WO2008029877A1

WO2008029877A1 - Anti-aging agent, skin-whitening agent, anti-oxidative agent, and anti-inflammatory agent

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Publication number: WO2008029877A1
Application number: PCT/JP2007/067402
Authority: WO
Inventors: Hiroko Kikuchi; Masaki Arashima; Hiroko Yoshida
Original assignee: Noevir Co Ltd
Current assignee: Noevir Co Ltd
Priority date: 2006-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2009-03-06
Also published as: JP2008063266A

Description

明細書

抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤

技術分野

[0001] 本発明は、天然由来成分を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤に関し、さらに詳しくはォオハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物の利用に関する。

背景技術

[0002] 加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシヮ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞の機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止'改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤への応用が検討されてきた。

[0003] 例えば、細胞賦活剤としてポンカンのエッセンス（特開 2001— 131045号公報）、美白剤として白鶴霊芝の水および/または有機溶媒抽出物（特開 2003— 89630号公報）、抗酸化剤としてサルォガセ科サルォガセ属植物の抽出物（特開平 10— 182 413号公報）が知られている。

発明の開示

[0004] このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。し力、し、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、抗炎症作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。

本発明は、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用を有する天然由来成分を開発し、それらの効果を有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤、ならびに各種組成物を提供することを課題とする。

[0005] 本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来その効果が知られていなかったォオノ、マボウに優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の第一の側面によれば、ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤が提供される。

本発明の第二の側面によれば、ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を含む組成物が提供される。

発明を実施するための最良の形態

[0006] ォォハマボウ（Glias nueberthii) (学名 Hibiscus tiliaceus)は、ァオイ目ァオイ科フヨゥ属に属する常緑高木であり、琉球列島以南の亜熱帯〜熱帯地域に分布する。ォォハマボウまたはその抽出物には、分析しきれないほどの非常に多くの種類の成分が含まれており、これらが総合的に作用して本発明の様々な効果が得られるものと推測される。

[0007] このォオノ、マボウを使用する際は、その使用部位には特に制限はなぐ全体または花、葉、茎、枝、根、種子、樹皮、樹液、果皮、果実、芽などの任意の部位を使用すること力 Sできる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。

それらはそのまま粉砕して、その原体や乾燥物を使用することもできる力それらの部位からの抽出物を用いることが好ましい。

[0008] 抽出には、ォォハマボウのいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、葉や樹皮などを用いるとよい。その際、複数の部位を用いて抽出物を得るようにしてもよい。また、異なる溶媒を用いて抽出された抽出物を 2種以上混合して用いてもよい。

抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。

[0009] 抽出方法としては、室温、冷却または加温した状態で、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬させて抽出する方法、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、生の植物から圧搾して抽出物を得る圧搾法等が例示できる。これらの任意の方法を単独で、または 2種以上を組み合わせて、抽出を行うこと力 Sできる。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。オートクレーブなどを用いて、カロ圧下で抽出することも可能である。

[0010] 抽出温度としては、 5°C程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、 1時間〜 14日間程度とするのが適切である。

抽出の際の植物と溶媒との比率は特に限定されるものではないが、植物 1に対し、溶媒 0. 5〜； 1000質量倍が好ましぐ特に抽出操作、効率の点で 0. 5〜； 100質量倍が好ましい。

[0011] 抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール； 1 , 3—ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；ェチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸ェチル等のエステル類；アセトン、ェチルメチノレケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほ力、、任意の 2種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの 1種または 2種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。

[0012] ォオノ、マボウの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができる力一定期間放置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。あるいは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行つた後に用いてもよい。ォォハマボウの上記抽出物やその処理物および分画物は、各処理および分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のべシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。

[0013] ォオノ、マボウまたはその抽出物は、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用を有し、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤として好ましく利用すること力 Sでさる。

これらの各剤は、ォオノ、マボウまたはその抽出物を有効成分として含む限り、その形態およびその他の成分の配合の有無等については、何ら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル (賦形剤）、溶剤、その他の一般的な添加剤 (酸化防止剤、着色剤、分散剤等)を任意に含むことができる。

[0014] 各剤中の有効成分である、ォオノ、マボウまたはその抽出物の量は、剤の種類や使用目的等によって調整することができる力 S、効果や安定性などの点から、全量に対して、固形分換算で 0. 00001〜； 100質量⁰ /₀力ましぐより好まし <は 0. 00；!〜 50質量％である。

[0015] ォォハマボウまたはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れた細胞賦活効果、コラーゲン産生作用、およびァロマターゼ活性促進作用を有し、老化症状の防止改善に優れた効果を発揮する。ァロマターゼは、エストロゲンを産生する際に働く酵素であり、ァロマターゼ活性促進作用によりエストロゲンの産生が促進されると、女性ホルモンによる美肌効果ゃ抗老化効果が期待できる。

