WO2008026591A1

WO2008026591A1 - Bactericidal agent against pathogenic bacterium of periodontal disease comprising red longhorn beetle frass as active ingredient

Info

Publication number: WO2008026591A1
Application number: PCT/JP2007/066669
Authority: WO
Inventors: Kuniyasu Ochiai; Seishiroh Mochizuki; Hirotaka Kishida; Kouichi Nomura
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2006-08-28
Filing date: 2007-08-28
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2009-02-28
Also published as: JP2009274957A

Description

明細書

ベニ力ミキリフラスを有効成分とする歯周病原菌殺菌薬

技術分野

[0001] 本発明は、歯周病原菌用殺菌薬歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬に関するものである。

背景技術

[0002] 歯周病は、 40才以上の国民の約 80%が罹患する、いわば国民病である。

近年、アメリカで行われた大規模な疫学調査から、重症の歯周病患者は、動脈硬化、肺炎の発症率が高いばかりでなぐ歯周病が糖尿病や早産にも深く関係することが判明した。歯周病が全身疾患の原因及び誘因となり、さまざまな慢性疾患を引き起こす可能性が強く指摘されている。高齢者の増加と共に、歯周病患者はますます増加傾向にあり、対策が急務である。

口腔内には、約 700種、 60億の細菌が常在する力歯周病は、歯肉溝内に生息する嫌気性グラム陰性桿菌により発症することが知られている。歯周病は単独の細菌で発症する感染症ではなぐ一群の弱毒菌により長期間の潜伏の後に発症する。歯周病原細菌は、多くの細胞に毒性を示す内毒素、直接免疫担当細胞を破壊する白血球毒素、及び、歯肉組織を破壊するタンパク分解酵素、コラーゲン分解酵素など多くの病原因子を産生する。

従って、個々の病原因子の排除による予防は困難であり、病原菌の増加を防止する必要がある。

しかし、これらの原因菌は、常在菌の一種と考えられ、口腔内の正常細菌がつくる正常歯垢 (プラーク）、つまり、バイオフィルムに付着し、歯周病原細菌優勢で強固な病原性バイオフィルムを形成する。

このバイオフィルムの除去は極めて困難で、専門的歯面清掃、つまりスケーリング、によるプラークコントロールが最善の方法である力定期的な通院が必要となる。従つて、高齢者や時間的に拘束される勤労者には困難であることが多ぐ簡便に、歯周病原菌の増殖を抑制する薬剤などの開発が急務である。 [0003] 現在、う蝕と歯周病の口腔感染症予防目的で行われて!/、るプラークコントロールは、スケーリングが最も有効な方法とされる力このスケーリングは専門的な技術が必要とされる。従って、日常的な口腔感染症予防は、歯磨剤を用いたブラッシングが中心となる。

[0004] 歯磨剤と共に口腔感染症予防薬として殺菌薬を使用できる。また、洗口液に殺菌薬を添加したものを使用できる。この殺菌薬を用いる場合には、以下の問題点が指摘され、使用は限定的なものになっている。

薬剤である殺菌薬としては、ダルコン酸クロールへキシジンがある。歯面に吸着し、長期使用により歯の着色や歯石沈着を起こす欠点が指摘されており、良好な薬剤と言うことができない。

ポビドンョード薬は、殺菌効果は強いものの、強い粘膜刺激作用がある。また、一部では酵素製剤を含む歯磨剤が使用されて!/、るが、強!/、効果は望めなレ、。

その他に、抗生薬を使用することがある力長期使用により耐性菌が出現するため、菌交代症の原因となり、短期的な治療目的以外の使用は困難であり、避けること力 S 必要である。

[0005] 以上のことを前提として、殺菌効果の強い天然物の開発が必要とされる。

口腔には、正常歯垢細菌として多数を占めるレンサ球菌群と、通常菌数は少ないものの、歯垢の増加と共に病原性を発揮する細菌群とが常在して!/、る。

前者には、歯面や粘膜面に付着し、外来性細菌の定着を阻害する有益な、 Strepto coccus mitisなどのグラム陽性レンサ球菌群が含まれる。

後者に (ュ、 ¾周病原細菌の Porphyromonas gingivalis (FDC 381、 Porphyromonas gingivalis

(ATCC 53978)、 Prevotella intermedia (ATCC

25611) などの嫌気性グラム陰性菌が含まれる。

従って、抗菌薬開発には、前記の全ての細菌に対して作用する抗菌薬は有効であるということはできず、前者の有益な常在細菌群には極力影響が少なぐ後者の歯周病原細菌に強い抗菌作用を発揮する特性を有する薬剤の開発が必要となる。

[0006] 従来、行われた抗歯周病の医薬には以下の例が知られている。特許文献 1は、「ω—ァルケ二ルイソチオシアナート、 ω—アルキルチオアルキルィソチオシアナート、 ω—フエニルアルキルイソチオシアナートを含む（わさび成分）抗歯周病剤」である。

