ペプチド鎖の全アミノ酸残基数が 50以下である。
本明細書において「天然に存在しない人為的に合成された抗菌ペプチド」とは、そ のペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に存在するものではなぐ人為的な化学 合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造されるペプチド断 片をいう。
本明細書において「抗菌ペプチド」とは、少なくとも一種の細菌に対して抗菌活性を 示す複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に 含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。アミノ酸残基数が 10程度までのォ リゴペプチド或いはそれ以上のアミノ酸残基から成るポリペプチドも本明細書におけ る抗菌ペプチドに包含される。
本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖の
N末端アミノ酸及び C末端アミノ酸を包含する用語である。なお、本明細書において は、アミノ酸を IUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した 1文字表記 (但し配列表では 3文字表記）で表す。
本明細書において所定のアミノ酸配列（即ち NLS或いは LIFR由来のアミノ酸配列 )に対して「部分的な改変が施されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配歹 IJ)」とは、当該所 定のアミノ酸配列を備える抗菌ペプチドが有する抗菌性を損なうことなぐ当該所定 のアミノ酸配列において 1個または複数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は 付加（揷入）されることによって形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、 1個または複 数個（典型的には 2個または 3個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類 置換 (conservative amino acid replacement)によって生じた目 ή歹1 J (列えば、 ί¾基十玍ァミノ 酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列に 1個又は複数個（一般には 2〜3個程度）のアミノ酸残基が付加（揷入）された配列等 は、本明細書でレ、う「部分的な改変が施された配列（改変アミノ酸配歹 IJ)」に包含され る典型例である。 [0008] ここで開示されるペプチドは、そのペプチド鎖中に、 NLS関連アミノ酸配列（国際公 開第 WO03/91429号)を有することにより、好ましい抗菌性を発現し得る。更に、こ こで開示されるペプチドは、そのペプチド鎖中に上記のように特定される LIFR関連 アミノ酸配列を有する。このことによって、 NLS抗菌ペプチドと比較して抗菌活性（特 に大腸菌のようなグラム陰性細菌に対する抗菌活性）を向上させることができる。
[0009] 好ましい一つのペプチドは、前記 NLS関連アミノ酸配列と、前記 LIFR関連アミノ酸 配列とから実質的に構成される。典型的には、前記 LIFR関連アミノ酸配列は前記 N LS関連アミノ酸配列の C末端側に隣接して配置されることを特徴とする。
このような構成のペプチドは、本発明を特徴付けるアミノ酸配列（NLS関連アミノ酸 配列と LIFR関連アミノ酸配歹 IJ)のみから構成されるためにペプチド鎖が短ぐ化学合 成によって容易に製造すること力 Sできる。
[0010] また、好まし!/、幾つかの態様では、前記 LIFR関連アミノ酸配列として、以下のァミノ 酸配列：
(a) DFSTSTLYLKWN (配列番号 84)；
03) 0?3丁31¾1し10 ^1 (配列番号85)；
(c) DFSTSTLQLKWN (配列番号 86)；
(d) DFFTSSLLLKWN (酉己歹lJ番号87)；
(e) DFSTFTLTLKWS (配列番号 88)；
のうちの!/、ずれかの配列を有する。
これら特定の LIFR関連アミノ酸配列を有することにより、グラム陽性細菌はもとより グラム陰性細菌に対しても高い抗菌活性を有する。
[0011] また、好ましい幾つかの態様では、前記 NLS関連アミノ酸配列として、以下のァミノ 酸配列：
(a) PKKKRKV (配列番号 4)；
( ）1¾0¾¾¾0^(配列番号82)；
(c) RIRKKLR (配列番号 43)；
のうちの!/、ずれかの配列を有する。
これら NLS関連アミノ酸配列は 7アミノ酸残基から成る短い NLS (a及び c)又は改 変 NLS (b)であるものの高い抗菌活性を発揮し得る。また、本態様の抗菌ペプチド は、 NLS関連アミノ酸配列がコンパクトであることからペプチド鎖が短くなり、化学合 成によって容易に製造し得る。
[0012] また、本発明は他の側面として、ここで開示される抗菌ペプチドの製造方法を提供 する。即ち、本方法は、少なくとも 1種の細菌に対して抗菌性を有する天然に存在し なレ、抗菌ペプチドの製造方法であって、
少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列であって、少なくと も 1単位の核移行性配列（NLS)又は該 NLSに部分的な改変が施されたアミノ酸配 列から成る NLS関連アミノ酸配列を決定すること（選択すること）、
以下の白血病阻害因子受容体 (LIFR)由来の部分アミノ酸配列：
DFX TX X X X LKWX
1 2 3 4 5 6
(ここで、 X及び Xは互いに独立して或いは共通して S又は Fであり、 Xは T又は Sで
1 2 3
あり、 Xは L又は Iであり、 Xは Y, H, Q, L又は Tであり、 Xは N又は Sである。）又は
4 5 6
該 LIFR由来アミノ酸配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列から成る LIFR関 連アミノ酸配列を決定すること（選択すること）、
前記決定 (選択）した NLS関連アミノ酸配列と、前記決定 (選択）した LIFR関連アミ ノ酸配列とを有するペプチド鎖を設計すること、および、
前記設計したペプチド鎖を合成すること、
を包含する。