[0016] ォオノ、マボウまたはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたメラニン産生抑制効果およびチロシナーゼ活性阻害効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。

[0017] ォォハマボウまたはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたフリーラジカル消去効果、およびスーパーオキサイドァニオンの消去効果を有し、皮膚の光老化等を防止して、優れた抗酸化作用を発揮する。

[0018] ォォハマボウまたはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害効果、およびホスホリパーゼ A2活性阻害効果を有し、皮膚の炎症を抑え優れた抗炎症作用を発揮する。

[0019] これらの各剤は、皮膚に外用するだけではなぐ毛髪等への利用や経口摂取も可能であり、外用組成物、経口用組成物などの各種組成物に応用することが可能であここで、外用組成物とは、化粧料、皮膚外用剤、医薬部外品、外用医薬品等のいずれかのカテゴリ一に限定されることはなく、皮膚または毛髪に外用される全ての組成物を意味している。経口用組成物についても、医薬品、食品、飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味するものである。

[0020] 外用組成物の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系やカラミン口ーシヨン等の分散系、クリームや乳液などの乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤、パップ剤などの種々の剤型で提供することあでさる。

具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料、リップスティック、メーキャップ化粧料、ファンデーション等の各種化粧料;液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼布剤、パップ剤、等の様々な形態の医薬部外品や外用医薬品などが例示できる。

[0021] 経口用組成物の形態も任意であり、液剤、シロップ剤、エキス等の液状の形態、または、顆粒剤、錠剤、散剤、カプセル剤、飴剤等の固形剤、あるいはゼリー、グミ、ガムなどの様々な形態に加工し使用することができ、特に限定されることはない。

具体的には、飲料を含む一般食品、健康食品（サプリメント）、機能性食品、栄養補助食品、経口医薬品、医薬部外品などが例示できる。

[0022] ォオノ、マボウまたはその抽出物を、たとえば化粧品、外用医薬品、医薬部外品等を含む皮膚外用剤に配合することにより、シヮ、タルミ、肌のハリゃ皮膚の弾力低下、シミ、くすみと!/、つた種々の皮膚症状の防止 ·改善に優れた効果を発揮する外用組成物を得ることができ、保湿用皮膚外用剤あるいは美白用皮膚外用剤として用いることができる。特に、ォォハマボウまたはその抽出物を含む老化防止改善用皮膚外用剤として使用すること力好ましレヽ。

さらに、ォオノ、マボウまたはその抽出物は、美白等の美容、健康維持、または栄養補給を目的とするような飲食品や健康食品（サプリメント）、医薬部外品、機能性食品等にあ用いることカでさる。

[0023] 外用組成物または経口用組成物等の組成物には、ォォハマボウまたはその抽出物の他に、その用途および必要に応じて、通常皮膚化粧料、毛髪用化粧料、医薬部外品、医薬品等の製剤に使用される任意の成分が含まれる。そのような成分としては、水、油剤（油性成分）、アルコール類、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、矯味剤、色素、着色剤、乳化剤、可溶化剤、分散剤、ゲル化剤、可塑剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、 pH調整剤、緩衝剤、界面活性剤、滑沢剤、キレート剤、薬剤 (薬効成分）、香料、樹脂、コーティング剤、防菌防黴剤、防腐剤、保存剤、酸化防止剤、 pH 調整剤等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤、あるいはォォハマボウ以外の植物またはその抽出物との併用も可能である。

[0024] ォオノ、マボウまたはその抽出物を含む飲食品の場合も、食品に用いられる各種成分との組合せにぉレ、ては、特に限定されるものはなレ、。

すなわち、食品の剤型は任意であって、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの種々の剤型で提供することができ、必要に応じて、医薬品'医薬部外品'食品などに配合される油性成分、保湿剤、粉体、乳化剤、可溶化剤、増粘剤、薬剤、香料、防菌防黴剤、アルコール類、砂糖、練乳、小麦粉、食塩、ブドウ糖、鶏卵、バター、マーガリン、水飴、カルシウム、鉄分、調味料、香辛料、ビタミン Aおよびそれらの誘導体、力ロテノイド類、リボフラビンおよびその誘導体、ビタミン B類およびそれらの塩もしくは誘導体、ァスコルビン酸およびその誘導体、コバラミン類、ビタミン Eおよびそれらの誘導体、ビタミン、アデノシンおよびその誘導体、フラボノイド類およびタンニン類を酉己合することもできる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、あるいは抗炎症剤との併用も可能である。

[0025] 外用組成物中または経口用組成物等の組成物中のォォハマボウまたはその抽出物の配合量は、組成物の種類や使用目的等によって調整することができる力効果や安定性などの点から、全量に対して、固形分換算で 0. 00001-50. 0質量％が好ましく、より好ましくは、 0. 0001— 25. 0質量⁰ /₀である。さらには、 0. 0001〜； 10質量％が好ましぐより好ましくは 0. 000；!〜 5質量％であり、さらに好ましくは 0. 00；!〜 5質量％であり、一層好ましくは 0. 0；!〜 5質量％、特に好ましくは 0.；!〜 5質量％である。

