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WO2008032659A1 - Peptide signal de sécrétion doté d'une efficacité améliorée, et procédé de production de protéine au moyen dudit peptide - Google Patents

Peptide signal de sécrétion doté d'une efficacité améliorée, et procédé de production de protéine au moyen dudit peptide Download PDF

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Publication number
WO2008032659A1
WO2008032659A1 PCT/JP2007/067525 JP2007067525W WO2008032659A1 WO 2008032659 A1 WO2008032659 A1 WO 2008032659A1 JP 2007067525 W JP2007067525 W JP 2007067525W WO 2008032659 A1 WO2008032659 A1 WO 2008032659A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
signal peptide
amino acid
dna
protein
secretory signal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/067525
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kosei Kawasaki
Satoru Ohgiya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority to JP2008534318A priority Critical patent/JPWO2008032659A1/ja
Publication of WO2008032659A1 publication Critical patent/WO2008032659A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a secretory signal peptide and a protein production method using them.
  • Proteins include those that are synthesized inside a cell and then remain inside the cell and those that are released outside the cell. Proteins released outside the cell are generally called secreted proteins. In addition, there are proteins that have been synthesized in the cell and then penetrated into the cell membrane, endoplasmic reticulum membrane, etc., or partly inserted. These proteins are called membrane proteins.
  • secreted proteins and membrane proteins have amino acid sequence characteristics different from those of other proteins. A relatively hydrophobic amino acid sequence is often found on the N-terminal side of these proteins. This amino acid coordination IJ is called “secretory signal peptide” (the sequence is called “secretory signal coordination 1]”! /).
  • secretory signal peptide the sequence is called “secretory signal coordination 1]”! /.
  • secretory signal peptide of a secreted protein or a membrane protein is replaced with a secretory signal peptide derived from another protein, in many cases, the same secretory signal peptide activity (secretion or localization to membrane)
  • secretory proteins or membrane proteins substituted with secretion signal peptides derived from proteins of different species are also secreted extracellularly or localized in the membrane.
  • secretory signal peptides are widely used in fields such as molecular biology.
  • the secretory production of a protein using a secretory signal peptide has the following advantages: [0006] (1) In an intracellular expression system for proteins produced and accumulated in cells, the target protein accumulated in the cells may be degraded by proteolytic enzymes existing in the cells. Arise. On the other hand, in a protein secretion expression system using a secretory signal peptide, the target protein is secreted into the culture medium, so there is relatively little risk of degradation or the like.
  • the target protein In the intracellular expression system of a protein, the target protein is accumulated in a limited intracellular space, and therefore there is a risk of forming an aggregate at a high concentration.
  • the target protein is transferred to the culture medium, and as a result, it is diluted rather than produced intracellularly, and there is less possibility of such a problem.
  • the secretory expression system is suitable for mass production of proteins and is often used practically for the production of pharmaceuticals.
  • the N-terminus of the target protein can be obtained as a natural protein.
  • S-methionine or formylmethionine which is not always the same as the natural protein, and biochemistry
  • the activity may also be different from the natural type.
  • ⁇ 1 factor ( ⁇ 1 mating factor) of budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a secreted protein and has a secretory signal peptide.
  • the secretory signal peptide derived from the a1 factor is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the secretory signal peptide consists of a pre-sequence consisting of the first to 19th amino acid sequences in SEQ ID NO: 2 and the 20th to 89th amino acids.
  • a prosequence consisting of a sequence.
  • the pre-sequence and the pro-sequence are collectively referred to as pre-pro-binding IJ.
  • a sequence containing a force prepro sequence whose pre sequence is a secretory signal sequence is often referred to as a secretory signal sequence.
  • the synthesized nascent ⁇ 1 factor has a secretory signal peptide containing the above-mentioned preb mouth sequence on the heel end side.
  • the ⁇ 1 factor having a secretory signal peptide synthesized intracellularly is cleaved by the endopeptidase in the process of translocation into the endoplasmic reticulum, and becomes an ⁇ ⁇ factor precursor.
  • the prosequence is then cleaved by the endoplasmic reticulum Kex2 endopeptidase at a site typified by a peptide bond between the 85th arginine and 86th glutamic acid of SEQ ID NO: 2.
  • the Golgi Ste l 3 endopeptidase cleaves at the sites represented by peptide bonds on the C-terminal side of the 87th alanine and the C-terminal side of the 89th alanine of SEQ ID NO: 2.
  • mature ⁇ 1 factor will be synthesized.
  • the synthesized mature ⁇ 1 factor is secreted extracellularly.
  • secretory signal peptides derived from Saccharomyces cerevisiae proteins include secretory signal peptides derived from proteins such as ⁇ -factor receptor, invertase, and phosphatase, in addition to the above-mentioned secretory signal peptides derived from ⁇ 1 factor.
  • secretory signal peptides have a common force in terms of their ability to secrete proteins and peptides connected to their C-terminal side (in the case of membrane proteins, they are produced in the membrane). The ability to transport and secrete a large amount of proteins and peptides to the outside of the cell and to secrete them.
  • the ⁇ 1 factor-derived secretory signal peptide is very often used because of its high secretion efficiency, and there are many achievements related to the secretory production of various proteins. It has been known.
  • proteins secreted and produced using a secretory signal peptide derived from factor a 1 include, for example, invertase (Non-patent document 1), epidermal growth factor (Non-patent document 2), interferon- ⁇ 1 ( Non-patent document 3), 13-endorphin (non-patent document 4), anti-CD33 single chain antibody (non-patent document 5), phytase (non-patent document 6) and the like are known.
  • a 1 factor It is known that the secretory signal peptide derived can function as a secretory signal peptide not only in Saccharomyces cerevisiae but also in other yeast species and can secrete proteins (Non-patent Document 7).
  • secretory signal peptide derived from ⁇ factor is also used in an expression system (Invitrogen) using methanol yeast Pichia pastoris.
  • the secretory signal peptide derived from ⁇ 1 factor can be widely applied to secrete and express a protein.
  • Patent Document 1 discloses an invention relating to modification of a pre-sequence.
  • most of the natural signal arrangement IJ (signal sequence in a narrow sense) of egg white lysozyme is substituted with leucine, which is a hydrophobic amino acid.
  • leucine which is a hydrophobic amino acid.
  • Patent Document 1 when a gene encoding a fusion protein in which a DNA sequence encoding the modified signal sequence and a DNA sequence encoding human lysozyme are linked is expressed in Saccharomyces cerevisiae, the natural signal sequence The amount of secreted protein is increased as compared with the case of using. However, the increase in secretion volume has only been about 2.5 times.
  • Patent Document 2 discloses an invention relating to modification of a prosequence.
  • glycosylation site 2 includes one glycosylation site (eg, the 23rd asparagine in SEQ ID NO: 2) of the three pro sequences derived from ⁇ 1 factor and its glycosylation recognition sequence IJ (23rd A gene encoding a pro-sequence that leaves a portion encoding Asnolagin followed by 2 amino acids) and from which part or all of the open-ended sequence on the C-terminal side has been deleted, and its 3 ′ end It was disclosed that a gene encoding a fusion protein was constructed in which a gene coding for a Kex2 cleavage site was linked to the side, and a gene encoding an insulin-like substance protein was linked to the 3 ′ end. Yes.
  • IJ glycosylation recognition sequence
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2564536
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2793215
  • Patents l Emr, 3 ⁇ 4.D., Schekman, R., rlessel, ⁇ ., Thorner, j., “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America J, 1983, 80th , .7080-7084
  • Non-Patent Document 2 Brake, AJ, Merryweather, JP, Coit, DG, Heberlin, UA, Masiarz, FR, Mullenback, GT, Urdea, MS, Valenzuela, P., Barr, PJ, ⁇ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America J, 1984, Vol. 81, p.4642-4646
  • Non-Patent Document 3 Singh, A., Lugovoy, J., ohr, W., Perry, L.J., "Nucleic Acids Research", 1984, Vol. 12, No. 23, p.8927-8938
  • Non-Patent Document 4 Bitter, GA, Chen,.., Banks, AR, Lai, ⁇ _ ⁇ ⁇ , “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America J, 1984, —81, p.5330- 5334
  • Non-Patent Document 5 Emberson, LM, Trivett, AJ, Blower, PJ, Nicholls, PJ, “JOURNA L OF IMMUNOLOGICAL METHODS], 2005, Vol. 305, No. 2, ⁇ ⁇ 135- 151
  • Non-Patent Document 6 Xiong, AS, Yao, QH, Peng, RH, Han, P ⁇ ., Cheng, ZM, Li, Y., jOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGYJ, 2005, Vol. 98, No.
  • an object of the present invention is to identify and provide a secretory signal peptide having higher secretory efficiency than, for example, conventionally used secretory signal peptides.
  • a secretion signal consisting of an amino acid sequence in which a specific amino acid residue is replaced with another amino acid in the secretion signal peptide derived from ⁇ 1 factor of Saccharomyces cerevisiae Peptide power
  • the secretory production amount of the protein linked to the C-terminal side can be improved at least 3 times compared to the secretion signal peptide derived from the natural ⁇ 1 factor, and the present invention was completed. It came to do.
  • the present invention includes the following.
  • the secretion signal peptide according to 1) or (10).
  • (25) A method for producing a protein, characterized by culturing the transformant according to any one of (22) to (24) and allowing the foreign protein to be secreted or expressed in a membrane.
  • a secretory signal peptide exhibiting high / low secretion efficiency of linked proteins when cells of various species such as Saccharomyces cerevisiae are used as hosts. According to the present invention, the protein secretion productivity is improved, and the means for supplying protein as an industrial or research sample is greatly improved.
  • FIG. 1 shows luciferase (CLuc) in each mutant and wild-type culture supernatant.
  • V shows the relative emission intensity
  • FIG. 2 shows luciferase (CLuc) in each mutant and wild-type culture supernatant.
  • V shows the luminescence value (relative value) per microbial mass (OD600).
  • the secretory signal peptide according to the present invention is a variant of the secretory signal peptide derived from ⁇ 1 factor of Saccharomyces cerevisiae. Specifically, it is the following secretory signal peptide (a) or (b).
  • the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a secretory signal peptide derived from Saccharomyces cerevisiae ⁇ 1 factor.
  • the first to 19th amino acid sequences are pre-sequences, while the 20th and the 89th amino acid sequences are pro-sequences.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a gene (cDNA) encoding a secretory signal peptide derived from Saccharomyces cerevisiae ⁇ 1 factor.
  • the secretion signal peptide described in the above (a) is the 19th alanine, the 20th alanine, the 21st in the a1 factor-derived secretion signal peptide (amino acid sequence IJ described in SEQ ID NO: 2).
  • a secretory signal peptide comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of proline, 22nd valine, 23rd asparagine and 24th threonine is substituted with another amino acid.
  • the secreted production amount of the protein linked to the C-terminal side in a host such as yeast as compared with the secretory signal peptide derived from the wild type ⁇ 1 factor (that is, the peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2) can be improved by 3 times or more (for example, 3 to 20 times, preferably 5 to 20 times).
  • a host such as yeast compared to the secretory signal peptide derived from wild type ⁇ 1 factor (that is, the peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2), it was linked to the C-terminal side. It is possible to improve the localization of the protein membrane (cell membrane, endoplasmic reticulum membrane, etc.).
  • substitution at the amino acid position described above may be single or a combination of two or more.
  • the other amino acids are! / Other than the specific amino acids of the secretion signal peptide derived from the wild-type ⁇ 1 factor at each position described above, and may be misplaced amino acids! /.
  • Ni! / The following amino acids are preferably substituted.
  • the secretion signal peptide described in (b) above is further one or several (eg, for example) at positions other than the 19th to 24th amino acids in the secretion signal peptide described in (a). 1 to 10, preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 amino acids), which is composed of an amino acid sequence deleted, substituted or added, and compared with a secretory signal peptide derived from wild type ⁇ 1 factor
  • positions other than the 19th to 24th amino acids include the 18th and 25th amino acids.
  • the secretory signal peptide according to the present invention retains a predetermined amino acid substitution at the 19th to 24th amino acid positions of the secretory signal peptide described in (a) above. It has at least 70% or more, 80% or more, 90% or more, preferably 95% or more amino acid sequence identity with the amino acid sequence of the described secretory signal peptide, and compared with the secretory signal peptide derived from wild-type ⁇ 1 factor Also included are peptides that can increase the secretory production of proteins linked to the C-terminal side by a factor of 3 or more.
  • the secretory signal peptide according to the present invention can be made into a fusion protein linked to a foreign protein.
  • the foreign protein means a protein exogenous to the secretory signal peptide according to the present invention.
  • the peptide is also ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the foreign protein is not particularly limited, and may be any naturally occurring secreted protein, membrane protein, or other non-secretory protein.
  • a non-secretory protein is linked to a secretory signal peptide, there are many cases where no secretion is observed. Therefore, in the present invention, non-secretory protein A protein that can be secreted in quality is called a foreign protein.
  • a secreted protein or membrane protein is linked, it is preferable to link the mature protein obtained by removing / excluding the secretory signal peptide naturally present in the protein to the secretory signal peptide according to the present invention.
  • the secretory signal peptide portion of a secreted protein or membrane protein can be determined by subjecting the mature protein to N-terminal amino acid analysis and comparing it with the deduced amino acid sequence obtained from the base sequence of cDNA.
  • a signal peptide prediction program such as SignalP3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ and Nielsen H., (1997) Protein Engineering, 10: 1-6). It is also possible.
  • foreign proteins examples include various hormones (such as insulin) of proteins or peptides, erythropoietin, cytodynamic force (such as interferon), and various enzymes (such as invertase and amylase).
  • hormones such as insulin
  • erythropoietin erythropoietin
  • cytodynamic force such as interferon
  • enzymes such as invertase and amylase
  • the position at which the foreign protein is linked to the secretory signal peptide according to the present invention can be appropriately selected so that the secretory signal peptide according to the present invention and the foreign protein have their respective functions or activities. It is preferable that a foreign protein is linked to the C-terminal side of the secretory signal peptide according to the invention.
  • the DNA according to the present invention is DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention or DNA encoding the above-mentioned fusion protein (hereinafter referred to as "DNA encoding the fusion protein according to the present invention").
