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WO2008020131A1 - Méthode de criblage de composes aux propriétés anti-amyloide - Google Patents

Méthode de criblage de composes aux propriétés anti-amyloide Download PDF

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WO2008020131A1
WO2008020131A1 PCT/FR2007/001372 FR2007001372W WO2008020131A1 WO 2008020131 A1 WO2008020131 A1 WO 2008020131A1 FR 2007001372 W FR2007001372 W FR 2007001372W WO 2008020131 A1 WO2008020131 A1 WO 2008020131A1
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WO
WIPO (PCT)
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complexes
screening method
amyloid
disease
alzheimer
Prior art date
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Application number
PCT/FR2007/001372
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English (en)
Inventor
Hoau-Yan Wang
Philippe Morain
Caryn Thibierge
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Laboratoires Servier SAS
Original Assignee
Laboratoires Servier SAS
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Priority to EP07823424A priority patent/EP2051994A1/fr
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to the medical field, and is of particular interest to pharmacological research units.
  • the invention relates in fact to a method for screening compounds with anti-amyloid properties.
  • the invention implements biochemical techniques for the ex vivo analysis of biological samples making it possible to rapidly identify compounds intended for the curative and / or preventive treatment of neurodegenerative diseases and of Alzheimer's disease in particular .
  • the subject of the invention is a method for screening compounds having the ability to dissociate high affinity complexes between the ⁇ -amyloid peptide and the nicotinic acetylcholine receptor of human cortex tissues.
  • Alzheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease that affects a large proportion of the elderly population. This disease is clinically characterized by a loss of memory and a decline in cognitive function. Neuropathologically, Alzheimer's disease is characterized by the presence of two types of brain histopathological lesions: amyloid plaques and neurofibrillary degeneration (DNF). A third characteristic of Alzheimer's disease is cortical atrophy corresponding to pronounced neuronal loss.
  • DNF neurofibrillary degeneration
  • a ⁇ ⁇ -amyloid peptides
  • amyloid plaques or senile plaques around the neurons would be at the origin of the etiology of Alzheimer's disease.
  • amyloid deposits represents the early and invariable characteristic of all forms of Alzheimer's disease, including familial forms.
  • Neurofibrillary degeneration is an intraneuronal accumulation of fibrils formed of helically paired filaments or PHFs (paired helical filaments).
  • PHFs are constituted by the assembly of tau microtubular proteins. The biochemical characterization of these proteins reveals the presence of a major triplet of tau proteins abnormally phosphorylated (tau 60, 64 and 69) and aggregated.
  • Normal tau protein is phosphorylated 2 to 3 times as opposed to 5 to 9 times in Alzheimer's disease and plays a role in the polymerization-depolymerization of microtubules of the neuronal cytoskeleton as well as in axonal transport.
  • Cortical atrophy results in a loss of 8 to 10% of brain weight every 10 years in patients with Alzheimer's disease, while in healthy subjects this loss is only 2%. Cortical atrophy is accompanied by dilated cerebral ventricles and cortical furrows, reduced hippocampal volume, and neuronal loss, particularly affecting the cholinergic system.
  • the amyloid plaques result from spherical deposits of amyloid substance.
  • the amyloid substance consists of filaments of a polypeptide of 39 to 43 amino acids called A ⁇ ( ⁇ -amyloid).
  • the ⁇ -amyloid peptide has a ⁇ -sheet conformation conferring on it its insoluble character and its toxicity.
  • the ⁇ -amyloid peptide is a normal catabolic product of a large membrane glycoprotein called APP (amyloid precursor protein).
  • APP amyloid precursor protein
  • the amyloid plaques are surrounded by neuritic extensions and glial cells. The amyloid plaques impregnate the nervous parenchyma and diffuse into the cortical gray matter of all brain regions. The occipital cortex seems more frequently affected by these amyloid deposits.
  • the neurotoxicity of ⁇ -amyloid peptide is a major problem of Alzheimer's disease.
  • amyloid plaques located in the extracellular space are derived from cell lysis of neurons with a very large accumulation of amyloid deposits in the lysosomal compartment. This intraneuronal accumulation causes degeneration of the neuronal cell and cell death and release of these deposits in the extracellular space, gradually forming the amyloid plaques (Nagele et al., 2002). Amyloid plaques are surrounded by neuritic extensions and glial cells and contain fragments of nuclei, evidence that they come from dead neurons. The ⁇ 7-type nicotinic receptor plays a key role in the entry of A ⁇ peptide into neurons (D'Andréa and Nagele 2006). Wang et al.
  • a ⁇ peptide binds specifically and with high affinity to ⁇ 7 nicotinic acetylcholine receptors ( ⁇ 7 nAChR) present at the extracellular surface of the neuron (Wang et al., 2000).
  • the interaction of the A ⁇ peptide, in particular the A ⁇ 42 peptide, with the ⁇ 7 nAChR receptor appears to be an essential and prior stage for the intraneuronal accumulation of the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes, said complexes on the surface of the neurons being subjected to endocytosis leading to their accumulation in the lysosomal compartment (Nagele et al., 2002).
  • a first method consists of an injection of ⁇ -amyloid peptides in brains of mice, performed using a cannula ⁇ in the intra-cerebroventricular (icv) position.
  • This method (Yamada et al 2005, Mazzola et al., 2003) makes it possible to obtain mice with a memory deficit after 7 days of exogenous supply of ⁇ -amyloid peptides.
  • This mouse model is obtained quickly and can be used to test new products in the treatment of neurodegenerative diseases and Alzheimer's disease in particular.
  • This method is based on a model that does not exactly represent the pathophysiology of Alzheimer's disease.
  • this method of identifying compounds acting on the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complex has no apparent validity since the tau pathology of cerebral aging does not develop in this mouse model.
  • the present murine model does not respect a construction validity, given that, on the one hand, the ⁇ -amyloid peptides are of exogenous origin and not naturally produced by the animal and, on the other hand, the model is animal and not human.
  • the injection of exogenous ⁇ -amyloid peptides into mouse brains requires working in vivo which rules out this method of routine use for the screening and identification of anti-Alzheimer compounds.
  • transgenic mice as a model of Alzheimer's disease, carrying mutations present in familial forms of Alzheimer's disease, on APP and / or PS1 (presenilin-1) genes. These models therefore have an undeniable construction validity for family forms but very questionable for sporadic forms that represent more than 97% of cases.
  • a first type of transgenic mouse has only one mutation on APP (Hsiao et al., 1996) or a double mutation on APP and PS1 (Holcomb et al., 1998).
  • the descriptive validity of the transgenic models described above is not complete since they do not reliably reproduce the physiopathological characteristics associated with Alzheimer's disease. Indeed, we observe on the one hand an absence of degeneration neurofibrillary, on the other hand little or no neuronal loss as well as late onset of senile plaques in the cortex of single or double transgenic mice. Consequently, the use of single or double transgenic mouse models is not recommended in view of the physiological differences existing with Alzheimer's disease and the delay at which the lesions associated with this pathology appear.
  • transgenic mouse model comprising three mutated genes (APP, PS1 and tau) (LaFerla et al., 2003) also has disadvantages.
  • the construction validity of this model is questionable since a mutation in the tau gene, not present in humans with Alzheimer's disease, is added compared to previous models.
  • the descriptive validity of this model is good since it mimics the physiological lesions of Alzheimer's disease that consist of amyloid plaques, neurofibrillary tangles and neuronal loss.
  • this method requires a delay of 6 months to 12 months before obtaining mice with the typical lesions of Alzheimer's disease. Consequently, this transgenic mouse model can be validly used in a method for confirming the anti-amyloid properties of a test compound but can not reasonably be used as a first-line for the screening of compounds in view of the duration and the difficulty of implementing said model.
  • a third method (Wang et al., 2000) is to test the ability of compounds to prevent the formation of exogenously delivered A ⁇ peptide complexes and ⁇ 7 present in rat tissues (hippocampal and rat cortex synaptosomes).
  • This in vitro method is more rapidly implemented than the methods described above, however it has the disadvantage of not being representative of the complexes present in humans since they are extracts of rat brains and A ⁇ peptides are provided. exogenous way. Consequently, this model does not respect the conditions of validity of construction nor those of descriptive validity required for the use of the latter in a method of screening compounds capable of acting on the complex A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR at the origin amyloid plaque formation.
