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WO2008031264A1 - Composé de glycoside de furost-5-ène-3, 22, 26-triol pour la prévention et le traitement des cancers - Google Patents

Composé de glycoside de furost-5-ène-3, 22, 26-triol pour la prévention et le traitement des cancers Download PDF

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WO2008031264A1
WO2008031264A1 PCT/CN2006/002314 CN2006002314W WO2008031264A1 WO 2008031264 A1 WO2008031264 A1 WO 2008031264A1 CN 2006002314 W CN2006002314 W CN 2006002314W WO 2008031264 A1 WO2008031264 A1 WO 2008031264A1
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WO
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pharmaceutical composition
glycoside
composition according
formula
extract
Prior art date
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Ceased
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PCT/CN2006/002314
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shoei-Sheng Lee
Ming-Yang Lai
Chien-Kuang Chen
Chih-Chiang Wang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lotus Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Lotus Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a steroidal glycoside which is a compound for preventing and treating cancer, and particularly relates to a method for promoting apoptosis.
  • a furanosine (furost-5-ene-3, 22, 26-triol) glycoside compound that acts to prevent and treat cancer.
  • the present invention has been directed to the above-mentioned problems, and proposes a furan-containing glycoside compound which prevents and treats cancer by a mechanism for promoting apoptosis, thereby effectively eliminating the defects of the prior art.
  • a first aspect of the invention provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a furanol (furost-5-ene-3, 22, 26-trioI) glycoside of the structure of formula I:
  • the steric configuration of the carbon atom at the 25th position may be R, S or racemization
  • R 2 is selected from a hydrogen group or a methyl group
  • R 3 is selected from the group consisting of hydrogen group, glucose, rhamnose, galactose, xylose, and arabinose;
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an effect of promoting apoptosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an action of preventing and treating cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an action of preventing and treating liver cancer, lung cancer, and colorectal cancer. According to the invention, wherein the striol glycoside of formula I is dichotomin.
  • the striol glycoside of formula I is 26-OPD-glucopyranosyl-22 ⁇ -methoxy-(255)-furazan-5-ene-3 ⁇ , 26-diol 3-OaL -pyranosyl-(1 ⁇ 4)- ⁇ - ⁇ -glucopyranoside
  • the striol glycoside of formula I is 26-OPD-glucopyranosyl-22 ⁇ -methoxy-(25i?)-furazan-5-ene-3 ⁇ ,26-diol 3- O-oc-L-pyranosyl-(1 ⁇ 4)- ⁇ - ⁇ -glucopyranoside
  • the striol glycoside of formula I is 26-OPD-glucopyranosyl-22 ⁇ -hydroxy-(25i?)-furan steroid-3, 26-diol 3-OaL-pyranazole Liglycosyl-(1 - 2)-[aL-pyran rhamido-(1 - 4)]- ⁇ - ⁇ -glucopyranoside (26-O--D-glucopyranosyl-22a-hydroxy-( 25i?)-furostane-3,26-diol
  • the compound glycerol triol glycoside of formula I is derived from a water extract or extract of the genus.
  • the compound glycerol triol glycoside of formula I is derived from an aqueous extract or extract of an asparagus plant.
  • a second aspect of the invention provides a process for preparing a glycerol comprising a compound of formula I (furost-5-ene-3, 22, 26-triol)
  • a method of saccharifying a composition comprising: providing a genus or a plant of Asparagus; and then extracting the plant with an aqueous solution to obtain a Formula I A composition of a glycerol glycoside.
  • the method further comprises: extracting the aqueous solution with an organic solvent.
  • the organic solvent is n-butanol or ethyl acetate.
  • Fig. 1 is a schematic view showing the process of preparing a glucosinolate (furost-5-ene-3, 22, 26-triol) glycoside compound according to the present invention
  • Fig. 2 is a result of the apoptosis experiment of the extract of the palmetto of the present invention, wherein Fig. 2(a) is the experimental result of the PK-1 -1 extract of the palmetto; Fig. 2(b) is the experimental result of the PK-1-2 extract of the palmetto extract ;
  • Fig. 3 shows the apoptosis of tumor cells after injection of the purified product of the present invention, Dai Yuming, that is, Dichotomin (PK-22-1), wherein Fig. 3(a) is a control group injected with phosphate buffered saline (PBS); b) for the injection group of the purified product Dai Yuming (PK-22-1);
  • PBS phosphate buffered saline
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the nuclear DNA fragmentation of GP7TB and HepG2 by Dichotomin (PK-22-1) of the present invention
  • Figure 5 is a schematic view showing the experimental results of the in vitro test of F344 rats by Dichotomin (PK-22-1) and PK22-3 of the present invention
  • Figure 6 is a chromatogram of the preparation of the isolated compounds 5-7 by high performance liquid chromatography. detailed description
  • n-butanol soluble PK-1-1, 2.34 g
  • aqueous layer PK-1-2, 13.78 g
  • the organic layer was first used as the mobile phase, and then the water layer was reversed.
  • the mobile phase was subjected to centrifugal partition chromatography (CPC) separation, followed by dextran LH-20 chromatography (Sephadex LH-20 140 ml; 50% methanol/water solution) to obtain 18 mg of dichotomin (l, PK-). 22-1), extract containing dichotomin PK-22-2 (21 mg) and PK-22-3 (17 mg) without dichotomin.