力、かる構成の方法によると、上述した特性の本発明の抗菌ペプチドを好適に製造 すること力 Sでさる。
[0013] 好ましくは前記ペプチド鎖として、全アミノ酸残基数が 50以下であるペプチド鎖を 設計する。このような短!/、ペプチド鎖から成るペプチドは化学合成が容易であるととも に、比較的低分子量のペプチドであるため、抗菌剤等の薬学的な組成物を調製する のに用いる材料として好ましレ、。
例えば、好ましレ、一態様では、 NLS関連アミノ酸配列と LIFR関連アミノ酸配列とか ら実質的に構成され、 LIFR関連アミノ酸配列が NLS関連アミノ酸配列の C末端側に 隣接して配置されるようにペプチド鎖を設計する。このような構成のペプチド鎖は本 発明を特徴付けるアミノ酸配列のみから構成されるためにペプチド鎖が短くなり得、 化学合成によって容易に製造すること力 Sできる。
[0014] また、本発明は他の側面として、ここで開示される少なくとも 1種の抗菌ペプチドと、 薬学的に許容され得る担体とを含む抗菌剤を提供する。
上述のとおり、本発明によって提供される NLS関連アミノ酸配列及び LIFR関連ァ ミノ酸配列を含む抗菌ペプチドは、グラム陽性細菌はもとよりグラム陰性細菌に対して も高い抗菌活性を発揮し得る。従って、ここで開示される抗菌剤は、グラム陰性細菌 の抗菌 (殺菌又は静菌）目的に好適な抗菌剤である。
全アミノ酸残基数が 50以下の抗菌ペプチドを主成分とする抗菌剤が好まし!/、。この ような鎖長の短!/、ペプチド（即ち比較的低分子量の抗菌ペプチド）を含む抗菌剤は 取扱いが容易であり、生体内及び/又は生体外での利用に好適な抗菌剤となり得る 。また、使用する抗菌ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されている ものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖の C末端アミノ酸残基）のカル ボキシル基のアミド化により、抗菌ペプチドの構造安定性 (例えばプロテアーゼ耐性） を向上させ得る。
[0015] また、本発明は、ここで開示されるいずれかの抗菌ペプチドをコードするヌクレオチ ド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む天然に存在しない人為 的に設計されたポリヌクレオチド (例えばそれら配列により実質的に構成されるポリヌ クレオチド)を提供する。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル 結合で結ばれたポリマー（核酸)を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定さ れない。種々の長さの DNAフラグメント及び RNAフラグメントが本明細書におけるポ リヌクレオチドに包含される。また、「天然に存在しない人為的に設計されたポリヌクレ ォチド」とは、そのヌクレオチド鎖 (全長）がそれ単独で自然界に存在するものではな ぐ化学合成或いは生合成 (即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成さ れたポリヌクレオチドを!/、う。
ここで開示される好ましいポリヌクレオチドの例として、本明細書中のいずれかの配 列番号に示されるアミノ酸配列ほたは該配列に部分的な改変が施された配歹 IJ)をコ ードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むか或 いはそれら配列により実質的に構成されるポリヌクレオチドが挙げられる。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及し ている事項 (例えば抗菌ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の 実施に必要な事柄 (例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、ペプチドを成分とす る薬剤組成物の調製に関するような一般的事項）は、有機化学、生化学、遺伝子ェ 学、タンパク質工学、分子生物学、薬学、医学、衛生学等の分野における従来技術 に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されて いる内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
[0017] ここで開示される抗菌ペプチドは、天然に存在しない人為的に設計されたペプチド であり、 NLS関連アミノ酸配列と LIFR関連アミノ酸配列とを有する比較的短い鎖長 のポリペプチドまたはオリゴペプチドである。すなわち、ここで開示される抗菌ぺプチ ドは、従来は組み合わせることが全く示唆されていない NLSと LIFRの CBDに含まれ る部分アミノ酸配列とが近接（特に好ましくは隣接）して存在しているペプチド断片と いう点で、天然に存在する種々のポリペプチド (ペプチド鎖）と明確に区別される物質 である。
ここで開示されるペプチドは、 NLS関連アミノ酸配列及び LIFR関連アミノ酸配列が 組み込まれた一次構造又は当該二つの配列のみから成る一次構造であり得る。典 型的には、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に対する NLS関連アミノ酸配列 及び LIFR関連アミノ酸配列の占める割合が 50個数％以上であり、この割合が 70個 数％以上であることが好ましぐ 90個数％以上が更に好ましい。
なお、本発明の抗菌ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基が L型アミノ酸であるも のが好ましいが、抗菌活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部が D型アミノ酸に置換されているものであってもよい。また、抗菌性を失わない限り、ぺ プチド鎖を構成する個々のアミノ酸残基が種々の修飾 (例えば、 C末端アミノ酸の力 ルポキシル基のアミド化、 N末端アミノ酸のァミノ基のァシル化）を受けたものであって もよい。例えば、ペプチド鎖の N末端アミノ酸残基がァシル化（ァセチル化）された抗 菌ペプチドによると、高い抗菌活性と低い溶血作用の両立を実現し得る。