  • the object of the present invention is therefore to propose an alternative strategy to the methods for identifying compounds capable of acting on the ⁇ -amyloid- ⁇ 7 nAChR complexes, in order to remedy at least in part the drawbacks already known from the selection methods. said compounds.
  • the invention therefore proposes an ex vivo screening method recreating the physiological conditions present in patients suffering from Alzheimer's disease. These optimal conditions are obtained by using human brains, in particular frontal cortex derived from patients suffering from Alzheimer's disease. This model fulfills by definition the criteria of validity of construction and descriptive validity since it is a direct use of the diseased human tissue.
  • the ex vivo conditions of the screening method according to the invention make it possible to remove the constraints related to the production and manipulation of animal models.
  • human biological materials makes it possible to overcome all the artifacts and errors related to the physiological differences existing between animal and human species.
  • the use of human biological materials in the context of the screening method according to the invention is particularly important in view of the fact that Alzheimer's disease and neurodegenerative pathologies in general do not exist naturally in other species. than the human species.
  • the invention thus relates to a method for screening compounds capable of dissociating or preventing ⁇ -amyloid peptide complexes with nicotinic acetylcholine receptors derived from human brains.
  • the invention relates to a method for screening compounds capable of dissociating or preventing ⁇ -amyloid peptide complexes with ⁇ 7 nicotinic acetylcholine receptors derived from human brains.
  • the screening method according to the invention therefore makes it possible to identify compounds with curative or preventive properties depending on whether these compounds are respectively capable of dissociating or preventing the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes.
  • anti-amyloid or “anti-beta amyloid” property is meant the ability for a compound to dissociate or oppose the formation of intracellular or extracellular deposits of ⁇ -amyloid peptides either by dissociation or by inhibition of the formation of the complexes formed by the A ⁇ peptides with the nicotinic acetylcholine receptors.
  • alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor denotes a pentameric cell surface receptor, expressed mainly in the cortex and the hippocampus, and having an important role in learning and memory. .
  • ⁇ -amyloid refers to all of the ⁇ -amyloid peptides whose peptides A ⁇ 1-39 or A ⁇ 39 , A ⁇ 1-40 or A ⁇ 40 , A ⁇ ].
  • the fragments of ⁇ -amyloid peptides supra have a biological activity and can be used in the screening method according to the present invention. Said fragments are, for example, fragments A ⁇ 1-28 and A ⁇ 25-35 .
  • the ⁇ -amyloid peptides used in the context of the invention are in particular the peptides A ⁇ 3 ç > , A ⁇ 40 , A ⁇ 41 , A ⁇ 42 and / or A ⁇ 43 .
  • a ⁇ 42 has the highest affinity for nicotinic ⁇ 7 acetylcholine receptors and has the most important role in the etiology of Alzheimer's disease.
  • the present screening method is performed from human brain samples and preferably from human cortex and hippocampus. These samples are taken post-mortem from patients with Alzheimer's disease.
  • the invention relates, preferably, to a screening method characterized in that the dissociation of ⁇ -amyloid peptide complexes and nicotinic ⁇ 7 receptors of acetylcholine is demonstrated by immunohistochemistry.
  • immunohistochemistry relates to all techniques for the revelation of antigens by antibodies to detect or isolate defined molecules.
  • the screening method comprises the following steps of incubation of ⁇ -amyloid peptide complexes with nicotinic acetylcholine receptors in presence or in the absence of a test compound, then determining the amount of undissociated complexes in the presence or absence of test compound and the evaluation of the difference in the amount of undissociated complexes, said difference indicating that the test compound modulates the dissociation of ⁇ -amyloid peptide complexes with nicotinic acetylcholine receptors.
  • the screening method according to the invention also comprises a step of isolating the non-dissociated complexes of ⁇ -amyloid peptides with the nicotinic acetylcholine receptors using antibodies to the ⁇ -amyloid peptide.
  • the anti- ⁇ -amyloid peptide antibodies used in the screening method are directed against the ⁇ -amyloid peptides A ⁇ 39 , A ⁇ 40 , A ⁇ 41 , A ⁇ 42 and / or A ⁇ 43 .
  • These antibodies may be monoclonal antibodies of mouse or goat.
  • the present screening method is characterized by the revelation, in particular by Western-blot method, of undissociated complexes using anti-nicotinic acetylcholine receptor antibodies, in particular anti-antibodies. nicotinic ⁇ 7 receptors of acetylcholine.
  • the screening method according to the invention has demonstrated compound S 24795, chloride or iodide of 1- (4-bromophenyl) -2- (1-methyl-2-pyridiniumyl) -1-ethanone, as compound capable on the one hand, to inhibit the formation of ⁇ -amyloid- ⁇ 7 nAChR complexes and, on the other hand, to dissociate said ⁇ -amyloid- ⁇ 7 nAChR complexes accumulated in amyloid plaques around the neuron and in deposition within the neuron.
  • the compound S 24795, identified by the screening method of the present invention is therefore a compound capable of dissociating the ⁇ -amyloid peptide complexes with the nicotinic acetylcholine receptors present in the brains of patients suffering from the disease. Alzheimer's as well as to inhibit the formation of said complexes.
  • the invention also relates to each compound identified from the screening method according to the invention.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the compound obtained from the screening method according to the invention as active principle in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • active principle is meant any substance responsible for the pharmacodynamic or therapeutic properties of the pharmaceutical composition.
  • excipients is understood to mean any substance into which the active principle of a medicament is incorporated in order to facilitate the preparation and administration thereof and to condition the consistency thereof, the form and than the volume.
  • non-toxic, pharmaceutically acceptable excipients mention may be made, by way of indication and not limitation, of diluents, solvents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersing agents, binders, blowing agents, disintegrating agents, retardants, lubricants, absorbents, suspending agents, dyes or flavoring agents.
  • compositions intended for the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases and Alzheimer's disease in particular are in a form suitable for oral, parenteral, nasal, percutaneous, rectal, perlingual, ocular or respiratory and in particular simple or coated tablets, sublingual tablets, sachets, packets, capsules, glossettes, lozenges, suppositories, creams, ointments, dermal gels, and oral or injectable ampoules.
  • the present invention further relates to the use of compounds identified from the screening method according to the invention for obtaining pharmaceutical compositions for the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases.
  • the compounds identified by the screening method according to the invention are used in the treatment of "neurodegenerative diseases” such as, for example, Alzheimer's disease, Pick's disease, Lewy body dementia, Steel-Ridchardson's syndrome. Down syndrome, Shy-Drager syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, neurodegenerative ataxia, Huntigton's disease, Parkinson's disease, progressive primary aphasia, Machado-Joseph's disease, Parkinson's disease Gilles de La Tourette, paralytic parenchymia, Kennedy's disease, familial spasmodic paralysis, Werdriig-Hoffinann's disease, Kugelberg-Welander's disease, Tay-Sach's disease, Sandhoff's disease, Wohlfart's disease Kugelberg-Welander, spastic paraparesis, progressive multifocal leukoencephalitis and prion-related diseases including Creutzfeldt-Jakob or Gerstmann-Straus
  • preventive corresponds to a preventive treatment intended to reduce the risk of developing Alzheimer's disease by inhibiting the binding of ⁇ -amyloid peptides on nicotinic cell receptors ⁇ 7 acetylcholine. This inhibition limits the formation of ⁇ -amyloid- ⁇ 7 nAChR complexes at the origin of amyloid plaques, a lesion present in Alzheimer's disease.
  • preventive may be understood as secondary prevention that is intended to decrease prevalence by reducing the course and duration of the disease.
  • treatment is meant a curative treatment prescribed for the purpose of treating patients with Alzheimer's disease by dissociating the ⁇ -amyloid- ⁇ 7 nAChR complexes present in the human brains and constituting the senile plaques.
  • Alzheimer's disease is understood to mean a fatal neurodegenerative disease affecting memory and mental functioning, in particular with the alteration of language, the disruption of elaborate gestures and disorders of orientation in time and space. These cognitive disorders are related to two neuropathological lesions characteristic of senile plaques and neurofibrillary degeneration that allow definitive post-mortem diagnosis.