  • CPC centrifugal partition chromatography
  • MCZ00/900ZN3/X3d 1?9 ⁇ /800 ⁇ OAV (3) Preparation and separation of peracetylated succinyl glycoside derivative of the present invention: n-butanol soluble fraction (PK-1-1) obtained by gel column chromatography and centrifugal partition chromatography One of the active fractions is Fr. 1-2-3. Take this fraction (61 mg) in a 10 liter round bottom flask, add 0.1 ml of acetic anhydride and 0.1 ml of pyridine, and close the reaction at 58 °C.
  • Part B (1.70 g) was also subdivided into dextran LH-20 (MeOH) to obtain four blocks, of which the second group weighed 217 mg and was separated by semi-preparative high performance liquid chromatography.
  • Column Merck, purospher STAR RP- 18e, 5 ⁇ , 10 X 250 mm; extract, methanol/water 70% (18 min), 70-90% (1 min, linear gradient), 90% ( 8 min) ; flow rate, 3 ml/min ; column temperature, 40 V; evaporative light scattering detector (ELSD) (5% flush ), gain 2, temperature: 40 °C, pressure: 3,3 bar.
  • ELSD evaporative light scattering detector
  • HMBC CDaOD, 400 MHz: H-4 corresponds to C-3, C-5; H-6 corresponds to C-4, C-8; H-15 corresponds to C-13, C-16; H-18 corresponds to C- 12, C-13, C-14, C-17; H-19 corresponds to Cl, C-5, C-9, C-10; H-20 corresponds to C-13, C-17, C-21; H- 21 corresponds to C-17, C-20, C-22; 22-OMe corresponds to C-22; H-27 corresponds to C-24, C-25, C-26; ⁇ - ⁇ corresponds to C-3; ⁇ - ⁇ ' Corresponds to C-26.
  • IR v cm" 1 (KBr): 3396, 2931, 1651, 1455 1377, 1040 910, 811 668;
  • HMBC CDsOD, 400 MHz: H-6 corresponds to C-4, C-8; H-18 corresponds to C-12, C-13, C-14, C-17; H-19 corresponds to C-1, C- 5, C-9, C-10; H-20 corresponds to C-13 C-17, C-21; H-21 corresponds to C-17, C-20, C-22; H-26 corresponds to C-24, C -25, C-27; H-27 corresponds to C-24, C-25, C-26; ⁇ - ⁇ corresponds to C-3; ⁇ - "corresponds to C-26.
  • Table 1 and Table 2 are the 1 H- of the compound 5-7 aglycone (CD 3 ⁇ D), respectively. NMR and 13 C-NMR data of the compound 5-7 and ribosomes (glycone) (CD 3 0D) -NMR with the 13 C-NMR data. ⁇
  • F344 rats Female, 8 weeks, weighing about 200 grams were injected subcutaneously in the back.
  • mice Female rats, 8 weeks, weighing about 20 grams
  • mice were divided into 3 groups of 5 each, and the mice were intraperitoneally injected with 1 kg of PK-1-1 per kg or PK-1-2, another phosphate buffer saline (PBS, phosphate buffer saline) was used as a negative control group.
  • PBS phosphate buffer saline
  • the liver, kidney, spleen, stomach, lung, The sections of the brain tissue were normal.
  • In situ end-labeling assay ( ⁇ -mediated dUTP Nick-End Labeling; TUNEL, Promega®) was used to detect GP7TB in rat hepatoma cells to see if palmetto extract caused apoptosis.
  • the cells were first cultured on a microscope slide, and then treated with 150 g/ml of sunflower extract PK-1-1 and PK-1-2 for 24 hours, after 4% formaldehyde (formaldehyde) and activator. After treatment with (Triton X-100), TdT enzyme action and propidium iodide (PI) staining were added, and if yellow-green fluorescence was observed, it was shown to be apoptotic cells.
  • TUNEL Triton X-100
  • Figure 2(a) and (b) The experimental results of PK-1-1 and PK-1-2 are shown in Figure 2(a) and (b), respectively.
  • Figure 2(a) shows obvious yellow-green fluorescence, showing PK-1-1. Can significantly promote the apoptosis of GP7TB cells.
  • MTS Cell viability assay
  • Tumor volume 0.52 X length X width X height
  • GP7TB cells Place 3x10 6 GP7TB cells in several 10 cm culture dishes and treat them with 12.5 g/ml for 24 hours using Dai Zhiming (PK-22-1) and extracts without Dai Mingming (PK-22-3). These cells were collected, and 5 ⁇ 10 6 GP7TB or GP7TB cells treated with PK-22-1 and PK-22-3 were injected into each of the three sites of the back of each F344 rat. After 3 weeks of observation, the results are shown in Fig. 5(a).
  • Dai Yuming also has inhibitory activity. As shown in Table 8, in addition to the confirmed inhibitory activity against liver cancer cells, Dai Yuming has better inhibitory activity against colorectal cancer and lung cancer cells. Table 8. Results of inhibition test of other cancer cells by Dichotomin (PK-22-1)
  • furost-5-ene-3,22,26-triol glycoside compound proposed by the present invention can promote apoptosis, so that all cancer cells can be obtained by the compound. Promote apoptotic mechanisms to prevent and treat diseases such as cancers that occur in mammals or humans.