実施例

[0026] 以下に、ォォハマボウ抽出物の調製例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤等としての処方例についてさらに詳細に説明する力 S、本発明の技術的範囲はこれらによりなんら限定されるものではない。

[0027] <抽出方法 1 :エタノール抽出物〉

ォオノ、マボウの葉または樹皮を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の 20倍量の 50質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら 2時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、抽出物を得た。

[0028] <抽出方法 2 :熱水抽出物 >

ォオノ、マボウの葉または樹皮を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の 20倍量の精製水を加え、オートクレーブにより 20分間、 120°Cに加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、抽出物を得た。

[0029] <ヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のように真皮線維芽細胞賦活作用を評価した。

倉敷紡績 (株)製正常ヒト真皮線維芽細胞を、 1ゥエルあたり 2. 0 X 10⁴個となるように 96ウェルマイク口プレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)に 1質量％のゥシ胎児血清（FBS)を添加したものを用いた。 24時間培養後、 1質量°/ 83添加 DMEM培地により表 1に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに 48時間培養した。上清を除いた後、 3— (4, 5—ジメチルー 2—チアゾリル） - 2, 5—ジフエニルテトラゾリゥムブロミド（MTT試薬）を 400〃 g /ml含有する培地に交換し、約 2時間培養した。その後、テトラゾリゥム環の開環により生じるフオルマザンを 2—プロパノールにより抽出し、マイクロプレートリーダーで 55 Onmの吸光度を測定した。同時に、濁度として 650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。

得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を 100としたときの相対値により表 1に示す。

[0030] [表 1] 試料添加濃度（mg/ml ) % of contro l

コン卜ローノレ 100

0. 03 1 11

0. 06 1 19

0. 13 130

0. 25 161

0. 5 241

[0031] 表 1より明ら力なように、ォォハマボウ抽出物を添加した培地では、有意な真皮線維皮芽細胞賦活効果が認められた。

[0032] <ヒト表皮細胞賦活作用の評価〉

上記抽出方法 2で得られたォォハマボウ葉熱水抽出物を用いて、以下のように表皮細胞賦活作用を評価した。

ヒト表皮未全角化細胞を、 1ゥエルあたり 2. 0 X 10⁴個となるように 96ウェルマイク口プレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)に 5質量％のゥシ胎児血清 (FBS)を添加したものを用いた。 24時間培養後、 5質量°/^8 S添加 DMEM培地により表 2に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに²⁴時間培養した。上清を除いた後、 MTT試薬を 100 gZml含有する培地に交換して約 2時間培養した。その後、テトラゾリゥム環の開環により生じるフォノレマザンを 2—プロパノールにより抽出し、マイクロプレートリーダーで 550nmの吸光度を測定した。同時に、濁度として 650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。

得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を 100としたときの相対値により表 2に示す。

[0033] [表 2]

[0034] 表 2より明らかなように、ォォハマボウ抽出物を添加した培地では、有意な表皮細胞賦活効果が認められた。

[0035] <ヒト真皮繊維芽細胞コラーゲン産生作用の評価〉上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のように真皮線維芽細胞コラーゲン産生作用を評価した。

正常ヒト真皮繊維芽細胞を、 1ゥエルあたり 2. 0 X 10⁴個となるように 96ウェルマイク口プレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)に 5 質量％のゥシ胎児血清（FBS)を添加したものを用いた。 24時間培養後、 0. 5質量 %FBS添加 DMEM培地により表 3に示す試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに 24時間培養した。

培養上清中に分泌されたタイプ Iコラーゲン定量には ELISA法を用い、最後は標識されたペルォキシダーゼに対し 2, 2' アジノビス（3 ェチルベンゾチアゾリンー 6—スルホン酸）ジアンモニゥム塩 (ABTS)および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより 405nmの吸光度を測定した。

PIERCE社製 BCA Protein Assay Kitによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプ Iコラーゲン産生量を求めた。

得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプ Iコラーゲン産生量を 100としたときの相対値により表 3に示す。

[表 3]

[0037] 表 3より明らかなように、ォオノ、マボウ抽出物を添加した培地では、有意な真皮繊維芽細胞コラーゲン産生効果が認められた。

[0038] <ヒト表皮細胞コラーゲン産生作用の評価〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のように表皮細胞コラーゲン産生作用を評価した。

ヒト表皮未全角化細胞を、 1ゥエルあたり 2. 0 X 10⁴個となるように 96ウェルマイク口プレートに播種した。播種培地には、ダノレべッコ改変ィーグノレ培地（DMEM)に 5質量％のゥシ胎児血清（FBS)を添加したものを用いた。 24時間培養後、 5質量°/^8 S添加 DMEM培地により表 4に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに 5日間培養した。