困 JSJi丙原困殺困薬力メ寸象とする—困（ま、 Porphyromonas gingivalis、 Actinobacillus ac tinomycetemcomitans、 Fusobactenum nucleatum、及び Prevoteha nigrescens (Z) ¾ 周病原因菌であることを述べている。この発明は、口腔レンサ球菌に対する作用についても同等に作用するものであると考えられる。薬剤の作用の点では、歯周病原因菌と口腔レンサ球菌に同等に作用してしまう結果となる。

同様に、「ポリフエノール及び特定のリグナン類からなる歯周病予防又は治療用組成物」である発明（特許文献 2)について同じことが指摘できる。また、ポリフエノールそのものが、抗ぅ蝕及び抗歯周病組成物として用いられてきた（特許文献 3、特許文献 4、特許文献 5)。

「松樹皮、ローズバヅッ、ライチ種子から選ばれる少なくとも 1種の植物の抽出物を、病原菌や免疫細胞が放出するプロテアーゼを阻害することができるプロテアーゼ阻害剤として含有する口腔用組成物」（特許文献 6)、「ラタトフエリンとゥシ初乳及びゥシ初乳の免疫グロブリン濃縮物を用いる新規齲歯と歯周病治療用医薬組成物」（特許文献 7)、「システィンプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、歯周病、又は細菌 •ウィルス感染症などのいずれかであるシスティンプロテアーゼ阻害剤」（特許文献 8) 、「炭素数 11〜； 16の δ —ラタトンから選ばれる少なくとも 1種のラタトン類を有効成分とする歯周病原菌の付着抑制剤。」（特許文献 9)、「ジヒドロフアルネソール、イソカンフィルシクロへキサノールなどから選ばれた口腔用組成物に添加するための抗菌香料。」（特許文献 10)、「特定構造の大環状ラタトンを含有する抗菌性口腔用組成物及び虫歯菌と歯周病菌に対して増殖抑制能を有する前記抗菌性口腔用組成物」（特許文献 11 )など知られて!/、る。

いずれも歯周病原菌殺菌薬として選択的に作用することを述べるものではない。竹成分を用いる特許には、特許文献 12がある。

これは、「油性基剤 (Α)及び竹酢液 (Β)、そして必要に応じて水（C)及び乳化剤（ D)を含有する油中水型ェマルジヨン組成物であることを特徴とする竹酢液のクリーム状状組組成成物物」」ででああるる。。技技術術的的なな内内容容ととししてて、、本本発発明明とと相相違違すするる。。

特特許許文文献献 1133はは、、孟孟宗宗竹竹抽抽出出物物ななどどとと εε ——ポポリリリリジジンンをを組組みみ合合わわせせてて用用いいるるももののででああるる。。又又、、対対象象ととすするる菌菌はは、、「「うう蝕蝕のの原原因因はは、、主主ととししててスストトレレププトトココッッカカスス''ミミュューータタンンスス（（SSttrree ppttooccooccccuuss mmuuttaannss))のの増増殖殖力力ままたた歯歯周周病病のの原原因因はは、、主主ととししててボボルルフフイイロロモモナナスス ''ジジンンジジババリリスス（（PPoorrpphhyyrroommoonnaass ggiinnggiivvaalliiss))ゃゃァァククチチノノババシシララスス ..ァァククチチノノミミセセテテムムココミミタタンンスス ((AA ccttiinnoobbaacciilllluuss

[0008] 以上の従来技術をみても明らかなように、口腔に用いられる医薬は従来口腔レンサ球菌と歯周病原細菌の両方を対象とするものであり、口腔レンサ球菌に対する殺菌作用が弱ぐ歯周病原細菌に対して十分に殺菌作用するといつた両方の菌に対して相違する作用の医薬は従来存在せず、新しい医薬の開発が望まれていた。

[0009] 図 6は歯垢の形成機序を示す図である。

歯垢は、口腔内微生物、特に細菌が増殖する場であり、口腔内の最も高い病原性因子の一つである。歯垢の形成機序は、まず歯に最初に付着する細菌（Streptococc usなど、図 6の A群）が歯の表面に定着し、初期歯垢を形成する。

形成された初期歯垢に対して付着を起こす細菌は、前記 Streptococcusなどと親和性が高い菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6の B群）である。これらの菌は、歯に最初に付着する菌とは異なり、直接歯の表面に定着することはない。しかし、これらの二次付着菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6の B群）の付着'凝集に伴い、歯垢の肥厚化及び成熟化が進む。

歯垢が肥厚化するにつれて歯垢内部は酸素濃度が低下する。この結果、前記二次付着菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6の B群）と親和性が高い歯周病原菌（Porphyromonasや Prevotellaなど、図 6の C群）が付着.凝集し、歯周病原性歯垢が形成される。成熟歯垢はバイオフィルムとしての性状を備えており、外部からの抗菌物質、抗体さらに化学療法薬などの浸透を阻害すると共に、内部の菌体成分、代謝産物などが宿主に対してさまざまな為害作用をもたらす。このような背景から、歯周病原性歯垢形成の阻止は、口腔内の病原性を低下させ、う蝕や歯周病のみならず、細菌性心内膜炎や誤嚥性肺炎などの全身性疾患の発症を抑えることができるので、非常に重要なことであると考えられる。この歯垢形成機序に対応して、歯周病原性歯垢形成の阻止を行なうことにより、口腔及び歯面の健康を維持しょうとするのであれば、歯に最初に付着する細菌（Strept ococcusなど、図 6の A群）には作用せず、選択的に、二次付着菌（Actinomycesや Fu sobacteriumなど、図 6の B群）及び歯周病原菌（Porphyromonasや Prevotellaなど、図 6の C群）に作用しこれらの付着や増殖を阻止することが有効な手段となる。