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Description

可预防及治疗癌症的喃三醇配糖体化合物 技术领域 本发明涉及一种甾体配糖体（steroidal glycoside) ，其为用于预防及治 疗癌症的化合物， 特别涉及一种以促进细胞凋亡作用来预防及治疗癌症 的喃三醇（furost-5-ene-3,22，26-triol) 配糖体化合物。
背景技术
根据行政院卫生署历年来的死亡统计， 癌症均为台湾十大死因之首， 显示癌症仍为医药治疗上尚待努力的领域。
目前治疗癌症的方法有多种， 大致分为非外科手术及外科治疗。 在 非外科治疗中， 化学药物是经常使用的治疗方式， 但对于移转性且后期 的癌症， 经常治疗效果有限， 并伴随严重副作用的发生， 使得化学治疗 效果多令人失望， 即使目前有最新研发的抗血管生成疗法， 其对于癌症 的治疗效果亦相当有限。
有鉴于此， 本发明即在针对上述之困扰， 提出一种以促进细胞凋亡 的机制来预防及治疗癌症的含呋喃结构的 体配糖体化合物， 以有效克 服现有方法的缺陷。
发明内容
一本发明的第一方面在于提供一种药物组合物， 其包含有效量的式 I 所示结构的喃三醇（furost-5-ene-3,22,26-trioI) 配糖体：
Figure imgf000002_0001
其中， 选自氢、 葡萄糖、 鼠李糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 由 葡萄糖、 鼠李糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖等单糖组成的四糖、 五糖以 及六糖所组成的群组中的任意一种；
第 25位置碳原子的立体构型可为 R、 S或消旋化；
R2选自氢基或甲基；
R3选自氢基、 葡萄糖、 鼠李糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖所组成的 群组中的任意一种；
以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物具有促进细胞凋亡的作用。
本发明的药物组合物具有预防及治疗癌症的作用。
本发明的药物组合物具有预防及治疗肝癌、 肺癌及大肠癌的作用。 根据本发明， 其中式 I的喃三醇配糖体为戴绮铭（dichotomin)。
根据本发明， 其中式 I 的喃三醇配糖体为 26-O-P-D-吡喃葡萄糖基 -22α-甲氧基 -(255)- 呋甾 -5-烯 -3β, 26-二醇 3-O-a-L-吡喃鼠李糖基 -(1→ 4)-β-ϋ- 吡 喃 葡 萄 糖 苷
(26-O- -D-glucopyranosyl-22 -methoxy-(25lS')-furost-5-ene-3pj26-diol 3-O- -L-rhamnopyranosyl-(l 4)-P-D-glucopyranoside)
根据本发明， 其中式 I 的喃三醇配糖体为 26-O-P-D-吡喃葡萄糖基 -22α-甲氧基 -(25i?)- 呋甾 -5-烯 -3β,26-二醇 3-O-oc-L-吡喃鼠李糖基 -(1→ 4)-β-ϋ- 吡 喃 葡 萄 糖 苷
(26-O- -D-glucopyranosyl-22 -methoxy-(25i?)-furost-5-ene-3 ,26-diol 3-O-a-L-rhamnopyranosyl-(l→ 4)-P-D-glucopyranoside) »
根据本发明， 其中式 I 的喃三醇配糖体为 26-O-P-D-吡喃葡萄糖基 -22α-羟基 -(25i?)- 呋喃甾体 -3, 26-二醇 3-O-a-L-吡喃 鼠李糖基 -(1— 2)-[a-L- 吡 喃 鼠 李 糖 基 -(1 — 4)]-β-ϋ- 吡 喃 葡 萄 糖 苷 (26-O- -D-glucopyranosyl-22a-hydroxy-(25i?)-furostane-3,26-diol
3-O-a-L-rhamnopyranosyl-(l -* 2)-[ -L-rhamnopyranosyl-(l ― 4)]- β-D-glucopyranoside)。
根据本发明，其中式 I化合物喃三醇配糖体来自蒲葵属植物的水抽提 物或提取物。
根据本发明，其中式 I化合物喃三醇配糖体来自天门冬植物的水抽提 物或提取物。
本发明的第二方面在于提供一种制备包含式 I 化合物喃三醇 (furost-5-ene-3,22,26-triol) 配糖体的组合物的方法， 其包括： 提供蒲葵属 植物或天门冬植物； 然后以水溶液抽提该植物， 以得到含有式 I 的喃三 醇配糖体的组合物。
Figure imgf000004_0001
根据本发明， 该方法进一步包括： 以有机溶剂萃取该水溶液。
根据本发明， 该有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
本发明将通过以下实施例进行举例说明， 使本领域技术人员可以据 以完成之， 然本发明不应仅限于这些实施例。 附图说明
图 1 为本发明制备喃三醇（furost-5-ene-3，22,26-triol) 配糖体化合物的流 程示意图；
图 2 为本发明的蒲葵萃取物进行细胞凋亡实验结果， 其中图 2(a) 为蒲 葵萃取物 PK-1 -1 实验结果； 图 2(b) 为蒲葵萃取物 PK-1-2实验结 果；