培養上清中に分泌されたタイプ IVコラーゲン定量には、 IV型コラーゲンに対するモノクローナル抗体 (認識部位： _α 2鎖）およびビォチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ ELIS Α法を用い、アビジン化ホースラディッシュペルォキシダーゼを添カロし、 3, 3' , 5, 5'—テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダ一により 650nmの吸光度を測定した。

PIERCE社製 BCA Protein Assay Kitによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプ IVコラーゲン産生量を求めた。

得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプ IVコラーゲン産生量を 100としたときの相対値により表 4に示す。

[表 4]

[0040] 表 4より明らかなように、ォオノ、マボウ抽出物を添加した培地では、有意な表皮細胞コラーゲン産生効果が認められた。

[0041] <ァロマターゼ活性促進作用の評価〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のようにァロマターゼ活性促進作用を評価した。

表 5に示す各試料濃度に調製したサンプル溶液 4 1に、 NADP +、 MgCl、ダル

2 コース 6—ホスフェート、グルコース 6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびコントロール昆虫細胞膜タンパクの混合溶液（CPY19/MFC ハイスループット 'インヒビター-スクリーニングキット (High Throughput Inhibitor Screening Kit)、 BD Bios ciences社製） 96 1を添加し、 10分間 37°Cに加温した。 15nM CPY19 (ァロマタ一ゼ）、 50 M 7 メトキシ一 4 トリフルォロメチルクマリン（基質）溶液 100 1を添加し、 30分間 37°Cに加温した。 lOOmMトリス塩基 75 1を添加し、反応を停止させた。励起波長 409nm、発光波長 530nmにおいて蛍光測定を行った。 7—メトキシー 4 —トリフルォロメチルクマリンは CYP19により分解され、 7—ヒドロキシ一 4—トリフルォロメチルクマリンが生成して蛍光を生じるため、蛍光測定によりァロマターゼ活性促進能の定量を行った。

得られた結果を、試料無添加のコントロールにおけるァロマターゼ活性促進作用を 100としたときの相対値により、表 5に示す。

[表 5]

Pく 0.01、 * : 0.01く Pく 0.05

[0043] 表 5より明らかなように、ォォハマボウ抽出物には、有意なァロマターゼ活性促進作用が認められた。

[0044] <ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用の評価〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のように表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。

正常ヒト表皮メラニン細胞を、 1ゥエルあたり 3. 0 X 10⁴個となるように 96ウェルマイク口プレートに播種した。播種培地には、倉敷紡績 (株）製 Medium 154Sを用いた。 2 4時間培養後、 Medium 154Sにより表 6に示す各試料濃度に調整したサンプノレ培養液に交換し、さらに 48時間培養した。次に 1質量％1¾101 — Xを含有するリン酸緩衝液 75 1に交換して細胞を完全に溶解させ、内 50 1を粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる 0. 05質量％し—ドーパ含有リン酸緩衝液 50 / を加え、 37 °Cで 2時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の 405nmの吸光度を測定し、各測定値を次式に導入して、生成されたドーパメラニン量を求めた。

ドーノメラニン生成量 =

{ (反応後 405歷値—反応前 405腹値）— 2. 166 }/5. 238

また、 PIERCE社製 BCA Protein Assay Kitによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのメラニン生成量を求めた。試料無添加の場合をコントロールとした。結果を表 6に示す。

[0045] [表 6]

[0046] 表 6より明らかなように、ォオノ、マボウ抽出物を添加した培地では、メラニン産生量の低下が認められ、優れたチロシナーゼ活性阻害作用が認められた。

[0047] < B16マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のようにメラニン産生抑制作用を評価した。

B16マウスメラノーマ細胞（B16F0細胞）を 1ディッシュあたり 1 · 8 X 10⁴個となるように 90mmディッシュに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（DME M)に 5質量％ゥシ胎児血清 (FBS)を添加したものを用いた。 24時間培養後、 5質 i%FBS添加 DMEM培地により表 7に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに 5日間培養した。培養終了後、トリプシン処理により細胞を剥離し、 1 . 5mlマイクロチューブに移して遠心操作して、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物の色を、下記の判定基準に基づいて、その黒化状況を目視判定した。評価は 5段階評価とし、ネガティブコントロール（判定 5)に試料無添加の 5質量°/(^83添加 DME M培地、ポジティブコントロール（判定 1)に乳酸ナトリウムを 50mM含有する 5質量％ FBS添加 DMEM培地を用いた。

また、メラニン産生量を評価するために、沈殿物に細胞溶解剤 Solvable (株式会社パーキンエルマ一ジャパン)を加えて煮沸し、室温に戻して分光光度計（(株）日立ハイテクノロジーズ製分光光度計 U— 3010)により 500nmにおける吸光度を測定した。