  • DNA encoding the fusion protein according to the present invention DNA encoding the fusion protein according to the present invention.
  • the foreign protein in the fusion protein can be secreted or expressed on a membrane.
  • DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention is preliminarily incorporated into an expression vector (a vector having a promoter and the like and used mainly for protein production) to facilitate the construction of a plasmid for the production of foreign proteins. It is possible to
  • DNA encoding the fusion protein in preparation of DNA encoding the fusion protein according to the present invention, the analysis according to the present invention is performed.
  • a DNA encoding a secretory signal peptide for example, a genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae is used as a saddle type, and primers complementary to the nucleotide sequences at both ends of the region encoding the ⁇ 1 factor-derived secretory signal peptide
  • the wild type ⁇ 1-factor-derived secretory signal peptide coding region is amplified by PCR using.
  • the secreted signal peptide according to the present invention is encoded by a known mutagenesis method (for example, Kunkel method or PCR using a synthetic oligonucleotide as a primer for mutagenesis) on the amplified PCR product.
  • a known mutagenesis method for example, Kunkel method or PCR using a synthetic oligonucleotide as a primer for mutagenesis
  • DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention can be chemically synthesized.
  • the DNA encoding the desired foreign protein is a genomic DNA of the organism from which the foreign protein is derived, cD mRNA, etc., and a primer complementary to the nucleotide sequences at both ends of the foreign protein coding region. It can be obtained by amplification using the PCR used. Alternatively, when DNA encoding a foreign protein has already been cloned, it can be obtained, for example, by cutting it out from the vector with a restriction enzyme from the vector containing the DNA. Alternatively, DNA encoding a foreign protein can be chemically synthesized.
  • the DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention and the DNA encoding the foreign protein are linked so that the codon frames match.
  • the positional relationship between the DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention and the DNA encoding the foreign protein can be appropriately selected so that the expressed fusion protein functions.
  • Strength It is preferable that the DNA encoding the foreign protein is operably linked to the 3 ′ end of the DNA encoding the secretory signal peptide according to the present invention.
  • an enzyme DNA ligase
  • double-stranded DNA having sequences already linked may be chemically synthesized.
  • the recombinant vector according to the present invention can be obtained by inserting a DNA encoding the fusion protein according to the present invention into an appropriate vector.
  • the vector to be used is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and examples thereof include a plasmid, a shuttle vector, and a neuroper plasmid.
  • a shuttle vector for example, a DNA distribution that allows the vector to replicate autonomously in Escherichia coli. ⁇ By including IJ, it can be maintained and replicated in cells both in the host used for protein expression and in E. coli. Further, if the vector itself does not have replication ability, it may be a DNA fragment that can be replicated by inserting it into the host chromosome.
  • the promoter having transcription initiation activity in the host is functionally linked to the 5 'end of the DNA encoding the fusion protein according to the present invention. . That is, the recombinant vector according to the present invention is inserted so that a promoter suitable for the host is functionally linked to the 5 ′ end of the DNA encoding the fusion protein according to the present invention. Is preferred.
  • the promoter may be inducible or non-inducible (constitutive).
  • a promoter that is recognized to have a strong transcription initiation activity in the host to be used for example, a promoter derived from a gene encoding a Saccharomyces cerevisiae glycolytic enzyme is desirable.
  • examples of such a promoter include a promoter derived from a TDH3 (glyceroanolaldehyde triphosphate dehydrogenase) gene.
  • the promoter, the DNA encoding the differentiation signal peptide according to the present invention, and the DNA encoding the foreign protein are separately inserted and ligated. Can also be constructed.
  • the promoter that has transcription initiation activity in relation to the host is a fusion protein according to the present invention. It is preferably functionally linked to the 5 ′ end of the DNA encoding the.
  • the secretory signal peptide according to the present invention is encoded as a DNA fragment or recombinant vector for producing a foreign protein.
  • a DNA fragment or recombinant vector containing the DNA to be prepared can also be produced.
  • DNA encoding a foreign protein to be secreted or membrane expressed is appropriately inserted into the DNA fragment or recombinant vector.
  • the DNA fragment or recombinant vector according to the present invention containing the DNA encoding the fusion protein according to the present invention (hereinafter referred to as "the recombinant vector according to the present invention") is introduced into the host.
  • the host is not particularly limited 1, e.g., true fungi and animal cells containing various yeasts.
  • the yeast may be any yeast, for example, Saccharomyces 'cereviche, Schizosaccharomyces pombe, Pichia' pastris, Candida albicans, Hansenula polymorpha (Hansenula polymorpha). Saccharomyces cerevisiae is particularly preferred from the viewpoint that transformation methods and gene manipulation techniques have been established.
  • Saccharomyces cerevisiae ⁇ 1 factor-derived secretory signal peptide can function in different yeasts other than Saccharomyces cerevisiae (Non-patent Document 7).
  • Other fungi include the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma, the genus Rhizopus j3 ⁇ 4, the genus Mucor and the like.
  • the method for introducing the recombinant vector according to the present invention into the host is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into the host.
  • electroporation electroporation (elect mouth position method), spheroplast method, Examples include the lithium acetate method.
  • it may be a transformation method of yeast or the like such as substitution or insertion into a vector such as a Yip system or a chromosome.
  • the method for introducing the recombinant vector according to the present invention into a true fungus or animal cell containing yeast or the like may be described in a general academic book, academic paper, or the like. ! /
  • DNA having homology with the host chromosomal DNA sequence is added to both ends thereof,
  • DNA having homology with the host chromosomal DNA sequence is added to both ends thereof,
  • it can be incorporated into the chromosomal DNA of the host cell by the homologous recombination function inherent to the host.
  • the introduction of the DNA fragment into the host can be performed according to the above-described method for introducing the recombinant vector according to the present invention.
  • Confirmation of whether or not the recombinant vector according to the present invention has been incorporated into a host can be performed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • DNA is prepared from the transformant, PCR is performed by designing DNA-specific primers. Thereafter, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with bromide zyme, SYBR (registered trademark) Green solution, etc., and the amplified product is detected as a band. Confirm that the product has been transformed.
  • using a primer previously labeled with a fluorescent dye, etc. CR can be used to detect the amplification product.
  • a method may be employed in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence, enzyme reaction, or the like.
  • the obtained transformant is cultured under conditions capable of growth.
  • V in the case of deviation, it is desirable to set the culture conditions of the transformant in consideration of the characteristics of the host and the stability of the desired foreign protein.
  • the culture temperature is set to, for example, 4 to 37 ° C, preferably 20 to 30 ° C.
  • the pH of the medium may be set to 3 ⁇ 5 to 6 ⁇ 5, preferably 5 ⁇ 5 to 6 ⁇ 0, for example.
  • the culture time is, for example, 1 to 120 hours, preferably 1 to 24 hours in the logarithmic growth phase.
  • the secretory production amount of the foreign protein may be evaluated by any method as long as the production amount of the foreign protein can be specifically measured.
  • the culture supernatant obtained by subjecting the solution to centrifugation can be measured using the enzyme activity, physiological activity, etc. of the foreign protein as indicators.
  • the amount of secretion of foreign protein can be measured by a general immunological technique such as Western plotting or ELISA using an antibody specific to the target foreign protein. Alternatively, a method using a fluorescence microscope or flow cytometry may be used.
  • the foreign protein is a membrane protein
  • the membrane fraction is separated, so that the cell membrane or the like can be isolated according to the above-described method for measuring the amount of secreted protein produced.
  • the amount of localization on the membrane can be measured.
  • the amount of localization on the cell membrane may be measured by subjecting the transformant to flow cytometry using an antibody specific for the foreign protein as it is.
  • the desired foreign protein secreted and produced can be obtained from a culture supernatant by a conventional protein purification method such as ammonium sulfate salting out, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, hydrophobic interaction chromatography. It can be purified by high performance liquid chromatography, affinity chromatography, isoelectric focusing, polyacrylamide gel electrophoresis, etc.
  • a foreign protein can be efficiently secreted and produced in a host.
  • the protein expression system using the secretory signal peptide according to the present invention is a secretory protein expression system.
  • the secretory protein expression system has the advantage that it is relatively easy to purify the initial crude sample, that is, the culture medium with less contaminants other than the desired protein than the expression system that accumulates the desired protein in the cell.
  • CLuc luciferase
  • Saccharomyces cerevisiae was used as the host.
  • the expression plasmid pCLuRA-TDH3 is an expression vector that allows CLuc to be expressed in Saccharomyces cerevisiae.
  • International Publication No. 2006/132350 International Application PCT / JP2006 / 311597; Japanese Patent Application 2005- No. 169768 is the basis of priority.
  • This plasmid pCLuRA-TDH3 is a secreted signal peptide derived from wild type ⁇ 1 factor (amino acid sequence: SEQ ID NO: 2) and a mature protein of CLuc (1st to 18th in the amino acid sequence of CLuc shown in SEQ ID NO: 3). And a gene encoding a fusion protein (hereinafter referred to as “a CLuc gene”) with the amino acid sequence (the amino acid sequence excluding the IUC corresponding to the CLuc secretion signal peptide).
  • a CLuc gene a gene encoding a fusion protein
  • the plasmid pCLuRA_TDH3 has a saccharomyces.
  • Cerevisiae TDH3 (systematic gene name: YGR192C) gene promoter operably incorporated upstream (5 ') of the a CLuc gene.
  • YGR192C systematic gene name: YGR192C gene promoter operably incorporated upstream (5 ') of the a CLuc gene.
  • plasmid pCLuRA-TDH3 is essential for replication of plasmids that function in E. coli. Contains essential DNA sequences and ampicillin resistance gene. This plasmid is therefore a shuttle vector that is replicated and maintained in both Saccharomyces cerevisiae and E. coli.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a partial base sequence of the plasmid pCLuRA-TDH3, which shows the TDH3 gene promoter, a CLuc gene, and the 5 'and 3' base sequences thereof.
  • Example 1 Secretory expression of CLuc using a mutant ⁇ 1-factor-derived secretory signal peptide (corresponding to the secretory signal peptide according to the present invention)
  • sgl-f CACCAAGAACTTAGTTTCGAGGG (IJ No. 5)
  • the composition of this Error Prone PCR reaction solution was as follows: Taq DNA polymerase (Roche, 5 unit / ⁇ 1) 1 ⁇ ⁇ ; lOxPCR Duffer without magnesium ion 10 ⁇ 1; Deoxynucleotide mixed solution for Error Prone PCR 10 ⁇ 1; 25 mM magnesium chloride 28 ⁇ 1; 5 mM manganese chloride 5.0 1; Plasmid pCLuRA-TDH3 solution (15 ⁇ 3 ⁇ 4 / 1) 1 ⁇ 1; sgl-i (SEQ ID NO: 5 XlOpmol / a 1) 3 ⁇ 1; sg2_r (SEQ ID NO: 6) (10 pmol / ⁇ 1) 3 1; Sterile water 39 ⁇ 1.
  • composition of the above-mentioned error-prone PCR-use doxynucleotide mixed solution was as follows: lOOmM dCTP 100 ⁇ 1; lOOmM dTTP 100 ⁇ 1; lOOmM dGTP 20 ⁇ 1; 100 mM dATP 20 a 1; sterilized water 760 ⁇ l.
  • Error Prone PCR was performed at 94 ° C for 1 minute (denaturation), 45 ° C for 1 minute (annealing), and 72 ° C for 1 minute (extension) in 30 cycles.
  • the DNA fragment obtained by Error Prone PCR corresponds to the region between the 678th to 990th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • SQ-GPD 1-F0 CATGTATCTATCTCATTTTCTTAC (IJ No. 7)
  • the composition of this PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase (Toyobo) 0.4 ⁇ 1; 10x KOD plus buffer 2 ⁇ ⁇ ; 2 mM each dNTP mixture 2 ⁇ ⁇ ; 25 mM magnesium sulfate 0.8 1; SQ-GPD 1-F0 (SEQ ID NO: 7) (10 01 0 1/1) 0.6 1; sgl_r (SEQ ID NO: 8) (10 pmol / 1) 0.6 1; Plasmid pCLuRA_TDH3 solution (lng / 1) 1 ⁇ 1; Sterile water 12.6
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for one cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (denaturation), at 50 ° C for 30 seconds (annealing), and at 68 ° C. A cycle of 1 minute (extension) was performed in 30 cycles.
  • the entire PCR reaction solution obtained by this PCR was electrophoresed with 1% agarose. As a result, an approximately 250 bp DNA fragment was confirmed.
  • This DNA fragment was purified by Sigma GenElute TM MINUS EtBr SPIN COLUMNS and ethanol precipitation and dissolved in 10-1 TE buffer to obtain “DNA solution B”.
  • sg2-f CAGGACTGTCCTTACGAACCTGA (IJ number 9)
  • SQ-CLuc-CRl TGGACAACCGTCAAACTCCTGGTTGATCTT (IJ No. 10)
  • the composition of this PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase 0.4 ⁇ 1; 10x KOD plus buffer 2 ⁇ ⁇ ; 2mM each dNTP mixture 2 ⁇ ⁇ ; 25 mM magnesium sulfate 0.8 a 1; sg2-f (SEQ ID NO: 9) (10 pmol / ⁇ 1) 0.6 ⁇ 1; SQ-CLuc-CRl (SEQ ID NO: 10) (lOpmo 1 / a 1) 0.6 a 1; plasmid pCLuRA-TDH3 (lng / ⁇ 1) 1 ⁇ 1; sterilized water 12.6 ⁇ 1.
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for 1 cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (denaturation), at 50 ° C for 30 seconds (annealing), and at 68 ° C A cycle of 1 minute (extension) was performed in 30 cycles.
  • a DNA fragment of about 700 bp was confirmed. This DNA fragment was purified by Sigma GenElute TM MINUS EtBr SPIN COLUMNS and ethanol precipitation, and dissolved in 10-1 TE buffer to obtain “DNA solute night C”.
  • PCR was performed using the obtained mixture of DNA solution A, DNA solution B, and DNA solution C as a bowl.
  • the DNA fragment obtained by PCR corresponds to the region between the 460th force and the 1663th base in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the DNA solution A obtained by Erro r Prone PCR is used as part of the saddle type, a point mutation was introduced into the region encoding the ⁇ 1 factor-derived secretory signal peptide. Contains DNA molecules.