以上のことから、歯に最初に付着する細菌（Streptococcusなど、図 6の A群）には作用せず、 B群の二次付着菌、及び C群の歯周病原菌の付着や増殖を阻止することができる医薬の開発が必要とされている。

従来の技術では、必要なものは残し、排除する必要があるものだけを選択的に殺菌するような医薬にはなっておらず、的確に選択的に作用する医薬の開発が望まれている。

具体的には、口腔に用いられる医薬は、従来口腔レンサ球菌と歯周病原細菌の両方を対象とするものであった。そこで、歯周病原性歯垢形成の阻止をはかるうえで、歯に最初に付着する細菌と親和性が高い菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6の B群）及びこれらの細菌と親和性が高!/、歯周病原菌（Porphyromonasや Prevotella など、図 6の C群）に対して強い殺菌力を有している一方、口腔及び歯面の健康を維持する観点から、 A群の歯に最初に付着する細菌（Streptococcusなど、図 6の A群）に対しては殺菌力が弱い、歯周病原性歯垢形成の阻止薬が必要とされている。特許文献 1 :特開 2006— 131542号公報

特許文献 2：特開 2005— 162654号公報

特許文献 3：特開平 1 90124号公報

特許文献 4 :特開平 7— 285876号公報

特許文献 5：特開平 1 90124号公報

特許文献 6：特開 2005— 179206号公報

特許文献 7：特開 2003— 137809号公報

特許文献 8：特開 2005— 139084号公報

特許文献 9：特開 2003— 300850号公報

特許文献 10 :特開 2002— 265978号公報特許文献 11：特開 2001— 163744号公報

特許文献 12：特開 2005— 200393号公報

特許文献 13：特開 2004— 123630号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明の課題は、（a)歯周病の原因となる嫌気性グラム陰性桿菌に対しては強い殺菌力を有している一方、（b)口腔内に生息する正常歯垢細菌であるレンサ球菌群に対しては殺菌力が弱い歯周病原菌殺菌薬、この歯周病原菌殺菌薬を含む口腔衛生薬及びこの歯周病原菌殺菌薬を含む食品を提供することである。

又、本発明の課題は、（a)歯周病原性歯垢形成の阻止をはかるうえで、歯に最初に付着する細菌と親和性が高い菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6の B群）及びこれらの細菌と親和性が高い歯周病原菌（Porphyromonasや Prevotellaなど、図 6 の C群）に対して強い殺菌力を有している一方、（b)口腔及び歯面の健康を維持する観点から、 A群の歯に最初に付着する細菌（Streptococcusなど、図 6の A群）に対しては殺菌力が弱い、歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含む口腔衛生薬及びこの歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含む食品を提供することである。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者らは前記課題について鋭意研究し、以下のことを見出して、本発明を完成させた。本発明者らが薬剤として有効であることを見出したベニ力ミキリフラス抽出物について、歯周病原菌殺菌薬として歯周病原細菌に用いた場合は、 0. 1 %濃度でも 12〜； 15%の発育阻害効果が認められ、さらに、 0. 06%においても 10%の発育阻害効果があることを新たに見出した。

多くの口腔細菌と共凝集し、歯垢蓄積に重要な役割を果たす Actinomyces菌属に対しても、殺菌効果が認められ、 0. 25%添加で約 40%の発育阻害が認められた。一方、口腔の健康維持に必要な有益口腔レンサ球菌 Streptococcus gordonii、 Strept ococcus sanguinis Streptococcus oralis Streptococcus mitisにメ寸する^ 且タカ果は、培地への 0. 1 %を添加した場合では全く発育阻害効果が認められな力た。

また、本発明者らは前記課題について鋭意研究し、以下のことを見出して、本発明を完成させた。本発明者らが薬剤として有効であることを見出したベニ力ミキリフラス抽出物について、 ω歯周病原性歯垢形成の阻止をはかるうえで、歯に最初に付着する細菌と親和性が高い菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6の B群）及びこれらの細菌と親和性が高い歯周病原菌（Porphyromonasや Prevotellaなど、図 6の C 群）に対して強!/、殺菌力を有して!/、る一方、 S.mitis (図 6の A群）に対しての阻害率は 0. 50 %濃度でも 40 %以下であることを確認した。

以上のことから、ベニ力ミキリフラス抽出物は、前記の B群及び C群に対しては阻害率が高ぐ A群に対しては阻害率が低!/、作用を示して!/、ると!/、うこと力 Sできる。