得られた結果を表 7に示す。

[0048] <目視評価の判定基準 > 判定沈殿物の色

1 ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白）

2 ポジティブコントロールより僅かに黒化する（うす!/、褐色）

3 ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色） 4 ネガティブコントロールと比べやや黒化が抑制されている（黒褐色) 5 ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒）

[0049] [表 7]

[0050] 表 7より明らかなように、ォオノ、マボウ抽出物を添加した培地では、有意なメラニン産生抑制効果が認められた。

[0051] < DPPHラジカル消去による抗酸化作用の評価〉

上記抽出方法 2で得られたォオノ、マボウ樹皮熱水抽出物を用いて、以下のように D ΡΡΗラジカル消去による抗酸化作用を評価した。

50質量％エタノールを用いて、表 8に示す各試料濃度となるように試料溶液を調整し、 96ウエノレマイクロプレートに 100〃 1ずつ添カロした。そこへ、 0. 2mMの 1 , 1ージフエニル— 2—ピクリルヒドラジル（DPPH)エタノール溶液を 100〃 1ずつ添加し、よく混合後、室温、暗所にて 24時間静置した。最後に、 DPPHラジカルに由来する 516 nmの吸光度を測定した。

試料を添加しな力た場合の吸光度を (A)、試料を添加した場合の吸光度を (B)としたとき、 DPPHラジカルの消去率を次式より求めた。

ラジカル消去率 = { 1一（B) / (A) } X 100

結果を表 8に示す。

[0052] [表 8] 試料添加濃度（m_g/ml) Scavenging Act i v i ty (%)

1 85

10 96 [0053] 表 8より明らかなように、ォォハマボウ抽出物には、優れた DPPHラジカル消去効果が認められた。

[0054] < SOD様活性評価（スーパーオキサイドァニオン消去能の評価）〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のように SOD様活性を評価した。

0. 25mM WST— 1および ImM Hypoxanthineを含む HANK' S ( + )溶液 7 511 1に、 HANK' S ( + )溶液により表 9に示す各試料濃度に調製したサンプル溶液 2 5〃1を添カロした。さらに、キサンチンォキシダーゼ 25 ^ 1 (0· 0075 Units)を添加し、 37°C、 15分間反応させた後、 450nmの吸光度を測定した。サンプル溶液に代えて HANK' S ( + )溶液のみを添加した場合の吸光度を (A)、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を (B)としたとき、スーパーオキサイドァニオン消去率は次式に定義される。

消去率（％) = { 1— (B) / (A) } X 100

得られた結果を表 9に示す。

[0055] [表 9]

[0056] 表 9より明らかなように、ォォハマボウ抽出物には、優れたスーパーオキサイドァニオン消去効果が認められた。

[0057] <ホスホリパーゼ A (PLA )阻害作用の評価） >

2 2

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のようにホスホリパーゼ A (PLA )阻害作用を評価した。

2 2

最終濃度 60ng/mlとなるよう調整したホスホリパーゼ A (PLA )と表 10に示す濃

2 2

度に調製したサンプル、 10mMとなるように調整した DTNB (5, 5—ジチォビス（2— ニトロ安息香酸)を混合し、室温で 10分間静置した。さらに基質として 1. 66mMのジヘプタノィルチオ— PC (Diheptanoyl Thio— PC)を添加し、室温で 45分間反応させた後、 414nmの吸光度を測定した。また、 PLA溶液にかえてバッファーのみを添加した場合の吸光度を測り、両測定値の差を求めた。サンプル無添加のコントロールの値を (A)、サンプル添加時の値を (B)としたとき、 PLA酵素阻害作用は次式に定

2

我れる。

消去率（％) = { 1— (B) / (A) } X 100

得られた結果を表 10に示す。

[表 10]

[0059] 表 10より明らかなように、ォォハマボウ抽出物には、優れた PLA酵素阻害作用が

2

認められた。

[0060] <ヒアルロニダーゼ阻害作用の評価）〉

上記抽出方法 1で得られたォオノ、マボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のようにヒアルロニダーゼ阻害作用を評価した。

市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を 0. 9mg/mlになるように、 0. 1 Mリン酸緩衝液 (ρΗ7· 0)に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ゥシ精巣由来）を 5, 300 unit/mlとなるように、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 0)に溶解し、酵素溶液とした。酵素溶液は用時調製とした。

緩衝液で表 11に示す各試料濃度に調製したサンプル溶液 0. lml,および酵素溶液 0. 03mlを試験管に入れ、 37°Cで 20分間反応させた。次に、活性化剤を 0. 06m 1加え、 37°Cで 20分間反応させた。さらに、基質溶液を 0. 15ml加え、 37°Cで 1時間反応させた。 0. 4Nの NaOH水溶液 0. 06mlを加えて反応を停止させた後、すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液 (pH9. 1)を 0. 06ml添加し、 3分間煮沸した後、さらに氷冷した。 p— DABA(p—ジメチルァミノべンズアルデヒド）溶液を 2· 0ml添加し、 37°Cで 2 0分間反応させた後、各試験管から 96ウェルマイク口プレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて 585nmにおける吸光度を測定した。コントロールには、サンプル無添加の緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると、分解産物である N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc)が減少し、 p— DABAによる吸光度が低くなる。ヒアルロニダーゼ阻害作用は、次式に定義される。阻害率（％)