图 3 为注射本发明的纯化物戴绮铭， 即 Dichotomin (PK-22-1)后， 肿瘤细 胞出现凋亡现象， 其中图 3(a)为注射磷酸缓冲液（PBS)的对照组； 图 3(b)为注射纯化物戴绮铭（PK-22-1)的试验组；
图 4 为本发明的戴绮铭 （Dichotomin ) (PK-22- 1)对 GP7TB及 HepG2产生 核 DNA断裂作用的示意图；
图 5 为本发明的戴綺铭 （Dichotomin ) (PK-22- 1)及 PK22-3进行 F344大 鼠离体试验的实验结果示意图； 以及
图 6 为本发明高效液相层析制备分离化合物 5 ~ 7的层析图。 具体实施方式
(1)本发明蒲葵抽出物的分离：
将蒲葵去壳的种子 200公克磨碎并以 0.8 公升的水煮沸二小时抽取 三次， 离心取出上清液并减压浓缩至体积 200 毫升， 再以乙酸乙酯（200 毫升 x 3) ， 正丁醇（200毫升 x 3) 分别进行提取， 减压浓缩得正丁醇可溶 物（PK-1-1, 2.34 公克） 与水层（PK-1-2, 13.78 公克） 。 将部分正丁醇可 溶物（PK-1-1, 1.55公克）以正丁醇： 甲醇： 水 = 4: 1 4为分离溶媒系统， 先以有机层为动相， 再逆转以水层为动相进行离心式分配层析（CPC) 分 离， 接着以葡聚糖 LH-20层析（Sephadex LH-20 140毫升； 50% 甲醇 /水 溶液） 得到 18 毫克的戴绮铭（dichotomin)(l, PK-22-1)， 含戴绮铭 (dichotomin) 的提取物 PK-22-2 (21毫克） 与不含戴绮铭 （dichotomin) 的 PK-22-3 (17毫克) 。
(2)含化合物戴绮铭（dichotomin)的提取物 PK-17-1, PK-22-4的制备： 将正丁醇可溶物（PK-1-1, 1.03 公克） 部分以葡聚糖 LH-20 层析
(Sephadex LH-20 , 140 毫升 ； 50% 甲 醇 /水溶液） 得到含戴绮铭 (dichotomin) 的提取物 PK-17-1 (234毫克）， 此部分（203 毫克） 再以葡 聚糖 LH-20层析， 进一步处理得到另一含戴绮铭 （dichotomin) 的提取物 (PK-22-4, 36毫克） 。
Dichotomin(l) ： 无晶形粉末；
[ a ]D 25 = -84 （c 1.0, MeOH);
IR^ cm"1 (KBr): 3437 (br s, OH), 2933 (m)， 1633 (m), 1454 (m), 1388 (m), 1262 (m)， 1128 (s)， 1049 (s), 910 (w), 804 (w);
Ή-NMR (CD3OD, 400 MHz): 51.87 (br d, J = 14.2 Hz, Η-1β), 1.07 (m H-la), 1.61 (m, Η-2β), 1.91 (m, H-2 a ), 3.59 (m, H-3 a ), 2.28 (br t, J = 13.0 Hz, Η-4β), 2.44 (dd, J= 2.8, 13.0 Hz, H-4 a ), 5.38 (br d, J= 2.9 Hz H-6), 1.58 (m, H-7a), 2.01 (m, H-7a)5 1.66 (m, H-8), 0.95 (m, H-9), 1.53 (m, Η-11β), 1.56 (m, H-lla), 1.80 (m, Η-12β), 1.18 (m, H-12 ), 1,13 (m H-14), 1.27 (m, Η-15β), 1.97 (m, H-15a)， 4.36 (dd, /= 7.4, 14.4 Hz, H-16), 。 (9·£6ΐΐ 9Ζ0"Η"0 Joj -ρο ο) ς· \1 .[Η-ΙΑΙ] (SATIBSSU) SW-IS3
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MCZ00/900ZN3/X3d 1?9Ζΐεθ/800Ζ OAV (3)本发明的过乙酰化喃三醇配糖体衍生物的制备与分离： 正丁醇可溶物部分（PK-1-1) 经凝胶管柱层析及离心式分配层析得 到活性部份之一为 Fr. 1-2-3, 取此部分（61 毫克） ， 置于 10亳升圆底瓶 中， 加入 0.1毫升醋酸酐及 0.1毫升吡啶， 于 58 °C下密闭反应 12小时， 减压浓缩后以硅胶管柱层析分离（230~400 mesh硅胶， 25~40% 乙酸乙酯 / 甲苯) ， 得到 25毫克膺戴绮铭酯， 即 pseudodichotomin peracetate 膺戴绮铭酯 ( Pseudodichotomin peracetate) (2)： 无晶形粉末；
[a]D 25: -30° (c 1.0 CHCh);
IRv cm"1 (KBr) 2941 (m), 1752 (s)， 1636 (w), 1435 (w), 1373 (m), 1224 (s)， 1139 (m), 1042 (s);