[0013] 本発明によれば、以下の発明が提供される。

(1)ベニ力ミキリフラス成分を含む歯周病原菌用殺菌薬。

(2) (1 )記載の歯周病原菌用殺菌薬を含有することを特徴とする口腔衛生薬。

(3) (1 )記載の歯周病原菌用殺菌薬を含有することを特徴とする食品。

(4)ベニ力ミキリフラス成分を含むことからなる歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬。

(5) (4)記載の歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有することを特徴とする口腔衛生薬。

(6) (4)記載の歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有することを特徴とする食品。

発明の効果

[0014] 本発明によれば、ベニ力ミキリフラス成分を含む歯周病原菌殺菌薬、歯周病原菌殺菌薬を含有する口腔衛生薬、及び歯周病原菌殺菌薬を含有す食品が得られる。ベニ力ミキリフラス成分を 1重量％程度含有する場合には、グラム陽性レンサ球菌群及び歯周病原細菌に対して作用し、これらの全被検菌の発育をほぼ阻害する活性を有している。しかし、 0. 25%程度とすることにより歯周病原細菌に対して作用し 30力も 60

%と顕著な発育阻害活性があり、 0. 1 %程度とすることにより 10から 15%程度の阻害活性がある。一方、グラム陽性レンサ球菌群に対しては 0. 25%程度で阻害活性は 0から 40%であり、 0. 1 %程度でほとんど影響を与えない。以上のことから、本発明の医薬、それを含む口腔衛生薬及び食品は、歯周病原菌殺菌薬及び歯周病予防薬として有用である。

また、ベニ力ミキリフラス成分を含むことからなる歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬、前記歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有する口腔衛生薬並びに前記歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有することを特徴とする食品を得ることができる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]ベニ力ミキリフラス水抽出成分の歯周病菌発育阻害作用を示す図である。

[図 2]ベニ力ミキリフラス水抽出成分の歯垢形成菌発育阻害作用を示す図である。

[図 3]24穴マルチウエル'スクリーニング法による対照結果を示す図である。

[図 4]ベニ力ミキリフラス水抽出成分はグラム陽性菌に対する発育阻害作用を示す図である。 Actinomycesには有効である力 S、 Streptococcusには有効でないことを示す図である。

[図 5]ベニ力ミキリフラス水抽出成分はグラム陰性菌に対して高い発育阻害作用を示す図である。

[図 6]歯垢の形成'成熟の機序を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0016] ベニ力ミキリフラス及びべ二力ミキリフラス成分を用いる医薬については、本発明者らにより既に発明されている（特開 2003— 277276号)。本発明では、ベユカミキリフラス及びべ二力ミキリフラス成分を含むことからなる歯周病原菌用殺菌薬、歯周病原菌用殺菌薬を含有する口腔衛生薬、及び歯周病原菌用殺菌薬を含有する食品並びにべ二力ミキリフラス成分を含むことからなる歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬、前記歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有する口腔衛生薬並びに前記歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有する食品である。

[0017] 本発明の対象であるべ二力ミキリフラス及びべ二力ミキリフラス成分を取得するために用いられる原料の竹としては、モウソゥチク属、シホウチタ属、マダケ属、シュドササ属、ササモルファ属、ナリヒラタケ属、トウチク属などの竹類が用いられる。なかでも、マダケ属の孟宗竹及びノヽチタが好適に用いられる。これらの竹が切り取られ、放置されると、ベニ力ミキリ（Purpuricenus temminckii Guerin— Menevillel844)力、をつみつけ、その幼虫が竹類を食べて成長する。その成長過程で、排泄物を竹の中に残す。これをべ二力ミキリフラスと呼ぶ。このべ二力ミキリフラスを集めて、ベニ力ミキリフラス及びべユカミキリフラス成分を本発明の歯周病原菌殺菌薬などの対象物質とする。なお、ベニカミキリは、主に我が国では、本州（ャブツバキ帯ーブナ帯下部）、佐渡、四国、九州、 ¾岐、対馬などに分布し、春から夏にかけて出現する。

[0018] 竹から得られるベニ力ミキリフラスは、しっとりとした粒状の薄黄色を帯びた組成物として得られる。このべ二力ミキリフラスは、水分を含有するので、これを乾燥させることにより水分を取り除いて粉状体とすることができる。乾燥させるには、 30〜80°Cの条件下に行う。 80°Cを越える高温で処理すると、分解などを伴うので、好ましくない。この粉状のものを、ガーゼなどを用いて患部に直接接触させることにより、薬剤として使用すること力 Sできる。また、このべ二力ミキリフラスは、格別水分などを取り除くことなく、そのまま歯周病原菌殺菌薬として使用することもできる。また、このべ二力ミキリフラスから水又は有機溶媒により抽出されたべ二力ミキリフラス成分を歯周病原菌殺菌薬として用いること力 Sでさる。