[0018] ここで開示される抗菌ペプチドの鎖長（アミノ酸残基数）は、含有する NLS関連アミ ノ酸配列及び LIFR関連アミノ酸配列の長さに応じて異なり得るので特に限定されな いが、全アミノ酸残基数が 50以下（例えば 17〜50個）であるものが好ましぐアミノ酸 残基数が 30以下 (例えば 17〜30個）で構成されるものがさらに好ましい。
また、ペプチドのコンホメーシヨン（立体構造）については、使用する環境下で抗菌 性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難 Vヽとレ、う観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましレ、。このような形状のぺプチ ドはェピトープを構成し難い。かかる観点から、薬学的組成物（抗菌用途）に適用す る抗菌ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量 (典型的にはアミノ酸残基数 : 17-30,例えばアミノ酸残基数： 19〜20)のものが好適である。
[0019] 本発明の抗菌ペプチドを構成するための NLS関連アミノ酸配列としては、従来、各 種の生物やウィルスから発見されたネイティブな NLSの何れかを選択し、その配列 のまま利用することができる。具体例として配列番号 1〜配列番号 81にそれぞれ示さ れる NLS力 S挙げられる。塩基性アミノ酸残基の含有率が高いものが好ましい。例えば 、 40%以上（更に好ましくは 50%以上）のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基（リジン 及び/又はアルギニン）であるものが好適である。 5〜25個程度のアミノ酸残基で 1 単位を構成する NLSが好適である。例えば、 RRMKWKK (配列番号 1)、 RVHPY QR (配列番号 2)、 PKKKRKV (配列番号 4)、 GKKRSKA (配列番号 5)、 RGRRR RQR (配列番号 7)、 RKKRRQRRR (配列番号 20)及び PRRRK (配列番号 26)の ような 5アミノ酸残基以上で構成される NLS関連アミノ酸配列を 1単位又は 2単位以 上含むペプチドが好ましい。
一方、 RKRR (配列番号 27)のような、 1単位が 4アミノ酸残基以下である場合には 、同種又は異なる NLSと組み合わせ、全体で 5アミノ酸残基以上となるアミノ酸配列 を設計するとよい。すなわち、 1単位が 4アミノ酸残基以下の NLSを 2単位以上（典型 的には 2単位、 3単位又は 4単位)含む NLS関連アミノ酸配列を設計するとよい。例え ば NLSとして RKRR (配列番号 27)を選択した場合、その配列を二単位タンデムに 繋!/ヽだ 8アミノ酸残基から成る配列（RKRRRKRR)を NLS関連アミノ酸配列とするこ と力 Sできる。
[0020] また、利用可能なデータベース等の情報源から抗菌ペプチドを構築する為の NLS を選択するにあたっては、塩基性アミノ酸残基に富む NLSを選択することが好ましい 。例えば、全アミノ酸残基数の 40%以上、好ましくは 50%以上、特に好ましくは 70% 以上がアルギニン残基及び/又はリジン残基である NLSが好適な候補であり得る。 また、 2単位又は 3単位以上の NLSを含むように NLS関連アミノ酸配列を設計する 場合、好ましくは、これら NLSがペプチド鎖中で隣接して配置されるように設計する。 この場合、隣接する一方の NLSの C末端アミノ酸と他方の NLSの N末端アミノ酸とが 直接結合した形態が好ましい。或いは、隣接する二つの NLSの間にリンカ一として 1 〜数個程度のアミノ酸残基が介在したものも NLS関連アミノ酸配列として好ましい。
[0021] ネイティブな NLSに代えて部分的な改変が施された改変 NLSを採用してもよい。
そのような改変配列の好適例として、 1個若しくは数個のアミノ酸残基が同類置換さ れた配列が挙げられる。また、 1個若しくは数個（典型的には 2、 3個程度）の非塩基 性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に置換した配列が挙げられる。例えば、 7ァミノ 酸残基から成る典型的な NLSである PKKKRKV (配列番号 4)の N末端アミノ酸残 基であるプロリンを塩基性アミノ酸残基（例えばアルギニン）に置換した配列 RKKKR KV (配列番号 82)、或いは、 PKKKRKV (配列番号 4)の N末端側から第 6番目の アミノ酸残基「リジン」を「アルギニン」に同類置換した配歹1 !¾¾¾^¥(配列番号83 )が、好適例として挙げられる。
[0022] ここで開示されるペプチドは、上記 NLS関連アミノ酸配列の他に、種々の生物種が 有する LIFR中のサイト力イン.バインディング 'ドメイン（CBD)に包含される部分アミ ノ酸配列を LIFR関連アミノ酸配列として有する。
即ち、ここで開示されるペプチドは LIFR関連アミノ酸配列として、以下の配列： DFX TX X X X LKWX
1 2 3 4 5 6
を有する。配列中の X及び Xは互いに独立して或いは共通して S又は Fである。また
1 2
、配列中の Xは T又は Sであり、 Xは L又は Iであり、 Xは Y， H， Q， L又は Tであり、
3 4 5
Xは N又は Sである。
6
力、かる LIFR関連アミノ酸配列として選択して使用し得る好例として、配列番号 84〜 88で示す各配列が挙げられる。配列番号 84に示すアミノ酸配列は、ヒト由来 LIFR の有するサイト力イン結合ドメインの一つである CBD1 (cytokine binding domain 1)に 含まれる部分アミノ酸配列である。 CBD1は、 CNTF (Ciliary neurotrophic factor)等 のサイト力インの結合に関与するドメインとして知られており、該部分アミノ酸配列は C NTFの結合やシグナリングに関与しているものと考えられている（FEBSレターズ（F EBS Letters), 579巻、 2005年、 pp. 4317— 4323)。また、酉己歹 IJ番号 85〜88に示 す配列は、動物種は異なるがいずれも LIFR中に含まれる配列であり、配列番号 84 に示すアミノ酸配列の相同（ホモロジ一）配列（配列モチーフ）として認識される。 或いは、これらネイティブな LIFR由来アミノ酸配列に部分的な改変が施されたアミ ノ酸配列であってもよい。そのような改変配列の好適例として、 1個若しくは数個のァ ミノ酸残基が同類置換された配列が挙げられる。