= (コントロール吸光度一サンプノレ吸光度） zコントロール吸光度結果を表 11に示す。

[0061] [表 11]

[0062] 表 11より明らかなように、ォォハマボウ抽出物には、優れたヒアルロニダーゼ活性の阻害作用が認められた。

続いて、本発明を実施した処方例を示す。

[実施例 1]乳液

[表 A]

( 1 ) スクヮラン 0. 0 (質量％)

( 2 ) メチルフエュルポリシロキサン 4. 0

( 3 ) 水素添加パーム核油 0. 5 (4 ) 水素添加大豆リン脂質 0. 1

( 5 ) モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン E. o .)

1. 3

(6) モノステアリン酸ソルビタン 1. 0

( 7 ) グリセリン 4. 0

( 8 ) パラォキシ安息香酸メチル 0. 1

(9) カルボキシビ二ルポリマ一 0. 1 5

(10) 精製水 1 0 0とする残部

(11) アルギニン（ 1質量％水溶液） 2 0. 0

(12) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 1、葉） 3. 0 製法：（1)〜（6)の油相成分を 80°Cにて加熱溶解する。一方（7)〜（10)の水相成分を 80°Cにて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザ一により均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11)と（12)を順次加え、均一に混合する。

[0064] [実施例 2]化粧水

[表 B] ( 1 ) ェタノ一ノレ 1 5. 0 (質量％)

(2) ポリオキシエチレン（4 0 E. O. ) 硬化ヒ 7シ油 0. 3

(3) 香料 0. 1

(4) 精製水 1 0 0とする残部

(5) クェン酸 0 · 0 2

(6) タエン酸ナトリウム 0. 1

( 7) グリセリン 1. 0

(8) ヒドロキシェチノレセノレロース 0. 1

(9) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、葉） 5. 0 製法：（1)に（2)及び（3)を溶解する。溶解後、（4)〜（8)を順次添加した後、十分に攪拌し、（9)を加え、均一に混合する。

[実施例 3]クリーム

[表 C]

( 1 ) スクヮラン 1 0. 0 (質量

(2) ステアリン酸 2. 0

( 3 ) 水素添加パーム核油 0. 5

(4) 水素添加大豆リン脂質 0. 1

( 5) セタノール 3. 6

(6) 親油型モノステアリン酸グリセリン 2. 0

( 7) グリセリン 1 0. 0

(8) パラォキシ安息香酸メチル 0. 1

( 9) アルギニン（ 2 0質量％水溶液） 1 5. 0

(10) 精製水 1 0 0とする残部

(11) カルボキシビュルポリマー（ 1質量％水溶液） 1 5. 0

(12) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 1、菜） 5. 0 製法：（1)〜（6)の油相成分を 80°Cにて加熱溶解する。一方（7)〜（10)の水相成分を 80°Cにて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザ一により均一に乳化する。乳化終了後、（11)を加え、冷却を開始し、 40°Cにて（12) を加え、均一に混合する。

[実施例 4]美容液

[表 D] 精製水 0 0とする残部（質量％) グリセリン 0 0

ショ糖脂肪酸エステル 3

(4 カルボキシビ二ルポリマー（ 1質量。 /₀水溶液） 7 5 (5 アルギン酸ナトリウム（ 1質量％水溶液） 5 0 (6 モノラウリン酸ポリグリセリル 0 ( 7 マカデミアナツッ油脂肪酸フィトステリル 3 0 (8 N-ラゥロイル- L-グルタミン酸ジ（フィトステリル. 2—ォクチルドデシル）

2. 0

(9) 硬化パーム油 2. 0

(10) スクヮラン（オリーブ由来） 1. 0

(11) ベへ-ノレアルコ一ル 0. 7 5

(12) ミツロウ 1. 0

(13) ホホノ油 1. 0

(14) 1、 3—プチレングリコール 1 0. 0

(15) L_アルギニン（ 1 0質量％水溶液） 2. 0

(16) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、葉） 5. 0 製法：（1)〜（6)の水相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解する。一方、（7)〜（14)の油相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、 50°Cにて（15)を加える。さらに 40°Cまで冷却し、（16)を加え、均一に混合する。

[0067] [実施例 5]水性ジエル

[表 E]