[0019] ベニ力ミキリフラスより水抽出物を取り出す場合には、過剰量の水（熱水）と容器内で接触させる。水には熱湯を用いることが効果的である。通常、 0. 00；!〜 0. 007重量％程度の濃度になるように水量を調節する。抽出には、環流条件下に加熱する。加熱時間は、適宜設定する。加熱処理は、通常少なくとも 15分以上、 1時間程度は必要である。その結果、ベニ力ミキリフラスの抽出成分は熱水層に移行させることができる。この熱水処理は 2回以上、通常 3回程度まで繰り返すことが有効である。この一回目の操作により、一般には、ベニ力ミキリフラス重量に対して 0. 3〜； 1. 0%程度、通常 0. 7重量％程度の割合で液状物が得られる。このようにして得られる液状物を環流条件下に濃縮する。最終的に、ベニ力ミキリフラスの抽出物は、茶褐色の粉末状のものとして得られる。収量は、ベニ力ミキリフラスの重量に対して 1. 0〜2. 0重量％程度のものが得られる。温水の利用も可能である。圧力をかけた条件下にも行うことができる。このようにして得られる粉末状の水抽出物を、使用に際しては、適宜水に溶かして薬剤として利用する。後の実施例に示すようにべ二力ミキリフラス 10gを用いて水抽出を行った結果、 176. 2mgのフラス抽出物を得ている。

[0020] ベニ力ミキリフラスを有機溶媒に接触させて処理することにより有機溶媒による抽出物としたものを薬斉 IJとして利用すること力 Sできる。有機溶媒としては、エタノール、メタノ一ノレ、イソプロパノーノレなどのァノレコーノレ類、グリセリン、エチレングリコーノレ、プロピレングリコール、 1 , 3—ブチレングリコールなどの多価アルコール又はその誘導体、アセトン、メチルェチルケトンなどのケトン類、酢酸ェチル、酢酸イソプロピルなどのェステル類、ェチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類を挙げることができる。また、石油エーテル、 n—へキサン、 n—ペンタンなどの脂肪族炭化水素なども用いること力できる。これらの中では、エタノール、 1 , 3—ブチレングリコール、プロピレンダリコールなどが用いられる。これらには、水を含めて混合溶媒として用いることもできる。いずれも溶媒抽出した後、更に他の溶剤に接触させて、さらに特定の成分を取り出すことができる力そのような操作を施すことなぐエタノール或いは 1 , 3 ーブチレングリコール溶媒のものを適当な濃度のものとして、患部に直接、塗りつけることによって、用いることカできる。

[0021] ベニ力ミキリフラスの有機溶媒抽出に当たっては、へキサンなどで抽出を行って、へキサン抽出物と残さに分け、この残さをメタノール抽出し、メタノール抽出物と残さに分け、メタノール抽出物を酢酸ェチル溶解成分とブタノール溶解成分に分けることができ、残さを水抽出を行うなどして、各種溶解成分を取り出すこともできる。

[0022] ベニ力ミキリフラスを、口腔衛生剤として用いる場合には、水抽出物又は有機溶剤抽出物として 0. ；!〜 1. 10重量％程度の濃度のものを用いることが一般的である。ベニ力ミキリフラス成分を含む歯周病原菌用殺菌薬は、（a)歯周病の原因となる嫌気性グラム陰性桿菌に対しては強い殺菌力を有している一方、（b)口腔内には生息する別の正常歯垢細菌であるレンサ球菌群に対しては殺菌力が弱い医薬であるから、歯周病治療薬及び歯周病予防薬となる歯周病原菌殺菌薬、この歯周病原菌殺菌薬を含有する口腔衛生剤及び歯周病原菌殺菌薬を含有する食品として使用することができる。歯周病の原因となる嫌気性グラム陰性桿菌に対しては強い殺菌力を有している一方、（b)口腔内には生息する別の正常歯垢細菌であるレンサ球菌群に対しては殺菌力が弱い薬剤として用いる場合には 0. 5%以下の濃度とすることが有効であり、好ましくは 0. 25%以下の濃度とすること、更に好ましくは 0. 1 %濃度とすることが必要である。

[0023] ベニ力ミキリフラス成分を含む歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬は、（a)歯周病の原因となる嫌気性グラム陰性桿菌に対しては強い殺菌力を有しており、成熟歯垢形成の原因となる菌（Actinomycesや Fusobacteriumなど、図 6 の B群)及び歯

周病原菌（Porphyromonasや Prevotellaなど、図 6の C群）に対して強い殺菌力を有している一方、（b)口腔に生息する正常歯垢細菌であるレンサ球菌群に対しては殺菌力が弱い。

[0024] 本発明の歯周病原菌用殺菌薬、歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬は、飲食物又は口腔衛生薬に添加して適用することができる。

添加する口腔衛生薬の剤型は液剤、固形剤、半固形剤のいずれであっても良ぐ歯磨き剤、トローチ剤、液状又は粉末状うがい薬、塗布液、チューインガムなどに適用可能である。

また、本発明の歯周病原菌用殺菌薬又は歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を配合する飲食物としてはジュースなどの清涼飲料、キャンディ、チューインガムなどの菓子類が適当である。