  • composition of this PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase 1 ⁇ 1;
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for 1 cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (degenerative), 50 ° C for 30 seconds (annealing), and 68 ° C. A cycle of 1 minute 20 seconds (extension) was performed in 30 cycles.
  • a cycle of 1 minute 20 seconds (extension) was performed in 30 cycles.
  • the remaining PCR reaction solution was purified by Sigma GenElute TM PCR Clean-Up Kit and ethanol precipitation, dissolved in 50 1 TE buffer, and used as “DNA Purification Night D”.
  • SQ-GPD1-R0 CAGCTTTTTCCAAATCAGAGAGCAG ( ⁇ ⁇ lj number 11)
  • mut-CLuc-CFl TCTCTGGCCTCTGTGGAGATCTTAAAATGA (SEQ ID NO: 12)
  • the composition of this PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase 1 ⁇ 1; 10x KOD plus buffer 5 ⁇ 1; 2 mM each dNTP mixture 5 ⁇ 1; 25 mM magnesium sulfate 2 ⁇ ⁇ ; SQ-GPD1-R0 (SEQ ID NO: lXlOpmol / l) 1.5 1; mut-CLuc-CFl (SEQ ID NO: 12) (lOpmol / 1) 1.5 1; Plasmid pCLuRA_TDH3 solution (lng / ⁇ 1) 1 ⁇ 1; Sterile water 33 ⁇ 1.
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for 1 cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (degenerative), 50 ° C for 30 seconds (annealing), and 68 ° C. A cycle of 7 minutes (extension) was performed in 30 cycles. A portion of the PCR reaction solution obtained by this PCR reaction was electrophoresed with 1% agarose. As a result, a DNA fragment of about 6.5 kbp was confirmed. The remaining PCR reaction solution was purified with Sigma GenElute TM PCR Clean-Up Kit, ethanol precipitated, and then dissolved in 50 1 TE buffer to obtain “DNA solution E”.
  • DNA fragment contained in each of DNA solution D and DNA solution E thus obtained has the sequence between the 460th to 525th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the Share the sequence between the 1556th to 1663th bases!
  • Saccharomyces cerevisiae generally undergoes homologous recombination with high probability in cells. Therefore, if DNA solution D and DNA solution E were simultaneously introduced into Saccharomyces cerevisiae, a point mutation was introduced into the region encoding Saccharomyces cerevisiae that contains the circular DNA ( ⁇ 1 factor-derived secretory signal peptide.
  • the mutant plasmid pCLuRA-TDH3 is reconstituted by homologous recombination, and Saccharomyces cerevisiae can be transformed with this reconstituted plasmid.
  • Saccharomyces cerevisiae BY4743 A PRB vermillion was transformed using an equal volume mixture of DNA solution D and DNA solution E. Transformation was performed using the Frozen-EZ Yeast Transformation II from Zymo Research according to the product protocol.
  • each colony of the mutant was added to a synthetic liquid medium (SD-ura agar medium with agar removed and a final concentration of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) added: Then, simply called “buffered SD-ura medium”) was inoculated into a 96-well deep well plate (2 ml volume of each well) in which 0.95 ml was dispensed to each well.
  • a synthetic liquid medium SD-ura agar medium with agar removed and a final concentration of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) added: Then, simply called “buffered SD-ura medium”
  • 6 of the 96 wells were mutated as controls! /, Na! /, Saccharomyces cerevisiae BY4743 ⁇ PRB vermilion transformed with plasmid pCLuRA-TDH3 (hereinafter simply “wild type”) was called).
  • Deep well plates inoculated with mutant and wild-type Saccharomyces cerevisiae were cultured at 30 ° C for 48 hours with shaking at 1200rpm. Thereafter, the culture medium was transplanted in a 96-well format as it was to a 96-well deep well plate (2 ml volume of each well) in which 0.95 ml of the same medium was dispensed to each well at 50 to 1 per well. Next, the deep wall plate containing the transplanted culture solution was subjected to shaking culture at 1200 rpm for 48 hours at 30 ° C.
  • the deep well plate was centrifuged, and the culture supernatant for each well was transferred to a 96-well plate (black) as it was in a 96-well format.
  • FIG. 1 shows the relative luminescence intensity (RLU) for luciferase (CLuc) in each mutant and wild type culture supernatant. Each bar is the result of one mutant or wild type. The six bars at the right end show the relative emission intensity of the wild type, and the others show the relative emission intensity of the mutants! [0118] Among the mutants as shown in Fig. 1, mutants having a relative luminescence intensity that was at least 3 times the average value of the relative luminescence intensity exhibited by the wild type 6 clones were selected.
  • RLU relative luminescence intensity
  • the extracted and purified DNA was used to transform E. coli DH5 strain.
  • the transformed E. coli was smeared on LB (10 g / l NaCl, lOg / 1 Bac to Trypton, 5 g / l yeast extract) agar plate medium containing ampicillin sodium (100 g / ml) to form colonies.
  • a plasmid was extracted from each colony thus formed by a conventional method and purified, and the nucleotide sequence between the 1st to 2700th bases in SEQ ID NO: 4 was examined.
  • amino acid substitutions of the following mutants were identified (in the following description, for example, ⁇ G79A '' means that the 79th glycine (G) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is alanine (A)).
  • G 79th glycine
  • A alanine
  • A19V mutant (hereinafter referred to as “pCLuRA-TDH3 [a A19 ⁇ ]”).
  • V22F mutant (hereinafter referred to as “pCLuRA-TDH3 [a V22 F]”)
  • T24A mutant (hereinafter referred to as “pCLuRA-TDH3 [a T24 8]”).
  • V22A / T26T mutant (Here, “T26T” means that there is a base sequence encoding threonine at position 26! /, With no amino acid substitution! /, There is a base substitution)
  • a P21L single amino acid substitution mutant plasmid (hereinafter referred to as “pCL uRA-TDH3 [a P21L]”) was prepared as follows.
  • a linear DNA fragment of pCLuRA-TDH3 [aP21L] was prepared by PCR.
  • the following oligo DNA primers were used for PCR.
  • sequence “CTA” at the 5 ′ end of primer P21L-for is a sequence that replaces the proline codon with a leucine codon.
  • the composition of the PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase (Toyobo) 0.4 ⁇ 1; 10x KOD plus buffer 2 ⁇ ⁇ ; 2 mM each dNTP mixture 2 ⁇ ⁇ ; 25 mM magnesium sulfate 0.8 1; P21L-for (SEQ ID NO: 1 SXlOpmol / 1) 0.6 ⁇ 1; P21_rev (SEQ ID NO: 1 4) (10 pmol / 1) 0.6 1; Plasmid pCLuRA_TDH3 solution (lng / 1) 1 ⁇ 1; Sterile water 12.6 1
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for one cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (denaturation), at 50 ° C for 30 seconds (annealing), and at 68 ° C. A cycle of 8 minutes (extension) was performed in 30 cycles.
  • the entire PCR reaction solution obtained by this PCR was electrophoresed with 1% agarose. As a result, a DNA fragment of about 7.5 kbp was confirmed. This DNA fragment was purified by Sigma GenElute TM MINUS EtBr SPIN COLUMNS and ethanol precipitation.
  • both 5 'ends of the obtained DNA fragment were phosphorylated with T4 polynucleotide kinase. This was ligated with T4 DNA ligase as a DNA substrate and circularized. The circularized DNA was ethanol precipitated and then dissolved in 50 1 TE buffer.
  • FAR-f AACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCT (IJ Number 15)
  • mut-CLuc-R AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGT (SEQ ID NO: 16)
  • the composition of this PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase (Toyobo) 1 ⁇ 1; 10x KOD plus buffer 5 ⁇ 1; 2 mM each dNTP mixture 5 ⁇ 1; 25 mM sulfate Gnesium 2 1; FAR-f (SEQ ID NO: ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ ) 1.5 1; mut-CLuc-R (SEQ ID NO: 1 Q) (l0pmo ⁇ / ⁇ ⁇ ) 1.5 ⁇ ⁇ ; the above circular DNA solution 1 1; sterilization Water 33 1.
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for 1 cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (degenerative), 50 ° C for 30 seconds (annealing), and 68 ° C. A cycle of 3 minutes (extension) was performed in 30 cycles.
  • the DNA fragment obtained by this PCR is a region between the first to the 2663th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the purified DNA fragment was ligated with restriction enzymes BamHI (recognition site starting with the 40th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4) and Xbal (2576th in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4). After double digestion with 6 bases starting from the base, the whole amount was electrophoresed with 1% agarose. After electrophoresis, a DNA fragment of about 2.5 kbp was purified by Sigma GenElute TM MINUS EtBr SPIN COLUMNS and ethanol precipitation, and dissolved in TE buffer to give “DNA lyophilization night F”.
  • the plasmid pCLuRA-TDH3 was similarly double digested with restriction enzymes BamHI and Xbal, and then electrophoresed with 1% agarose. After electrophoresis, a DNA fragment of about 5 kbp was purified by Sigma GenElute TM MINUS EtBr SPIN COLUMNS and ethanol precipitation and dissolved in TE buffer solution to obtain “DNA solution G”.
  • DNA solution F and DNA solution G were mixed in equal amounts and ligated with T4 DNA ligase.
  • This reaction solution was used to transform E. coli DH5a strain.
  • the transformed E. coli was smeared on an LB agar plate medium containing ampicillin sodium (100 g / ml) to form colonies.
  • A20T single amino acid substitution mutant plasmid (hereinafter referred to as “pCL uRA-TDH3 [aA20T]”) was prepared as follows.
  • a linear DNA fragment of pCLuRA-TDH3 [aA20T] was prepared by PCR.
  • the following oligo DNA primers were used for PCR.
  • A20T— c ACTCCAGTCAACACTACAACAGA (IJ No. 17)
  • sequence “ACT” at the 5 ′ end of primer A20T-C is a sequence that replaces the alanine codon with a threonine codon.
  • composition of this PCR reaction solution was as follows: KOD plus DNA polymerase (Toyobo) 0.4 ⁇ 1; 10x KOD plus buffer 2 ⁇ ⁇ ; 2 mM each dNTP mixture 2 ⁇ ⁇ ; 25 mM magnesium sulfate 0.8 1; A20T-C (SEQ ID NO: 17) (10 0101/1) 0.6 1; A20_rev (SEQ ID NO: 18) (lOpmol / 1) 0.6 1; Plasmid pCLuRA_TDH3 solution (lng / 1) 1 ⁇ 1; Sterile water 12.6 1 .
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 minutes (inactivation of anti-polymerase antibody) for one cycle, and at 94 ° C for 15 seconds (degenerative), at 48 ° C for 30 seconds (annealing), and at 68 ° C. A cycle of 8 minutes (extension) was performed in 30 cycles.
  • the entire PCR reaction solution obtained by this PCR was electrophoresed with 1% agarose. As a result, a DNA fragment of about 7.5 kbp was confirmed. This DNA fragment was purified by Sigma GenElute TM MINUS EtBr SPIN COLUMNS and ethanol precipitation.
  • both 5 'ends of the obtained DNA fragment were phosphorylated with T4 polynucleotide kinase. This was ligated with T4 DNA ligase as a DNA substrate and circularized. Using this reaction solution, E. coli DH5a strain was transformed. The transformed E. coli was smeared on LB agar plate medium containing ampicillin sodium (100 g / ml) to form colonies.
  • German amino acid substitution mutant plasmid hereinafter referred to as “pCLuRA-TDH3 [a V22A]”
  • pCLuRA-TD CL3 [ ⁇ ⁇ 23 ⁇ ] German amino acid substitution mutant plasmid
  • pCLuRA-TD CL3 [ ⁇ ⁇ 23 ⁇ ] N23Y single amino acid substitution mutant plasmid
  • V22A GCTAACACTACAACAGAAGATGAAA (SEQ ID NO: 19)
  • V22-rev- c TGGAGCAGCTAATGCGGAGGAT (SEQ ID NO: 20)
  • primers used in PCR for pCLuRA-TDH3 [aN23Y] were as follows.
  • N23Y TACACTACAACAGAAGATGAAACGG (SEQ ID NO: 21)
  • N23- rev- c GACTGGAGCAGCTAATGCGGAG (SEQ ID NO: 22)
  • Saccharomyces cerevisiae BY4743 ⁇ PRB vermilion was transformed with CLuRA-TDH3 [a V22F] and pCLuRA-TDH3 [a T24A], respectively.
  • the culture was shaken at 1200 rpm for 48 hours at ° C.
  • the culture medium was transplanted in a 96-well format as it was to a 96-well deep well plate (2 ml of each well) in which 0.91 ml of the same medium was dispensed to each well.
  • the deep well plate containing the transplanted culture solution was subjected to shaking culture at 1200 rpm for 30 hours at 30 ° C.
  • Plasmids pCLuRA-TDH3, pCLuRA-TDH3 [a A19V], pCLuRA-TDH3 [a A20T], pCLuRA_TDH3 [a P21L, pCLuRA_TDH3 [a V22A, pCLuRA_TDH3 [a V22F, pCL uRA-TDH3 [H N23Y] [aT24A] was used to transform Saccharomyces cerevisiae BY4743 ⁇ PRB vermillion, respectively.
  • the culture solution was transplanted in a 96-well format as it was to a 96-well deep well plate in which 0.91 ml of the same medium was dispensed to each well.
  • the deep well plate containing the transplanted culture solution was subjected to shaking culture at 1200 rpm for 30 hours at 30 ° C.
  • each bar represents the result of each mutant or wild type shown, and the horizontal axis represents the luminescence value per OD (OD600).