Ή-NMR (CDCh, 400 MHz): δ 1.06 (dt, J : 3.3, 13.1 Hz, H-la), 1.83 (m, Η-1β), 1.91 (m, H-2a), 1.52 (m, Η-2β), 3.55 (m, H-3), 2.41 (dd, J : 3.7 12.8 Hz, H-4a), 2.25 (dd, J = 11.0 12.8 Hz, Η-4β), 5.36 (br d, J二 4.4 Hz, H-6), 1.55 (m, H-7a), 2.01 (m Η-7β), 1.57 (m, H-8), 0.94 (dd, /= 5.0, 10.7 Hz, H-9), 1.53 (m, H-lla), 1.49 (m Η-11β), 1.22 (m, H-12a), 1.77 (m, Η-12β), 0.96 (m, H-14), 2.13 (m H-15a), 1.38 (m, Η-15β), 4.69 (ddd, J二 5.6, 7.7, 9.8 Hz, H-16), 2.44 (br d J= 9.8 Hz, H-17), 0.64 (s, 3H H-18), 0.98 (s, 3H, H-19), 1.54 (s, 3H, H-21), 2.06 (m, H-23), 2.04 (m, H-23), 1.22 (m H-24), 1.53 (m, H-24), 1.68 (m, H-25), 3.27 (dd, J= 6.0 9.5 Hz, H-26), 3.67 (m H-26), 0.85 (d, J: 6.6 Hz, 3H, H-27), 3-O-glu: 4.54 (d, J: 7.8 Hz, H-1'), 3.53 (dd, /= 7.8, 9.4 Hz, H-2'), 5.26 (t, J二 9.4 Hz, H-3'), 3.69 (t J = 9.5 Hz, H-4'), 3.58 (m, H-5'), 4.31 (dd, /= 3.6, 12.4 Hz, H-6'), 4.45 (m, H-6'), rha-(l→2); 4.87 (d, J : 1.3 Hz, H-1"), 5.01 (m, H-2"), 5.22 (dd, / = 3.4, 10.1 Hz, H-3"), 5.02 (m, H-4"), 4.34 (m, H-5"), 1.16 (d, /= 6.2 Hz, 3H, H-6"), rha-(l→4)-rha-(l→4): 4.73 (d, J = 1.7 Hz, H-1"'), 5.08 (m H-2"'), 5.15 (m H-3'"), 3.58 (t, /= 9.5 Hz, H-4'"), 3.79 (dq, /= 6.1, 9.5 Hz, H-5 1.26 (d, J = 6.1 Hz, 3H, H-6'"), 26-O-glu: 4.43 (d, J二 7.9 Hz, H-1""), 4.96 (dd, J= 7.9, 9.5 Hz, H-2""), 5.16 (t, J= 9.5 Hz, H-3""), 5.05 (m, H-4""), 3.65 (m, H-5""), 4.10 (dd, J : 2.2, 12.2 Hz, H-6""), 4.23 (dd, J二 4.6, 12.2 L
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M£J00/900ZN3/X3d t9Z而 800Ζ fA
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(4)从天门冬分离含呋喃结构的甾体配糖体成分：
天门冬新鲜成熟果实（4.26 Kg) 去子部分， 加水（3公升） 并以搅拌机 打碎萃取， 浓缩， 得水抽提物（203公克）。 该抽提物经乙酸乙酯和正丁醇 分别提取后， 得乙酸乙酯（EtOAc) 可溶、 正丁醇（/2-BuOH) 可溶（18.2 公 克） 和水可溶三部分。 正丁醇可溶部分（17.0公克） 以大型离心式分配层 析（CPC, Sanki LLI型）进行分配， 依其相似性合并为四个部分（Fr. A, 4.8 g; Fr. B. 3.2 g; Fr. C， 2.1 g; Fr. D， 7.0 g) 。
B 部份（1.70公克） 亦以葡聚糖 LH-20 (MeOH) 细分得到四个区组， 其中第二区组重 217毫克， 再以半制备型高效液相层析法进行分离， 条 件如下： 管柱， Merck, purospher STAR RP- 18e, 5 μιη， 10 X 250 mm; 冲提 液， 甲醇 /水 70% (18 min) ， 70 ~ 90% (1 min， 直线梯度） ， 90% (8 min) ； 流速， 3 ml/min ; 管柱温度， 40 V； 蒸发光散射检测器（ELSD) (5% 冲提 物） ， gain 2， 温度： 40 °C， 压力： 3,3 bar。 得到化合物 5 (10 mg, 滞留 时间约 15.0 min) 、 6 (5 mg, 滞留时间约 19.3 min) 及 7 (30 mg， 滞留时 间约 12.3 min) (图 6) 。 化合物 5： 26-O- -D-glucopyranosyl-22 a -methoxy-(25,S -furost-5-ene- 3 β ,26-diol 3-0- a -L-rhamnopyranosyl-(l→ 4)- β -D-glucopyranoside
Figure imgf000010_0001
白色固体；
[a ]D 27 -43.0° (c 1.0， MeOH);
I v max cm"1 (KBr): 3406, 2934, 1639， 1378, 1037;
和 13C-NMR: 表一与表二；