本発明の歯周病原菌用殺菌薬又は歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬は、上記最終製品に対し、好ましくは 0. 001〜；!重量％の濃度で、特に好ましくは 0. 002-0. 125重量％程度の濃度になるように添加して使用される。添加量が下限重量未満では歯周病抑制効果が発揮されず、添加量が上限重量を超えると、歯周病原菌殺菌薬として飲食物や口腔衛生剤等に配合するには適さないこともめる。

[0025] 歯磨剤組成物は以下の通りである。

(A)ベニ力ミキリフラス成分 0. 0；!〜 0. 5%

(B)キサンタンガム 0· 4〜2· 0重量⁰ /₀、

(C)ァニオン性界面活性剤及び/又は両性界面活性剤 0. 5〜10. 0重量％、 (D)水 10〜40重量％

歯磨き組成物の組成は以下の通りである品名重量部

リン酸水素カルシウム 20

無水ケィ酸 8

液 43

19

増粘剤 0.6

香料 0.8

水 8.595

ベニ力ミキリフラス成分 0.005

計 100

[0027] チューインガム

品名重量部

ガムベース 22

砂糖 49.5

グノレコース 10

水あめ 17.995

香料 0.5

ベニ力ミキリフラス成分 0.005

計 100

[0028] 口中洗浄剤

品名重量部

エタノーノレ 10

ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油サッカリンナトリウム 0.2

' 0.1

6 香料 0.2

クェン酸ナトリウム適量 (pH調整済み）

ベニ力ミキリフラス成分 0.005

水残部

計 100

[0029] 以下に、本発明の内容を実施例により説明する。

本発明のベニ力ミキリフラスの抽出液の製造方法である有機溶媒による抽出液の製造方法については、実施例 1及び 2、水による抽出液の製造方法については実施例 3で示す。

医薬として用いた場合の毒性試験の結果を実施例 4に示した。ベニ力ミキリフラスを歯周病原菌用殺菌薬として用いた場合の効果について実施例 5、歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬としてグラム陽性菌に対する効果を実施例 6、及び同じくグラム陰性菌に対する効果を実施例 7として示す。

以下に、その内容及び実験結果について詳細に説明する。

実施例 1

[0030] (ベニ力ミキリフラスの有機溶媒による抽出液の製造）

竹から得られたベニ力ミキリフラス 591gを、へキサンで抽出を行って、へキサン抽出物 332mgと残さに分け、この残さをメタノール抽出し、メタノール抽出物 14. 6gと残さに分け、メタノール抽出物が酢酸ェチルに溶解した区分 3. 685gと水により溶解した区分に分けることができ、水により溶解した区分について、 n—ブタノール溶剤で処理し、ブタノール溶解区分 1. 931gと水区分に分けることができ、メタノール抽出残さを水（熱水）抽出を行って、水抽出物 12. 132gを得た。

実施例 2

[0031] (ベニ力ミキリフラスの有機溶媒による抽出液の製造）

竹力も得られたベニ力ミキリフラス 1037gを、へキサンで抽出を行って、へキサン抽出物 509. 9mgと残さに分け、この残さを、メタノール抽出し、メタノール抽出物と残さに分け、メタノール抽出物を酢酸ェチル溶解区分 5. 41g及び水溶解区分にわけることができ、水により溶解した区分について、 n—ブタノール溶剤で処理し、ブタノール溶解区分 2. 53gと水区分 3. 65gに分けることができ、メタノール抽出残さを、水（熱水）抽出を行って、水抽出物 27. 132gを得た。

実施例 3

[0032] (ベニ力ミキリフラスの水抽出液の製造）

竹力も採取したベニ力ミキリフラス 10gを、水 500mlに溶解させ、加熱し、環流条件下に加熱した。加熱処理は、 5時間行った。得られたベニ力ミキリフラスの抽出成分を含有する成分に関し、同様に 2回操作を繰り返した。その結果、ベニ力ミキリフラス水抽出物 176. 2mgを得た。以後の実施例ではこれを必要量の水に溶解して用いる。実施例 4

[0033] (24穴マルチウエル'スクリーニング法（毒性試験））

24穴マルチウエル'スクリーニング法（高岡聡子著「組織培養入門」学会出版センタ一発行 68頁記載）により、本発明のベニカリキリフラスの薬剤の毒性試験を行った。 (この方法は、 ABCD各ライン (行)及び 1から 6列のゥエル (合計 24穴）を用意し、 Aラインについて薬剤原液 0. 1mlを含む (A1)、及び濃度が倍々に希釈され、濃度が相違する（(A2〜A5)、薬剤を含まない (A6) )を用意する。次に、細胞の浮

遊液を調製する。細胞数は、 5 X 10⁴/ml程度である。各ゥエルに細胞浮遊液を 0. 9 mlずつ分注する。これを水平にしたまま、左右に軽く揺すって、炭酸ガスふらん器で培養した。 3〜7日培養し、培地をすて、メタノールを静かに注入し、 10分以上固定。流水で洗った後、ギムザ染色を行い、染色異常が見られるかどうかで毒性を判定するものである。 )