  • FIG. 1 Western blot illustrating the inhibition by S 24795 of A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes originating from synaptosomes of frontal cortex of patients suffering from Alzheimer's disease or post-mortem control subjects.
  • the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes are incubated in medium alone (Krebs-Ringer) or in the presence of S 24795 (30 ⁇ M) for 10 minutes followed by incubation in the presence of A ⁇ peptide 42 for 30 minutes.
  • FIG. 1 Western blot illustrating the inhibition by S 24795 of A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes originating from synaptosomes of frontal cortex of patients suffering from Alzheimer's disease or post-mortem control subjects.
  • the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes are incubated in medium alone (Krebs-Ringer) or in the presence of S 24795 (30 ⁇ M) for 10 minutes followed by incubation in the presence of A ⁇
  • FIG. 3 Western blot illustrating the dissociation by S 24795 of A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes originating from synaptosomes of frontal cortex of patients suffering from Alzheimer's disease or from post-mortem control subjects.
  • Complex Aß 42 - ⁇ 7 nAChR are incubated in the medium (Krebs-Ringer) or presence of S 24795 (1, 10, 30 or lOO ⁇ M) for 10 minutes and in the presence or in the absence of Aß 42
  • Figure 5 Quantification of 45 Ca 2+ entry in synaptosomes of human frontal cortex from patients with Alzheimer's disease and post-mortem control subjects treated with S 24795. Control brain slices are incubated or not in the presence of A ⁇ 42 (1 ⁇ M) prior to treatment with S 24795 (10 ⁇ M). Calcium inputs are induced either by the ⁇ 7 agonist (PNU282987) or by NMDA added to glycine.
  • Post mortem human frontal cortex from patients with Alzheimer's disease and healthy control subjects are from the Harvard Brain Tissue Resource Center and Analytical Biological Services.
  • patients with Alzheimer's disease have been divided into two subgroups with or without associated vascular pathologies. Only the brains of patients without associated pathology were used in this study.
  • the cortex collected in the study comes from people who died within 15 hours of sampling.
  • the cortex removed are stored at -80 ° C until used in the screening method according to the invention.
  • the cortex is cryoprotected for 2 weeks in 0.2M sodium phosphate buffer (NaH 2 PO 4 , 2H 2 O 2 NaH 2 PO 4 , 12H 2 O, pH 7.4) containing 20% (W / V) sucrose. . They are then frozen for 1 minute in isopentane maintained at a temperature of -30 ° C. in dry ice. Sections of 5 .mu.m thick, made in a cryostat thermostated at -30 ° C. (Super Frost Plus Fisher) are finally placed in a 0.02M PBS buffer and then stored at 4 ° C.
  • a homogenization solution containing 25 mM HEPES at pH 7.5, 1 mM EDTA, 50 ⁇ g / ml leupeptin, 10 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml of inhibitor soybean trypsin, 0.04mM PMSF, a mixture of phosphatase inhibitory proteins and 0.2% 2-mercaptomethanol.
  • the homogenate is centrifuged at 1000 g and 4 ° C for 10 minutes. The supernatant from this first centrifugation is then centrifuged at 15000 g for 30 minutes in order to obtain a pellet of synaptosomes.
  • the pellet of synaptosomes is washed twice by suspension in 10 ml of an ice-maintained Krebs-Ringer solution comprising 25 mM HEPES at pH 7.4, 118 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 25 mM NaHCO 3 , 1.3 mM CaCl 2 1.2mM MgSO 4 , 1.2mM KH 2 PO 4 , 10mM glucose, 100 ⁇ M ascorbic acid, 50 ⁇ g / ml leupeptin, 10 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml of soy trypsin inhibitor, 0.04mM PMSF and a mixture of phosphatase inhibiting proteins, aerated for 10 minutes with 95% O 2 /5% CO 2 and then centrifuged again at 15000g for 10 minutes at 4 ° C.
  • the washed synaptosomes are then suspended in ImI of oxygenated Krebs-Ringer solution and the protein concentration of said synaptosome suspension
  • the synaptosomes of human cortex are incubated in an oxygenated Krebs-Ringer solution in the presence of compound S 24795 at 37 ° C. for 30 minutes in a total incubation volume of 500 ⁇ l.
  • Compound S 24795 is present in the reaction medium at concentrations of 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M or 100 ⁇ M.
  • the synaptosomes are also incubated in the presence of 10 nM A ⁇ 42 or in the presence of a vehicle.
  • the reaction is stopped by diluting in 1.5 ml of a 1M EDTA solution maintained in ice-Ca 2+ calcium ion - without Krebs-Ringer solution and then centrifuging for 10 minutes at 15000g and 4 ° C.
  • the resulting synaptosome pellet is solubilized in 250 ⁇ l of immunoprecipitation buffer (25mM HEPES at pH 7.5, 20OmM NaCl, 1mM EDTA, 50 ⁇ g / ml leupeptin, 10 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml soy trypsin inhibitor, 0.04mM PMSF and a mixture of inhibitors protein phosphatase) containing 0.5% digitonin, 0.2% chelated sodium and 0.5% NP-40.
  • immunoprecipitation buffer 25mM HEPES at pH 7.5, 20OmM NaCl, 1mM EDTA, 50 ⁇ g / ml leupeptin, 10 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml soy trypsin inhibitor, 0.04mM PMSF and a mixture of inhibitors protein phosphatase
  • the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes are isolated by immunoprecipitation using anti-A ⁇ antibodies. 42 incubated in their presence for 16 hours at 4 ° C and concentrated by incubation for 2 hours in the presence of 25 .mu.l of conjugated agarose beads A / G (Cai et al. 1999, Wang et al., 2000, Jin et al. 2001).
  • isolated A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes are solubilized in 100 ⁇ l of SDS-PAGE buffer (62.5 mM Tris-HCl at pH 6.8). % glycerol, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) under heat for 5 minutes.
  • the complexes are then deposited on an 8-16% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Anti- ⁇ 7 nAChR monoclonal antibodies are used in the Western Blot analysis and then revealed by chemiluminescence. The intensity of the bands obtained is analyzed by densitometry in order to quantify the effects of the compounds as a function of their dose on the amount of A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes present.
  • Compound S 24795 is used as an anti-amyloid agent in the ex vivo screening method protocol according to the invention.
  • the compound S 24795 is a pyridine compound used as a mnemocognitive facilitator capable of improving the cognitive processes and / or of opposing the cognitive disorders associated with aging. In contrast to mnemocognitive facilitators acting directly on central cholinergic systems, compound S 24795 lacks hypothermic activity that may be troublesome in the treatment of patients with neurodegenerative disease. 1.8) Functional recovery method
  • Functional recovery experiments are performed from 1.2-based brains from patients according to 1.1. Functional recovery induced by treatment with S 24795 (10 ⁇ M) is evaluated on the incoming calcium flux by the ⁇ 7 and NMDA receptors. It was tested after Ih treatment with S 24795 on control brains exposed to A ⁇ 42 (30 minutes) and on brains of patients with Alzheimer's disease. The treatments with A ⁇ 42 (1 ⁇ M) and S 24795 (10 ⁇ M) are performed on cortex slices from these brains. Synaptosomes are then prepared as described in 1.4. In order to evaluate the influx of Ca 2+ by the ⁇ 7 and NMDA receptors, the synaptosomes are incubated in the presence of 45 Ca 2+ (5 ⁇ M) for 5 minutes at 37 ° C.
  • the screening method makes it possible to identify a preventive property of S 24795, added before the A ⁇ peptides, on the formation of the A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes.
  • S 24795 added before the A ⁇ peptides
  • FIG. 1 the addition of A ⁇ peptides to synaptosomes of non-diseased human cortex induces a sharp increase in the amount of A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes.
  • the screening method makes it possible to identify a curative property of S 24795 since dissociating complexes formed before the death of the patient.
  • S 24795 induces a major decrease in the amount of A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR complexes present in diseased brains.
  • the results illustrated in FIG. 3 confirm the ability of the screening method to identify a compound with a curative property in that, without the addition of A ⁇ peptides, this compound can induce dissociation of complexes already present in diseased human tissues.
  • This screening method therefore makes it possible to specifically select compounds capable of preventing complex formation, which is applicable to early stages of the disease where the compounds have a preventive action, and secondly to dissociate already existing complexes, which is applicable to advanced or even severe stages of the disease, where the compounds have a curative action.