HMBC (CDaOD, 400 MHz): H-4对应 C-3， C-5; H-6对应 C-4， C-8; H-15对应 C-13, C-16; H-18对应 C-12, C-13, C-14, C-17; H-19对应 C-l, C-5, C-9, C-10; H-20对应 C-13, C-17, C-21; H-21对应 C-17, C-20, C-22; 22-OMe 对应 C-22; H-27对应 C-24, C-25, C-26; Η-Γ对应 C-3; Η-Γ'对应 C-26。
ESI-MS [M+H]+ m/z 917 (C46H76018+H)
化合物 6: 26-0- β -D-glucopyranosyl-22 a -methoxy-(25?)-furost-5-ene-3 β , 26-diol 3-0- a -L-rhamnopyranosyl-(l→ 4)- β -D-glucopyranoside
Figure imgf000010_0002
白色固体；
[a ]D" -36. Γ {C 0.7, MeOH);
IR v max cm"1 (KBr): 3397, 2934, 1652, 1379 1035, 668;
Ή 和 13C-NMR: 表一与表二；
ESI-MS [M+H]+ m/z 917 (C«H76018+H)o 化合物 7 26-O- β -D-glucopyranosyl-22 « -hydroxy-(25 ?)-furostane-3,26- diol 3- (9- a. -L-rhamnopyranosyl-(l 2)-[ a -L-rhamnopyranosyl-(l→ 4)]- β -D-glucopyranoside
Figure imgf000011_0001
白色固体；
[ a ]D 27 -58.0° (c 1.0, MeOH);
IR v cm"1 (KBr): 3396, 2931, 1651, 1455 1377, 1040 910, 811 668;
Ή 和 13C-NMR: 表一与表二；
HMBC (CDsOD, 400 MHz): H-6对应 C-4, C-8; H-18对应 C-12, C-13, C-14, C-17; H-19对应 C-1, C-5, C-9, C-10; H-20对应 C-13 C-17, C-21; H-21对 应 C-17, C-20, C-22; H-26对应 C-24, C-25, C-27; H-27对应 C-24, C-25, C-26; Η-Γ对应 C-3; Η- "对应 C-26.
ESI-MS [M+K]+ m/z 1090 (C51H86〇22+K) 表一与表二分别为化合物 5-7非糖体 （aglycone) (CD3〇D)的 1 H-NMR 与 13C-NMR 数据和化合物 5-7 糖体（glycone) (CD30D)的 -NMR 与 13C-NMR数据。 π
Figure imgf000012_0001
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MCZ00/900ZN3/X3d 1?9Ζΐεθ/800Ζ OAV 表二、 化合物 5-7糖体的 1 H-NMR 与 ' 3C-NMR数据
Figure imgf000013_0001
(5)本发明的蒲葵水抽提物经口喂食试验：
分别在三只 F344的大鼠（雌鼠， 8周， 重约 200公克） 背部皮下注射
106或 3 X 106个大鼠肝肿瘤 GP7TB细胞株之细胞， 口服管喂蒲葵水抽出 物及阴性对照组之磷酸缓冲液（PB S)， 蒲葵水抽提物之剂量为每天每只
0.1公克（相当于 0.5 公克 /公斤）， 连续管喂 20天及 40天， 观察肿瘤细胞 生长情形， 测量肿瘤的长宽高并记录之， 结果发现经过 40天的管喂蒲葵 水抽出物组均不见肿瘤生成， 如表三所示。 表三 蒲葵水抽提物经口管喂试验
Figure imgf000014_0001
(6)本发明的单一剂量毒性试验：
使用正常的 SCID/CB17 品系小鼠（雌鼠， 8周， 重约 20公克）分成 3 组， 每组各 5 只， 于小鼠腹腔注射剂量为每公斤 1 公克之 PK-1-1 或是 PK-1-2, 另以磷酸缓冲液（PBS， phosphate buffer saline)作为阴性对照组， 经 2周后观察， 生长情况良好， 每组体重正常增加， 其肝， 肾， 脾， 胃， 肺， 脑的组织之切片均正常。
(7)本发明的蒲葵萃取物 PK-1-1 及 PK-1-2 的细胞凋亡作用（apoptosis detection)：
利用原位末端标记技术试验 (ΧαΤ-mediated dUTP Nick-End Labeling; TUNEL, Promega®) 侦测大鼠肝癌细胞 GP7TB， 了解蒲葵萃取物是否会 引起细胞凋亡（apoptosis) 。 先将细胞培养在显微镜载玻片（microscope slide) 上， 再以 150 g/ml的蒲葵萃取物 PK-1-1及 PK-1-2作用 24小时， 经过 4% 甲醛（formaldehyde) 与活化剂（Triton X- 100) 的处理之后， 随之 加入 TdT酵素作用及碘化丙啶（propidium iodide， PI) 染色， 如观察到黄 绿色荧光即显示为凋亡细胞。 蒲葵萃取物 PK-1-1 及 PK-1-2之实验结果 分别如图 2(a)及（b) 所示，其中图 2(a) 有明显的黄绿色荧光，显示 PK-1-1 可明显促进 GP7TB细胞之凋亡。