[0023] ここで開示されるペプチドでは、好ましい抗菌活性を発揮し得る限りにおいて、ぺプ チド鎖中における NLS関連アミノ酸配列及び LIFR関連アミノ酸配列の存在位置は 特に限定されない。典型的には、 N末端寄りに NLS関連アミノ酸配列が配置され、そ の C末端側に LIFR関連アミノ酸配列が配置されるようにペプチド鎖を設計するとよい 。ペプチド鎖の N末端側からみて NLS関連アミノ酸配列と LIFR関連アミノ酸配列と が連続してタンデムに並ぶことが特に好ましい。後述する実施例に示す抗菌ぺプチ ドは、ここで開示される抗菌ペプチドの好適な具体例である力 好適なペプチドがこ れらアミノ酸配列のものに限定されることを意味しない。
[0024] ここで開示される抗菌ペプチドのうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化 学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又 は液相合成法のレ、ずれを採用してもよ!/、。ァミノ基の保護基として Boc (t-butyloxyca rbonyl)或!/、は Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl)を適用した固相合成法が好適で ある。例えば、市販のペプチド合成機（例えば、 PerSeptive Biosystems社、 Applied Bi osystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸 配列、修飾（C末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
[0025] 或!/、は、遺伝子工学的手法に基づレ、て抗菌ペプチドを生合成してもよ!/、。このアブ ローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すな わち、所望する抗菌ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 (ATG開 始コドンを含む。）の DNAを合成する。そして、この DNAと該アミノ酸配列を宿主細 胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、 ターミネータ一、ェンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含す る。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて 構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆 虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又 は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、 目的とするポリペプチドを細 胞内で発現、生産させること力 Sできる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中） からポリペプチドを単離し、精製することによって、 目的の抗菌ペプチドを得ることが できる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばィー スト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又 は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、 目的とするポリペプチドを細 胞内で発現、生産させること力 Sできる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中） からポリペプチドを単離し、精製することによって、 目的の抗菌ペプチドを得ることが できる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導 入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよぐ かる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではな!/、ため、詳細な説明は省略する
〇
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システ ムを利用すること力できる。すなわち、 目的の抗菌ペプチドのアミノ酸配列をコードす る遺伝子（DNA)を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用べク ター（例えばノバジェン社カも提供されて!/、る pETシリーズおよびアマシャムバイオサ ィエンス社から提供されてレ、る pGEXシリーズのような GST(Glutathione S-transferas e)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターによ り宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して 目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次い で、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した 目的のペプチド断片（設計した抗菌ペプチド）をァフィ二ティクロマトグラフィー等の方 法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばァ マシャムバイオサイエンス社により提供される GST/Hisシステムを利用し得る。 )を 用いることによって、本発明の抗菌ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の铸型 DNA (即ち抗菌ペプチドのァミノ 酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合 成に必要な種々の化合物 (ATP、 RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆ る無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成する こと力 Sできる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えば Shimizuらの論文 (Sh imizu et al., Nature Biotechnology, 19， 751-755(2001》、 Madinらの論文 (Madin et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2)， 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記 載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの 受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、 日本の東洋紡 績（株）から入手可能な PROTEIOS (商標） Wheat germ cell-free protein synthesis kit )が市販されている。
従って、上述のようにしてひとたび抗菌ペプチドのアミノ酸配列を決定 '設計しさえ すれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の抗 菌ペプチドを容易に生産することができる。例えば、 日本の (株)ポストゲノム研究所 のピュアシステム（登録商標）に基づいて本発明の抗菌ペプチドを容易に生産するこ と力 Sできる。
本発明の抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的な ヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法に よって容易に製造 (合成)することができる。すなわち、設計したアミノ酸配歹 IJを構成 する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、抗菌ペプチドのァミノ 酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとた びヌクレオチド配列が決定されれば、 DNA合成機等を利用して、所望するヌクレオ チド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得ら れた一本鎖 DNAを铸型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的には PCR)を 採用して目的の二本鎖 DNAを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、 DNAの形態であってもよぐ RNA( mRNA等）の形態であってもよい。 DNAは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一 本鎖で提供される場合は、コード鎖 (センス鎖)であってもよぐそれと相補的な配列 の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよレ、。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で 又は無細胞タンパク質合成システムにて、抗菌ペプチド生産のための組換え遺伝子 (発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
[0028] 本発明によって提供されるポリヌクレオチドの!/、くつかは、新規なアミノ酸配列の抗 菌ペプチドをコードする。
例えば、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 50以下 (好ましくは 30以下）で あって、配列番号 89〜95の!/、ずれかで示されるアミノ酸配列或!/、は該アミノ酸配列 に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を有するペプチド（又は該アミノ酸配列から 成るペプチド）をコードするヌクレオチド配列及び/又は該配列と相補的なヌクレオチ ド配列を含む（又はそれら配列から実質的に構成された）天然に存在しない人為的 に設計されたポリヌクレオチドが提供される。
[0029] 本発明の抗菌ペプチドはグラム陽性細菌に加えグラム陰性細菌に対しても有効な 抗菌活性を示し、好ましいものでは比較的広い抗菌スペクトルを有する。このため、 抗菌剤の主成分として好適に用いられ得る。例えば、細菌感染症の治療、創傷面の 消毒、眼病予防、口腔内洗浄 (うがい）、食品の防腐や鮮度保持、脱臭、家具や衛生 機器表面の殺菌又は静菌等の目的に用いられ得る。
抗菌ペプチドの他、抗菌剤に含まれる担体又は副次的成分（典型的には用途に応 じて薬学的に許容され得るもの）としては、抗菌剤の用途や形態に応じて適宜異なり 得る力 水（典型的には蒸留水、生理食塩水その他の緩衝液）、種々の有機溶媒、 種々の緩衝液その他充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、色素 、香料等が挙げられる。 [0030] 抗菌剤の形態に関して特に限定はない。例えば、内用剤若しくは外用剤の典型的 な形態として、軟膏、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠 剤、カプセルが挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又 は適当な緩衝液 (例えば PBS )等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造 粒物とすることもできる。抗菌剤に含まれる担体は、抗菌剤の形態に応じて異なり得 なお、抗菌ペプチド（主成分)及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態 の薬剤 (組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよぐかかる 製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもな!/、ため詳細な説明は省略する。処 方に関する詳細な情報源として、例えば Comprehensive Medicinal Chemistry, Corwi n Hansch監修， Pergamon Press刊（1990)が挙げられる。