毒性試験の内容は、以下の通りであった。

(1)薬剤抽出液の作成

ベニ力ミキリフラス水抽出物（ベニ力ミキリフラス 3· 9gに、 20ccの純水を添加して撹拌し、室温から 100°C直前 (沸騰直前）まで加熱し、この温度において煮出した状態として、 1時間保ち、室温まで冷却し、遠心分離器により（1200rpm. 10分間）、遠心分離を行った。上澄の清浄液を濾過滅菌し、薬剤原液を作成した。

(2)毒性試験として、前記 24穴マルチウエル'スクリーニング法を行った。

(3)使用細胞は、以下の細胞を使用した。 NHDF— NEO CRYOPRESERV ED (ヒト皮膚線芽細胞新生児）である。 BIO WHITTAKER (ACAMBREX COM PANY製製造年月日：1999年 5月 10日 Lot番号： 9F0889保証書添付のもの）

(4)培養培地は、以下の培地を使用した。

FBM (改変 MCDB202血清添加）

(5)添加条件は以下の通りであった。原液のマルチウエルへの添加は、 1ゥエルあたり、 0. 1mlであった。希釈は、 PBS (リン酸緩衝塩類溶液）により、最終濃度を、 0%、 12. 5%、 25%、 50%の 4段階とした。

(6)培養条件培地 FBMに浮遊した細胞液 0. 9mlを、各 24ゥエルに添加した。 36°C で 4日間、加温した。

(7)鑑定法

(ィ）ゥエル内の培地を捨て（細胞は、ゥエルに接地）、直ちに、メタノールで固定後、ギムザ染色を行った。顕微鏡により観察し、写真記録を行った（図 3)。

(口） 25cm²のプラスチック培養瓶で原液 50%を添加し、 8日間観察した。また、培養後、ギムザ染色を行った。

(8)鑑定法 (ィ）の結果

以上の操作により得られた、 24穴マルチウエル'スクリーニング法による対照結果によれば、対照結果（0%)と前記最終濃度 0%、 12. 5%、 25%、 50%の結果と比較して、最終濃度 0%、 12. 5%、 25%、 50%のいずれも、増殖及び形態に変化はなぐ毒性がないことがわかった。

(9)鑑定結果 (口）の結果

25cm²のプラスチック培養瓶で原液 50%を添加し、 8日間観察した結果では、増殖及び形態共に影響は見られなかった。培養後、ギムザ染色を行った結果によれば、異常はなかった。

(10)結論ベニ力ミキリフラスの水抽出液は、ヒト由来泉維芽細胞に影響を与えず、薬剤として使用した場合に安全であると言うことができる。

実施例 5

予め凍結保存してある歯周病原因菌 Porphyromonas gingivalis (FDC

381)、 Porphyromonas gingivalis (ATCC 53978)、 Prevotella intermedia (ATCC

25611)を対象

に、使用濃度に応じた発育阻害率及び濁りの度合いを測定した結果、同じく口腔レンサ球菌の Streptococcus

gordonii (ATし C 10558)、 streptococcus

sanguinis (ATし C 10556)、 streptococcus

oralis (ATCC 10557) , Streptococcus mitis (ATCC 903)を対象に、使用濃度に応じた発育阻害率及び濁りの度合いを測定した結果を算出した。

結果を表 1に纏めた。表 1の左側数値は濁り度合を示す。（）内は阻害率を示している。

又その結果を図 1及び図 2に示した。

[表 1]

ベニ力ミキリフラス水抽出成分を 0. 75重量％程度含有する場合には、グラム陽性レンサ球菌群及び歯周病原細菌に対して作用し、これらの全被検菌の発育はほぼ発育阻害活性を有している。 0. 25%程度とすることにより歯周病原細菌に対して作用し 30から 60%と顕著な発育阻害活性があり、 0. 1 %程度とすることにより 12から 1 5%程度の阻害活性がある。グラム陽性レンサ球菌群に対しては 0. 25%程度で阻害活性は 0から 30%であり、 0. 1 %程度でほとんど影響を与えないことを示している。以上のことから、本発明の薬剤は、歯周病原菌殺菌薬及び予防剤として有用であること力 ^sゎカゝる。

実施例 6

予め凍結保存してある以下のグラム陽性菌を対象に使用濃度に応じた発育阻害率を測定した。

Mutansグループについては、 S. mutansを使用し、 S.mu.と表す。使用菌株は、 MT 8 148、 MT 6229、 ATCC

25175、 OMZ 175である。また、 S. sobrinusを使用し、 S.sob.と表す。使用菌株は、 AT CC 33478、 OMZ 176、 AHT 6715である。

Mitisグループについては、 S. mitisを使用し、 S.mi.と表す。使用菌株は ATCC 903、 A TCC

6249である。また、 S. sanguinisを使用し、 S.sa.と表す。使用菌株は ATCC 10556、 ST 205、 ST

202である。また、 S. gordoniiを使用し、 S.g.と表す。使用菌株は ATCC 10558、 Chailli sである。また、 S. oralisを使用し、 S.o.と表す。使用菌株は ATCC