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Description

明 細 書
効率向上型分泌シグナルペプチド及びそれらを利用したタンパク質生産 方法
技術分野
[0001] 本発明は、分泌シグナルペプチド及びそれらを利用したタンパク質生産方法に関 する。
背景技術
[0002] タンパク質には、細胞内で合成された後、細胞内に留まるもの、細胞外に放出され るものが存在する。細胞外に放出されるタンパク質を、一般的には分泌タンパク質と 呼ぶ。また、細胞内で合成された後、細胞膜や小胞体膜等に貫通した、或いは一部 が揷入された形態で存在するタンパク質が存在する。これらのタンパク質は膜タンパ ク質と呼ばれる。
[0003] 分泌タンパク質及び膜タンパク質には、それ以外のタンパク質とは異なるアミノ酸配 列上の特徴があることが知られている。それらのタンパク質の N末端側には、比較的 疎水性の高いアミノ酸配列がしばしば見出される。このアミノ酸配歹 IJは、「分泌シグナ ルペプチド」 (その配列を「分泌シグナル配歹 1]」と!/、う)と呼ばれる。分泌シグナルぺプ チドが分泌タンパク質 (細胞外への分泌)や膜タンパク質 (膜への局在)の生産におい て重要であることは、分泌タンパク質や膜タンパク質のアミノ酸配列から分泌シグナル 配列を除去することで、それぞれ細胞外への分泌や膜への局在が見られなくなること から、広く認識されている。
[0004] また、分泌タンパク質又は膜タンパク質の分泌シグナルペプチドを別のタンパク質 由来の分泌シグナルペプチドで置換しても、多くの場合、同様の分泌シグナルぺプ チド活性 (分泌や膜への局在)が見られることや、生物種の異なるタンパク質由来の分 泌シグナルペプチドで置換された分泌タンパク質又は膜タンパク質も同様に細胞外 へ分泌されるか、或いは膜に局在されることが知られている。このように、分子生物学 等の分野では、分泌シグナルペプチドは汎用的である。
[0005] 分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌生産には、次のような利点がある [0006] (1)細胞内で生産され、蓄積されるタンパク質の細胞内発現系では、細胞内に存在 するタンパク質分解酵素等により、蓄積される目的のタンパク質が分解されてしまうこ と力 Sしばしば生じる。一方、分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系 では、培養液中に目的タンパク質が分泌されることから、比較的分解等の虞が少ない
[0007] (2)タンパク質の細胞内発現系では、 目的のタンパク質を精製するためには、細胞 の破砕が必要であり、且つ細胞内のあらゆる物質が夾雑物となる。一方、分泌シグナ ルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、生産されたタンパク質が培養液 中に分泌されるため、細胞の破砕が不要であると共に、初発粗試料、即ち培養液中 に目的のタンパク質以外の夾雑物が少なぐ 目的のタンパク質の精製が比較的容易 である。
[0008] (3)タンパク質の細胞内発現系では、 目的のタンパク質は限りある細胞内スペース に蓄積されるため、高濃度になると凝集体を形成する等の虞がある。一方、分泌シグ ナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、培養液中に目的タンパク質が 移行するため、結果として細胞内で生産されるよりも希釈され、そのような虞が少ない 。この理由から、分泌発現系がタンパク質の大量生産に適しており、実用的にも医薬 品の生産等でよく用いられている。
[0009] (4)分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、 目的のタンパク 質の N末端が天然型のタンパク質として得ることができる。一方、タンパク質が細胞内 に留まるような細胞内発現系では、 N末端力 Sメチォニン又はホルミルメチォニンである ことが多ぐこれにより必ずしも天然型のタンパク質と同一であるとは限らず、生化学 的活性も天然型とは違う場合がある。
[0010] 出芽酵母サッカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)の α 1因子（ α 1 mati ng factor )は、分泌タンパク質であり、分泌シグナルペプチドを有する。具体的には、 a 1因子由来の分泌シグナルペプチドは、配列番号 2記載のアミノ酸配列から成るぺ プチドである。当該分泌シグナルペプチドは、配列番号 2において、第 1番目から第 1 9番目までのアミノ酸配列から成るプレ配列と、第 20番目から第 89番目までのアミノ酸 配列から成るプロ配列とを含む。当該プレ配列とプロ配列とを合わせて、プレプロ配 歹 IJと呼ばれる。なお、狭義には、プレ配列が分泌シグナル配列である力 プレプロ配 列を含む配列を、分泌シグナル配列と呼ぶことが多レ、。
[001 1] 合成された新生 α 1因子は、 Ν末端側に上述したプレブ口配列を含む分泌シグナル ペプチドを有することとなる。細胞内で合成された分泌シグナルペプチドを有する α 1 因子は、小胞体内に移行する過程でプレ配列部分がエンドぺプチダーゼにより切断 され、 α ΐ因子前駆体となる。次いで、プロ配列が小胞体の Kex2エンドぺプチダーゼ により、配列番号 2の第 85番目のアルギニンと第 86番目のグルタミン酸との間のぺプ チド結合に代表される部位で切断される。さらに、ゴルジ体の Ste l 3エンドぺプチダー ゼにより、配列番号 2の第 87番目のァラニンの C末端側及び第 89番目のァラニンの C 末端側のペプチド結合に代表される部位で切断され、これらのプロセッシングを経て 、成熟 α 1因子が合成されることとなる。合成された成熟 α 1因子は、細胞外に分泌さ れる。
[0012] サッカロミセス'セレピシェのタンパク質由来の分泌シグナルペプチドとしては、上 述した α 1因子由来の分泌シグナルペプチド以外にも、例えば、 α因子受容体、イン ベルターゼ、ホスファターゼ等のタンパク質由来の分泌シグナルペプチドが知られて おり、これまでに用いられている。しかしながら、これらの分泌シグナルペプチドは、そ の C末端側に接続されているタンパク質やペプチドを分泌させる (膜タンパク質の場 合には、膜に生産させる)能力という点では共通性を有する力 どの程度の量のタン ノ ク質やペプチドを細胞外に輸送し、分泌させること力 Sできる力、 (膜タンパク質の場合 には膜に生産させることができる力 とレ、う効率 (以下、「分泌効率」とレ、う)は同一では ない。実際には、それらの中でも、 α 1因子由来の分泌シグナルペプチドがその高い 分泌効率から非常によく用いられ、種々のタンパク質の分泌生産に関する多くの実 績が知られている。
[0013] a 1因子由来の分泌シグナルペプチドを用いて分泌生産させたタンパク質としては 、例えば、インベルターゼ (非特許文献 1)、上皮細胞増殖因子 (非特許文献 2)、インタ 一フエロン- α 1 (非特許文献 3)、 13 -エンドルフィン (非特許文献 4)、抗 CD33シングル 鎖抗体 (非特許文献 5)、フイターゼ (非特許文献 6)等が知られている。また、 a 1因子 由来の分泌シグナルペプチドは、サッカロミセス'セレビシェのみならず、他の酵母種 でも分泌シグナルペプチドとして機能し、タンパク質を分泌させることができることが 知られている (非特許文献 7)。さらに、 α ΐ因子由来の分泌シグナルペプチドは、メタ ノール酵母ピキア.パストリス (Pichia pastoris)を用いた発現系 (Invitrogen社)等におい ても用いられている。このように、 α 1因子由来の分泌シグナルペプチドは、タンパク 質を分泌発現させるために広く適用可能である。
[0014] ところで、分泌タンパク質又は膜タンパク質由来のプレ配列やプロ配列を改変し、 連結したタンパク質の分泌効率を向上させる試みがなされている。
[0015] 特許文献 1には、プレ配列の改変に関する発明が開示されている。特許文献 1記載 の発明では、卵白リゾチームの天然のシグナル配歹 IJ (狭義のシグナル配列)の大部分 を疎水性アミノ酸であるロイシンに置換している。特許文献 1の記載によれば、その改 変シグナル配列をコードする DNA配列とヒトリゾチームをコードする DNA配列とを連結 した融合タンパク質をコードする遺伝子をサッカロミセス'セレピシェで発現させると、 天然のシグナル配列を用いた場合と比較して該タンパク質の分泌量が増大する。し 力、しながら、分泌量の向上は 2.5倍程度にとどまつている。
[0016] 一方、特許文献 2には、プロ配列の改変に関する発明が開示されている。特許文献
2には、 α 1因子由来のプロ配列の 3つあるうちの 1つの糖鎖付加部位 (例えば、配列 番号 2における第 23番目のァスパラギン)とその糖鎖付加認識配歹 IJ (第 23番目のァス ノ ラギンとそれに続く 2アミノ酸）とをコードする部分を残し、それより C末端側にあるプ 口配列の一部或いは全部を欠失させたプロ配列をコードする遺伝子と、その 3'末端 側に Kex2切断部位をコ一ドする遺伝子とを連結し、さらにその 3'末端側にインシユリ ン様物質タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合タンパク質をコードする遺伝 子を構築したことが開示されている。特許文献 2の記載によれば、その融合タンパク 質をコードする遺伝子をサッカロミセス.セレピシェで発現させると、天然のプロ配列 を用いた場合と比較して、該タンパク質の分泌量が増大する。しかしながら、分泌量 の増大は 3倍に満たず、劇的に向上したとは言い難い。
[0017] 近年、医薬としてのタンパク質、工業用酵素の生産はもとより、文部科学省の「タン パク質 3000」プロジェクトにみられるように、生化学的現象解明のためのタンパク質試 料の提供の手段として、所望のタンパク質が簡便且つ多量に生産できるタンパク質 発現系の開発が強く求められている。そのため、タンパク質の分泌発現系は、分泌効 率の向上という点においてさらなる改善の必要性がある。
また、膜タンパク質が合成される際には、シグナル配列による小胞体膜の通過とい う、分泌タンパク質と共通したメカニズムを利用することが一般的に知られている。従 つて、上述した分泌シグナルペプチドは、膜タンパク質を効率的に生産することにも 適応可能であると考えられる。
特許文献 1：特許第 2564536号公報
特許文献 2：特許第 2793215号公報
^特許文 l : Emr， ¾.D., Schekman, R.， rlessel, Μ·し.， Thorner, j., 「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of AmericaJ， 1983年，第 80 卷， .7080-7084
非特許文献 2 : Brake, A.J., Merryweather, J. P., Coit, D.G., Heberlin, U.A., Masiarz, F.R., Mullenback, G.T., Urdea, M.S. , Valenzuela, P., Barr, P.J., 「Proceedings of th e National Academy of Sciences of the United States of AmericaJ , 1984年， —81巻， p.4642-4646
非特許文献 3 : Singh, A., Lugovoy, J., ohr, W.， Perry, L.J.,「Nucleic Acids Resear ch」， 1984年，第 12巻，第 23号， p.8927-8938
非特許文献 4 : Bitter, G.A., Chen, . . , Banks, A.R., Lai, Ρ_Η·， 「 Proceedings of th e National Academy of Sciences of the United States of AmericaJ , 1984年， —81巻， p.5330-5334
非特許文献 5 : Emberson， L.M., Trivett, A.J., Blower, P.J., Nicholls, P.J.,「JOURNA L OF IMMUNOLOGICAL METHODS] , 2005年，第 305巻，第 2号， ρ· 135- 151 非特許文献 6 : Xiong， A.S., Yao， Q.H. , Peng, R.H., Han, P丄.， Cheng, Z.M., Li, Y.， jOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGYJ , 2005年，第 98巻，第 2号， ρ·418_428 ^特許文 : Kalandadze, A., alleno, M., roncerrada,し， Strominger, J.L., Wuch erpfennig, .W.,「THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY] , 1996年，第 27 1巻，第 33号， .20156-20162 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] 上述したように、分泌タンパク質や膜タンパク質の生産効率を現在よりもさらに向上 させることは極めて重要な課題である。
[0020] そこで、本発明は、例えば、従来用いられてきた分泌シグナルペプチドよりも分泌 効率が高い分泌シグナルペプチドを同定し、提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0021] 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、サッカロミセス'セレピシェの α 1 因子由来の分泌シグナルペプチドにおいて、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置 換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド力 天然型の α 1因子由来の分 泌シグナルペプチドと比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を少な くとも 3倍以上に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0022] 本発明は以下を包含する。
[0023] (1)以下の (a)又は (b)の分泌シグナルペプチド。
[0024] (a)配列番号 2記載のアミノ酸配列において、第 19番目のァラニン、第 20番目のァラ ニン、第 21番目のプロリン、第 22番目のバリン、第 23番目のァスパラギン及び第 24番 目のトレォニンから成る群より選択される少なくとも 1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置 換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド
(b)上記 (a)の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において、上記第 19番目〜第 24 番目のアミノ酸以外の位置で、 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたァ ミノ酸配列から成り、且つ配列番号 2記載のアミノ酸配列から成る分泌シグナルぺプ チドと比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を 3倍以上向上させる、 分泌シグナルペプチド
(2)上記第 19番目のァラニンが他のアミノ酸に置換されて!/、ることを特徴とする、 (1 )記載の分泌シグナルペプチド。
[0025] (3)上記第 19番目のァラニン力 Sパリンに置換されていることを特徴とする、（1 )又は（ 2)記載の分泌シグナルペプチド。
[0026] (4)上記第 20番目のァラニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、 (1 )記載の分泌シグナルペプチド。
[0027] (5)上記第 20番目のァラニンがトレオニンに置換されていることを特徴とする、 (1) 又は（4)記載の分泌シグナルペプチド。
[0028] (6)上記第 21番目のプロリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、 (1) 記載の分泌シグナルぺプチド。
[0029] (7)上記第 21番目のプロリンがロイシンに置換されていることを特徴とする、（1)又 は（6)記載の分泌シグナルペプチド。
[0030] (8)上記第 22番目のパリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、 (1) 記載の分泌シグナルぺプチド。
[0031] (9)上記第 22番目のバリンがフエ二ルァラニン又はァラニンに置換されて!/、ることを 特徴とする、（1)又は（8)記載の分泌シグナルペプチド。
[0032] (10)上記第 23番目のァスパラギンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とす る、（ 1 )記載の分泌シグナルペプチド。
[0033] (11)上記第 23番目のァスパラギンがチロシンに置換されていることを特徴とする、 (