( 1 ) カルボキシビ二ルポリマ一 0 . 5 (質量。/。）

(2) 精製水 1 00とする残部

( 3 ) 水酸化ナトリウム（ 1 0質量％水溶液） 0 . 5

(4) エタノール 1 0 . 0

(5) パラォキシ安息香酸メチル 0 . 1

(6) 香料 0 . 1

( 7) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、葉） 3 . 0

(8) ポリオキシエチレン（ 6 0 E. O. ) 硬化ヒ " = 7シ油 1. 0 製法：（1)を（2)に加え、均一に攪拌した後、（3)を加える。均一に攪拌した後、（4) に予め溶解させた（5)を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（6)〜（8) を加え、均一に攪拌混合する。

[0068] [実施例 6]クレンジング料

[表 F] ( 1 ) スクヮラン 8 1. 0 (質量⁰ /。）

(2) イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル 1 5. 0

( 3 ) 精製水 1 0 0とする残部

(4) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 1、樹皮） 4. 0 製法：（1)と（2)を均一に溶解する。これに、（3)と（4)を順次加え、均一に混合する。

[実施例 7]洗顔フォーム

[表 G]

( 1 ) ステアリン酸 1 6 (質量％)

( 2 ) ミリスチン酸 1 6

(3) 親油型モノステアリン酸グリセリン 2

( 4 ) グリセリン 2 5

( 5 ) 水酸化ナトリウム

(6 ) ヤシ油脂肪酸アミドプロピルべタイン

( 7) 精製水 00とする残部

(8) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、樹皮） 5. 0 製法：（1 4)の油相成分を 80°Cにて加熱溶解する。一方（5)〜 7)の水相成分を 80°Cにて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、 40°Cにて (8)を加え、均一に混合する。

[実施例 8]メイクアップベースクリーム

[表 H]

( 1 ) スクヮラン 1 0 . 2 (質量。 /₀)

(2) セタノー 2 . 0

(3) グリセリントリ一 2—ェチルへキサン酸エステル 2 . 5

(4) 親油型モノステアリン酸グリセリル 1 . 0

( 5) プロピレングリコ一ル 1 1 . 0

(6) ショ糖脂肪酸エステル 1 . 3

( 7) 精製水 1 0 0とする残部

(8) 酸化チタン 1 . 0

( 9) ベンガラ 0 . 1

(10) 黄酸化鉄 0 . 4

(11) 香料 0 . 1

(12) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、葉） 3 . 0 製法： (1 4)の油相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解する。一方、（5 7)の水相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解し、これに（8) 10)の顔料を加え、ホモミキサ一にて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、 40°Cにて（11)と（12)の成分を加え、均一に混合する。 [実施例 9]乳液状ファンデーション

[表 I]

1 ) メチ^^ボリシロキサン 2 . 0 (質量％)

2) スクヮラン 5 . 0

3) ミリスチン酸オタチルドデシル 5 . 0

4) セタノー 1 . 0

5) ポリオキシエチレン（ 2 0 E. O. ) ソルビタンモノステアリン酸エステル

1 . 3

6) モノステアリン酸ソルビタン 0 . 7

7) 1、 3—ブチレングリコール 8 . 0

8) キサンタンガム 0 . 1

9) パラォキシ安息香酸メチル 0 . 1

10) 精製水 1 0 0とする残部

11) 酸化チタン 9 . 0

12) タルク 7 . 4

13) ベンガラ 0 . 5

14) 黄酸化鉄 1 . 1

15) 黒酸化鉄 0 . 1

16) 香料 0 . 1

17) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 1、葉） 4 . 0 製法：（1 6)の油相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解する。一方、（7)〜（10)の水相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解し、これに（11)〜 15)の顔料を加え、ホモミキサ一にて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、 40°Cにて（16)と（17)の成分を順次加え、均一に混合する。

[実施例 10]油中水型ェモリエントクリーム

[表 J]

( 1 流動バラフィン 3 4 0 (質量％)

( 2 マイクロクリスタリンワックス 2 0

( 3 ワセリン 5 0

(4 ジグリセリンォレイン酸エステル 5 0

(5 塩化ナトリウム 3

(6 塩化力リウム 0

( 7 プロピレングリコール 3 0

(8 1、 3—ブチレングリコール 5 0

( 9) パラォキシ安息香酸メチル 0

(10) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 1 , 3 0

(11) 精製水 00とする残部

(12) 香料 0. 1 製法：（5)と（6)を（11)の一部に溶解して 50°Cとし、 50°Cに加熱した (4)に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、 70°Cにて加熱溶解した（1 3)に均一に分散する。これに、（7)〜（10)を（11)の残部に 70°Cにて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、 40°Cにて（12) を加え、均一に混合する。

[実施例 11]パック

[表 K]

( 1 ) 精製水 1 00とする残部（質量％)