[0031] 本発明によって提供される抗菌剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使 用すること力 Sでさる。
ここで開示される NLS関連アミノ酸配列及び LIFR関連アミノ酸配列を含む抗菌ぺ プチドは、比較的高い濃度のカチオン、塩類 (例えば塩化ナトリウム）或いは血清のよ うな有機物が存在する系においても高い抗菌活性を維持し得る。従って、ここで開示 される抗菌剤は、カチオン、塩類や血清等が存在する系（場)での使用に特に好適で ある。例えば、本発明によって提供される抗菌剤は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮 下、皮内若しくは腹腔内への注射或いは灌腸によって患者に投与することができる。 或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、衛生陶器表 面の消毒 (殺菌）や食品の防腐目的に使用する場合は、比較的多量 (例えば 1〜100 mg/ml)の抗菌ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーする力、、或 いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎ ず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等と 同じ形態、使用方法を適用することができる。
例えば、放射線治療を受けているガン患者やエイズ患者にとって、細菌感染症の 予防及び治療は重大な関心事である。ここで開示される抗菌ペプチドは、感染症の 原因たる細菌（例えば黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌、病原性大腸菌のよう なグラム陰性細菌）に対して高い抗菌作用を示し得る。このため、本発明の抗菌ぺプ チドは、抗菌剤の主成分として有用である。
[0032] また、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療 に使用する素材として用い得る。例えば、抗菌ペプチドをコードする遺伝子（典型的 には DNAセグメント、或いは RNAセグメント）を適当なベクターに組み込み、 目的と する部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る抗菌ペプチドを 発現させることが可能である。従って、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌクレ ォチド (DNAセグメント、 RNAセグメント等）は、上述した患者等に対し、細菌感染を 予防し又は治療する薬剤として有用である。
[0033] 再生医療の分野にお!/、て、皮膚、骨、各種の臓器の培養時の細菌感染を防止する ことは重要である。ここで開示される抗菌ペプチドは、哺乳動物細胞及び組織に対す る毒性が極めて低ぐ細菌に選択的に抗菌作用を示し得る。このため、培養臓器等 の細菌感染を防止する薬剤として極めて有用である。例えば、適当な濃度で本発明 の抗菌ペプチド単独又は当該ペプチドを主成分の一つとする抗菌剤を培養液中に 添加することにより、培養中の臓器等の細菌感染を防止することができる。
また、培養細胞や培養組織に対して、本発明の抗菌ペプチドをコードするポリヌク レオチドを遺伝子治療に使用する素材として用いることができる。例えば、本発明の 抗菌ペプチドをコードする遺伝子（典型的には DNAセグメント又は RNAセグメント） を適当なベクターに組み込み、 目的とする培養組織に導入することにより、常時或い は所望する時期に培養組織 (細胞）内で本発明に係る抗菌ペプチドを発現させること が可能である。従って、本発明によって提供される本発明の抗菌ペプチドをコードす るポリヌクレオチド（DNAセグメント、 RNAセグメント等）は、培養組織の細菌感染を 防止する薬剤として有用である。
[0034] 以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に 示すものに限定することを意図したものではない。
[0035] <実施例 1 :抗菌ペプチドの合成及び精製〉
計 11種類のペプチド（サンプル;!〜 11)を後述するペプチド合成機を用いて製造し た。表 1には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列を列挙している。 [0036] [表 1] 表 1 ァミノ酸配列 総アミノ酸残基数 サン,ル 1 R R V-DFSTSTLYLKWN (配列番号 89) 1 9 サングル 2 RIR KLR-DFSTSTLYL WN (配列番号 90) 1 9 サン ル 3 RIR LR-DFSTSTIHLKWN (配列番号 9 1 ) 1 9 サンダル 4 RIR KLR-DFSTSTLQL WN (配列番号 92) 1 9 サンプル 5 RIR LR-DFFTSSLLL WN (配列番号 93) 1 9 サンダル 6 RIR KLR-DFSTFTLTL WS (配列番^ 94) 1 9 サンプル 7 P V-DFSTSTLYL WN (配列番号 95) 1 9 サンズル 8 DFSTSTLYL WN (配列番 S.84) 1 2 サン,ル 9 P R V (配列番号 4) 7 サングル 10 R R V (配列番号 82) 7 サン/ル 1 1 RIR KLR (配列番号 43) 7
[0037] 表 1に示すように、サンプル;!〜 7のペプチドは何れも N末端側に NLS関連アミノ酸 配列が配置され、それに隣接して C末端側に LIFR関連アミノ酸配列が配置されてい る。即ち、サンプル 1の N末端側配歹 IJ「： KKKRKV」、サンプル 2〜6の N末端側配 列「RIRKKLR」及びサンプル 7の N末端側配列「PKKKRKV」は!/、ずれも NLS関 連アミノ酸配列であり、該配列の C末端側に隣接する配列は全て LIFR関連アミノ酸 配列である。
具体的には、サンプル 1, 2及び 7の「DFSTSTLYLKWN」はヒト由来 LIFRの CB D1に含まれる第 147位 (Asp)〜第 158位 (Asn)の 12アミノ酸残基から成る部分アミノ 酸配列である。また、サンプル 3の「DFSTSTIHLKWN」はィヌ由来 LIFRの対応す る部位のアミノ酸配列である。また、サンプル 4の「DFSTSTLQLKWN」はラット由 来 LIFRの対応する部位のアミノ酸配列である。また、サンプル 5の「DFFTSSLLLK WN」はマウス由来 LIFRの対応する部位のアミノ酸配列である。また、サンプル 6の「 DFSTFTLTLKWS」はニヮトリ由来 LIFRの対応する部位のアミノ酸配列である。 一方、サンプル 8〜； 11は比較対象のためのサンプルである。即ち、表示されるよう に、サンプル 8は LIFR関連アミノ酸配列のみから成るペプチドであり、サンプル 9〜1 1は NLS関連アミノ酸配列のみから成るペプチドである。