1)又は（10)記載の分泌シグナルペプチド。
[0034] (12)上記第 24番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、
( 1 )記載の分泌シグナルペプチド。
[0035] (13)上記第 24番目のトレオニンがァラニンに置換されていることを特徴とする、 (1) 又は（12)記載の分泌シグナルペプチド。
[0036] (14) (1)〜（； 13)のいずれ力、 1記載の分泌シグナルペプチドをコードする DNA。
[0037] (15) (14)記載の DNAを含む DNA断片。
[0038] (16) (14)記載の DNAを含む組換えベクター。
[0039] (17) (1)〜（； 13)のいずれ力、 1記載の分泌シグナルペプチドと外来タンパク質とを 連結した融合タンパク質。
[0040] (18)上記分泌シグナルペプチドの C末端側に上記外来タンパク質が連結されて!/ヽ ることを特徴とする、（17)記載の融合タンパク質。
[0041] (19) (17)又は（18)記載の融合タンパク質をコードする DNA。
[0042] (20) (19)記載の DNAを含む DNA断片。 [0043] (21) (19)記載の DNAを含む組換えベクター。
[0044] (22) (20)記載の DNA断片又は（21)記載の組換えベクターを有する形質転換体
〇
[0045] (23)宿主が酵母であることを特徴とする、（22)記載の形質転換体。
[0046] (24)上記酵母がサッカロミセス.セレビシェであることを特徴とする、（23)記載の形 質転換体。
[0047] (25) (22)〜（24)のいずれ力、 1記載の形質転換体を培養し、上記外来タンパク質 を分泌発現又は膜に発現させることを特徴とする、タンパク質生産方法。
発明の効果
[0048] 本発明によれば、サッカロミセス.セレビシェを始めとする種々の生物種の細胞等を 宿主とした場合における、連結したタンパク質の高!/、分泌効率を示す分泌シグナル ペプチドが提供される。本発明に従えば、タンパク質の分泌生産性が向上し、産業 上、又は研究用試料としてのタンパク質の供給手段が大きく改善される。
[0049] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-249721号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0050] [図 1]図 1は、各変異体及び野生型の培養上清におけるルシフェラーゼ (CLuc)につ
V、ての相対発光強度を示す。
[図 2]図 2は、各変異体及び野生型の培養上清におけるルシフェラーゼ (CLuc)につ
V、ての菌体量 (OD600)当たりの発光値 (相対値)を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0051] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0052] 本発明に係る分泌シグナルペプチドは、サッカロミセス'セレピシェの α 1因子由来 の分泌シグナルペプチドの変異体である。具体的には、以下の (a)又は (b)の分泌シグ ナルペプチドである。
[0053] (a)配列番号 2記載のアミノ酸配列において、第 19番目のァラニン、第 20番目のァラ ニン、第 21番目のプロリン、第 22番目のバリン、第 23番目のァスパラギン及び第 24番 目のトレォニンから成る群より選択される少なくとも 1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置 換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド；
(b)上記 (a)の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において、上記第 19番目〜第 24 番目のアミノ酸以外の位置で、 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたァ ミノ酸配列から成り、且つ配列番号 2記載のアミノ酸配列から成る分泌シグナルぺプ チドと比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を 3倍以上向上させる、 分泌シグナルペプチド。
[0054] 配列番号 2に示されるアミノ酸配列から成るペプチドは、サッカロミセス'セレピシェ の α 1因子由来の分泌シグナルペプチドである。配列番号 2に示されるアミノ酸配列 において、第 1番目から第 19番目のアミノ酸配列がプレ配列であり、一方、第 20番目 力、ら第 89番目のアミノ酸配列がプロ配列である。また、配列番号 1に示される塩基配 列は、サッカロミセス'セレピシェの α 1因子由来の分泌シグナルペプチドをコードす る遺伝子 (cDNA)である。
[0055] 上記 (a)記載の分泌シグナルペプチドは、 a 1因子由来分泌シグナルペプチド (配列 番号 2記載のアミノ酸配歹 IJ)において、第 19番目のァラニン、第 20番目のァラニン、第 21番目のプロリン、第 22番目のバリン、第 23番目のァスパラギン及び第 24番目のトレ ォニンから成る群より選択される少なくとも 1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された アミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチドである。このアミノ酸置換により、酵母等 の宿主において、野生型 α 1因子由来分泌シグナルペプチド (即ち、配列番号 2記載 のアミノ酸配列から成るペプチド)と比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌 生産量を 3倍以上 (例えば、 3〜20倍、好ましくは 5〜20倍)向上させること力 Sできる。或 いは、このアミノ酸置換により、酵母等の宿主において、野生型 α 1因子由来分泌シ グナルペプチド (即ち、配列番号 2記載のアミノ酸配列から成るペプチド)と比較して、 C末端側に連結したタンパク質の膜 (細胞膜、小胞体膜等)への局在を向上させること ができる。
[0056] なお、上述したアミノ酸位置での置換は、単独であっても、或いは 2以上を組合わせ てもよい。
[0057] ここで、他のアミノ酸とは、上述した各位置の野生型 α 1因子由来分泌シグナルぺ プチドの特定のアミノ酸以外の!/、ずれのアミノ酸であってよ!/、が、各位置にお!/、ては 、下記のアミノ酸に置換されることが好ましい。
[0058] (1)第 19番目のァラニン：バリン、ロイシン又はイソロイシンへの置換
(2)第 20番目のァラニン：トレオニン又はセリンへの置換
(3)第 21番目のプロリン：ロイシン、ノ リン又はイソロイシンへの置換
(4)第 22番目のバリン：フエ二ルァラニン又はァラニンへの置換
(5)第 23番目のァスパラギン：チロシン又はフエ二ルァラニンへの置換
(6)第 24番目のトレオニン：ァラニン又はパリンへの置換
[0059] 一方、上記 (b)記載の分泌シグナルペプチドは、（a)記載の分泌シグナルペプチドに おいて、上記第 19番目〜第 24番目のアミノ酸以外の位置で、さらに 1又は数個 (例え ば、 1〜10個、好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は 付加されたアミノ酸配列から成り、且つ野生型 α 1因子由来分泌シグナルペプチドと 比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を 3倍以上向上させることが できるものである。第 19番目〜第 24番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第 1 8番目や第 25番目のアミノ酸が挙げられる。
[0060] さらに、本発明に係る分泌シグナルペプチドには、上記 (a)記載の分泌シグナルぺ プチドの第 19番目〜第 24番目のアミノ酸の位置における所定のアミノ酸置換を保持 し、上記 (a)記載の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列と少なくとも 70%以上、 80% 以上、 90%以上、好ましくは 95%以上のアミノ酸配列同一性を有し、且つ野生型 α 1 因子由来分泌シグナルペプチドと比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌 生産量を 3倍以上向上させることができるペプチドも含まれる。
[0061] 本発明に係る分泌シグナルペプチドは、外来タンパク質と連結された融合タンパク 質とすること力 Sできる。ここで、外来タンパク質とは、本発明に係る分泌シグナルぺプ チドに対して外因的なタンパク質を意味する。当該外来タンパク質には、ペプチドも ρ¾よれ 。
[0062] ここで、外来タンパク質としては、特に限定されるものではなぐ天然に存在する分 泌タンパク質、膜タンパク質、又は他の非分泌性タンパク質のいずれであってもよい 。ただし、非分泌性タンパク質を分泌シグナルペプチドと連結した場合にお!/、ては、 分泌が全く見られないケースも多い。そこで、本発明においては、非分泌性タンパク 質の中でも分泌が達成されるタンパク質を外来タンパク質とする。なお、分泌タンパク 質又は膜タンパク質を連結する場合には、当該タンパク質が天然に有する分泌シグ ナルペプチドを除!/、た成熟タンパク質を本発明に係る分泌シグナルペプチドに連結 することが好ましい。例えば、分泌タンパク質又は膜タンパク質の分泌シグナルぺプ チド部分は、成熟タンパク質を N末端アミノ酸分析に供することによって、 cDNAの塩 基配列から得られる推定アミノ酸配列とこれを比較して知ることができる。或いは、 Sig nalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/及び Nielsen H.り， (1997) Protein Engineering, 10: 1-6)等のシグナルペプチド予測プログラムによって推定することも可 能である。
[0063] 外来タンパク質の例としては、タンパク質又はペプチドの各種ホルモン (インシュリン 等)、エリスロポエチン、サイト力イン (インターフェロン等)、各種酵素 (インベルターゼ、 アミラーゼ等)が挙げられる。或いは、近年のゲノムの大規模解析により発見された、 機能が未知であるタンパク質も対象とすることができる。
[0064] 本発明に係る分泌シグナルペプチドに対して外来タンパク質を連結する位置は、 本発明に係る分泌シグナルペプチドと外来タンパク質とがそれぞれの機能又は活性 を有するように適宜選択することができる力 本発明に係る分泌シグナルペプチドの C末端側に外来タンパク質が連結されることが好ましい。
[0065] 本発明に係る DNAは、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードする DNA又は 上述の融合タンパク質をコードする DNA (以下、「本発明に係る融合タンパク質をコー ドする DNA」という)である。特に、本発明に係る融合タンパク質をコードする DNAを含 む DNA断片又は組換えベクターを宿主に導入することで、融合タンパク質中の外来 タンパク質を分泌発現又は膜に発現させることができる。また、本発明に係る分泌シ グナルペプチドをコードする DNAを発現ベクター (プロモーター等を有し、タンパク質 生産を主目的に用いられるベクター)に予め組み込むことにより、外来タンパク質生産 のためのプラスミド構築を容易にすることが可能である。
[0066] 以下では、本発明に係る融合タンパク質をコードする DNA、又はそれを含む DNA断 片若しくは組換えベクターの作製を説明する。
[0067] 先ず、本発明に係る融合タンパク質をコードする DNAの作製では、本発明に係る分 泌シグナルペプチドをコードする DNAと外来タンパク質をコードする DNAとを準備す る。本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードする DNAの準備では、例えばサッカ 口ミセス'セレピシェのゲノム DNAを铸型として、 α 1因子由来分泌シグナルペプチド をコードする領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用いた PCRによって、 野生型 α 1因子由来分泌シグナルペプチドコード領域を増幅する。次いで、増幅さ せた PCR産物に対して、公知の変異導入法 (例えば Kunkel法や変異導入を目的とし た合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた PCR)によって、本発明に係る分泌 シグナルペプチドをコードする DNAを作製できる。或いは、本発明に係る分泌シグナ ルペプチドをコードする DNAを化学合成することも可能である。
[0068] 一方、所望の外来タンパク質をコードする DNAは、外来タンパク質が由来する生物 のゲノム DNA、 cD氣 mRNA等を铸型として、該外来タンパク質コード領域の両端の 塩基配列に相補的なプライマーを用いた PCRによって増幅することで得ることができ る。或いは、外来タンパク質をコードする DNAが既にクローン化されている場合には、 例えば、該 DNAを含むベクターより、制限酵素でベクターから切り出すことで得ること 力できる。或いは、外来タンパク質をコードする DNAを化学合成することもできる。
[0069] 本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードする DNAと外来タンパク質をコードす る DNAとの連結においては、コドンのフレームが合うように連結させる。本発明に係る 分泌シグナルペプチドをコードする DNAと外来タンパク質をコードする DNAとの連結 の際の位置関係は、上述したように、発現される融合タンパク質が機能するように適 宜選択することができる力 本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードする DNAの 3'末端側に外来タンパク質をコードする DNAが機能的に連結されることが好ましい。 連結手段としては、酵素 (DNAリガーゼ）の反応によるものが一般的である。或いは、 既に連結された状態の配列を有する二本鎖 DNAを化学合成してもよい。
[0070] 本発明に係る組換えベクターは、適当なベクターに本発明に係る融合タンパク質を コードする DNAを揷入することにより得ること力 Sできる。使用するベクターは、宿主中 で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、へ ノレパープラスミド等が挙げられる。シャトルベクターを用いた場合には、例えば該べク ターに大腸菌（Escherichia coli)で該ベクターが自立的に複製可能ならしめる DNA配 歹 IJを含めることにより、タンパク質発現に利用する宿主と大腸菌との双方で細胞内に 保持され、複製されるようにすること力 Sできる。また該ベクター自体に複製能がない場 合には、宿主の染色体に揷入すること等によって複製可能となる DNA断片であって あよい。
[0071] 本発明に係る組換えベクターでは、宿主において転写開始活性を有するプロモー ターが本発明に係る融合タンパク質をコードする DNAの 5'末端側に機能的に連結さ れていること力 S好ましい。即ち、本発明に係る組換えベクターには、宿主に適したプロ モーターが本発明に係る融合タンパク質をコードする DNAの 5'末端側に機能的に連 結されるように揷入されていることが好ましい。プロモーターとしては、誘導性であって も非誘導性 (構成的)であってもよい。タンパク質の分泌生産性という観点より、用いる 宿主において転写開始活性が強力であると認知されているもの、例えば、サッカロミ セス 'セレビシェ解糖系の酵素をコードする遺伝子由来のプロモーターが望ましい。 例えば、そのようなプロモーターとしては、 TDH3 (グリセロアノレデヒド三リン酸デヒドロ ゲナーゼ)遺伝子由来のプロモーター等が挙げられる。
[0072] 或いは、本発明に係る組換えベクターの作製では、プロモーター、本発明に係る分 泌シグナルペプチドをコードする DNA及び外来タンパク質をコードする DNAをそれぞ れ別々に揷入し、連結することにより構築することもできる。
[0073] 一方、本発明に係る DNA断片では、上述の本発明に係る組換えベクターの作製に 準じて、宿主にぉレ、て転写開始活性を有するプロモーターが本発明に係る融合タン ノ ク質をコードする DNAの 5'末端側に機能的に連結されていることが好ましい。
[0074] なお、上述した本発明に係る組換えベクター又は DNA断片の作製に準じて、例え ば、外来タンパク質生産用 DNA断片又は組換えベクターとして、本発明に係る分泌 シグナルぺプチドをコ一ドする DNAを含む DNA断片又は組換えベクターを作製する こともできる。次いで、分泌発現又は膜発現対象の外来タンパク質をコードする DNA を当該 DNA断片又は組換えベクターに適宜揷入する。