(8)本发明的蒲葵提取物 PK-1-1、 PK-17-1 及纯化合物戴绮铭（dichotomin) (PK-22-1) 对肝肿瘤细胞株（GP7TB, Huh7, HepG2) 生长抑制的试验：
利用细胞存活率试验法（MTS， Promega®) 来测定蒲葵提取物 PK-1-1 及 PK-17-1对细胞生长与毒性的影响。 先在 96孔盘培养皿中各放入 104 个大鼠肝肿瘤细胞株 GP7TB , 人类肝肿瘤细胞株 Huh-7及 HepG2， 隔夜 培养后， 再分别加入不同浓度的萃取物作用 24小时后， 将培养液倒掉， 更换每毫升含 20 μΐ MTS培养液作用 1小时， 因 MTS中含有
[3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium]， 此化合物会经活细胞内的 NADPH或 NADH 等去氢酶代谢成紫色的甲臜（formazan)产物， 透过 490 nm可见光即可呈 现不同读值， 可了解与萃取物作用后细胞的存活率。 如表四及表五所示， 萃取物 PK- 17- 1于浓度达 25 μ£/ηι1时即对 GP7TB细胞产生抑制作用， 同 样对于 Huh-7及 HepG2细胞株具有一致的抑制结果。
PK- 1 - 1及 ΡΚΠ- 1对细胞株的 MTS分析
Figure imgf000015_0001
*斜体粗字之 OD值表示细胞形态（morphology) 已有改变
表五 PK- 1 - 1及 PK17- 1对细胞株的生长抑制情形
Figure imgf000016_0001
*栏内数字单位为 104细胞
重复进行三次实验将结果平均， 如表六所示， 求得化合物 dichotomin (PK-22- 1)抑制 GP7TB 细胞生长之 IC5Q为 1.65 M (1.97 g/ml) , 正对照组 adriamycin之 IC5。 则为 2.66 M (1.54 g/ml)。 表六 各种浓度戴绮铭 （dichotomin ) (PK-22-1)及阿霉素 （Adriamycin ) 对 GP7TB细胞株的生长抑制结果
Amount of Cells (cells/ml)*
浓度 （ g/ml)
PK-22-1 Adriamycin
0 2.06 x 105 1.71 x 105
1 1.30 x 105 7.80 x 104
2 4.60 x 104 2.30 x 104
4 2.00 x 104 2.00 x 104
6 1.10 x 104 3.00 x 104
8 5.00 x 104 2.50 x 104 10 3.00 x 103 2.30 x 104
12 1.60 x 103 1.60 x 104
*Mean value of triplicate experiments
(9)本发明的戴绮铭 （Dichotomin) (PK-22-1) 抑制大鼠肝肿瘤成长活体 内、in vivo) 试验：
每只大鼠先施予 3 X 106个 GP7TB细胞的背部下皮注射， 约 1周后 等肿瘤形成约 0.3 公分左右， 开始直接在肿瘤位置注射戴绮铭（PK-22-1, 2.0 mg/Kg) 或磷酸缓冲液对照组， 每天打 1剂， 连续打 8天， 直接测量 肿瘤大小， 比较对照组与注射戴绮铭对肿瘤生长的影响， 结果如表七所 示， 经由戴绮铭注射后所形成的肿瘤大小约只有对照组的 1/2， 并由图 3(b)显示， 经戴綺铭注射后的肿瘤细胞出现凋亡现象（apoptosis)。 病理切 片结果如图 3(a)所示， 显示磷酸缓冲液对照组的肿瘤细胞依然维持瘤细 胞多形性（pleomorphism)之正常生长状态。 表七 戴绮铭 （Dichotomin) (PK-22-1) 对大鼠肝肿瘤细胞生长的影响
Figure imgf000017_0001
肿瘤体积= 0.52 X 长 X 宽 X 高
(10)本发明由蒲葵萃取的戴绮铭 （dichotomin) (ΡΚ-22-1)、 含戴绮铭的 提取物（ΡΚ-22-2, ΡΚ-22-4)与不含戴绮铭的萃取物（ΡΚ-22-3)对 GP7TB细胞 核 DNA产生断裂 （fragmentation) 的影响：
为了了解活性成分及提取物对 GP7TB细胞生长抑制原因，将一系列 的提取物及戴绮铭， 以固定浓度（12.5 g/ml) 处理 GP7TB细胞， 经过 48 小时后， 萃取细胞的 DNA， 进行洋菜胶电泳分析， 结果如图 4所示， 显 示含戴绮铭的萃取物会对 GP7TB及 HepG2产生核 DNA断裂作用， 其中 以戴绮铭（PK-22-1)的作用最为显著， 据此可推断出戴绮铭具有可促进上 述细胞株凋亡的作用。
(11)本发明的戴绮铭 (dichotomin) (PK-22-1) 及不含戴绮铭（PK-22-3)的 萃取物的离体（en/ ) 抗肿瘤试验：
在数个 10公分培养皿内放置 3xl06个 GP7TB细胞，分别使用戴绮铭 (PK-22-1) 及不含戴绮铭（PK-22-3)的萃取物以 12.5 g/ml处理 24小时， 再将这些细胞收集起来，在每只 F344大鼠的背部皮下分 3个部位各注射 5 X 106个 GP7TB或经 PK-22-l、 PK-22-3处理的 GP7TB细胞。 于 3个星 期后观察，结果如图 5(a) 所示， 9只老鼠中有 6只受戴绮铭 （PK-22-1) 处 理过后的 GP7TB 不会形成肿瘤， 图 5(b)则显示另外 3 只经戴绮铭 (PK-22-1) 处理后所形成的肿瘤约只有 GP7TB对照组的 1/6,至于受不含 戴绮铭的萃取物 PK-22-3 处理所形成的肿瘤大小则与 GP7TB 对照组一 样。