  • the dissociation of the complexes A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR will prevent the excessive intraneuronal accumulation of complexes A ⁇ 42 - ⁇ 7 nAChR and consequently oppose to the neuronal death due to these deposits.
  • the realization of the screening method according to the invention from synaptosomes of human brains avoids the artifacts and false-positives related to the differences between the animal and human species.
  • the ex vivo implementation of this screening method makes it possible to obtain a speed and a repeatability for the identification of compounds capable of to dissociate ⁇ -amyloid peptide complexes with nicotinic acetylcholine receptors.
  • this screening method is carried out on biological material representing a severe and fixed stage of Alzheimer's disease, it makes it possible to select and identify compounds acting at an ultimate stage of the disease.
  • the screening method according to the invention ensures the identification of compounds that can be used in the curative treatment of neurodegenerative diseases and of Alzheimer's disease in particular.

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Abstract

L'invention concerne une méthode de criblage de composés aux propriétés anti-amyloïde. La méthode de criblage de composés ayant l'aptitude de dissocier ou prévenir des complexes de forte affinité entre les peptides ß-amyloïde et les récepteurs nicotiniques de L'acétylcholine de tissus de cortex humains permet d'identifier rapidement des composés destinés au traitement curatif et/ou préventif des maladies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier.

Description

METHODE DE CRIBLAGE DE COMPOSES AUX PROPMETES
ANTI-AMYLOIDE
La présente invention relève du domaine médical, et intéresse en particulier les unités de recherche pharmacologique. L'invention concerne en effet une méthode de criblage de composés aux propriétés anti-amyloïde.
A cette fin, l'invention met en œuvre des techniques de biochimie pour l'analyse ex vivo de prélèvements biologiques permettant d'identifier rapidement des composés destinés au traitement curatif et/ou préventif des maladies neurodégénératives et de la maladie d' Alzheimer en particulier. Ainsi, l'invention a pour objet une méthode de criblage de composés ayant l'aptitude de dissocier des complexes de forte affinité entre le peptide β-amyloïde et le récepteur nicotinique de l'acétylcholine de tissus de cortex humains.
La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative progressive qui affecte une large proportion de la population âgée. Cette maladie se caractérise sur le plan clinique par une perte de la mémoire et un déclin des fonctions cognitives. Sur le plan neuropathologique, la maladie d'Alzheimer se traduit par la présence de deux types de lésions histopathologiques cérébrales : les plaques amyloïdes et la dégénérescence neurofibrillaire (DNF). Une troisième caractéristique de la maladie d'Alzheimer est l'atrophie corticale correspondant à une perte neuronale prononcée.
L'accumulation de peptides β-amyloïde (Aβ) sous forme de dépôts intraneuronaux et de plaques amyloïdes ou plaques séniles autour des neurones serait à l'origine de l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. Conjointement avec les désordres cognitifs associés et la dégénérescence neurofibrillaire, l'accumulation de dépôts amyloïdes représente la caractéristique précoce et invariable de toutes les formes de la maladie d'Alzheimer, incluant les formes familiales.
La dégénérescence neurofibrillaire correspond à une accumulation intraneuronale de fibrilles formées de filaments appariées en hélice ou PHF (paired helical filaments). Les PHF sont constituées par l'assemblage de protéines microtubulaires tau. La caractérisation biochimique de ces protéines révèle la présence d'un triplet majeur de protéines tau anormalement phosphorylées (tau 60, 64 et 69) et agrégées. La protéine tau normale est phosphorylée 2 à 3 fois contre 5 à 9 fois dans la maladie d'Alzheimer et joue un rôle dans la polymérisation-dépolymérisation des microtubules du cytosquelette neuronal ainsi que dans le transport axonal.
L'atrophie corticale se traduit par une perte de 8 à 10% du poids du cerveau tous les dix ans chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer alors que chez des sujets sains cette perte n'est que de 2%. L'atrophie corticale s'accompagne d'une dilatation des ventricules cérébraux et des sillons corticaux, d'une réduction du volume de l'hippocampe ainsi que d'une perte neuronale affectant particulièrement le système cholinergique.
Les plaques amyloïdes résultent de dépôts de substance amyloïde de forme sphérique. La substance amyloïde est constituée de filaments d'un polypeptide de 39 à 43 acides aminés nommé Aβ (β-amyloïde). Le peptide β-amyloïde présente une conformation en feuillet β lui conférant son caractère insoluble et sa toxicité. Le peptide β-amyloïde est un produit catabolique normal d'une glycoprotéine membranaire de grande taille appelée APP (protéine précurseur de l'amyloide). Les plaques amyloïdes sont entourées de prolongements neuritiques et de cellules gliales. Les plaques amyloïdes imprègnent le parenchyme nerveux et diffusent dans la substance grise corticale de toutes les régions cérébrales. Le cortex occipital semble plus fréquemment affecté par ces dépôts amyloïdes. La neurotoxicité du peptide β-amyloïde constitue un problème majeur de la maladie d'Alzheimer.
Des travaux récents montrent que les plaques amyloïdes localisées dans l'espace extracellulaire sont issues de la lyse cellulaire de neurones présentant une accumulation très importante de dépôts amyloïdes dans le compartiment lysosomal. Cette accumulation intraneuronale entraîne une dégénérescence de la cellule neuronale puis la mort cellulaire et le relargage de ces dépôts dans l'espace extracellulaire, formant peu à peu les plaques amyloïdes (Nagele et al. 2002). Les plaques amyloïdes sont entourées de prolongements neuritiques et de cellules gliales et contiennent des fragments de noyaux, preuve qu'elles proviennent de neurones morts. Le récepteur nicotinique de type α7 joue un rôle primordial dans l'entrée du peptide Aβ dans les neurones (D'Andréa et Nagele 2006). Wang et al. ont démontré que le peptide Aβ se lie de manière spécifique et avec une haute affinité aux récepteurs nicotiniques α7 de l'acétylcholine (α7 nAChR) présents à la surface extracellulaire du neurone (Wang et al. 2000). L'interaction du peptide Aβ, en particulier le peptide Aβ42, avec le récepteur α7 nAChR semble être une étape essentielle et préalable à l'accumulation intraneuronale des complexes Aβ42-α7 nAChR, lesdits complexes à la surface des neurones faisant l'objet d'une endocytose aboutissant à leur accumulation dans le compartiment lysosomal (Nagele et al. 2002).
En outre, l'accumulation intraneuronale de ces composés Aβ-α7 provoque une phosphorylation anormale de tau (Wang et al. 2003) et des dysfonctionnements synaptiques dont une défaillance de la neurotransmission cholinergique (Roselli et al. 2005 ; Almeida et al. 2005 ; Shemer et al. 2006).
L'ensemble de ces données tendent à démontrer qu'une perturbation chronique des récepteurs α7 nAChR par les peptides Aβ,en particulier les Aβ42, chez les individus âgés et les malades atteints de la maladie d'Alzheimer est un mécanisme central par lequel les peptides Aβ provoquent des dysfonctionnements neuronaux, la formation de plaques amyloïdes et la phosphorylation de protéines tau à l'origine de la neurodégénérescence fïbrillaire.
En conséquence, les composés capables d'inhiber l'interaction Aβ42-α7 nAChR pourraient s'avérer être des agents particulièrement efficaces pour réduire la formation de plaques amyloïdes ainsi que les dysfonctionnements neuronaux.
Il apparaît donc intéressant, à la lumière de leur importance dans les pathologies neurodégénératives et liées au vieillissement, d'identifier des composés capables d'agir sur le complexe Aβ42-α7 nAChR à l'origine de la formation de plaques amyloïdes.
L'identification de ces composés peut être effectuée par différentes méthodes, lesquelles se révèlent plus ou moins adaptées et efficaces en fonction des cas. Elles sont parfois insuffisantes à elles seules, ne sont alors utiles que combinées, et présentent, en tout état de cause, un certain nombre d'avantages et d'inconvénients sommairement rappelés ci-après et qui seront discutés sur la base de deux critères de validité des modèles animaux : la validité de construction basée sur la similitude des conditions inductrices de la pathologie et des mécanismes neurobiologiques sous-jacents, la validité descriptive basée sur la similitude des états comportementaux induits.