[0075] さらに、本発明に係る融合タンパク質をコードする DNAを含む本発明に係る DNA断 片又は組換えベクター (以下、「本発明に係る組換えベクター等」という)を宿主中に導 入することにより形質転換体を作製する。宿主としては、特に限定されるものではない 1、例えば各種酵母を含む真性菌類及び動物細胞が挙げられる。酵母としては、い ずれの酵母であってもよいが、例えば、サッカロミセス 'セレビシェ、シゾサッカロミセ ス 'ボンべ (Shizosaccharomyces pombe)、ピキア'パストリス、カンジダ'アルビカンス（C andida albicans)、ハンセヌラ.ポリモルファ（Hansenula polymorpha)が挙げられ、形質 転換法や遺伝子操作技術が確立されているという観点から、特にサッカロミセス ·セレ ピシェが好ましい。また、サッカロミセス.セレピシェの α 1因子由来分泌シグナルぺ プチドは、サッカロミセス 'セレビシェ以外の異種の酵母でも機能できることが確認さ れている (非特許文献 7)。その他の菌類としては、ァスペルギルス（Aspergillus)属、ぺ ニシリウム (Penicillium)属、トリコテノレマ (Trichoderma)属、リゾプス (Rh izopus)j¾、ムコ ール (Mucor)属等が挙げられる。
[0076] 宿主への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、宿主に DNAを導入する 方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法（エレクト口ポレーシヨン法）、スフ エロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、 Yip系等のベクター或いは染色 体への置換'揷入等の酵母等の形質転換法であってもよい。さらに酵母等を含む真 性菌類又は動物細胞への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、一般的学 術書や学術論文等に記載されてレ、るレ、かなる方法によってもよ!/、。
[0077] また、プロモーターと本発明に係る融合タンパク質をコードする遺伝子とが連結され た本発明に係る DNA断片を、その両端に宿主染色体 DNA配列と相同性を有する DN Aを付加することで、ベクターを用いずに、宿主が本来有する相同組換え機能により 、宿主細胞の染色体 DNAに組み込むことも可能である。該 DNA断片の宿主の導入は 、上述の本発明に係る組換えベクター等の導入方法に準じて行うことができる。
[0078] 本発明に係る組換えベクター等が宿主に組み込まれたか否かの確認は、 PCR法、 サザンハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法等により行うこと ができる。例えば、形質転換体から DNAを調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCRを行う。その後は、増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、キヤピラリー電気泳動等を行い、臭化工チジゥム、 SYBR (登録商標） Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転 換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて P CRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増 幅産物を結合させ、蛍光、酵素反応等により増幅産物を確認する方法を採用しても よい。
[0079] 次!/、で、得られた形質転換体を生育可能な条件下で培養する。 V、ずれの場合にお V、ても、形質転換体の培養条件は宿主の特性及び所望の外来タンパク質の安定性 等を考慮して設定されることが望ましい。例えば、本実施例に示すように、出芽酵母 サッカロミセス'セレビシェを宿主としてゥミホタル由来ルシフェラーゼ (外来タンパク質 に相当する)を分泌発現させる場合には、酵母が生育し且つルシフェラーゼが失活し ないように、培養温度は、例えば 4〜37°C、好ましくは 20〜30°Cに設定する。また培地 の pHは、例えば 3·5〜6·5、好ましくは 5·5〜6·0に設定すればよい。培養時間は、例え ば 1〜120時間、好ましくは対数増殖期である 1〜24時間である。
[0080] 外来タンパク質が分泌タンパク質となる場合には、外来タンパク質の分泌生産量の 評価は、該外来タンパク質の生産量を特異的に測定できる限り、いかなる方法によつ てもよく、例えば、培養液を遠心分離に供することで得られた培養上清について、該 外来タンパク質の有する酵素活性、生理活性等を指標として測定可能である。また、 対象の外来タンパク質に特異的な抗体を利用したウェスタンプロット法、 ELISA等の 一般的な免疫学的手法によって、外来タンパク質の分泌生産量を測定することがで きる。或いは、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを使った方法であってもよい。
[0081] 一方、外来タンパク質が膜タンパク質となる場合には、形質転換体を分離した後、 膜画分を分離することで、上述した分泌タンパク質の分泌生産量の測定方法に準じ て細胞膜等の膜への局在量を測定することができる。或いは、形質転換体をそのま ま、外来タンパク質に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー等に供することで、 細胞膜への局在量を測定してもよレ、。
[0082] このようにして、分泌生産された所望の外来タンパク質は、培養上清から通常のタ ンパク質精製法、例えば硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマト グラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ァフィニテ ィークロマトグラフィー、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等によって 精製すること力 Sでさる。 [0083] 以上に説明したように、本発明に係る分泌シグナルペプチドによれば、宿主におい て外来タンパク質を効率的に分泌生産することができる。本発明に係る分泌シグナル ペプチドを使用したタンパク質発現系は、分泌タンパク質発現系である。分泌タンパ ク質発現系は、細胞内に所望のタンパク質を蓄積させる発現系よりも、初発粗試料、 即ち培養液中に所望のタンパク質以外の夾雑物が少なぐ精製が比較的容易である という利点を有する。
実施例
[0084] 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する力 本発明の技術的範囲はこ れら実施例に限定されるものではない。
[0085] 本実施例では、本発明に係る分泌シグナルペプチドの改良された分泌機能により 分泌される外来タンパク質として、ゥミホタル (シプリディナ'ノクティル力 (Cypridina noc tiluca》由来のルシフェラーゼ (以下、「CLuc」と称する)を用いた。
[0086] 一方、宿主としては、サッカロミセス.セレビシェを用いた。
[0087] 発現プラスミド pCLuRA- TDH3は、サッカロミセス'セレピシェにおいて、 CLucを分 泌発現させる発現ベクターであり、国際公開第 2006/132350号パンフレット (国際出願 PCT/JP2006/311597号；日本国特許出願 2005-169768号を優先権の基礎とする)に 開示されている。
[0088] このプラスミド pCLuRA-TDH3は、野生型 α 1因子由来分泌シグナルペプチド (ァミノ 酸配列：配列番号 2)と CLucの成熟タンパク質（配列番号 3に示す CLucのアミノ酸配 列において、 1-18番目のアミノ酸配列 (CLucの分泌シグナルペプチドに相当する配 歹 IJ)を除いたアミノ酸配列）との融合タンパク質をコードする遺伝子（以下、「a CLuc遺 伝子」という)を含んでいる。
[0089] さらにプラスミド pCLuRA_TDH3には、 a CLuc遺伝子の上流 (5'側)に、サッカロミセ ス.セレピシェの TDH3(系統的遺伝子名： YGR192C)遺伝子のプロモーターが作動可 能に組み込まれている。よって、このプロモーターが作動することで、 a CLuc遺伝子 が発現され、 α 1因子由来分泌シグナルペプチドの機能によって CLucが細胞外に分 泌、されることとなる。
[0090] また、プラスミド pCLuRA-TDH3には、大腸菌において機能するプラスミド複製に必 要な DNA配列及びアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。従って、このプラスミドは、 サッカロミセス 'セレビシェ及び大腸菌の双方で複製され、保持されるシャトルベクタ 一である。
[0091] 配列番号 4に示す塩基配列は、プラスミド pCLuRA-TDH3の部分塩基配列であり、 TDH3遺伝子のプロモーター、 a CLuc遺伝子及びそれらの 5'側と 3'側の塩基配列を 示している。
[0092] 〔実施例 1〕変異型 α 1因子由来分泌シグナルペプチド (本発明に係る分泌シグナル ペプチドに相当)を用いた CLucの分泌発現
1-1.変異型 α 1因子由来分泌シグナルペプチド遺伝子ライブラリーの構築 プラスミド pCLuRA-TDH3において、 α 1因子由来分泌シグナルペプチドをコードす る領域 (配列番号 4に示す塩基配列において第 701番目から第 955番目の塩基の間 に相当する領域)をターゲットとして、 Error Prone PCR (誤りがち PCR)を施した。この Er ror Prone PCRでは、以下のオリゴ DNAプライマーを使用した。
[0093] sgl-f: CACCAAGAACTTAGTTTCGAGGG (酉己歹 IJ番号 5) この Error Prone PCRの反応液の組成は以下の通りであった： Taq DNA polymerase (Roche社、 5 unit/ μ 1) 1 μ \; lOxPCR Duffer without magnesium ion 10 μ 1; Error Pron e PCR用デォキシヌクレオチド混合溶液 10 μ 1; 25mM塩化マグネシウム 28 μ 1; 5mM塩 化マンガン 5.0 1；プラスミド pCLuRA-TDH3溶液 (15θΓ¾/ 1) 1 ^ 1; sgl-i (配列番号 5 XlOpmol/ a 1)3 μ 1; sg2_r (配列番号 6)(10pmol/〃 1) 3 1;滅菌水 39 μ 1。
[0094] なお、上述の Error Prone PCR用デォキシヌクレオチド混合溶液の組成は以下の通 りであった： lOOmM dCTP 100 μ 1; lOOmM dTTP 100 μ 1; lOOmM dGTP 20 μ 1; 100m M dATP 20 a 1;滅菌水 760 μ 1。
[0095] Error Prone PCRは、 94°Cで 1分 (変性)、 45°Cで 1分 (アニーリング)及び 72°Cで 1分（ 伸長)のサイクルを 30サイクルで行った。なお、この Error Prone PCRによって得られる DNA断片は、配列番号 4に示す塩基配列にお!/、て第 678番目から第 990番目の塩基 の間の領域に相当する。
[0096] 次!/、で、 Error Prone PCRによって得られた PCR反応溶液全量を 1%ァガロースで 電気泳動した結果、約 300bpの DNA断片を確認した。この DNA断片を、シグマ社 Gen Elute™ MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、 10〃 1の TE緩衝液 ( 10mM Tris- HC1 ImM EDTA, ρΗ8· 0)に溶解させ、「DNA溶液 Α」とした。「DNA溶液 Ajには Error Prone PCRによりランダム点突然変異が導入された DNA分子が含まれ
[0097] また、配列番号 4に示す塩基配列において第 460番目から第 700番目の塩基の間 の領域を PCRにて増幅した。この PCRでは、以下のオリゴ DNAプライマーを使用した
[0098] SQ-GPD 1-F0: CATGTATCTATCTCATTTTCTTAC (酉己歹 IJ番号 7) この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase (東洋 紡績） 0.4 μ 1; 10x KOD plus buffer 2 μ \; 2mM each dNTP mixture 2 μ \; 25mM硫酸 マグネシウム 0.8 1； SQ-GPD 1-F0 (配列番号 7)(10 0101/ 1) 0.6 1； sgl_r (配列番 号 8) ( 10pmol/ 1) 0.6 1;プラスミド pCLuRA_TDH3溶液 (lng/ 1) 1 μ 1;滅菌水 12.6
[0099] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 50°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 1分 (伸長)のサイクルを 30サイクルで行つ た。この PCRによって得られた PCR反応溶液全量を 1 %ァガロースで電気泳動した結 果、約 250bpの DNA断片を確認した。この DNA断片を、シグマ社 GenElute™ MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、 10〃 1の TE緩衝液に溶解させ、「D NA溶液B」とした。
[0100] さらに、配列番号 4に示す塩基配列において第 968番目から第 1663番目の塩基の 間の領域を PCRにて増幅した。この PCRでは以下のオリゴ DNAプライマーを使用した
[0101] sg2-f: CAGGACTGTCCTTACGAACCTGA (酉己歹 IJ番号 9)
SQ-CLuc-CRl : TGGACAACCGTCAAACTCCTGGTTGATCTT (酉己歹 IJ番号 10) この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase 0.4 ^ 1 ； 10x KOD plus buffer 2 μ \; 2mM each dNTP mixture 2 μ \; 25mM硫酸マグネシウム 0.8 a 1; sg2-f (配列番号 9)(10pmol/ μ 1) 0.6 μ 1; SQ-CLuc-CRl (配列番号 10) (lOpmo 1/ a 1) 0.6 a 1;プラスミド pCLuRA-TDH3溶 ί夜 (lng/ ^ 1) 1 ^ 1;滅菌水 12.6 μ 1。
[0102] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 50°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 1分 (伸長)のサイクルを 30サイクルで行つ た。この PCRによって得られた PCR反応溶液全量を 1 %ァガロースで電気泳動した結 果、約 700bpの DNA断片を確認した。この DNA断片を、シグマ社 GenElute™ MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、 10〃 1の TE緩衝液に溶解させ、「D NA溶 ί夜 C」とした。
[0103] 次いで、得られた DNA溶液 A、 DNA溶液 B及び DNA溶液 Cの混合物を铸型として、 PCRを行った。この PCRによって得られる DNA断片は、配列番号 4に示す塩基配列に おいて第 460番目力も第 1663番目の塩基の間の領域に相当する。し力、しながら、 Erro r Prone PCRによって得られた DNA溶液 Aを铸型の一部として使用しているので、 α 1 因子由来分泌シグナルペプチドをコードする領域に、点突然変異が導入された DNA 分子が含まれる。
[0104] この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase 1 μ 1;
10χ KOD plus buffer 5 ^ 1; 2mM each dNTP mixture 5 ^ 1; 25mM硫酸マグネシウム 2 μ ΐ; SQ-GPD1-F0 (配列番号 7)(10 0101/ 1) 1.5 1; SQ-CLuc-CRl (配列番号 10) ( lOpmol/ 1) 1.5 1; DNA溶液 A 3 μ \; DNA溶液 Β 1 μ 1; DNA溶液 C 1 μ 1;滅菌水 29
[0105] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 50°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 1分 20秒 (伸長)のサイクルを 30サイクルで 行った。この PCR反応によって得られた PCR反応溶液の一部を 1 %ァガロースで電気 泳動した結果、約 1.2kbpの DNA断片を確認した。残りの PCR反応溶液を、シグマ社 G enElute™ PCR Clean-Up Kitとエタノール沈殿で精製し、 50 1の TE緩衝液に溶解さ せ、「DNA溶 ί夜 D」とした。