(12)本发明的戴绮铭 （PK-22-1)对其他癌细胞的抑制试验
将各癌细胞株悬浮液放置于 96孔培养皿中， 存放于 37 °C并通入 5% C02, 经 24小时培养后， 加入 ΙΟΟ μΙ 生长基与 2 μΐ不同浓度（100， 10， 1, 0.1及 0.01 μΜ)的戴绮铭（PK-22-1),另以相同方式进行对照药物 mitomycin 的癌细胞培养。 经 72小时培养后， 于培养皿中加入 20 μΐ的 alamarBlue 试剂， 再培养 6 小时后以荧光侦测仪测定细胞密度， 荧光侦测仪是以 GENios与微读取机， 于波长 530 nm进行激发并于波长 590 nm接收发散 以进行测量。 以 IC5Q值表示于试验结束后， 投与试验物质造成细胞数目 减少 50%时之浓度， 以此数值显示其抑制癌细胞之活性。
对于其它癌细胞， 戴绮铭亦具有抑制活性。 如表八所示， 除对肝癌 细胞已证实具有抑制活性外， 戴绮铭对于大肠癌与肺癌细胞具有更好的 抑制活性。 表八、 戴绮铭 （Dichotomin ) (PK-22-1)对其他癌细胞的抑制试验结果
Figure imgf000019_0001
* IC5。为达到 50%抑制程度之最低浓度
由 上 述 之 实 验 结 果 可 知 ， 本 发 明 提 出 之 喃 三 醇 (furost-5-ene-3,22,26-triol) 配糖体化合物确实可以促进细胞凋亡，使所有 癌症细胞可藉由此化合物的促进凋亡机制， 以达到预防及治疗发生在哺 乳动物或人类之癌症等疾病。
根据本发明的描述， 在不背离本发明的精神下， 本领域普通技术人 员可进行各种修饰与调整， 这些变化都应在本发明的保护范围内。

Claims

权利要求
1 .一种药物组合物 ， 其包含有效量的式 I 所示结构 的喃三醇 (furost-5-ene-3 ,22,26-triol) 配糖体：
Figure imgf000020_0001
其中， ^选自氢、 葡萄糖、 鼠李糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 由 葡萄糖、 鼠李糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖等单糖组成的四糖、 五糖以 及六糖所组成的群组中的任意一种；
第 25位置碳原子的立体构型可为 R、 S或消旋化；
R2选自氢基或甲基；
R3选自氢基、 葡萄糖、 鼠李糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖所组成的 群组中的任意一种；
以及药学上可接受的载体或赋形剂。
2. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其具有促进细胞凋亡的作用。
3. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其具有预防及治疗癌症的作用。
4. 如权利要求 3所述的药物组合物， 其具有预防及治疗肝癌、 肺癌及大 肠癌的作用。
5. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其为戴绮铭（dichotomin)。
6. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中所述式 I 的喃三醇配糖体为 26- O-P-D-吡喃葡萄糖基 -22α-甲氧基 -(25 - 呋甾 -5-烯 -3 β， 26-二醇 3 - 吡喃鼠李糖基 -( 1→ 4)-P-D-吡喃葡萄糖苷。
7. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中所述式 I 的喃三醇配糖体为 26- Ο- β-Ό-吡喃葡萄糖基 -22α-甲 氧基人 R)-呋 甾 -5-烯 -3 β，26-二醇 3-O-a-L-吡喃鼠李糖基 -(1— 4)-β-ϋ-吡喃葡萄糖苷。
8. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中所述式 I 的喃三醇配糖体为 26-O-P-D-吡喃葡萄糖基 -22a-羟基 -(25；?)- 呋喃甾体 -3, 26-二醇 3-O-a-L- 吡喃鼠李糖基 -(l→2)-[a-L-吡喃鼠李糖基 -(1— 4)]- β-D-吡喃葡萄糖苷。
9.如权利要求 1 所述的药物组合物， 其中该式 I 的喃三醇配糖体来自蒲 葵属植物的水抽提物或提取物。
10.如权利要求 1所述的药物组合物， 其中该式 I的喃三醇配糖体来自天 门冬植物的水抽提物或提取物。
11.一种制备权利要求 1-10中任意一项所述的药物组合物的方法，该方法 包括： 提供蒲葵属植物或天门冬植物； 以及以水溶液抽提该植物， 以取 得该含有式 I 的喃三醇配糖体的组合物。
Figure imgf000021_0001
12. 如权利要求 11所述的方法， 该方法进一步包括： 以有机溶剂萃取所 述水溶液提取物。
13. 如权利要求 12所述的方法， 其中该有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
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