Une première méthode consiste en une injection de peptides β-amyloïdes dans des cerveaux de souris, réalisée à l'aide d'une canule ^en position intra-cérébro-ventriculaire (i.c.v). Cette méthode (Yamada et al. 2005 ; Mazzola et al. 2003) permet d'obtenir des souris présentant un déficit de mémoire après 7 jours d'apport exogène de peptides β- amyloïdes. Ce modèle murin est obtenu rapidement et peut être utilisé pour tester de nouveaux produits pressentis dans le traitement des pathologies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier. Cette méthode est basée sur un modèle ne représentant pas exactement la pathophysiologie de la maladie d'Alzheimer. En effet, cette méthode d'identification de composés agissant sur le complexe Aβ42-α7 nAChR n'a pas de validité apparente puisque la pathologie tau du vieillissement cérébral ne se développe pas dans ce modèle murin. En outre, le présent modèle murin ne respecte pas une validité de construction compte-tenu que, d'une part les peptides β-amyloïdes sont d'origine exogènes et non produits de manière naturelle par l'animal et d'autre part le modèle est animal et non humain. Enfin, l'injection de peptides β-amyloïdes exogènes dans des cerveaux de souris exige de travailler in vivo ce qui écarte cette méthode d'un usage en routine pour le criblage et l'identification de composés anti-Alzheimer.
Plusieurs autres méthodes d'identification de composés utilisent des souris transgéniques comme modèle de maladie d'Alzheimer, portant des mutations présentes dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer, sur les gènes APP et/ou PSl (préséniline-1). Ces modèles présentent donc une validité de construction indéniable pour les formes familiales mais très discutable pour les formes sporadiques qui représentent plus de 97% des cas.
Un premier type de souris transgénique ne comporte qu'une mutation sur l'APP (Hsiao et al. 1996) ou une double mutation sur APP et PSl (Holcomb et al. 1998). La validité descriptive des modèles transgéniques décrits supra n'est pas complète puisqu'ils ne reproduisent pas de manière fiable les caractéristiques physiopathologiques liées à la maladie d'Alzheimer. En effet, on observe d'une part une absence de dégénérescence neurofibrillaire, d'autre part peu ou pas de perte neuronale ainsi qu'une apparition tardive des plaques séniles dans le cortex des souris simple ou double transgéniques. En conséquence, l'utilisation de modèles de souris simple ou double transgéniques n'est pas recommandée compte-tenu des différences physiologiques existant avec la maladie d'Alzheimer et du délai auquel apparaissent les lésions liées à cette pathologie.
L'utilisation d'un modèle transgénique de souris comprenant trois gènes mutés (APP, PSl et tau) (LaFerla et al. 2003) présente également des désavantages. La validité de construction de ce modèle est discutable puisqu'une mutation dans le gène tau, non présente chez l'homme atteint de maladie d'Alzheimer, est ajoutée par rapport aux modèles précédents. Cependant, la validité descriptive de ce modèle est bonne puisqu'il mime bien les lésions physiologiques de la maladie d'Alzheimer qui consistent en des plaques amyloïdes, des dégénérescences neurofibrillaires et de la perte neuronale. Cependant, cette méthode nécessite un délai de 6 mois à 12 mois avant d'obtenir des souris présentant les lésions typiques de la maladie d'Alzheimer. En conséquence, ce modèle de souris transgéniques peut valablement être utilisé dans une méthode de confirmation des propriétés anti-amyloïde d'un composé testé mais ne peut raisonnablement pas être utilisé en première intention pour le criblage de composés compte-tenu de la durée et de la difficulté de mise en œuvre dudit modèle.
Une troisième méthode (Wang et al. 2000) consiste à tester la capacité de composés à empêcher la formation de complexes entre peptides Aβ apportés de manière exogène et α7 présent dans des tissus de rat (synaptosomes d'hippocampe et de cortex de rat). Cette méthode in vitro est plus rapidement mise en œuvre que les méthodes décrites supra, toutefois elle a l'inconvénient de ne pas être représentative des complexes présents chez l'homme puisque ce sont des extraits de cerveaux de rat et que les peptides Aβ sont apportés manière exogène. En conséquence, ce modèle ne respecte ni les conditions de validité de construction ni celles de validité descriptive requises pour l'utilisation de ce dernier dans une méthode de criblage de composés capables d'agir sur le complexe Aβ42- α7 nAChR à l'origine de la formation de plaques amyloïdes. La présente invention a donc pour but de proposer une stratégie alternative aux méthodes d'identification de composés susceptibles d'agir sur les complexes β-amyloïde-α7 nAChR, en vue de remédier au moins en partie, aux inconvénients déjà connus des méthodes de sélection desdits composés. L'invention propose donc à ce titre une méthode de criblage ex vivo recréant les conditions physiologiques présentes chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ces conditions optimales sont obtenues en utilisant des cerveaux humains en particulier des cortex frontaux issus de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ce modèle remplit par définition les critères de validité de construction et de validité descriptive puisqu'il s'agit d'une utilisation directe du tissu humain malade. Les conditions ex vivo de la méthode de criblage selon l'invention permettent de lever les contraintes liées à la réalisation et à la manipulation de modèles animaux. De plus, l'utilisation de matériels biologiques humains permet de s'affranchir de tous les artefacts et erreurs liés aux différences physiologiques existantes entre les espèces animales et humaine. L'utilisation de matériels biologiques humains dans le cadre de la méthode de criblage selon l'invention est particulièrement importante compte-tenu du fait que la maladie d'Alzheimer et les pathologies neurodégénératives en général n'existent pas de manière naturelle chez des espèces autre que l'espèce humaine.
L'invention concerne donc une méthode de criblage de composés capables de dissocier ou de prévenir les complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine issus de cerveaux humains.
De manière préférée, l'invention porte sur une méthode de criblage de composés capables de dissocier ou prévenir les complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques α7 de l'acétylcholine issus de cerveaux humains.
La méthode de criblage selon l'invention permet donc d'identifier des composés aux propriétés curative ou préventive en fonction que ces composés sont respectivement capables de dissocier ou de prévenir les complexes Aβ42-α7 nAChR.
Par propriété « anti-amyloïde » ou « anti-bêta amyloïde » on entend la capacité pour un composé à dissocier ou à s'opposer à la formation de dépôts intracellulaires ou extracellulaires de peptides β-amyloïde que ce soit par dissociation ou par inhibition de la formation des complexes que forment les peptides Aβ avec les récepteurs nicotiniques de Facétylcholine.
Dans le contexte de l'invention le récepteur nicotinique alpha 7 de l'acétylcholine (α7 nAChR) désigne un récepteur cellulaire de surface pentamérique, exprimé principalement dans le cortex et l'hippocampe, et possédant un rôle important dans l'apprentissage et la mémoire.
Dans le contexte de l'invention les expressions « β-amyloïde », « Aβ » et « peptide β- amyloïde » concernent l'ensemble des peptides β-amyloïdes dont les peptides Aβ1-39 ou Aβ39, Aβ1-40 ou Aβ40, Aβ].^ ou Aβ41 Aβ1-42 ou Aβ42, Aβ1-43 ou Aβ43 et leurs fragments (Glenner et al. 1984). Les fragments des peptides β-amyloïde supra ont une activité biologique et sont utilisables dans la méthode de criblage selon la présente invention. Lesdits fragments sont par exemple des fragments Aβ1-28 et Aβ25-35. Les peptides β-amyloïde utilisés dans le cadre de l'invention sont en particulier les peptides Aβ3ç>, Aβ40, Aβ41, Aβ42 et/ou Aβ43. Le peptide Aβ42 présente la plus forte affinité vis à vis des récepteurs nicotiniques α7 de l'acétylcholine et a le rôle le plus important dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer.
La présente méthode de criblage est réalisée à partir d'échantillons de cerveaux humains et de préférence à partir de cortex et d'hippocampe humains. Ces échantillons sont prélevés post-mortem sur des patients atteints de la maladie d'Alzheimer.
L'invention porte, de manière préférée, sur une méthode de criblage caractérisée en ce que la dissociation des complexes de peptides β-amyloïde et de récepteurs nicotiniques α7 de l'acétylcholine est mise en évidence par immunohistochimie.