[0106] 一方、プラスミド pCLuRA-TDH3の塩基配列のうち、配列番号 4に示す塩基配列に お!/、て第 526番目から第 1555番目の塩基の間の領域を欠!/、た領域を PCRにて増幅 した。この PCRでは以下のオリゴ DNAプライマーを使用した。 [0107] SQ-GPD1-R0: CAGCTTTTTCCAAATCAGAGAGAGCAG (酉己歹 lj番号 11) mut-CLuc-CFl: TCTCTGGCCTCTGTGGAGATCTTAAAATGA (配列番号 12) この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase 1 μ 1; 10x KOD plus buffer 5 ^ 1; 2mM each dNTP mixture 5 ^ 1; 25mM硫酸マグネシウム 2 μ ΐ; SQ-GPD1-R0 (配列番号 l lXlOpmol/ l) 1.5 1； mut-CLuc-CFl (配列番号 12 ) (lOpmol/ 1) 1.5 1;プラスミド pCLuRA_TDH3溶液 (lng/ ^ 1) 1 ^ 1;滅菌水 33 μ 1。
[0108] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 50°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 7分 (伸長)のサイクルを 30サイクルで行つ た。この PCR反応によって得られた PCR反応溶液の一部を 1%ァガロースで電気泳動 した結果、約 6.5kbpの DNA断片を確認した。残りの PCR反応溶液を、シグマ社 GenEl ute™ PCR Clean-Up Kitで精製し、エタノール沈殿を行った後、 50 1の TE緩衝液に 溶解させ、「DNA溶液 E」とした。
[0109] このようにして得られた DNA溶液 Dと DNA溶液 Eとにそれぞれ含まれる DNA断片は、 配列番号 4に示す塩基配列において第 460番目から第 525番目の塩基の間の配列及 び第 1556番目から第 1663番目の塩基の間の配列を共有して!/、る。
[0110] サッカロミセス 'セレビシェは、一般に細胞内で高い確率で相同組換えを起こす。そ こで、 DNA溶液 Dと DNA溶液 Eとを同時にサッカロミセス'セレピシェに導入すれば、 サッカロミセス ·セレビシェ内で環状 DNA( α 1因子由来分泌シグナルペプチドをコー ドする領域に点突然変異が導入された変異型プラスミド pCLuRA-TDH3)が相同組換 えにより再構成され、サッカロミセス 'セレビシェはこの再構成されたプラスミドで形質 転換され得る。
[0111] そこで、 DNA溶液 Dと DNA溶液 Eとの等量混合液を用いて、サッカロミセス'セレビシ ェ BY4743 A PRB 朱を形質転換した。形質転換は、 Zymo Research社の Frozen-EZ Yeast Transformation IIを用いて該製品のプロトコルに従って行った。
[0112] 1-2.変異型 α 1因子由来分泌シグナルペプチド遺伝子のスクリーニング
上記第 1-1節で形質転換されたサッカロミセス.セレビシェを、ゥラシルを含まない合 成寒天平板培地 (0.67% Yeast nitrogen base without amino acids (ベタトンディツキン ソン)、 40 μ g/mlアデニン、 20 μ g/ml L_アルギニン一塩酸塩、 100 μ g/ml L_ァスパラ ギン酸、 100 ^ g/ml L-グルタミン酸ナトリウム一水和物、 20 ^ g/ml L-ヒスチジン、 60 μ g/ml L-ロイシン、 30 μ g/ml L_リジン塩酸塩、 20 μ g/ml L_メチォニン、 50 μ g/ml L -フエ二ルァラニン、 375 a g/ml L-セリン、 200 μ g/ml L-トレオニン、 40 μ g/ml L-トリ プトファン、 30 ^ g/ml L-チロシン、 150 ^ g/ml L-バリン、 30 ^ g/ml L-イソロイシン、 2 %D-グルコース及び 2%寒天：以下では、単に「SD-ura寒天培地」という)に塗布し、 3 0°Cで 3日間培養し、形質転換体（以下では、単に「変異体」と称する）のコロニーを形 成させた。
[0113] 変異体の各コロニーを、コロニーピッカー装置を用い、合成液体培地（SD-ura寒天 培地から寒天を除き、最終濃度 200mMのリン酸カリウム緩衝液 (pH6.0)を加えたもの： 以下では、単に buffered SD-ura培地」という)が各ゥエルに 0.95mlずつ分注された 96 穴ディープゥエルプレート（各ゥエル 2ml容積）に接種した。ただし、 96穴のうち 6穴に は、対照として変異導入されて!/、な!/、プラスミド pCLuRA-TDH3で形質転換されたサ ッカロミセス.セレビシェ BY4743 Δ PRB 朱（以下では、単に「野生型」と称する）を接 種した。
[0114] 変異体及び野生型のサッカロミセス.セレピシェが接種されたディープゥエルプレー トを、 30°Cで 48時間、 1200rpmにて振盪培養した。その後、培養液を各ゥエル当たり 5 0〃 1ずつ、同じ培地が各ゥエルに 0.95mlずつ分注された 96穴ディープゥエルプレート (各ゥエル 2ml容積）に 96穴フォーマットそのままに移植した。次いで、移植された培養 液を含むディープゥヱルプレートを、 30°Cで 48時間、 1200rpmにて振盪培養した。
[0115] 培養後、ディープゥエルプレートを遠心分離し、各ゥエルにつき培養上清を 20 1ず つ 96穴フォーマットそのままに 96穴プレート (黒色)に移した。
[0116] 次いで、ベルトールド社 Centro LB 960を用いてそれぞれのゥエルに、ゥミホタルル シフェリン溶液（Ι Μゥミホタルルシフェリン、 lOOmM Tris-HCl, ρΗ7·5)を 80 1カロえ、 発光強度 (1秒積算)を測定した。
[0117] 結果の一例を図 1に示す。図 1は、各変異体及び野生型の培養上清におけるルシ フェラーゼ (CLuc)についての相対発光強度 (RLU)を示す。各バーは、 1つの変異体 又は野生型の結果である。右端の 6本のバーは野生型の相対発光強度を示し、その 他は変異体の相対発光強度を示して!/、る。 [0118] 図 1に示すような変異体の中から、野生型 6クローンが示す相対発光強度平均値の 3倍以上の相対発光強度を示した変異体を選択した。
[0119] 1-3.野生型の 3倍以上の相対発光強度を示す変異体におけるアミノ酸置換の特定 上記第 1-2節で選択した変異体からタカラバイオの「Genとるくん酵母用」を用いて プラスミドを含む DNAを抽出'精製した。
[0120] 次いで、抽出 ·精製した DNAを使用して、大腸菌 DH5 «株を形質転換した。形質転 換した大腸菌を、アンピシリンナトリウム (100 g/ml)を含む LB(10g/l NaCl, lOg/1 Bac to Trypton, 5g/l酵母エキス）寒天平板培地に塗抹し、コロニーを形成させた。
[0121] 形成したそれぞれの 1コロニーから常法によりプラスミドを抽出 '精製し、配列番号 4 における第 1番目から第 2700番目の塩基の間の塩基配列を調べた。その結果、以下 の変異体のアミノ酸置換を特定した (以下の記述において、例えば「G79A」とは、配 列番号 2に示すアミノ酸配列において、第 79番目のグリシン (G)がァラニン (A)に置換 されていることを表す。アミノ酸の一文字記号は国際純正'応用化学連合 (IUPAC)が 定める記号である）。
[0122] (1) A19V変異体 (以下、この変異体力も得られたプラスミドを「pCLuRA-TDH3[ a A19 ¥]」と称する）
(2) P21L/D43V/E45G変異体
(3) V22F変異体 (以下、この変異体から得られたプラスミドを「pCLuRA-TDH3[ a V22 F]」と称する）
(4) T24A変異体 (以下、この変異体力も得られたプラスミドを「pCLuRA-TDH3[ a T24 八]」と称する）
(5) A20T/I33V変異体
(6) V22A/T26T変異体 (ここで「T26T」とは、 26位のトレォニンをコードする塩基配列 につ!/、て、アミノ酸置換を伴わな!/、塩基置換があることを意味する）
(7) N23Y/L64W変異体
なお、プラスミド pCLuRA-TDH3[ a A19V]、 pCLuRA- TDH3[ a V22F]及び pCLuRA- TDH3[ a T24A]について、全塩基配列を調べた結果、表記のアミノ酸置換に対応す る塩基置換以外の変異が生じて!/、な!/、ことを確認した。 [0123] 1-4.プラスミド pCLuRA- TDH3[ a P21L]の作製
以下のようにして P21L単独アミノ酸置換変異プラスミド (以下、このプラスミドを「pCL uRA-TDH3[ a P21L]」と称する）を作製した。
[0124] 先ず、 PCRにより直鎖状の pCLuRA-TDH3[ a P21L]の DNA断片を作製した。作製 にあたり PCRに使用したオリゴ DNAプライマーは、以下のものであった。
[0125] P21L-for: CTAGTCAACACTACAACAGAAGATG (配列番号 13)
P21- rev: AGCAGCTAATGCGGAGGATGCT (配列番号 14)
プライマー P21L-forの 5'末端の「CTA」なる配列は、プロリンコドンをロイシンコドンに 置換する配列である。
[0126] この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase (東洋 紡績) 0.4 μ 1; 10x KOD plus buffer 2 μ \; 2mM each dNTP mixture 2 μ \; 25mM硫酸マ グネシゥム 0.8 1; P21L-for (配列番号 l SXlOpmol/ 1) 0.6〃 1; P21_rev (配列番号 1 4) (10pmol/ 1) 0.6 1;プラスミド pCLuRA_TDH3溶液 (lng/ 1) 1 μ 1;滅菌水 12.6 1
〇
[0127] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 50°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 8分 (伸長)のサイクルを 30サイクルで行つ た。この PCRによって得られた PCR反応溶液全量を 1 %ァガロースで電気泳動した結 果、約 7.5kbpの DNA断片を確認した。この DNA断片をシグマ社 GenElute™ MINUS E tBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した。
[0128] 次いで、得られた DNA断片の両 5'末端を T4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸 化した。これを DNA基質として T4 DNAリガーゼにより連結し、環状化させた。環状化 させた DNAについてエタノール沈殿を行った後、 50 1の TE緩衝液に溶解した。
[0129] さらに、この環状化された DNAを铸型として再度 PCRを行った。用いたプライマーは 、以下のものであった。
[0130] FAR-f: AACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCT (酉己歹 IJ番号 15)
mut-CLuc-R: AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGT (配列番号 16) この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase (東洋 紡績） 1 μ 1; 10x KOD plus buffer 5 ^ 1; 2mM each dNTP mixture 5 ^ 1; 25mM硫酸マ グネシゥム 2 1； FAR-f (配列番号 Ι δΧΐΟρπιοΙ/ ^ Ι) 1.5 1； mut-CLuc-R (配列番号 1 Q) ( l0pmo\/ μ \) 1.5 μ \;上記環状化 DNA溶液 1 1;滅菌水 33 1。
[0131] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 50°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 3分 (伸長)のサイクルを 30サイクルで行つ た。
[0132] この PCRによって得られる DNA断片は、配列番号 4に示す塩基配列において第 1番 目から第 2663番目の塩基の間の領域である。
[0133] 次いで、この PCRによって得られた PCR反応溶液の一部を 1 %ァガロースで電気泳 動した結果、約 2.5kbpの DNA断片を確認した。残りの PCR反応溶液を、シグマ社 Gen Elute™ PCR Clean-Up Kitとエタノール沈殿で精製した。
[0134] 精製後の DNA断片を、制限酵素 BamHI (配列番号 4に示す塩基配列において第 40 番目の塩基から始まる 6塩基が認識サイト）と Xbal (配列番号 4に示す塩基配列におい て第 2576番目の塩基から始まる 6塩基が認識サイト）とで二重消化した後、全量を 1 % ァガロースで電気泳動した。電気泳動後、約 2.5kbpの DNA断片を、シグマ社 GenElut e™ MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、 TE緩衝液に溶解させ 、「DNA溶 ί夜 F」とした。
[0135] 一方、プラスミド pCLuRA-TDH3を、同様に、制限酵素 BamHIと Xbalとで二重消化し た後、全量を 1 %ァガロースで電気泳動した。電気泳動後、約 5kbpの DNA断片を、シ グマ社 GenElute™ MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、 TE緩 衝液に溶解させ、「DNA溶液 G」とした。
[0136] 次!/、で、 DNA溶液 Fと DNA溶液 Gとを等量混合し、 T4 DNAリガーゼにより連結した。
この反応溶液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換した。形質転換した大腸菌をアン ピシリンナトリウム (100 g/ml)を含む LB寒天平板培地に塗抹し、コロニーを形成させ た。
[0137] 形成した 1コロニーから常法によりプラスミドを抽出 ·精製し、全塩基配列を調べた結 果、 目的とする P21L置換に対応する塩基置換が生じていること、及び他の変異が生 じていないことを確認した。
[0138] このようにして、 pCLuRA- TDH3[ a P21L]を作製した。 [0139] 1-5.プラスミド pCLuRA- TDH3[ a A20T]の作製
以下のようにして A20T単独アミノ酸置換変異プラスミド (以下、このプラスミドを「pCL uRA-TDH3[ a A20T]」と称する)を作製した。
[0140] 先ず、 PCRにより直鎖状の pCLuRA-TDH3[ a A20T]の DNA断片を作製した。作製 にあたり PCRに使用したオリゴ DNAプライマーは、以下のものであった。
[0141] A20T— c: ACTCCAGTCAACACTACAACAGA (酉己歹 IJ番号 17)
A20-rev: AGCTAATGCGGAGGATGCTGCG (配列番号 18)
プライマー A20T-Cの 5'末端の「ACT」なる配列は、ァラニンコドンをトレオニンコドン に置換する配列である。
[0142] この PCRの反応液の組成は以下の通りであった： KOD plus DNA polymerase (東洋 紡績) 0.4 μ 1; 10x KOD plus buffer 2 μ \; 2mM each dNTP mixture 2 μ \; 25mM硫酸マ グネシゥム 0.8 1; A20T-C (配列番号 17)(10 0101/ 1) 0.6 1; A20_rev (配列番号 18) (lOpmol/ 1) 0.6 1;プラスミド pCLuRA_TDH3溶液 (lng/ 1) 1 μ 1;滅菌水 12.6 1。
[0143] PCRは、 94°Cで 2分 (抗ポリメラーゼ抗体の失活)を 1サイクル、並びに 94°Cで 15秒 (変 性)、 48°Cで 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 8分 (伸長)のサイクルを 30サイクルで行つ た。この PCRによって得られた PCR反応溶液全量を 1 %ァガロースで電気泳動した結 果、約 7.5kbpの DNA断片を確認した。この DNA断片をシグマ社 GenElute™ MINUS E tBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した。
[0144] 次いで、得られた DNA断片の両 5'末端を T4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸 化した。これを DNA基質として T4 DNAリガーゼにより連結し、環状化させた。この反 応溶液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリ ンナトリウム (100 g/ml)を含む LB寒天平板培地に塗抹し、コロニーを形成させた。
[0145] 形成した 1コロニーから常法によりプラスミドを抽出 ·精製し、全塩基配列を調べた結 果、 目的とする A20T置換に対応する塩基置換が生じていること、及び他の変異が生 じていないことを確認した。
[0146] このようにして、 pCLuRA- TDH3[ a A20T]を作製した。