10557、 ATCC 9811である。

Salivariusグループについては、 S. salivariusを使用し、 S.sal.と表す。使用菌株は ATC

C 9222、 ATCC

7073、 HT9R、 HHTである。

Actinomycesについては、 Α· naeslundiiを使用し、 Α·η·と表す。使用菌株は、 ATCC 1 2104、 B 74である。また、 A. viscosusを使用し、 Α·ν·と表す。使用菌株は、 T 14,WVU 627、 W

1096である。 Candidaについては、 C. albicansを使用し、 C.a.と表す。使用菌株は、 C.a.株、宇多川株、矢崎株である。

ベニ力ミキリフラス水抽出成分 1. 00%、 0. 75%、 0. 50%、 0. 25%、 0. 13%を含有する場合に、阻害率を求めて、結果を図 4として示した。 1. 00%の場合について阻害率は 60%程度又は 60%を超えており、ベニ力ミキリフラス水抽出成分は有効に作用することがわかる。

ベニ力ミキリフラス水抽出成分 0· 75力、ら 0. 50%の場合には、 A. naeslundii(A.n.) 菌株 ATCC 12104、 B 74、 A. viscosus (Α·ν·)、 T 14、 WVU 627、 W 1096に対して阻害率は 60%を超えており、有効であることがわ力、る。

ベニ力ミキリフラス水抽出成分 0. 75、 0. 50%の場合には、以下のレンサ球菌に対してべ二力ミキリフラス水抽出成分の阻害率は、前記の A. naeslundii及び A. viscosus の場合に比較して 40%又は 40%以下であり、阻害率は低い結果となっていることがわ力、る。したがって、 Actinomycesと Streptococcusとでは、阻害率に関して有意な差力 fcること力ゎカゝる。

実施例 7

予め凍結保存してある以下のグラム陰性菌を対象に使用濃度に応じた発育阻害率を測定した。

Actinobacillusについては、 A.a.と表す。使用菌株は、 ATCC 33384、 Y 4である。 P revotellaについては、 P. nigrescensを使用し、 Ρ·η·と表す。使用菌株は、 ATCC 25261 、 ATCC 33563である。又、 P. intermediaを使用し、 P丄と表す。使用菌株は、 ATCC 2 5611でめる。 Porphyromonasについては、 P. gingivalisを使用し、 P.g.と表す。使用菌株は FDC381、 ATCC

49417、 ATCC 33277である。

Fusobacteriumについては、 F. n. fosiformeを使用し、 F.n.と表す。使用菌株は JC M 11024である。また、 F. n. vincentiiを使用し、 F.n.と表す。使用菌株は JCM 11023 である。また、 F. nucleatumを使用し、 F.n.と表す。使用菌株は、 JCM 8532である。

ベニ力ミキリフラス水抽出成分 1. 00%、 0. 75%、 0. 50%、 0. 250. 13%を含有する場合の、阻害率を求めて、図 5に黒塗りの直線で示した（なお、図中、白抜きは発育促進を示している。）。 1. 00、 0. 75%、 0. 50%の阻害率は 80%をほぼ超えており、十分に効果を確認できる（ATCC 25261 (P.n.)はいずれも 80%を超えている力 S、ATCC 33563 (Ρ·η·)は 0. 75%及び 0. 50%では、各々 60%及び 40%を下回る結果になっているが、これは ί列外であるということ力 Sできる。）。

ベニ力ミキリフラス水抽出成分 0. 25%の場合の阻害率については、 ATCC 33384 、 Y 4 (A. a. )の場合は 80%を超えており、 P. nigrescensの ATCC 25261 (P. n. )では 60%を超えており、 P. gingivalisの FDC381 (P. g.)では 60%を超えており、他の A TCC 49417、 ATCC 33277 (P. g.)についてもほぼ 60%程度であり、 fbsiformeの JCM 11024 (F. n. )についても 80%を超える結果となっている。

以上の結果を整理してみると、ベニ力ミキリフラス水抽出成分はグラム陰性菌に対して高レ、発育阻害作用を示してレ、るとレ、うこと力 Sできる。

産業上の利用可能性

本発明のベニ力ミキリフラス成分を含む歯周病原菌殺菌薬は、歯周病の原因となるグラム陰性桿菌に対しては強い殺菌力を有している一方、（b)口腔に生息する正常歯垢細菌であるレンサ球菌群に対しては殺菌力が弱い歯周病原菌殺菌薬であり、新しいタイプの歯周病原菌殺菌薬であり、新しい治療方法を可能にするものである。又、同様に口腔衛生薬や

食品にとしても用いることができるものである。

Claims

請求の範囲

[1] ベニ力ミキリフラス成分を含む歯周病原菌用殺菌薬。

[2] 請求項 1記載の歯周病原菌用殺菌薬を含有することを特徴とする口腔衛生薬。

[3] 請求項 1項記載の歯周病原菌用殺菌薬を含有することを特徴とする食品。

[4] ベニ力ミキリフラス成分を含むことからなる歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬。

[5] 請求項 4記載の歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有することを特徴とする口腔衛生薬。

[6] 請求項 4記載の歯周病原菌用殺菌薬及び歯周病原性歯垢形成の阻止薬を含有することを特徴とする食品。