Dans le cadre de l'invention, le terme « immunohistochimie » concerne l'ensemble des techniques de révélations des antigènes par des anticorps pour détecter ou isoler des molécules définies.
De préférence, la méthode de criblage comprend les étapes suivantes d'incubation des complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine en présence ou en l'absence d'un composé à tester, puis de détermination de la quantité de complexes non dissociés en présence ou en l'absence de composé à tester et l'évaluation de la différence de quantité de complexes non dissociés, ladite différence indiquant que le composé testé module la dissociation des complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
Préférentiellement, la méthode de criblage selon l'invention comprend également une étape d'isolement des complexes non dissociés de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine à l'aide d'anticorps anti-peptide β-amyloïde.
De façon préférée, les anticorps anti-peptide β-amyloïde utilisés dans la méthode de criblage sont dirigés contre les peptides β-amyloïde Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 et/ou Aβ43. Ces anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux de souris ou de chèvre.
De manière encore préférée, la présente méthode de criblage se caractérise par la révélation, en particulier par méthode Western-blot, des complexes non dissociés à l'aide d'anticorps anti-récepteurs à l'acétylcholine nicotiniques, en particulier d'anticorps anti- récepteurs nicotiniques α7 de l'acétylcholine.
Avantageusement, la méthode de criblage selon l'invention a mis en évidence le composé S 24795, i.e. chlorure ou iodure de l-(4-bromophényl)-2-(l-méthyl-2 pyridiniumyl)-l- éthanone, comme composé capable d'une part d'inhiber la formation de complexes β- amyloïde-α7 nAChR et d'autre part de dissocier lesdits complexes β-amyloïde-α7 nAChR accumulés en plaques amyloïdes autour du neurone et en dépôt à l'intérieur du neurone. Le composé S 24795, identifié par la méthode de criblage de la présente invention, est donc un composé capable de dissocier les complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine présents dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ainsi que d'inhiber la formation desdits complexes.
L'invention vise également chaque composé identifié à partir de la méthode de criblage selon l'invention. L'invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant le composé obtenu à partir de la méthode de criblage selon l'invention en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipient(s) pharmaceutiquement acceptables. Par « principe actif», on entend toute substance responsable des propriétés pharmacodynamiques ou thérapeutiques de la composition pharmaceutique. Dans le contexte de l'invention, on entend par « excipients » toute substance à laquelle on incorpore le principe actif d'un médicament afin d'en faciliter la préparation ainsi que l'administration et d'en conditionner la consistance, la forme ainsi que le volume. Parmi les excipients, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables on peut citer à titre indicatif et non limitatif les diluants, les solvants, les conservateurs, les agents mouillants, les émulsifiants, les agents dispersants, les liants, les agents gonflants, les agents désintégrants, les retardants, les lubrifiants, les absorbants, les agents de suspension, les colorants ou les aromatisants.
De plus, les compositions pharmaceutiques destinées à la prévention et/ou au traitement des pathologies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier sont sous une forme convenant à l'administration orale, parentérale, nasale, per ou transcutanée, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, et les ampoules buvables ou injectables.
La présente invention porte, en outre, sur l'utilisation de composés identifiés à partir de la méthode de criblage selon l'invention pour l'obtention de compositions pharmaceutiques destinées à la prévention et/ou au traitement de maladies neurodégénératives.
Les composés identifiés par la méthode de criblage selon l'invention sont utilisés dans le traitement des « pathologies neurodégénératives » telles que par exemple la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick, la démence à corps de Lewy, le syndrome de Steel- Ridchardson, le syndrome de Down, le syndrome de Shy-Drager, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie neurodégénérative, la maladie de Huntigton, la maladie de Parkinson, l'aphasie primaire progressive, la maladie de Machado-Joseph, la maladie de Gilles de La Tourette, le dusarthrie paralytique, la maladie de Kennedy, la paralysie spasmodique familiale, la maladie de Werdriig-Hoffinann, la maladie de Kugelberg- Welander, la maladie de Tay-Sach, la maladie de Sandhoff, la maladie de Wohlfart- Kugelberg-Welander, la paraparésie spastique, la leucoencéphalite multifocale progressive et les maladies liées au prion dont Creutzfeldt-Jakob ou la maladie de Gerstmann- Stràussler Scheinker.
Le terme « préventif» selon l'invention correspond à un traitement à visée préventive ayant pour objectif de diminuer le risque de développer la maladie d'Alzheimer en inhibant la fixation des peptides β-amyloïde sur les récepteurs cellulaires nicotiniques α7 de l'acétylcholine. Cette inhibition limite la formation de complexes β-amyloïde-α7 nAChR à l'origine des plaques amyloïdes, lésion présente dans la maladie d'Alzheimer. En outre, le terme « préventif » peut s'entendre comme la prévention secondaire qui est destinée à diminuer la prévalence en réduisant l'évolution et la durée de la maladie.
On entend par « traitement », un traitement à visée curative prescrit aux fins de soigner les patients atteints de la maladie d'Alzheimer en dissociant les complexes β-amyloïde-α7 nAChR présents dans les cerveaux humains et constituant les plaques séniles.
Plus particulièrement, l'utilisation de composés issus de la méthode de criblage selon l'invention pour l'obtention de compositions pharmaceutiques est destinée à la prévention et/ou au traitement de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. On entend par « maladie d'Alzheimer » une maladie neurodégénérative fatale affectant la mémoire et le fonctionnement mental avec notamment l'altération du langage, la perturbation des gestes élaborés, des troubles d'orientation dans le temps et dans l'espace. Ces troubles cognitifs sont liés à deux lésions neuropathologiques caractéristiques les plaques séniles et la dégénérescence neurofibrillaire qui permettent son diagnostic définitif post-mortem.
La présente invention est illustrée par, sans pour autant se limiter aux figures suivantes : - Figure 1 : Western-blot illustrant l'inhibition par le S 24795 des complexes Aβ42-α7 nAChR provenant de synaptosomes de cortex frontal de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou de sujets témoins post-mortem. Les complexes Aβ42-α7 nAChR sont incubés en milieu seul (Kreb's-Ringer) ou en présence de S 24795 (30 μM) pendant 10 minutes suivie d'une incubation en présence de peptide Aβ42 pendant 30 minutes. - Figure 2 : Quantification de l'inhibition de la formation de complexes Aβ42-α7 nAChR dans des synaptosomes de cortex frontal humains provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer et de sujets contrôles post-mortem, incubés ou non avec S 24795 (30μM) puis avec des peptides Aβ42 (10OnM). * : p<0.01 pour contrôles et patients atteints de la maladie d'Alzheimer, test de Newman-Keuls pour les comparaisons multiples.
- Figure 3 : Western-blot illustrant la dissociation par le S 24795 des complexes Aβ42- α7 nAChR provenant de synaptosomes de cortex frontal de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou de sujets témoins post-mortem. Les complexes Aβ42-α7 nAChR sont incubés en milieu seul (Kreb's-Ringer) ou en présence de S 24795 (1, 10, 30 ou lOOμM) pendant 10 minutes puis en présence ou en l'absence d'Aβ42
(10OnM).
- Figure 4 : Quantification de la dissociation de l'interaction des récepteurs α7 nAChR associés à Aβ42 dans des synaptosomes de cortex frontal humains provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer et de sujets témoins post-mortem, incubés avec du S 24795 (de 1 à lOOμM) puis en présence ou en l'absence d'Aβ42 (10OnM).
* : p<0.01 pour contrôles et patients atteints de la maladie d'Alzheimer, test de Newman-Keuls pour comparaisons multiples.
- Figure 5 : Quantification de l'entrée de 45Ca2+ dans des synaptosomes de cortex frontal humain provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer et de sujets témoins post-mortem traités par S 24795. Les tranches de cerveaux contrôles sont incubées ou non en présence d'Aβ42 (lμM) préalablement au traitement au S 24795 (lOμM). Les entrées de calcium sont induites soit par l'agoniste α7 (PNU282987) soit par du NMDA ajouté à de la glycine. I. Matériels et Méthodes
Ll) Patients
Des cortex frontaux humains post mortem issus de patients atteints de la maladie d'Alzheimer et de sujets sains témoins sont issus de banques de cerveaux (Harvard Brain Tissue Ressource Center et Analytical Biological Services).