[0147] 1-6.プラスミド pCLuRA_TDH3[ a V22A]及び pCLuRA_TDH3[ a N23Y]の作製
上記第 1-5節のプラスミド pCLuRA-TDH3[ a A20T]の作製方法に準じて、 V22A単 独アミノ酸置換変異プラスミド (以下、このプラスミドを「pCLuRA-TDH3[ a V22A]」と称 する)及び N23Y単独アミノ酸置換変異プラスミド (以下、このプラスミドを「pCLuRA-TD Η3[ α Ν23Υ]」と称する)を作製した。ただし、 PCRで用いたプライマーは、 pCLuRA- Τ DH3[ a V22A]につ!/、ては以下のものであった。
[0148] V22A: GCTAACACTACAACAGAAGATGAAA (配列番号 19)
V22- rev- c: TGGAGCAGCTAATGCGGAGGAT (配列番号 20)
一方、 pCLuRA-TDH3[ a N23Y]について PCRで用いたプライマーは以下のもので あった。
[0149] N23Y: TACACTACAACAGAAGATGAAACGG (配列番号 21 )
N23- rev- c: GACTGGAGCAGCTAATGCGGAG (配列番号 22)
それぞれのプラスミドについて、全塩基配列を調べた結果、 目的とするアミノ酸置換 に対応する塩基置換が生じて!/、ること、及び他の変異が生じて!/、な!/、ことを確認した
〇
[0150] このようにして、 pCLuRA-TDH3[ a V22A]及び pCLuRA-TDH3[ a N23Y]を得た。
[0151] 1-7.再現実験 (1)
プラスミド pCLuRA—TDH3、 pCLuRA— TDH3[ a A19V]、 pCLuRA— TDH3[ α P21L]、 p
CLuRA-TDH3[ a V22F]及び pCLuRA-TDH3[ a T24A]を用いて、それぞれサッカロミ セス ·セレビシェ BY4743 Δ PRB 朱を形質転換した。
[0152] 形質転換後、 SD-ura寒天培地上のコロニーをそれぞれ 3つずつ任意に選択して、 9
6穴ディープゥエルプレート（各ゥエル 2ml容積）の各穴 (ゥエル)に 0.95mlずつ分注され た buffered SD-ura培地にそれぞれ接種した。接種後のディープゥエルプレートを、 30
°Cで 48時間、 1200rpmにて振盪培養した。
[0153] 培養後、培養液を各ゥエル当たり 50 1ずつ、同じ培地が各ゥエルに 0.95mlずつ分 注された 96穴ディープゥエルプレート（各ゥエル 2ml容積）に 96穴フォーマットそのまま に移植した。
[0154] 次いで、移植された培養液を含むディープゥエルプレートを、 30°Cで 48時間、 1200r pmにて振盪培養した。
[0155] 培養後、各ゥエルの培養液から 100〃 1ずつを透明な 96穴プレートに移し、 600nmに おける吸光度 (即ち、菌体密度)を測定した (ブランクは buffered SD-ura培地)。さらに 、ディープゥエルプレートを遠心分離し、上記第 1-2節で説明した方法と同じ方法によ り培養上清中のルシフェラーゼ (CLuc)についての相対発光強度 (RLU)を測定した。 結果を以下の表 1に示す。
[表 1] 発光値
プラスミド 変異体 OD600 発光値 (相対値）
(相対値） /OD600
0.714 0.635 1.12 pCLuRA-TDH3 野生型 0.596 0.558 1.01
0.551 0.639 0.86
9.678 0.635 15.24 pCLuRA-TDH3 [aA19V] A19V 4.884 0.632 7.73
6.424 0.636 10.1
5.097 0.616 8.27 pCLuRA-TDH3 [aP21 L] P21 L 4.741 0.624 7.6
6.544 0.663 9.87
4.447 0.615 7.23 pCLuRA-TDH3 [aV22F] V22F 3.011 0.634 4.75
2.831 0.653 4.34
2.35 0.619 3.8 pCLuRA-TDH3 [aT24A] T24A 2.369 0.627 3.78
3.096 0.642 4.82
[0157] 表 1から明らかなように、野生型 (プラスミド pCLuRA-TDH3)と比較して、 A19V変異 体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a A19V])と P21L変異体 (プラスミド pCLuRA_TDH3[ a P 21L])では少なくとも 7倍、 V22F変異体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a V22F])では少な くとも 4倍、 T24A変異体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a T24A])では少なくとも 3.5倍の菌 体量 (OD600)当たりの発光値の増強、即ちルシフェラーゼタンパク質分泌量の増加 が観察された。
[0158] 1-8.再現実験 (2)
プラスミド pCLuRA-TDH3、 pCLuRA- TDH3[ a A19V]、 pCLuRA- TDH3[ a A20T]、 p CLuRA_TDH3[ a P21Lコ、 pCLuRA_TDH3[ a V22Aコ、 pCLuRA_TDH3[ a V22Fコ、 pCL uRA-TDH3[ a N23Y]及び pCLuRA_TDH3[ a T24A]を用いて、それぞれサッカロミセ ス.セレビシェ BY4743 Δ PRB 朱を形質転換した。 [0159] 形質転換後、 SD-ura寒天培地上のコロニーをかき取り、 1mlの buffered SD-ura培地 が予め分注されたディープゥエルプレートの各ゥエルに植菌した。各変異体 (形質転 換体)にっき、 6ゥエルづっ植菌した。植菌後のディープゥエルプレートを、 30°Cで 45 時間、 1200rpmにて振盪培養した。
[0160] 培養後、培養液を各ゥエル当たり 50 1ずつ、同じ培地が各ゥエルに 0.95mlずつ分 注された 96穴ディープゥエルプレートに 96穴フォーマットそのままに移植した。
[0161] 次いで、移植された培養液を含むディープゥエルプレートを、 30°Cで 23時間、 1200r pmにて振盪培養した。
[0162] 培養後、各ゥエルの培養液から 50 1ずつを透明な 96穴プレートに移し、 600nmに おける吸光度 (即ち、菌体密度)を測定した。さらに、ディープゥエルプレートを遠心分 離し、上記第 1-2節で説明した方法と同じ方法により培養上清中のルシフェラーゼ (C Luc)についての相対発光強度 (RLU)を測定した。ただし、分注するルシフェリンの濃 度は 5 とした。また、相対発光強度を菌体密度で除し、さらに野生型の値が 1にな るように正規化した。
[0163] 結果を、図 2及び以下の表 2に示す。図 2において、各バーは表記した各変異体又 は野生型の結果であり、横軸は菌体量 (OD600)当たりの発光値湘対値)を示す。な お、図 2及び表 2における結果は、上記において各変異体又は野生型が植菌された 後、移植された 6ゥエル (N=6)由来の各培養液からの平均値及び標準偏差である。
[表 2] 発光値
プラスミド 発光値 (相対値）
変異体 OD600 標準偏差
(相対値） /OD600 (N=6) pCLuRA-TDH3 野生型 0.321 0.321 1.00 0.11 pCLuRA-TDH3 [aA19V] A19V 5.709 0.293 19.52 0.52 pCLuRA-TDH3 [aA20T] A20T 2.024 0.296 6.85 0.26 pCLuRA-TDH3 [aP21 L] P21 L 5.827 0.290 20.12 1.72 pCLuRA-TDH3 [aV22F] V22F 2.445 0.291 8.40 0.75 pCLuRA-TDH3 [aV22A] V22A 4.431 0.304 14.58 1.43 pCLuRA-TDH3 [aN23Y] N23Y 1.528 0.272 5.63 0.58 pCLuRA-TDH3 [aT24A] T24A 2.285 0.290 7.89 0.26 図 2及び表 2から明らかなように、野生型 (プラスミド pCLuRA-TDH3)と比較して、 A1 9V変異体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a A19V])と P21L変異体 (プラスミド pCLuRA-TD H3[ a P21L])では約 20倍、 V22A変異体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a V22A])では約 1 5倍、 A20T変異体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a A20T])、 V22F変異体 (プラスミド pCLu RA-TDH3[ a V22F])、 N23Y変異体 (プラスミド pCLuRA_TDH3[ a N23Y])及び T24A変 異体 (プラスミド pCLuRA-TDH3[ a T24A])でもそれぞれ 5倍以上の菌体量 (OD600)当 たりの発光値の増強、即ちルシフェラーゼタンパク質分泌量の増加が観察された。 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明 細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の (a)又は (b)の分泌シグナルペプチド。
(a)配列番号 2記載のアミノ酸配列において、第 19番目のァラニン、第 20番目のァラ ニン、第 21番目のプロリン、第 22番目のバリン、第 23番目のァスパラギン及び第 24番 目のトレォニンから成る群より選択される少なくとも 1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置 換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド
(b)上記 (a)の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において、上記第 19番目〜第 24 番目のアミノ酸以外の位置で、 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたァ ミノ酸配列から成り、且つ配列番号 2記載のアミノ酸配列から成る分泌シグナルぺプ チドと比較して、 C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を 3倍以上向上させる、 分泌シグナルペプチド
[2] 上記第 19番目のァラニンが他のアミノ酸に置換されて!/、ることを特徴とする、請求項
1記載の分泌シグナルぺプチド。
[3] 上記第 19番目のァラニン力 Sパリンに置換されていることを特徴とする、請求項 1又は
2記載の分泌シグナルペプチド。
[4] 上記第 20番目のァラニンが他のアミノ酸に置換されて!/、ることを特徴とする、請求項
1記載の分泌シグナルぺプチド。
[5] 上記第 20番目のァラニンがトレオニンに置換されていることを特徴とする、請求項 1 又は 4記載の分泌シグナルペプチド。
[6] 上記第 21番目のプロリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項
1記載の分泌シグナルぺプチド。
[7] 上記第 21番目のプロリンがロイシンに置換されていることを特徴とする、請求項 1又 は 6記載の分泌シグナルペプチド。
[8] 上記第 22番目のパリンが他のアミノ酸に置換されて!/、ることを特徴とする、請求項 1 記載の分泌シグナルぺプチド。
[9] 上記第 22番目のバリンがフエ二ルァラニン又はァラニンに置換されて!/、ることを特 徴とする、請求項 1又は 8記載の分泌シグナルぺプチド。
[10] 上記第 23番目のァスパラギンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請 求項 1記載の分泌シグナルペプチド。
[11] 上記第 23番目のァスパラギンがチロシンに置換されていることを特徴とする、請求 項 1又は 10記載の分泌シグナルぺプチド。
[12] 上記第 24番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求 項 1記載の分泌シグナルぺプチド。
[13] 上記第 24番目のトレオニンがァラニンに置換されていることを特徴とする、請求項 1 又は 12記載の分泌シグナルぺプチド。
[14] 請求項 1〜； 13のいずれ力、 1項記載の分泌シグナルペプチドをコードする DNA。
[15] 請求項 14記載の DNAを含む DNA断片。
[16] 請求項 14記載の DNAを含む組換えベクター。
[17] 請求項;!〜 13のいずれか 1項記載の分泌シグナルペプチドと外来タンパク質とを連 結した融合タンパク質。
[18] 上記分泌シグナルペプチドの C末端側に上記外来タンパク質が連結されて!/、ること を特徴とする、請求項 17記載の融合タンパク質。
[19] 請求項 17又は 18記載の融合タンパク質をコードする DNA。
[20] 請求項 19記載の DNAを含む DNA断片。
[21] 請求項 19記載の DNAを含む組換えベクター。
[22] 請求項 20記載の DNA断片又は請求項 21記載の組換えベクターを有する形質転 換体。
[23] 宿主が酵母であることを特徴とする、請求項 22記載の形質転換体。
[24] 上記酵母がサッカロミセス'セレビシェであることを特徴とする、請求項 23記載の形 質転換体。
[25] 請求項 22〜24のいずれか 1項記載の形質転換体を培養し、上記外来タンパク質 を分泌発現又は膜に発現させることを特徴とする、タンパク質生産方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014101300A (ja) * 2012-11-19 2014-06-05 Chiba Univ 脳送達用キャリアおよびその用途
JP2016537993A (ja) * 2014-02-28 2016-12-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス アルファ接合因子プロペプチドバリアント
WO2025037535A1 (ja) * 2023-08-11 2025-02-20 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 ヒドロゲノフィラス属細菌由来の分泌シグナルペプチド遺伝子
EP4304360A4 (en) * 2021-03-11 2025-10-29 Tenza Inc Synthetic signal peptides to direct the secretion of heterologous proteins in yeast

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH022339A (ja) * 1987-12-30 1990-01-08 Chiron Corp 先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH022339A (ja) * 1987-12-30 1990-01-08 Chiron Corp 先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI H. ET AL.: "Impact of Amino Acid Changes in the Signal Peptide on the Secretion of the Tat-dependent Xylanase C from Streptomyces lividans", FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 255, no. 2, February 2006 (2006-02-01), pages 268 - 274, XP003019983 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014101300A (ja) * 2012-11-19 2014-06-05 Chiba Univ 脳送達用キャリアおよびその用途
JP2016537993A (ja) * 2014-02-28 2016-12-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス アルファ接合因子プロペプチドバリアント
US12024542B2 (en) 2014-02-28 2024-07-02 Novo Nordisk A/S Mating factor alpha pro-peptide variants
EP4304360A4 (en) * 2021-03-11 2025-10-29 Tenza Inc Synthetic signal peptides to direct the secretion of heterologous proteins in yeast
WO2025037535A1 (ja) * 2023-08-11 2025-02-20 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 ヒドロゲノフィラス属細菌由来の分泌シグナルペプチド遺伝子

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