( 2) ポリビュルアルコール 1 2. 0

( 3 ) ェタノール 1 7. 0

(4) グリセリン 9. 0

(5 ) ポリエチレングリコール（平均分子量 1 0 0 0) 2. 0

(6 ) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、葉） 5. 0

( 7) 香料 0. 1 製法：（2)と（3)を混合し、 80°Cに加温した後、 80°Cに加温した（1)に溶解する。均一に溶解した後、（4)と（5)を加え、攪拌しながら冷却を開始する。 40°Cまで冷却し、 (6)と（7)を加え、均一に混合する。

[0074] [実施例 12]入浴剤

L]

( 1 ) 香料 0 3 (質量％)

( 2 ) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 1、樹皮） 3 . 0

( 3) 炭酸水素ナトリウム 5 0. 0

(4) 硫酸ナトリウム 4 6. 7 製法：（1)〜(4)を均一に混合する。

[0075] [実施例 13]ヘアーワックス

[表 M]

( 1 ) ステアリン酸 3. 0 (質量％)

(2) マイクロクリスタリンワックス 2. 0

(3) セチゾレアノレコーノレ 3. 0

(4) 高重合メチルポリシロキサン 2. 0

(5) メチルポリシロキサン 5. 0

(6) ポリ（ォキシエチレン ' ォキシプロピレン）メチルポリシ！: ²キサン共重合体

1. 0

( 7) パラォキシ安息香酸メチル 0. 1

(8) 1、 3—ブチレングリコール 7. 5

(9) アルギニン 0. 7

(10) 精製水 1 0 0とする残部

(11) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、樹皮) 4. 0

(12) 香料 0. 1 製法：（1)〜（6)の油相成分を混合し、 75°Cにて加熱溶解後する。一方、（7)〜（10) の水相成分を 75°Cにて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、 40°Cにて（11)と（12)の成分を加え、均一に混合す

[0076] [実施例 14]ヘアートニック

[表 N] ) ェタノール (質量％) 精製水とする残部ォォハマボウ抽出物（抽出方法、葉）

香料製法：（1)〜（4)の成分を混合、均一化する。

[0077] [実施例 15]錠剤

[表 0] ) コーンスターチ (質量％) ) 結晶セルロース

カルボキシメチルセルロースカルシウム

無水ケィ酸

ステアリン酸マグネシウム

ォォハマボウ抽出物（抽出方法、葉）製法：（1)〜（6)を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して、 1錠 200mgの錠剤を得

[0078] [実施例 16]散剤

[表 P] ケィ酸アルミン酸マグネシウム (質量％) カルボキシメチルセルロースカルシウム

ォォハマボウ抽出物（抽出方法、葉）製法：（1)〜（3)の粉体を混合後、粉砕機にて粉砕し、均一に分散する。

[0079] [実施例 17]キャンデー

[表 Q] ) 白糖 (質量⁰ /。） ) 水飴

ォォハマボウ抽出物（抽出方法、葉）

) 香料製法：（1)と（2)を加熱混合 ·均一化した後冷却し、 70°Cで成分（3)と（4)を添加し、混合均一化した後成型する。

[0080] [実施例 18]ドリンク剤

[表 R]

( 1 ) アミノエチルスルホン酸 1 0 0 0 m g

(2) 硝酸チアミン 1 0 m g

(3) リン酸リボフラビンナトリゥム 5 m g

(4) 塩酸ピリドキシン 1 0 m g

(5) 無水カフエイン 50 m g

(6 ) クェン酸 2 50 m g

( 7) D—ソルビト—ル液 8 g

(8) ォォハマボウ抽出物（抽出方法 2、葉） 1 0 m g

( 9 ) 香料微量

(10) 精製水全体を 1 0 0 mLとする量製法：（1)〜（9)を順次（10)に添加し、均質化する。

[0081] 本発明によれば、ォオノ、マボウまたはその抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤を提供することができる。

さらに、ォオノ、マボウまたはその抽出物を化粧料、外用医薬品等の皮膚外用剤（または外用組成物）や食品等の経口用組成物に配合することにより、シヮ、タルミ、肌のノ、リまたは皮膚の弾力低下、シミ、くすみといつた種々の皮膚症状の発現防止ゃ改善に優れた効果を発揮する、様々な組成物を提供することができる。

[0082] 本願の開示は、 2006年 9月 6日に出願された特願 2006— 241623号に記載の主題と関連しており、それらのすべての開示内容は引用によりここに援用される。

既に述べられたもの以外に、本発明の新規かつ有利な特徴から外れることなぐ上記の実施形態に様々な修正や変更を加えてもよいことに注意すべきである。したがつて、そのような全ての修正や変更は、添付の請求の範囲に含まれることが意図されている。

Claims

請求の範囲

[1] ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤。

[2] ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を有効成分とする美白剤。

[3] ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。

[4] ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤。

[5] ォォハマボウ（Glias nueberthii)またはその抽出物を含む組成物。

[6] 外用組成物または経口用組成物である請求項 5記載の組成物。

[7] 老化防止改善用皮膚外用剤である請求項 5または 6記載の組成物。