Les patients et témoins inclus dans l'étude étaient des personnes âgées entre 50 et 90 ans.
Les témoins sont des personnes n'ayant pas présentés au cours de leur vie de troubles cognitifs ni de signes manifestes de perte de mémoire.
En outre, les patients atteints de la maladie d'Alzheimer ont été divisés en deux sous- groupes présentant ou non des pathologies vasculaires associées. Seuls les cerveaux de patients sans pathologie associée ont été utilisés dans le cadre de la présente étude.
Notons que le diagnostic de la maladie d'Alzheimer a été confirmé par la méthode immunohistochimique du National Institute on Aging et du Reagan Institute Working
Group on Diagnostic Criteria for the Neurological Assessement chez les patients qui présentaient les symptômes cliniques de la maladie d'Alzheimer.
1.2) Préparation des cortex
Afin d'éviter tout artefact post-mortem, les cortex prélevés dans le cadre de l'étude proviennent de personnes décédées dans les 15 heures précédant ledit prélèvement. Les cortex prélevés sont conservés à -80°C jusqu'à leur utilisation dans la méthode de criblage selon l'invention.
1.3) Conservation des cortex
Après prélèvement, les cortex sont cryoprotégés pendant 2 semaines, dans du tampon phosphate de sodium 0.2M (NaH2PO4, 2H2OZNaH2PO4, 12H2O, pH 7.4) contenant du saccharose à 20% (P/V). Ils sont ensuite congelés pendant 1 minute dans de l'isopentane maintenu à une température de -30°C dans de la carboglace. Des coupes de 5μm d'épaisseur, réalisées dans un cryostat thermostaté à -30°C (Super Frost Plus Fisher) sont finalement placées dans un tampon PBS 0.02M puis conservées à 4°C. 1.4) Préparation de synaptosomes lOOmg de cortex frontal post-mortem broyé dans la glace est homogénéisé dans 10 volumes de HEPES à 1OmM et pH 7.4 maintenu dans la glace et oxygéné en présence de 0.32mM de sucrose et O.lrnM d'EDTA puis est mélangé dans un broyeur à tissu Teflon/verre à 4°C dans une solution d'homogénéisation contenant 25mM de HEPES à pH 7.5, ImM de EDTA, 50μg/ml de leupeptine, lOμg/ml d'aprotinine, 2μg/ml d'inhibiteur de trypsine de soja, 0.04mM de PMSF, un mélange de protéines inhibitrices de la phosphatase et 0.2% de 2-mercaptométhanol. Dans un premier temps, l'homogénat est centrifugé à 1000g et 4°C pendant 10 minutes. Le surnageant issu de cette première centrifugation est dans un deuxième temps centrifugé à 15000g pendant 30 minutes afin d'obtenir un culot de synaptosomes. Le culot de synaptosomes est lavé deux fois par suspension dans 10ml d'une solution de Krebs-Ringer maintenue dans la glace comprenant 25mM HEPES à pH 7.4, 118mM de NaCl, 4.8mM de KCl, 25mM de NaHCO3, 1.3mM de CaCl2, 1.2mM de MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 1OmM de glucose, lOOμM d'acide ascorbique, 50μg/ml de leupeptine, lOμg/ml d'aprotinine, 2μg/ml d'inhibiteur de trypsine de soja, 0.04mM PMSF et un mélange de protéines inhibitrices de la phosphatase, aéré pendant 10 minutes avec 95% O2/5% CO2 puis centrifugé de nouveau à 15000g pendant 10 minutes à 4°C. Les synaptosomes lavés sont ensuite suspendus dans ImI de solution de Krebs-Ringer oxygénée et la concentration en protéines de ladite suspension de synaptosomes est déterminée par la méthode de Bradford.
1.5) Immunoprécipitation
Les synaptosomes de cortex humains sont incubés dans une solution oxygénée de Krebs- Ringer en présence du composé S 24795 à 370C pendant 30 minutes dans un volume total d'incubation de 500μl. Le composé S 24795 est présent dans le milieu de réaction aux concentrations de lμM, lOμM, 30μM ou lOOμM. Selon les expériences réalisées, les synaptosomes sont également incubés en présence de 10OnM d'Aβ42 ou en présence de véhicule. La réaction est stoppée en diluant dans 1.5ml d'une solution d'EDTA à ImM maintenue dans la glace - ion calcium Ca2+ - sans solution de Krebs-Ringer puis en centrifugeant pendant 10 minutes à 15000g et 4°C. Après prélèvement du surnageant, le culot de synaptosomes obtenu est solubilisé dans 250μl de tampon d'immunoprécipitation (25mM de HEPES à pH 7.5, 20OmM de NaCl, ImM d'EDTA, 50μg/ml de leupeptine, lOμg/ml d'aprotinine, 2μg/ml d'inhibiteur de trypsine de soja, 0.04mM PMSF et un mélange d'inhibiteurs de protéines phosphatase) contenant 0.5% de digitonine, 0.2% de sodium chélaté et 0.5% de NP-40. Après dilution des synaptosomes dans 750μl de tampon d'immunoprécipitation maintenu dans la glace et centrifugation à 4°C de manière à éliminer les résidus insolubles, les complexes Aβ42-α7 nAChR sont isolés par immunoprécipitation à l'aide d'anticorps anti-Aβ42 incubés en leur présence pendant 16 heures à 4°C et concentrés par incubation pendant 2 heures en présence de 25 μl de billes d'agarose conjugué A/G (Cai et al. 1999, Wang et al. 2000, Jin et al. 2001).
1.6) Electrophorèse et Western Blot
Après trois lavages avec ImI d'une solution saline de tampon phosphate à pH 7.2 suivis d'une centrifugation, les complexes Aβ42-α7 nAChR isolés sont solubilisés dans lOOμl de tampon SDS-PAGE (62.5mM Tris-HCl à pH 6.8, 10% de glycérol, 2% de SDS, 5% de 2- mercaptoéthanol, 0.1% de bleu de bromophénol) à chaud pendant 5 minutes. Les complexes sont ensuite déposés sur un gel d' electrophorèse SDS-polyacrylamide 8-16%.
Des anticorps monoclonaux anti-α7 nAChR sont utilisés dans l'analyse par Western Blot puis révélés par chimioluminescence. L'intensité des bandes obtenues est analysée par densitométrie afin de quantifier les effets des composés en fonction de leur dose sur la quantité de complexes Aβ42-α7 nAChR présents.
1.7) Composé anti-amyloïde
Le composé S 24795 est utilisé en tant qu'agent anti-amyloïde dans le protocole de méthode de criblage ex vivo selon l'invention.
Le composé S 24795 est un composé pyridinique utilisé comme facilitateur mnémocognitif capable d'améliorer les processus cognitifs et/ou de s'opposer aux troubles cognitifs liés au vieillissement. Contrairement aux facilitateurs mnémocognitifs agissant directement sur les systèmes cholinergiques centraux, le composé S 24795 est dépourvu d'activité hypothermisante pouvant être gênante dans le traitement des patients atteints de maladie neurodégénérative. 1.8) Méthode de récupération fonctionnelle
Les expériences de récupération fonctionnelle sont effectuées à partir de cerveaux selon 1.2 provenant de patients selon 1.1. La récupération fonctionnelle induite par le traitement au S 24795 (lOμM) est évaluée sur le flux entrant de calcium par les récepteurs α7 et NMDA. Elle a été testée après Ih de traitement par S 24795 sur des cerveaux contrôles exposés à Aβ42 (30 minutes) et sur des cerveaux de patients atteints de maladie d'Alzheimer. Les traitements par Aβ42 (lμM) et S 24795 (lOμM) sont effectués sur des tranches de cortex provenant de ces cerveaux. Des synaptosomes sont ensuite préparés comme décrit en 1.4. Afin d'évaluer les flux entrants de Ca2+ par les récepteurs α7 et NMDA, les synaptosomes sont incubés en présence de 45Ca2+ (5μM) pendant 5 minutes à 37°C dans du milieu Kreb's-Ringer. Les flux de Ca2+ sont induits pour α7 agoniste sélectif des récepteurs α7nAChR, PNU282987 (0.1, 1 et 10 μM), et pour les récepteurs NMDAR par l'addition de NMDA (0.1, 1 , lOμM) et de glycine (1 μM). La réaction est stoppée par l'ajout de Kreb's Ringer (4°C) contenant de l'EGTA mais dépourvu de calcium. Après deux lavages, les synaptosomes sont lysés par sonication dans l'éthanol (95%) et la radioactivité est comptée par spectrométrie à scintillation liquide. La spécificité des flux entrants de calcium est vérifiée grâce à l'addition d'inhibiteurs sélectifs du récepteur α7 (α-bungarotoxine) et NMDA (AP-5).