なお、いずれのサンプルも、 C末端アミノ酸のカルボキシル基（一 COOH)はアミド 化（一CONH )されている。
2
[0038] 上述した各ペプチド（何れも 20アミノ酸残基以下）は、市販のペプチド合成機（PEP TIDE SYNTHESIZER 9050、 PerSeptive Biosystems社製品）を用いて固相合成法（F modi)により合成した。なお、縮合剤として HATU (Applied Biosystems社製品）を 使用し、固相合成法に用いた樹脂及びアミノ酸は NOVA biochem社から購入した。 而して、上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合反 応を反復して樹脂に結合する Fmoc—アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、 目的の 鎖長の合成ペプチドを得た。具体的には、 20%ピぺリジン/ジメチルホルムアミド (D MF) (ペプチド合成用グレード、関東化学 (株)製品）によって、アミノ酸のァミノ保護基 である Fmocを切断除去し、 DMFで洗浄し、 Fmoc—アミノ酸 (-OH)各 4eqを反応させ 、 DMFで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した 後、 20%ピぺリジン/ DMFにより Fmoc基を切断し、 DMF、メタノールの順で上記反 応物を洗浄した。
[0039] 固相合成後、合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール 1. 8 mL、 m-タレゾール 0. 6mL、チオア二ソール 3. 6mL及びトリフルォロ酢酸 24mLを 加え、室温で 4時間撹拌した。その後、ペプチド鎖に結合していた樹脂を濾過して除 去した。
次いで、濾液に冷却エタノールを加え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。 その後、遠心分離 (2500rpmで 5分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジェ チルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、上記と同じ条件で遠心分離を行つ た。この撹拌と遠心分離の処理を計 3回反復して行った。
[0040] 得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ（Waters 600： Wate rs社製品）を用いて精製を行った。
具体的には、プレカラム（日本ウォーターズ（株）製品、 Guard-Pak Delta-pak C 18 A 300)及び C 18逆相カラム（日本ウォーターズ (株)製品、 XTerra (登録商標）カラム、 M S C 18、 5 01、 4.6 X 150mm)を使用し、 0. 1 %トリフノレオ口酢酸水溶液と 0· 1 %トリフ ノレォロ酢酸ァセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。即ち、溶離液に含まれ る上記トリフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比 で 5%から 60%への濃度勾配を設ける）、 1. 5mL/分の流速で上記カラムを用いて 30〜40分間の分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線 検出器（490E Detector : Waters社製品）を用いて波長： 220nmで検出され、記録チ ヤート上にピークとして示された。
また、溶離した各ペプチドの分子量を PerS印 tive Biosystems社製の Voyager DE RP (商標）を用いて MALDト TOF/MS (Matrix- Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry :マトリックス支援レーザーイオン化 飛行時間型 質量分析)に 基づいて決定した。その結果、 目的のペプチドが合成 '精製されていることが確認さ れ 。
[0041] <実施例 2 :合成ペプチドの抗菌活性〉
上記得られた合成ペプチド（サンプル;!〜 11)について、グラム陰性細菌（大腸菌： E. coli IFO 3972)及びグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌： S. aureus FDA209P)に対す る抗菌活性 (最小阻止濃度： MIC)を 96穴 (well)マイクロプレートを用いた液体培地 希釈法により求めた。
即ち、先ず滅菌蒸留水で最高試験濃度の 40倍の濃度の薬剤 (各サンプルぺプチ ド）溶液を調製し、次いでペプチド濃度が 200〜0· 78 Μの範囲内のいずれかとな るような ΜΗΒ培地（DIFCO社製品「ミューラーヒントンブロス (Mueller Hinton Broth)j ) をそれぞれ作製した。
[0042] 次いで、上記濃度範囲内の種々の濃度でペプチドを含有する MHB培地を 96穴マ イク口プレートに 100 μ Lずつ充填した。
一方、 37°Cで 18時間培養した寒天平板（DIFCO社製品「ミューラーヒントン寒天 (M ueller Hinton Agar)」）上の被験菌体をループで搔き取り、滅菌生理食塩水に懸濁し た。 2 10 6113/111し相当に調整した菌液5 しを、上記マイクロプレートの各ゥエル に充填されて!/、る所定濃度のペプチドを含有する MHB培地にそれぞれ接種した（ 試験菌数:約 l X 106cellS/mL)。接種後、 37°Cの恒温器内で培養を開始し、 24時 間後の濁度により菌発生の有無を調べた。その計測時における菌による濁度の増加 が認められな!/、最小ペプチド濃度（即ち薬剤濃度）を本実施例における MIC (単位： M)と定めた。結果を表 2に示す。なお、表中の結果において不等号（〉）が付され ているものは、その数値濃度においてペプチドが溶解しな力 たものであり、正確な 抗菌活性は求められなかった。