II. Résultats
Les résultats mettent en évidence deux types d'effets du composé S 24795.
Premièrement, la méthode de criblage permet, lorsque les peptides Aβ sont ajoutés aux extraits de cerveau, d'identifier une propriété préventive de S 24795, ajouté avant les peptides Aβ, sur la formation des complexes Aβ42-α7 nAChR. En effet, comme on peut le voir sur la figure 1, l'ajout de peptides Aβ aux synaptosomes de cortex humains non malades induit une forte augmentation de la quantité de complexes Aβ42-α7 nAChR.
Lorsque S 24795 est ajouté aux synaptosomes avant les peptides Aβ, la quantité de complexes Aβ42-α7 nAChR formés est diminuée de 92%, ce qui montre que S 24795 (à 30μM) prévient la formation de ces complexes induite par les peptides Aβ. Dans les synaptosomes provenant de cortex de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, la quantité de complexes présents est vingt fois plus importante que chez les contrôles non malades. L'addition de peptides Aβ n'induit pas d'augmentation du nombre de complexes présents dans les tissus malades, l'ensemble des récepteurs nicotiniques étant déjà saturés par les peptides Aβ endogènes. Dans ce cas, la méthode de criblage permet d'identifier un propriété curative de S 24795 puisque dissociant des complexes formés avant le décès du patient. S 24795 induit une diminution majeure de la quantité de complexes Aβ42-α7 nAChR présente dans les cerveaux malades. Les résultats illustrés sur la figure 3 confirment la capacité de la méthode de criblage à identifier un composé à propriété curative en ce que, sans ajout de peptides Aβ ce composé peut induire une dissociation des complexes déjà présents dans les tissus humains malades. En effet, l'absence de peptides Aβ exogènes le composé S 24795 induit, dès la concentration de lμM, une diminution d'environ 22% des complexes Aβ42-α7 nAChR déjà présents dans les extraits de cerveaux malades. Cette diminution devient significative aux concentrations de 10, 30 et lOOμM de S 24795 avec des complexes non dissociés diminuées de manière dose dépendante de l'ordre de 63% à la plus forte concentration (p<0.01 ANOVA 2 facteurs suivie d'un test de Newman-Keuls pour comparaisons multiples).
Cette méthode de criblage permet donc de sélectionner de manière spécifique des composés capables d'une part de prévenir la formation de complexes, ce qui est applicable à des stades précoces de la maladie où les composés ont une action préventive, et d'autre part de dissocier les complexes déjà présents, ce qui est applicable à des stades avancés voire sévères de la maladie, où les composés ont une action curative. En effet, la dissociation des complexes Aβ42-α7 nAChR va empêcher l'accumulation intraneuronale excessive de complexes Aβ42-α7 nAChR et par conséquence s'opposer à la mort neuronale due à ces dépôts.
La réalisation de la méthode de criblage selon l'invention à partir de synaptosomes de cerveaux humains évite les artefacts et faux-positifs liés aux différences entre les espèces animales et humaine. En outre, la mise en œuvre ex vivo de cette méthode de criblage permet d'obtenir une rapidité et une répétitivité pour l'identification de composés capables de dissocier les complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. Enfin, cette méthode de criblage étant mise en œuvre sur du matériel biologique représentant un stade sévère et figé de la maladie d'Alzheimer, elle permet donc de sélectionner et identifier des composés agissant à un stade ultime de la maladie. La méthode de criblage selon l'invention assure l'identification de composés utilisables dans le traitement curatif des maladies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier.
De plus, une expérience spécifique a été menée afin d'évaluer une éventuelle récupération fonctionnelle après dissociation des complexes Aβ42-α7 nAChR. Cette expérience montre que la dissociation par S 24795 des complexes Aβ42-α7 nAChR permet une récupération de certaines fonctionnalités des récepteurs α7 nAChR et des récepteurs au glutamate de type NMDAR. En effet l'entrée de calcium via α7 nAChR et NMDAR dans les synaptosomes de patients atteints de maladie d'Alzheimer est fortement diminuée, 35% des valeurs contrôles, par rapport aux synaptosomes de sujets contrôles (figure 5). Cette diminution de l'entrée de calcium est bien due à la formation des complexes Aβ42-α7 nAChR puisque l'ajout d'Aβ sur des tranches de cerveaux de sujets contrôles provoque une diminution de l'entrée de calcium, jusqu'à un niveau comparable à celui des patients. Le traitement par S 24795, en s'opposant à l'action de l'Aβ dans les cerveaux contrôles montre un rétablissement important de cette entrée de Ca2+. De façon plus remarquable, le traitement par S 24795 sur les complexes déjà formés chez les patients atteints de maladie d'Alzheimer provoque une augmentation importante de l'entrée de Ca2+ de l'ordre de 75% par rapport aux cerveaux de patients non traités atteints de maladie d'Alzheimer. La figure 5 montre que, après traitement au S 24795 des cerveaux de patients atteints de maladie d'Alzheimer et de contrôles prétraités à l'Aβ, l'entrée de Ca2+ atteint des niveaux comparables correspondants à environ 65% des valeurs contrôles sans Aβ.
Il est donc montré par cette expérience que la dissociation par S 24795 des complexes Aβ42-α7 nAChR, sur du tissu malade provenant de patients atteints de maladie d'Alzheimer, permet la restauration post-mortem de certaines fonctionnalités cellulaires, en l'espèce l'entrée de calcium.
Cette expérience souligne donc l'intérêt thérapeutique de cette méthode de criblage.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de criblage de composés capables de dissocier ou de prévenir les complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine issus de cerveaux humains.
2. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les composés identifiés ont des propriétés curative ou préventive.
3. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine sont de type al.
4. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les peptides β- amyloïde sont Aβ39, Aβ^, Aβ41, Aβ42 et/ou Aβ43.
5. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine sont issus de cortex ou d'hippocampes humains.
6. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dissociation des complexes de peptides β-amyloïde et de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine est mise en évidence par immunohistochimie.
7. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : l'incubation de complexes de peptides β-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine en présence ou en l'absence d'un composé à tester ; la détermination de la quantité de complexes non dissociés en présence ou en l'absence de composé à tester et l'évaluation de la différence de quantité de complexes non dissociés.
8. Méthode de criblage selon la revendication 7, caractérisée en ce que les complexes non dissociés sont isolés avec des anticorps anti-peptides β-amyloïde.
9. Méthode de criblage selon la revendication 8, caractérisée en ce que les anticorps sont dirigés contre les peptides β-amyloïde Aβ3g, Aβ40, Aβ41, Aβ42 et/ou Aβ43.
10. Méthode de criblage selon la revendication 7, caractérisée en ce que les complexes non dissociés sont mis en évidence à l'aide d'anticorps dirigés contre les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine.
11. Méthode de criblage selon la revendication 10, caractérisée en ce que les complexes non dissociés sont mis en évidence à l'aide d'anticorps anti-récepteurs nicotiniques α7 de l'acétylcholine.
12. Composé identifié par la méthode de criblage selon la revendication 1.
13. Composé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ce composé est le l-(4- bromophényl)-2-(l -méthyl-2pyridiniumyl)- 1 -éthanone.
14. Composition pharmaceutique caractérisée en qu'elle comprend un ou plusieurs excipient(s) pharmaceutiquement acceptable(s) et un ou plusieurs composé(s) selon la revendication 12.
15. Utilisation de composés selon la revendication 12 pour l'obtention de compositions pharmaceutiques destinées à la prévention et/ou au traitement de maladies neurodégénératives.
16. Utilisation de composés selon la revendication 12 pour l'obtention de compositions pharmaceutiques destinées à la prévention et/ou au traitement de la maladie d'Alzheimer.
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