[表 2]
表 2 抗菌活性 (M I C ： ： μ Μ)
サンプル No. L. coli Λ aureus サンプル 1 12.5 12.5
サンフ'ル 2 25 12.5
サンダル 3 50 12.5
サンアル 4 25 25
サンダル 5 12.5 12.5
サンダル 6 100 50 サンダル 7 21.4 5.3 サンダル 8 >50 >50
サンプル 9 >100 >100
サンフ'ル丄 0 >100 >100
サンダル 1 1 >100 >100 培地： MH B
[0044] 表 2に示す結果から明らかなように、 NLS関連アミノ酸配列及び LIFR関連アミノ酸 配列を有する抗菌ペプチド（サンプル 1〜 7)は、いずれも良好な抗菌活性を示した。 特に、グラム陰性細菌（大腸菌）に対してグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌）とほぼ同 等の抗菌活性を示した。
上記結果から、本発明に係る抗菌ペプチドは、比較的高濃度のカチオンを含む M HBであっても高い抗菌活性を維持し得ることが確かめられた。従って、本発明の抗 菌ペプチドは、血清のような種々のカチオン (または塩類）が比較的大量に存在する 系（例えば血液中）での用途に好適である。
[0045] 以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の 範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した 具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。例えば、本実施例では、 NLS関連 アミノ酸配列として表 1に示す 2種類の配列を採用している力 S、他の既知の NLS (配 列表参照）或いはそれらの改変配列を採用してもょレ、。
産業上の利用可能性
上述のように本発明のペプチドは高い抗菌活性を有しているため、医薬用、農薬用 をはじめ、各種の用途に用いられる殺菌剤、抗菌剤の有効成分として利用することが できる。

Claims

請求の範囲
[1] 天然に存在しない人為的に設計された抗菌ペプチドであって、ペプチド鎖中に、 少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列であって、少なくと も 1単位の核移行性配列（NLS)又は該 NLSに部分的な改変が施されたアミノ酸配 歹 IJから成る NLS関連アミノ酸配列と、
以下の白血病阻害因子受容体 (LIFR)由来の部分アミノ酸配列：
DFX TX X X X LKWX
1 2 3 4 5 6
(ここで、 X及び Xは互いに独立して或いは共通して S又は Fであり、 Xは T又は Sで
1 2 3
あり、 Xは L又は Iであり、 Xは Y, H, Q, L又は Tであり、 Xは N又は Sである。）又は
4 5 6
該 LIFR由来アミノ酸配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列から成る LIFR関 連アミノ酸配列と、
を有し、
全アミノ酸残基数が 50以下である、抗菌ペプチド。
[2] 前記 NLS関連アミノ酸配列と、前記 LIFR関連アミノ酸配列と、から実質的に構成さ れ、
前記 LIFR関連アミノ酸配列は、前記 NLS関連アミノ酸配列の C末端側に隣接して 配置される、請求項 1に記載の抗菌ペプチド。
[3] 前記 LIFR関連アミノ酸配列として、以下のアミノ酸配列：
(a) DFSTSTLYLKWN；
(b) DFSTSTIHLKWN；
(c) DFSTSTLQLKWN；
(d) DFFTSSLLLKWN；
(e) DFSTFTLTLKWS；
のうちのいずれかの配列を有する、請求項 1又は 2に記載の抗菌ペプチド。
[4] 前記 NLS関連アミノ酸配列として、以下のアミノ酸配列：
(a) PKKKRKV;
(b) RKKKRKV;
(c) RIRKKLR; のうちのいずれかの配列を有する、請求項 1〜3のいずれかに記載の抗菌ペプチド。
[5] 請求項;!〜 4のいずれかに記載の抗菌ペプチドと、薬学的に許容され得る担体とを 含む抗菌剤。
[6] 請求項 1〜4のいずれかに記載の抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び /又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に設計 されたポリヌクレオチド。
[7] 少なくとも 1種の細菌に対して抗菌性を有する天然に存在しない抗菌ペプチドの製 造方法であって、
少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列であって、少なくと も 1単位の核移行性配列（NLS)又は該 NLSに部分的な改変が施されたアミノ酸配 列から成る NLS関連アミノ酸配列を決定すること、
以下の白血病阻害因子受容体 (LIFR)由来の部分アミノ酸配列：
DFX TX X X X LKWX
1 2 3 4 5 6
(ここで、 X及び Xは互いに独立して或いは共通して S又は Fであり、 Xは T又は Sで
1 2 3
あり、 Xは L又は Iであり、 Xは Y, H, Q, L又は Tであり、 Xは N又は Sである。）又は
4 5 6
該 LIFR由来アミノ酸配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列から成る LIFR関 連アミノ酸配列を決定すること、
前記決定した NLS関連アミノ酸配列と、前記決定した LIFR関連アミノ酸配列とを 有するペプチド鎖を設計すること、
および、
前記設計したペプチド鎖を合成すること、
を包含する、抗菌ペプチド製造方法。
[8] 前記ペプチド鎖として、全アミノ酸残基数が 50以下であるペプチド鎖を設計する、 請求項 7に記載の方法。
[9] 前記 NLS関連アミノ酸配列と、前記 LIFR関連アミノ酸配列とから実質的に構成さ れ、
前記 LIFR関連アミノ酸配列が前記 NLS関連アミノ酸配列の C末端側に隣接して 配置されるようにペプチド鎖を設計する、請求項 7又は 8に記載の方法。
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